На правах рукописи МУРАВЬЕВА АННА БОРИСОВНА КОРРЕКЦИЯ ЕСТЕСТВЕННЫМИ АДАПТОГЕНАМИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 03.01.04. – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г.Ставрополь). Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент Эльбекьян Карине Сергеевна Официальные оппоненты: Главный научный сотрудник отдела медико биологических проблем РНИИАП, доктор биологических наук Друккер Нина Александровна Профессор кафедры внутренних болезней с основами общей физиотерапии, врач-эндокринолог, доктор медицинских наук Джериева Ирина Саркисовна. Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России Защита диссертации состоится «24» сентября 2014 г. в «13» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1, акт.зал). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Зоря, 21 Ж. Автореферат разослан «___»________ 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Сахарный диабет является полигенным заболеванием, в патогенезе которого значительное место отводится как наследственным, так и внешним, средовым факторам. Распространённость и заболеваемость сахарным диабетом продолжают увеличиваться (Кудрякова С.В. и др., 2001), и, по уточнённым данным экспертов ВОЗ, к 2025 году в мире будет насчитываться более чем 380 млн. больных сахарным диабетом (IDF, 2011; Дедов И.И., Балаболкин М.И., 2005). По определению ВОЗ, сахарный диабет (СД) – это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся хронической гипергликемией, которая является результатом нарушения секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов. Хроническая гипергликемия, являющаяся основным и объективным признаком наличия сахарного диабета, осуществляется инициацией нескольких биохимических процессов, к которым относят: окислительный стресс (GiuglianoD., 1996; TappiaP.S., 2006; Дедов И.И., Балаболкин М.И., 2003; Недосугова Л.В., 2006; Джериева И.С., 2012), избыточное образование конечных продуктов гликирования (Ahmed N.,2005; Kasradze D., 2010) и нарушение обмена липопротеинов (LeeA. Y., 1999, Kozakiewicz M., 2009). Нарушение гомеостаза при сахарном диабете сопровождается изменением и в обмене микроэлементов (Джукенова А.М., 2007), которые являются важными участниками обменных процессов. Снижение чувствительности тканей к избыточному действию инсулина и/или торможение процессов его секреции можно рассматривать как проявление адаптации организма к изменившимся внутренним условиям. В последние годы внимание исследователей привлекают адаптогенные свойства целого ряда натуральных веществ. Как известно, к адаптогенам относят биологически активные вещества естественного (в основном, растительного) происхождения, стимулирующие способность организма противостоять внешним и внутренним неблагоприятным факторам среды (Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2012; Сейфулла Р.Д., Кондрашин И.М., 2011). И сегодня по-прежнему остро стоит проблема поиска такого рода средств с целью повышения адаптивных возможностей организма человека в разных ситуациях. Действующие начала некоторых лекарственных растений, относимых к разряду адаптогенов (женьшень, радиола, элеутерококк и др.), обладают широким спектром фармакологической активности. Помимо центральных 3 (антистрессорных, психотонизирующих, ноотропных) свойств, они влияют на деятельность различных внутренних органов (Арушанян Э.Б., 2006), проявляя, в том числе, и отчётливую противодиабетическую активность. За последние годы в медицинской науке резко возрос интерес к изучению лечебных возможностей гормона мозговой железы эпифиза – мелатонина. В круг его терапевтических возможностей входят разного рода патологии: органические поражения головного мозга (Арушанян Э.Б., 2012), заболевания желудочно-кишечного тракта (РапопортС.И, 2012; РахимоваО.Ю., 2012), сердечно-сосудистые заболевания (Джериева И.С., 2012). Эпифизарный гормон мелатонин обладает и универсальными адаптогенными свойствами (Mertz W., 1987; Huang Y.C., 2005; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2012), которые реализуются на самых разных функциональных уровнях и затрагивают большинство органов и систем. Будучи естественным хронобиотиком, мелатонин оказывает ритморганизующее влияние на патологически изменённые колебания любых физиологических функций (Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2009; Джериева И.С., 2012). Все вышеизложенное в совокупности определило цель и основные задачи настоящего исследования. Цель работы. Экспериментальное изучение фармакологической активности мелатонина и тонизида на модели декомпенсированного сахарного диабета, а также сравнительная оценка их антидиабетических свойств. Задачи исследования: 1.