МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ПЕРВОГО ПРЕЗИДЕНТА РОССИИ Б. Н. ЕЛЬЦИНА МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА РАСТЕНИЙ Рекомендовано методическим советом УрФУ в качестве учебно-методического пособия для студентов, обучающихся по программе бакалавриата по направлению подготовки 020400 «Биология» Екатеринбург Издательство Уральского университета 2012 УДК 581.198(07) М545 Составители: Г. Г. Борисова, М. Г. Малева, Г. Ф. Некрасова, Н. В. Чукина Ответственный редактор Н. В. Чукина Рецензенты: лаборатория экологической физиологии растений Института биологии Коми НЦ УрО РАН (заведующая лабораторией доктор биологических наук, профессор Т. К. Г о л о в к о); Е. И. JI и Xа ч е в а, кандидат технических наук, доцент кафедры пищевой биотехнологии (Уральский государственный экономический университет) Методы оценки антиоксидантного статуса растений : [учеб.-метод. пособие] / Г. Г. Борисова и др. ; отв. ред. Н. В. Чукина. - Екатеринбург : Изд-во Урал, ун-та, 2012. 72 с. ISBN 978-5-7996-0738-8 В учебно-методическом пособии отражены общие представления об окислительном стрессе у растений и антиоксидантных системах, пред­ ставлены методики определения индикаторов окислительного стресса, низкомолекулярных антиоксидантов, тиолов, активности ферментов ан­ тиоксидантной защиты и содержания белков. Пособие предназначено для студентов биологического факультета разных уровней подготовки (бакалавров, специалистов, магистров) и мо­ жет быть использовано аспирантами. ISBN 978-5-7996-0738-8 © Уральский федеральный университет, 2012 От составителей Окислительный стресс у растений возникает в результате действия различных неблагоприятных факторов внешней среды, которые, как правило, вызывают образование в их клетках повы­ шенного количества активных форм кислорода (АФК), отличаю­ щихся высокой реакционной способностью. Под действием АФК происходит окислительное повреждение жизненно важных систем (например, перекисное окисление липи­ дов - ПОЛ). В ответ на окислительный стресс у растений индуци­ руется антиоксидантная защитная система (АОС). Она представле­ на низкомолекулярными соединениями, антиоксидантными фер­ ментами, а также SH-обогащенными белками, способными ней­ трализовать токсичные радикалы и связать избыток поллютантов. Учебно-методическое пособие состоит из двух разделов. Первый раздел - теоретический. В нем отражены общие представ­ ления об окислительном стрессе у растений и их антиоксидантных системах, приведен перечень вопросов для самопроверки знаний и указана рекомендуемая литература. Второй раздел представляет собой лабораторный практикум. Здесь показаны методы опреде­ ления индикаторов повреждения систем клеток, некоторых АФК, компонентов АОС (низкомолекулярных антиоксидантов, тиолов и ферментов антиоксидантной защиты), а также содержания бел­ ков как вспомогательного показателя, необходимого для расчета удельной активности ферментов. Описанные методики апробиро­ ваны в многочисленных опытах и могут быть успешно использо­ ваны при изучении антиоксидантного статуса растений. Данное учебно-методическое пособие предназначено для студентов-биологов разных уровней подготовки. Оно может исполь­ зоваться бакалаврами (направление 020400) при проведении специ­ ального практикума по физиологии и биохимии растений; студентами-магистрантами при выполнении блока лабораторно-прак­ тических занятий в рамках специальных курсов («Физиология стресса», «Энзимология» и др.) в соответствии с магистерской программой «Физиология и биохимия растений», а также аспиран­ тами при проведении экспериментальных исследований. Раздел 1 ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЙ Оксигенный фотосинтез и аэробное дыхание - два важней­ ших процесса, обеспечивающих энергией клетки подавляющего числа живых организмов. Эти процессы связаны с окислительно­ восстановительными превращениями молекулярного кислорода. Участие кислорода в метаболизме возможно благодаря тому, что его молекула относительно стабильна и спонтанно не реагирует с биологическими молекулами. Однако все аэробные организмы подвергаются постоянной опасности, связанной с образованием в клетках АФК. Под этим термином подразумевают формы ки­ слорода с чрезвы чайно вы сокой реакционной способностью, которые могут окислять практически все классы биологических молекул: белки, липиды мембран, ДНК и т. д. М олекулярный кислород в обычном состоянии представляет собой триплет (имеет два неспаренных электрона с параллельны­ ми спинами, которые локализованы на различных орбиталях). Большинство органических молекул синглетны, их электроны обладаю т антипараллельными спинами. Вследствие различий в направлении спинов электронов взаимодействие органических молекул с молекулой кислорода протекает достаточно медленно. Однако в клетке высока вероятность образования АФК, которые представляют собой как свободнорадикальные частицы, так и ней­ тральные молекулы. Свободный радикал представляет собой час­ тицу, имеющую неспаренный электрон на внешней электронной орбитали. Такую частицу обозначаю т специальным символом: \ Важным свойством свободного радикала является его высокая х им ическая активность и то, что он не мож ет исчезнуть, пока не прореагирует с другим свободным радикалом (в реакции дисмутации). К АФК относят синглетный кислород (]0 2), супероксид анион радикал (02*"), гидропероксидный радикал (Н02*), пероксид водо­ рода (Н2 0 2), гидроксильный радикал (НО*), в некоторых случаях озон (Оз). АФК постоянно образуются в растительных и живот­ ных клетках в реакциях и процессах, в которых участвует моле­ кулярный кислород. В нормально функционирующих клетках со­ держание АФК поддерживается на низком уровне, так как специ­ альные ферментные системы постоянно заняты их ликвидацией. В норме концентрации АФК в клетках невысоки: концентрация 0 2*~ составляет порядка КГ 11 М, Н2 0 2 - IO" 8 М, НО* - меньше КГ11 М. Однако в стрессовых условиях содержание АФК в клет­ ках начинает быстро увеличиваться и развивается окислительный стресс. Окислительный стресс в растениях возникает в результате действия практически всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая засуху, почвенное засоление, низкие и высокие температуры, ультрафиолетовое излучение, недостаток элементов минерального питания, патогенные организмы различной приро­ ды, загрязнение ксенобиотиками и т. д. Формирование АФК происходит при неполном восстановле­ нии молекулярного кислорода до воды одним, двумя и тремя электронами. В результате захвата молекулой одного электрона образуется супероксидный радикал (0 2^) или его протонированная форма - гидропероксидный радикал (Н02*) при слабокислых значениях pH. Образование пероксида водорода (Н2 0 2) происходит в ре­ зультате присоединения одного электрона и двух протонов к супероксидному радикалу, а также в результате взаимодействия (дисмутации) двух молекул супероксида: 2 0 Г + 2Н+ -> Н2 0 2 + 0 2 Пероксид водорода относится к окислителям средней силы. Благодаря относительно продолжительному времени жизни и растворимости в липидном бислое, пероксид может легко диф­ фундировать через мембраны (через акваиорины). При дальней­ шем одноэлектронном восстановлении возможно появление гид­ роксильного радикала (НО*) - очень сильного окислителя. Этот радикал не способен к внутриклеточной миграции, так как мо­ ментально вступает в реакцию с биологическими молекулами. Гидроксильный радикал не только инициирует разрушение мем­ бран и деградацию белков, взаимодействуя с остатками многих аминокислот, но и разрушает углеводные мостики между нуклео­ тидами, разрывая цепи ДНК и РНК. Полагают, что такие процес­ сы могут быть факторами природного мутагенеза. Гидроксиль­ ный радикал является наиболее опасным еще и потому, что в рас­ тительных клетках нет ферментных систем, осуществляющих его нейтрализацию. Такие металлы, как Cu, Fe, Mn, Со, обладающие переменной валентностью, могут непосредственно участвовать в образовании высокотоксичных гидроксильных радикалов в реакциях Фентона (а) и Хабера - Вейса (а, б, в): Ме(п_1)+ + Н2 0 2 —►Ме"++ НО” + НО" (а) Сунероксид обеспечивает восстановление металла: 0 2- + Меп+-> Ме(п"1)++ 0 2 (б) Суммарная реакция (цикл Хабера - Вейса) - это катализи­ руемое металлом восстановление пероксидов посредством супер­ оксида: 0 2- + Н2 0 2 -> 0 2 + НО“ + НО* (в) К АФК относится также синглетный кислород (*02). Основ­ ной путь его образования обусловлен световыми реакциями, ко­ торые опосредованы пигментами-фотосенсибилизаторами (глав­ ным образом, хлорофиллом). Поглощая квант света, этот пигмент переходит в синглетное или триплетное возбужденное состояние. Молекулы пигмента в обоих возбужденных состояниях, сталки­ ваясь с молекулярным кислородом, передают на него свою энер­ гию, в результате чего и образуется химически очень активный синглетный молекулярный кислород. Основное значение в его генерации имеют триплетные состояния пигментов, которые об­ ладают более значительным временем жизни. Кроме того, возмо­ жен и другой механизм фотодинамического действия - образова­ ние свободных радикалов при диссоциации комплекса триплет- ной молекулы пигмента, кислорода и субстрата. Синглетный ки­ слород может быстро реагировать с большинством органических молекул (/?Н). Эффективным генератором синглетного кислорода является важнейший пигмент фотосинтеза - хлорофилл, и в клетках расте­ ний всегда имеется опасность того, что этот пигмент проявит свое повреждающее действие. В генерации АФК значительную роль играет озон, образую­ щийся в результате фотодиссоциации молекулярного кислорода под влиянием солнечной энергии. Озон так же, как и пероксид водорода и синглетный кислород, не является радикалом, однако, обладая высокой реакционной способностью, может продуциро­ вать кислородные радикалы. В последнее десятилетие вследствие интенсивного развития промышленности наметилась стабильная тенденция к росту концентрации озона в тропосфере, что проис­ ходит за счет накопления в воздухе продуктов сгорания нефти, газа и угля. Образование озона усиливается за счет интенсифика­ ции УФ-радиации. Это связано с действием радикалов хлора и брома, которые возникают при облучении промышленных фреонов, аэрозолей и растворителей. При взаимодействии озона с 0 2 возникает супероксид-анион: Оз + 0 2 — ►2 0 2 + 0 2 и затем пероксид водорода, синглетный кислород и гидроксиль­ ный радикал. Накапливающийся озон повреждает растения. Отрицательное действие озона проявляется в снижении скорости фотосинтеза, повреждении листьев, подавлении роста корней и побегов, уско­ рении старения и снижении урожая. Образование АФК в разных компартментах клетки Образование АФК происходит во всех частях растительной клетки. Это связано как с неферментативными (например, окис­ лительно-восстановительными