Изоляция противоангиогенного вещества из Agaricus Blazei Murill: его противоопухолевое и противометастатическое воздействие

Изоляция противоангиогенного вещества
из Agaricus Blazei Murill: его
противоопухолевое и
противометастатическое воздействие
Yoshiyuki Kimura,1 Tadashi Kido,3 Takeshi Takaku,2 Maho Sumiyoshi1 и Kimiye Baba3
1 Второе Отделение Клинической Биохимии, Медицинский Университет и 2 Единый
Центр Наук, Отделение Shigenobu, Университет Ehime, Shigenobu-cho, Onsen-gun, Ehime 7910295; and 3 Отделение Фармакогнозии, Университет Фармацевтических Наук Осака,
Nasahara, Takatuski Сити, Осака 569-1094
(получено 10ого июня 2004г./исправлено 26ого июля 2004г./одобрено 27ого июля 2004г.)
Ранее мы выявили, что провитамин Д2 (эргостерол), выделенный из Agaricus Blazei,
приостанавливает рост опухоли посредством торможения реваскуляризации, вызванной
опухолью. В настоящем исследовании мы изолировали из гриба последующие
противоангиогенные вещества (А-1 и А-2), используя систему анализа ангиогенеза,
вызванного Matrigel и дополненного эндотелиальным фактором роста. А-1 был
идентифицирован
как
пироглютамат
натрия.
Позднее
мы
исследовали
противоопухолевое и противометастатическое воздействие А-1 на мышей, носителей
карциномы легких Льюиса (КЛЛ). А-1 (30,100 и 300 мг/кг) тормозил рост опухоли и
метастазирование легких. Путем орального приема А-1 (30,100 и 300 мг/кг)
наблюдалось торможение уменьшения количества селезеночных лимфоцитов, Т клеток
CD4+ и CD8+ у мышей, носителей КЛЛ. Далее, благодаря использованию А-1, мы
наблюдали увеличение количества апоптических клеток опухолей, Т клеток CD8+, а
также, природных клеток киллеров, распространившихся в опухоли. Наблюдалось
притормаживание увеличения выражения фактора Willebrand (измерение ангиогенеза)
в опухоли. Данные результаты позволили сделать вывод, что противоопухолевое и
противометастатическое воздействие А-1 (пироглютамат натрия) может быть связано с
подавлением сниженной иммунной реакции, вызванной ростом опухоли и
реваскуляризации, вызванной опухолью. Это первый доклад, демонстрирующий, что
пироглютамат натрия, изолированный из Agaricus Blazei, как противоангиогенное
вещество
обладает
сильнодействующим
противоопухолевым
и
противометастатическим, а также иммуномодулирующим действием на мышей,
носителей опухоли. (Cancer Sci 2004; 95: 758–764)
В Бразилии базидиальный гриб Agaricus Blazei Murill (японское название: Himematsutake
или Agarikusutake) традиционно использовался в качестве продукта лечебного питания для
предотвращения рака, диабета, гиперлипидемии, артериосклероза и хронического гепатита.
Официально подтверждено, что ежегодно в Японии производится от 200000 до 400000 кг
сухого тела Agaricus Blazei. 1, 2) Для предотвращения рака и/или в качестве
вспомогательного средства совместно с химиотерапевтическими лекарствами после удаления
злокачественной опухоли, Agaricus Blazei используют от 300000 до 500000 людей. 1, 2)
Обычно прописывают 3-5 граммов водного экстракта Agaricus Blazei три раза в день.
Горячий водный экстракт Agaricus Blazei обладает сильным противоопухолевым
воздействием на мышей, носителей саркомы 180. 3–6) Предполагается, что
- (1-6) глюкановой фракции. 3–6) Ранее мы
исследовали противоопухолевое воздействие различных веществ, изолированных из
липидной части Agaricus Blazei и идентифицировали эргостерол как активное вещество. 7)
Мы обнаружили, что эргостерол тормозил реваскуляризацию, вызванную опухолью. Далее,
мы обнаружили, что ацетон - растворимые фракции экстрактов этанола тормозили рост
опухоли и метастаз у мышей, носителей карциномы легких Льюиса (КЛЛ), а также
ангиогенез, вызванный Matrigel (неопубликованные данные). В предварительном
эксперименте, в ацетон - растворимых фракциях экстрактов этанола, мы обнаружили
большое количество Д-маннитола. Тем не менее, in vivo (данные не указаны) Д-маннитол не
оказывает эффекта на ангиогенез, вызванный Matrigel. Поэтому мы приготовили метанол растворимую фракцию из хлороформ - метанола (1:1, в объемном отношении) для того,
чтобы удалить Д-маннитол. После этого мы попытались изолировать противоангиогенные
вещества из метанол- растворимой фракции, которые проявляли противоопухолевое и
противоангиогенное воздействие. С помощью метода анализа ангиогенеза, вызванного
Matrigel, мы изолировали два активных вещества (А-1 и А-2) из Agaricus Blazei. Этот доклад
ставит себе целью определить структуру А-1 и эффект, оказываемый А-1 на рост опухоли и
метастаз легких у мышей, носителей КЛЛ. Кроме того, с целью прояснить механизм
противоопухолевого и противоангиогенного воздействия А-1, мы исследовали эффект А-1 на
селезеночную иммунную функцию, апоптоз опухоли и реваскуляризацию, вызванную
опухолью.