Изучить дозозависимые эффекты диабетогена аллоксана в отношении: – показателей, характеризующих клиническую картину заболевания (летальность животных; масса тела, потребление воды, диурез); – уровня содержания глюкозы и длительности гипергликемического периода; – процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ); – содержания макро- и микроэлементов. 2. На модели аллоксанового диабета оценить влияние адаптогенов на углеводный и липидный обмены. 3.Оценить влияние мелатонина и тонизида на антиоксидантный статус лабораторных животных с аллоксановым диабетом. 4.Изучить состояние элементного гомеостаза животных с аллоксаниндуцированным сахарным диабетом при использовании мелатонина и тонизида. 4 5.Сопоставить фармакологические эффекты адаптогенов животного (мелатонина) и растительного (тонизид) происхождения. Научная новизна. 1. Впервые проведена комплексная оценка эффективности использования препаратов мелатонина и тонизида в условиях экспериментального декомпенсированного СД. Установлено, что изученные адаптогены оказывают нормализующее влияние на патологические изменения углеводного и липидного обменов, процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему защиты организма у аллоксан-индуцированных животных, причем более выраженное влияние оказывает мелатонин. 2. Впервые установлено, что введение мелатонина и тонизида способствует коррекции минерального обмена в условиях модели декомпенсированного СД. 3. В условиях экспериментальной модели СД впервые установлена достоверная положительная корреляция между уровнем гликированного гемоглобина, липопротеинов низкой плотности и нарушениями в микроэлементном составе сыворотки крови (по уровню меди и цинка). Практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о перспективности использования препаратов антиоксидантно-метаболического действия (мелатонина и тонизида) в комплексной терапии СД. Количественные изменения макро- и микроэлементов и их корреляционные связи с про- и антиоксидантным статусом могут стать дополнительным признаком декомпенсированного СД. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Экспериментальная модель аллоксан-индуцированного СД позволяет воспроизвести состояние, проявляющееся гипергликемией, нарушением липидного обмена, развитием окислительного стресса и декомпенсацией элементного статуса, и может быть использована для изучения фармакологической активности препаратов. 2. При введении мелатонина и тонизида аллоксан-индуцированным животным отмечается выраженный антигипергликемический эффект, который характеризуется снижением уровня глюкозы и HbA1c. Мелатонин, обладая менее выраженным антигипергликемическим действием, в сравнении с тонизидом, значительно превосходит его по степени корригирующего воздействия на состояние липидного обмена. 5 3. Мелатонин и тонизид вызывают достоверное снижение содержания малонового диальдегида у аллоксан-индуцированных животных, которое сопровождается значимым увеличением активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы. Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования использованы в подготовке краевой программы «Развитие здравоохранения Ставропольского края: меры социальной поддержки по бесплатному обеспечению лекарственными препаратами граждан, страдающих сахарным диабетом». Результаты и выводы диссертационной работы внедрены в курс лекций и практических занятий на 6 кафедрах Ставропольского государственного медицинского университета: общей и биологической химии, эндокринологии, детской эндокринологии и диабетологии, физиологии, патофизиологии. Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); конкурсе «У.М.Н.И.К Ставропольского края 2011», по результатам которого автор исследования признан победителем (Ставрополь, 2011); Международной конференции студентов и молодых учёных, СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2012); Международной научнопрактической конференции «Инновации молодых ученых» (Ставрополь, 2012);III Международной конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012); Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (Казань, 2013); II Международной научной интернет-конференции «Физико-химическая биология» (Ставрополь, 2013); IV Международной научно-практической дистанционной конференции «Наука и образование» (Мюнхен, 2013); Международной научной конференции «Образование и наука без границ» (Мюнхен, 2013); XV международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2013). Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 13 научных работах, в том числе в 5 статьях в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ. Общий объем публикаций составляет 1,4 п.л., личный вклад автора составил 50-85%. Объем и структура работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных результатов, обсуждения, заключения, 6 выводов, библиографического указателя, включающего 49 отечественных и 106 иностранных источников. Диссертация изложена на 110 страницах компьютерного текста и иллюстрирована 8 рисунками и 13 таблицами. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проведены на базе кафедры общей и биологической химии Ставропольского государственного медицинского университета, клинико-диагностической лаборатории Краевого эндокринологического диспансера, клинико-диагностической лаборатории городской клинической больницы № 3. Для достижения поставленной цели и решения задач был разработан дизайн исследования, состоящий из 2 этапов (рис. 1). I этап исследования выполнен на 90 белых нелинейных крысах-самцах массой 150–180 гр. Содержание животных и проведение экспериментов соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ № 51000.3-96 и 51000.4-2008) и осуществляли с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях. Настоящее исследование одобрено локальным этическим комитетом СтГМУ (протокол заключения № 22 от 21.12.2010 г). Животных содержали в условиях вивария при стандартной температуре с естественным освящением и свободным доступом к воде и корму. В двух группах (по 30 животных в каждой) воспроизводили экспериментальный сахарный диабет внутрибрюшинным введением аллоксана (производства ООО «НТК Диаэм») в дозе 100 мг/кг и 150 мг/кг после 24 часового голодания. Эффект препарата регистрировали на 3, 10, 14 сутки. Для сравнения использовали 15 интактных животных и 15 животных с введением дистиллированной воды в объеме 0,2 мл (контроль). Для изучения антидиабетического эффекта веществ использовали стандартные биохимические показатели углеводного, липидного и минерального обменов, а также про-/антиоксидантный статус крови. Определение концентрации глюкозы в крови проводили глюкооксидазным методом с помощью набора «Фотоглюкоза» (ООО «ИМПАКТ»). Принцип метода основан на окислении β-D-глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкооксидазы. Определение содержания гликозилированного гемоглобина проводили на анализаторе D-10 компании Bio-Rad. Программа определения гемоглобина 7 A1c D-10 основана на принципах ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. I этап эксперимента Экспериментальные животные (n=90, крысы) Интактные (n=15) Контроль (дист.вода) (n=15) Аллоксан 100 мг/кг (n=30) Аллоксан 150 мг/кг (n=30) ЗАБОР КРОВИ для определения: глюкозы, гликолизированного гемоглобина (HbA1c), холестерина (ХС), супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), малонового диальдегида (МДА), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов (ТГ), содержания микро- (Zn2+, Fe3+, Cu2+) и макро- (Na+, K+, Ca2+) элементов. II этап эксперимента Экспериментальные животные (n=90, крысы) Контроль (дис.вода) (n=15) Аллоксан 150 мг/кг (n=15) Мелатонин 0,1 мг/кг (n=15) Тонизид 200 мг/кг (n=15) Аллоксан 150 мг/кг + мелатонин 0,1 мг/кг (n=15) Аллоксан 150 мг/кг +тонизид 200 мг/кг (n=15) ЗАБОР КРОВИ для определения: глюкозы, HbA1c, ХС, ТГ, СОД, КАТ, МДА, ЛПНП, ЛПВП, содержания микро- (Zn2+, Fe3+, Cu2+) и макро- (Na+, K+, Ca2+) элементов. Статистический анализ Рис. 1. Дизайн исследования. Определение холестерина в крови осуществляли колориметрическим методом с использованием набора реагентов «Холестерин-витал-12/22/32». Метод основан на гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой с образованием свободного холестерина. Образовавшийся и имеющийся в пробе 8 холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе. Активность супероксоддисмутазы определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм по методу Н.Р. Mistra и J. Fridowich в модификации О.С. Брусова (1972). В основе метода лежит способность СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН 10,2. Активность каталазы определяли по методике А.Н. Баха и С.А.Зубковой (1997). Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Содержание макро- (Na+, K+, Ca2+) и микро- (Zn2+, Fe3+, Cu2+) элементов определяли методом атомно-адсорбционного анализа на спектрофотометре (ААS, тип-1N), принцип работы которого состоит в поглощении ультрафиолетового или видимого излучения атомами газа. II этап исследования выполнен на крысах-самцах (n=90), которые были ранжированы на 6 подгрупп (по 15 животных в каждой): первая группа – крысы, которым вводили дистиллированную воду (контрольные), вторая – группа животных, получивших аллоксан однократно в дозе 150 мг/кг, третья и четвертая группы – животные, получавшие внутрибрюшинно в течение14 дней мелатонин (Melatonin фирма Sigma-Aldresh, USA) в дозе 0,1 мг/кг между 16-18 часами и тонизид 200 мг/кг (Биолит, Россия) в утренние часы. Животные пятой и шестой групп получали изучаемые вещества на фоне аллоксан-индуцированного сахарного диабета. При количественной обработке результатов сопоставляли значения, полученные в опытных группах с контрольными и исходными показателями. Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке с расчетом среднего значения, достоверного интервала и стандартного отклонения. Для выборок с нормальным распределением использовали параметрический t-критерий Стьюдента (пакет программ BIOSTAT для статистического анализа) для двух независимых выборок. В других случаях сравнения относительных величин с оценкой статистической зависимости различий выполняли, используя критерий Пирсона. Статистические методы были выбраны с учетом возможности их применения для «малых» (n<30) выборок. Для всех видов анализа статистически значимыми считали различия при р<0,05. 9 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Влияние исследуемых веществ на метаболические процессы и элементный состав крови. Как следует из полученных результатов, выраженная дозовая зависимость в действии аллоксана наблюдалась как в отношении летальности (табл.1), так и интегральных показателей, характерных для клинического течения экспериментального диабета (табл.2). Таблица 1 Влияние различных доз аллоксана на летальность экспериментальных животных Экспериментальные группы, доза, мг/кг Время регистрации Интактные животные 1-5 сутки 0/20 6-25 сутки 1/20 Аллоксан, Аллоксан, 100 мг/кг 150 мг/кг Изучаемые показатели: гибель/всего животных 4/30 15/40 2/26 4/25 Кроме этого, у выживших животных из группы, получившей аллоксан в дозе 150 мг/кг, в отличие от животных, получивших диабетоген в меньшей дозе, в течение всего эксперимента наблюдалось дальнейшее прогрессирующее снижение массы тела, гиподинамия, неопрятность, пилоэрекция, кровоточивость десен, шатание и выпадение зубов. Для подтверждения патологического характера биохимических сдвигов необходимо было в первую очередь определить выраженность и длительность гипергликемического периода, обусловленного действием аллоксана. Полученные данные представлены на рисунке 2. Таблица 2 Влияние различных доз аллоксана на интегральные показатели состояния животных (M±m) Изучаемые Экспериментальные группы показатели Контроль Аллоксан, Аллоксан, (дис.вода) 100 мг/кг 150 мг/кг Масса тела, г 200,0±10,0 180,0±5,0 160,0±6,2 Потребление 18,0±2,0 30,0±5,0* 48,2±7,1* воды, мл/сутки Диурез, мл/сутки 14,0±1,0 30,0±3,0* 57,0±4,2* Обозначения: * - р< 0,05 – достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с контролем. 10 Уровень глюкозы в крови крыс после введения аллоксана в дозе 100 мг/кг и 150 мг/кг достоверно превосходил таковой у интактных животных, причем пик подъёма наблюдался на 3-й день эксперимента. Для формирования модели СД мы использовали аллоксан в дозе 150 мг/кг, так как реакции, вызванные меньшей дозой, были менее выраженными, к концу эксперимента (25 день) уровень глюкозы восстанавливался до нормы. 17.8 18 16 14 11.2 день 12 10 8 6 4 3.7 2 0 Контроль Аллоксан 100 мг/кг Контроль 3 день 10 день Аллоксан 150 мг/кг 25 день Рис. 2. Длительность гипергликемического периода у крыс при внутрибрюшинном введении аллоксана в дозах 100 и 150 мг/кг. Влияние аллоксана (150мг/кг) на метаболические показатели крови. Содержание глюкозы в крови под влиянием аллоксана достигало 6,9±0,9 ммоль/л (у контрольных животных – 4,1±0,4 ммоль/л, р<0,01). Уровень гликированного гемоглобина превышал таковые показатели у контрольных животных в 2,6 раза. Тяжесть протекания СД подтверждалась и нарушением липидного обмена, проявляющимся достоверным повышением в плазме крови содержания ХС – на 32%, ТГ – на 25% и ЛПНП – на 29%, и одновременном падении концентрации ЛПВП – на 29% (рис. 3). 11 Глюкоза ммоль/л Гликированный гемоглобин * 7 % * 14 5 4 10 2.5 8 2 6 3 ммоль/л * 3 12 6 Холестерин 1.5 4 2 2 1 0 1 0.5 0 0 ТГ ЛПНП ммоль/л 4.5 * ЛПВП % 40 * 16 4 35 14 3.5 30 12 3 25 10 20 8 15 6 10 4 0.5 5 2 0 0 0 2.5 2 1.5 1 Интактные животные Контроль % * Аллоксановый диабет Рис. 3. Изменения показателей углеводного и липидного обмена под влиянием аллоксана в дозе 150 мг/кг. Обозначения: * - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с контролем (дис. вода). При развитии СД отмечались выраженные сдвиги и в состоянии про- и антиоксидантной систем крови (рис. 4), например, содержание МДА в сыворотке крови оказалось на 120% выше, чем у контрольных животных, а активность СОД уменьшилась в 2 раза. Одновременно с этим возрастало содержание каталазы до 345,3±3,3 мкат/л (в контроле – 225,6±2,9 мкат/л) (рис. 4). 