На правах рукописи ВОВК АНАСТАСИЯ АНДРЕЕВНА ФАРМАКОКОРРЕКЦИЯ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ
реклама
На правах рукописи ВОВК АНАСТАСИЯ АНДРЕЕВНА ФАРМАКОКОРРЕКЦИЯ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ АВЕРСЕКТА-2 ПРИ ОБРАБОТКЕ ЖИВОТНЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Троицк – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина» Научный руководитель: Герунова Людмила Карповна доктор ветеринарных наук, профессор Официальные оппоненты: Самородова Инна Моисеевна доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», кафедра физиологии и фармакологии, профессор Гарипов Талгат Валирахманович доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана», заведующий кафедрой физиологии, профессор Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» Защита состоится «__» ___________2012г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 220.066.01 при ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 457100, Челябинская область, г. Троицк, ул. Гагарина, 13, тел. 8 (35163) 2-48-88; факс 8 (35163) 2-04-72; E-mail: [email protected], официальный сайт: www.usavm.ac.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины». Автореферат разослан «__» _____________ 2012г. Ученый секретарь диссертационного совета Борисенко Елена Валерьевна 2 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время во всем мире ежедневно животным вводят более 10 млрд. доз лекарственных средств. На животноводческих предприятиях России практически нет коров, свиней, овец, коз и птиц, которые бы не получали те или иные фармакологические препараты (А.М. Смирнов, 2010). Особенно широко используют противопаразитарные средства, поскольку в производственных условиях все сельскохозяйственные животные подвергаются ежегодной профилактической противопаразитарной обработке. Учитывая, что большинство противопаразитарных препаратов несет потенциальную опасность и способно вызывать нежелательные реакции у обрабатываемых животных, предъявляют высокие требования по безопасности к данной группе лекарственных средств (В.Е. Абрамов, В.В. Напалкова, Н.П. Бирюкова, 2010). Проблема химизации и острых отравлений в сельскохозяйственной отрасли и ветеринарии сохраняет свою актуальность вследствие непрекращающегося синтеза новых и накопления давно известных химических соединений в окружающей среде и организме животных (П.Г. Жминько, 2011). Мировой ветеринарной практикой доказано, что биопестициды являются альтернативой химическим средствам. Авермектинсодержащие средства принадлежат к группе биопестицидов и активно используются в растениеводстве и животноводстве. Средства данной группы относятся к 3-му классу опасности (умеренно опасные, ГОСТ 12.1.007-76) и сохраняют потенциальную возможность развития нежелательных реакций. Поскольку иммунная система неизбежно вовлекается в патологический процесс при любом химическом стрессе (Т.В. Герунов, Ю.В. Редькин, Л.К. Герунова, 2011), не исключена возможность нарушения иммунной реактивности у продуктивных животных с развитием дистрофических изменений в органах иммуногенеза, что приводит к необратимым функциональным изменениям в организме, вызывающим преждевременную выбраковку (А.А. Карпенко, 2011). В связи с этим особое внимание должно уделяться выявлению и устранению иммунотоксических эффектов в фармакодинамике лекарственных средств. Степень разработанности проблемы. В ходе длительного периода изучения и использования авермектинов накоплены сведения об общетоксических эффектах данной группы препаратов (Г. Катцун, Г. Бертман, 1998; B.F. Bishop, C.I. Bruce, N.A. Evans et al., 2002; Atcins, 2005; Е.В. Семеряк, С.В. Савицкий, Л.К. Герунова, 2012). Суждения об иммунотропной активности авермектинов крайне разноречивы и отрывочны (J.Uhlir, P.Volf, 1992, Т.С. Стерлина и др., 2001; А.В. Викторов, Т.Д. Черкасова, В.А. Юркин и др. 2003, 2009). В связи с этим изучение действия на иммунную систему авермектинсодержащих препаратов и поиск иммунокорригирующих средств для снижения риска побочных эффектов остаются по-прежнему актуальными. 3 Цель исследований – установить иммунотоксические эффекты Аверсекта-2 и изыскать возможность их фармакокоррекции при противопаразитарной обработке крупного рогатого скота. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: Определить особенности психоэмоционального и функционального состояния нервной системы у лабораторных животных при острой интоксикации Аверсектом-2. Установить изменения показателей крови и иммунной реактивности крыс при введении терапевтических и токсических доз Аверсекта-2. Выявить структурные изменения в органах иммунной системы у лабораторных крыс при интоксикации Аверсектом-2 и введении энтеросорбента, модифицированного бетулином. Установить изменения гематологических показателей и неспецифической резистентности у крупного рогатого скота после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 и использовании сорбента с бетулином. Изучить патоморфологические изменения в органах иммунной системы у крупного рогатого скота при обработке Аверсектом-2 и ее сочетании с энтеросорбцией. Разработать рекомендации для специалистов ветеринарной службы «Фармакокоррекция иммунотропных эффектов Аверсекта-2 при противопаразитарной обработке животных». Предмет и объект исследования. Объектом исследования служили белые беспородные лабораторные крысы и крупный рогатый скот чернопестрой породы (коровы и бычки). Предмет исследования – иммунотоксические эффекты Аверсекта-2 и иммунокорригирующие свойства бетулинсодержащего сорбента. Научная новизна. В отличие от проведенных ранее исследований по установлению иммунотропной активности природного комплекса Аверсектина С, полученного в результате культивирования штамма S. avermitilis (Т.