Вещества и методы
Общие экспериментальные процедуры
Спектр 1H-NMR (499.8 мегагерц) и 13C-NMR (125.68 герц) были зафиксированы в D2O с
помощью спектрометра Varian Unity Inova 500 (Tosoh, Токио). Масс-спектры были измерены
с помощью спектрометра Hitachi M-4000 H (Токио). Тонкослойная хроматография (ТСХ),
предварительная ТСХ, обращённо-фазовая колоночная хроматография и предварительная
обращённо-фазная хроматография (ОФХ (RP-HPLC)) были проведены с использованием
силикагеля 60 F254, силикагеля 60 PF254, силан силикагеля 60 PF254 (Merck, Германия) и
колонки Shimpak PREP-ODS (20 i.d
Shimadzu, Kyoto,
Япония) соответственно. Остальные химикаты были реагентами.
Природные вещества и изоляция противо-ангиогенных веществ из Agaricus Blazei
Сушеные грибные тела Agaricus Blazei были предоставлены компанией BHN Co. (Токио).
Контрольные образцы находятся на хранении во Втором Отделении Клинической Биохимии,
Медицинский Университет; Университете Ehime (Ehime, Япония). Сушеные грибные тела
Agaricus Blazei (1кг) были напрямую получены с использованием CHCl3-MeOH (1:1) (2 литра
x 3) в течение 3 часов с последующим охлаждением. Экстракт был сгущен под пониженным
давлением для получения темно-коричневого экстракта (250 г). Экстракт CHCl3-MeOH (72 г)
был получен с MeOH (1 литр x 3 раза) и разделен на MeOH - растворимую фракцию (34.3 г)
и MeOH - нерастворимую (37.7 г). Д-маннитол был изолировани из MeOH – нерастворимой
фракции(37.7 г). MeOH - растворимая фракция (34.3 г) была успешно выделена с помощью
CHCl3 и EtOAc для получения экстракта CHCl3 (6.86 г), экстракта EtOAc (0.16 г) и экстракта
H2O (19.2 г), соответственно. Далее, эргостерол (163.2 мг) и бензойная кислота (55.0 мг)
были изолированы из экстракта CHCl3 путем многоразового очищения с помощью
силикагелевой колоночной хроматографии. MeOH -растворимая часть (60 г) была обработана
с n-гексаном (1 литр x 3 раза) для получения n-гексан- растворимой (10.2 г) и n-гексаннерастворимой фракций (46.1 г). H2O-растворимая фракция и n-гексан- нерастворимая
фракция были соединены и противоангиогенные вещества были изолированы из этих
фракций под руководством метода анализа ангиогенеза, вызванного Matrigel. H2Oрастворимая плюс n-гексан- нерастворимая фракции (выход 65.3 г) были
хроматографированы на обращённо-фазовой силан кремнегелевой колонне и элюированы с
H2O - MeOH (7:3, в объемном отношении) для получения 20 фракций (М1-М30). Среди этих
20 фракций, фракции М5 и М6 тормозили ангиогенез, вызванный Matrigel. Фракции М5 и М6
(выход 5.54 г) были впоследствии разделены еще на четыре фракции (М5-1 – М5-4) с
помощью предварительной обращённо-фазной хроматографии (RP-HPLC)(Shimpack, PREPODS, элюат: H2O - MeOH (5:1, в объемном отношении); скорость потока: 6 мл/мин). М5-1 и
М5-2 тормозили ангиогенез, вызванный Matrigel. М5-1 и М5-2 (выработка 2.52 г), у которых
была нингидрин - положительная реакция, были очищены подготовительной ТСХ
(силикагель 60 PF 254, движение растворителя: H2O - MeOH (1:100, в объемном отношении)
для получения пяти веществ, включая А-1 (выход 293.7 мг) и А-2 (123.0 мг). Среди этих пяти
веществ три были идентифицированы как аланин, пролин и гамма- аминомасляная кислота
путем прямого сравнения с аутентичными образцами. Эти три вещества (аланин, пролин и
гамма аминомасляная кислота) не оказывали воздействие на ангиогенез, вызванный Matrigel,
в то время как А-1 и А-2 тормозили его.
