news_711 - Саратовский государственный университет

На правах рукописи
Слюзова Ольга Владимировна
ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ КАДМИЯ
НА АНТИОКСИДАНТНЫЕ ПРОЦЕССЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ БЕЛЫХ КРЫС
И ИХ ПОТОМСТВА
03.00.16 – экология
03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2008
1
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики ГОУ ВПО
«Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
вед. научный сотрудник
Киреев Роман Александрович
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор,
Заслуженный деятель науки РФ
Игнатов Владимир Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Анищенко Татьяна Григорьевна
доктор биологических наук,
ст. научный сотрудник
Соколов Олег Игоревич
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет»
Защита состоится «3» июля 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Саратовский
государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» по адресу:
410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83. E-mail: biosovet@sgu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет
им. Н.Г. Чернышевского»
Автореферат разослан «30» мая 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
2
С.А. Невский
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Изменение состояния окружающей
среды в промышленно развитых странах побуждает проводить интенсивное изучение воздействия экологических факторов на биологические
объекты. Во многих странах приоритетной группой экотоксикантов считаются тяжелые металлы и, в частности, кадмий. Загрязненность окружающей среды тяжелыми металлами отмечается в ряде регионов России, в том числе в Поволжье.
По информации комитета охраны окружающей среды и природопользования Саратовской области, в Саратове на протяжении последних
лет сохраняется превышение предельно допустимых концентраций по
кадмию в грунтовых водах, почве и снеговом покрове, обусловленное
наличием в селитебной зоне города стационарных промышленных источников загрязнения (О состоянии…, 2002, 2006).
Особенность кадмия состоит в том, что он очень медленно выводится из организма, и длительное поступление даже небольших доз этого элемента в условиях экологического неблагополучия может привести
к развитию нарушений деятельности сердечно-сосудистой, нервной,
иммунной систем, функций почек, печени, развитию онкологических
заболеваний, появлению врожденных пороков развития у потомства
(Shukla et al., 1988; Jamall et al., 1989; Wang et al., 1994; El-Safty et al.,
1996; Koyu et al., 2006). Считается, что главным механизмом токсического действия кадмия является индукция окислительного стресса. В
связи с этим весьма перспективной представляется оценка проантиоксидантного баланса организма в условиях экологического неблагополучия с целью ранней диагностики и патогенетически обоснованного лечения заболеваний. Одной из основных антиоксидантных систем
клетки является глутатионовая система, представляющая собой трипептид глутатион и группу ферментов, катализирующих реакции с его участием. В многочисленных работах зарубежных ученых показано влияние кадмия на глутатионовую систему детоксикации (Ulusu et al., 2003;
El-Demerdash et al., 2004; Casalino et al., 2004, 2006; Han et al., 2006;
Esrefoglu et al., 2007; Sinha et al., 2007). Тем не менее, в литературе отсутствуют сведения об активности этой системы и интенсивности процессов перекисного окисления у потомства при воздействии соединений
кадмия в период беременности и лактации.
Актуальность настоящего исследования связана с необходимостью прогнозирования последствий влияния ионов кадмия на организмы
матери и ребенка с целью разработки профилактических мероприятий
3
по снижению детской заболеваемости и смертности, особенно в послеродовой период.
Цель исследования: выявление экотоксикологического воздействия кадмия на антиоксидантные процессы у млекопитающих в модельной системе белых крыс и их потомства.
Задачи исследования:
- изучить активность ферментов глутатионовой системы (глутатион-S-трансферазы и глутатионредуктазы) и содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах, а также процессы свободнорадикального окисления в тканях самок белых крыс при воздействии нитрата
кадмия и рассмотреть их изменения в процессе адаптации;
- оценить ответную реакцию глутатионовой системы эритроцитов
у двух- и четырехмесячного потомства самок белых крыс, подвергавшихся влиянию ионов Cd2+ во время беременности;
- исследовать активность глутатионовой системы в эритроцитах,
печени, почках, сердце и мозге двух- и четырехмесячного потомства
белых крыс при неонатальном воздействии ионов Cd2+;
- рассмотреть динамику процессов свободнорадикального окисления в плазме крови и органах двух- и четырехмесячного потомства
после токсического действия ионов Cd2+ в неонатальный период;
- оценить половые различия и органоспецифичность кадмиевого
воздействия, определить особенность действия различных доз ионов
Cd2+ на активность глутатионовой системы и уровень свободнорадикального окисления в организме экспериментальных животных.
Научная новизна. Показано, что подострое воздействие нитрата
кадмия сопровождается краткосрочным увеличением активности ферментов глутатионовой системы и содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах. Впервые установлено, что воздействие кадмия на
самок крыс во время беременности вызывает изменения активности глутатионовой системы эритроцитов, связанные с полом и возрастом
потомства. В группе самок активность повышается к двухмесячному
возрасту с последующей нормализацией к четырем месяцам развития. У
самцов наблюдается сниженная активность глутатионовой системы к
двум месяцам, сменяющаяся повышением к четырехмесячному возрасту. Впервые выявлено дозозависимое снижение интенсивности работы
глутатионовой системы, содержания антиоксидантов и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах, печени, почках, сердце и мозге у двухмесячного потомства, получавшего Cd2+ с материнским
молоком. Установлено, что к четырехмесячному возрасту активность
глутатионовой системы возрастает в печени и эритроцитах, в почках и
сердце возвращается к контрольному уровню, а в мозге остается сни4
женной. Отмечено, что процессы свободнорадикального окисления усиливаются при неонатальном воздействии кадмия у двухмесячных животных, к четырехмесячному возрасту наблюдается тенденция к стабилизации во всех изученных органах. В плазме крови к четырехмесячному возрасту пероксидация прогрессирует. Введение токсиканта в пренатальный или неонатальный периоды приводит к более интенсивному
изменению изучаемых параметров у потомства в группе самцов по
сравнению с самками.
