Полешко Андрей Сергеевич
advertisement
На правах рукописи Полешко Андрей Сергеевич ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА МОДЕЛИ ВИРУСА САРКОМЫ ПТИЦ 03.00.04 – биохимия 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2008 Работа выполнена университет в ГОУ ВПО Новосибирский Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор государственный Покровский Андрей Георгиевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна кандидат биологических наук Чересиз Сергей Владимирович Ведущая организация: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Защита состоится «___» декабря 2008 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова 2, 630117, тел: (383) 333-54-81. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке исследовательского института биохимии СО РАН. ГУ Научно- Автореферат разослан «___» ноября 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Г.С. Русских 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Клеточные эпигенетические механизмы, включающие РНК-интерференцию, метилирование ДНК и модификации гистонов, участвуют в наследуемой регуляции экспрессии генов без изменения последовательностей ДНК. Исследования последних лет показали, что нарушение эпигенетической регуляции ряда генов приводит ко многим серьезным патологиям, включая онкологические заболевания, анемию, задержки умственного развития и др. Понимание причин возникновения таких заболеваний и поиск методов их лечения основаны на исследованиях биохимических механизмов эпигенетической регуляции, выявлению ферментов, ответственных за реактивацию, и разработке новых методов эпигенетической терапии (Egger G. et al, 2004). Кроме патологий, вызываемых нарушениями экспрессии клеточных генов, существует ряд инфекционных заболеваний, лечение которых тесно связано с эпигенетической регуляцией. Особенностью ретровирусных инфекций является наличие латентного резервуара инфицированных клеток, препятствующего элиминированию вируса из организма и полному излечению от ретровирусной инфекции. Исследование механизмов эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов необходимо для поиска новых подходов по реактивации инфицированных клеток, несущих латентный ретровирус. Используемые в настоящее время методы лечения ретровирусных инфекций основаны на высоко активной антиретровирусной терапии с применением комбинаций различных препаратов, ингибиторов вирусных белков и ферментов. Недостатками такого лечения являются: 1) сохранение в организме резервуара инфицированных клеток (несущих способную к реактивации латентную форму ретровируса); 2) длительная антивирусная терапия осложняется возможностью появления мутантных форм вируса, устойчивых к большинству используемых лекарственных препаратов. Наиболее перспективным направлением в лечении ретровирусных инфекций является применение антиретровирусной терапии совместно с активацией инфицированных клеток, несущих эпигенетически-молчащий интегрированный провирус, и составляющих вирусный резервуар. Такой подход позволяет элиминировать вирус из организма, за счет предотвращения ретровирусной репликации и удаления резервуара инфицированных клеток, в том числе несущих латентный ретровирус (Geeraert L. et al, 2008). Помимо проблемы латентных ретровирусных инфекций, изучение механизмов эпигенетического молчания ретровирусных генов является исключительно важным для генной терапии с применением векторов на основе ретровирусов. Поддержание продолжительной экспрессии «терапевтического» гена, доставленного ретровирусным вектором и 3 интегрированного в геном клетки-мишени, невозможно без понимания основных клеточных механизмов эпигенетической регуляции. Целью настоящей работы являлось создание модели, на основе клеточной линии HeLa, несущей интегрированный ретровирусный вектор, и последующее изучение механизмов эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов. В задачи настоящего исследования входило: Получить субпопуляцию клеток HeLa, несущих транскрипционно-молчащий интегрированный вектор на основе вируса саркомы птиц, кодирующий репортерный GFP ген. Оценить возможность использования данной клеточной линии для изучения механизмов эпигенетического контроля ретровирусов. Проверить возможность использования методов РНКинтерференции для изучения эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов. Оценить эффективность и специфичность нокдауна генов-мишеней посредством трансфекции клеток миРНК. Создать систему скрининга библиотек миРНК с высокой пропускной способностью для поиска клеточных генов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания. Осуществить скрининг библиотеки миРНК, содержащей потенциальные эпигенетические регуляторы, для определения клеточных генов, участвующих в поддержание эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов. На основе полученных