Материалы
Матрица базальной мембраны «Matrigel» (без фактора роста, растворимый экстракт
базальной мембраны опухоли Engelbreth- Holm-Swarm (EHS)) была приобретена у Becton
Dickinson Labware (Бедфорд, Массачусетс). Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) был
приобретен у Nissui Pharmaceutical Co. (Токио) и использовался в качестве среды
культивирования. Антибиотические и антигрибковые растворы (100x), содержащие 10000
ед/мл пенициллина, 10мг/мл стрептомицина и 25 µг/мл амфотерицина в 0.9% NaCl, были
приобретены у Sigma Co. (St. Louis, Миссури). Фетальная бычья сыворотка (ФБС) была
приобретена у GIBCO BRL (Окленд, Новая Зеландия). Сосудистый эндотелиальный фактор
роста и гепарин были приобретены у Wako Pure Chemical Co. (Осака, Япония). Средство
разделения лимфоцитов мышей (Lympholytes-Mouse) было приобретено у Dainippon
Pharmacy Co. (Осака, Япония). Флюоресцеин изотиоцианат (FITC) - меченые противомышиные антитела CD4 и CD8, фикоэритрин (ФЕ(FE)) - меченое противо-мышиное
природное антитело-киллер (ПК), флюоресцеин изотиоцианат - меченый противо -мышиный
IgG2a и ФЕ - меченый противо-мышиный IgG2a были приобретены у Serotec (Оксфорд,
Англия). Кроличье поликлональное антитело GM1, мышечный моноклональное противочеловеческое CD8 антитело (D-9) и были приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта
Круз, Калифорния) и DAKO Cytomation (Киото, Япония) соответственно. Набор для
определения апоптоза apoptosis in situ был приобретен у Wako Pure Chemical Co.
Клетки
Лекарственно-устойчивые клеточные линии мышей, носителей КЛЛ с большим
количеством метастаз, были приобретены в банке генов Riken (Tsukuba, Япония) и
содержались в среде культивирования DMEM, в которую была добавлена 10% ФБС ,
пенициллин (100ед/мл), стрептомицин (10µг/мл) и амфотерицин В (0.25µг/мл).
Животные
Мыши C57BL/6J женского пола (в возрасте 5 недель) были приобретены у Clea Japan Co
(Осака, Япония) и содержались в течении 1 недели в комнате с контролируемой
температурой и влажностью. До эксперимента они имели свободный доступ к еде и воде. С
мышами обращались согласно этическим принципами Мышиного Центра, Медицинского
Университета, Университета Ehime. Комитет по Исследованиям на Животных Университета
Ehime одобрил протокол эксперимента.
Измерение реваскуляризации, вызванной Matrigel.
Реваскуляризация, вызванная Matrigel, была проанализирована с помощью модификации
метода Passaniti et al.8) Вкратце, каждой из мышей C57BL/6J женского пола подкожно была
введена инъекция 0.5 мл Matrigel, содержащего 20 нг/мл сосудистого эндотелиального
фактора роста и 32 ед/мл гепарина в присутствии или отсутствии указанного количества
различных фракций или веществ, изолированных из Agaricus Blazei. Мыши были
умерщвлены, а гели извлечены и взвешены, количество гемоглобина в гелях было
определено с помощью Hemoglobin kit (Wako Pure Chemical Co.).
Измерение роста опухоли или легочных метастазов у мышей, носителей КЛЛ
внутривенной инъекции мышам C57BL/6J женского пола в нулевой день. Метанол растворимая фракция (300 или 900 мг на кг массы тела) экстракта CHCl3-MeOH или
вещество А-1 (30,100 и 300 мг на кг), изолированное из Agaricus Blazei, принималось
орально ежедневно (0700 ч) на протяжении 30 или 14 дней, начиная через 12 часов после
имплантации клеток КЛЛ. Метанол-растворимая фракция и А-1 были растворены в
дистиллированной воде. Здоровые мыши и мыши, носители КЛЛ, не проходящие лечение,
(контрольная группа) принимали дистиллированную воду по тому же графику. Содержание
А-1 составляло от 10 до 20% в горячем водном экстракте Agaricus Blazei. Людям горячий
экстракт Agaricus Blazei обычно прописывается в дозировке от 3 до 5 грамм три раза в день.
По этой причине в исследовании использовались дозировки 30,100 и 300 мг/кг. Объем
опухоли измерялся каждые 2-3 дня посредством прямого измерения циркулем. Он
рассчитывался как длина*ширину2/ 2. На 31 или 15 день мыши были умерщвлены путем
цервикального смещения, а их селезенки, зобные железы и легкие были изъяты и взвешены.
Метастазы в легких были подсчитаны с помощью стереомикроскопа. Все опухоли и
метастатические легочные ткани были выдержаны в 10% буферном формалине, по меньшей
мере, в течение 24 часов.
