МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет» (ПГУ) А. С. Есаулов, Н. Н. Митрофанова, В. Л. Мельников БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Учебноe пособие Пенза Издательство ПГУ 2015 1 УДК 579.61 Е81 Рецензенты: доктор биологических наук, заведующий кафедрой «Биология» Тамбовского государственного университета им. Г. Р. Державина Г. А. Лада; доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Биология, экология и химия им. А. Ф. Блинохватова» Пензенской государственной сельскохозяйственной академии А. И. Иванов Есаулов, А. С. Е81 Бактериологический метод лабораторной диагностики : учеб. пособие / А. С. Есаулов, Н. Н. Митрофанова, В. Л. Мельников. − Пенза : Изд-во ПГУ, 2015. – 84 с. ISBN 978-5-906831-14-9 Приведены современные данные о принципах, этапах, требованиях биологического метода лабораторной диагностики, его достоинствах и недостатках. Пособие составлено в соответствии с учебной программой для студентов специальности «Лечебное дело» по дисциплине «Микробиология, вирусология» и предназначено для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям. УДК 579.61 Рекомендовано к изданию методической комиссией Медицинского института Пензенского государственного университета (протокол № 8 от 09.04.2015) ISBN 978-5-906831-14-9 © Пензенский государственный университет, 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ Введение .................................................................................................................. 4 Принципы бактериологического исследования ................................................. 6 Физиология бактерий ........................................................................................... 13 Этапы бактериологического исследования ...................................................... 26 Схемы бактериологического метода исследования .......................................... 56 Общие требования проведения бактериологического исследования ............ 70 Техника взятия мазков для посева ...................................................................... 71 Материалы для бактериологического исследования ........................................ 73 Преимущества и недостатки бактериологического исследования .................. 76 Понятие о бактериологической лаборатории .................................................... 77 Требования, применяемые к бактериологическим лабораториям ................. 79 Современные системы бактериологического анализа ...................................... 81 Список литературы ............................................................................................... 82 3 ВВЕДЕНИЕ В течение долгих лет инфекционные болезни были и остаются наиболее опасными болезнями человеческого организма из-за их специфичности, распространенности, тяжелого течения и способности поражать большое количество людей в течение короткого периода времени. Основные открытия прошлого и нынешнего столетия, такие как стерилизация (Луи Пастер), иммунизация (Эдвард Дженнер), получение антибиотиков (Александр Флеминг), расширили наше понимание эпидемиологии инфекционных болезней и продемонстрировали возможность управления многими из этих заболеваний. Однако сражение с возбудителями инфекции все еще продолжается. В то время как человечеству удалось научиться управлять старыми эпидемиями, появились новые. Несмотря на улучшение условий жизни в экономически развитых странах, широко распространенную практику прививок и наличие эффективных антибиотиков, инфекционные болезни занимают еще значительное место в структуре заболеваемости и смертности человека и уступают первые места лишь болезням сердечно-сосудистой системы и злокачественным онкологическим заболеваниям. Применение лабораторных методов исследования является одним из ключевых аспектов диагностики и лечения инфекционных заболеваний. В арсенале специалистов в настоящее время есть разнообразные методы лабораторной диагностики как классические, так и новейшие, появившиеся в последние десятилетия и нашедшие широкое применение в практике. Клиническая лабораторная диагностика является наиболее динамично развивающейся отраслью медицины, активно внедряющей и использующей современные научные достижения. Лабораторная диагностика − неотъемлемая часть клинического обследования больного. Без данных лабораторных анализов невозможны не только постановка клинического диагноза, но и контроль над эффективностью и безопасностью лекарственной терапии. Бактериологический метод лабораторной диагностики действительно занимает ведущее место в клинико-диагностических показателях больного. Поэтому изучение его проведения, знание этапов, требований и деталей бактериологического анализа необходимо каждому врачу и студентам медицинских специальностей. 4 Знание основ клинико-лабораторной диагностики − необходимый фундамент для проведения фармацевтической опеки на надлежащем уровне. Клинико-лабораторная диагностика также является базой для всего цикла медицинских дисциплин, являющихся основой медицинского образования. Представляемое пособие по лабораторной диагностике, предназначенное в первую очередь для студентов медицинских вузов, учитывает специфику лечебной специальности и призвано помочь студентам в освоении данного предмета. 5 ПРИНЦИПЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериологическое исследование − исследование, предназначенное для выделения бактерий и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза. Существуют следующие принципы бактериологического исследования: 1. Квалифицированный выбор материала, подлежащего исследованию: для клинических образцов − с учетом характера и локализации патологического процесса, патогенеза заболевания и его стадии; для объектов окружающей среды − с учетом возможного значения их в качестве путей и факторов передачи микроорганизмов − возбудителей инфекций. 2. Отбор проб материала для исследования в необходимом и достаточном объеме. Обеспечение своевременной доставки материала для сохранения жизнеспособности искомых бактерий. 3. Выбор оптимального набора соответствующих питательных сред для первичного посева и накопления возбудителя с учетом характера материала, свойств искомого микроорганизма и посевных доз. 4. Соблюдение классических принципов тщательного изучения посевов. 5. Изучение фенотипических характеристик выделенных чистых культур, в первую очередь биохимических свойств с максимально возможной стандартизацией условий их определения. 6. Определение согласно классификационным таблицам таксономического положения выделенной культуры в соответствии с задачами исследования (родовой, видовой, внутривидовой принадлежности). Исследуемый материал следует брать в асептических условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию возможно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма. Одним из распространенных приемов бактериологического исследования является бактериоскопия. Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: «раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли» и «висячей капли». Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны. 6 • Метод «раздавленной капли». Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накрывают покровным (рис. 1). Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором. Рис. 1. Метод «раздавленной капли» • Метод «висячей капли». Необходимо иметь предметное стекло с луночкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с луночкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает (рис. 2). Рис. 2. Метод «висячей капли» К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевы бактериальных культур, производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. Бактериальная культура − искусственно выращиваемое на питательных средах скопление бактерий одного вида, являющихся потомками одной бактериальной клетки. Бактериальные культуры сохраняются на твердых (1,5−2 % мясо-пептонный агар), полужидких (0,5−0,7 % мясо-пептонный агар) или жидких (мясо-пептонный бульон) питательных средах. При отсутствии лиофильной сушки бактериальные культуры хранят в пробирках на питательных средах; стерильную ватную пробку вдвигают внутрь пробирки и заливают тонким слоем парафи- 7 на. Для хранения бактериальных культур удобно пользоваться пробирками с навинчивающимися пробками. Большинство бактериальных культур лучше сохраняется при температуре не выше 5−7 °С. Пробирки или ампулы с бактериальной культурой снабжают этикетками с указанием названия, номера и даты выделения. Все бактериальные культуры, выделяемые или хранящиеся в лаборатории, подлежат регистрации в соответствии со специальными инструкциями. Культивирование бактерий на искусственных питательных средах лежит в основе всех микробиологических исследований, позволяющих выяснить морфологические, физиологические и другие особенности бактерий. В зависимости от питательных потребностей бактерий бактериальные культуры могут быть получены на средах, в состав которых входят органические субстраты, или на солевых синтетических средах, включающих в качестве источника энергии углеродсодержащие соединения. Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты − питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т.д.), поэтому их еще называют «средами для культивирования». Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов. Требования, предъявляемые к средам Среды должны соответствовать следующим условиям: 1) быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста − витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать; 2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов − рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. 8 Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2−7,4). Исключение составляют холерный вибрион − его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5−9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2−6,8). Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена; 3) быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида; 4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.); 5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию; 6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других − низкий. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы − при RH2 не ниже 10. Окислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетворяет требованиям к нему аэробов и факультативных анаэробов; 7) быть по возможности унифицированным, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, среды для культивирования большинства патогенных бактерий должны содержать 0,8−1,2 мл аминного азота NH2, т.е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5−3,0 гл общего азота N; 0,5 % хлоридов в пересчете на натрия хлорид; 1 % пептона. Желательно, чтобы среды были прозрачными − удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами. Классификация питательных сред Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования. 9 В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки. • Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В настоящее время разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то, что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение. Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы. • Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких веществ, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин. Агар-агар − полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80−100 °С, застывает при 40−45 °С. Желатин − белок животного происхождения. При 25−30 °С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем. • Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма (рис. 3). 10 Рис. 3. Техника работы с плотными питательными средами 4. Назначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода; б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков − сыворотку крови, для возбудителя коклюша − кровь; в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН. Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут; г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по фермен- 11 тативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды; д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды − глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий. При посеве бактерий на питательные среды наблюдается сложный процесс роста бактериальных культур, в котором следует различать рост (увеличение размера) отдельных бактериальных клеток и их размножение, т.е. нарастание числа жизнеспособных особей. Рост отдельных бактерий можно наблюдать под микроскопом или путем микрокиносъемки в специальных камерах, процесс же размножения анализируют путем высева на плотные питательные среды с последующим подсчетом числа бактериальных колоний. В процессе культивирования происходит не только размножение, но и отмирание бактерий. Следовательно, полное представление об интенсивности размножения клеток бактериальных культур можно получить только в том случае, если подсчитывать не только число жизнеспособных особей, но и общее количество бактерий. 12 ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ Постоянные компоненты бактериальной клетки, их функции. Особенности строения ГР+ и Гр-бактерии Клетка бактерий одета плотной оболочкой. Этот поверхностный слой, расположенный снаружи от цитоплазматической мембраны, называют клеточной стенкой. Стенка выполняет защитную и опорную функции, а также придает клетке постоянную, характерную для нее форму (например, форму палочки или кокка), и представляет собой наружный скелет клетки. Эта плотная оболочка роднит бактерии с растительными клетками, что отличает их от животных клеток, имеющих мягкие оболочки. Внутри бактериальной клетки осмотическое давление в несколько раз, а иногда и в десятки раз выше, чем во внешней среде. Поэтому клетка быстро разорвалась бы, если бы она не была защищена такой плотной, жесткой структурой, как клеточная стенка. Толщина клеточной стенки 0,01−0,04 мкм. Она составляет от 10 до 50 % сухой массы бактерий. Количество материала, из которого построена клеточная стенка, изменяется в течение роста бактерий и обычно увеличивается с возрастом. Основным структурным компонентом стенок, основой их жесткой структуры почти у всех исследованных до настоящего времени бактерий является муреин (гликопептид, мукопептид). Это органическое соединение сложного строения, в состав которого входят сахара, несущие азот, аминосахара и 4−5 аминокислот. Причем аминокислоты клеточных стенок имеют необычную форму (D-стереоизомеры), которая в природе редко встречается. Составные части клеточной стенки, ее компоненты образуют сложную прочную структуру. С помощью способа окраски, впервые предложенного в 1884 г. Кристианом Грамом, бактерии могут быть разделены на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные организмы способны связывать некоторые анилиновые красители, такие как кристаллический фиолетовый, и после обработки иодом, а затем спиртом (или ацетоном) сохранять комплекс йод-краситель. Те же бактерии, у которых под влиянием этилового спирта этот комплекс разрушается (клетки обесцвечиваются), относятся к грамотрицательным. Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий различен. 13 У грамположительных бактерий в состав клеточных стенок входят, кроме мукопептидов, полисахариды (сложные, высокомолекулярные сахара), тейхоевые кислоты (сложные по составу и структуре соединения, состоящие из сахаров, спиртов, аминокислот и фосфорной кислоты) (рис. 4). Липопротеины Тейхоевые кислоты Полисахаридные цепи Кишечная палочка Белки Пептидные перемычки пептидогликана а) Золотистый стафилококк б) Рис. 4. Клеточная стенка грамотрицательных (а) и грамположительных (б) бактерий Стенки грамотрицательных бактерий более сложные по химическому составу, в них содержится значительное количество липидов (жиров), связанных с белками и сахарами в сложные комплексы − липопротеиды и липополисахариды. Муреина в клеточных стенках грамотрицательных бактерий в целом меньше, чем у грамположительных бактерий. Структура стенки грамотрицательных бактерий также более сложная. С помощью электронного микроскопа было установлено, что стенки этих бактерий многослойные. Внутренний слой состоит из муреина. Над ним находится более широкий слой из неплотно упакованных молекул белка. Этот слой в свою очередь покрыт слоем липополисахарида. Самый верхний слой состоит из липопротеидов. Клеточная стенка проницаема: через нее питательные вещества свободно проходят в клетку, а продукты обмена выходят в окружающую среду. Крупные молекулы с большим молекулярным весом не проходят через оболочку. 14 Клеточная стенка многих бактерий сверху окружена слоем слизистого материала − капсулой. Толщина капсулы может во много раз превосходить диаметр самой клетки, а иногда она настолько тонкая, что ее можно увидеть лишь через электронный микроскоп, − микрокапсулу (рис. 5). 3 1 2 4 5 6 Рис. 5. Схематическое изображение клеточной стенки грамотрицательных бактерий − Bacterium coli (no Роузу): 1 − липопротеидный слой с выступами и бугорками; 2 − липополисахаридный слой; 3 − каналы; 4 − рыхлоупакованные молекулы белка; 5 − гликопептидный слой; 6 − цитоплазматическая мембрана Капсула не является обязательной частью клетки, она образуется в зависимости от условий, в которые попадают бактерии. Она служит защитным покровом клетки и участвует в водном обмене, предохраняя клетку от высыхания. По химическому составу капсулы чаще всего представляют собой полисахариды. Иногда они состоят из гликопротеидов (сложные комплексы сахаров и белков) и полипептидов (род Bacillus), в редких случаях − из клетчатки (род Acetobacter). Слизистые вещества, выделяемые в субстрат некоторыми бактериями, обусловливают, например, слизисто-тягучую консистенцию испорченного молока и пива. Все содержимое клетки, за исключением ядра и клеточной стенки, называется цитоплазмой. В жидкой, бесструктурной фазе цитоплазмы (матриксе) находятся рибосомы, мембранные системы, митохондрии, пластиды и другие структуры, а также запасные питательные вещества. Цитоплазма обладает чрезвычайно слож- 15 ной, тонкой структурой (слоистая, гранулярная). С помощью электронного микроскопа раскрыты многие интересные детали строения клетки. Внешний липопротеидный слой протопласта бактерий, обладающий особыми физическими и химическими свойствами, называется цитоплазматической мембраной Через мембрану питательные вещества могут поступать в клетку в результате активного биохимического процесса с участием ферментов. Кроме того, в мембране происходит синтез некоторых составных частей клетки, в основном компонентов клеточной стенки и капсулы. Наконец, в цитоплазматической мембране находятся важнейшие ферменты (биологические катализаторы). Упорядоченное расположение ферментов на мембранах позволяет регулировать их активность и предотвращать разрушение одних ферментов другими. С мембраной связаны рибосомы − структурные частицы, на которых синтезируется белок. Между плазматической мембраной и клеточной стенкой имеется связь в виде десмозов − мостиков. Цитоплазматическая мембрана часто дает инвагинации − впячивания внутрь клетки. Эти впячивания образуют в цитоплазме особые мембранные структуры, названные мезосомами. Некоторые виды мезосом представляют собой тельца, отделенные от цитоплазмы собственной мембраной. Внутри таких мембранных мешочков упакованы многочисленные пузырьки и канальцы. Эти структуры выполняют у бактерий самые различные функции. Одни из этих структур − аналоги митохондрий. Другие выполняют функции эндоплазматической сети или аппарата Гольджи. Путем инвагинации цитоплазматической мембраны образуется также фотосинтезирующий аппарат бактерий. После впячивания цитоплазмы мембрана продолжает расти и образует стопки, которые по аналогии с гранулами хлоропластов растений называют стопками тилакоидов. В этих мембранах, часто заполняющих собой большую часть цитоплазмы бактериальной клетки, локализуются пигменты (бактериохлорофилл, каротиноиды) и ферменты (цитохромы), осуществляющие процесс фотосинтеза. В цитоплазме бактерий содержатся рибосомы − белок-синтезирующие частицы диаметром 200 A. В клетке их насчитывается больше тысячи. Состоят рибосомы из РНК и белка. У бактерий многие рибосомы расположены в цитоплазме свободно, некоторые из них могут быть связаны с мембранами. 16 Рибосомы являются центрами синтеза белка в клетке. При этом они часто соединяются между собой, образуя агрегаты, называемые полирибосомами или полисомами. У многих бактерий гранулы состоят из крахмала или других полисахаридов − гликогена и гранулезы. У некоторых бактерий при выращивании на богатой сахарами среде внутри клетки встречаются капельки жира. Другим широко распространенным типом гранулярных включений является волютин (метахроматиновые гранулы). Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние. Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белокинициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке-прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам. Двухнитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. Образуются две дочерние особи. На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток – колонии, различные по размерам, форме, поверхности, окраске и т.д. На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения или осадка (рис. 6). Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др. 17 Рис. 6. Колонии бактерий на плотной питательной среде Фазы размножение бактериальной клетки на жидкой питательной среде: 1) начальная стационарная фаза − то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится; 2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК; 3) фаза логарифмического размножения активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью; 4) максимальная стационарная фаза − бактерии достигают максимальной концентрации, т.е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит; 5) фаза ускоренной гибели − процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества (рис. 7). 18 Число микробов Время Рис. 7. Кривая размножения микроорганизмов в молоке: а – фаза адаптации; б – фаза ускоренного роста; в – фаза логарифмического размножения; г – фаза замедления; д – стационарная фаза; е – фаза отмирания Питание бактерий. Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены – это восемь химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 4−10 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций. Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор. Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ (рис. 8). В зависимости от источника получения углерода бактерии делят: 1) на аутотрофы (используют неорганические вещества – СО2); 2) гетеротрофы; 3) метатрофы (используют органические вещества неживой природы); 4) паратрофы (используют органические вещества живой природы). 19 Рис. 8. Схемы фагоцитоза и пиноцитоза у бактерий Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки. По источникам энергии микроорганизмы делят: 1) на фототрофы (способны использовать солнечную энергию); 2) хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций); 3) хемолитотрофы (используют неорганические соединения); 4) хемоорганотрофы (используют органические вещества). Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост. Среди бактерий выделяют: 1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из низкоорганизованных); 2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез некоторых веществ – витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде). Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений. Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями. Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку: 1. Пассивный транспорт (без энергетических затрат): а) простая диффузия; б) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков) (рис. 9). 20 Пассивная диффузия Высокая концентрация ионов или вещества в цитоплазме клетки Облегченная диффузия Ядро Белок-переносчик Низкая концентрация ионов или вещества в межклеточном пространстве Облегченная диффузия Пассивная диффузия Рис. 9. Схема пассивного транспорта 2. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны) (рис. 10). + Везикулы АТФ K Na+ H+ Na+ Ядро Каналикулы Микротрубочки Безопатеральная мембрана Микрофиламенты Межклеточные контакты Кальциевый гемостаз Рис. 10. Схема активного транспорта Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией. 21 Метаболизм бактериальной клетки Особенности метаболизма у бактерий: 1) многообразие используемых субстратов; 2) интенсивность процессов метаболизма; 3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения; 4) преобладание процессов распада над процессами синтеза; 5) наличие экзо- и эндоферментов метаболизма. В процессе метаболизма выделяют два вида обмена: 1) пластический (конструктивный): а) анаболизм (с затратами энергии); б) катаболизм (с выделением энергии); 2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах): а) дыхание; б) брожение. В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы и аэротолерантные анаэробы. Для аэробов акцептором является кислород. Микроаэрофилы растут в условиях низких концентраций О2. Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных – брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки. Аэротолерантные анаэробы используют анаэробный тип дыхания, но не гибнут в присутствии молекулярного кислорода. В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами. По строению выделяют: 1) простые ферменты (белки); 2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов. Различают также: 1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата); 2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата). Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства. 22 По месту действия выделяют: 1) экзоферменты (действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий); 2) эндоферменты (действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ). В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов: 1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами); 2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп); 3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей); 4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции); 5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров); 6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ). Виды пластического обмена Основными видами пластического обмена являются: 1) белковый; 2) углеводный; 3) липидный; 4) нуклеиновый. Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты. Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением. В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования. В бел- 23 ковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии. В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, который может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения. В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения: 1) спиртовое (характерно для грибов); 2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий); 3) молочнокислое (характерно для стрептококков); 4) маслянокислое (характерно для сарцин); 5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл). Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.). Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями. Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз. Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т.е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА. Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов. Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода. Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления 24 клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимой-РНК-полимеразы. Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зкависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК. 25 ЭТАПЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериологическое исследование проводится в несколько этапов. I. Посев доставленного материала на питательные среды Для некоторых видов материалов осуществляют предварительную подготовку их для посева, а затем инкубацию посевов для всех видов при условиях, соответствующих свойствам искомых бактерий. Техника посевов микроорганизмов Посевы проводят как с целью выделения возбудителей из исследуемого материала от больных, так и для получения чистых культур с целью последующего их изучения и идентификации. Техника посевов в жидких и на плотные питательные среды имеет свои особенности. В левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда (плотная или жидкая), в другой – исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Пробирки должны быть наклоненными, и нужно следить, чтобы при открытии в них не попали посторонние микробы или материал с окружающих предметов. Пробки из пробирок вынимают, держа их четвертым и пятым пальцами правой руки. Тремя другими пальцами правой руки, как карандаш, держат бактериологическую петлю или пипетку, которыми распределяют исследуемый материал. Сначала стерилизуют (прокаливают) петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают, и край их проносят через пламя горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Если он находится в жидком состоянии, для посева достаточно капли жидкости, которая задерживается в кильке бактериологической петли. Когда используют микробов, которые выросли на поверхности среды, осторожно плавным движением набирают небольшое количество их, следя, чтобы не повредить питательную среду. Петлю медленно вы- 26 нимают из пробирки, не касаясь ее стенок, и переносят в другую пробирку со средой. Штриховыми движениями от одной стенки пробирки к другой, начиная с нижней части среды, проводят материал по скошенной поверхности агара снизу вверх. Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы. При посеве материала на жидкую питательную среду петлю с материалом окунают в жидкость. Если он не снимается из петли, его осторожно растирают на стенке пробирки и омывают средой. Материал, который набирали пастеровской или градуированной пипеткой, выливают в питательную среду, а для равномерного распространения его пробирку осторожно, чтобы не замочить пробку, стряхивают или вращают, зажав в ладонях. Посев тампоном При посеве тампоном чашку открывают одной рукой, тампоном касаются поверхности агара возле края чашки и начинают проводить посев штрихами от края к краю чашки, втирая осторожно материал в поверхность среды, не повреждая его, постепенно вращая тампон. После проведения посева чашку вращают на 90° и повторяют посев перпендикулярно к предыдущему. При посеве уколом в столбик питательной среды пробирку с мясо-пептонним агаром, желатином и т.п. берут в левую руку, петлю с материалом – в правую и делают укол к дну пробирки в среду. Петлю осторожно вынимают, а пробирку закрывают. Посев материала в толщу питательной среды Перед посевом материал должен быть в жидком состоянии. Стерильной градуированной пипеткой набирают 0,1, 0,5 или 1,0 мл материала и выливают его в стерильные чашки Петри. После этого материал заливают 15−20 мл растопленного и охлажденного до 45−50 °С МПА. Осторожно покачивая чашку, круговыми движениями по поверхности стола перемешивают в ней материал, достигая его равномерного деления в среде. Чашку оставляют закрытой до полного застывания агара, а затем переворачивают вверх дном. Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах – механическом и биологическом разобщении бактерий (табл. 1, рис. 11). 27 Таблица 1 Принципы и методы выделения чистых культур микроорганизмов Механический принцип Методы 1. Фракционных разведений Л. Пастера 2. Пластинчастых разведений Р. Коха 3. Поверхностных посевов Дригальського 4. Поверхностных штрихов Биологический принцип Методы Принимают во внимание: а – тип дыхания (метод Фортнера); б – подвижность (метод Шукевича); в – кислоустойчивость; г – спорообразование; д – температурный оптимум; г – спорообразование; д – температурный оптимум; е – избирательную чувствительность лабораторных животных Рис. 11. Метод разведений Методы выделения чистых культур, основанные на механическом принципе Метод последовательных разведений, предложенный Л. Пастером, был одним из самых первых, который применялся для механического разъединения микроорганизмов. Он заключается в прове- 28 дении последовательных серийных разведений материала, который содержит микробов, в стерильной жидкой питательной среде. Этот прием достаточно кропотлив и несовершенен в работе, поскольку не позволяет контролировать количество микробных клеток, которые попадают в пробирки при разведениях. Этого недостатка не имеет метод Коха (метод пластинчатых разведений). Р. Кох использовал плотные питательные среды на основе желатина или агар-агара. Материал с ассоциациями разных видов бактерий разводился в нескольких пробирках с растопленным и охлажденным желатином, содержимое которых позже выливалось на стерильные стеклянные пластины. После культивирования в его толще образовывались изолированные колонии микроорганизмов, которые легко могут быть перенесены на свежую питательную среду с помощью платиновой петли для получения чистой культуры бактерий. Метод Дригальского является более совершенным методом, который широко распространен в повседневной микробиологической практике. Сначала на поверхность среды в чашке Петри пипеткой или петлей наносят исследуемый материал. С помощью металлического или стеклянного шпателя его тщательным образом втирают в среду. Чашку во время посева держат прикрытой и осторожно вращают, чтобы равномерно распределить материал. Не стерилизуя шпателя, проводят им посев материала во второй чашке Петриа, затем в третьей. Только после этого шпатель погружают в дезинфицирующий раствор или прожигают в пламени горелки. На поверхности среды в первой чашке наблюдаем, как правило, сплошной рост бактерий, во второй – густой рост, а в третьей – рост в виде изолированных колоний (рис. 12). Рис. 12. Метод Дригальского Метод посева истончающим штрихом сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Существует нескольько способов посева штрихом (рис. 13). 29 Рис. 13. Схемы метода посева истончающим штрихом Рассмотрим один из наиболее часто применяемых на практике. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Прокаливают петлю, удаляя тем самым избыток материала, и проводят посев параллельными штрихами от края к краю чашки. Так повторяют еще два раза (рис. 14). Рис. 14. Метод посева истончающим штрихом Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов (рис. 15). Рис. 15. Метод посева истончающим штрихом. Результат 30 Метод штрихов Для получения изолированных колоний можно использовать посев тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько приоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку. Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую культуру. II. Выделение чистых культур Выделение чистых культур из намеченных колоний для дальнейшего изучения происходит с использованием комбинированных сред для первичной идентификации. Выделение чистой культуры аэробных микроорганизмов состоит из ряда этапов В первый день (1-й этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Изучают его внешний вид, консистенцию, цвет, запах и другие признаки; готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Посев проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя методом Дригальского, ватномарлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18−48 ч. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов. Однако порой с целью накопления материала его засевают на жидкие питательные среды. На второй день (2-й этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невоору- 31 женным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств. Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходящем свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний. Характеристика колоний – важная составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии. Колонии характеризуются разными признаками: 1. Величина (диаметр); их разделяют на большие (4−6 мм и больше), средние (2−4 мм), мелкие (1−2 мм), карликовые или точечные (меньше 1 мм). 