С. Стерлина, 2001), были определены изменения иммунной реактивности и неспецифической резистентности у животных при введении терапевтических и токсических доз его препаративной формы Аверсекта-2 . В производственных опытах доказана иммунокорригирующая способность углеродного энтеросорбента, модифицированного бетулином, при противопаразитарных обработках крупного рогатого скота. Так, у коров, не получавших сорбент с бетулином после обработки Аверсектом-2, уровень ЦИК через 14 суток после начала опыта снижался на 43%, а через 3 недели – на 39%. В группе животных, подвергнутых энтеросорбции, - на 22 и 24% соответственно. Установлено, что трехдневный курс энтеросорбции позволяет снизить потерю общего белка до 4% через 14 суток и полностью восстановить его уровень через 21 сутки после обработки. Без введения 4 бетулинсодержащего сорбента данный показатель у коров снижался на 7,5 % через 14 суток и оставался на том же уровне через 21 сутки после обработки. Получены новые сведения о функциональном состоянии нервной системы животных в период острого химического стресса, вызываемого токсическими дозами Аверсекта-2, что расширяет возможности патогенетической терапии при отравлениях. Теоретическая значимость работы. Материалы исследований представляют определенную ценность для развития нового научного направления ветеринарной медицины – иммунотоксикологии. Полученные данные позволяют оценить потенциальную опасность передозировки Аверсекта-2 и увеличения кратности его применения. Результаты исследований подтверждают целесообразность сочетанного применения иммуноактивных средств и энтеросорбентов. Практическая значимость работы. Результаты исследований расширяют возможности диагностики и фармакокоррекции побочных эффектов авермектинсодержащих препаратов. Установленное снижение иммунной реактивности животных может отразиться на иммуногенности вакцин, вводимых после противопаразитарной обработки. На основании полученных результатов изданы методические рекомендации для специалистов ветеринарной службы «Фармакокоррекция иммунотропных эффектов Аверсекта-2 при противопаразитарной обработке животных», которые одобрены секцией Центра научного обеспечения АПК при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 9 от 17.09.2012 г.). Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией по следующим пунктам: 1. Механизм действия лекарственных веществ на организм животных, его отдельные системы и функции (фармакодинамика); 8. Токсичность лекарственных веществ для животных и характер их побочного действия, разработка показания и противопоказания для применения в ветеринарной практике, а также методов устранения побочных эффектов; 9. Изучение токсичности пестицидов, токсичных элементов, микотоксинов, полибромированных бифенилов, хлордиоксинов и других опасных контаминантов окружающей среды и объектов ветеринарного надзора; 12. Разработка методов диагностики, профилактики и антидотной терапии при отравлении животных пестицидами, токсичными элементами и другими опасными химическими веществами. Апробация и реализация результатов научных исследований. Апробация. Основные материалы диссертационной работы доложены и одобрены на научных конференциях аспирантов и преподавателей ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени П.А.Столыпина (Омск, 2010; 2011; 2012), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири», посвященной 70-летию со дня основания 5 ИЭВСиДВ (Краснообск, 2010), международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения», посвященной Всемирному году ветеринарии в ознаменование 250-летия профессии ветеринарного врача (Ульяновск, 2011), III съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (СанктПетербург, 2011), IX региональной научно-практической конференции молодых ученых вузов СФО «Инновации молодых ученых аграрных вузов – агропромышленному комплексу Сибирского региона» (Омск, 2011), XI Сибирской ветеринарной конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2012), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых вузов Минсельхоза РФ (Омск, Москва, 2012). Реализация. Результаты научно-исследовательской работы внедрены в ООО «Комплекс «Таврический» Таврического района Омской области и учебный процесс в ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени П.А.Столыпина. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе две из них – в журналах, рекомендованных ВАК. В совместных публикациях 80% материала принадлежит автору. На защиту выносятся следующие положения: 1. Авермектинсодержащий препарат Аверсект-2 угнетает гемопоэз и снижает иммунную реактивность животных при однократном введении в терапевтических и токсических дозах. 2. Энтеросорбция с использованием углеродного сорбента, модифицированного бетулином, нивелирует иммунотоксические эффекты Аверсекта-2. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах компьютерного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 53 рисунками. Список литературы включает 145 источников, в том числе иностранных авторов - 35. 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования Тема диссертации является разделом плановой научноисследовательской работы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина» 6 «Фармакотоксикологическая оценка новых лекарственных средств и пестицидов» с номером государственной регистрации 01201158552. Эксперименты выполнены на базе кафедры диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени П.