Научно-практическая значимость. Показано, что наиболее подвержены токсическому влиянию низких доз кадмия процессы ПОЛ и
активность глутатионовой системы мозга. Установлено, что пренатальный и неонатальный периоды являются столь чувствительными для токсического воздействия, что даже незначительные количества кадмия,
проникающие к плоду или в организм потомства с материнским молоком, способны вызывать изменения в функционировании глутатионовой
системы и нарушения процессов свободнорадикального окисления, которые регистрируются у подопытных животных даже по достижении
половой зрелости. В связи с этим представляется целесообразным рекомендовать пересмотр в сторону уменьшения предельно допустимых
концентраций кадмия для снижения риска развития патологических состояний. Изменение активности глутатионовой системы может быть
признано маркером не только прямого, но и опосредованного через материнский организм экотоксикологического воздействия кадмия на
потомство. Выявленные гендерные различия в реакции на кадмиевую
интоксикацию могут в дальнейшем послужить основой для подбора
антидотов или ведения антитоксической терапии не только в зависимости от возраста и дозы токсиканта, но и с учетом пола.
Основные результаты работы используются в научнопедагогической деятельности кафедры биохимии и биофизики Саратовского государственного университета. Материалы диссертации включены в руководство к практическим занятиям по экологической токсикологии для студентов биологического факультета СГУ, применяются в
работе Центральной научно-исследовательской лаборатории Саратовского государственного медицинского университета.
Апробация работы. Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на: 6-й международной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря»
(Астрахань, 2003); 2-м Съезде токсикологов Украины (Киев, 2004); 5-й
открытой окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации
XXI века» (Сургут, 2004); международной научной конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты» (Лодзь, Польша, 2004); 9-й между5
народной научной конференции «Науки о жизни 04» (Нова Горица,
Словения, 2004); 6-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки
о человеке» (Томск, 2005); 43-м конгрессе Европейского общества токсикологов и 6-м конгрессе токсикологии в развивающихся странах «Евротокс 2006/6 КТРС» (Кавтат/Дубровник, Хорватия, 2006); 6-й международной научной конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2006); международной научной конференции «Свободные
радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); научной конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии»
(Саратов, 2007); международной научной конференции «Структурные
преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при
воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека»
(Астрахань, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, две из
которых в изданиях перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Лабораторные эксперименты
проведены автором лично по плану, согласованному с научным руководителем. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях
вклад автора составил 50-80%.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, выводов и
списка цитируемой литературы, содержащего 430 источников, в том
числе - 341 зарубежный, иллюстрирована 28 рисунками и 11 таблицами.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В условиях экологического неблагополучия низкие дозы кадмия, попадающие в организм потомства, способны изменять активность
глутатионовой системы и вызывать состояние окислительного стресса.
2. В ответ на кадмиевую интоксикацию активность глутатионовой
системы изменяется по-разному у самок и самцов в эритроцитах при
пренатальном, и в сердце и почках при неонатальном воздействии.
3. Влиянию кадмия в неонатальный период наиболее подвержены
биохимические процессы в мозге потомства.
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность темы диссертационного исследования, определяются основные задачи и формулируется цель
работы, отмечается научная новизна и практическая значимость полученных результатов, приводятся сведения об апробации работы, определяются основные положения диссертации, выносимые на защиту.
6
Глава 1. КАДМИЙ КАК ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР,
ВОЗДЕЙСТВУЮЩИЙ НА ЖИВЫЕ ОРГАНИЗМЫ (обзор литературы)
В данной главе приведена информация о распространении кадмия
в среде обитания человека. Кадмий, в связи с его широким применением
в промышленном производстве на предприятиях города, можно считать
одним из основных экополлютантов г. Саратова. На основании данных
отечественной и зарубежной литературы описаны токсикологические
свойства кадмия, главные известные механизмы воздействия на органы
и системы живых организмов, последствия влияния кадмия на организм
матери, новорожденного и эмбрион. Представлена информация об антиоксидантной глутатионовой системе и влиянии кадмия на её активность. На основании приведенного обзора литературы сформулирована
цель и определен круг задач, решаемых в данной работе.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Перечень условных сокращений: GR – глутатионредуктаза;
GSH – глутатион восстановленный; GSSG – глутатион окисленный;
GST – глутатион-S-трансфераза; γ-GT – γ-глутамилтрансфераза; Hb –
гемоглобин; Imax – максимальная интенсивность хемилюминесценции;
Sобщ – общая светосумма импульсов хемилюминесценции; ГКНА – Lглутамил-3-карбокси-4-нитроанилид; ХДНБ – 1-хлор-2,4-динитробензол.
Исследования проводили в 2002-2007 гг. на беспородных крысах
обоего пола в количестве 213 особей. Эксперименты на грызунах осуществляли в соответствии с требованиями Женевской конвенции (International Guiding…, 1985). В качестве вещества, моделирующего условия
экологического загрязнения, использовали государственный стандартный образец ионов кадмия (ГСО 7874-2000), представляющий собой
Cd(NO3)2. Токсикант вводили перорально, с помощью зонда, натощак.