2. Форма колоний. Она может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподобная), ризоидная. 3. Прозрачность. Колонии бывают прозрачными, пропускающими свет, и мутными. 4. Рельеф. В вертикальном разрезе колонии разделяются на плоские, выпуклые, куполообразные, каплеподобные, конусообразные, плосковыпуклые, плоские (стелятся по поверхности среды), с вдавленным центром и приподнятою серединой (в виде яичницыглазуньи). 5. Поверхность колоний. Может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth – гладкий и блестящий), а шершавые – R-формы (rough – шершавый, неравный). Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, бородавчатой, иметь радиальную исчерченность и т.п. 6. Цвет. Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно-молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигмен- 32 том, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и т.п. 7. Консистенция. При дотрагивании к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и т.п. Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают их методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижность бактерий в «висячей» или «раздавленой» капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов. Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают с поверхности среды и засевают на скошенный агар или в секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18−24 года. Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их. На жидких питательных средах бактерии также могут расти поразному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных. Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов. Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы не образуют пигменты, осадок имеет сероватобелый или желтоватый цвет. Подобным образом растут, как правило, анаэробные бактерии. Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной. Аэробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влажной, тол- 33 стой, иметь вязкую, слизистую консистенцию и прилипать к петле (тянутся за ней). Однако встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами. В случае необходимости изготовливается мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний. На третий день (3-й этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию. Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность окрашиваться) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виде выделенных возбудителей. Определение вида бактерий по их морфологическим признакам называется морфологической идентификацией. Определение вида возбудителей по их культуральныи признакам называют культуральной идентификацией. Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виде выделенных микробов. Поэтому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны. Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и т.п. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.). Определение вида возбудителя по его биохимическим свойствам называется биохимической идентификацией. Для исследования способности бактерий расщеплять белки (протеолитические свойства) используют молоко или среду с желатином. Протеолиз в молоке выражается растворением сгустка казеина, который образован бактериями, свертывающими молоко. Среды с желатином готовят на мясной воде, добавляя 1 % пептона, 0,5 % хлорида натрия и 10−20 % желатина. Посев делают уко- 34 лом. Протеолиз проявляется разжижением столбика среды. Поскольку некоторые виды бактерий отличаются особенностями разжижения желатина, этот признак можно учитывать при их идентификации. Пептолитические свойства (способность расщеплять пептоны – продукты неполного гидролиза белка) обнаруживают с помощью МПБ и пептонной воды. Их засевают микроорганизмами, а затем определяют образование конечных продуктов – аммиака, сероводорода и индола. Для нахождения аммиака в пробирку вставляют и прижимают пробкой красную лакмусовую бумажку. В атмосфере аммиака он приобретает синий цвет. Индикатором на сероводород является раствор ацетата свинца, который при аналогичных условиях определения окрашивает фильтровальную бумагу, смоченную индикатором, в черный цвет за счет образования сульфида свинца. Индол можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной 12 % раствором щавелевой кислоты. При наличии индола бумага приобретает розовый цвет. Более чувствительным является метод Эрлиха. Согласно общепринятному методу пробкой пробирки прижимают бумагу, пропитанную специальным индикатором (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида). При наличии индола цвет его изменяется на сиренево-розовый или малиновый. В другом варианте определения индола к 48-часовой бульонной культуре бактерий добавляют 1−2 мл серного эфира, а затем – реактив Эриха. В нижней части слоя эфира за 1−2 мин появляется яркое малиновое кольцо. В микробиологической практике широко используются дифференциально диагностические среды Ендо, Левина, Плоскирева, которые позволяют обнаружить разложение лактозы бактериями. Они позволяют проводить первичную дифференциацию бактерий кишечного тракта, что чрезвычайно важно для быстрого выделения чистых культур с их следующей идентификацией. Эти среды селективные для многих представителей семьи кишечных бактерий. Выпускаются они в сухом виде, поэтому их приготовление в лабораториях не нуждается в затрате времени. Среда Эндо состоит из сухого питательного агара, 1 % лактозы и индикатора фуксина, обесцвеченного раствором сульфита натрия. Свежая среда имеет слабую розовую окраску. При росте лактозопозитивних микроорганизмов, тех, которые расщепляют лактозу (E. сoli), их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском. Колонии лактозонегативних микробов (сальмонеллы, шигеллы) на этой среде бесцветны. 35 В состав среды Левина также входят МПА, лактоза, однозамещенный фосфат калия, индикаторы метиленовый синей, эозин. Нативная среда имеет фиолетовый цвет. Колонии лактозопозитивных бактерий имеют темно-синюю расцветку, а лактозонегативные – розовый оттенок. Сухой бакто-агар Плоскирева (Бактоагар Же, MacConkey Agar) содержит в составе агар с солями желчных кислот, лактозу, цитрат натрия, гипосульфит, фосфат натрия, брилинтовый зеленый, соду кальцинированная, йод и нейтральный красный. Микроорганизмы, которые расщепляют лактозу, образуют колонии розового цвета, а те, что ее не ферментируют, – бесцветные. В микробиологической практике часто возникает потребность исследовать ферментацию не только одного, а одновременно нескольких углеводов. С этой целью используют среды Гисса. Они могут иметь жидкую и полужидкую консистенцию. Основой жидкой среды является 1 % пептонная вода с 0,5 % натрия хлорид, 1 % углеводов (глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, маннита и др.). К нему добавляют индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NаOH). Устанавливают рН 7,2, при котором среда имеет желтый цвет. Среды с разными углеводами разливают в отдельные пробирки, в которые устанавливают поплавок – запаянную из одного конца стеклянную трубочку длиной 3 см открытым концом книзу. Стерилизуют паром под давлением 0,5 атм 15 мин. После посева бактерий, если они ферментируют углеводы, наблюдают появление красной окраски, которая свидетельствует об изменении рН в кислую сторону (образование кислоты), а порой из поплавка вытесняется жидкость. Тогда делают вывод об образовании газа. Следовательно, возможны три варианта при учете результатов посева на средах Гисса: микроорганизмы не ферментируют субстрату (негативный ответ) или бактерии ферментируют углеводы (позитивный ответ) с образованием кислоты без газа или кислоты и газа. Учитывая, что микроорганизмы по-разному действуют на углеводы (разлагают или не разлагают), при конечном учете результатов наблюдают пробирки с измененным или неизмененным цветом жидкости. Это создает впечатление пестроты, а такой ряд называют пестрым рядом Гисса. В настоящий момент в большинстве случаев пользуются набором сухих сред для определения сахаролитичних ферментов, из которых готовят полужидкие пестрые ряды. В отличие от предыдущей 36 группы в их состав входят индикаторы ВР (смесь водного голубого с розоловой кислотоы). При наличии газа наблюдаются пузырьки или разрывы питательной среды в толще агара. При подкислении среды с индикатором ВР она становится синей, а при подщелачивании – красной. Выпускаются также сухие среды Рассела и сахарный агар с мочевиной Олькеницкого. Среда Рессела является полужидким агаром с лактозой (1 %) и глюкозой (0,1 %) и индикатором ВР. После разливания его в пробирки их кладут так, чтобы образовался столбик агара и была скошена поверхность. Микроорганизмы засевают петлей сначала уколом в столбик, а затем по скошенной поверхности. Если бактерии ферментируют лактозу и глюкозу, наблюдают изменение цвета (подкисление) всей среды на синий. Если микробы способны метаболизировать только глюкозу, в этом случае изменяет цвет столбик среды. При условии образования газа наблюдают за появлением его пузырьков или разрывами агара. Трисахарный агар с мочевиной Олькеницкого – более сложная среда по сравнению с предыдущими. Он позволяет определить ферментацию лактозы, сахарозы, глюкозы, образования сероводорода и наличие у бактерий фермента уреазы. В состав среды соответственно вводят сухой питательный агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексную соль аммоний-железо сульфат, тиосульфат натрия, мочевину, индикатор феноловый красный. Готовая среда имеет бледнорозовый цвет. При расщеплении сахаров феноловый красный окрашивает среду в желтый цвет. Поскольку глюкоза имеется в небольших концентрациях (0,1 %), в аэробных условиях (скошенная поверхность) бактерии полностью будут утилизировать ее за первые часы роста. Через 18−24 ч они используют и пептоны как белковую питательную основу. При этом образуется аммиак, который делает среду щелочной, окрашивая ее в красный цвет. Однако в столбике агара желтый цвет остается, потому что там сохраняются кислые конечные продукты, которые обеспечивают низкий уровень рН. Энтеробактерии, которые разлагают лактозу и глюкозу, подкисляют среду во всей пробирке (желтый цвет столбика и скошенной поверхности). Поскольку лактозы (1 %) в 10 раз больше, чем глюкозы, через 18−24 ч инкубации ее запасы еще не исчерпаны, поэтому сохраняется желтый цвет среды. Однако через 48 ч за счет расщепления пептонов можно наблюдать за его покраснением (сдвиг рН в щелочную сторону). 37 Если бактерии образуют газ (углекислый, водород) при ферментации сахаров, появляются разрывы среды или происходит скопление газа на дне, который поднимает агар в пробирке. Сероводород микробы образуют из неорганических соединений, благодаря ферменту тиосульфатредуктазе. Взаимодействуют с сероводородом соли железа, которые, вступая с ним в реакцию, образуют сульфид железа в виде нерастворимого преципитата черного цвета в столбике. Уреаза, которую продуцируют бактерии, разрушает мочевину с выделением большого количества аммиака, под воздействием которого вся среда алеет. Поэтому при наличии уреазопозитивних штаммов провести учет ферментации сахаров невозможно. В таких случаях необходимо использовать другие среды. За последние годы в практике микробиологических лабораторий начали использовать специальные тест-системы для определения разнообразных свойств бактерий: «Roche», «API», «Enterotest», пластины и диски индикаторные биохимические. Они удобны для пользования, надежные, позволяют определять 12−20 и больше разнообразных признаков, значительно облегчить идентификацию микробов. Гемолитическая активность микроорганизмов является одним из самых существенных признаков их вирулентности, потому ее определение стало рутинной процедурой любой специализированной лаборатории. С этой целью используют кровяной МПА. Его готовят из растопленного и охлажденного до 45−50 °С питательного агара, к которому добавляют 5−10 % дефибрированной или свежей крови животного (барана или кролика). Агар с кровью тщательным образом перемешивают, не допуская образования пены, и разливают в чашки Петри. Если бактерии продуцируют гемолизины, вокруг колоний или штрихов посева образуются зоны просветления на матовом красном фоне. По цвету гемолиза (бесцветный, зеленоватый) можно определить тип гемолизинов (альфа-, бета-, гамма-, дельта- и т.