Мамалыга Ирина Николаевна

На правах рукописи
Мамалыга Ирина Николаевна
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И ПАРАМЕТРЫ АПОПТОЗА
ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ГЕСТОЗЕ
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.
Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Научный руководитель:
Заслуженный врач РФ
доктор медицинских наук,
профессор
Наталья Юрьевна Сотникова
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук,
профессор
Марина Александровна Стенина
Заслуженный деятель науки РУз
доктор медицинских наук,
профессор
Фируз Юсуфович Гариб
Ведущая организация:
ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени
В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской
помощи»
Защита состоится «21» октября 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «17» сентября 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент
2
Т.Е.Кузнецова
Актуальность научного исследования
Гестоз является одним из наиболее грозных осложнений беременности,
представляющих опасность для матери и плода [Кулаков, В.Н. и др., 2005; Савельева, Г.М. и др., 2005]. Несмотря на постоянное внимание к проблеме гестоза во всем мире, до настоящего времени вопросы этиологии и механизмы развития данной акушерской патологии остаются спорными.
Накопленные к настоящему времени сведения дают возможность полагать, что
важную роль в патогенезе гестоза играет иммунный компонент [Сухих, Г.Т. и
др., 1997; Сотникова Н.Ю. и др., 2005; Sargent, I.et. al., 2004; Xia, Y., 2007; Zhou,
L.L. et. al., 2008], причем клеткам, обладающим цитотоксическими свойствами,
отводится ведущая роль в этих процессах [Соколов Д.И., и соавт., 2007; Bachmayer, N. et. al., 2006; Dimitrakova-Dzhambazova, E. et. al.,, 2005; Mahmoud, F. et.
аl., 2003].
Имеющиеся данные об изменениях в содержании цитотоксических Тлимфоцитов (ЦТЛ) и NК клеток в периферической крови женщин с гестозом
носят весьма противоречивый характер [Bachmayer, N. et. al., 2006; Borzychowski, A.M. et. al., 2005; Dimitrakova-Dzhambazova, E. et. al., 2005; Paeschke,
S. et. al., 2005; Van Wijk M.J. et. al., 2001]. Вклад ЦТЛ и NК клеток в суммарную
продукцию цитокинов при гестозе остается мало изученным. Имеются лишь
отдельные сведения об отсутствии достоверных различий в характере продукции IL-2 и IFNγ цитотоксическими Т-лимфоцитами при неосложненной беременности и гестозе, и о повышенной продукции IFNγ CD16+ клетками у женщин с гестозом [Darmochwal-Kolarz, D. et. al., 2002]. Ряд авторов не отметили
изменений в относительном содержании IFNγ+ и IL-2+ NК у женщин с
неосложненным течением беременности и с преэклампсией [Van Nieuwenhoven,
A.L. et. al., 2008].
В литературе имеются противоречивые сведения об экспрессии рецептора к IL-2 ЦТЛ при гестозе [Астраух, Н.В., 2002; Abe, E. et. al., 2003;
Darmochwal-Kolarz, D. et. al., 2007; Hu D, et. al., 2008; Paeschke, S. et. al., 2005] и
практически полностью отсутствуют данные об экспрессии рецепторов к IFNγ
3
на поверхности клеток с цитотоксической активностью. Остаются неизученными вопросы, касающиеся продукции цитолитических молекул как при
неосложненном течении беременности, так и при гестозе. Также немногочисленны работы, посвященные изучению процессов апоптоза клеток с цитотоксической активностью и роли самих цитотоксических лимфоцитов в регуляции
Fas-индуцированного апоптоза при гестозе. Таким образом, сведения об особенностях функционального состояния клеток с цитотоксической активностью,
а так же параметрах апоптоза периферических цитотоксических Т-лимфоцитов
и естественных киллеров при гестозе малочисленны и достаточно противоречивы. В то же время, изучение роли данных популяций клеток в развитии характерных для гестоза осложнений, поможет лучше понять патогенез данной
акушерской патологии.
Цель научного исследования:
На основании определения особенностей активации, апоптоза, продукции и
рецепции цитокинов, экспрессии Granzyme B периферическими лимфоцитами с
цитотоксической активностью при беременности установить особенности их
функционирования при гестозе.
Задачи научного исследования:
1. Установить особенности содержания и активации периферических клеток с
цитотоксической активностью у женщин с гестозом.
2. Оценить спонтанную и стимулированную внутриклеточную продукцию
Granzyme B периферическими клетками с цитотоксической активностью
при гестозе.
3. Выявить особенности продукции и рецепции IFNγ и IL-2 периферическими
клетками с цитотоксической активностью при гестозе.
4. Оценить особенности параметров Fas-зависимого апоптоза периферических
клеток с цитотоксической активностью у женщин с гестозом.
Научная новизна исследования:
- Выявлены новые иммунные механизмы развития гестоза, заключающиеся в
накоплении клеток с повышенной цитотоксической активностью, включая
4
ЦТЛ, NК и NК-Т, активно продуцирующих IFNγ, IL-2 и GranzymeB, обладающих повышенной апоптоз-индуцирующей способностью.
- Впервые установлены особенности ранней активации периферических клеток
с цитотоксической активностью у женщин с гестозом, характеризующиеся усилением экспрессии CD69 и CD11b молекул на поверхности NК клеток с фенотипом CD56+.
- Впервые выявлены особенности спонтанной и стимулированной внутриклеточной продукции GranzymeB периферическими клетками с цитотоксической
активностью при гестозе, проявляющиеся увеличением содержания в крови
женщин CD8+GrB+ лимфоцитов и усилением стимулированной GranzymeB продуцирующей способности CD8+ и CD16+ клеток.