реакциями фенолов, хинонов, флавинов, автоокислением тем- и SH-содержащих соединений), так и с ферментативными процессами. Значительный вклад в об­ разование АФК вносит также функционирование цепей переноса электронов в мембранных структурах клетки. Образование АФК в хлоропластах В фотосинтезирующих клетках хлоропласты являются далеко не единственными продуцентами АФК, но, по сложившемуся мнению, самыми мощными. В них постоянно образуются синглетный кислород, супероксид-радикал и в дальнейшем пероксид водорода, что неразрывно связано с процессами фотосинтеза, протекающими в тилакоидной мембране. Обычный молекулярный кислород является сильным окисли­ телем, но не с высокой реакционной способностью. Это объясня­ ется электронной конфигурацией молекулы: основная форма ки­ слорода находится в триплетном состоянии - валентные электро­ ны имеют параллельные спины. Но кислород может с обращени­ ем спина перейти в возбужденное синглетное состояние и стать реакционно-способным и поэтому опасным синглетным кислоро­ дом С02)- В хлоропласте образование синглетного кислорода происходит в результате контакта 0 2 с хлорофиллом, который поглотил свет и оказался в возбужденном триплетном состоянии. Поскольку время жизни хлорофилла относительно большое, он «успевает» передать избыток энергии на 0 2, в результате чего об­ разуется J0 2. Кроме того, при большом потоке фотонов образова­ ние синглетного кислорода возможно в реакционном центре фо­ тосистемы П. Синглетный кислород способен окислять белки фотосинтетического аппарата, молекулы хлорофилла, липиды тилакоидных мембран. Поэтому крайне необходимо либо его постоянно «уби­ рать», либо препятствовать его образованию. И то и другое обес­ печивают каротиноиды, которые присутствуют в составе антен­ ных комплексов и реакционных центров. В хлоропластах супероксидный радикал возникает как в фо­ тосистеме I (при участии ферредоксина), так и в фотосистеме II (в процессе фотоокисления воды), а также при функционирова­ нии РБФ-карбоксилазы как оксигеназы. Оксигеназная реакция включает образование супероксид-аниона, который затем исполь­ зуется при оксигеназном распаде РБФ на 3-ФГК и 2Ф-гликолевую кислоту. В хлоропластах действуют разные системы ликвидации АФК, тем не менее они в состоянии обеспечить только относительную стабильность уровня АФК. Образование АФК в митохондриях В митохондриях образование супероксид-радикала, а затем и пероксида водорода сопряжено с функционированием дыхатель­ ной электрон-транспортной цепи во внутренней митохондриаль­ ной мембране. Восстановление кислорода до воды происходит с достаточно большой скоростью, при этом, однако, может осуществляться спонтанное одноэлектронное восстановление кислорода с образо­ ванием супероксида на комплексах I, II и III дыхательной цепи. Сайты, где возможен перехват электронов кислородом и образо­ вание супероксида, точно не установлены, но ими могут быть многие центры, содержащие железосерные кластеры, гемы и свя­ занные хиноны. Механизм повреждений связан, например, с тем, что Н2 0 2 взаимодействует с Fe2+ в составе железосерных кластеров. При этом из состава комплексов высвобождаются ионы железа, кото­ рые инициируют реакции Фентона. Гидроксильный радикал, об­ разующийся в этих реакциях, является еще более сильным окис­ лителем. Повреждению под действием АФК подвергаются многие ферменты, функционирующие в матриксе митохондрий. Среди них аконитат-гидратаза, фермент цикла трикарбоновых кислот, который напрямую инактивируется супероксид-радикалом. Окис­ лительному повреждению подвергаются и некоторые субъедини­ цы в составе глициндекарбоксилазного и пируватдегидрогеназного комплексов, а также единицы АТФ-синтазы. В матриксе мито­ хондрий обнаружены специфические протеазы, с помощью кото­ рых окончательно разрушаются белки, поврежденные АФК. Кро­ ме того, мишенями для АФК являются митохондриальные мем­ браны и митохондриальная ДНК. Образование АФК в других клеточных компартментах Реакции, которые протекают в пероксисомах, изучены не так хорошо, как реакции, происходящие в хлоропластах и митохонд­ риях. Для пероксисом характерна метаболическая пластичность, так как их метаболизм во многом определяется типом клетки, в которой они находятся. Но во всех пероксисомах образуется и в той или иной мере накапливается пероксид водорода, синтез которого может быть связан с разными процессами. Оксигеназная функция РБФ-карбоксилазы в хлоропластах приводит к образова­ нию гликолата, который транспортируется в пероксисомы и окис­ ляется гликолатоксидазой до глиоксилата с образованием Н2 О2 . Разновидностью пероксисом являются глиоксисомы, присут­ ствующие в запасающих тканях прорастающих семян масличных растений. В этих тканях происходит распад запасных жиров и про­ цесс ß-окисления жирных кислот, необходимый для конверсии жиров и углеводов. Помимо этих процессов, в пероксисомах воз­ можны и другие реакции, в которых образуются АФК, хотя и не столь активно. Пероксисомы, как и хлоропласта, и митохондрии, продуцируют супероксид-радикал в ходе нормального метабо­ лизма. Например, пероксисомы вовлечены в метаболизм ксанти­ на, метаболита, образующегося при распаде нуклеиновых кислот. Показано, что в матриксе пероксисом из листьев гороха образо­ вание супероксид-радикала происходит при окислении ксантина ферментом ксантиноксидазой. Образованный Ог~ трансформиру­ ется в Н2 О2 , так