данных создать модель эпигенетической регуляции экспрессии генов. Научная новизна и практическая значимость работы. Исследования последних лет показали, что нарушения механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов приводит к различным патологиям и заболеваниям, и кроме того затрудняет лечение ряда инфекционных заболеваний вызываемых ретровирусами. Поиск новых подходов для лечения этих заболеваний осложняется за счет отсутствия достаточных знаний о механизмах клеточного эпигенетического контроля и причинах, вызывающих его нарушения, а так же возможных методах эпигенетической терапии. На сегодняшний день для лечения ретровирусных инфекций, таких как вирус иммунодефицита человека, наиболее перспективными методами является применение антиретровирусной терапии совместно с активацией резервуара инфицированных клеток, несущих латентный ретровирус. Для реактивации латентных форм ретровирусов применяются ингибиторы 4 гистоновых деацетилаз и ДНК метилтрансфераз. Данные препараты имеют высокую активность, но также и высокую токсичность для клеток, что не позволяет им пройти клинические испытания и быть использованными в антиретровирусной терапии. Таким образом, исследование механизмов эпигенетического контроля ретровирусных генов совместно с поиском новых групп соединений, способных к реактивации латентных ретровирусов и обладающих низкой токсичностью, являются особенно актуальным. Положения, выносимые на защиту: Выделенная из клеточной линии HeLa, субпопуляция клеток HeLa ТИ, несущая транскрипционно-молчащий интегрированный ретровирусный вектор на основе вируса саркомы птиц, содержащий GFP репортерный ген под контролем различных промоторов, может быть использована как модель для изучения механизмов эпигенетического контроля экспрессии генов. Методы РНК-интерференции могут быть применены для поиска и определения клеточных генов участвующих в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. Продукты экспрессии генов HDAC1, DAXX и HP1γ, участвуют в поддержании эпигенетического молчания. Нокдаун этих генов приводит к реактивации ретровирусного репортерного гена. Клеточные гены SETDB1, CHAF1A, TRIM24, TRIM33, RAD21, PBRM1, ZMYND8, MBD1, MBD3, DNMT3a, RING1, PHC2, FBXL11, Suv420H2, JMJD2A, выявленные в ходе скрининга библиотеки миРНК, участвуют в эпигенетическом контроле экспрессии генов. На основе полученных данных предложена модель эпигенетического контроля ретровирусов. Апробация работы и публикации. Результаты работ были представлены на международных конференциях: «33rd Retroviruses meeting» (Колд Сприн Харбор, США, 2008), «Международная Студенческая Конференция XXXVIII» (Новосибирск, Россия. 2008), «12th Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2007), «32nd Retroviruses meeting» (Колд Сприн Харбор, США, 2007), «11th Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2006). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 31 рисунок, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а так же списка литературы (240 источников). 5 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Библиотека миРНК. В ходе исследований была использована библиотека миРНК «Epigenetics Set» (QIAGEN, США). Библиотека содержала 200 генов (две независимые миРНК против каждого генамишени). Культивирование клеток, выделение субпопуляции HeLa ТИ клеток. Популяция человеческих эпителиальных клеток HeLa была культивирована в культуральной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0.1 мг/мл стрептомицина и 1х фангазон. Клетки инкубировались при 37оС в присутствии 5% СО2. Сортировка клеток проводилась на проточном цитофлюориметре Becton Dickinson FACS-VantageSE. Анализ количества GFP-положительных клеток. Измерение уровня экспрессии GFP проводилось на проточном цитофлюорометре Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson, США) и Guava EasyCyte (Guava Technologies, США). Полученные данные обрабатывались при помощи программ FlowJo (Tree Star Inc, США) и CytoSoft (Guava Technologies, США). РНК-интерференция. В качестве трансфекционного реагента для трансфекции миРНК в клеточную линию HeLa использовался реагент DharmaFECT 1 (Dharmacon, США). Трансфекция клеток проводилась согласно протоколу компании производителя. Спустя 96 часов после начала трансфекции количество GFP-положительных клеток измерялось методами проточной цитофлюорометрии. Измерение эффективности нокдауна методом РНК-интерференции на уровне мРНК и белка проводилось после 48 и 72 часов с момента начала трансфекции, соответственно. Скрининг библиотеки миРНК. Скрининг был осуществлен с использованием трансфекционного реагента DharmaFECT 1, согласно протоколу компании изготовителя, оптимизированному для использования с 96-луночными плашками. Объем трансфекционной смеси в каждой лунке составлял 100 мкл, итоговая концентрация миРНК 50 нМ, количество клеток в лунке 5000. Плашки инкубировались при 37 оС с 5% CO2 в течении 48 часов, затем трансфекционная смесь заменялась на стандартную ростовую среду. Через 96 часов после начала трансфекции количество GFP-положительных клеток определялось с помощью методов проточной цитофлюорометрии. В качестве контролей использовались миРНК против HDAC1 и GAPDH, как положительный и отрицательный контроль, соответственно. 