п.). Чтобы обнаружить липолитические свойства микробов, в состав питательных сред вводят липиды или жироподобные субстанции. Бактерии при таких условиях образуют радужные венчики вокруг колоний при расщеплении липидов. Редуцирующие свойства изучают, добавляя в состав сред красители (метиленовый синий, например), которые способны возобновляться. Фиксируя время изменения цвета индикатора, можно судить о степени выражения редуцирующей активности. 38 Декарбоксилазную активность бактерий оценивают на специальных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, глютаминовой кислотой и др.) и соответствующими индикаторами. С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, т.е. проводят идентификацию по антигенными свойствами. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи энтеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигели) содержат оболочковый О-антиген, жгутиковый Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны по химическому составу, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютиногенных сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологической идентификации. Ее относят к одному из главных методов установления вида выделенной культуры. Чаще всего используется ориентировочная реакция агглютинации на стекле. С этой целью на предметное стекло наносят разные диагностические сыворотки (против отдельных возбудителей или их антигенов), а затем в каждую каплю вносят стерильной петлей небольшое количество чистой культуры. За несколько минут наблюдают за феноменом агглютинации. Образование аглютината (хлопьев) свидетельствует о гомологичности антигенов возбудителя и антител диагностической сыворотки, что позволяет определить вид инфекционного агента. При наличии позитивной ориентировочной реакции агглютинации ее ставят в развернутом варианте (реакция агглютинации Грубера). При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия) идентификацию проводят по токсигенным свойствам микробов. Метод основывается на определении токсигенной активности коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации. Образование линий преципитации между колониями токсигенних штаммов и бумагой, пропитанной антитоксинной сывороткой, свидетельствует о позитивной реакции. Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и т.п.). Такой метод называют идентификацией по биологическим свойствам. Как объекты чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс. Очень важным при выделении микроорганизмов является определение их чувствительности к антибиотикам с целью выбора оптимального препарата для лечения. Чаще всего пользуются методом 39 стандартных дисков (метод диффузии в агар, диско-дифузийний метод). Для этого на поверхность специальной плотной питательной среды в чашках Петри засевают культуру микроорганизмов и налагают бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками. Посевы инкубируют при оптимальной температуре 18−24 ч и измеряют зоны задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. По размерами этих зон определяют принадлежность бактерий к чувствительным, умеренно резистентным или стойким штаммам. На основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных, биологических и других свойств микробов делают окончательный вывод об идентификации. Например: «Выделено Escherichia coli» или «Выделенный возбудитель принадлежит к виду Staphylococcus epidermidis» (рис. 16). диффузный Рис. 16. Культуральные особенности бактерий 40 Выделение чистой культуры анаэробных бактерий В лабораторной практике часто придется работать с анаэробными микроорганизмами. Они более прихотливы к питательным средам, чем аэробы, чаще нуждаются в специальных ростовых добавках, требуют прекращения доступа кислорода при их культивировании, длительность роста их длиннее. Потому работа с ними более сложна, требует значительного внимания бактериологов и лаборантов. Важной является защита материала, который содержит анаэробные возбудители от токсичного влияния атмосферного кислорода. Потому материал из очагов гнойной инфекции рекомендуется забирать во время их пункции с помощью шприца, время между взятием материала и посевом его на питательную среду должно быть максимально коротким. Поскольку для культивирования анаэробных бактерий используют специальные питательные среды, которые не должны содержать кислорода и имеют низкий окислительно-восстановительный потенциал (Eh = −20 − 150 мВ), к их составу вводят индикаторы – резазурин, метиленовий синий и т.п., которые реагируют на смену этого потенциала. При росте Eh бесцветные формы индикаторов изменяют свой цвет: резазурин окрашивает среду в розовый цвет, а метиленовий синей – в голубой. Такие изменения свидетельствуют о невозможности использования сред для культивирования анаэробных микробов. Способствует снижению окислительно-восстановительного потенциала введение в среду не меньше 0,05 % агара, который, увеличивая его вязкость, способствует уменьшению поступления кислорода. Это в свою очередь достигается еще и использованием свежих (не позже двух часов после изготовления) и редуцируемых питательных сред. Следует учесть особенности бродильного типа метаболизма анаэробных бактерий – они требуют более богатых на питательные компоненты и витамины сред. Чаще всего используют сердечномозговой и печеночный настои, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитический перевар казеина, пептон, триптон. Обязательным является добавление факторов роста, таких как твин-80, гемин, менадион, цельная или гемолизированная кровь. Методы создания анаэробных условий. Учитывая, что свободный молекулярный кислород является токсичным для облигатноанаэробных бактерий, обязательным условием культивирования та- 41 ких микроорганизмов является ограничение его доступа. Существует ряд методов (механических, физических, биологических), которые позволяют это обеспечить. Физические методы 1. Перед посевом бактерий на питательную среду его обязательно регенерируют для удаления избытка растворенного кислорода. С этой целью среду кипятят в течение 15−20 мин на водяной бане, а затем быстро охлаждают до необходимой температуры. 2. Для предупреждения проникновения кислорода в среду его заливают слоем стерильного вазелинового масла или парафина. 3. Столбик питательной среды в пробирках должен быть достаточно высоким (10−12 см). Кислород, как правило, дифундирует в толщу столбика на глубину до 2 см, потому ниже создаются благоприятные условия для культивирования анаэробных микробов. 4. Эвакуационно-заместительный метод заключается в использовании анаэростатов. Они представляют собой герметичные металлические или пластмассовые банки, из которых можно выкачать кислород и заменить его инертным газом (гелий, азот, аргон). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, которая состоит из 80 % азота, 10 % диоксида углерода и 10 % водорода. Порой допустимым считается использование природного газа. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, используют палладиевые катализаторы. С целью поглощения водяных паров используют хлорид кальция, силикагель и т.п., которые помещают на дно анаэростата. Химические методы 1. Использование веществ, способных поглощать кислород. С этой целью допустимым является применение щелочного раствора пирогаллола. При этом учитывают поглощающую активность вещества: на 100 мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия. Кислородосвязывающий эффект имеет также гидросульфит натрия Na2S2O4. Для связывания кислорода в 1 л воздуха используют смесь, которая состоит из 100 мл свежего 20 % раствора Na2S2O4 и 16 мл 50 % гидроксида калия. 2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая, что рост облигатно-анаэробных бактерий происходит в средах с низким уровнем окислительно-восстановительного потенциала, к ним добавляют специальные восстановители: цистеин (0,03−0,0,5 %), тиогликолевую 42 кислоту или тиогликолат натрия (0,01−0,02 %), сульфид натрия, аскорбиновую кислоту (0,1 %), разнообразные сахара. Функции обновителей могут выполнять кусочки паренхиматозных органов животных (печень, почки, сердце) или даже растений (картофель, другие корнеплоды). Степень поглощения кислорода или степень возобновления среды измеряют электрометрически или с помощью индикаторов (резазурин, нейтральный красный, феносафранин). 3. Использование специальных газогенерирующих систем, которые позволяют создать бескислородные условия в микроанаэростатах, транспортных пластиковых пакетах и т.п. Одной из самых распространенных является система «Gas Generating Box». В ее состав входят химические генераторы водорода (борогидрит натрия) и углекислого газа (таблетки бикарбоната натрия и лимонной кислоты), а также палладиевый катализатор, который поглощает кислород (рис. 17). Чашки с посевами помещаются в микроанаэростат, на дне которого находится слой палладиевого катализатора. Кончик пакета «Gas Generating Box» надрезают ножницами и наливают в него 10−15 мл воды. Пакет располагают в микроанаэростате. Через 15−20 мин в нем создаются анаэробные условия. Водород, который выделяется, взаимодействует с кислородом, образуя воду, а углекислота продуцируется при взаимодействии бикарбоната натрия с лимонной кислотой. Рис. 17. Анаэростат и система «Gas Generating Box» 43 Биологические методы • Метод Фортнера Метод заключается в совместном культивировании на одной среде аэробных и анаэробных микроорганизмов. Сначала посередине чашки вырезают полоску агара шириной до 0,5−1,0 см. С одной стороны засевают исследуемый материал, содержащий анаэробные возбудители, а на другой – микробы, которые являются индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или «чудесная палочка»). Края чашки заливают парафином или заклеивают пластилином. Через некоторое время на поверхности среды вырастают колонии как аэробных, так и анаэробных микробов. При поглощении кислорода Serratia marcescens дает рост бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушениях герметичности – ярко-красные. На другой половине чашки вырастают колонии анаэробных микробов. • Метод Хеннеля («часовых стекол») Он является своеобразной модификацией предыдущего метода. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2−2,5 см. Сверху он покрывается «часовым стеклом», заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens. Аэробные микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей. В высокоспециализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и т.п. За последние годы созданы стационарные анаэробные боксы, которые содержат все необходимое для создания анаэробных условий культивирования, включая термостаты. Как правило, такие камеры заполняются трехкомпонентной газовой смесью. Бактериолог работает с камерой, находясь снаружи, применяя резиновые рукавицы, вмонтированные в нее. Такое оборудование имеет неопровержимые преимущества, которые заключаются в том, что полностью исключается контакт кислорода с исследуемым материалом. Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов Учитывая современное развитие микробиологической науки, выделять и идентифицировать культуры анаэробных микроорганиз- 44 мов можно аналогично аэробным бактериям. Обязательным при этом является соблюдение на всех этапах исследования условий анаэробиоза, используя для этого трехкомпонентную газовую смесь (в определенном соотношении азот, водород и углекислый газ) или систему «Gas Generating Box». Однако возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции можно выделять и идентифицировать по другой схеме. На первом этапе (1-й день исследования) изучают макроскопические особенности клинического материала, делают мазок и окрашивают его методом Грама. После этого материал засевают на среду Китта−Тароцци и молоко по Тукаеву. Предварительно среду регенерируют на кипящей водяной бане в течение 10−20 мин и охлаждают. Непосредственно после посева материала среду нагревают на водяной бане при 80 °С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных неспоровых форм микробов. Среды ставят в термостат и при температуре 37 °С культивируют 1−3 суток. На втором этапе изучают проявления роста микроорганизмов (помутнение, образование осадка и газа на среде Китта−Тароцци, пептонизация молока по Тукаеву). Поскольку среда Китта−Тароцци сверху залита слоем вазелинового масла для предотвращения доступа кислорода, в него погружают пастеровскую пипетку, набирают жидкость, из которой готовят мазок, окрашивая его методом Грамма. Под микроскопом в мазке можно видеть большие граммположительные палочкоподобные бактерии. После этого проводят посев материала по методам Вейнберга или Цейсслера для получения изолированных колоний. Метод Вейнберга. Готовят несколько узких высоких пробирок (3−4) с растопленным и охлажденным до 42−45 °С сахарным мясопептонным агаром. Возможно использование среды Вильсон−Блера. Материал из среды Китта−Тароцци вносят в первую пробирку с помощью пастеровской пипетки и тщательным образом перемешивают, потом переносят во вторую, а дальше – в третью. Для застывания агара их быстро охлаждают под струей холодной водопроводной воды. За счет этого живые микробные клетки фиксируются в определенных участок агара. После застывания агара пробирки культивируют при оптимальной температуре в течение 1−2 суток для образования изолированных колоний (рис. 18). 45 Рис. 18. Колонии по Вейнбергу Содержимое каждой пробирки можно, кроме того, забрать пастеровской пипеткой или трубкой Виньяль−Вейона, следя, чтобы не было пузырьков воздуха. Последние имеют длину около 30 см и диаметр 0,5−0,6 см. Верхний конец их, который закрывается ватой, имеет перетяжку, а нижний вытянут в виде капилляра. После заполнения пипетки ее вытянутый конец запаивают и кладут в термостат для культивирования. Через 1−2 дня в агаре вырастают колонии анаэробных бактерий. Для того чтобы их изолировать, трубку надрезают напильником на определенном уровне, разламывают, колонию берут бактериальной петлей или иглой, переносят в соответствующую среду. Для выделения изолированных колоний методом Цейсслера материал из среды Китта−Тароцци или молока по Тукаеву наносят петлей или пастеровской пипеткой (1−2 капли) на чашку Петри с сахарно-кровяным агаром и делают посев шпателем методом Дригальского. Не стерилизуя шпатель, засевают вторую чашку, а затем и третью. Чашки переворачивают вверх дном, подписывают, ставят в анаэростат, в котором создают анаэробные условия, а затем – в термостат при температуре 37 °С на 2−3 сутки. На последней чашке вырастают изолированные колонии. Третий этап исследования начинается с изучения морфологических особенностей колоний, которые выросли в чашках Петри или трубках Виньяль−Вейона. Исследуются их форма, величина, цвет, характер краев, рельеф колонии, консистенция и т.п. Из колоний готовят мазки, красят их методом Грама. После этого колонии отсевают в среду Китта−Тароцци для получения чистой культуры. Посевы инкубируют определенное время при оптимальной температуре. 46 На четвертом этапе обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителей на соответствующих средах, проверяют ее на чистоту и проводят идентификацию. Идентифицируют выделенные чистые культуры анаэробных микроорганизмов подобно аэробным по морфологическим, культуральным, биохимическим и биологическим признакам. Обязательно используют определение токсигенных свойств возбудителей в биологической пробе и реакции нейтрализации на лабораторных животных. В некоторых случаях определяют антигенные свойства микроорганизмов. Таким образом, на основании изучения разнообразных свойств микроорганизмов делается вывод о принадлежности их к тому или другому виду. Среды для культивирования анаэробных микроорганизмов Среду КиттаТароцци готовят на основе бульона Хоттингера, к которому добавляют кусочки бычьей печенки или мяса. Стерилизуют его при 1 атм в течение 30 мин, pH среды – 7,4−7,6. После посева материала среду заливают сверху слоем вазелинового масла толщиной до 1 см. Анаэробный кровяной агар готовят на основе эритрит-агара. В его состав входят также специальные добавки: среда 199 (10 %), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1 %), метадион (10 мкг/мл), цитратная кровь (до 5 %) и т.п. После стерилизации среду разливают в чашки Петри. Используют не позже, чем через 2 ч после изготовления. Желтковый агар. В растопленную и охлажденную до 56−60 °С среду на основе эритрит-агара добавляют суспензию куриного желтка (20 %), глюкозу (0,2 %), гемин (10 мкг/мл) и разливают в чашки Петри. Среду используют для определения лецитиназной активности возбудителей, в частности C. perfringens. При наличии лецитиназы вокруг колоний образуются зоны помутнения. Коммерческая среда для контроля стерильности. Ее можно использовать в качестве транспортной. Для улучшения роста анаэробных бактерий в ее состав можно вводить специальные добавки, такие как среда 199, гемин, твин-80, метадион, цитратна кровь и т.п. Среда Вильсон−Блера. Готовят на основе растопленного и охлажденного до 60 °С 1 % сахарного (глюкоза) МПА, рН 7,4 с добавлением на 100 мл 10 мл стерильного 20 % раствора сульфита 47 натрия и 1 мл 8 % раствора хлорида железа. Готовую среду не стерилизуют. Среду используют для ускоренной диагностики газовой анаэробной инфекции, вызванной Clostridium рerfringens. Уже через 1−2 ч наблюдают изменение среды: она чернеет в результате возобновления сульфита натрия в сульфат, который взаимодействует с хлоридом железа, образуя сульфид железа. Появляются также разрывы агара в результате интенсивного газообразования. Лакмусовое молоко. Готовят среду из свежего молока. Предварительно его кипятят и оставляют в прохладном месте на одни сутки. Снимают верхний слой жира и процедуру повторяют. Молоко фильтруют и 10 % раствором бикарбоната натрия доводят рН до 7,2. Перед стерилизацией к молоку добавляют 5−10 % лакмусовой настойки и идентичное количество 10 % раствора бикарбоната натрия, чтобы пена молока приобрела сине-фиолетовый оттенок. При подщелачивании молока оно становится сине-фиолетовым, при подкислении – розовым вплоть до красного. III. Финальная идентификация чистой культуры На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры. Идентификация микроорганизмов с помощью бактериофагов Бактериофаги имеют выраженное литическое действие на микроорганизмы. Эту особенность используют для определения их вида. С этой целью в две пробирки с мясо-пептонным бульоном засевают исследуемую культуру бактерий. Потом в одну из них добавляют несколько капель индикаторного фага. Пробирки инкубируют при оптимальной температуре в течение 18−24 ч. Сравнивают мутность бульона в контрольной и опытной пробирках и делают вывод о чувствительности микроорганизмов к литическому действию бактериофагов (рис. 19). 48 Рис. 19. Литическое действие бактериофагов (справа – позитивный результат) С этой целью можно использовать плотную питательную среду, на которую газоном засевают исследуемую культуру бактерий. После подсушивания чашек на них бактериологической петлей или пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего разведения бактериофага, которое указано на ампуле. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С в течение 18−24 ч и фиксируют наличие прозрачных круглых пятен, которые свидетельствуют о литическом действии бактериофагу. Позитивный результат свидетельствует о принадлежности бактерий к определенному виду. Фаготипирование микроорганизмов проводят с целью анализа эпидемиологической ситуации для определения источника инфекции. Чаще всего его выполняют при диагностике стафилококковых, кишечных и других инфекций. В основе теста лежит определение фаговариантов (фаговаров) возбудителей. Для этого дно чашки с мясо-пептонным агаром по числу бактериофагов разделяют на квадраты. Выращивают четырехчасовую бульонную культуру исследуемого штамма и 1 мл ее засевают на поверхность среды. Распределяют равномерно культуру по 49 поверхности среды и избыток ее сливают. Чашку подсушивают в термостате при 37 °С в течение 30−40 мин и на поверхность агара в каждый квадрат капают пипеткой бактериофаги соответствующих разведений. Посевы ставят в термостат или оставляют при комнатной температуре в течение 18−20 ч, после чего оценивают результаты. Учет результатов проводят на темном фоне с помощью лупы. В зависимости от степени чувствительности культуры к бактериофагам выделяют разные степени лизиса бактерий, который оценивается по наличию лизиса или его отсутствию (рис. 20). Рис. 20. Фаготипирование бактерий Учитывая, что чувствительность бактерий к фагу является достаточно постоянным признаком, сравнивают фаготипы исследуемых культур с фаготипом микроба, который был выделен от достоверного источника инфекции. При их совпадении делают вывод об обнаруженном источнике инфекции. Определение бактериоциногенности микроорганизмов Бактериоцины – это вещества антибиотической природы, которые продуцируются бактериями и способны подавлять жизнедеятельность клеток других штаммов того же вида или родственных видов бактерий. Они имеют достаточно узкий спектр противомикробного действия, направленный против филогенетически близких возбудителей. Этот тест используют с эпидемиологической целью для выявления источника инфекции, а также для идентификации определенных групп бактерий. 50 Для определения бактериоциноваров на поверхность агара в чашке Петри в виде полоски по диаметру засевают бактериологической петлей культуру возбудителя. Чашку инкубируют в термостате при оптимальной температуре в течение 24−48 ч, потом микроорганизмы убивают с помощью УФ или паров хлороформа. Культуру осторожно снимают с поверхности агара с помощью шлифовального стекла, и к ней перпендикулярными штрихами бактериологической петлей подсевают 4-часовые бульонные культуры индикаторных штаммов. После 18−24-часовой инкубации при оптимальной температуре оценивают чувствительность индикаторных штаммов к бактериоцинам по величине зон задержки роста. Такой подход позволяет определить бактериоценотип исследуемых микроорганизмов (рис. 21). Рис. 21. Бактериоцинотипирование (зоны задержки роста) Для определения чувствительности исследуемого штамма к определенным бактериоцинам в плотную питательную среду уколом засевают индикаторные бактерии, которые продуцируют определенные типы бактериоцинов. После инкубации в термостате микробы, которые выросли, инактивируют с помощью паров хлороформа или ультрафиолетового облучения. Потом на поверхность чашки заливают растопленный и охлажденный до 45 °С МПА, смешанный с 0,2 мл 51 4-часовой бульонной культуры исследуемого штамма. После того, как агар застынет, чашку опять помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре на протяжении суток. По диаметру зон задержки роста культуры оценивают чувствительность ее к бактериоцинам. Учет результатов посева в комбинированные среды после 18−20 ч инкубации. Изучение морфологических и тинкториальных свойств. Посевы для воспроизведения тестов минимального дифференцирующего ряда. Ориентировочное изучение культур в реакциях агглютинации. Реакция агглютинации. Механизм, практическое использование Агглютинацией называется склеивание бактерий при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Ее используют: 1) для определения вида и серовара выделенных бактерий (СЕРОТИП); 2) для обнаружения антител в сыворотке крови больного (СЕРОДИАГНОСТИКА). Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: Аг (агглютиноген), Ат (агглютинин) и электролит (изотонический раствор натрия хлорида). В качестве Аг в РА применяют взвеси живых и убитых бактерий (ДИАГНОСТИКУМЫ). Для получения агглютинирующих сывороток обычно иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2–7 суток в возрастающих дозах вводят взвесь убитых, а в конце – 2–3 раза живых бактерий. Через неделю после иммунизации определяют титр сыворотки, или максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают. Полученные таким образом агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения вида бактерий надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микроорганизму в том случае, если как минимум агглютинирует его до половины титра. Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглюти- 52 нинов, вследствие чего нет необходимости разводить их. Реакцию агглютинации в них ставят на предметном стекле. Ориентировочная, или пластинчатая, реакция агглютинации. Ориентировочную РА выполняют перед постановкой развернутой реакции для того, чтобы отобрать на среде агглютинирующиеся в сыворотке колонии бактерий (культуры) и исключить из дальнейших исследований неагглютинирующиеся. Ставят ее при комнатной температуре на предметном стекле. Для этого на его поверхность пастеровской пипеткой раздельно наносят 2–3 капли различных сывороток в разведениях 1:10–1:20 и каплю 0,5 % раствора NaCl (контроль РА). В каждую каплю за исключением контрольной вносят подозрительные колонии (петлю культуры) и тщательно перемешивают до равномерного помутнения. Результаты реакции учитывают через несколько минут невооруженным глазом. При положительной реакции в каплях с сывороткой появляются крупные или мелкие хлопья, при отрицательной – жидкость остается равномерно мутной. Развернутая реакция агглютинации для идентификации бактерий. Ставят ее следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй – в третью пробирку и т.д. Получив двукратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более), в них вносят по 1–2 капли двухмиллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °С, затем ведут предварительный учет, начиная с контрольных. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взвешенных хлопьев в двух-трех и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции. Окончательные результаты учитывают через 18–20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++» «++» и «+» – убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка. Реакция агглютинации для серодиагностики инфекционных болезней. При использовании РА для выявления в сыворотке больных антител к соответствующему патогенному микробу в целях серодиа- 53 гностики берут 5 мл крови, получают сыворотку и разводят ее изотоническим раствором натрия хлорида от 1:50–1:100 до 1:800–1:1600, так как в более низких ее титрах могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или у больных с другим диагнозом. В качестве Аг в этой реакции используют заведомо известные взвеси убитых микроорганизмов (ДИАГНОСТИКУМЫ), с которыми безопасно работать РА для серодиагностики ставится и учитывается так же, как и развернутая РА для определения вида бактерий. Диагностическое значение имеют титры 1:100–1:200 и выше. Более достоверные результаты дает выявление нарастания титра антител в парных сыворотках, полученных от больного в начале заболевания и спустя 3–5 суток и более, когда титр агглютининов повышается под воздействием находящегося в организме патогенного микроба. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обычных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчайшим микроорганизмам. РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабатывают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37 °С. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции. Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пуговицы». 54 IV. Определение рода и вида микроорганизмов на основании учета результатов посевов в среды минимального дифференцирующего ряда Конечная цель бактериологического исследования – определение вида выделенного микроорганизма. Для того, чтобы это сделать, необходимо знать: 1) культуральные признаки колонии (только по внешнему виду колоний на МПА можно легко идентифицировать некоторые микроорганизмы, например, Bacillus mycoides образует ветвистые стелящиеся по мясопептонному агару колонии, напоминающие мицелий гриба); 2) морфологические признаки микроорганизмов (по культуральным и морфологическим признакам часто можно определить лишь род микробов); 3) биохимические признаки − отношение к различным источникам питательных веществ – углеводам, белкам, жирам и др. (для этого чистую культуру пересевают на «пестрый ряд» различных сред с индикаторами) и физиологические признаки – отношение к кислороду, температуре и кислотности среды. Используя полученную информацию и пользуясь определителем для бактерий, устанавливают род и вид выделенного в чистой культуре микроорганизма. 55 СХЕМЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 22. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителя сибирской язвы 56 Рис. 23. Схема бактериологического исследования на Clostridium perfringens Рис. 24. Схема бактериологической идентификации Clostridium tetani 57 Рис. 25. Принципиальная схема бактериологического выделения Clostridium botulinum 58 Рис. 26. Принципиальная схема выделения стафилококков 59 Рис. 27. Принципиальная схема бактериологического выделения стрептококков группы А 60 Рис. 28. Принципиальная схема бактериологического выделения пневмококков 61 Рис. 29. Принципиальная схема бактериологического выделения энтерококков 62 Рис. 30. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей актиномикозов 63 Рис. 31. Принципиальная схема бактериологического выделения Pseudomonas aeruginosa 64 Рис. 32. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителя туляремии 65 Рис. 33. Схема бактериологического выделения возбудителя чумы 66 Рис. 34. Схема бактериологического выделения возбудителя иерсиниозов 67 Рис. 35. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей лептоспирозов 68 Рис. 36. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей туберкулеза 69 ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ ПРОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Из множества важных и нужных требований особое внимание обращаем на следующие условия: • Микроорганизм должен быть взят из зоны поражения – там, где предполагается воспалительный процесс. • В материал не должна быть занесена посторонняя флора, т.е. руки должны быть стерильными, инструмент для взятия − стерильным, желательно одноразовым. • Условия транспортировки должны обеспечивать выживание даже капризного микроорганизма в течение всего времени транспортировки в лабораторию. Лучшим вариантом является использование разовых систем транспортировки, содержащих одну из транспортных сред − Эймса, Стюарта или КэрриБлеера. Каждая из этих сред выпускается в варианте с активированным углем или же без угля. Уголь необходим для сорбции токсинов, снижающих жизнеспособность микробов. Так, посевы на гонорею рекомендуется брать только в среды с углем. Биологический материал погружают в столбик среды таким образом, чтобы он не оставался на ее поверхности. Среда предупреждает гибель микробных клеток, сохраняет их жизнеспособность, но в то же время препятствует размножению микроорганизмов, что исключает или существенно ограничивает преимущественный рост менее требовательных микроорганизмов при ассоциативной микрофлоре. Транспортировать и хранить взятый материал в лабораторию лучше всего при температуре 10−20 °С, не подвергая сильным температурным колебаниям, прямому солнечному свету. • Необходимо правильно и полно заполнять направления, не ограничиваясь поверхностными данными − номером пробы и ФИО. Чем больше вводных данных получит врач-бактериолог, тем больше пользы принесет больному и вам его ответ. Помните, что для предотвращения загрязнения направление всегда транспортируется отдельно от материала. Пробы биоматериала следует брать до начала антибактериальной терапии. Если пациент уже начал прием препаратов, а посев очень хочется взять (именно хочется, поскольку диагностическая ценность в таком случае падает в разы), старайтесь делать это перед приемом очередной дозы препарата. 70 ТЕХНИКА ВЗЯТИЯ МАЗКОВ ДЛЯ ПОСЕВА Материал из ран берут стерильным зондом, по возможности из более глубоких отделов, очистив рану от отмерших тканей, так как верхние отделы могут содержать сапрофитную микрофлору. Взятый материал помещают в пробирку с транспортной средой. Мазок из зева берется натощак стерильным зондом с воспаленных участков, при налетах (по краю их) и при наличии пленок − из глубины крипт миндалин, задней стенки глотки, дужек, языка. Взятый материал помещают в пробирку с транспортной средой. Мазок из носа, уха берется стерильным зондом. Взятый материал помещают в пробирку с транспортной средой (рис. 37). Рис. 37. Взятие образцов биоматериала из носа Мазок с конъюнктивы глаза берется врачом-офтальмологом специальным глазным шпателем. Взятый материал помещают в пробирку с транспортной средой. Материал из уретры у мужчин берут стерильным зондом, производя соскоб на глубине 3−4 см. Взятый материал помещают в пробирку с транспортной средой. Материал из уретры у женщин берут стерильным зондом, вводимым на глубину 1,5െ2 см. Зонд с материалом помещается в пробирку с транспортной средой. Материал из цервикального канала шейки матки берут с помощью стерильного зонда, вводя его в цервикальный канал на 1−1,5 см, и, осторожно поворачивая, вынимают, не прикасаясь к стенкам влагалища, после чего помещают в транспортную среду. Материал, взятый в транспортные контейнеры со средами Эймса или Стюарта, хранится при комнатной температуре и доставляется в лабораторию в течение 1−2 суток с момента взятия. 71 Посев мочи на уропатогенную флору Исследование микрофлоры мочи проводится в средней порции утренней мочи после тщательного туалета наружных половых органов. Мочу собирают в стерильный стакан с крышкой в количестве не менее 3−5 мл и доставляют в лабораторию в течение 1,5−2 ч. Длительное хранение мочи при комнатной температуре до исследования приводит к изменению физических свойств, разрушению клеток и размножению бактерий, что может привести к ложноотрицательному или недостоверному результату исследования. Взятие материала для исследования должно выполняться до начала приема антибиотиков и антибактериальных препаратов или проводиться в интервалах между курсами лечения. Нельзя сдавать мочу на посев женщинам во время месячных. Нельзя использовать для бактериологического исследования мочу из мочеприемника и подкладного судна. Кал на дисбактериоз Материалом для исследования на дисбактериоз кишечника служит утренний кал, помещенный в специальный контейнер с помощью мерной ложки, вмонтированной в крышку контейнера. Количество материала для исследования − примерно 2 г (3 лопатки). Если фекалии содержат слизь, кровяные или белые прожилки, предпочтительно именно этот участок брать в качестве материала для анализа. Взятый материал доставляется в лабораторию не позже 1,5 ч с момента дефекации. 72 МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ • Кровь. Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3−4 пробы крови, взятые с интервалом 4−6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры (например, Staphylococcus epidermidis), если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают как минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови. • Спинномозговая жидкость. Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1−2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1−2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С. • Испражнения. Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3−5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами. Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен 73 стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5−6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае − в транспортную среду. • Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3−5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи. • Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики. Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20−50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами − лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.). • Мокрота. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости. Промывные воды бронхов. При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку. • Материал, отделяемый глоткой, ротовой полостью и носом. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, забирая материал разными тампонами. 