А.Столыпина и ООО «Комплекс «Таврический» Таврического района Омской области в период с 2009 по 2012г.г. Дизайн исследований представлен на рисунке 1. В опытах использовали противопаразитарный препарат Аверсект-2 (1% раствор аверсектина С) производства ООО НЦБ Фармбиомед (Москва, Россия) и углеродный энтеросорбент, модифицированный бетулином в этанольно-глицериновой основе (ИППУ СО РАН, г. Омск). Определение иммунотоксических эффектов Аверсекта-2 и их фармакокоррекция Противопаразитарная обработка Острая интоксикация 2 мг/кг 20 мг/кг 40 мг/кг интактные ГЗТ интактные АОК Неврологическое тестирование, поведенческие реакции 0,2 мг/кг Фон, через 14 суток, через 21 сутки после введения Неспецифическая резистентность Патоморфологическое исследование органов иммунной системы Фармакокоррекция углеродным энтеросорбентом, модифицированным бетулином (0,2 г/кг), в течение 3х суток после введения Аверсекта-2 Рисунок 1 – Дизайн исследований В лабораторных экспериментах в качестве опытной модели использовали 196 белых беспородных лабораторных крыс в возрасте 3-х и 67 ти месяцев с массой тела 95-120г и 260-290г соответственно, содержащихся в условиях вивария на стандартном рационе. В производственных условиях объектом исследования служил крупный рогатый скот черно-пестрой породы: двадцать коров в возрасте 4-5 лет и пятнадцать 9-ти месячных бычков. Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли с соблюдением рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (2003). Для определения влияния токсических доз Аверсекта-2 на поведение препарат вводили лабораторным крысам однократно, подкожно. Контрольными группами служили интактные животные. Животных всех групп подвергали ежедневно в течение 3-х суток после интоксикации неврологическому тестированию. Тестирование в установке «Открытое поле» проводили через 48 часов после затравки (Я. Буреш, О.Бурешова, 1991г.). Для подсчета лейкоцитов, эритроцитов и лейкограммы использовали гематологический анализатор Sysmex XT(Япония) или счетную камеру Горяева, лейкограмму в этом случае определяли по мазкам крови, окрашенным по методу Романовского-Гимза. Для выявления фермента миелопероксидазы (МРО) и незрелых форм гранулоцитарного ростка мазки крови окрашивали по методу Грэхема-Кнолля (1966). Для более объективного суждения о содержании фермента использовали полуколичественный метод оценки L. Kaplowa (1955) в модификации G. Astaldi и L. Verga (1957) с вычислением среднего цитохимического коэффициента (К). НСТ-тест (спонтанный и активированный) проводили по методике Стьюарта в модификации Нагоева (1975), фагоцитарную активность лейкоцитов крови определяли по методу Гостева (1950). Состояние клеточного звена иммунного ответа при введении в организм Аверсекта-2 определяли по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у лабораторных крыс по методике Lagrange et al. (1980). Гуморальный иммунный ответ у крыс на введение Аверсекта-2 в терапевтической дозе оценивали методом A.J.Cunningham (1965) по количеству антителообразующих клеток (АОК) на 4 и 8 сутки после проведения противопаразитарной обработки. В те же сроки устанавливали характер гуморальной иммунной реакции к Т-зависимому антигену. Материалом для изучения общей патоморфологической картины при интоксикации и обработке Аверсектом-2 служили органы иммунной системы крыс и бычков: тимус, селезенка, мезентериальные лимфатические узлы, а также печень. Патматериал фиксировали в 4%-ном нейтральном растворе формальдегида и заливали в парафин (В.Г. Елисеев, 1967). Из блоков готовили срезы толщиной 5 мкм. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином по методу Ван-Гизона. Окрашенные препараты исследовали под световым микроскопом. Статистическую обработку цифровых данных проводили в программе STATISTICA6.1rus, при этом для оценки результатов производственного 8 опыта использовали t-критерий Стьюдента для зависимых выборок. Результаты лабораторных опытов оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых выборок. При этом вычисляли медиану (Me), а границы варьирования изучаемой совокупности показателей определяли в пределах от нижнего до верхнего квартилей (P25 ; P75). Дополнительно определяли среднее арифметическое значение (M) и отклонение от среднего арифметического значения (m). 2.2. Структура поведения лабораторных крыс при острой интоксикации Аверсектом-2 Крысам опытных групп Аверсект-2 вводили однократно подкожно в дозах 2, 20 и 40 мг/кг. Контролем служили интактные животные. Тестирование в установке «Открытое поле» проводили через 48 часов после затравки. Изменения поведения крыс всех опытных групп были однотипными. Токсические дозы Аверсекта-2 вызывали достоверное снижение показателей «числа пересеченных линий» и увеличение «количества циклов неподвижности», а также времени «реакции замирания». Интоксикация приводила к угасанию активных форм поведения и преобладанию пассивных поведенческих актов у крыс в условиях новой обстановки. 