6 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение и анализ субпопуляции клеток HeLa несущих молчащий ретровирус, кодирующий репортерный GFP ген Популяция HeLa ТИ клеток, несущих молчащий ретровирусный GFP репортерный ген, была получена, как показано на Рисунке 1. Популяция человеческих HeLa клеток была инфицирована ретровирусным вектором, несущим GFP репортерный ген. После инфицирования клетки были отсортированы на GFP-отрицательный фенотип. Полученная клеточная субпопуляция содержала неинфицированные клетки и клетки с эпигенетически-молчащим репортерным GFP геном. После сортировки, субпопуляция GFP-негативных клеток была обработана ингибитором гистоновых деацетилаз – трихостатином А (TSA). Обработка проводилась с концентрацией TSA 500 нМ в течение 24 часов. Обработка клеток приводила к гиперацетилированию гистонов и активации молчащих генов, в том числе репортерного GFP гена. Через 48 часов после начала обработки клетки были отсортированы на GFP-положительный фенотип. Полученная клеточная субпопуляция содержала инфицированные клетки, с ранее молчащим GFP-репортерным геном. В течение последующих 10 дней происходило восстановление эпигенетической репрессии репортерного гена, и изменение фенотипа клеток на GFP-отрицательный. Затем клетки вновь были отсортированы на GFP-негативный фенотип. Таким образом, в итоге была получена Трихостатин А Индуцируемая (ТИ) субпопуляция HeLa клеток, несущая молчащий ретровирусный репортерный ген. Подобная процедура получения HeLa ТИ клеток была проделана с ретровирусными векторами несущими репортерный GFP ген под контролем CMV промотора (HeLa ТИ CMV), нативного вирусного LTR промотора (HeLa ТИ LTR), и клеточного промотора EF1α (HeLa ТИ EF1α). Из полученной субпопуляции HeLa ТИ CMV клеток было выделено 11 индивидуальных клеточных клонов (HeLa CMV ТИ1 - ТИ11). 7 Инфицированные HeLa клетки HeLa клетки GFP+ инфицирование ретровирусом несущим репортерный GFP ген Сортировка на GFPотрицательный фенотип GFPHeLa ТИ клоны Обработка Трихостатином А выделение индивидуальных клонов Сортировка на GFPположительный фенотип Сортировка на GFPотрицательный фенотип ~10 дней GFP(+) ТИ клетки GFP (-) Рисунок 1. Стратегия получения субпопуляции HeLa ТИ клеток, несущих эпигенетическимолчащий интегрированный ретровирус, кодирующий репортерный GFP ген. 2. Применение методов РНК-интерференции для поиска клеточных генов участвующих в поддержании эпигенетического молчания Ввиду того, что трихостатин А имеет широкий спектр ингибирования гистоновых деацетилаз 1-го (широкораспространенного) и 2-го (тканеспецифического) класса, были использовали методы, основанные на РНК-интерференции, для специфического нокдауна различных генов, представителей семейства гистоновых деацетилаз, с целью выявления конкретных представителей семейства, участвующих в поддержании ретровирусного эпигенетического молчания. Представители семейства гистоновых деацетилаз 1-го класса (HDAC1, HDAC2 и HDAC3) являются потенциальными кандидатами, участвующими в поддержании эпигенетического молчания, кроме того, для некоторых из них ранее было показано взаимодействие с ретровирусной ДНК после интеграции в геном клетки хозяина (Greger J.G. et al, 2005). Экспрессия гистоновой деацетилазы 4 (HDAC4), представителя 2-го класса, является 8 тканеспецифичной, однако, ранее была показана экспрессия HDAC4 в HeLa клетках (Greger J.G. et al, 2005). В первоначальном эксперименте была осуществлена попытка повторить эффект ингибитора гистоновых деацетилаз Трихостатина А с помощью нокдауна генов-мишеней посредством трансфекции HeLa ТИ-CMV клеток специфичной миРНК. Клетки были трансфецированны специфическими пулами миРНК («SMARTpool», Dharmacon, США), состоящими из смеси четырех независимых миРНК. Как показано на рисунке 2, трансфекция субпопуляции ТИ-CMV клеток пулом миРНК против HDAC1 приводит к появлению значительного числа клеток экспрессирующих репортерный GFP ген, в то время как трансфекция миРНК против HDAC2, HDAC3 и HDAC4 не приводит к сколько либо значимой реактивации. Ранее была показана роль белка DAXX в связывании с ретровирусным преинтеграционным комплексом и инициации эпигенетического молчания после интеграции ретровирусной ДНК в геном клетки хозяина (Greger J.G. et al, 2005). Трансфекция субпопуляции ТИ-CMV клеток пулом миРНК специфичным к DAXX приводит к реактивации эпигенетическимолчащего ретровирусного репортерного гена (рисунок 2). % GFP(+) клеток 60 50 40 30 20 10 0 NT HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC4 DAXX миРНК Рисунок 2. Нокдаун белков HDAC1 и DAXX приводит к реактивации молчащего репортерного GFP гена. NT – нетрансфецированые клетки. Для подтверждения специфичности нокдауна посредством миРНК был проанализирован уровень мРНК и белкового продукта генов-мишеней. Результаты ОТ ПЦР в реальном времени показали, что трансфекция клеток миРНК приводит к значительному (более 80%) снижению уровня мРНК гена-мишени (рисунок 3а). Определение количества белка методом Вестерн Блот подтвердило нокдаун гена-мишени на уровне белкового продукта (рисунок 3б). Полученные результаты подтвердили специфичность нокдауна гена-мишени на уровне мРНК и белкового продукта, а так же отсутствие неспецифического влияния на изменение уровней мРНК других генов (рисунок 3а). 9 HDAC1 мРНК 1,2 HDAC2 мРНК HDAC3 мРНК HDAC4 мРНК DAXX мРНК 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 DF1 HDAC1 HDAC2 HDAC4 DAXX siControl Mock HDAC2 Mock siControl DAXX GAPDH GAPDH GAPDH Mock siControl HDAC2 HDAC4 HDAC1 siControl HDAC3 HDAC1 Mock DAXX миРНК Б Mock HDAC3 siControl Относительный уровень мРНК А HDAC3 HDAC4 GAPDH GAPDH Рисунок 3. Определение специфичности нокдауна гена посредством трансфекции миРНК. В качестве одного из потенциальных кандидатов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания, был проанализирован белок гетерохроматина 1 (HP1). В клетках млекопитающих данный белок представлен тремя изоформами: HP1-альфа (HP1α), HP1-бета (HP1β) и HP1-гамма (HP1γ). Для определения возможной роли различных изоформ данного белка в поддержании эпигенетического молчания клеточная линия HeLa ТИ клеток была трансфецирована пулами миРНК против изоформ белка HP1. Как показано на рисунке 4, нокдаун белка HP1γ приводит к реактивации молчащего репортерного гена, в то время как нокдаун других изоформ HP1α и HP1β, не вызывает увеличения GFPположительных клеток более, чем трансфекционный реагент (DF1). Ввиду 10 % GFP(+) клеток высокой гомологичности изоформ белка HP1, для подтверждения специфичности миРНК против конкретной изоформы белка HP1 был проведен анализ нокдауна белковых продуктов методом Вестерн Блот (рисунок 4). Полученные результаты подтвердили специфичность миРНК против гена мишени, а также отсутствие изменений количества других изоформ. 50 40 30 20 10 0 NT DF1 HP1β HP1α HP1γ HDAC1 siControl HP1α миРНК: Mock siControl GAPDH HP1γ+GAPDH HP1γ HP1β HP1α миРНК GAPDH GAPDH HP1β HP1α HP1γ Рисунок 4. Анализ роли изоформ белка HP1 гамма в поддержании эпигенетического молчания. Для полного анализа и характеристики клеточной популяции HeLa ТИ клеток на наличие потенциальных неспецифических эффектов после трансфекции миРНК, была произведена трансфекция клеток специально разработанными контрольными миРНК, не имеющими мРНК-мишени. В ходе эксперимента, было показано, что контрольные миРНК не вызывают сколько либо значительного эффекта, что, в свою очередь, говорит об отсутствии неспецифического клеточного ответа на трансфекцию миРНК, и подтверждает возможность использования миРНК нокдауна в данной клеточной линии. 11 % GFP(+) клеток 3. Влияние положения сайта интеграции на реактивацию молчащего ретровируса Полученные в ходе клеточной сортировки индивидуальные клоны клеточной популяции HeLa ТИ были исследованы для определения влияния сайтов интеграции на механизм эпигенетического молчания, а так же уровень реактивации репортерного GFP гена. Ранее, с помощью реакции ПЦР в реальном времени было показано, что популяция ТИ клеток имеет не более одной копии интегрированной ретровирусной ДНК на клетку. Таким образом, предполагается наличие одной копии ретровирусной ДНК и в индивидуальных клонах, выделенных из популяции ТИ клеток. DMSO 500 нМ TSA 50 40 30 20 10 0 Т И-1 Т И-2 Т И-3 Т И-5 Т И-6 Т И-7 Т И-8 Т И-9 Т И-10 Т И-11 Трансфекционный реагент миРНК HDAC1 миРНК HDAC2 миРНК HDAC3 миРНК HDAC4 миРНК DAXX 70 % GFP(+) клеток Т И-4 60 50 40 30 20 10 0 ТИ-1 ТИ-2 ТИ-3 ТИ-4 ТИ-5 ТИ-6 ТИ-7 ТИ-8 ТИ-9 ТИ-10 Рисунок 5. Анализ реактивации молчащего репортерного гена в индивидуальных клонах Как показано на рисунке 5, обработка трихостатином А приводит к реактивации репортерного гена во всех клонах ТИ клеток, но с разным уровнем интенсивности. В свою очередь, нокдаун HDAC1 при помощи миРНК, приводит к реактивации репортерного гена во всех клонах, повторяя эффект трихостатина А. Однако, нокдаун белка DAXX приводит к значимой реактивации в 6 из 10 клонов. Основываясь на полученных результатах, мы предполагаем, что HDAC1 и, в большинстве случаев, 12 DAXX участвуют в поддержании ретровирусного эпигенетического молчания в независимых участках клеточного генома, однако, положение сайта интеграции может влиять на интенсивность реактивации эпигенетического молчания. В