12 Нмоль/л 9 8 7 МДА % * СОД 3 350 2.5 300 6 * 1.5 3 * 200 150 1 100 1 0.5 50 0 0 0 2 Интактные животные КАТ 250 2 5 4 мкат/л Контроль Аллоксановый диабет Рис. 4. Изменения показателей МДА, СОД и КАТ под влиянием введения аллоксана в дозе 150 мг/кг. Обозначения, как на рис. 3. Полученные данные указывают на то, что под влиянием аллоксана у животных развивался окислительный стресс, что свидетельствует о нарушении равновесия в балансе про- и антиоксидантной систем. Биохимические исследования элементного статуса также показали, что диабетоген вызывает значительные количественные сдвиги в содержании крови крыс натрия, калия и кальция (табл. 3). Так, на 14-е сутки после аллоксан-индуцированного сахарного диабета концентрация натрия в плазме была снижена на 9,5 %, что может быть связано с массивным выведением натрия вместе с осмотически обусловленным выходом воды из внутриклеточного пространства. Концентрация кальция в крови у крыс с аллоксановым диабетом увеличивалась до 5,2±0,1 моль/л (у животных контрольной группы – 1,66±0,04 моль/л). Одновременно наблюдалось значительное истощение (на 37 %, р<0,01) запасов калия в сравнении с показателями животных контрольной группы. 13 Таблица 3 Содержание микро- и макроэлементов в крови крыс с аллоксан-индуцированным сахарным диабетом (M±m) Макроэлементы Натрий, Калий, Кальций, ммоль/л ммоль/л моль/л Микроэлементы Цинк, Железо, Медь, мкмоль/л мкмоль/л мкмоль/л Интакт188,49± 3,5±0,16 1,85±0,06 25,49±1,61 ные 1,27 Контроль 185,52±1,05 2,89±0,12 1,66±0,04 24,87±0,99 (дис.вода) Аллоксан 170,87±7,03 1,94±0,11 5,24±0,06 16,27±0,88 150 мг/кг * * * * Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов группой не проводилось. 42,74±0,43 8,96±0,38 41,76±0,42 9,07±0,10 53,58±1,90 8,34±0,11 * * сравнение с интактной Диабетоген вызывал статистически достоверные сдвиги и в содержании таких эссенциальных микроэлементов, как цинк, железо, медь. Свидельством этому является уменьшение содержания цинка в 1,5 раза (p<0,01), меди – до 8,34±0,31 мкмоль/л (в контроле – 9,07±0,152 мкмоль/л, p<0,01). Однако стоит отметить, что при этом содержание железа в этой группе животных достигало 53,58±1,90 мкмоль/л (p<0,01), что было существенно выше, чем в контрольной группе (41,39±0,43 мкмоль/л). Корреляционной анализ между показателями эссенциальных микроэлементов и систем про- и антиоксидантной активности установил достоверную положительную связь между содержанием меди и СОД (r=+0,32; р>0,05), меди и МДА (r=+0,66; р>0,05) и отрицательную корреляционную взаимосвязь между содержанием цинка и МДА (r=-0,95; р<0,05). Положительная корреляционная связь установлена между содержанием гликозилированного гемоглобина и меди (r= +0,97; р<0,05). Влияние мелатонина и тонизида на метаболические процессы, состояние про- и антиоксидантной систем и элементный гомеостаз. Мелатонин и тонизид при повторном введении животным заметно ослабляли метаболические процессы. Например, установлено, что под влиянием мелатонина уровень глюкозы в крови повысился на 21% (р<0,01), а содержание гликированного гемоглобина– на 18% (таб. 4). Эффект тонизида проявлялся слабее. При изучении липидного обмена было установлено, что и мелатонин, и тонизид снижали содержание холестерола в крови до 1,6±0,1 ммоль/л и 14 1,9±0,2 ммоль/л, соответственно, однако следует заметить, что воздействие тонизида не носило значимого характера. При анализе липидных фракций было выявлено, что в подгруппе животных, получавших мелатонин, уровень ЛПНП статистически значимо уменьшался на 16% (р<0,01), при одновременном увеличении содержания фракции ЛПВП на 21%. Под влиянием и мелатонина, и тонизида сдвиги в содержании триацилглицеролов носили невыраженный характер. Таблица 4 Влияние мелатонина и тонизида на состояние углеводного и липидного обменов (M±m) Состояние № животных Глюкоза ммоль/л НЬА1с (%) Холесте рин ммоль/л ЛПНП (%) ЛПВП (%) ТГ ммоль/л 1 Интактные 4,05±0,39 5,05±0,39 2,12±0,06 2,81±0,73 1,45±0,49 2,72±1,47 2 Контроль (дис. вода) 4,35±0,22 5,23±0,15 2,10±0,07 2,67±0,33 1,38±0,54 2,77±0,97 Мелатонин 5,27±0,30 * 6,19±0,16 * 1,63±0,11 * 2,34±0,28 * 1,67±0,16 * 2,66±0,13 Тонизид 4,72±0,33 5,49±0,17 1,98±0,15 2,25±0,15 1,52±0,30 3,12±0,24 3 4 Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов сравнение с интактной группой не