Иммуногистохимическое исследование опухоли
Ткани опухоли, выдержанные в 10% буферном формалине были постепенно обезвожены в
растворах, содержащих повышенное процентное содержание этанола (70, 80, 95 и 100%),
очищены в Histoclear (FUME HOOD, AS-ONE, Токио, Япония), залиты парафином под
вакуумом, поделены на кусочки толщиной 5мм, депарафинированы и пропитаны
гематоксилином и эозином. Количество апоптических клеток в депарафинированных частях
опухоли было определено с помощью метода in situ
nick-end labeling (TUNEL), с использованием набора для определения Apoptosis in situ
Detection kit. Рост эндотелия (реваскуляризация, вызванная опухолью) и инвазия Т-клеток
CD
-киллеров в опухолях были также определены с помощью
техники иммунопероксидазы, с использованием не свойственных человеку антител vWF для
обнаружения сосудистых эндотелиальных клеток, антител анти- CD
асиало GM1 для обнаружения природных клеток-киллеров. Было сфотографировано четыре
различных микроскопических поля (усиление x100 или x 400) на тарелке, были подсчитаны
TUNEL-положительные апоптические клетки, CD8- и ПКК -положительные клетки в
опухолях.
Структура А-1
А-1 – это бесцветное густое вещество с положительной -нингидрин реакцией. Обработка
А-1 50% HCl дала L- глютаминовую кислоту. FAB-MS (m/z): 128.0379 (M –1) C5H7O3N. 1HNMR (в D2O,
ppm): 2.08 (1H, dddd, J=12.9, 8.9, 7.1 и 5.7 герц), 2.39 (1H, ddd, J=17.4, 9.3 и
7.1 герц), 2.43 (1H, ddd, J=17.4, 8.9 и 6.7 герц), 2.53 (1H, dddd, J=12.9, 9.3, 9.2 и 6.7 герц), 4.24
(1H, dd, J=5.7 и 9.2 герц). 13C-NMR (в D2O,
ppm): 184.35 (-C O-), 181.90 (-COO-), 60.28
(-CH-), 27.64 (-O=C-CH2-), 26.72 (-CH2-H2-).
Статистический анализ
Все величины выражены ±SE. Данные были проанализированы при помощи
одностороннего анализа вариантов, впоследствии различия между величинами были
проанализированы с помощью Fisher’s protected LSD multiple- comparison test (теста
множественного сравнения). Различия считались значительными при P <0.05.
Результаты
Воздействие метанол-растворимой фракции, приготовленной из хлороформметанолового (1:1) экстракта Agaricus Blazei на вес опухоли и метастазирование легких
у мышей, носителей КЛЛ.
Как видно из таблицы 1, по сравнению с весом опухолей у мышей, носителей КЛЛ, не
проходящих курс лечения (контрольные группы), у мышей, носителей КЛЛ и проходящих
курс лечения, конечный вес опухоли значительно уменьшился после орального приема
метанол-растворимой фракции (300 или 900 мг/кг) в течение 30 дней подряд. Данная
фракция была приготовлена из экстракта хлороформ-метанола (1:1). Более того, благодаря
оральному приему метанол-растворимой фракции, притормозилось образование опухолевых
метастаз в легких.
Таблица 1. Воздействие метанол-растворимой фракции,
приготовленной из хлороформ
- метанолового (1:1) экстракта Agaricus Blazei на вес опухоли и метастазирование легких
у мышей, носителей КЛЛ.
Количест
во
животных
Мыши, носители КЛЛ
(контрольная группа) + метанол растворимая фракция
(300 мг/кг)
(900 мг/кг)
Вес
опухоли
Метастазы
в легких
(количество
колоний)
8
3.31± 0.50
13±4 (6/8)
8
8
1.41± 0.73
*
0.85± 0.25
*
5±3 (4/8)
4± 1* (3/8)
Метанол-растворимая фракция (300 или 900 мг/кг) принималась орально мышами, носителями
КЛЛ, ежедневно в течение 30 дней. Величины выражены ± SE у 8 мышей. * P<0.05, значительно
отличается от мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).
Воздействие активных веществ (А-1 и А-2), оказываемое на ангиогенез, вызванный
Matrigel
Гели, сформировавшиеся после подкожной имплантации Matrigel, были легко отличимы от
окружающих тканей и оказывали небольшую местную или ангиогенную реакцию (рис. 1).
Гели, произведенные из Matrigel, в которые было добавлено 20 нг/мл сосудистого
эндотелиального фактора роста и 32 ед/мл гепарина, вызывали ангиогенную реакцию (рис.