экспериментах, описанных ранее, молчащий TSA-чувствительный репортерный ген GFP был под контролем промотора цитомегаловируса человека hCMV. Для того чтобы определить зависимость полученных результатов от типа промотора, были протестированы клеточные субпопуляции с ретровирусным векторами, несущими молчащий репортерный GFP ген был под контролем нативного ретровирусного ASV LTR промотора и клеточного промотора EF1α. Клеточные линии HeLa ТИ с различными ретровирусными векторами были трансфецированы контрольной миРНК и миРНК против HDAC1. Как показано на рисунке 6, во всех случаях нокдаун HDAC1 приводит к реактивации экспрессии ретровирусного репортерного GFP гена. Разница в количестве GFPположительных клеток в разных клеточных линиях объясняется тем, что промоторы LTR и EF1α обладают меньшей транскрипционной активностью, в сравнении с промотором hCMV. % GFP(+) клеток 60 50 40 30 20 10 0 RISC+ Промоторы: HDAC1 hCMV RISC+ HDAC1 ASV LTR RISC+ HDAC1 EF1a миРНК Рисунок 6. Анализ популяции HeLa ТИ клеток несущих молчащий репортерный ген GFP под контролем различных промоторов. 4. Экспрессия вирусных белков-антагонистов приводит к реактивации эпигенетически-молчащего ретровируса Известны некоторые вирусные белки, способные связывать и ингибировать гистоновые деацетилазы (Chiocca S. et al, 2002; Saffert R.T. et al, 2006). Эти белки могут действовать как антагонисты и защищать вирусный геном от эпигенетической репрессии посредством гистоновых деацетилаз, подтверждая участие последних в клеточном антивирусном ответе. Было показано, что белок птичьего аденовируса Gam-1 способен 13 ингибировать HDAC1 (Chiocca S. et al, 2002), кроме того, была описана роль вирусного белка pp71 в ингибировании белка DAXX, путем связывания и дальнейшей протеосомной деградации (Kalejta et al, 2007). Как показано на рисунке 7, трансфекция популяции ТИ клеток плазмидной ДНК, кодирующей дикий тип белков Gam-1 и pp71, приводит к значительному увеличению числа клеток, экспрессирующих репортерный GFP ген, в то время как мутантные формы белков вызывают незначительный эффект. Таким образом, полученные данные независимо подтверждают роль белков HDAC1 и DAXX в поддержании ретровирусного эпигенетического молчания. 50 30 40 % GFP(+) клеток % GFP(+) клеток 60 30 20 10 0 Mock Gam-1 wt 25 20 15 10 5 0 Mock Gam-1 mt pp71 wt pp71 mt1.3 pp71 mt2.3 Рисунок 7. Реактивация молчащего гена GFP после трансфекции векторами, несущими вирусные белки-антагонисты. 5. Создание системы скрининга библиотек миРНК с высокой пропускной способностью Результаты экспериментов, описанных выше, подтвердили возможность использования полученной субпопуляции HeLa ТИ клеток для исследования механизмов регуляции ретровирусного эпигенетического контроля, а так же показали возможность применения методов РНК интерференции для поиска клеточных генов, участвующих в поддержании эпигенетического транскрипционного молчания. С учетом современных технологий, доступных в области РНК интерференции, в частности специфического нокдауна генов посредством трансфекции миРНК, была разработана система скрининга библиотек миРНК с высокой пропускной способностью для поиска клеточных генов, вовлеченных в эпигенетическую регуляцию ретровирусных генов. Система скрининга была разработана с использованием 96-луночных планшетов, а так же механизированных систем автоматического нанесения образцов. В ходе скрининга миРНК переносилась на 96-лучночный планшет, где смешивалась с трансфекционным реагентом, после чего к готовой трансфекционной смеси добавлялись HeLa ТИ клетки (рисунок 8). 14 Количество GFP-положительных клеток в образцах после миРНК нокдауна анализировалось на 96-луночном проточном цитофлюориметре. миРНК миРНК библиотека Трансфекция HeLa ТИ клеток 100 75 50 A B C D E F G H 25 % GFP(+) клеток 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Анализ количества GFP-положительных клеток - положительный (HDAC1) и отрицательный (GAPDH) контроли - отсутствие реактивации после нокдауна белка мишени - Реактивация репортерного гена после нокдауна белка мишени HDAC 1 GAPD H Рисунок 8. Схема системы скрининга с высокой пропускной способностью библиотек миРНК для поиска клеточных генов участвующих в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. 