2.3. Гематологические показатели и неспецифическая резистентность крыс при острой интоксикации Аверсектом-2 После интоксикации Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг количество лейкоцитов, процентное содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов снижаются по сравнению с группой контроля. Через 4 суток в периферической крови появляются незрелые формы гранулоцитов – метамиелоциты. Абсолютное содержание различных форм лейкоцитов в периферической крови крыс представлено на рисунке 2. Острая интоксикация Аверсектом-2 в дозах 20 и 40 мг/кг сопровождается развитием лейкопении в первые сутки после введения препарата, через 40 суток снижается процентное и абсолютное содержание сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов. При проведении морфологического анализа лейкоцитов через 14 суток после введения Аверсекта-2 у всех опытных крыс наблюдались в разной степени выраженные однотипные изменения: присутствие в периферической крови промиелоцитов, метамиелоцитов и лимфоцитов с вакуолизированной цитоплазмой. В сегментоядерных нейтрофилах у животных опытных групп регистрировали токсическую зернистость цитоплазмы и фрагментацию ядер. 9 Э Э 100 8095.83 250 200 Лц* Мн * 150 100 100 211П 100 100 50 80 51.62 0 12.24 52.76 100 53.97 100 100 контроль Лф* Лц* 100 60 58.75 П** 100 40 20 39.13 0 100 Мн С* 60 37.97 100 контроль Лф** 2 мг/кг 91.15 100С 2 мг/кг Рисунок 2 - Абсолютное содержание лейкоцитов в крови крыс (n=5) через 4 (А) и 14 (Б) суток после интоксикации Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг относительно контроля (100%). Примечание : достоверность различий относительно контроля * - р≤0,05. Изменения со стороны показателей эритроцитарного ростка кроветворения отмечали через 7 и 14 суток после введения Аверсекта-2 в дозе 2 мг/кг. Количество эритроцитов снизилось на 22,7% (р≤0,01) и 20% (р≤0,05) соответственно. При этом уровень гемоглобина в крови опытных крыс статистически достоверно не отличался от контроля. При интоксикации в дозах 20 и 40 мг/кг регистрировали снижение количества эритроцитов и гемоглобина уже через 1 сутки после затравки на 43 и 46% и 37 и 34% соответственно. В дальнейшем количество эритроцитов у животных, интоксицированных в дозе 20 мг/кг, постепенно возрастало и через 14 суток достигло прежнего уровня, однако при исследовании крови через 30 и 40 суток вновь отмечали снижение содержания эритроцитов и гемоглобина. В группе с более высокой дозой Аверсекта-2 (40 мг/кг) уровень эритроцитов в периферической крови был достоверно ниже, чем у интактных животных, на всем протяжении исследования. При однократной интоксикации крыс Аверсектом-2 в дозе 20 мг/кг достоверное увеличение среднего цитохимического коэффициента миелопероксидазы отмечено через 14 суток после введения препарата. Эта тенденция сохраняется и через 30 суток с момента интоксикации у крыс, получивших препарат в дозах 20 и 40 мг/кг. 2.4. Патоморфологические изменения в органах иммунной системы крыс при острой интоксикации Аверсектом-2 Морфологическое исследование проводили через 14 и 40 суток после острой интоксикации крыс Аверсектом-2 в дозах 2; 20 и 40 мг/кг. 10 У крыс, получивших препарат в дозе 2 мг/кг массы тела, при вскрытии отмечали застойную гиперемию тимуса и селезенки. Тимус сохранял типичное строение. Корковое вещество каждой дольки содержит большое количество лимфоцитов, плотно прокрашено, а мозговое вещество окрашено в бледно-розовый цвет и демонстрирует менее плотное содержание. При гистоисследовании селезенки были установлены следующие морфологические различия между группами интоксицированных и интактных крыс. При визуальной оценке диаметры лимфатических фолликулов белой пульпы у опытных крыс больше, чем у контрольных, шире и маргинальная зона. При анализе гистосрезов мезентериальных лимфатических узлов крыс опытной группы установлено сужение границ коркового вещества с уменьшением количества и размеров лимфатических фолликулов. Граница паракортикальной зоны стерта, в мозговом веществе лимфатических узлов клетки располагаются менее плотно, чем у интактных крыс. Внешний вид печени макроскопически не изменен. При микроскопическом исследовании регистрировали появление многочисленных лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме органа, зернистую дистрофию гепатоцитов и развитие простого сливающегося мелкоочагового некроза. У крыс, однократно интоксицированных препаратом в дозах 20 и 40 мг/кг, регистрируются следующие структурные изменения. В тимусе отмечается уменьшение в объеме долек, при этом границы корковой и мозговой зон не нарушены. При патоморфологическом исследовании селезенки у крыс с дозой 20 мг/кг регистрировали снижение количества лимфатических фолликулов. Они не имели четкой границы маргинальной зоны, выраженных герминативных центров. Количество периартериальных лимфоидных муфт у этих животных было уменьшено по сравнению с контролем. Другие же крысы этой группы, напротив, имели большее, чем в контрольной группе количество лимфатических фоликулов с четким зональным делением и выраженными маргинальными зонами и герминативными центрами. Количество периартериальных лимфоидных муфт в этом случае было приблизительно одинаково в опыте и контроле. У некоторых крыс, интоксицированных Аверсектом-2 в дозе 40 мг/кг, через 40 суток после введения препарата выявляли признаки редуцирования белой пульпы, в частности за счет отсутствия В-зависимых структур (лимфатических фолликулов) и преобладания площади красной пульпы. Вместе с тем у большинства животных регистрировали увеличение числа лимфатических фолликулов с герминативными центрами, при этом была хорошо выражена маргинальная зона. Брыжеечные лимфатические узлы при вскрытии у опытных крыс не имели отличий от таковых в группе контроля. Микроскопические изменения у всех опытных крыс носили однонаправленный характер и заключались в сужении границы коркового вещества с уменьшением в нем общего числа и размеров лимфатических фолликулов. Паракортикальная зона не имела четких границ. Границы 11 мозгового вещества были расширены, мозговые лимфатические синусы увеличены в объеме, плотно заполнены клеточными элементами. Печень опытных крыс не увеличена в размерах, темно-коричневого цвета и плотной консистенции. При гистоисследовании у крыс с дозами затравки 20 и 40 мг/кг были установлены признаки развития токсической жировой дистрофии. После интоксикации Аверсектом-2 в дозе 40 мг/кг отмечали разрастание соединительной ткани в паренхиме печени и наличие часто встречающихся лейкоцитарных инфильтратов. 