1). Использование смеси Matrigel/ сосудистый эндотелиальный фактор роста /гепарин
значительно увеличивало вес геля и концентрацию в нем гемоглобина в сравнении с тем,
когда Matrigel вводился самостоятельно на 6 день после имплантации. Метанол-растворимая
фракция (800µг/мл), приготовленная из хлороформ-метаноло-растворимой фракции,
значительно тормозила ангиогенез, вызванный смесью Matrigel/сосудистый эндотелиальный
фактор роста /гепарин (таблица 2). Более того, изоляция активных компонентов из фракций
М5 плюс М6 была проведена под руководством анализа Matrigel -имплантированного
ангиогенеза, описанного в «Веществах и Методах», а четыре фракции (М5-1 – М5-4),
обладающие противоангиогенным воздействием были получены из фракций М5 плюс М6 с
помощью предварительной обращённо-фазной хроматографии, как описано в «Веществах и
Методах». Среди этих четырех фракций, М5-1 и М5-2 тормозили ангиогенез, вызванный
смесью Matrigel /сосудистый эндотелиальный фактор роста /гепарин (таблица 3). А-1 и А-2
были изолированы как противоангиогенные вещества из фракций М5-1 и М5-2 путем
повторяющейся ТСХ, описанного в «Веществах и Методах» (таблица 3). А-1 в дозировке 400
или 800 µг/мл тормозил ангиогенез, вызванный Matrigel, пополненным сосудистым
эндотелиальным фактором роста и гепарином.
Рис. 1. Противоангиогенное воздействие А-1, изолированного из метанол–растворимой
фракции A. blazei. a) и b) Воздействие A-1 на вес Matrigel (a) и концентрацию гемоглобина (b)
гелей, вызванных Matrigel пополненного сосудистым эндотелиальным фактором роста и
гепарином. Величины выражены±SE у 6 мышей в каждой группе c) Фотографии Matrigel
через 6 дней после подкожного введения Matrigel самостоятельно или Matrigel, пополненного
сосудистым эндотелиальным фактором роста и гепарином.
В отсутствии или присутствии указанного количества A-1.
Таблица 2. Воздействие активных веществ из A. blazei. на ангиогенез, вызванный
Matrigel (1)
Лечение
Matrigel
самостоятельно
Matrigel+
сосудистый
эндотелиальный
фактор роста (СЭФР)
(20 нг/мл) + гепарин
(32 ед/мл)
Matrigel/ СЭФР/
гепарин + метанол растворимая фракция
эктракта метанол –
хлороформа
Количество
животных
Вес Matrigel
Концентрация
гемоглобина (мг/
Matrigel)
3
18.3+-1.22
248.2+-50.2
7.5+-1.50
29.0+-9.00
52.5+-11.0
314.3+-68.2
133.2+-6.65
270.2+-157.0
92.9+-20.2
76.1+-1.50
248.7+-44.9
20.5+-2.5
20.0+-9.00
16.0+-2.00
26.0+-5.00
11.5+-4.58
12.5+-1.15
17.5+-4.50
3
(800µг/мл)
+М2 (800µг/мл)
+М3 (800µг/мл)
+М4 (800µг/мл)
+М5 (800µг/мл)
+М6 (800µг/мл)
+М7 (800µг/мл)
3
3
3
3
3
3
3
+М8 (800µг/мл)
+М9 (800µг/мл)
+М10 (800µг/мл)
+М11 (800µг/мл)
+М12 (800µг/мл)
+М13 (800µг/мл)
+М14 (800µг/мл)
+М15 (800µг/мл)
+М16 (800µг/мл)
+М17 (800µг/мл)
+М18 (800µг/мл)
+М19 (800µг/мл)
+М20 - 23 (800µг/мл)
+М24 - 30 (800µг/мл)
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
137.6+-84.7
207.4+-118.0
101.7+-84.8
339.2+-7.50
213.9+-90.2
182.1+-21.4
182.7+-29.5
217.1+-72.3
187.5+-55.7
185.9+-55.1
180.3+-89.9
98.7+-20.5
110.8+-28.4
90.4+-70.6
11.0+-7.00
17.0+-6.00
18.0+-1.00
21.0+-2.50
18.5+-8.50
19.5+-2.50
13.5+-3.50
16.0+-7.30
18.0+-5.00
10.0+-7.00
14.5+-6.50
15.5+-6.50
15.0+-6.00
14.0+-4.00
Структура активных веществ(а) (А1 и А2).
А-1 и А-2, обладающие противоангиогенным воздействием, были изолированы из метанолрастворимой фракции экстракта хлороформ-метанола (1:1). А-1 – это густое вещество,
дающее положительную нингидрин реакцию. Обработка А-1 50% HCl давала Lглютаминовую кислоту. Основываясь на анализе спектра FAB-MS, молекулярная формула А1 – C5H7O3N (M –1, 128.0379). Спектр 1H-NMR (в D2O
ppm) А-1 показывал
протонные, соответствующие метиленовым группам при 2.08 (1H, dddd, J=12.9, 8.9, 7.1 и 5.7
герц) и 2.53 (1H, dddd, J=12.9, 9.3, 9.2 и 6.7 герц) при позиции C-4, и 2.39 (1H, ddd, J=17.4, 9.3
и 7.1 герц) и 2.43 (1H, ddd, J=17.4, 8.9 и 6.7 герц) при позиции C-3, и сигнал,
соответствующий метиной группе при 4.24 (1H, dd, J=5.2 и 9.7 герц) при позиции C-5.