6. Скрининг библиотеки миРНК, содержащей известные клеточные эпигенетические регуляторы Для скрининга HeLa ТИ клеток с целью определения факторов, участвующих в поддержании ретровирусного эпигенетического молчания, 15 была использована библиотека, созданная в сотрудничестве с Петером Адемсом (Peter D. Adams, Fox Chase Cancer Center), содержащая миРНК против 200 генов, с известными или предполагаемыми функциями в эпигенетической регуляции экспрессии генов. В данную библиотеку входят известные белки-модификаторы хроматина, ДНК метилтрансферазы, транскрипционные факторы, факторы, участвующие в клеточном ответе на повреждение цепей ДНК и др. Библиотека представлена двумя независимыми миРНК против каждого гена. 80 70 % GFP(+) клеток 60 50 40 30 20 10 0 80 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181 191 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181 191 70 % GFP(+) клеток 60 50 40 30 20 10 0 Рисунок 9. Скрининг библиотеки миРНК с целью поиска клеточных факторов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания (HeLa ТИ-CMV). На рисунке 9 показаны результаты скрининга HeLa ТИ клеток двумя независимыми миРНК против каждого гена-мишени (верхняя и нижняя панели). Как видно из результатов скрининга, для части генов реактивация репортерного GFP гена подтверждена двумя независимыми миРНК (отмечены на рисунке), в то время как в другой части генов реактивация происходила после трансфекции только одной из двух миРНК для генамишени. В качестве контролей в ходе первичного скрининга были использованы миРНК против HDAC1 и GAPDH, как положительный и отрицательный контроль, соответственно. Критерием отбора генов, потенциальных участников ретровирусного эпигенетического молчания, было увеличение процента GFP-положительных клеток до 15% в популяции ТИ-СMV клеток либо 7.5% в популяции ТИ-LTR клеток (для одной из двух миРНК против гена-мишени), увеличение в 10 раз и в 3 раз относительно фонового уровня, соответственно. Из 200 генов, составляющих библиотеку эпигенетических факторов, для повторного 16 скрининга с четырьмя независимыми миРНК было отобрано 28 генов, соответствующих обозначенному критерию. Для скрининга 28 генов, отобранных в ходе предварительного скрининга, была использована библиотека миРНК, содержащая четыре независимые миРНК против каждого гена. Повторный скрининг был произведен на популяциях HeLa ТИ-CMV и HeLa ТИ-LTR клеток в ходе трех независимых экспериментов. Критерием «положительной миРНК» (вызывающей значимую реактивацию) являлось увеличение GFPположительных клеток более чем в 10 (3) раз, а так же значение статистического параметра p<0.0001 (p<0.01) для HeLa ТИ-CMV (ТИ-LTR) клеток, соответственно. Критерием «положительного гена» (нокдаун которого приводит к реактивации репортерного гена) было наличие двух и более «положительных» миРНК против данного гена. Реактивация репортерного гена 80 Отсутствие значимого эфекта % GFP(+) клеток 70 60 50 40 30 20 10 Реактивация репортерного гена 80 2 D M B D 3 X7 C M B 1 B A 30 0 M G H EP R M 1 21 D R PB A IM 33 TF 2 TR A XL 11 FB D 8 TM 3A N D IM 24 ZM YN 1 TD TR B F1 A SE A H C G H A D A PD C 1 H 0 Отсутствие значимого эфекта % GFP(+) клеток 70 60 50 40 30 20 10 SF 1a A 2 TM 2 EH C1 A 42 0H V SU 1 G IN R SM M B D 1 2 B TD SE 2C JM JD 2A JM JD M 2 D PR IM 28 TR 2 C PH X TR A 3 D LE 3 PO A R B IR H A G H D A PD C 1 H 0 Рисунок 10. Вторичный скрининг генов, выявленных в ходе первичного скрининга, с использованием четырех независимых миРНК против гена-мишени (HeLa ТИ-CMV). Из 28 генов отобранных для вторичного скрининга 15 генов соответствовало критерию «положительного» гена в популяциях ТИ-CMV и ТИ-LTR клеток (рисунок 10). Остальные 13 генов имели всего одну «положительную» миРНК, что говорит о ее ложноположительном 17 результате, либо ни одной миРНК, соответствующей обозначенному критерию. На таблице 1 представлены клеточные гены, участвующие в поддержании эпигенетического молчания, выявленные в ходе скрининга библиотеки миРНК на популяциях HeLa ТИ-CMV и HeLa ТИ-LTR клеток. Ген CHAF1A SETDB1 TRIM24 RAD21 PBRM1 ZMYND8 MBD3 MBD1 RING1 HPH2 Suv420H2 JMJD2A FBXL11 DNMT3A TRIM33 Функция в клетке Фактор сборки хроматина 1, субъединица А (p150) H3K9 гистоновая метилтрансфераза, репрессор транскрипции Транскрипционный фактор TIF1alfa, ко-репрессор транскрипции Когезин, участвует в репарации двухцепочечных разрывов ДНК Полибромопротеин 1, часть комплекса модификации хроматина PBAF Протеин-киназа С связывающийся белок, регулятор транскрипции ДНК метил-CpG связывающийся белок, репрессор транскрипции ДНК метил-CpG связывающийся белок, репрессор транскрипции Компонент поликом комплекса, роль в моно убиквитинилировании гистона H2AK119, транскрипционный репрессор Компонент поликом комплекса, роль в моно убиквитинилировании гистона H2AK119 H4K20 гистоновая метилтрансфераза, репрессор транскрипции H3K36 гистоновая деметилаза, репрессор транскрипции H3K36 гистоновая деметилаза, репрессор транскрипции de novo ДНК метилтрасфераза Транскрипционный фактор TIF1gamma, репрессор транскрипции Таблица 1. Клеточные гены, участвующие в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. 