2. Интерфероны — биологически активные белки, которые синтезируются клеткой в ходе защитной реакции. Данные соединения выделяются во внеклеточную жидкость и далее через рецепторы действуют на другие клетки. Система интерферонов не имеет специализированных клеток, органов, она существует в каждой клетке, так как каждая клетка может быть заражена вирусом и должна иметь систему распознавания и удаления чужеродной генетической информации. Семейство ИФН человека классифицируют на три класса. Интерфероны всех трех классов имеют антивирусные свойства, но различаются тем, что связываются с разными клеточными рецепторами. 3. ИФН играют важную роль в механизмах естественного иммунного ответа. Выделяют 4 звена функционирования системы ИФН. ИФН прикрепляются к клеточным рецепторам, начинается синтез вторичных мессенджеров, которые в свою очередь могут подавлять практически любой из этапов размножения вирусов (транскрипцию — трансляцию — сборку — выход вирионов потомства). Универсальной мишенью для ИФН является остановка трансляции вирусных РНК на рибосомах инфицированных клеток. Блокирование стадии инициации трансляции и разрушение мРНК вируса определяют универсальный механизм действия ИФН при вирусных инфекциях. 4. Было определено, что основной функцией интерферонов в организме является защита от вирусных частиц, следовательно, их очень часто применяют в противовирусной терапии. Наиболее активно интерферон используют при лечении острой респираторной вирусной инфекции у детей (ОРВИ), с применением интерферонов типа α и γ. Все интерфероны делят на природные и рекомбинатные. Природные соединения получают из лейкоцитов человеческой крови, такой способ позволяет получать незначительные количества ИФН, а также отличается дороговизной исходного сырья. Получение же рекомбинатных ИФН позволяет нарабатывать субстанции генно-инженерных соединений в неограниченном количестве. Применение рекомбинантного интерферона позволило расширить арсенал лекарственных средств для лечения очень многих тяжелых заболеваний. 5. Грандиозным достижением применения интерферонов является разработка нового поколения интерфероноактивных препаратов — индукторов ИФН (ИИ). Механизм действия обеспечивается индукцией интерферона, синтезом синтетических полипептидов и активизацией ферментов системы интерферона. Разработка ИИ и применение их в клинической практике значительно расширило возможности интерферонотерапии и предоставило врачу более широкий выбор лекарственных препаратов для формирования противоинфекционного и противовирусного иммунитета (таблица 2). 6. Плазмидозависимые технологии являются высокопроизводительными, тем не менее, имеют серьезный недостаток – целевой продукт, как правило, образовывает в клетке нерастворимые в воде кристаллообразные формы, так называемого «тельца включения». Процесс изготовления и очистки интерферона при использовании плазмидной технологии состоит из таких стадий: собирание клеточной биомассы; её дезинтеграция; растворение «телец включения» путем денатурации белковых структур с помощью мочевины или гуанин-дихлорида; ренатурация денатурированных молекул интерферона; очистка интерферона от балластных компонентов. Стадия ренатурации является ключевой стадией в процессе получения рекомбинантных белков, в процессе которой денатурированный белок приобретает нативную пространственную структуру, обеспечивающую его биологическую активность. В процессе ренатурации молекул интерферона наблюдается образование некорректных внутренне- и межмолекулярных связей. Это приводит к частичному образованию неправильных мономерных форм рекомбинантного интерферона, конформация которых отличается от таковой у естественного интерферона, и возникновению его олигомерных структур, которые отсутствуют в естественном интерфероне. Предложен оригинальный способ получения рекомбинантного интерферона с использованием встроенного в бактериофаг гена интерферона. Бактериофаг, заражая бактериальную клетку, размножается в ней, копируя многократно свою ДНК и встроенный в неё ген интерферона, синтезирует свои белки, в том числе и интерферон. На определенной стадии развития бактериофаг лизирует бактериальную клетку. Интерферон выходит в культуральную жидкость, причем, в водорастворимом состоянии, не образовывая нерастворимых форм. Синтез организован таким образом, что интерферон накапливается вне клетки (в культуральной среде), поэтому не образовывает «телец включения», как это имеет место в плазмидной технологии получения интерферона (Intron-A, Roferon-A и др.). Накопление интерферона в культуральной жидкости разрешает очищать его по упрощенной схеме: отсутствие необходимости сбора биомассы, её дезинтеграции, денатурации белков с целью растворения «телец включения» и ренатурации молекул интерферона. Отсутствие стадии концентрирования клеток (сбор биомассы), а также и клеточных белков, разрешает получить высокоочищенный препарат интерферона менее сложным методом, чем тот который используется при «плазмидной» технологии. Очищение осуществляется ионообменной хроматографией. По предложенной технологии был получен рекомбинантный интерферон «Лаферон». В полученном препарате обнаруживается не менее 95 % белка интерферона. 7. В качестве примера можно привести краткую технологию получения интерферона-α-2b, предложенную российскими учеными. 1) Культивирование штамма продуцента. Продуцентом является Е. Coli BL21(DE3)[pET22(b+)-IFN-a- 2b-2Тф]. Штамм BL21(DE3) был трансформирован плазмидой, которая содержит вставку гена интерферона. Получали инокулят на среде Лурия - Бертани, имеющей в составе триптон, дрожжевой экстракт, хлорид натрия и ампициллин. Культивирование проводили в течение 7 часов при температуре 37°С и перемешивании 240 об/мин. Далее культивировали в ферментере синтетическую среде, которая по составу практически аналогичной предыдущей, только вместо хлорида натрия использовали глюкозу. рН поддерживали на нейтральном уровне. Культивирование продолжали до тех пор, пока прирост оптической плотности культуры за 1 час не снижался до 1 ОЕ. 8. 2) Приготовление экстракта клеток, содержащего интерферон-а-2b. Клетки Е. Coli ресуспендировали в буфере. Клетки разрушали на проточном дезинтеграторе. Тельца включения собирали центрифугированием. Осадок телец включения ресуспендировали буфере и собирали центрифугированием, дважды повторяя эту процедуру. Тем самым удаляется основная масса нуклеиновых кислот и часть растворимых белков. Осадок отмытых телец включения переносят в буфер и растворяют твердые вещества в течение 2-4 часов при постоянном перемешивании и подогреве до комнатной температуры. 9. Затем осуществляют сульфитолиз, добавляя к полученному раствору сульфит натрия. Известно, что данная процедура необходима для перевода полимеров интерферона в мономерную форму. Полученный раствор осветляли центрифугированием и обессоливали на колонке сефадекса. В полученный раствор добавляли 2-меркаптоэтанол и инкубировали 48 часов при 6°С без перемешивания. Далее в смесь добавляли уксусную кислоту. Выпавший осадок удаляли центрифугированием. В осадок выпадает часть бактериальных белков, а также часть неправильно собранного интерферона. Раствор ренатурированного интерферона концентрировали с помощью ультрафильтрации. 10. 3) Ионно-обменная хроматография. Ренатурированный интерферон-α-2b наносят на колонку для ионно-обменной хроматографии. Далее интерферон элюируют Na-ацетатным буфером. Фракции анализировали ВЭЖХ, объединяя те из них, содержание мономера нативного интерферона в которых составляло более 80 %. В настоящее время разработаны методы получения субстанций различных видов получения рекомбинантных интерферонов (интерферон-α-2b, интерферон-α-2а, γ-интерферон, δ-интерферон и др.) и их готовых лекарственных форм, многие из которых нашли широкое применение в медицине.