Спектр 13C-NMR (в D2O
ppm) А-1 показывал углеродные сигналы в результате
карбонильных групп при 181.90 и 184.35, сигнал в результате метин группы при 60.28 и
сигналы в результате метилен групп при 26.72 и 27.64. Несмотря на то, что эти данные по А1 схожи с данными по L-пироглютамату, химические сдвиги у А-1 отличался от химических
сдвигов у L-пироглютамата. Поэтому можно предположить, что А-1 – это соль натрия или
калия пироглютамата. Атомно-абсорбционный анализ А-1 выявил наличие натрия, но другие
металлы не были обнаружены. Поэтому, основываясь на атомно-абсорбционный анализе А-1,
был сделан вывод, что А-1 – это натриевый пироглютамат. Структура А-2 все еще
исследуется.
Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на рост опухоли и метастазирование
легких у мышей, носителей КЛЛ.
По сравнению с объемом опухоли у мышей, носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения
(контрольная группа), объем опухоли у мышей, носителей КЛЛ, проходивших курс лечения,
значительно уменьшился вследствие орального приема А-1 (30,100 и 300 мг/кг) в течение 30
дней подряд (рис. 2). Более того, конечный вес опухоли и образование опухолевых метастаз в
легких также тормозились благодаря оральному приему А-1 в дозировке 30,100 и 300 мг/кг
(таблица 4). Между тремя дозировками А-1 (30,100 и 300 мг/кг) не было значительной
разницы. Для исследования противоопухолевого и противометастатического воздействия
более маленьких дозировок А-1 необходимы дальнейшие исследования. Количество
n=8) и концентрация гемоглобина (7.80±1.25 г/100
мл, n=8) у мышей, носителей КЛЛ, были значительно (P=0.010 и P=0.012 соответственно)
ин/100мл), чем у здоровых
мышей. Как видно из таблицы 5, оральный прием А-1 (30,100 и 300 мг/кг) значительно
тормозил сокращение количества эритроцитов и концентрации гемоглобина у мышей,
носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения (контрольные группы). С другой стороны, не
наблюдалось значительных различий в количестве лейкоцитов у здоровых мышей и у мышей,
носителей КЛЛ, проходивших и не проходивших курс лечения А-1.
Рис. 2. Воздействие A-1, выделенного из A. blazei, на рост опухоли у мышей, носителей
КЛЛ. A-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально один раз в день мышами с подкожно
имплантированной КЛЛ ежедневно в течение 30 дней. Величины выражены ± SE у 8 мышей.
* P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей КЛЛ , не проходивших курс
лечения.
Таблица 3. Воздействие активных веществ из A. blazei на ангиогенез, вызванный
Matrigel (2)
Лечение
Matrigel
самостоятельно
Matrigel+ СЭФР (20
нг/мл) + гепарин (32
ед/мл)
Matrigel/ СЭФР/
гепарин
+М5-1 (800µг/мл)
+М5-2 (800µг/мл)
+М5-3 (800µг/мл)
+М5-4 (800µг/мл)
Matrigel
самостоятельно
Matrigel+ СЭФР (20
нг/мл) + гепарин (32
ед/мл)
Matrigel/ СЭФР/
гепарин
+А-1 (800µг/мл)
+А-2 (800µг/мл)
Matrigel
самостоятельно
Matrigel+ СЭФР (20
нг/мл) + гепарин (32
ед/мл)
Matrigel/ СЭФР/
гепарин + Lпроглютаминовая
кислота
(500µг/мл)
Количество
животных
Вес Matrigel (мг)
Концентрация
гемоглобина (мг/
Matrigel)
5
50.4±13.8 *
15.0±2.48 *
5
231.5±42.1
21.8±1.11
5
5
5
5
151.5±22.5
127.3±33.3 *
204.8±35.5
191.3±26.3
15.4±0.87 *
15.4±1.03 *
20.6±2.16
25.0±3.52
5
117.2±10.6 *
7.0±0.45 *
5
455.9±53.0
30.4±3.09
5
5
183.0±44.6 *
174.4±40.8 *
14.2±3.23 *
15.4±4.19 *
5
152.2±27.5
9.0±0.89
5
397.9±56.6
24.6±5.20
5
167.8±29.0 *
9.2±1.02 *
Величины выражены ± SE у 5 мышей. * P<0.05, значительно отличается от Matrigel, дополненного
СЭФР (20 нг/мл) и гепарином (32 ед/мл)
Таблица 4. Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на вес опухоли и
метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.
Количест
во
животных
Мыши, носители КЛЛ
(контрольная группа)
Вес
опухоли (г)
8
8
8
8
+А-1(30 мг/кг)
(100 мг/кг)
(300 мг/кг)
Метастазы
в легких
(количество
колоний)
3.02± 0.86
10±3 (6/8)
0.63± 0.40
*
0.51± 0.15
*
0.51
±0.22*
5±3 (4/8)
4± 1 * (3/8)
4± 1* (3/8)
А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, носителями КЛЛ, один раз в день в течение
30 дней. Величины выражены ± SE у 8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей, носителей
КЛЛ (контрольная группа).