2.5. Иммунная реактивность крыс при моделировании условий противопаразитарной обработки крупного рогатого скота Аверсектом-2 У крыс опытной группы через 1 и 4 суток снижалось процентное и абсолютное содержание сегментоядерных нейтрофилов вплоть до развития острой нейтропении (табл.1), что свидетельствует об угнетении гранулоцитарного ростка кроветворения. Таблица 1- Абсолютное содержание лейкоцитов в крови крыс при однократном введении Аверсекта-2 в дозе 0,2 мг/кг, ×109/л (M±m), n=5 Группы Общее колич-во лейко-в Эозинофилы Нейтрофилы П С Лимфоциты Контроль Опыт 12,94±0,57 7,84±0,61 ** Контроль 5,46±0,36 Через 24 часа после введения Аверсекта-2 0,99±0,10 0,09±0,04 3,36±0,25 9,18±0,32 0,40±0,08 0,04±0,02 1,56±0,21 7,99±0,70 ** ** Через 4 суток после введения Аверсекта-2 0,41±0,04 0,07±0,03 3,18±0,13 8,98±0,56 0,18±0,07 0,02±0,02 1,44±0,9 5,92±0,51 * ** ** Через 8 суток после введения Аверсекта-2 0,13±0,02 0,07±0,02 2,65±0,37 5,46±0,36 Опыт 4,93±0,91 0,10±0,04 Контроль 13,98±0,66 Опыт 10,53±0,80* 0,04±0,02 3,18±0,51 4,93±0,91 Моноциты Клетки Боткина Гумпрехта 0,05±0,03 0,06±0,03 0,32±0,07 0,49±0,06 0,00±0,00 0,03±0,03 0,30±0,13 0,26±0,08 0,00±0,00 0,26±0,05 0,00±0,00 0,36±0,02 Примечание: достоверность различий относительно контроля: * - (р≤0,05) ** - (р≤0,01). О выраженном гематотоксическом действии Аверсекта-2 говорит достоверное увеличение процентного содержания клеток Боткина-Гумпрехта через 1 сутки после введения препарата (4,80±0,73 против 2,20±0,27%, р≤0,05) и снижение доли эозинофилов (3,8±0,73 против 7,00±0,44, р≤0,05). Качественные изменения клеток лейкоцитарного ростка отмечали через 4 и 8 суток после первого введения препарата. В этот период преобладали клетки с рыхлым, петлистым, кружевным характером хроматина ядра, что свидетельствует о незрелости выбрасываемых костным мозгом клеток. 12 Таблица 2-Абсолютное содержание лейкоцитов в крови крыс при повторном введении Аверсекта-2 в дозе 0,2 мг/кг, ×109/л (M±m), n=5 Группы Общее колич-во лейкоцитов Контроль Опыт 6,69±0,38 Контроль Опыт 9,35±0,36 Контроль Опыт 8,00±0,34 9,17±0,33 ** 11,09±0,3 5* Моноциты Клетки Боткина Гумпрехт а Через 8 суток после введения Аверсекта-2 0,06±0,02 0,10±0,03 2,07±0,18 4,34±0,62 0,00±0,00 0,11±0,07 0,07±0,04 3,90±0,52 4,81±0,70 ** Через 14 суток после введения Аверсекта-2 0,06±0,02 0,08±0,02 2,23±0,14 6,88±0,30 0,00±0,00 0,30±0,07 0,00±0,00 0,11±0,03 0,09±0,02 0,00±0,00 0,53±0,03 ** 0,02±0,02 0,21±0,09 Эозинофилы Нейтрофилы П С Лимфоциты 0,09±0,00 0,20±0,07 2,09±0,28 8,02±0,33 * Через 21 сутки после введения Аверсекта-2 0,23±0,06 0,11±0,04 1,89±0,07 5,56±0,33 5,86±0,80 0,03±0,02 0,12±0,04 2,45±0,35 3,06±0,49 0,00±0,00 0,19±0,04 * ** * ** Примечание: достоверность различий относительно контроля: * - (р≤0,05) ** - (р≤0,01). При исследовании мазков крови отмечали появление лимфоцитов с токсигенной зернистостью, вакуолизацией ядра и цитоплазмы. Через 21 сутки после повторной обработки развивается выраженная лейкоцитопения . 2.6. Клеточные и гуморальные иммунные реакции у крыс при использовании Аверсекта-2 Клеточное звено иммунного ответа при введении крысам Аверсекта-2 определяли по реакции ГЗТ. Животных сенсибилизировали в область предплюсны тазовых конечностей Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг. Через 7 суток проводили разрешающее введение препарата в той же дозе в объеме 0,05 мл в область предплюсны левой тазовой конечности, а в правую – 0,05 мл 0,9%ного раствора NaCl. Учет реакции проводили через 24 часа после введения разрешающей дозы. У всех животных опытной группы после повторного введения в область предплюсны Аверсекта-2 регистрировали признаки развития воспалительной реакции: красноту, припухлость и повышение местной температуры. Вследствие отека стопа увеличилась в объеме на 31% и составила 1,15±0,06 см3 против 0,88±0,04 см3 (Р≤0,01) в контроле. Оценку влияния однократного введения Аверсекта-2 в терапевтической дозе (0,2 мг/кг) на гуморальный иммунный ответ проводили по количеству АОК на 4 и 8 сутки после проведения противопаразитарной обработки. В результате было отмечено достоверное увеличение числа АОК в селезенке 13 крыс через 96 и 192 часа после его введения по сравнению с интактными крысами (рис.3). 450 ** Содержание АОК в селезенке кл/п.зр. 400 350 ** 300 247,20 250 227,89 200 150 100 50 38,40 4- NaCL 0,9%(96ч.)+NaCL 0,9%(96ч.) 5- Аверсек-2 (96ч.) 6-Аверсект-2 (192ч.) 0 -50 4 5 6 Среднее значение по группе Дов ерительный интерв ал группы Рисунок 3 - Влияние Аверсекта-2 на процесс спонтанного образования АОК в селезенке крыс (М±m), n=5. В скобках указано время, по истечении которого проводили учет реакции; достоверные различия по сравнению с контрольной группой: ** - (р≤0,01). 800 Содержание АОК в селезенке кл/п.