- Установлены закономерности изменений спонтанной внутриклеточной продукции и рецепции IFNγ и IL-2 периферическими лимфоцитами у женщин с гестозом, проявляющиеся повышением содержания IFNγ-продуцирующих цитотоксических Т-лимфоцитов, IL-2-продуцирующих CD8+ и CD56+ клеток, количества CD8+ и CD16+ клеток, экспрессирующих рецепторы к IL-2, и снижением уровня CD16+ и CD56+ NК клеток, экспрессирующих рецепторы к IFNγ.
- Установлено, что при гестозе стимуляция ФМА и иономицином через 5 часов
инкубации индуцирует усиленную внутриклеточную продукцию IFNγ CD8+,
CD16+ и CD56+ клетками, через 24 часа - IL-2 цитотоксическими Тлимфоцитами.
- Выявлено, что при гестозе повышается апоптоз индуцирующая активность
CD16+ и CD56+ NК клеток, усиливается готовность ЦТЛ и CD16+ NК клеток к
апоптозу, увеличивается содержание CD16+ и CD56+ NК клеток вступивших в
апоптоз, но при этом возрастает количество аннексин-негативных клеток с цитотоксической активностью всех типов.
Практическая значимость исследования:
- Получены новые нормативные данные о содержании клеток с цитотоксической активностью, продуцирующих Granzyme B при гестозе.
- Уточнена роль клеток с цитотоксической активностью в патогенезе гестоза.
5
Реализация результатов работы:
Нормативные данные функционального состояния и параметров апоптоза
периферических клеток с цитотоксической активностью при гестозе используются в работе врачей аллергологов-иммунологов КДП ФГУ«Ив НИИ МиД им.
В.Н. Городкова Росмедтехнологий» и в учебном процессе на кафедре акушерства, гинекологии и медицинской генетики ГОУ ВПО «Ив ГМА Росздрава».
Апробация работы:
Основные положения работы доложены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005); Международной научнопрактической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» - Новосибирск, 2008; 13 Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту:
Иммунные механизмы развития гестоза связаны с накоплением клеток с
повышенной цитотоксической и апоптоз-индуцирующей активностью на фоне
нарушения их элиминации путем апоптоза. В периферической крови беременных женщин с гестозом повышено содержание активированных цитотоксических лимфоцитов, NК и NК-Т, активно продуцирующих IL-2, IFNγ и
GranzymeB, экспрессирующих молекулы адгезии. Для гестоза характерно изменение рецепции цитокинов, проявляющееся увеличением содержания CD25
позитивных ЦТЛ и CD16+ NК и снижением NK-клеток, экспрессирующих рецепторы к IFNγ. У женщин с гестозом наблюдается усиленный ответ клеток с
цитотоксической активностью на стимуляцию ФМА и иономицином.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации:
Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 3 глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы,
включающего 255 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа
6
иллюстрирована 6 рисунками и 19 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследования проводились на базе акушерской и гинекологической клиник
Федерального
государственного
учреждения
«Ивановский
научно-
исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (директор
– заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Посисеева Л.В.).
Обследованы: 141 женщина в III триместре гестации, в том числе - 63 беременных женщины, у которых течение гестационного процесса не было
осложнено развитием гестоза (контрольная группа) и 78 беременных женщин с
гестозом.
Иммунологические исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (зав. лабораторией заслуженный врач РФ,
д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю.).
Материалом для исследования у женщин служила периферическая венозная кровь.
Для проведения иммунологических исследований выделяли обогащенную популяцию лимфоцитов периферической крови стандартным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколлурографина (d-1,078).
Поверхностный фенотип лимфоцитов и внутриклеточную экспрессию
цитокинов определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом
двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин
изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ). Процедуру окрашивания и фиксации
клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмыразработчика. Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest
7
Control (мышиные IgG1-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США). Исследования
методом проточной цитометрии производили в лимфоцитарном гейте. При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом
CD45+CD14-. В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "LYSYS II".
Фирма-производитель и клон, использованных в исследовании мАТ, указаны в таблице 1.
Таблица 1.
Характеристика моноклональных антител, использованных в работе
МАТ
CD3
CD8
CD16
CD56
CD56
CD69
CD25
CD95, Fas
CD95L, FasL
CD119
CD11b
CD11c
Recombinant
Annexin V
Клон
ICO-90
ICO-31
ICO-116
ICO186
MEM-188
TP1.55.3
ICO-124
ICO-160
Alf-2.1
92101
ICO-GM1
HCl-3
-
Фирма-производитель
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
«Caltag Laboratories», США
«Immunotech», Франция
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
«Caltag Laboratories», США
«R&D Systems», США
НПЦ «МедБиоСпектр», Россия
«Becton Dickinson», США
«Caltag Laboratories», США
Флюорохром
FITC, PE
FITC, PE
FITC, PE
FITC
PE
PE
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
PE
FITC
Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили
тест с одновременным окрашиванием клеток моноклональными АТ антиCD16+, анти-CD56+ или анти-CD8+ и Annexin V. Для этого на первом этапе
проводили стандартную процедуру окрашивания клеток моноколональными
антителами к соответствующей популяции. После 30 минутной инкубации
клетки отмывали центрифугированием в 1 мл PBS. Клетки ресуспендировали в
50 мкл PBS, добавляли 5 мкл Annexin V, коньюгированного с FITC, инкубировали 15 мин в темноте. Затем добавляли 200 мкл стабилизирующего буфера
(CALTAG Laboratories, США), и не более, чем в течение 30 мин анализировали
на проточном цитофлюориметре.