как в пероксисомах присутствует супероксиддисмутаза, а за ликвидацию пероксида водорода отвечают каталаза и аскорбатпероксидаза. Образование АФК в пероксисомах наиболее быстро должно отражаться на редокс-статусе цитозоля. Мембраны пероксисом содержат аквапорины, через которые пероксид, образованный в пероксисомах, способен диффундировать в цитозоль. Наиболее важной особенностью пероксисом является то, что они могут продуцировать супероксид-радикал непосредственно в цитозоль. В цитозоле образование АФК может быть связано с протека­ нием некоторых биохимических реакций, например, катализи­ руемых флавиновыми оксидазами. Образованием пероксидов со­ провождается окисление аминокислот при участии соответст­ вующей оксидазы: ä-NH 2 + 0 2 + Н20 -*• R=0 + NH 3 + Н2 0 2 Образование супероксид-радикала связано с работой ком­ плекса цитохром Р4 5 о-зависимой монооксигеназы, локализован­ ной в эндоплазматической сети, ядерной мембране и других час­ тях клетки. Его функции связаны с деградацией выводимых из метаболизма соединений и детоксикацией органических ксено­ биотиков. Монооксигеназная система осуществляет первичную модификацию разнообразных сложных молекул, включая в их струкіуру атом кислорода. В ходе этой достаточно сложной и мно­ гоступенчатой реакции часть электронов может уходить не по на­ значению, а перехватываться кислородом с образованием супер­ оксид-радикала. Такая особенность действия ферментного ком­ плекса способствует накоплению в клетке АФК в том случае, если растение вынуждено поглощать и нейтрализовать чужерод­ ные органические вещества. Повреждение биомолекул активными формами кислорода Активные радикалы, главным образом НО*, взаимодействуя с органическими веществами, образуют гидропероксиды ДНК, бел­ ков, липидов (ЖЮН). Изменения макромолекул под действием АФК называются окислительными модификациями макромоле­ кул. Органические гидропероксиды ЖЮН по своей структуре подобны Н2 0 2 и характеризуются высокой реакционной способ­ ностью. При последующих превращениях они переходят в спир­ ты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные органические со­ единения. АФК приводят к перекисному окислению липидов, вы­ зывая в остатках полиненасыщенных жирных кислот цепные ре­ акции с образованием липидных радикалов £’, пероксилов £ 0 0 *, гидропероксидов £ООН и алкоксилов £0*. Первые три превращения представляют собой начало и ход цепной реакции (инициация). В ходе третьего превращения наряду и с липидным радикалом образуется гидропероксид. Последний, взаимодействуя с ионами металлов переменной валентности, на­ ходящихся в восстановленной форме, например с Fe2+ или Си+, создают разветвления цепи. Продукты расщепления, несущие двойную связь, под действием радикалов подвергаются дальней­ шему перекисному окислению и распаду. В результате жирные кислоты образуют целый ряд соединений. Многие из них пред­ ставляют собой альдегиды, которые обладают высокой биологи­ ческой активностью и часто высокотоксичны. При распаде жирных кислот, сопровождающем ПОЛ, сначала образуются диеновые конъюгаты, а затем такие метаболиты, как малоновый диальдегид. Продуктами ПОЛ могут быть и более простые соединения, например такие, как пентан и этан. ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны, что в свою очередь приводит к нарушениям функций мембранных белков и внутриклеточной компартментации веществ. Продукты окислительной модификации липидов вызывают мутации и блокируют клеточное деление. Прежде ПОЛ считали исключительно спонтанным процес­ сом, протекающим без участия ферментов. Затем было показано, что важную роль в ПОЛ играют и ферментативные реакции, в частности, реакции, катализируемые липоксигеназами. Актива­ ция этого фермента наблюдается при стрессах, связанных с по­ вреждением растений, при нападении насекомых или травоядных животных. Окисление липидов с помощью этих ферментов приводит к образованию специфических веществ - эйкозаноидов, выпол­ няющих функцию сигнальных молекул при экспрессии генов. Таким образом, в результате перекисного окисления липидов мембран возникает каскад свободнорадикальных реакций с обра­ зованием разнообразных спиртов, эфиров, альдегидов. Среди дан­ ных соединений могут быть и токсичные. Например, 4-гидрокси2 -гексанал и малоновый диальдегид оказывают токсическое дей­ ствие в клетках растений, модифицируя структуру белков и ДНК. АФК вызывают окислительную модификацию нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. Наиболее заметное дейст­ вие оказывает гидроксильный радикал, который модифицирует все четыре основания в молекуле ДНК, образуя множество про­ изводных форм. Под действием АФК нуклеотиды подвергаются перекисному окислению. Дальнейшее превращение образовав­ шихся перекисей приводит к гидропроизводным типа /ЮН или /?