Выявление краткосрочных механизмов адаптации в ответ на подострую кадмиевую интоксикацию проводили на самках, которым в
течение 10 дней вводили физиологический раствор (контрольная группа), или нитрат кадмия в дозе 2 мг/кг в пересчете на Cd2+. Исследование
осуществляли через 1, 4 и 8 дней после последнего введения токсиканта
(1-я, 2-я и 3-я опытные группы соответственно).
Изучение пренатального влияния ионов кадмия проводили на
потомстве самок крыс, которым с 6-го по 15-й день беременности вводили нитрат кадмия в дозе 2 мг/кг в пересчете на Cd2+ (опытная группа)
и физиологический раствор (контрольная группа). Исследование потом7
ства, с разделением на группы самок и самцов, осуществляли на 60-й и
120-й дни жизни.
Для изучения воздействия ионов кадмия в период новорожденности использовали самок, которым с 1-го по 10-й дни лактации вводили
Cd(NO3)2 в дозе 0,5 и 2 мг/кг в пересчете на Cd2+ (опытные группы) и физиологический раствор (контрольная группа). Потомство (самки и самцы) подвергали исследованию на 60-й и 120-й дни жизни.
Для анализа использовали гепаринизированную плазму, эритроцитарную массу и супернатант гомогенатов органов (печени, почек,
сердца и мозга), подготовленные по общепринятым методам.
Определение состояния глутатионовой системы по активности
GST, GR и содержанию GSH производили в эритроцитах и супернатанте
гомогенатов органов (Медицинские лабораторные технологии, 2002). В
плазме крови и супернатанте гомогенатов органов определяли также
активность γ-GT с помощью коммерческого набора «ГаммаГлутамилтрансфераза Liquid», изготовитель «Lachema», и содержание
монооксида углерода (Wolff, 1976). Кроме того, в супернатанте гомогенатов органов и плазме крови исследовали параметры индуцированной
хемилюминесценции, свидетельствующие об уровне про- и антиоксидантов: максимальную интенсивность хемилюминесценции и общую
светосумму импульсов хемилюминесценции (Густов и др., 1999). Содержание гемоглобина определяли гемцианидным методом с помощью
коммерческого набора «Гемциан-Диахим», изготовитель «Абрис+», количество белка в образцах определяли по методу Бредфорд (Bradford,
1976). В работе использовали центрифугу Т-24, спектрофотометр СФ46, анализатор Флюорат®-02-Панорама, биохемилюминометр БХЛ-06.
Полученные данные обрабатывали общепринятыми статистическими методами (Реброва, 2002), с использованием пакета
«STATISTICA 6.0» (STAT – SOFT, 2001).
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Изучение краткосрочных механизмов адаптации
к воздействию Cd(NO3)2 у самок крыс
Установлено, что воздействие на экспериментальных животных
ионами кадмия в дозе 2 мг/кг в течение 10 дней приводит к достоверному снижению GST, GR и GSH эритроцитов у животных 1-й группы относительно контрольного уровня в 2,2 раза, 2 и 1,4 раза соответственно
(рис. 1). После 4 дней адаптации у животных отмечается увеличение
активности GST в 1,3 раза, GR – в 2,2 раза и содержания GSH – в 1,5
8
раза по сравнению со значениями 1-й группы. По прошествии 8 дней
после последнего введения токсиканта обнаруживается уменьшение
изучаемых показателей относительно уровня 2-й группы: GST – в 1,5
раза, GR – в 1,8 раза, GSH – в 1,3 раза, при этом все они оказываются
ниже контрольных значений.
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
24
20
1,91
*
18
1,50
*
1,80
*
Контроль
^
22
3,30
0,88
1 группа
(1день)
^1,92
2 группа
(4день)
19,6
18,2
1,30
* # 1,04
3 группа
(8день)
*
*
16
14
13,0
12
#
14,6
10
Контроль
1 группа
(1день)
2 группа
(4день)
3 группа
(8день)
Глутатион-S-трансфераза
Глутатионредуктаза
а
Глутатион восстановленный
б
Рис. 1. Активность глутатион-S-трансферазы и глутатионредуктазы (а)
и уровень восстановленного глутатиона (б) эритроцитов самок крыс под воздействием Cd(NO3)2. По оси ординат: а – GST, мкмоль ХДНБ/мг Hb в мин,
GR, мкмоль GSSG/мг Hb в мин; б – нмоль/мг Hb; *) различия по отношению к
контрольной группе,^) различия между 1-й и 2-й группами, #) различия между
2-й и 3-й группами – достоверны при p<0,05
В ходе исследования параметров индуцированной хемилюминесценции у самок крыс наблюдается достоверное усиление Imax после
десятидневного кадмиевого воздействия, свидетельствующее о повышении выработки свободных радикалов в 3,3 раза в плазме, в 2,5 раза в
сердце, в 2,2 раза в мозге и в 2 раза в печени по сравнению с контрольным уровнем (табл. 1). Также в этой группе животных выявляется достоверное увеличение Sобщ (показателя, обратно пропорционального
антиоксидантной активности пробы): в мозге в 2,5 раза, в плазме в 2,2
раза, в сердце в 2 раза и в печени в 1,9 раза относительно контрольного
уровня.