проводилось. Согласно полученным данным, мелатонин подавлял интенсивность перекисного окисления (табл. 5) в сравнении с показателями контрольной группы животных, что выражалось в снижении содержания МДА в 1,6 раза (p<0,05). Под влиянием мелатонина активность СОД и КАТ изменялись незначительно. Тонизид, напротив, существенно увеличивал активность этих ферментов, не изменяя концентрацию МДА. 15 Таблица 5 Влияние мелатонина и тонизида на выраженность ПОЛ и активность ферментов антиоксидантной системы в крови крыс (M±m) № Состояние животных МДА Нмоль/мл Активность СОД % Активность каталазы мкат/л 1 Интактные 3,72±0,16 2,55±0,16 225,63±2,1 2 3,68±0,21 2,52±0,12 223,71±1,9 4 Контроль (дис. вода) Мелатонин 2,35±0,09 227,24±2,8 5 Тонизид 2,34±0,21 * 3,51±0,12 2,80±0,06 267,30±3,2 * * Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов сравнение с интактной группой не проводилось. Изучение состояния элементного гомеостаза показало, что тонизид и мелатонин влияют на минеральный обмен (табл. 6). Таблица 6 Влияние мелатонина и тонизида на содержание макро- и микроэлементов в крови аллоксан-индуцированных животных (M±m) Интактные Контроль (дис. вода) Мелатонин Тонизид Натрий, Калий, Кальций, Цинк, Железо, Медь ммоль/л ммоль/л ммоль/л мкмоль/л мкмоль/л мкмоль/л 188,49 ± 1,27 3,05 ± 0,16 1,85 ± 0,06 25,49 ± 1,61 42,74±0,43 9,07 ± 0,10 185,52±1,52 2,89±0,12 1,66±0,04 24,87±0,98 41,76±0,42 8,96±0,98 162,70±4,79 2,08±0,156 5,29±0,47 10,41±0,54 40,33±3,79 8,57±0,74 * * * 147,89±4,84 2,07±0,10 5,95±0,10 9,78±1,10 * * * * 42,54±2,33 10,08±0,48 Обозначения, как в таблице 2. В данной серии экспериментов сравнение с интактной группой не проводилось. Под влиянием тонизида регистрировалось статистически достоверное снижение содержания натрия на 21,5% и калия – на 32% при одновременном повышении содержания кальция в 3,6 раза (p<0,05) в сравнении с показателями контрольной группы животных. Действие мелатонина имело ту же направленность, однако было менее интенсивным. Под его влиянием концентрация натрия в крови животных 16 снижалась на 12% в сравнении с показателями животных контрольной группы, а калия – на 28%. Под влиянием мелатонина и тонизида концентрация цинка снижалась, соответственно, до 30,3±3,8 мкмоль/л и 32,5±2,3 мкмоль/л (р<0,05) в сравнении с показателями животных контрольной группы. Фармакологические эффекты мелатонина и тонизида при экспериментальном сахарном диабете. При изучении интегральных показателей животных с аллоксаниндуцированным сахарным диабетом наблюдали выраженную полидипсию и полиурию, потерю массы тела, резкое увеличение потребления воды и суточного диуреза. Смертность в этой группе животных к концу наблюдения достигала 30%. Адаптогены эффективно предотвращали гибель животных, что проявлялось повышением количества выживших животных с аллоксаниндуцированным СД. Объем потребляемой жидкости и уровень диуреза заметно снизились. Наиболее выраженное снижение наблюдалось у крыс, получавших тонизид. Мелатонин оказывал менее эффективное действие. Эффективность изучаемых препаратов оценивали по степени снижения содержания глюкозы крови и показателям липидного обмена в сравнении с показателями животных с аллоксановым диабетом. Полученные данные представлены на рисунке 5. Введение мелатонина животным с аллоксаниндуцированным СД способствовало снижению содержания глюкозы в 1,5 раза, а гликированного гемоглобина крови - в 2,5 раза, тогда как под влиянием тонизида отмечалось достоверное снижение только содержание глюкозы в 1,2 раза. При применении мелатонина и тонизида отмечался значительный гиполипидемический эффект, выражающийся в снижении содержания общего холестерола на 9% и 13, соответственно. Под воздействием мелатонина содержание ТГ уменьшалось на 41%, ЛПНП и ЛПВП – на 32%, а отношение ЛПНП к ЛПВП составило 1,7 (у животных с аллоксановым СД коэффициент составил 8,2). Действие тонизида также вызывало снижение содержания ХС, ТГ, ЛПНП и повышение ЛПВП (рис. 5). 17 Глюкоза Гликированный гемоглобин Δ 14 % 7 6 * * 5 4 Δ 12 2.5 10 2 6 2 4 1 2 0 0 3.5 3 2.5 2 1.5 0 * 1 0 ЛПНП ТГ Δ % 10 Δ * * * 0.5 ЛПВП % Δ 1.4 1.2 8 Δ * * 1 6 4 1 0.5 Δ 1.5 * 3 4 ммоль/л 3 8 ммоль/л Холестерин 2 0.8 * * 0.6 0.4 0.2 0 0 Аллоксан + Контроль Аллоксановый Аллоксан + тонизид (дис. вода) диабет мелатонин Рис. 5. Влияние адаптогенов на изменения углеводного и липидного обменов при аллоксаниндуцированном сахарном диабете. Δ Обозначения: - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с контролем (дис. вода); * - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с аллоксановым диабетом. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита. Введение адаптогенов способствовало ограничению оксидантного стресса, что подтверждалось достоверным снижением содержания МДА под влиянием мелатонина и тонизида, в сравнении с данными животных, не получавших фармакологическую коррекцию. Снижение содержания МДА сопровождалось достоверным увеличением активности СОД и КАТ в 1,5 раза (табл. 7). 18 Таблица 7 Влияния мелатонина и тонизида на выраженность ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной защиты животных с аллоксановым сахарным диабетом (M±m) № 1. 2. Состояние животных (n=10) Контроль (дис.вода) Аллоксановый диабет Активность СОД, % Активность каталазы, мкат/л МДА, Нмоль/мл 2,52±0,12 223,73±1,91 3,68±0,21 1,45±0,04* 345,31±3,32* 8,22±0,41* Аллоксан. диабет 2,88±0,10∆ 219,54±2,80∆ 3,20±0,13∆ + мелатонин 4. Аллоксан. диабет 2,42±0,12∆ 229,40±2,34∆ 4,81±0,19∆ + тонизид Обозначения: * - достоверность различий при сравнении показателей опытных групп с контролем (дис.вода); ∆ – достоверность различий при сравнении показателей животных опытных групп с аллоксановым диабетом. 3. Минеральный обмен. У животных с аллоксан-индуцированным СД использование адаптогенов приводило к восстановлению содержания микроэлементов в крови. Так, например, было установлено, что при введении мелатонина значимо увеличивалось содержание цинка (в 1,3 раза), железа (в 1,7 раз), меди (в 1,1 раз) и калия (в 1,2 раза) и уменьшилось количество натрия (в 1,2 раз) в сравнении с показателями животных с аллоксан-индуцированным сахарным диабетом (табл. 8). Тонизид при этих условиях увеличивал концентрацию калия (в 1,1 раз), кальция и меди (в 2,6 и 1,2 раза соответственно) и снижал содержание цинка (в 1,4 раза) и железа (в 1,1 раз). 19 Таблица 8 Содержание микро- и макроэлементов в крови крыс(M±m) Натрий, ммоль/л Калий, ммоль/л Кальций, моль/л Цинк, мкмоль/л Железо, мкмоль/л Медь, мкмоль/л Контроль (дис.вода) 170,87±7,00 3,05±0,16 1,85±0,06 25,49±1,61 42,74±0,43 9,07±0,10 Мелатонин 182,43±1,27 2,95±0,16 1,71±0,06* 24,58±1,61 41,39±0,43 9,07±0,15 Тонизид 171,69±4,51 2,28±0,14 5,94±0,17 11,48±0,32 35,24±5,46 9,88±0,41 Аллоксан 150 мг/кг 188,49±1,27 1,94±0,11 5,24±0,06 16,27±0,88 31,86±2,65 8,34±0,31 * * * * * * Аллоксан+ мелатонин 156,38±5,58 2,28±0,14 5,85±0,23 21,56±0,34 53,58±1,90 8,85±0,59 *Δ *Δ *Δ *Δ *Δ *Δ Аллоксан+ тонизид 171,60±4,48 2,11±0,04 5,94±0,17 11,48±0,31 30,04±3,13 9,88±0,41 * *Δ *Δ *Δ *Δ *Δ Обозначение, как в таблице 7. Таким образом, тонизид и мелатонин улучшали измененный минеральный обмен у животных с экспериментальным сахарным диабетом. По мнению специалистов, важной характеристикой микроэлементного статуса является не только абсолютное содержание микро- и макроэлементов, но и их соотношение. Так, например, чем выше коэффициент Zn/Cu, тем устойчивее система антиоксидантной защиты (Ракитский В.Н., Юдина Т.В., 2005). В наших исследованиях значение этого коэффициента у контрольных животных было равно 2,8. У крыс с диабетом величина отношения Zn/Cu в крови уменьшалась в 1,44 раза, что указывает на преимущественное протекание оксидантных реакций. После введения животным мелатонина величина отношения Zn/Cu повысилась до контрольных величин, что указывает на улучшение состояния антиоксидантной системы. ВЫВОДЫ 1. Изученные адаптогенны гормонального (мелатонин) и растительного (в виде комплекса лекарственных растений – тонизид) происхождения обладают широким спектром антидиабетической активности. Исследованные вещества при повторном введении снижают содержание глюкозы и гликированного 20 гемоглобина в крови, ограничивают смертность животных, снижают объем потребляемой жидкости и суточный диурез. 2. Мелатонин и тонизид обладают антиоксидантными свойствами, которые выявляются на модели экспериментального аллоксанового диабета. Повторные инъекции мелатонина ограничивают интенсивность перекисного окисления липидов, что проявляется в снижении содержания малонового диальдегида. Тонизид заметно увеличивает активность ферментов антиоксидантной системы супероксиддисмутазы и каталазы, существенно не изменяя концентрацию малонового диальдегида. 3. Исследованные вещества при аллоксан-индуцированном сахарном диабете меняют целый ряд показателей липидного обмена, проявляя гиполипидемический эффект. Мелатонин и тонизид снижают содержание холестерола в крови. В подгруппе животных, получавших мелатонин, уровень липопротеинов низкой плотности уменьшается на 16% (р<0,01) при одновременном увеличении содержания фракции липопротеинов высокой плотности на 21% (р<0,01). 