(ОН)г, главным из которых является 8 -гидроксигуанин. Белки так же, как липиды и нуклеиновые кислоты, повреж­ даются АФК. При действии АФК происходит окисление амино­ кислот с образованием пероксильных радикалов. Из пероксильных радикалов образуются гидропероксиды и алкоксильные ра­ дикалы. Последние обладают высокой реакционной способно­ стью и сами могут индуцировать образование высокореактивных соединений радикальной природы. Гидропероксиды также гене­ рируют новые радикалы, если имеются ионы металлов с пере­ менной валентностью. АФК-индуцированные окислительные мо­ дификации аминокислот приводят к нарушению третичной струюуры белков, их денатурации и агрегации с сопутствующей потерей функциональной активности. Сигнальная роль АФК Довольно долго АФК рассматривали как неизбежное зло, возникавшее при переходе организмов к аэробному образу жизни. Однако оказалось, что роль этих опасных молекул двойственная. Клетки растений (и животных) воспринимают и используют АФК в качестве сигнальных молекул, вторичных мессенджеров, кото­ рые помогают им анализировать внешние воздействия и внутрен­ ние сигналы. В некоторых случаях растительная клетка специально начинает продуцировать АФК, чтобы с их помощью включать те или иные процессы. Условия среды часто становятся для растений стрессовыми, тогда нарушается нормальный метаболизм, подавляется рост, из­ меняются процессы развития, а в экстремальных случаях насту­ пает гибель организма. Однако растения могут адаптироваться к неблагоприятной обстановке. Восприятие клеткой внешнего сиг­ нала о «неблагополучии» запускает сигнальные системы, ведущие к экспрессии генов, продукты которых необходимы для репара­ ции повреждений, восстановления гомеостаза и акюшмации к но­ вым условиям. Известно, что АФК в сигнальных системах играют большую роль при стрессе. Роль пероксида водорода как вторич­ ного мессенджера была подтверждена во многих случаях, связан­ ных с экспрессией генов, контролирующих синтез ферментовантиоксидантов, а также синтез аскорбата и глутатиона. АФК участвуют в процессе старения листьев и цветков, свя­ занном с активной программой клеточной смерти - апоптозом. Эта программа направлена на избирательное разрушение клеток. Программируемая клеточная смерть зависит от активации фер­ ментов, избирательно разрушающих клеточные структуры и бел­ ки. АФК участвуют в регуляции апоптоза, так как влияют на его развитие и протекание. Повышение уровня АФК наблюдается во многих случаях гибели клеток, когда она явно детерминирована, например при старении. Общие представления о системе антиоксидантной защиты Повреждающему эффекту свободных радикалов и активных форм кислорода противостоит система антиоксидантной защиты, главным действующим звеном которой являются антиоксиданты соединения, способные тормозить, уменьшать интенсивность свободнорадикального окисления, нейтрализовать свободные ра­ дикалы путем обмена своего атома водорода на кислород свобод­ ных радикалов. В выведении свободных радикалов и радикаль­ ных форм антиоксидантов главную роль играют системы естест­ венной детоксикации. Защита от повреждающего действия АФК осуществляется на всех уровнях организации: от клеточных мем­ бран до организма в целом. Антиоксидантная система тканей представлена: 1 ) ферментными антиоксидантами: каталазой, пероксидазами, супероксиддисмутазой, глутатионредуктазой; 2 ) низкомолекулярными компонентами: аскорбиновой кисло­ той, низкомолекулярными SH-соединениями, флавоноидами, ви­ таминами А, Е, К, убихиноном; 3) макромолекулярными неферментативными компонентами: белком-переносчиком железа - трансферрином и др. По механизму действия антиоксиданты можно разделить: 1 ) на «мусорщиков», которые очищают организм от всех сво­ бодных радикалов, чаще всего восстанавливая их до стабильных неактивных продуктов; 2 ) «ловушки» - антиоксиданты, которые имеют сродство к какому-то определенному свободнорадикальному продукту («ло­ вушки» синглетного кислорода, гидроксил-радикала и т. д.). Их часто используют для уточнения механизма свободнорадикаль­ ной реакции; 3) антиоксиданты, обрывающие цепи, - вещества, молекулы которых более реакционноспособны, чем их радикалы. Чаще все­ го это фенолы, которые легко отдают свои электроны, превращая радикал, с которым они прореагировали, в молекулярный про­ дукт. Сами они при этом превращаются в слабый феноксилрадикал, который уже не способен участвовать в цепной реакции. Таким образом, к настоящему времени достаточно хорошо известно защитное действие низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы растений. Однако механизмы их за­ щитного действия выяснены недостаточно. Образование АФК и последующие оксидативные изменения органических веществ представляют собой неспецифические ре­ акции. У растений, устойчивых к различным воздействиям, про­ цессы генерации АФК обычно заторможены, что во многом опре­ деляется активным функционированием у них систем детоксика­ ции. Возможно, именно с этим связана в значительной мере и большая стойкость мембран растений, устойчивых к стрессорам. Вопросы для самоконтроля 1. Какие основные типы АФК вы знаете? Укажите их основ­ ное биологическое значение. 2. Что такое «окислительный стресс»? 3. Какие механизмы образования АФК в клетках растений вы знаете? 4. Какова роль озона в генерации АФК? 5. Как влияют АФК на биомолекулы в растительных клетках? 6 . Что является причиной возникновения в клетке перекисного окисления липидов? 7. Каким образом АФК участвуют в передаче сигналов в рас­ тительных клетках растений? 8 . Какие вещества называют антиоксидантами? На какие группы по механизму действия можно разделить антиоксиданты? 9. В чем заключается сущность каталитического действия каталазы? Почему этот фермент относят к компонентам антиоксидантной защиты? 10. Какие ферменты относят к группе пероксидаз? Укажите черты сходства и различия между этими ферментами. 11. В чем заключается принципиальное различие в механиз­ мах действия каталазы и пероксидаз? Укажите черты сходства между этими ферментами. 