По прошествии 4 дней после последнего введения токсиканта
происходит достоверное снижение Imax и Sобщ относительно 1-й группы в плазме крови в 1,7 и 1,8 раза, в печени – в 3,5 и 2,2 раза, в мозге – в
1,7 и 1,5 раза соответственно. В сердце Imax снижается в 1,9 раза, а
Sобщ остается на уровне 1-й группы.
Спустя 8 дней адаптации изменения показателей хемилюминесценции носят разнонаправленный характер. В плазме крови выявляется
достоверное уменьшение Imax и Sобщ относительно 2-й группы в 2,8 и
9
1,4 раза, при этом оба показателя оказываются ниже контрольного уровня. В печени в 3-й группе наблюдается тенденция к повышению изучаемых параметров и их приближение к контрольным значениям. В мозге
выявляется тенденция к повышению Imax на фоне поддержания на
прежнем уровне Sобщ. В сердце Imax 3-й группы остается на уровне
группы с четырехдневной адаптацией, а Sобщ понижается в 1,3 раза.
Как в мозге, так и в сердце животных 3-й экспериментальной группы
параметры хемилюминесценции превышают контрольный уровень.
Таблица 1
Показатели хемилюминесценции плазмы крови
и супернатанта гомогенатов органов самок крыс
на фоне воздействия нитрата кадмия
1 группа
2 группа
3 группа
Показатели
Контроль
(1 день)
(4 день)
(8 день)
плазма крови
Imax (мВ)
6,4±1,3
21,1±3,0* 12,5±1,3*^
4,5±0,5#
Sобщ (мВ·сек) 29,3±5,5 64,0±2,9* 35,9±7,6^
25,0±1,4
печень
Imax (мВ)
7,01,2
14,22,7* 4,10,5*^
6,11,0#
*
Sобщ (мВ·сек) 14,54,3 27,52,3
12,81,4^ 17,01,9#
сердце
Imax (мВ)
8,20,3
20,53,0* 10,64,7^ 10,50,9*
Sобщ (мВ·сек) 18,02,3 36,43,1* 32,52,4 25,02,9*●
мозг
Imax (мВ)
8,11,1
17,62,7* 10,41,8
12,00,9#
Sобщ (мВ·сек)
9,21,1
22,62,3 14,41,8^ 13,61,2*#
Примечание: *) различия по отношению к контрольной группе,
^) различия между 1-й и 2-й группами, ●) различия между 2-й и 3-й группами,
#) различия между 1-й и 3-й группами – достоверны при p<0,05
Таким образом, проведенное исследование выявило уменьшение
активности ферментов глутатионовой системы и уровня восстановленного глутатиона эритроцитов и усиление свободно-радикальных процессов в тканях и плазме крови экспериментальных животных под воздействием нитрата кадмия. Со временем происходит реализация краткосрочных адаптационных механизмов, которая проявляется в увеличении
активности глутатионовой системы. Также имеет место стабилизация
процессов пероксидации в плазме и печени. Ткани сердца и мозга проявляют большую чувствительность к токсическому агенту и демонстрируют недостаточность адаптационных резервов.
10
3.2 Исследование воздействия ионов Cd2+ в период беременности
самок крыс на постнатальное развитие потомства
Выявлено, что воздействие ионов кадмия в дозе 2 мг/кг на самок
крыс во время беременности приводит к изменению активности глутатионовой системы эритроцитов у потомства.
У двухмесячных самцов наблюдается снижение GR и GSH относительно контрольного уровня в 3,6 раза (p<0,005) и 1,3 раза (p<0,05)
соответственно. Напротив, у двухмесячных самок отмечен рост ферментативной активности GST в 2,4 раза (рис. 2а), GR в 2,6 раза (p<0,05) и
содержания GSH в 1,2 раза (p<0,05). По достижении возраста 4 месяцев
в группе подопытных самцов выявляется увеличение GST в 1,5 (p<0,05),
GR в 2,1 (p<0,01) и GSH в 1,3 раза (p<0,01) по сравнению с контрольными значениями. У самок активность GR повышается в 2,2 раза (p<0,05),
а GST и содержание восстановленного глутатиона поддерживается на
уровне контрольных значений.
Активность γ-GT плазмы (рис. 2б), свидетельствующая о повреждении клеточных мембран, достоверно возрастает у двухмесячных
животных: в 1,9 раза у самок и в 2,6 раза у самцов относительно уровня
контроля. К 4 месяцам развития у самцов наблюдается менее значительное увеличение: в 1,5 раза, у самок в 2 раза.
8
0,8
*
7
*
4
6,03
3
1
3,18
3,89
3,50 3,70
контроль
самцы
кадмий
самцы
двухмесячные
0,4
0,22
0,59 0,58
0,48
0,32 0,29
0,31
0,0
контроль
самки
кадмий самки
четырехмесячные
а
0,57
0,2
0,1
1,44
0
*
0,5
0,3
4,57
2,95
*
*
0,6
5
2
*
0,7
6
контроль
самцы
кадмий
самцы
двухмесячные
контроль
самки
кадмий
самки
четырехмесячные
б
Рис. 2. Активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов (а)
и γ-глутамилтрансферазы плазмы крови (б) на фоне пренатального
воздействия ионов Cd2+. По оси ординат: а – мкмоль ХДНБ/мг Hb в мин,
б – мкмоль ГКНА/мг белка в мин; *) различия по отношению
к контрольной группе достоверны при p<0,05
Таким образом,
сическое воздействие
самцов наблюдается
напротив, у самок в
установлены разнонаправленные реакции на току самок и самцов. К двухмесячному возрасту у
сниженная активность глутатионовой системы,
этот период активность глутатионовой защиты
11
эритроцитов повышается. По достижении четырехмесячного возраста и
у подопытных самцов реализуются компенсаторные механизмы.