4. Мелатонин и тонизид восстанавливают измененный минеральный обмен животных с экспериментальным сахарным диабетом. Введение мелатонина увеличивает содержание цинка (в 1,3 раза), железа (в 1,7 раз), меди (в 1,1 раз) и калия (в 1,2 раза), что заметно приближает эти значения к показателям, характерным для нормы. Соотношение макро- и микроэлементов, являющееся важной характеристикой минерального обмена, под влиянием мелатонина нормализуется. После введения животным мелатонина величина отношения Zn/Cu повысилась до контрольных величин, что указывает на улучшение состояния антиоксидантной системы. Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК 1. Муравьева А.Б. Изучение антидиабетических свойств естественных адаптогенов различного происхождения в эксперименте / Эльбекьян К.С., Арушанян Э.Б., Муравьева А.Б.// Медицинский вестник Северного Кавказа. Ставрополь, 2011. № 3. С. 55-57. 2. Муравьева А.Б. Особенности нарушения макро- и микроэлементного спектра сыворотки крови при экспериментальном сахарном диабете / Эльбекьян К.С., Ходжаян А.Б., Муравьева А.Б. // Фундаментальные исследования. Москва, 2011. № 10 (2). С. 411-413. 21 3. Муравьева А.Б. Сравнительна оценка антиоксидантной активности естественных адаптогенов при экспериментальном сахарном диабете / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Шляхин Г.В. // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. Саратов, 2011. № 11. С.56-58. 4. Муравьева А.Б. Влияние мелатонина на показатели окислительного стресса и элементного дисбаланса при экспериментальном сахарном диабете / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В. // Фундаментальные исследования. Москва, 2013. №9(1). С. 178-181. 5. Муравьева А.Б. Биологическое моделирование аллоксан-индуцированного сахарного диабета/ Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В. // Здоровье и образование в XXI веке.Москва, 2013. - № 1- 4.Т. 15. С.117 -121 . Список работ, опубликованных по теме диссертации 6. Муравьева А.Б. Влияние естественных адаптогенов гормонального и растительного происхождения на показатели аллоскан-индуцированного сахарного диабета / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б. // Сборник материалов XVIII Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство" Москва, 2011. С. 495-496. 7. Муравьева А.Б. Изменение нарушения макро-и микроэлементного спектра сыворотки крови при экспериментальном сахарном диабете /Муравьева А.Б. // Международная конференция студентов и молодых ученых, СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 2012. С. 36-38. 8. Муравьева А.Б. Недостаток микро- и макроэлементов как один из признаков предрасположенности к сахарному диабету / Муравьева А.Б. // Международная научно-практическая конференция «Инновации молодых ученых», Ставрополь, 2012. С. 43-45. 9. Муравьева А.Б. Антиоксидантная активность адаптогенов различного происхождения при экспериментальном сахарном диабете / Муравьева А.Б., Эльбекьян К.С. // III Международная интернет - конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». Казань, 2012. С. 339-340. 10. Муравьева А.Б. Влияние мелатонина на выраженность процессов перекисного окисления липидов и состояние механизмов антиоксидантной защиты при экспериментальном сахарном диабете / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В. // Российская научно-практическая 22 конференция «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики». Казань, 2013г. С. 198-199. 11. Muravyeva A.B.,.Pharmacological action adaptogens various origin at experimental diabetes / Elbekyan K.C., Muravyeva A.B., Gevandova M.G., Hodzhayan A.B., Pazhitneva E.B. // Materials of the conference "EDUCATION AND SCIENCE WITHOUT BORDERS" № 2. Munich, 2013. 12. Муравьева А.Б. Некоторые биохимические основы и фармакологическая активность адаптогенов различного происхождения при экспериментальном сахарном диабете / Эльбекьян К.С., Муравьева А.Б., Гевандова М.Г, Ходжаян А.Б., Пажитнева Е.В. // IV Международная научно-практическая дистанционная конференция "Наука и образование". Мюнхен, 2013. С. 366370. 13. Муравьева А.Б. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная активность при аллоксановом сахарном диабете у крыс и их коррекция мелаксеном / Муравьева А.Б., Пажитнева Е.В.// II Международная научная интернет- конференция «Физико- химическая биология». Ставрополь, 2014. С. 126 – 128. Список сокращений. - АОЗ – антиоксидантная защита - КАТ – каталаза - ЛПВП – липопротеины высокой плотности - ЛПНП – липопротеины низкой плотности - МДА – малоновый диальдегид - ПОЛ – перекисное окисление липидов - СД – сахарный диабет - СОД – супероксиддисмутаза - ТГ – триглицириды - ХС – холестерин - HbA1c – гликированный гемоглобин 23