74 Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя. Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов. Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют, т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде. Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства. Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса. Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред, а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма. 75 ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Преимуществами бактериологического посева являются: • Высокая специфичность метода (т.е. перекрестных ложных реакций не наблюдается). • Возможность исследовать абсолютно любую биологическую жидкость человека. • Лечебная цель – определение чувствительности выявленного микроба к тому или иному лечебному средству (антибиотикограмма), что позволяет с достаточно высокой точностью проводить лечебные назначения. Недостатки бактериологического посева: • Длительность получения результата. • Высокие требования к забору материала. • Определенные требования к квалификации персонала бактериологических лабораторий. Показания для проведения бактериологического исследования Применение микробиологического метода исследования достаточно широко распространено в медицинской практике, в частности, в инфекционных болезнях, гинекологии, урологии, хирургии, отоларингологии, онкологии и др. Безусловным показанием для необходимости проведения бакпосева являются любое воспалительное заболевание органов и систем организма человека, подозрение на септический процесс. 76 ПОНЯТИЕ О БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Бактериологическая лаборатория − научно-практическое учреждение, выполняющее бактериологические, иммунологические и другие микробиологические исследования. Различают медицинские, ветеринарные и промышленные бактериологические лаборатории. Медицинские бактериологические лаборатории организуются при больницах, санитарно-эпидемиологических станциях и т.п. для проведения исследований в целях уточнения диагнозов и санитарноэпидемиологического контроля. При бактериологической лаборатории имеются: средоварня, мойка, препараторская, стерилизационная и виварий. Устройство и оборудование бактериологических лабораторий должны быть приспособлены для выполнения исследований в стерильных условиях, гарантирующих персонал от возможного заражения. Помещение бактериологической лаборатории должно быть светлым и просторным. Необходимо исключить возможность сквозняков. Специальное место отводится для окраски препаратов (рис. 38). Рис. 38. Персонал в бактериологической лаборатории Обязательным оборудованием рабочего места бактериолога являются горелка, банка с раствором карболовой кислоты для исполь- 77 зованных пипеток, закрывающийся сосуд для ваты, штативы для пробирок и бактериальной петли, эмалированные кюветы, пинцеты, ножницы, скальпель, предметные и покровные стекла. В бактериологической лаборатории должны находиться металлические подносы для чашек Петри, оцинкованные ведра или баки для сброса использованной посуды. Помимо обычной лабораторной посуды, бактериологические лаборатории снабжаются специальными видами посуды: чашки Петри для выращивания бактерий на плотных средах, бактериальные матрацы и др. Необходимы также резиновые груши для насасывания в пипетки особо опасного материала. Бактериологическая посуда должна быть чисто вымыта, стерилизована термообработкой и закрыта стерильными ватными пробками. Для стерилизации посуды не следует применять химических средств, так как их следовые количества могут повлиять на развитие микробов. Важнейшими для бактериологической лаборатории являются приспособления для посевов микроорганизмов (бактериальные петли, пастеровские пипетки, стеклянные и платиновые шпатели). Для проведения посевов в асептических условиях бактериологические лаборатории оснащаются специальными застекленными боксами, оборудованными ультрафиолетовыми лампами (см. Боксы бактериологические). Бактериологической лаборатории необходимы: холодильник для хранения бактериальных культур, сывороток и других биологических субстратов; микроскоп с осветителем; центрифуга; термостат или термостатная комната для выращивания бактерий; аппарат для встряхивания различных смесей; автоклав, суховоздушный стерилизатор (печь Пастера) для стерилизации питательных сред, посуды и электрические стерилизаторы. Подсобные помещения для работы с лабораторными животными, для мойки и сушки посуды, для розлива питательных сред и т.п. должны быть соответствующим образом оборудованы. 78 ТРЕБОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ К БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ ЛАБОРАТОРИЯМ При работе в бактериологической лаборатории, особенно с патогенными микроорганизмами, необходимо соблюдение следующих правил: 1. Все лица, находящиеся в бактериологической лаборатории, должны быть в халатах. 2. В помещении запрещаются прием пищи и курение. 3. Каждый работник должен пользоваться только своим рабочим местом. 4. Все операции должны производиться с соблюдением правил стерильности: все посевы проводят вблизи пламени горелки, переливание зараженных жидкостей производят над лотком с дезинфицирующим раствором и т.п. 5. Весь инвентарь, находившийся в контакте с заразным материалом, подлежит стерилизации или уничтожению. 6. Все культуры, а также зараженные животные учитываются и регистрируются в журнале по специальной форме. Лабораторный стол Для проведения микробиологического исследования лаборанту необходимо иметь соответствующим образом оборудованное рабочее место. Лабораторный стол должен иметь определенную высоту, чтобы, сидя за ним, легко было микроскопировать. По возможности стол должен быть покрыт линолеумом, а каждое рабочее место − оцинкованным подносом или зеркальным стеклом. Рабочее место должно быть снабжено микроскопом, штативами для пробирок и красок, платиновой петлей и иглой для посевов, чашкой с мостиком для препаратов, промывалкой, песочными часами, предметными и покровными стеклами, пипетками, набором красок, фильтровальной бумагой, спиртовой или газовой горелкой и банкой с дезинфицирующим раствором (лизол, карболовая кислота, сулема, хлорамин или лизоформ), куда опускают для обеззараживания бывшие в употреблении предметные и покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки и т.д. Посуда, в которой выращиваются микробы, обеззараживанию химическими веществами не подлежит. Следы дезинфицирующих веществ на такой посуде делают ее в дальнейшем непригодной для роста и размножения микроорганизмов. После использования посуду складывают в металлические бачки или ведра с крышкой, пломбируют и стерилизуют в автоклаве. Мелкий инструментарий (пинцеты, скаль- 79 пели, ножницы) после его использования помещают в стерилизатор и кипятят в течение 30−60 мин или погружают в 3−5 % мыльнокарболовый раствор хлорамина на 30−60 мин. Рабочее место должно содержаться в абсолютной чистоте. Недопустимо, чтобы стол был загрязнен исследуемым заразным материалом (моча, кал, гной и т.д.). В последнем случае заразный материал со стола может попасть на другие окружающие предметы, и тогда возможна внутрилабораторная инфекция. После окончания работы лаборант должен привести в порядок рабочее место, за которое он отвечает, и с целью профилактики стекло на рабочем месте протереть кусочком ваты, смоченным 5 % раствором карболовой кислоты или хлорамина (рис. 39, 40). Рис. 39. Техника микроскопирования бактериологических объектов Рис. 40. Рабочее место сотрудника бактериологической лаборатории 80 СОВРЕМЕННЫЕ СИСТЕМЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Система ВАСТЕС460 − радиометрический метод быстрого определения роста МБТ (Mycobacterium tuberculosis) путем регистрации уровня меченого СО2, образующегося в процессе утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный С14. Для роста МБТ в данной системе используют флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную среду Middlebrook 7H9, содержащую радиоактивный С14. При размножении МБТ утилизируют С14 и выделяют С1402; в этом случае учет идет по нарастанию С1402. Применение ВАСТЕС 460 позволило сократить сроки получения результатов выявления микобактерий до 14 дней, система оказалась пригодной для быстрой идентификации М. tuberculosis complex и определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза. Система ВАСТЕС MGIT960 − индикаторные пробирки MGIT (М. Growth Indicator Tube) с той же средой Middlebrook 7Н9; содержат в придонной части флюоресцирующий индикатор (трис-4,7-дифенил-1, 10-фенантролин рутениум хлорид пентагидрат), «погашенный» высокими концентрациями 02. В процессе роста МБТ поглощают 02, что сопровождается усилением свечения индикатора, интенсивность которого оценивают с помощью трансиллюминатора. Полностью автоматизированный комплекс позволяет одновременно исследовать лекарственную чувствительность МБТ в 960 исследуемых образцах. Наличие роста МБТ в системе ВАСТЕС регистрируется на 4−5-й день от момента посева. В системе ВАСТЕС, где используют те же абсолютные концентрации противотуберкулезных препаратов, учет лекарственной устойчивости идет в течение 6 нед. В последние годы для быстрого определения лекарственной устойчивости используют метод микрочипов, основанный на молекулярно-генетическом анализе (ПЦР) выявления точечных мутаций в гроВ гене, ответственном за устойчивость к рифампицину, и в katG гене, ответственном за лекарственную устойчивость к изониазиду. Установлено, что более 95 % устойчивых к рифампицину штаммов МБТ содержат точечные мутации (делеции и вставки в гроВ гене, кодирующих Р-субъединицу РНК-полимеразы) и более 70 % устойчивых к изониазиду штаммов МБТ имеют делеции и вставки в katG гене, кодирующих каталазу/пероксидазу. Результаты метода микрочипов могут быть получены на 3−4-й день исследования. 81 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Борисов, Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л. Б. Борисов. − 4-е изд. перераб. и доп. − М. : Медицинское информагенство, 2005. − 735 с. 2. Васильев, Д. А. Методы общей бактериологии : учеб.-метод. пособие / Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин, Н. М. Никишина. – Ульяновск, 1998. 3. Воробьев, А. А. Медицинская и санитарная микробиология : учеб. пособие для студентов мед. вузов / А. А. Воробьев, Ю. С. Кривошеин, В. П. Широбоков. − М. : Academia, 2005. − 462 с. 4. Зверев, В. В. Микробиология, Вирусология, иммунология : учеб. / В. В. Зверев. − М. : Медицина, 2007. – 814 с. 5. Лабинская, А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований : руководство / А. С. Лабинская. − М. : Медицина, 2005. – 157 с. 6. Нетрусов, А. И. Микробиология : учеб. / А. И. Нетрусов, И. Б. Котова. − 3-е изд., испр. − М., 2009. − 352 с. 7. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии : учеб. пособие / под ред. А. А. Воробьева, Ю. С. Кривошеина. − М. : Высш. шк., 2001. − 224 с. 8. Поздеев, О. К. Медицинская микробиология : учеб. / О. К. Поздеев. М., 2004. – 779 с. 9. Ткач И. С. Бактериологическое исследование кала. Анализ кала на дисбактериоз, анализ кала на кишечную инфекцию / И. С. Ткач // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2014. № 10(3). – С. 135−144. 10. Шаршкова, М. А. Результаты бактериологического исследования у пациентов с кератитом / М. А. Шаршкова, Л. А. Деев // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. − 2012. − № 14(3). – С. 260−264. 11. Хаитов, Р. М. Иммунология : учеб. / Р. М. Хаитов. − М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. − 320 с. 82 Учебное издание Есаулов Антон Сергеевич, Митрофанова Наталья Николаевна, Мельников Виктор Львович БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Редактор Н. А. Сидельникова Компьютерная верстка Р. Б. Бердниковой Дизайн обложки А. А. Стаценко Подписано в печать 06.10.2015. Формат 60×841/16. Усл. печ. л. 4,88. Тираж 100. Заказ № 842. Издательство ПГУ. 440026, Пенза, Красная, 40. Тел./факс: (8412) 56-47-33; е-mail: [email protected] 83