8
Стимулированную внутриклеточную продукцию цитокинов исследовали
в клеточной суспензии инкубировавшейся при 370С и 5%СО2 в течение 5 и 24
часов в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 2 mM L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина, 10 нг/мл
форболмиристатацетата (ФМА) (Sigma, США), 1M иономицина (Sigma, США)
в присутствии 2 M моненсина (Sigma, США). Затем клетки отмывали от препаратов физиологическим раствором центрифугированием при 1500 об/мин 5
мин. В качестве контроля использовали показатели исходного уровня клеток
внутриклеточно продуцирующих IL-2, IFNγ и GranzymeB в периферической
крови. Подсчет концентрации и жизнеспособности лимфоцитов до и после инкубации показал, что гибель клеток во всех случаях составила менее 8%.
Внутриклеточную процедуру окрашивания клеток-продуцентов IFNγ, IL-2 и
GranzymeB проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя, используя коммерческий набор FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, США) для пермеабилизации клеточной мембраны.
Характеристика моноклональных антител, использованных для определения внутриклеточной продукции цитокинов, представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Характеристика моноклональных антител, использованных для определения
внутриклеточного содержания цитокинов
МАТ
Анти-IL-2
АнтиGranzymeB
Анти-IFN
Клон
MQ1-17H12
GB-12
Фирма-производитель
CALTAG Laboratories, США
CALTAG Laboratories, США
Флюорохром
PE
PE
B27
CALTAG Laboratories, США
PE
Внутриклеточный синтез цитокинов и GranzymeB оценивали в популяции
CD8+, CD16+, CD56+ лимфоцитов (CD8+GrB+, CD16+GrВ+, CD56+GrВ+,
CD8+IL-2+, CD16+IL-2+, CD56+IL-2+, CD8+IFNγ+, CD16+ IFNγ+, CD56+IFNγ+
клетки). При проведении процедуры окрашивания клетки сначала инкубировали с мАТ к поверхностным маркерам клеток в соответствии со стандартным
9
протоколом. Затем клетки фиксировали в течение 15 мин в 100 мкл фиксирующего буфера А из набора FIX & PERM cell permeabilization kit. Клетки отмывали от фиксирующего буфера в 2 мл PBS центрифугированием в течение 5 мин
при 1500 об/мин, надосадочную жидкость сливали. Отмытые клетки инкубировали со 100 мкл пермеабилизирующего буфера В и с мАТ для внутриклеточного окрашивания.
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000 и программы STUD BAT из
комплекта «Statistica». Достоверность различий сравниваемых показателей
определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты работы и их обсуждение
Для уточнения особенностей функционального состояния при гестозе
нами была проведена оценка особенностей функционального состояния и параметров апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью.
Исследование содержания в периферической крови беременных женщин
клеток с цитотоксической активностью выявило достоверное повышение при
гестозе уровня всех популяций исследуемых клеток, включая цитотоксические
Т-лимфоциты (p<0,001), NК-Т клетки (p<0,001) и NК клетки с фенотипом
CD16+ (p<0,02) и CD56+ (p<0,001). Вероятно, увеличение этого пула NK-T клеток происходило за счет увеличения популяции CD16+CD56-, поскольку в периферической крови женщин с гестозом отмечалось достоверное повышение
лишь этой популяции. Отмеченное нами повышение уровня цитотоксических
лимфоцитов в периферической крови женщин с гестозом могло быть обусловлено высоким уровнем сывороточного содержания провоспалительных цитокинов, которое отмечается большинством авторов при гестозе [Лукина Н.С. и др.,
2005; Медвинский, И.Д., 2004; Пелевина М.И. и др., 2006; Сотникова Н.Ю. и
др., 2007; Чистякова, Г.Н. и др., 2006; López-Jaramillo, P. et. al., 2008 ].
Важную информацию о функционировании клеток дает степень их активации [Ярилин, А.А., 1999].
10
Данные, характеризующие функциональное состояние лимфоцитов с цитотоксической активностью, приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Сравнительная характеристика функционального состояния периферических
клеток с цитотоксической активностью у женщин с физиологической беременностью и гестозом
Показатель
CD56+CD69+
CD56+CD11b+
CD56+CD11b+
GrВ+
CD8+Gr В+
IL-2+
CD8+IL-2+
CD56+IL-2+
IFNγ+
CD8+IFNγ+
CD25+
CD8+CD25+
CD16+CD25+
CD119+
CD16+CD119+
CD56+CD119+
*- коэффициент
ФБ
n=19
1,24±0,10
2,03±0,40
2,03±0,40
19,71±1,19
6,39±0,3
16,99±0,80
4,80±0,67
1,90±0,16
16,83±0,69
2,97±0,67
5,52±0,11
0,62±0,07
0,27±0,02
11,05±0,94
2,18±0,13
2,08±0,33
достоверности разности результатов по
Гестоз
n=35
1,82±0,19***
4,47±0,67*
4,47±0,67*
23,22±0,79*
10,15±0,83****
23,38±1,28****
7,84±1,23*
2,56±0,27*
22,48±1,46***
5,89±0,83**
7,16±0,34****
1,04±0,18*
0,55±0,07****
6,86±0,64****
1,14±0,17****
1,27±0,16*
сравнению с показате-
лями у женщин с ФБ (*- p<0,05, ** - p<0,02, *** - p<0,01**** - p<0,001).
Нами проведено исследование особенностей экспрессии маркера ранней
активации CD69 на поверхности ЦТЛ и NК у беременных женщин с гестозом
по сравнению с аналогичными показателями женщин с нормально протекающей беременностью. Выраженные изменения при гестозе мы отметили только в
популяции CD56+ NК, где наблюдалось достоверное увеличение количества
CD69-позитивных клеток (р<0,01).
У женщин с гестозом по сравнению с таковым у женщин с физиологически протекающей беременностью было выявлено увеличение общего количества лимфоцитов, экспрессирующих CD11b молекулу, (p<0,05). При этом в
крови женщин с гестозом достоверно выше, чем при неосложненной беремен11
ностью, был уровень естественных киллеров с фенотипом CD56+, экспрессирующих CD11b (p<0,05).