3.3 Исследование воздействия ионов Cd2+ в период лактации самок крыс
на постнатальное развитие потомства
Показано, что при воздействии ионов кадмия в дозах 0,5 и 2 мг/кг
на организм самки во время лактации у двухмесячного потомства выявляется дозозависимое достоверное снижение активности антиоксидантного фермента GST в эритроцитах у самцов в 1,5 и 2 раза, у самок в 1,3 и
1,5 раза, по сравнению с контрольным уровнем (рис. 3).
GR снижается у самцов в 1,2 (р<0,05) и в 1,5 раза (р<0,001), у самок сохраняется на уровне контрольной группы. Количество GSH эритроцитов уменьшается у самцов в 1,2 (р<0,05) и в 1,6 (р<0,001) раза, у
самок уровень снижается при использовании большей дозы в 1,4 раза
р<0,05. Активность γ-GT плазмы крови возрастает в прямой зависимости от дозы у самцов – в 1,3 (р<0,05) и в 1,8 (р<0,001) раза, у самок – в
1,4 (р<0,05) и 1,7 (р<0,001) раза.
В печени у двухме6,3
5,8
*
сячного
потомства неона5,3
*#
5,47
4,8
4,75
тальная
интоксикация
*
4,3
4,27
*
также
вызывает
уменьше3,18
3,8
3,67
3,3
ние
активности
GST при
2,95
2,8
* 2,49
2,97
#
2,3
*
употреблении
дозы
2
2,06
* 1,94 #
2,07
1,8
* 1,48
мг/кг у самцов в 1,3 раза
1,3
контроль
Cd 0,5
Сd 2 мг/кг контроль
Cd 0,5
Сd 2 мг/кг
(p<0,005), у самок – в 1,1
самцы
мг/кг
самцы
самки
мг/кг
самки
самцы
самки
раза (p<0,001); GR снизилась у самцов в 1,4 раза
двухмесячные
четырехмесячные
(р<0,001), у самок – в 1,5
раза (р<0,001). СодержаРис. 3. Активность глутатион-S-трансферазы
ние GSH сокращается под
эритроцитов на фоне неонатального
влиянием ионов кадмия
воздействия ионов Cd2+. По оси ординат:
дозозависимо: у самцов в
мкмоль ХДНБ/мг Hb в мин, *) различия по
1,2 (р<0,05) и 1,4 раза
отношению к контрольной группе и
(р<0,005), у самок в
)
# различия между группами с дозами 0,5 и
1,1 (р<0,005) и в 1,3 раза
2 мг/кг Cd2+– достоверны при p<0,05
(р<0,005), по сравнению с
контрольной группой.
Показано снижение γ-GT в печени в 2 раза (р<0,01) в группе с дозой 0,5 мг/кг и в 3 раза (р<0,005) при дозе 2 мг/кг у самцов; в группе самок активность фермента снижается зависимо от дозы в 1,7 (р<0,005) и в
12
3,7 раза (р<0,001), относительно контроля. Сходные процессы угнетения
глутатионовой системы выявляются также в почках, сердце и мозге
двухмесячного потомства крыс (рис. 4).
25
35,5
24,5
20,3
21,8
21,2
17
17,8
13
* 13,7
13,7
*
9
контроль
самцы
Cd 0,5
мг/кг
самцы
33
21,4
21
* 11,2
#
*
9,9
Сd 2
мг/кг
самцы
двухмесячные
*
13,0
*#
контроль
самки
Cd 0,5
мг/кг
самки
Сd 2
мг/кг
самки
четырехмесячные
а
*
32,2
28
23
17,5
29,7
24,2
*
21,7
26,9
*#
16,9
18
19,2
*
13
контроль
самцы
13,7
Cd 0,5
мг/кг
самцы
#
*21,4
22,6
*#
Сd 2
мг/кг
самцы
контроль
самки
двухмесячные
*
20,7
Cd 0,5
мг/кг
самки
Сd 2
мг/кг
самки
*
четырехмесячные
б
Рис. 4. Активность глутатион-S-трансферазы сердца (а) и мозга (б)
на фоне неонатального воздействия ионов Cd2+. По оси ординат:
мкмоль ХДНБ/мг Hb в мин, *) различия по отношению к контрольной группе и
#) различия между группами с дозами 0,5 и 2 мг/кг Cd2+– достоверны при p<0,05
Отмечено дозозависимое достоверное увеличение Imax плазмы
(рис. 5а) относительно контроля у самцов в 1,8 и 2,9 раза, у самок в 1,4 и
2,3 раза. Sобщ также повышается при употреблении доз Cd2+ 0,5 и
2 мг/кг в группах самцов в 1,9 (р<0,001) и 3,2 (р<0,001) раза, в группе
самок в 2 (р<0,001) и 2,5 (р<0,001) раза по сравнению с нормальным
уровнем. Вместе с тем, повышается уровень монооксида углерода в
плазме у подопытных самцов в 1,2 (р<0,01) и в 1,4 (р<0,001) раза, у самок в 1,2 (р<0,01) и 1,5 (р<0,001) раза относительно контрольных значений в группах с дозами 0,5 и 2 мг/кг кадмия соответственно. Аналогичная динамика изменения параметров хемилюминесценции и СО наблюдается во всех изученных органах двухмесячного потомства.