зр. 700 600 536,57 470,03 500 ** 400 381,51 300 1- ЭБ (96ч.) 2- Аверсект-2 и ЭБ (96ч.) 3- Аверсект-2 (96ч.) + ЭБ (96ч.) 200 Среднее значение по группе 100 1 2 3 Дов ерительный интерв ал группы Рисунок 4 - Антителообразование в селезенке крыс, обработанных Аверсектом-2 и иммунизированных ЭБ (М±m), n=5. В скобках указано время ожидания в часах от введения препарата до иммунизации ЭБ и затем от введения ЭБ до учета реакции; достоверные различия по сравнению с контрольной группой: ** - (р≤0,01). Поскольку в естественных условиях любому организму постоянно приходится сталкиваться с воздействием не одного, а многих антигенов, совместное действие которых может усиливать или ослаблять иммунный 14 ответ, то вторая серия опытов заключалась в воспроизведении таких условий за счет внутрибрюшинной иммунизации ЭБ одновременно с обработкой Аверсектом-2, а также через 96 часов после введения препарата. В результате исследований установлено угнетающее действие Аверсекта-2 на образование АОК в селезенке крыс, подвергнутых иммунизации ЭБ. Так, введение крысам 0,2 мг/кг Аверсекта-2 практически одновременно с иммунизацией ЭБ (рис.4) тормозит антителообразование на 30%, а при введении ЭБ через 96 часов после обработки Аверсектом-2 – на 12,5%. 2.7. Фармакокоррекция неспецифической резистентности крыс в условиях острой интоксикации Аверсектом-2 Содержание фагоцитирующих клеток возрастало через 14 суток после интоксикации Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг до 26,71±0,52% по сравнению с 23,43±0,30%, в контрольной группе, р≤0,05. Вместе с тем увеличились показатели спонтанного и активированного НСТ-тестов на 14% (р≤0,01) и 50% (р≤0,01) соответственно. В этот период в периферической крови преобладали ЦИК малых размеров, их общее количество было достоверно ниже регистрируемых ЦИК средних размеров у интактных крыс (339,71±9,75 против 415,43±3,30 ед., р≤0,01). Анализ показателей неспецифической резистентности крыс после введения бетулинсодержащего сорбента показывает, что трехдневный курс энтеросорбции не изменяет установленных при интоксикации тенденций к увеличению спонтанного и активированного НСТ-тестов, но снижает уровень фагоцитирующих клеток (20,29±1,43%) относительно контрольных (23,43±0,30%) и интоксицированных животных (26,71±0,52%, р≤0,05). Изменения ЦИК заключаются в укрупнении их размеров до средней величины. 2.8. Иммунная реактивность коров после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 и коррекции энтеросорбентом Общее количество лейкоцитов у коров на фоне обработки противопаразитарным препаратом Аверсект-2 имело тенденцию к снижению, а при введении сорбента с бетулином даже достоверно снижалось. Эта закономерность сохранялась на протяжении всего периода исследования, хотя колебания значений показателя находились в пределах физиологической нормы. При снижении общего количества лейкоцитов через 14 суток после обработки регистрировали достоверное уменьшение абсолютного содержания лимфоцитов и их доли в лейкограмме животных обеих подвергнутых исследованию групп. Через 21 сутки после начала опыта у животных, не подвергавшихся энтеросорбции, процентное содержание лимфоцитов в лейкограмме возвращалось к фоновому значению, а у животных, получавших сорбент с бетулином, сохранялась тенденция к 15 снижению процентного содержания этих клеток. Достоверное снижение общего количества моноцитов и их доли в лейкограмме у коров двух исследованных групп через 14 суток после начала эксперимента является закономерным и расценивается как результат перехода их в ткани с целью удаления разрушенных клеток и патогенных иммунных комплексов. В лейкограмме коров обеих групп регистрировали однотипные изменения. Так, через 14 суток после введения препарата отмечали увеличение процентного содержания нейтрофилов по сравнению с фоновыми показателями. У животных первой опытной группы (без энтеросорбции) данный показатель увеличился на 9,5% , а у коров, получавших сорбент на фоне обработки, он возрос на 23,5 %. Через 14 суток после обработки установлена тенденция к снижению спонтанного и активированного НСТ–тестов у коров, не получавших сорбент, на фоне достоверного повышения процента фагоцитирующих клеток (табл. 3 ). Таблица 3 - Показатели неспецифической резистентности коров до и после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 с последующей коррекцией энтеросорбентом (M±m), n=5. Группы Фагоцитоз с латексом, % НСТ-тест (спонт.), % НСТ-тест (активир), % ЦИК по Дижону, ед. Размер ЦИК До введения Аверсекта-2 80,50±1,08 1,00±0,26 1,80±0,53 596,70±37,57 средний 341,30±22,38 *** малый Через 14 суток 83,10±0,91 * 0,40±0,16 1,40±0,16 Через 21 сутки До введения Аверсекта-2 и сорбента 85,00±1,09 1,40±0,40 2,60±0,60 365,00±32,75 малый 90,60±0,85 0,00±0,00 0,40±0,16 491,30±10,68 средний Через 14 суток 77,00±3,90 0,80±0,29 1,40±0,52 384,00±10,45 ** * * *** малый Через 21 сутки 78,00±3,74 0,60±0,16 1,50±0,45 375,30±7,57 малый Примечание: при определении достоверности различий показатели через 14 суток после обработки сравнивали с показателями до обработки, а через 21 сутки – с показателями через 14 суток * - (р≤0,05) ** - (р≤0,01) *** - (р≤0,001) Совершенно обратную тенденцию отмечали у коров, получавших сорбент после проведения противопаразитарной обработки. Здесь при достоверном снижении процента фагоцитирующих клеток значение спонтанного и активированного НСТ–тестов достоверно возрастало через 14 суток с сохранением данной тенденции в последующие 7 суток. В процессе исследований выявлено достоверное снижение уровня ЦИК в обеих группах (табл. 3). Разница заключается лишь в выраженности снижения по отношению к фоновому значению. У коров, не получавших сорбент с бетулином после противопаразитарной обработки, данный показатель снижался на 43% через 14 суток после начала опыта, а через 3 недели - на 39%. В группе животных, подвергнутых энтеросорбции, - на 22% и 24% соответственно. 