Таблица 5. Воздействие А-1, изолированного из Agaricus Blazei, на вес опухоли и
метастазирование легких у мышей, носителей КЛЛ.
Количест
во
животных
Здоровые мыши
Мыши, носители КЛЛ
(контрольная группа)
+А-1(30 мг/кг)
(100 мг/кг)
(300 мг/кг)
Лейкоцит
ы (X10 3/мл)
Эритроцит
ы
(X10 4/мл)
3.32±
0.182
799.0±7.43 *
12.4±0.09 *
506.3±78.4
685.9± 72.9
*
743.2 ±22.0
*
692.6± 37.2*
7.80±1.25
10.5±1.14 *
11.3±0.39 *
10.6±0.59 *
6
8
8
8
8
4.73±
0.400
3.63±
0.483
3.12
±0.585
5.83±1.13
4
Концентрац
ия
гемоглобина
(г/ 100 мл)
А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, носителями КЛЛ, один раз в день на
протяжении 30 дней. Величины выражены ± SE у 6-8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от
мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).
Таблица 6. Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на количество лимфоцитов, Т
клеток CD
CD
-киллеров в селезенках мышей, носителей
КЛЛ.
Количество клеток (X10 6 клеток/селезенка)
Количест
во
животных
Здоровые мыши
Мыши, носители
КЛЛ (контрольная
Лимфоциты
Т клетки
CD4
Т клетки
CD8
Клетки
ПК
6
35.0± 4.54 *
6.50±0.90
*
7.77±1.19
*
0.17±0.0
2
8
13.9± 1.65
группа)
+А-1(30 мг/кг)
(100 мг/кг)
(300 мг/кг)
8
8
8
46.4± 9.77 *
30.3 ±4.31 *
28.4±3.53 *
2.21±0.36
5.97±1.13
*
4.13±0.44
4.61±0.58
*
4.54±0.72
8.78±0.78
*
6.34±0.63
6.62±0.62
0.26±0.0
3
0.42±0.0
6*
0.27±0.0
5
0.21±0.0
3
А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался орально мышами, носителями КЛЛ, один раз в день на
протяжении 30 дней. Величины выражены ± SE у 6-8 мышей. * P<0.05, значительно отличается от
мышей, носителей КЛЛ (контрольная группа).
Воздействие А-1 на селезеночные CD
киллеры у мышей, носителей КЛЛ.
CD
-клетки и клетки природные
Количество лимфоцитов в селезенках у мышей, носителей КЛЛ, сократилось до
селезеночных CD4 и CD
-клеток у мышей, носителей КЛЛ, также сократилось до
мыши) CD
клеток (здоровые мыши) CD
-клеток. Не наблюдалось значительной разницы между
количеством селезеночных природных клеток-киллеров у здоровых мышей и мышей
контрольной группы. Как видно из таблицы 6, уменьшение селезеночных лимфоцитов у
мышей, носителей КЛЛ значительно тормозилось оральным приемом А-1 в дозировке 30,100
и 300 мг/кг. Уменьшение количества CD
CD
-клеток у мышей, носителей КЛЛ,
также тормозилось оральным приемом А-1 в дозировке 30 и/или 300 мг/кг. При оральном
приеме А-1 в дозировке 100 мг/кг наблюдалась тенденция торможения
(P=0.0596)сокращения CD
-клеток. При оральном приеме А-1 в дозировке 30 мг/кг
количество клеток природных киллеров увеличилось в сравнении со здоровыми мышами и
мышами, носителями КЛЛ, не проходившими курс лечения (таблица 6).
Воздействие А-1 на иммуногистохимию опухолей у мышей, которым была подкожно
имплантирована КЛЛ.
На 31 день А-1 (30,100 и 300 мг/кг) увеличивал количество апоптичных клеток в опухолях
у мышей, которым была подкожно имплантирована КЛЛ (рис. 3а и таблица 7). У мышей,
носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения, выражение vWF в опухолях увеличилось
(рис. 3bи таблица 7). Эти данные демонстрируют, что реваскуляризация стимулировалась
вместе с ростом опухоли. Ангиогенез в опухолях тормозился посредством орального приема
А-1 (30,100 и 300 мг/кг) (рис. 3b и таблица 7). CD
- клетки заполонили центральную
часть опухолей после орального прием А-1 (30,100 и 300 мг/кг). Природные клетки-киллеры
также заполонили центральную часть опухолей после орального прием А-1 (30,100 и 300
мг/кг) (рис. 3,c и d, таблица 7).
Воздействие А-1 на образование метастаз в легких у мышей, которым была внутривенно
введена КЛЛ.