7. Изучение влияния положения сайта интеграции на клеточные механизмы, контролирующие эпигенетическое молчание В предыдущих экспериментах (рисунок 5) было исследовано влияние положения сайта интеграции на механизмы поддержания эпигенетического молчания с участием белков HDAC1 и DAXX. На четырех независимых HeLa ТИ-CMV клонах была исследована реактивация молчащего ретровируса после нокдауна некоторых генов, выявленных в ходе скрининга. На рисунке 12 показаны результаты нокдауна генов CHAF1A, SETDB1, MBD3, TRIM33, RAD21, RING1 и Suv420H2 в клонах ТИ-1, ТИ-2, ТИ-3 и ТИ-4. Как видно из результатов эксперимента, все гены, проанализированные в ходе эксперимента, участвуют в поддержании ретровирусного эпигенетического молчания независимо от сайта интеграции (рисунок 11). Стоит отметить, что результаты эксперимента показывают низкую активность реактивации для клона ТИ-4 в случае нокдауна всех анализируемых факторов, что может 18 быть причиной особенности сайта интеграции и, по-видимому, является особенностью данного клона. Тем не менее, стоит упомянуть интересную особенность реактивации, наблюдаемую после нокдауна гена MBD3 в различных клонах. В случае клонов ТИ-10 и ТИ-11 наблюдается высокая реактивация (около 50%), в случае ТИ-1 и ТИ-4 клонов, напротив, реактивация не превышает 15%. Учитывая функцию данного белка в связывании с метилированной ДНК и репрессии транскрипции, предполагается, что метилирование ДНК интегрированного ретровирусного вектора характерно не во всех случаях, и вероятно зависит от положения сайта интеграции. Эти данные частично объясняют относительно низкую реактивацию, наблюдаемую после нокдауна ДНК метилтрансферазы DNMT3a (рисунок 10). клон ТИ-1 80 клон ТИ-4 клон ТИ-10 клон ТИ-11 % GFP(+) клеток 70 60 50 40 30 20 10 0 NT RISC+ HDAC1 CHAF1A SETDB1 MBD3 TRIM33 RAD21 RING1 Suv420H2 миРНК Рисунок 11. Реактивация молчащего репортерного GFP гена после трансфекции миРНК индивидуальных HeLa ТИ клонов. Таким образом, полученные данные подтвердили гипотезу о том, что описанные гены, и, следовательно, их белковые комплексы, участвуют совместно в процессе поддержания ретровирусного эпигенетического молчания независимо от положения сайта интеграции. Однако, полученные данные подразумевают, что метилирование промотора, контролирующего репортерный ген, возможно зависит от положения сайта интеграции. Тем не менее, утверждение о зависимости метилирования интегрированной ретровирусной ДНК от положения сайта интеграции требует более детального изучения и дальнейших экспериментов. 8. Модель ретровирусного эпигенетического молчания Для обобщения полученных данных была предложена модель эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов, согласно известным либо предполагаемым функциям найденных генов (рис. 12). 19 Один из комплексов, участвующий в поддержании эпигенетического ретровирусного молчания - комплекс белков: SETDB1 – MBD - CHAF1A DNMT. Данный репрессорный комплекс формируется во время S фазы клеточного цикла (Sarraf et al, 2004), и участвует в переносе эпигенетических маркеров на дочерние цепи хроматина во время репликации ДНК (рисунок 12в). В данный комплекс входят белки, участвующие в распознавании метилированной ДНК (MBD), необходимые для специфической посадки комплекса, H3K9 гистоновая метилтрансфераза SETDB1 и ДНК метилтрансферазы (DNMT), переносящие эпигенетические маркеры на дочерние цепи ДНК и хроматин, а также фактор ассоциации хроматина CHAF1A, осуществляющий сборку комплекса во время S фазы клеточного цикла. Рисунок 12. Модель эпигенетической регуляции экспрессии ретровирусных генов. В другой комплекс, участвующий в поддержании эпигенетического молчания, входят белки RING1 и PHC2 (рисунок 12в). Данный комплекс участвует в моноубиквитинилировании лизина K119 на гистоне H2A, и является репрессором транскрипции. Убиквитинилирование гистона H2A приводит к гипоацетилированию хроматина, привлечению корепрессоров 20 транскрипции, и последующему транскрипционному молчанию. Однако, нокдаун факторов, поддерживающих убиквитинилированное состояние гистона H2A или обработка клеток протеосомным ингибитором MG132 приводит к деубиквитинилированию гистона H2A, а также привлечению гистоновых ацетилтрансфераз, и последующей активацией хроматина. Также предполагается участие в эпигенетическом молчании ретровирусов комплекса белков: TRIM24/33 - SETDB1 - HDAC1 - HP1. Последние исследования продемонстрировали роль комплекса TRIM28SETDB1-HDAC1-HP1 в эпигенетической репрессии транскрипции вируса лейкемии мышей (MLV). Механизм действия данного комплекса заключается в узнавании праймер-связывающего сайта интегрированного провируса и последующего привлечения ДНК метилтрансфераз, гистоновых деацетилаз и белка хроматина первого типа, модифицирующих хроматин в районе интеграции провируса (рисунок 12б). Мы предполагаем существование подобного механизма эпигенетической репрессии комплексом, основанным на белках TRIM33 и TRIM24. Существующие данные о семействе TRIM-белков говорят о высокой гомологии белков TRIM24, TRIM28, TRIM33, а так же сходной доменной структуре, предполагая наличие