16 Резкое снижение показателя ЦИК может свидетельствовать об отложении иммунных комплексов в различных органах и тканях с последующим развитием воспалительной реакции и дистрофических процессов. Через 14 суток после обработки Аверсектом-2 уровень общего белка в организме коров достоверно снижается на 7,5%. Введение бетулинсодержащего сорбента позволяет снизить потерю общего белка до 4% через 14 суток и полностью восстановить его уровень через 21 сутки после обработки. Уровень альбуминов достоверно не изменяется в течение всего периода наблюдения. Содержание α-1-глобулинов возрастает (р≤0,001) в обеих опытных группах, а α-2-лобулинов – снижается (р≤0,01), хотя и незначительно. Установленные тенденции сохраняются до окончания эксперимента. Уровень β-глобулинов у коров, обработанных Аверсектом-2, снижается(р≤0,001) относительно фона, а у коров с введением сорбента, напротив, возрастает (р≤0,01) через 14 суток. Через три недели эти тенденции сохраняются, но различия сглаживаются. 2.9. Патоморфологические изменения в органах иммунной системы коров после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 и фармакокоррекции У бычков, подвергнутых однократной обработке Аверсектом-2, было отмечено разрыхление пульпы селезенки и ее выбухание над уровнем разреза при макроскопическом исследовании через 3 недели после обработки. Трехдневный курс энтеросорбции нивелировал признаки застойной гиперемии. Количество лимфатических фолликулов в селезенке бычков, обработанных Аверсектом-2, и у контрольных животных было примерно одинаковым. При этом в опытной группе регистрировали большое количество фолликулов, не имеющих четкого зонального деления и выраженных герминативных центров. Проведение коррекции энтеросорбентом, модифицированным бетулином, позволяет стимулировать иммунные процессы и приводит к увеличению в селезенке числа фолликулов с четким зональным делением. При этом увеличивается количество периартериальных лимфоидных муфт, являющихся зоной преимущественно Т-клеток. На гистологических срезах тимуса у бычков отмечалось сужение коркового и увеличение площади мозгового вещества, однако плотность клеточного состава корковой и мозговой зон была существенно ниже, чем в тимусе контрольных бычков. Применение энтеросорбента, модифицированного бетулином, приводит к стимуляции пролиферативных процессов, что проявляется в увеличении плотности клеток в мозговом и корковом веществах органа. При анализе гистосрезов брыжеечных лимфатических узлов установлено сужение границ коркового вещества с уменьшением общего количества и размеров лимфатических фолликулов по сравнению с группой контроля. В этот же период в органе усиливается 17 пролиферативная активность Т-лимфоцитов, о чем свидетельствует увеличение паракортикальной зоны. Проведение энтеросорбции, напротив, приводит к расширению корковой зоны в лимфатических узлах и стимулирует появление лимфоидных фолликулов с выраженными герминативными центрами, что свидетельствует об активации пролиферативных процессов в тимуснезависимой зоне лимфатического узла. ВЫВОДЫ 1. Острая интоксикация крыс Аверсектом-2 в дозах 2, 20 и 40 мг/кг сопровождается нарушением психоэмоционального статуса животных с преобладанием депрессивных поведенческих реакций, проявляющихся дефицитом исследовательского поведения. 2. Дозы препарата 20 и 40 мг/кг вызывают у крыс развитие лейкопении с разнонаправленными изменениями процентного содержания нейтрофилов и лимфоцитов. В течение 7 суток после интоксикации отмечается снижение уровня эритроцитов до 4,97±0,24×1012/л и гемоглобина до 55,00±5,00%, через 14 суток увеличивается количество незрелых клеток гранулоцитарного ростка в периферической крови. Средний цитохимический коэффициент миелопероксидазы возрастает через 30 суток после интоксикации, но уже через 40 суток при воздействии дозы 40 мг/кг снижается до 0,45±0,009 против 1,22 ±0,02 в контроле. 3. Патоморфологические изменения в органах иммунной системы крыс при острой интоксикации Аверсектом-2 в дозах 2, 20 и 40 мг/кг свидетельствуют о разнонаправленных изменениях белой пульпы селезенки и однотипном действии этих доз на структуру мезентериальных лимфатических узлов, что проявляется сужением границ коркового вещества и расширением мозгового. В печени при воздействии дозы 2 мг/кг развивается зернистая дистрофия, а при воздействии доз 20 и 40 мг/кг жировая дистрофия, переходящая в мелкоочаговый некроз. 4. При двукратной обработке крыс Аверсектом-2 в дозе 0,2 мг/кг с интервалом в 10 суток общее количество лейкоцитов варьирует от 9 4,93±0,91×10 /л в первые 8 суток до 11,09±0,35×109/л через 14 суток после обработки (период адаптации) с последующим развитием лейкопении с выраженными морфологическими признаками апоптоза лейкоцитов через 21 сутки после повторного введения препарата. 5. Аверсект-2 обладает аллергизирующими свойствами, что подтверждает выраженный воспалительный отек стопы у крыс при введении препарата в дозе 2 мг/кг после предварительной сенсибилизации. 6. Однократное введение крысам Аверсекта-2 в дозе 0,2 мг/кг достоверно увеличивает число АОК в селезенке на 4-е и 8-е сутки исследования. Сочетание терапевтической обработки с иммунизацией ЭБ, напротив, приводит к снижению их количества на 30%. Двукратное введение препарата вызывает увеличение индекса массы селезенки (0,346±0,01 против 18 0,250±0,01 в контроле, р≤0,01) при снижении индекса массы тимуса (0,10±0,01 против 0,16±0,01, р≤0,01). 