Известно, что молекулы адгезии участвуют в реализации межклеточных
взаимодействий по типу клетка-клетка и клетка-межклеточный матрикс, вовлекаясь, таким образом, в осуществление процессов миграции клеток и взаимодействие цитотоксических клеток с клетками-мишенями [Пальцев, М.А., 1995].
Взаимодействие CD11b-позитивных NК клеток с клетками мишенями приводит
к усилению продукции различных цитокинов и цитолитических веществ, которые опосредуют цитотоксическую активность NК клеток [Пальцев, М.А., 1995],
что может играть непосредственную роль в развитии системного воспалительного иммунного ответа у женщин с гестозом.
Поскольку в основе развития любого иммунного ответа, в том числе и
материнского иммунного ответа на развивающийся плод, лежит цитокиновая
регуляция [Ковальчук Л.В. и др., 2001], мы предположили, что изучение продукции важнейшего провоспалительного цитокина IFNγ, а также IL-2, отвечающего за пролиферативный ответ иммунокомпетентных клеток, представляет
несомненный интерес.
Установлено, что для гестоза характерно значительное увеличение количества периферических лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-2 по
сравнению с таковым при нормально протекающей беременности (p<0,001).
Повышение содержания IL-2 позитивных клеток при гестозе происходило за
счет увеличением пула ЦТЛ и CD56+ NК (p<0,05 в обоих случаях).
Известно, что IL-2 является цитокином, активирующим пролиферативный и дифференцировочный ответы Т-лимфоцитов [Ковальчук Л.В. с соавт.,
2001; Белоцкий, С.М. с соавт., 2008]. IL-2 индуцирует экспрессию перфорина и
GranzymeB ЦТЛ, усиливая цитотоксическую активность CD8+лимфоцитов [Белоцкий, С.М. с соавт., 2008] и увеличивает экспрессию антиапоптотического
гена Bcl-2, оказывая угнетающее влияние на апоптоз клеток [Akbar, A.N. et.al.,
1996; Gupta, S. et.al., 2005]. Это позволяет предположить, что повышение продукции IL-2 цитотоксическими лимфоцитами свидетельствует о важной регу12
ляторной функции клеток с цитотоксической активностью при гестозе.
Одновременно при гестозе повышалось содержание IFNγ-синтезирующих
лимфоцитов по сравнению с аналогичным параметром женщин с неосложненной беременностью (p<0,01) за счет увеличения пула IFNγ-позитивных ЦТЛ
(p<0,02).
Известно, что IFN- оказывает потенциально опасное воздействие на беременность за счет индукции апоптоза трофобласта [Aban, M. et.al., 2004] и активации гранзим-перфоринового механизма уничтожения клетки-мишени [Tobias, M. et.al., 2007]. IFNγ непосредственно стимулирует экспрессию рецепторов к ангиотензину II в стенке кровеносных сосудов [Fernandez-Castelo, S. et.
al., 1987; Horiuchi M. S. et.al., 2000], что может провоцировать развитие гипертензии, которая является характерным симптомом гестоза. В работах последних
лет было показано, что при преэклампсии повышается сывороточная концентрация IFNγ-индуцибельного протеина CXCL10/IP-10, обладающего не только
провоспалительными, но и выраженными анти-ангиогенными свойствами
[Gotsch, F. et.al., 2007]. Одновременно с этим доказана способность IFN стимулировать адгезию клеток на поверхности эндотелия [Белоцкий, С.М. с соавт.,
2008]. Повышение IFN-продуцирующей способности клеток с цитотоксической активностью у женщин с осложненным течением гестационного процесса,
вероятно, может обуславливать клинические проявления гестоза.
У беременных женщин с гестозом было выявлено значительное увеличение количества лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих GranzymeB,
по сравнению с показателями женщин с неосложненным течением беременности (p<0,05). Достоверно более высокое содержание GranzymeB -позитивных
лимфоцитов отмечалось в популяции CD8+ клеток (p<0,001). GranzymeB представляет специфичную к остатку аспарагиновой кислоты сериновую протеазу,
принимающую активное участие в гранзим-перфориновом механизме уничтожения клетки-мишени активированными ЦТЛ. Этот механизм подразумевает
образование в зоне контакта с клеткой-мишенью трансмембранных каналов с
помощью белка перфорина. Через этот канал внутрь клетки поступают гранзи13
мы, представляющие протеолитические ферменты, основным из которых является GranzymeB, превращающий прокаспазу-3 в каспазу-3. Включение последней приводит к разрушению белков цитоскелета и ядра клетки [Белоцкий, С.М.
с соавт., 2008]. Можно предположить, что повышение уровня GranzymeBпозитивных ЦТЛ при гестозе ведет к развитию цитотоксических реакций против тканей материнских органов, плаценты и плода, что может обуславливать
клинические проявления гестоза. Это предположение согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что активированные ЦТЛ могут опосредованно через перфорин-гранзимовый путь повреждения клеток разрушать аутологичные тромбоциты [Zhang, F. et.al., 2006], вызывая характерную для гестоза
тромбоцитопению [Zhang, F. et.al., 2006].
Характер продукции цитокинов и цитотоксических молекул цитотоксическими Т-лимфоцитами изменяется в динамике их дифференцировки. Известно, что наивные клетки не способны выполнять эффекторные функции и не
способны к высокому уровню продукции цитокинов [Tobias, M. et.al., 2007], тогда как наиболее мощными продуцентами IL-2, IFN- и GranzymeB являются
претерминально-дифференцированные и терминально-дифференцированные
эффекторные CD8+ клетки памяти [Талаев В.Ю. с соавт., 2005; Maldonado A.
et.al., 2003].
По-видимому, при гестозе усилен процесс дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов, и основной пул CD8+ лимфоцитов представлен популяциями эффекторных клеток памяти, способными к быстрому реагированию на
повторное поступление антигена усилением цитотоксических реакций.