Как видно из рисунка 4, А-1 (30,100 и 300 мг/кг) значительно тормозил количество
опухолевых колоний, метастазирующих в легкие по сравнению с мышами, которым была
внутривенно введена КЛЛ, не проходивших курс лечения.
Таблица 7. Воздействие А-1, выделенного из Agaricus Blazei, на количество
апоптичных клеток, выражение фактора vWF (von Willebrand factor) и количество Тклеток CD8 и ПК опухолей у мышей, носителей КЛЛ.
Количество
животных
Апоптичные
клетки (колво/поле)
Выражение
vWF
Клетки
CD8 (колво/поле)
Клетки ПК
(колво/поле)
(область мм
2/поле)
Мыши, носители
КЛЛ (контрольная
группа)
8
24± 5
5543.4±1755.8
151±31
299±83
+А-1(30 мг/кг)
8
80± 29 *
208.0± 165.4 *
302±26 *
515±64 *
(100 мг/кг)
8
148 ±25 *
675.1 ±335.8 *
450±65 *
411±52 *
8
92±9 *
355.9± 228.6*
289±59 *
444±59 *
(300 мг/кг)
Вывод
В нашем предыдущем исследовании мы изолировали эргостерол от липидной фракции
Agaricus Blazеi, как противоопухолевого вещества, и получили доказательство, что механизм
его противоопухолевого воздействия может затрагивать торможение ангиогинеза, вызванного
опухолью. Более того, мы предположили, что вещество(ва) с небольшим молекулярным
весом в метанол- или водно-растворимой фракции могут обладать противоангиогенным
воздействием. В настоящем исследовании мы изолировали два активных вещества (А-1 и А2) из метанол-растворимой фракции Agaricus Blazei как противоангеогенные вещества под
руководством метода анализа ангиогенеза, вызванного Matrigel. Основываясь на анализе 1Hи 13C-NMR, FAB-MS и атомной абсорбции было определено, что А-1 – это натриевый
пироглютамат. Механизм противоангиогенного воздействия А-1 еще должен быть
исследован. Возможно, он заключается в тормозящем эффекте производства СЕФР в КЛЛ
клетках и присоединения СЕФР к сосудистым эндотелиальным клеткам. Следующим шагом
было изучение противоопухолевого противометастатического воздействия изолированного
А-1 для прояснения затронутых механизмов. А-1 не влияет на синтез ДНК в клетках КЛЛ
или на пупочные венные эндотелиальные клетки (HUVECs ) (данные не
продемонстрированы). Солидные опухоли вызывают реваскуляризацию и получающийся в
результате ангиогенез стимулирует рост опухоли и метастаз. 9–13) В нашем исследовании in
vivo мы показали противоопухолевое и противометастатическое воздействие А-1 на мышей,
носителей КЛЛ, и его воздействие, тормозящее снижение иммунных функций (сокращение
количества селезеночных лимфоцитов, CD
CD
-клеток) на мышей, носителей
КЛЛ. Кроме того, А-1 увеличил количество природных клеток-киллеров у мышей, носителей
КЛЛ. Иммуногистохимия опухолей после орального применения А-1 выявила, что А-1
увеличил апоптоз клеток опухоли и инвазию CD
-клеток и природных клеток-киллеров
в центральную область опухолей. Более того, мы подтвердили, что А-1 тормозил выражение
vWF в опухолях (реваскуляризация, вызванная опухолью). Таким образом, у мышей,
носителей опухоли, было обнаружено, что А-1 (натриевый пироглютамат) стимулировал
специфические иммунные функции в селезенке и опухолях. Было продемонстрировано, что
природные клетки-киллеры являются посредником для сильного противоопухолевого и
противометастатического воздействия. 14–16). Было выявлено, что и CD
CD
клетки необходимы для побуждения регрессии опухоли и развития защитных функций
организма. 17–20). Недавно было объявлено, что интерлейкин (ИЛ)-21 оказывает сильный
противоопухолевый эффект посредством активации природных клеток-киллеров и Т-клеток
21). Исходя из полученных результатов можно предположить, что механизм
противоопухолевого и противометастатического воздействия А-1 (натриевый пироглютамат)
может быть связан с подавлением снижения иммунной реакции, вызванного ростом опухоли
и ангиогенезом, вызванным опухолью. Это первый доклад, демонстрирующий, что
натриевый пироглютамат (А-1), изолированный из Agaricus Blazei, обладает
противоопухолевым и противометастатическим воздействием, явившимся результатом
противоангиогенного воздействия и модулирования иммунной системы у мышей, носителей
опухоли.
Рис. 4. Воздействие А-1, изолированного из A. blazei на образование метастаз в легких у
мышей, которым была внутривенно введена КЛЛ. А-1 (30, 100 и 300 мг/кг) принимался
орально мышами, которым была внутривенно введена КЛЛ, один раз в день в течение 14
дней. Величины выражены ± SE у 7 мышей. * P<0.05, значительно отличается от мышей,
носителей КЛЛ, не проходивших курс лечения.