сходных функций в инициализации эпигенетического транскрипционного молчания ретровирусов. Оставшиеся факторы, выявленные в ходе миРНК скрининга, являются либо транскрипционными факторами DAXX, RAD21 и др. (рисунок 12а), либо гистоновыми модификаторами (FBXL11, JMJD2A, Suv420H2), привлекаемыми описанными выше комплексами и транскрипционными факторами для модифицирования хроматина (рисунок 12в). Выводы 1. Была получена субпопуляция клеточной линии HeLa (HeLa ТИ), несущая транскрипционно-молчащий интегрированный ретровирусный вектор на основе вируса саркомы птиц, содержащий GFP репортерный ген под контролем различных промоторов (LTR, CMV и EF1a), как модель для изучения механизмов эпигенетической регуляции экспрессии гена. При обработке клеток HeLa ТИ ингибитором гистоновых деацетилаз трихостатином А происходит реактивация транскрипционно-молчащего репортерного гена. 2. Трансфекция HeLa ТИ клеток различными миРНК выявила отсутствие неспецифической реактивации репортерного гена и высокую 21 эффективность нокдауна гена-мишени на уровне мРНК и белкового продукта. С использованием методов миРНК-нокдауна было установлено, что продукты экспрессии генов HDAC1, DAXX и HP1γ, участвуют в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. 3. Разработана система скрининга библиотек миРНК для поиска клеточных генов потенциально участвующих в эпигенетической регуляции экспрессии генов. Определены статистические параметры воспроизводимости и чувствительности системы скрининга: коэффициент корреляции - r (0,98±0,01); статистический параметр Z’ (0,8±0,03). 4. Скрининг библиотеки миРНК «Epigenetics Set» (QIAGEN), содержащей известные факторы, потенциально участвующие в эпигенетической регуляции, выявил 15 генов (SETDB1, CHAF1A, TRIM24, TRIM33, RAD21, PBRM1, ZMYND8, MBD1, MBD3, DNMT3a, RING1, PHC2, FBXL11, Suv420H2, JMJD2A), участвующих в поддержании эпигенетического молчания ретровирусных генов. 5. На основе полученных данных предложена модель эпигенетического контроля экспрессии ретровирусных генов, включающая найденные транскрипционные факторы, ко-репрессоры транскрипции и ферменты модифицирующие хроматин. Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях: 1. А.С. Полешко, Р.А. Катз, А.М. Скалка, А.Г. Покровский. Механизмы ретровирусного эпигенетического молчания // Вестник Новосибирского Государственного Университета: Биология и клиническая медицина. – 2008. - Т.6. – №.3. – C. 3-11. 2. Poleshko, A., Palagin, I., Zhang, R., Boimel, P., Castagna, C., Adams, P.D., Skalka, A.M. and Katz, R.A. Identification of cellular proteins that maintain retroviral epigenetic silencing: evidence for an anti-viral response // Journal of Virology. – 2008. – Vol.82. - N.5. – P.2313-2323. 3. А.С. Полешко. Изучение эпигенетических механизмов транскрипционного молчания. Материалы XLVI Международной Научной Студенческой Конференции, Новосибирск, Россия, 26-30 Мая 2008. 4. Andrey Poleshko, Margret B. Einarson, Peter D. Adams, Anna Marie Skalka and Richard A. Katz. siRNA screening identifies host factors that 22 maintain retroviral epigenetic silencing. Abstract book of «33rd Cold Spring Harbor Retrovirus meeting», Cold Spring Harbor, 19-24 May 2008. 5. Andrey Poleshko, Margret Einarson, Anna Marie Skalka and Richard A. Katz. Development of a high throughput assay for identification of proteins that maintain epigenetic silencing. Abstract book of «Fox Chase Cancer Center 12th Annual Postdoctoral and Graduate Student research conference», Philadelphia, 1 June 2007. 6. Poleshko, A., Palagin, I., Zhang, R., Boimel, P., Castagna, C., Adams, P.D., Skalka, A.M. and Katz, R.A. Identification of host factors that maintain retroviral epigenetic silencing: evidence for an antiviral response. Abstract book of «32nd Cold Spring Harbor Retrovirus meeting», Cold Spring Harbor, 22-29 May 2007. 7. Poleshko, A., Katz, R.A., Zhang, R., Adams, P.D., Skalka, A.M. Development of a high throughput assay for reactivation of epigenetically silenced genes. Abstract book of «Fox Chase Cancer Center 11th Annual Postdoctoral and Graduate Student research conference», Philadelphia, June 2, 2006. Список сокращений GFP ASV LTR CMV TSA H3, H4, H2A/B РНКи миРНК - зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein) - вирус саркомы птиц (Avian Sarcoma Virus) - длинные концевые повторы (Long Terminal Repeat) - цитомегаловирус (Cytomegalo Virus) - трихостатин А (Trichostatin A) - гистоны H3, H4, H2A, H2B - РНК-интерференция - малая интерфирирующая РНК Благодарности Автор благодарит ближайших коллег, оказавших помощь в подготовке данной работы, и персонально выражает благодарность Пустыльняку В. О. (НИИМББ СО РАМН, Новосибирск) за моральную поддержку и дружеское участие при работе над диссертацией, Покровского А. Г. за научное руководство работой. Соискатель Полешко А. С. 23