Изучение особенностей рецепции IL-2 и IFNγ лимфоцитами с цитотоксической активностью выявило, что у женщин с гестозом по сравнению с аналогичными показателями женщин с нормально протекающей беременностью в
целом было значительно повышено содержание лимфоцитов, экспрессирующих
рецепторы к IL-2 (р<0,001), за счет CD8+ лимфоцитов (р<0,05) и CD16+ NК
(р<0,001).
14
Повышение количества лимфоцитов с цитотоксической активностью,
экспрессирующих на своей поверхности рецепторы к IL-2, по-видимому, свидетельствует о готовности клеток к быстрому реагированию под влиянием цитокинового сигнала и об активированном состоянии ЦТЛ и NК клеток при гестозе. В качестве такого сигнала может выступать усиленная продукция IFN,
способствующая пролиферации и дифференцировке клеток с цитотоксической
активностью.
Проведенные исследования показали, что у женщин с гестозом нарушена
рецепция IFN, у них было достоверно снижено содержание CD119+ лимфоцитов по сравнению с аналогичными показателями женщин с физиологической
беременностью (р<0,001). Кроме того, при гестозе было ниже, чем у женщин с
физиологической беременностью, содержание NК клеток с фенотипом CD16+ и
СD56+, экспрессирующих рецепторы к IFNγ (р<0,001 и р<0,05 соответственно),
что может способствовать освобождению IFNγ в среду, не вызывая его последующего повторного связывания с лимфоцитами и, вопреки антипролиферативному действию IFN [Ковальчук Л.В. и др., 2001], усиливать пролиферацию
NК клеток в процессе развития иммунного ответа при гестозе.
Наибольшие изменения при гестозе наблюдались в популяции ЦТЛ, и заключались в значительном повышении содержания CD8+ лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины и цитолитические молекулы. Это может быть обусловлено усиленным поступлением в материнский кровоток антигенов плодового происхождения за счет повышения проницаемости плаценты,
обусловленной характерным для гестоза усилением апоптоза клеток трофобласта с последующей активацией реакций адаптивного иммунитета [StraszewskiChavez, S.L. et.al., 2004]. Одновременное увеличение уровня цитотоксических
Т-лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-2 и экспрессирующих рецепторы к нему, может запускать процесс аутоактивации, поддерживая тем самым высокий уровень пролиферации и дифференцировки клеток с цитотоксической активностью при гестозе.
15
Увеличение
содержания
ЦТЛ,
внутриклеточно
продуцирующих
GranzymeB, свидетельствует об их высоком цитолитическом потенциале и усилении активации гранзим-перфоринового механизма уничтожения клетокмишеней. Повышение цитолитической способности ЦТЛ может обуславливать
повреждение клеток организма беременной женщины и вызывать характерные
для гестоза проявления полиорганной недостаточности. Увеличение продукции
IFN может способствовать развитию гипертензивного синдрома и нарушению
функции почек при гестозе. Наблюдавшееся при гестозе повышение содержания CD56+ NК клеток, находящихся на ранних этапах активации и экспрессирующих адгезионные молекулы, может повышать миграционную способность
клеток с последующим их участием в нарушении функции эндотелия и развитии полиорганной недостаточности. При гестозе отмечалось также увеличение
в крови количества CD16+ NК клеток, экспрессирующих рецепторы к IL-2, на
фоне снижения содержания CD16+CD119+ клеток.
Важную информацию о функциональном состоянии клеток дает оценка
их способности отвечать на дополнительную стимуляцию. Именно способность
к адекватному иммунному ответу определяет характер течения беременности.
Для оценки потенциальных возможностей клеток с цитотоксической активностью продуцировать цитокины и цитолитические молекулы клетки инкубировали с неспецифическими стимуляторами ФМА и иономицином в течении 5ч и
24ч, после чего оценивали изменение содержания клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-2, IFN или GranzymeB, в сравнении с их исходным уровнем.
Анализ полученных результатов показал, что при гестозе неспецифическая стимуляция способствовала более быстрому и значительному повышению
содержания всех популяций цитотоксических клеток, внутриклеточно продуцирующих IFN, по сравнению с контрольной группой. При этом наибольшие
изменения продукции IFN под влиянием стимуляции при гестозе наблюдались
в популяции CD56+ NК клеток.
При физиологической беременности (рис. 1) после инкубации лимфоцитов с ФМА и иономицином уже через 5 часов наблюдалось значительное уве16
личение количества IFN+ лимфоцитов, в том числе и CD8+IFN+ клеток, по
сравнению с исходным уровнем до инкубации (p<0,001 и p<0,05 соответственно). Это увеличение было более выраженным после 24 ч стимуляции (p<0,001 в
обоих случаях). Следует отметить, что при неосложненной беременности уровень CD16+IFN+ NК не изменялся после 5 часов инкубации с ФМА и иономицином (p>0,05), но увеличивался через 24 часа стимуляции (p<0,05) по сравнению с исходными значениями до инкубации. Достоверные различия в содержании CD56+IFN+ NК после 5 и 24 часовой инкубации отсутствовали (p>0,05).
35
*^
30
25
%
*
20
15
*^
10
*
5
*
0
IFNg
CD8+IFNg
спонтанная продукция
CD16+IFNg
инкубация 5 ч
CD56+IFNg
инкубация 24 ч
Рис.1 Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IFN периферическими ЦТЛ и NК при физиологической
беременности.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IFN продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IFN продуцирующих клеток после 5- часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
При гестозе (рис.2) только 24-часовая стимуляция ФМА и иономицином
приводила к увеличению уровня IFN+ клеток в общей популяции лимфоцитов
(p<0,001), но уже через 5 часовой стимуляции возрастало количество всех типов клеток с цитотоксической активностью, внутриклеточно продуцирующих
IFN (p<0,02; p<0,05 и p<0,05 соответственно), и оставалось высоким после 24
17
часов инкубации.