Установлено, что под влиянием токсического агента в печени четырехмесячных подопытных самок и самцов наблюдается незначительное повышение активности GST относительно контрольных показателей. Ферментативная активность глутатионредуктазы увеличивается у
обоих полов в 1,2 раза при воздействии дозой 2 мг/кг кадмия. Уровень
GSH поддерживается в пределах нормы. Сходная тенденция обнаруживается также и в отношении глутатионовой системы эритроцитов. Ферментативная активность γ-GT печени, характеризующая доступность
для клеток субстрата синтеза глутатиона, остается сниженной по отношению к контрольным значениям, но в меньшей степени, чем у двухме-
13
сячных животных. Уменьшение происходит дозозависимо в 1,5 (р<0,01)
и 2,3 (р<0,001) раза у самцов; 2,8 (р<0,01) и 3,4 (р<0,005) раза у самок.
Увеличение периода после кадмиевой интоксикации с 2 до 4 месяцев приводит к сокращению выраженности изменений изучаемых показателей в мозге у подопытных животных обоих полов. Неонатальное
воздействие кадмия способствует достоверному снижению активности
GST в мозге самцов с увеличением дозы воздействия в 1,2 и 1,6 раза; в
мозге самок в 1,3 и 1,5 раза по сравнению с уровнем контрольной группы (рис. 4б). В изменении уровня восстановленного глутатиона и активности GR также выявляется тенденция к снижению относительно нормы. Активность γ-GT мозга уменьшается при кадмиевой интоксикации
дозами 0,5 и 2 мг/кг по сравнению с контрольными значениями в 1,9
(р<0,01) и 2,1 раза (р<0,01) у самцов; у самок в 1,6 (р<0,05) и 1,5 раза
(р<0,05) соответственно.
В реакции глутатионовой системы почек и сердца четырехмесячного потомства на интоксикацию наблюдаются половые различия. Неонатальное воздействие кадмия не влияет на активность GST в почках
самцов. У самок происходит увеличение в 1,2 (р<0,05) и 1,4 раза
(р<0,05) относительно контрольного уровня в группах с дозами 0,5 и
2 мг/кг соответственно. Ферментативная активность глутатионредуктазы почек под действием токсиканта незначительно повышается только у
самок в группе с дозой 2 мг/кг, в остальных случаях не изменяется. Содержание GSH в почках самок под влиянием токсиканта сохраняется в
пределах нормы. У самцов выявляется снижение относительно контрольных показателей, максимально в 1,3 раза (р<0,001) в группе с дозой 2 мг/кг. Снижение активности γ-GT почек менее выражено, чем у
двухмесячных крысят, и уменьшается относительно значений контрольной группы в 2 (р<0,01) и 3 (р<0,005) раза у самцов (в группах 0,5 и
2 мг/кг соответственно); и в 2,8 раза (р<0,05) в обеих экспериментальных группах самок.
При исследовании ткани сердца выявлена та же тенденция. У самок кадмиевая интоксикация не оказывает воздействия на активность
ферментов GST, GR, и GSH. В группе самцов достоверно снижается
активность GST в 1,3 и 1,6 раза, содержание GSH в 1,1 (р<0,05) и 1,2
раза (р<0,05) в группах с дозой 0,5 и 2 мг/кг кадмия относительно контрольной группы (рис. 4а). Активность GR сердца снижается в обеих
экспериментальных группах самцов, активность γ-GT уменьшается по
сравнению с контролем у самцов в 1,8 (р<0,05) и 2,4 раза (р<0,005), у
самок в 2,2 (р<0,01) и 1,9 раза (р<0,005) с увеличением дозы воздействия.
14
Установлено, что у четырехмесячных животных под действием
кадмия происходит увеличение параметров хемилюминесценции в
плазме. Imax достоверно повышается относительно контроля у самцов в
2 и 1,8 раза, у самок в 2,4 и 2,7 раза в группах с дозами 0,5 и 2 мг/кг кадмия соответственно (рис. 5а).
Общая светосумма
7,5
7,12
*
5,52
*#
* # 6,50
импульсов
хемилюминес6,0
*
4,88
6,04
ценции плазмы возрастает
4,5
*
в обеих группах самцов в
4,43
4,51
4,05
2,48
3,0
*
*
1,6 раза. В группе самок
2,84
*
2,26
2,41
увеличение составляет 2,8
1,5
контроль Cd 0,5 мг/кг Сd 2 мг/кг контроль Cd 0,5 мг/кг Сd 2 мг/кг
(р<0,01) и 3 раза (р<0,01)
самцы
самцы
самцы
самки
самки
самки
при воздействии 0,5 и 2
двухмесячные
четырехмесячные
мг/кг кадмия соответственно. Количество СО в
плазме как в группе саа
мок, так и в группе самцов
4,82
*
4,47
возрастает вместе с дозой
#
4,2
*
3,65
*
в 1,1 и 1,2 раза.
*
2,88
3,2
3,46
3,16
В печени четырех3,18
1,95
* 1,99
*
*
2,2
2,79
месячного потомства до1,83
1,65
*
стоверно увеличивается
1,2
контроль Cd 0,5 мг/кг Сd 2 мг/кг
контроль Cd 0,5 мг/кг Сd 2 мг/кг
Imax у самцов в 1,9 раза
самцы
самцы
самцы
самки
самки
самки
по сравнению с уровнем
двухмесячные
четырехмесячные
контроля при обеих дозах
кадмия, у самок в 1,4 и 1,8
б
раза с увеличением дозы
Рис. 5. Уровень максимальной интенсивности
воздействия (рис. 5б).