7. Острая интоксикация крыс Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг через 14 суток после затравки сопровождается активацией фагоцитоза (26,71±0,52 против 23,43±0,30% в контроле р≤0,05), спонтанного и активированного НСТ-тестов (16,43±0,20 и 34,57±2,25% против 14,43±0,30 и 25,29±0,52% соответственно, р≤0,01) на фоне развития прогрессирующей лейкопении и абсолютной лимфоцитопении с появлением в периферической крови промиелоцитов, иммунобластов и лимфоцитов с вакуолизированной цитоплазмой, при этом уменьшается количество ЦИК малых размеров. Введение сорбента, модифицированного бетулином, в дозе 0,2 г/кг в течение 3-х суток после острой интоксикации Аверсектом-2 в дозе 2 мг/кг предотвращает развитие выраженных изменений в гемограмме у крыс и приводит к преобладанию ЦИК средних размеров, а также способствует снижению гиперактивного фагоцитоза и стимулирует Т-клеточные структуры лимфатических узлов и тимуса. 8. Однократная обработка крупного рогатого скота Аверсектом-2 в дозе 0,2 мг/кг приводит к угнетению гемопоэза, увеличению фагоцитарной активности через 14 суток (до 83,10±0,91 против 80,50±1,08% до введения, р≤0,05) при снижении уровня спонтанного и активированного НСТ-тестов (до 0,40±0,16 и 1,40±0,16 против 1,00±0,26 и 1,80±0,53% соответственно), содержания общего белка в сыворотке крови (до 90,25±2,43 против 97,58±1,16 г/л до обработки, р≤0,001) и уровня ЦИК (на 43% через 14 суток и 39% через 21 сутки после введения препарата относительно фоновых значений). В тимусе и мезентериальных лимфатических узлах бычков через 21 сутки после однократной обработки Аверсектом-2 происходит сужение границ коркового вещества и снижение плотности клеточного состава в мозговом. 9. Фармакокоррекция бетулинсодержащим сорбентом позволяет минимизировать потерю общего белка организмом коров с полным восстановлением его уровня через 21 сутки после обработки, а также повысить показатели спонтанного и активированного НСТ-тестов (до 0,80±0,29 и 1,40±0,52 против 0,00±0,00 и 0,40±0,16 соответственно, р≤0,05) при снижении уровня ЦИК. У бычков 3-х – дневный курс энтеросорбции после однократной обработки Аверсектом-2 способствует расширению границ Т-зависимых зон в мезентериальных лимфатических узлах, тимусе и селезенке. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Рекомендуем при использовании Аверсекта-2 для противопаразитарной обработки животных учитывать, что препарат обладает гематотоксичностью, аллергизирующими свойствами и снижает неспецифическую резистентность в течение 14 суток после обработки, а также подавляет Т-зависимый гуморальный иммунный ответ на антигены в 19 первые восемь суток после введения, что имеет принципиальное значение для установления сроков иммунизации животных после обработки. 2. Для минимизации гемато- и иммунотоксических эффектов Аверсекта-2 целесообразны трехдневные курсы энтеросорбции с применением углеродного сорбента, модифицированного бетулином, в дозе 0,2 г/кг массы. 3. Разработаны методические рекомендации для специалистов ветеринарной службы «Фармакокоррекция иммунотропных эффектов Аверсекта-2 при противопаразитарной обработке животных» (Омск, 2012). СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1.Вовк А. А. Клинические проявления и изменение естественной резистентности у крыс под действием токсической дозы противопаразитарного препарата Аверсект-2 / А. А. Вовк // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: материалы междунар. науч.-практ. конф. – Краснообск, 2010. - С. 298-303. 2.Вовк А. А. Лейкоцитарное звено крови лабораторных крыс при интоксикации Аверсектом-2 / А. А. Вовк // Вестник НГАУ – 2011. - № 2 (18). – С. 8387. 3.Вовк А. А. Особенности поведения лабораторных крыс в тесте «Открытое поле» при острой интоксикации препаратом Аверсект-2 /А. А. Вовк // Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы междунар. науч.практ. конф. – Ульяновск, 2011. – Т. 2. - С. 202-205. 4. Вовк А. А. Особенности лейкоцитарной реакции у крыс при введении терапевтической дозы Аверсекта-2 / А. А. Вовк // Материалы III съезда фармакологов и токсикологов России: сб. науч. тр. – СПб., 2011. - С. 201-203. 5.Вовк А. А. Патоморфологические изменения у крыс при острой интоксикации препаратом Аверсект-2 / А. А. Вовк, А. А. Устюжанина // Научные основы развития АПК : сб. науч. тр. студенческой конф. – Барнаул, 2011. - С. 202-203. 6.Вовк А. А. Активность миелопероксидазы коров после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 и коррекции энтеросорбентом / А. А. Вовк // Инфекционная патология животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. – Омск, 2011. - С. 207-209. 7.Герунова Л. К. Иммунная реактивность коров после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 и коррекции энтеросорбентом /Л. К. Герунова, А. А. Вовк // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – 2012. - № 1. – С. 6063. 8.Вовк А. А. Белковый спектр плазмы крови коров после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 и коррекции энтеросорбентом / А. А. Вовк, Л. К. Герунова //Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы науч.-практ. конф. – Новосибирск, 2012. - С. 60-61. 9.Вовк А. А. Патоморфологические изменения в органах иммунной системы животных при воздействии Аверсекта-2 и энтеросорбента, модифицированного бетулином / А. А. Вовк, М. В. Кошкарев // Экологические проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском хозяйстве: материалы междунар. науч.практ. конф. – Екатеринбург, 2012. – С. 15-19. 10.Фармакокоррекция иммунотропных эффектов Аверсекта-2 при противопаразитарной обработки животных : метод. рекомендации / Л. К. Герунова, А. А. Вовк. – Омск : [б. и.], 2012. – 15 с. 20