Выявленная нами способность к более раннему ответу NК клеток в виде
усиления продукции IFN при гестозе в ответ на дополнительное воздействие
может способствовать усилению клинических проявлений гестоза, а так же
приводить к более быстрому срыву компенсаторно-защитных механизмов организма беременной женщины с гестозом и повреждению плода под влиянием
дополнительной антигенной нагрузки на организм беременной женщины с гестозом.
35
*^
30
25
20
%
15
*
10
*
* *
5
0
IFNg
CD8+IFNg
спонтанная продукция
*
CD16+IFNg
инкубация 5 ч
*
CD56+IFNg
инкубация 24 ч
Рис. 2 Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IFN периферическими ЦТЛ и NК при гестозе.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IFNпродуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IFN продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Данные по ответу лимфоцитов с цитотоксической активностью на неспецифическую стимуляцию продукцией IL-2 представлены на рисунке 3.
18
35
*
30
*
25
20
%
15
*
10
*
*
5
*
*^
0
IL-2+
CD8+IL-2+
спонтанная продукция
CD16+IL-2+
инкубация 5 ч
CD56+IL-2+
инкубация 24 ч
Рис.3 Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IL-2 периферическими ЦТЛ и NК при физиологической
беременности.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IL-2 продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IL-2 продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Как видно из рисунка 3., при физиологической беременности после инкубации лимфоцитов с ФМА и иономицином уже через 5 часов наблюдалось значительное увеличение содержания клеток, внутриклеточно продуцирующих IL2 в общей популяцией лимфоцитов (p<0,001), в популяциях CD8+ и CD16+
клеток (p<0,01 и p<0,02 соответственно) по сравнению с исходным уровнем IL2 продуцирующих клеток в периферической крови, и оставалось таким же высоким после 24-часовой инкубации. При физиологической беременности в популяции CD56+ клеток продукция IL-2 усиливалась лишь через 24 часа после
инкубации с ФМА и иономицином по сравнению с исходным уровнем в периферической крови (p<0,001).
При гестозе наблюдались сходные с физиологической беременностью закономерности ответа клеток на стимуляцию за исключением ЦТЛ, которые
медленнее, чем при физиологической беременности, отвечали усилением внут19
риклеточной продукции IL-2 на неспецифическую стимуляцию (рис.4).
35
30
*
*
25
20
%
15
*^
10
*
5
*
*^
0
IL-2+
CD8+IL-2+
спонтанная продукция
CD16+IL-2+
инкубация 5 ч
CD56+IL-2+
инкубация 24 ч
Рис.4. Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IL-2 периферическими ЦТЛ и NК при гестозе.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IL-2 продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IL-2 продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Показатели содержания CD8+IL-2+ и CD56+IL-2+ после 24 часовой инкубации с ФМА и иономицином при гестозе были достоверно выше, чем при 5 часовой инкубации (p<0,05 в обоих случаях).
Стимулированная GranzymeB-продуцирующая способность клеток с цитотоксической активностью при гестозе была не нарушена, имела сходный характер с таковой при физиологической беременности, но, независимо от длительности стимулирующего воздействия, оставалась всегда более высокой, чем
при неосложненной беременности. При физиологической беременности (рис.5)
5 часовая стимуляция ФМА и иономицином достоверно повышала общее количество лимфоцитов, внутриклеточно синтезирующих GranzymeB (p<0,001), а
также увеличивала содержание CD8+GrB+ ЦТЛ и CD16+GrB+ NК (p<0,001,
p<0,02, соответственно) по сравнению с исходным уровнем.
20
40
*^
35
30
*
25
% 20
15
*
*
10
*
*
5
0
GrB+
CD8+GrB+
спонтанная продукция
CD16+GrB+
инкубация 5 ч
CD56+GrB+
инкубация 24 ч
Рис.5. Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции GranzymeB ЦТЛ и NК при физиологической беременности.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания GranzymeB продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания GranzymeB продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Повышение содержания GrB+ клеток в общей популяции лимфоцитов, в
популяциях CD8+ и CD16+ клеток отмечалось и через 24 часа инкубации по
сравнению с исходным уровнем (p<0,001; p<0,001 и p<0,05 соответственно).
При физиологической беременности стимуляция ФМА и иономицином не влияла на содержание CD56+ NК клеток, внутриклеточно продуцирующих
GranzymeB как после 5 ч, так и после 24 ч инкубации клеток (р>0,05 в обоих
случаях).
При гестозе наблюдалась сходная динамика изменений показателей в
процессе стимуляции клеток ФМА и иономицином. (рис.6). В группе с гестозом
после инкубации клеток с ФМА и иономицином увеличивалось общее содержание лимфоцитов, а также ЦТЛ и CD16+ NК клеток, внутриклеточно продуцирующих GranzymeB по сравнению с исходным уровнем и после 5 часовой
стимуляции клеток (p<0,001, p<0,02 и p<0,001 соответственно) и после 24 часо21
вой стимуляции клеток (p<0,001, p<0,01 и p<0,01 соответственно). Стимуляция
ФМА и иономицином не влияла на содержание CD56+ NК, внутриклеточно
продуцирующих GranzymeB, как после 5 часовой, так и после 24 часовой инкубации клеток по сравнению с исходным уровнем до инкубации (р>0,05 в обоих
случаях).
40
35
*
*
30
25
% 20
*
15
*
*
*
10
5
0
GrB+
CD8+GrB+
исходный уровень
CD16+GrB+
инкубация 5 ч
CD56+GrB+
инкубация 24 ч
Рис. 6. Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции GranzymeB периферическими ЦТЛ и NК при гестозе.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания GranzymeB продуцирующих клеток статистически достоверны.