хемилюминесценции плазмы (а) и печени (б)
Sобщ возрастает у самцов
на фоне неонатального воздействия
2+
)
в обеих группах в 1,5 раза
ионов Cd . По оси ординат: мВ, * различия
(р<0,05); у самок в 1,9
по отношению к контрольной группе и #)
различия между группами с дозами 0,5 и
(р<0,05) и 1,7 раза
2 мг/кг Cd2+– достоверны при p<0,05
(р<0,05) при воздействии
дозами 0,5 и 2 мг/кг соответственно. Уровень СО в печени экспериментальных животных также
достоверно повышается, с максимальным увеличением в 1,2 раза
(р<0,005) в группе самцов с дозой 2 мг/кг. Та же динамика, а именно,
менее выраженное, чем в двухмесячном возрасте, изменение изучаемых
показателей хемилюминесценции выявляется и при исследовании тканей почек, сердца и мозга.
15
Таким образом, после воздействия ионов кадмия во время лактации у двухмесячного потомства наблюдается дозозависимое снижение
GST, GR, γ-GT и уровня GSH во всех исследованных тканях, в плазме
крови происходит увеличение ферментативной активности γ-GT. Также
выявляется увеличение параметров хемилюминесценции и уровня СО,
свидетельствующих об усилении ПОЛ, в плазме и образцах тканей. По
достижении четырехмесячного возраста активность глутатионовой системы остается сниженной в мозге, увеличивается в печени и эритроцитах, а в сердце и почках в группах самцов наблюдается снижение, тогда
как в группах самок функционирование поддерживается на уровне контроля. Параметры хемилюминесценции во всех изученных органах у
четырехмесячного потомства остаются повышенными, но менее значительно, чем у двухмесячных животных. Исключение составляет плазма
крови, где наблюдается прогрессирование увеличения хемилюминесценции, демонстрирующее наличие необратимых повреждений клеточных мембран.
Итак, исходя из проанализированных литературных источников и
данных нашего исследования, можно спрогнозировать результат более
длительного воздействия кадмия или влияния более высоких доз данного токсиканта на популяцию. Эти факторы могут вызвать более сильное
и продолжительное состояние окислительного стресса, лежащее в основе развития многих известных на сегодняшний день заболеваний. Кроме
того, усиленная выработка свободных радикалов может стать причиной
увеличения количества мутаций в генофонде. В конечном итоге кадмиевая интоксикация приведет к появлению менее жизнеспособного потомства с нарушенной репродуктивной функцией, подверженного широкому кругу заболеваний, и, как следствие, возможной полной элиминации
популяции. Для того чтобы данный прогноз не реализовался, рекомендуем пересмотреть в сторону уменьшения предельно допустимые концентрации кадмия в окружающей среде и продуктах питания, по мере
возможности выводить за пределы города экологически опасные производства, использовать приемы, позволяющие удалять уже накопившийся
кадмий из природных сред, а также повышать уровень общественной
осведомленности об условиях жизни в городе.
Выводы
1. Воздействие на организм самок белых крыс кадмия, относящегося к неблагоприятным экологическим факторам, вызывает выраженный дисбаланс в про-антиоксидантной системе: снижение активности
16
ферментов глутатионовой системы, уровня восстановленного глутатиона эритроцитов и активизацию свободнорадикальных процессов в тканях и плазме крови. Интоксикация сопровождается реализацией краткосрочных адаптационных механизмов, проявляющихся во временном
увеличении активности глутатионовой системы эритроцитов. Процессы
свободнорадикального окисления и уровень антиоксидантов стабилизируются с течением времени в плазме крови и печени, но не в сердце и
мозге самок крыс.
2. Кадмиевая интоксикация в пренатальный период характеризуется разнонаправленными изменениями в активности глутатионовой
системы эритроцитов у самок и самцов. У самок компенсаторное увеличение активности данной системы происходит ко второму месяцу жизни, а у самцов – только к четырехмесячному возрасту.
3. У двухмесячных самок и самцов при неонатальном воздействии
ионов Cd2+ снижается активность глутатионовой системы во всех исследованных тканях. У четырехмесячных животных после неонатальной
кадмиевой интоксикации активность глутатионовой системы увеличивается в печени и эритроцитах, а в мозге остается сниженной, но менее
значительно, чем в двухмесячном возрасте. Половые различия в реакции
изучаемой системы обнаружены в сердце и почках подопытных животных. У самцов наблюдается снижение активности глутатионовой системы, а у самок функционирование поддерживается на контрольном
уровне.
4. Воздействие ионов кадмия в неонатальный период сопровождается увеличением показателей индуцированной хемилюминесценции
и содержания СО у двух- и четырехмесячных крыс во всех тканях и
плазме крови. К четырем месяцам постнатального развития показатели
также остаются увеличенными, но в меньшей степени, чем у двухмесячных животных.
5. Продемонстрирован дозозависимый эффект кадмиевого воздействия в неонатальный период на активность глутатионовой системы,
уровень оксида углерода и показатели хемилюминесценции во всех изученных органах двухмесячных животных. К четырехмесячному возрасту
после токсического влияния сохраняется дозозависимый эффект в изменении активности γ-глутамилтрансферазы и глутатионредуктазы в эритроцитах и печени у самцов и глутатион-S-трансферазы во всех органах в
обеих гендерных группах.