Таким образом, неадекватность иммунного ответа у женщин с гестозом,
по нашим результатам, заключается в усилении цитотоксических реакций со
стороны ЦТЛ и NК клеток под влиянием стимуляции, о чем свидетельствует
выявленное нами повышение уровня цитотоксических лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IFN и GranzymeB.
Клетки осуществляют свою цитотоксическую функцию, в том числе и за
счет индукции апоптоза. О способности индуцировать апоптоз свидетельствует
экспрессия молекул FasL, которая осуществляет запуск Fas-зависимого пути
22
апоптоза [Ярилин А.А., 2000; Nagata, S., 1999]. В литературе имеются данные,
что процесс взаимодействия Fas-FasL сопровождается секрецией провоспалительных цитокинов TFN, IFN и IL-1 [Rescigno, M.et. al., 2000]. Кроме того,
взаимодействие Fas и FasL может способствовать активации нейтрофилов, развитию нейтропении и повреждению сосудистого эндотелия, которые наблюдаются при гестозе [Nagata, S., 1999; Waring, P., 1999].
Данные по изучению апоптоза клеток с цитотоксической активностью
приведены в таблице 4. При гестозе было выявлено повышение уровня лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности FasL молекулу (p<0,01), а также
FasL экспрессирующих клеток в популяции NК с фенотипом CD16+ (p<0,05) и
CD56+ (p<0,05) по сравнению с аналогичными показателями у женщин с нормально протекающей беременностью. Повышение при гестозе уровня периферических CD16+FasL+ и CD56+FasL+ NК может быть обусловлено высокой
концентрацией в крови женщин с гестозом IL-2 [López-Jaramillo, P. et. al.,2008;
Madazli, R. et. al.,2003]. Известно, что IL-2 индуцирует экспрессию Bcl-2 генов
и способствует усилению поверхностной экспрессии FasL [Xiao S. et. al., 1999],
препятствуя развитию апоптоза [Akbar, A.N. et. al., 1996]. Эти результаты также
хорошо согласуются с выявленным нами снижением уровня NК клеток как с
фенотипом CD56+, так и с фенотипом CD16+, экспрессирующих рецепторы к
IFN, который является одним из индукторов апоптоза [Tobias, M. et. al.,2007].
Экспрессия Fas молекул свидетельствует о готовности самих клеток к
вступлению в апоптоз. [Waring, P. et. al., 1999]. Повышение при гестозе уровня
клеток, готовых к апоптозу мы наблюдали только в популяции CD16+ NК
(p<0,01). Учитывая, что в целом при гестозе содержание CD16+ NК было повышено, увеличение количества Fas-позитивных CD16+ NК можно расценивать как естественный процесс элиминации активированных клонов клеток.
Отсутствие накопления CD16+ NК клеток может свидетельствовать о менее
значимой роли данной популяции клеток в патогенезе гестоза.
23
Таблица 4.
Особенности параметров апоптоза у женщин с гестозом
Показатель
ФБ
n=22
CD95+
17,21±1,31
CD16+CD95+
3,73±0,66
CD95L+
18,59±1,40
CD16+CD95L+
5,54±0,68
CD56+CD95L+
5,09±0,54
CD8+AnnexinV17,08±0,54
CD16+AnnexinV+
3,06±0,19
CD16+AnnexinV7,56±0,62
CD56+AnnexinV+
4,32±0,53
CD56+AnnexinV7,04±0,92
*- коэффициент достоверности разности результатов по
Гестоз
n=31
21,95±1,49 **
7,33±1,08***
24,38±1,24 ***
8,24±0,84*
7,68±0,95*
21,88±1,70*
4,69±0,44***
12,49±1,35***
6,33±0,66*
11,10±1,07**
сравнению с показате-
лями у женщин с ФБ (*- p<0,05, ** - p<0,02, *** - p<0,01**** - p<0,001).
С целью определения уровня апоптирующих клеток, мы оценивали параметры аннексинового теста. Как известно, наличие молекул аннексина на поверхности клетки свидетельствует о том, что клетка вступила в апоптоз.
Анализ полученных результатов показал, что при гестозе, наряду с повышением уровня CD16+ и CD56+Аннексин+ NК (p<0,01 и p<0,05 соответственно), наблюдалось увеличение содержания Аннексин-негативных лимфоцитов с
цитотоксической активностью в популяциях ЦТЛ (p<0,05), CD16+ (p<0,01) и
CD56+ NК (p<0,02).
Таким образом, развитие гестоза сопровождается накоплением в периферической крови беременных женщин ЦТЛ, NК и NК-Т клеток, активно продуцирующих IFNγ, IL-2 и GranzymeB, и обладающих повышенной апоптозиндуцирующей способностью, что свидетельствует о высоком уровне их цитотоксической активности. Это может обуславливать непосредственное участие
данных популяций лимфоцитов в развитии синдрома полиорганной и эндотелиальной дисфункции у женщин с гестозом. Отличительной чертой системного материнского иммунного ответа при беременности, осложненной гестозом,
являлось наличие более выраженных изменений со стороны реакций адаптив24
ного иммунитета. Именно в популяции ЦТЛ значительно возрастало число
клеток, внутриклеточно продуцирующих IFNγ, IL-2 и GranzymeB. СD56+ NК
при гестозе, по-видимому, выполняют в большей степени регуляторные функции, однако, именно данная популяция клеток может способствовать развитию
эндотелиальной дисфункции, о чем свидетельствует усиление экспрессии адгезионных молекул. Было отмечено, что при гестозе периферические цитотоксические Т-лимфоциты и NК способны отвечать резким усилением функциональной активности в ответ на дополнительную антигенную нагрузку. Выявленные нами нарушения параметров апоптоза при гестозе свидетельствуют о
накоплении в периферической крови беременных женщин с гестозом клеток,
обладающих высоким цитотоксическим потенциалом, что способствует пролонгированию патологического иммунного ответа.
Выводы
1. В развитии гестоза важную роль играет накопление клеток с цитотоксической активностью с повышенным цитотоксическим потенциалом при
одновременном усилении их апоптоз-индуцирующей способности и
функциональной активности в ответ на неспецифическую стимуляцию.
2. Установлено, что при гестозе в периферической крови повышается содержание клеток с цитотоксической активностью, включая ЦТЛ, ЕК и
ЕК-Т. Для женщин с гестозом характерно высокое содержание CD56+
ЕК, экспрессирующих молекулы CD69 и CD11b.
3. Выявлено, что при гестозе в крови повышается количество CD8+ клеток,
продуцирующих GranzymeB. Стимуляция ФМА и иономицином в равной степени усиливает GranzymeB-продуцирующую способность CD8+ и
CD16+ лимфоцитов как при неосложненной беременности, так и при гестозе, но при гестозе повышение уровня GranzymeB - продуцирующих
клеток более выражено.
4. Установлено, что у женщин с гестозом усиливается спонтанная внутриклеточная продукция IFNγ периферическими цитотоксическими Тлимфоцитами и IL-2 CD8+ и CD56+ клетками, при этом рецепция IFNγ
25
CD16+ и CD56+ ЕК снижена, а рецепция IL-2 CD8+ и CD16+ клетками
повышена по сравнению с показателями неосложненной беременности.
5. Установлено, что
при гестозе неспецифическая стимуляция ФМА и
иономицином уже через 5 часов индуцирует усиленный внутриклеточный
синтез IFNγ всеми типами исследованных клеток с цитотоксической активностью, тогда как при неосложненной беременности повышение IFNγпродуцирующей способности CD16+ NК клеток наблюдается только после 24-часовой стимуляции. Внутриклеточная продукция IL-2 CD8+ лимфоцитами при гестозе в отличие от неосложненной беременности, усиливается только через 24 часа инкубации.
6. При гестозе повышается готовность CD16+ NК клеток к апоптозу, одновременно увеличивается апоптоз-индуцируюшая активность CD16+ и
CD56+ NК клеток, возрастает количество аннексин-негативных клеток с
цитотоксической активностью всех типов, при этом повышение количества клеток, вступивших в апоптоз, отмечается только в популяциях
CD16+ и CD56+ NК.
Практические рекомендации.
- Дополнительно к стандарту иммунологического обследования беременной
женщины с гестозом рекомендуется проводить оценку параметров активации и
апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью.
-Врачам аллергологам-иммунологам рекомендуется определять содержание периферических цитотоксических лимфоцитов, продуцирующих GranzymeB и
использовать результаты в комплексной оценке цитолитического потенциала
иммунной системы женщин с гестозом.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Фенотип лимфоцитов с цитотоксической активностью у беременных
женщин с гестозом и возможности цитокинотерапии [Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю. Сотникова., И.А. Панова, Н.Г. Коряковская // Медицинская
иммунология.- 2005. – Том 7. - № 2-3. – С.310-311.
2. Особенности влияния препарата «Суперлимф» на фенотип лимфоцитов с
цитотоксической активностью in vitro у беременных женщин с гестозом
26
[Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю. Сотникова., И.А. Панова, Н.Г. Коряковская // Russian Journal of Immunology.- 2005.-V. 9, Suppl. 2.- P.242-243.
3. Параметры активации периферических естественных киллеров при гестозе [Текст] / Н.Ю. Сотникова., И.Н. Мамалыга, Н.Г. Коряковская, И.А. Панова, А.В Кудряшова // Russian Journal of Immunology.- 2007.-V. 9,
Suppl.4.- P.100
4. Продукция и рецепция IL-2 и IFNγ естественными киллерами при гестозе
[Текст] / Н.Ю.Сотникова, А.В.Кудряшова, И.Н.Мамалыга., И.А.Панова //
Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских
наук.- 2008.- Приложение 1.- С. 75-79.
5. Параметры активации естественных киллеров при гестозе [Текст] / И.Н.
Мамалыга, Н.Ю.Сотникова, И.А.Панова., А.В.Кудряшова // Материалы
международной научно-практической конференции «Иммунологические
аспекты репродукции человека».- Новосибирск, 2008.- С.27-28.
6. Особенности состояния периферических ЕК при гестозе [Текст] / Н.Ю.
Сотникова., А.В. Кудряшова, И.А. Панова, И.Н. Мамалыга, Л.Ю. Мальгина // Российский иммунологический журнал.- 2008.- Т.2(11).-№2-3.С.291.
7. Влияние препарата «Суперлимф» на параметры активации цитотоксических клеток беременных женщин [Текст] / Н.Ю.Сотникова, И.Н. Мамалыга, А.В.Кудряшова, И.А. Панова // Материалы IV съезда акушеровгинекологов России. - Москва, 2008.- С.241.
8. Нарушение продукции и рецепции IFNγ при гестозе [Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю. Сотникова, А.В. Кудряшова, И.А. Панова // Бюллетень Военно-Медицинской академии.-2009.-Приложение 1(25).-с. 499-500
9. Нарушение регуляции апоптоза лимфоцитов при гестозе [Текст] / А.В.
Кудряшова., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мальгина Л.Ю., Мамалыга
И.Н. // Медицинская иммунология.- 2009.- т.11.-№ 4-5.-с.411
10.Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Лазарева Ю.Ю., Мамалыга И.Н., Панова И.А. Характеристика дифференцировки и функциональной активности цитотоксических Т-лимфоцитов при гестозе // Медицинская иммунология.-2009.-т.11.-№4-5.-с.421
27