6. В ответ на токсическое воздействие кадмия во время лактации
у двух- и четырехмесячного потомства наиболее значительно изменяются активность γ-глутамилтрансферазы, глутатионредуктазы и показатели
хемилюминесценции. Более сильные изменения изучаемых показателей
17
при воздействии кадмия происходят в мозге и почках экспериментальных животных, а печень и сердце на неонатальную интоксикацию реагируют менее выраженными изменениями.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
* – публикации в печатных изданиях перечня ВАК РФ
1. Слюзова О.В., Стрельникова Н.А., Степанова Е.В., Киреев Р.А.
Влияние ионов кадмия на метаболические показатели и проантиоксидантный статус самок белых крыс // Материалы VI международной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря». – Астрахань. – 2003. – С. 103 – 105.
2. Kireev R.A., Slyzova O.V., Stepanova E.V., Strelnikova N.A. Effect
cadmium ions on metabolic processes and pro-antioxidant status in female
rats // Abstracts Summer Meeting SFRR-2004 «Reactive oxygen species and
antioxidants». – Lodz, Poland. – 2004. – Р. 159 – 160.
3. Kireev R.A., Stepanova E.V., Slyzova O.V. Effect of prenatal exposure of cadmium ions on metabolic parameters, free radical scavenging system and lipid peroxidation in adult rat offspring // Abstract «Life Sciences
04». – Nova Gorica, Slovenia. – 2004. – Р. 144.
4. Слюзова О.В., Степанова Е.В., Киреев Р.А. Проантиоксидантный статус потомства самок белых крыс, подвергшегося
воздействию ионами кадмия в пренатальный период // Материалы II
съезда токсикологов Украины. – Киев. – 2004. – С. 46 – 47.
5. Слюзова О.В., Киреев Р.А. Состояние глутатионовой системы у
2-месячного потомства, подвергавшегося воздействию ионами кадмия в
пренатальный период. Эффективность применения препарата «Фитосоя» // Материалы V открытой окружной конференции молодых ученых
«Наука и инновации XXI века». – Сургут. – 2004. – С. 103 – 105.
6. Киреев Р.А., Слюзова О.В., Степанова Е.В., Бучарская А.Б.
Пренатальное влияние ионов кадмия на метаболические процессы и
про-антиоксидантный статус 4-месячного потомства самок белых крыс
// Естествознание и гуманизм. Сборник научных работ. – Томск. – 2004.
– Т. 1, № 3. – С. 50 – 52.
7. Степанова Е.В., Слюзова О.В., Бучарская А.Б., Киреев Р.А. Изменение показателей хемилюминесценции и гемограммы крови самок
белых крыс на фоне воздействия ионами кадмия // Материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск. –
2005. – С. 86 – 87.
8. Темралеева А.Д., Груздева М.С., Слюзова О.В., Чапурина Н.А.
Неонатальное опосредованное влияние кадмия на содержание восстановленного глутатиона, активность глутатион-S-трансферазы и состоя18
ние свободнорадикального окисления в тканях половозрелых самок беспородных белых крыс // Сборник статей VI Международной научной
конференции «Состояние биосферы и здоровье людей». – Пенза. – 2006.
– С. 165 – 167.
9. *Kireev R.A., Slyzova O.V., Stepanova E.V. Development of free
radical scavenging system and lipid peroxidation under the influence of gestational cadmium exposure // Toxicology Letters. – 2006. – Vol. 164, S. 1. –
P. 183 – 184.
10. *Kireev R.A., Stepanova E.V., Slyzova O.V., Solodovnikova E.I.,
Doroshenko L.V., Soldatova Y.V. Effect of nicotine on metabolic processes
and pro-antioxidant status in male rat: Age-related differences // Toxicology
Letters. – 2006. – Vol. 164, S. 1. – P. 133 – 134.
11. Темралеева А.Д., Слюзова О.В., Груздева М.С., Чапурина Н.А.
Отдаленное опосредованное влияние ионов кадмия на состояние про- и
антиоксидантной системы в тканях самок крыс // Материалы международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и
старение». – Астрахань. – 2006. – С. 90 – 95.
12. Слюзова О.В., Чапурина Н.А., Киреев Р.А. Свободнорадикальные процессы в тканях самок крыс на фоне неонатального воздействия ионов кадмия // Астраханский медицинский журнал. – 2007. – Т. 2,
№ 2. – С. 172 – 173.
13. Слюзова О.В., Груздева М.С., Плешакова Е.В. Снижение воздействия кадмийсодержащих токсичных веществ на живые организмы
// Энергосбережение в Саратовской области. – 2007. – Т. 28,
№ 2. – С. 24 – 26.
19
Слюзова Ольга Владимировна
ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ КАДМИЯ
НА АНТИОКСИДАНТНЫЕ ПРОЦЕССЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ БЕЛЫХ КРЫС
И ИХ ПОТОМСТВА
03.00.16 – экология
03.00.04 – биохимия
Автореферат
Корректор В.А. Рассомахина
_____________________________________________________________________
Подписано в печать 28.05.08. Формат 60841/16.
Бумага офсетная № 1. Гарнитура Times. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 321.
_____________________________________________________________________
Отпечатано в типографии ООО «Правильный вывод».
410710, Саратов, ул. Рабочая, 105.
20