12. В чем заключается сущность каталитического действия супероксиддисмутазы? Почему этот фермент относят к фермен­ там антиоксидантной защиты? 13. Какая связь существует между функционированием су­ пероксиддисмутазы и такими ферментами, как каталаза и пероксидазы? 14. Ионы каких металлов входят в активный центр суперок­ сиддисмутазы, которая обнаружена у растений? 15. В каких клеточных компартментах у растений локализо­ вана супероксиддисмутаза? 16. В чем заключается сущность каталитического действия глутатионредуктазы? В каких компартментах клетки у растений локализован этот фермент? 17. Укажите названия основных представителей низкомоле­ кулярных компонентов антиоксидантной системы растений. 18. Сопоставьте вещества, являющиеся низкомолекулярными антиоксидантами у растений и животных. Какие из них свойст­ венны только растениям? 19. В чем заключается сущность антиоксидантного действия аскорбиновой кислоты и глутатиона? 20. Какие функции выполняет пролин? 21. Какую химическую природу имеют каротиноиды? В чем заключается сущность их антиоксидантного действия? 22. Что представляют собой по химической природе флавоноиды? Какие функции они выполняют? 23. На какие группы можно разделить низкомолекулярные антиоксиданты растений по механизму их действия? 24. Какие низкомолекулярные антиоксиданты растений мож­ но отнести к водорастворимым компонентам, а какие - к жирора­ створимым? Список рекомендуемой литературы Владимиров Ю. А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю. А. Владимиров // Соросов, образоват. журн. 2000. Т. 6 , № 12. С. 13-19. Зыкова В. В. Участие активных форм кислорода в реакции митохон­ дрий растений на низкотемпературный стресс / В. В. Зыкова, А. В. Ко­ лесниченко, В. К. Войников // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 2. C. 302-310. Кузнецов В. В. Физиология растений : учебник для вузов / В. В. Куз­ нецов, Г. А. Дмитриева. М .: Высш. шк., 2005. С. 615-713. Кулинский В. И. Активные формы кислорода и оксидативная моди­ фикация макромолекул: польза, вред и защита / В. И. Кулинский // Со­ росов. образоват. журн. 1999. № 1. С. 2-7. Мерзляк М. Н. Активированный кислород и жизнедеятельность рас­ тений / М. Н. Мерзляк // Соросов, образоват. журн. 1999. № 9. С. 20-26. Полесская О. Г. Растительная клетка и активные формы кислорода : учеб. пособие / О. Г. Полесская. М. : Изд-во «Книжный дом Универси­ тет», 2007. Рубин Б. А. Физиология и биохимия дыхания растений / Б. А. Ру­ бин, М. Е. Ладыгина. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1974. Физиология растений : учебник для студентов вузов / под ред. И. И. Ермакова. М : Изд. центр «Академия», 2005. Чиркова Т, В. Физиологические основы устойчивости растений / Т. В. Чиркова. С П б.: Изд-во С.-Петербург, ун-та, 2002. Bhattacharjee 5. Reactive oxygen species and oxidative burst: Roles in stress, senescence and signal transduction in plants / S. Bhattacharjee // Cur­ rent Sei. 2005. Vol. 89, Nr 7. P. 1113-1121. Vranova E. Signal transduction during oxidative stress / E. Vranova, D. Inze, F. van Breusegem // J. of Exper. Bot. Vol. 53, Nr 372. P. 1227-1236. Willekens H. Catalases in plants / H. Willekens, D. Inze, M. van Mon­ tagu, M. van Camp // Molecular Breeding. 1995. Vol. 1. P. 207-228. Раздел 2 ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ (ПОЛ) Активные радикалы, главным образом НО', взаимодействуя с органическими веществами, образуют гидропероксиды ДНК, бел­ ков, липидов (ЖЮН). Гидропероксиды так же, как и пероксиды, химически активны и в ходе метаболизма переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. В липи­ дах, в основном в полиненасыщенных жирных кислотах, АФК вызывают цепные реакции с накоплением липидных (£’), пероксильных (£00*), алкоксильных (£0*) и других радикалов. Участие тяжелых металлов с переменной валентностью, таких как медь, железо, кобальт и др., приводит к разветвлению этой цепи. Перекисное окисление липидов является индикаторной реак­ цией повреждения клеточных мембран. В результате ПОЛ обра­ зуются конечные метаболиты (малоновый диальдегид, этан, пентан и др.), реагирующие с тиобарбтуровой кислотой (ТБК-реагирующие продукты). Существует несколько методов определения перекисного окисления липидов. Здесь приведены два наиболее доступных метода [13, 2 0 ]. Метод 1 Реактивы и оборудование Приготовление буферного раствора Для работы необходимо приготовить 0,1 М фосфатный буфер pH 7,4. Этот буфер может понадобиться для работы с антиоксидантными ферментами, поэтому ниже приведена табл. 1 , по кото­ рой можно быстро приготовить буфер с заданным значением pH. Составляющие буфера обычно готовят заранее и хранят при тем­ пературе 6 °С в течение одного месяца. Для буфера необходимы двухзамещенный фосфат натрия Na2 HP04( 12Н2 0 ) - М 358 либо Na2 HPC>4 (2 H2 0 ) - М 178 и однозамещенный фосфат натрия NaH2 P0 4 (H2 0 ) - М 138 либо NaH2 P 0 4 (2H2 0 ) - М 156. Таблица 1 Фосфатный буфер 0,1 М pH 6,4-8,0 pH Na2HP04 (0,2 М), мл NaH2P0 4 (0,2 М), мл Вода, мл 6,4 26,5 73,0 До 200 6,6 37,5 62,0 То же 6 ,8 49,0 51,0 » 7,0 61,0 39,0 » 7,2 72,0 28,0 7,4 81,0 19,0 » » 7,6 87,0 13,0 » 7,8 91,5 8,5 » 8,0 94,7 5,3 » Перед использованием буферного раствора значение pH про­ веряют и, если необходимо, корректируют. Приготовление реактивов На дистиллированной воде готовят: а) ортофосфорную кислоту (М 82) - 1 м л н а 100м л (1 %-й р-р); б) FeS0 4 (М 152) - 28 мг сульфата железа на 10 мл. На 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4 готовят: в) тиобарбитуровую кислоту (ТБК; М 144) - 0,6 г на 100 мл (0,6 %-й р-р). Для более быстрого растворения ТБК раствор луч­ ше нагреть на водяной бане (70-80 °С); г) н-бутанол. Все растворы готовят перед проведением реакции. Оборудование 1. Пластиковые термостойкие пробирки с крышками (Falcon) объемом 15 мл или стеклянные пробирки с притертыми крышками. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Центрифуга. 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8 . Водяная баня. 9. Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 10. Спектрофотометр. Ход работы Выделение продуктов перекисного окисления липидов Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают в ступке с небольшим количеством (1,5-2 мл) 0,1 М фосфатного буфера pH 7,4 и с добавлением стеклянного песка. Конечный объем буфера составляет 5 мл. Гомогенат фильтруют через ка­ проновую ткань, фильтрат используют для определения интен­ сивности процессов ПОЛ. Реакцию проводят в пластиковых или стеклянных пробирках. Реакционная смесь состоит из 3 мл раствора ортофосфорной ки­ слоты, 1 мл раствора ТБК, 0,1 мл раствора FeS0 4 и 0,3 мл фильт­ рата. Опытные пробирки плотно закрывают крышками и поме­ щают на водяную баню, нагретую до 95-100 °С на 1 ч. Затем быстро охлаждают в сосуде с холодной водой (10 °С). После охлаж­ дения к каждой пробе приливают 4 мл н-бутанола, встряхивают и центрифугируют 10 мин при 10 000 g. После центрифугирования верхний слой бутанола с окрашенным экстрактом осторожно снимают пипеткой и переносят в чистые, сухие пробирки. Оптическую плотность бутанольного экстракта измеряют против «-бутанола при Д5 3 2 и Дбоо- Содержание ТБК-реагирующих продуктов рассчитывают по формуле ТБКРП = (Д532 - Д600)/(155 • 0,3 0,1), где ТБКРП - ТБК-реагирующие продукты, мМ/г сырого веса; 155 - коэффициент экстинции тиобарбитуровой кислоты (ТБК), мМ- 1см_1; 0,3 - объем фильтрата, внесенного в реакционную смесь, мл; . 1 . - содержание сырой массы листьев, эквивалентное 1 мл фильтрата, г. 0 Ме т о д 2 Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Реакционную среду готовят на дистиллированной воде непо­ средственно перед каждым опытом. Одна проба реакционной среды (4 мл) содержит: а) трихлоруксусную кислоту (ТХУ; М 163) - 0,4 г (10 %-й р-р); б) тиобарбитуровую кислоту (ТБК; М 144) -1 0 мг (0,25 %-й р-р). Оборудование 1. Пластиковые термостойкие пробирки с крышками (Falcon) объемом 15 мл или стеклянные пробирки с притертыми крышками. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Водяная баня. 6 . Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 7. Спектрофотометр. Ход работы Выделение продуктов перекисного окисления липидов Растительный материал (0,3 г сырых листьев) растирают в ступке с небольшим количеством реакционной среды (около 1 мл), состоящей из раствора тиобарбитуровой кислоты и трихлоруксусной кислоты. Для лучшей гомогенизации добавляют стеклян­ ный песок. Гомогенат переносят в пробирку, обмывая ступку не­ большими порциями реакционной среды (по 0,5 мл). Конечный объем использованной реакционной среды составляет 4 мл. Гомо­ генат хорошо перемешивают, пробирки плотно закрывают и по­ мещают в нагретую до 95-100 °С водяную баню на 30 мин. Затем пробы резко охлаждают, помещая в сосуд с холодной (около 10 °С) водой. Содержимое проб центрифугируют 10 мин при 10 000 g. Оптическую плотность супернатанта измеряют на спектрофото­ метре при Дяг и Дбоо против реакционной среды. Содержание ТБК-реагирующих продуктов рассчитывают по формуле ТБКРП = (Д532 - Д600)/(155 • 0,3), где ТБКРП - ТБК-реагирующие продукты, мМ/г сырого веса; 155 - коэффициент экстинции ТБК, m N T ' c m "1; 0,3 - навеска растительного материала, г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОНА Супероксидный радикал является наиболее опасной формой АФК, особенно для мембранных струкіур. В отличие от молеку­ лярного кислорода, для передвижения которого мембраны не пред­ ставляют преграды, супероксидный анион, обладая зарядом, окру­ жен молекулами воды, что не позволяет ему преодолеть гидрофоб­ ный мембранный барьер. Кроме того, он имеет большое время жизни и становится источником образования других АФК. За ос­ нову при определении супероксидного радикала принята методи­ ка, описанная в [9]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Na-фосфатный буфер (0,1 М, pH 7,2). Для его приготовления берут 1,56 г NaH2 P0 4 (2 H2 0 ) (М 156) и разбавляют в 80 мл H2 0 OTCr. Титруют 1 М NaOH (4 г на 100 мл воды) до pH 7,2 и доводят дис­ тиллированной водой до объема 1 0 0 мл. Среду выделения готовят на 0,1 М Na-фосфатном буфере pH 7,2. На 50 мл буфера: - диэтилдитиокарбамат натрия (М 171) -1 7 мг (2 мМ). Следующие реактивы готовят отдельно, непосредственно перед каждым опытом. На 30 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера (pH 7,2): - 50 мг нитросинего тетразолия (М 817,6); - 30 мг диэтилдитиокарбамата натрия (М 171). Оборудование 1. Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 2. Пипетки (дозаторы). 3. Секундомер (таймер). 4. Центрифуга (рефрижераторная). 5. Стеклянный песок для гомогенизации проб. 6 . Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 7. Спектрофотометр. Ход работы Выделение супероксидного радикала Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством среды выделения с до­ бавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центрифуж­ ную пробирку, обмывая ступку несколько раз небольшим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем пробы составляет 3 мл. Цен­ трифугируют в течение 10 мин (10 ООО g при 4 °С). Супернатант сливают в пробирку, помещенную в стакан со льдом. Определение супероксидного радикала Реакцию проводят в кюветах для спектрофотометра при ком­ натной температуре. В кювету приливают 1 мл раствора нитросинего тетразолия, 1 мл раствора диэтилдитиокарбамата натрия и до­ бавляют 0,3-0,5 мл супернатанта. Смесь быстро встряхивают и измеряют оптическую плотность при длине волны 540 нм каждые 10 с в течение 2-3 мин. Отмечают изменение абсорбции за единицу времени на ли­ нейном участке кривой, т. е. А = ДД540It- Образование супероксиданиона (в относительных единицах на грамм сырого веса в мину­ ту) рассчитывают по формуле: СА = А- Ѵі/(Ѵ2 -т), где СА - содержание супероксид-аниона, у. е. / г сырого веса; А - изменение абсорбции за единицу времени опытной пробы; Ѵ\ - общий объем пробы, мл; V, - объем супернатанта, вносимого в пробу, мл; т - навеска растительного материала, г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА Образование пероксида водорода (Н2 О2 ) происходит в резуль­ тате присоединения одного электрона и двух протонов к супероксидному радикалу, а также в результате взаимодействия (дисмутации) двух молекул супероксида: 20Г + 2Н* — Н20 2+ 0 2 За основу при определении содержания пероксида водорода взят спектрофотометрический метод Bellincampi с соавт., Wolff [7, 19]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Ксшеноловый реактив. К 10 мл дистиллированной воды до­ бавляют 260 мкл серной кислоты, растворяют 9,5 мг соли Мора (железо аммоний сернокислое, FeS0 4 (NH4 )2 S0 4 • 6Н2 0). В отдель­ ном объеме дистиллированной воды (10 мл) растворяют 7,6 мг ксиленолового оранжевого. Затем оба раствора смешивают, при этом происходит переход окраски из темно-малиновой в светлокрасную или темно-оранжевую. В полученной смеси растворяют 1,82 г сорбитола и доводят объем до 50 мл. Реактив оставляют на ночь в холодильнике. Приготовление стандартного раствора пероксида водорода. Из аптечного пероксида первоначально готовят раствор с концен­ трацией 300 мкг мл-1, для чего 100 мкл пероксида (3 %) разводят в 10 мл дистиллированной воды. Далее полученный раствор пе­ роксида разводят аналогично, получая при этом раствор с кон­ центрацией 3000 нг мл-1. Приготовленный раствор снова разбав­ ляют в 1 0 раз ( 1 0 0 мкл в 1 мл), получив при этом стандартный раствор пероксида водорода с концентрацией 300 нг мл'"1. Стан­ дартный раствор используют для приготовления серии разбавле­ ний для построения калибровочной кривой с известными концен­ трациями пероксида: 300; 150; 76; 37,5; 30; 15; 5 нгмл-1. Оборудование 1. Мерные колбы на 100 мл. 2. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Эппендорфы объемом 2 мл. 5. Центрифуга (рефрижераторная). 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8 . Кюветы стеклянные объемом 1 мл. 9. Спектрофотометр. Ход работы Выделение супернатанта Растительный материал (0,3-0,5 г сырых листьев) растирают в 2 мл дистиллированной воды, количественно переносят гомогенат в центрифужные пробирки (конечный объем пробы доводят до 3-4 мл). Центрифугируют в течение 15 мин (при 12 ОООg). Су­ пернатант используют для проведения анализа. Определение пероксида водорода В эппендорф вносят 1 мл супернатанта и 1 мл ксиленолового реактива, плотно закрывают и встряхивают. Смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Прореагировавшую смесь центрифу­ гируют в течение 5 мин при 10 ООО g. Измерение оптической плотности проводят спектрофотометрически при длине волны 560 нм против смеси ксиленолового реактива и дистиллирован­ ной воды в соотношении 1 : 1 . Содержание пероксида водорода в супернатанте рассчитыва­ ют с помощью калибровочного графика. Для его построения ис­ пользуют стандартный раствор пероксида водорода (300 нг мл-1), разбавленный до концентраций Н2 О г: 300; 150; 76; 37,5; 30; 15; 5 нг мл-1. Окрашивание растворов для калибровочного графика проводят по схеме для опытных проб. Для расчета содержания пероксида водорода используют формулу СП = (К • V- Х)/(т • 880), где СП - содержание Н2 О2 , мкмоль/г сырого веса; К - концентрация H20 2 (определяется по калибровочной кри­ вой), нг мл-1; V- общий объем экстракта, мл; X - разведение (отношение количества внесенного образца к общему объему реакционной смеси); т - навеска растительного материала, г; 880 - коэффициент перевода нг в мкмоль. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИОКСИДАНТОВ При определении содержания водорастворимых антиокси­ дантов за основу взят метод Рогожина [2], который основан на способности хлорного железа (Fe3+) окислять антиоксиданты. При этом хлорное железо (Fe3+) восстанавливается до хлористого же­ леза (Fe2+), количество которого определяется по интенсивности окраски при добавлении о-фенантролина. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов На 96 %-м растворе этанола готовят: а) о-фенантролин (М 180,2) - 99 мг о-фенантролина на 20 мл (25 мМ). На 50 %-м этаноле: б) FeCl3 (М 270) - 100 мг на 50 мл (12,3 мМ); в) аскорбиновую кислоту (М 176) - 20 мг на 100 мл ( 2 0 0 мкг/мл). На дистиллированной воде: г) соляную кислоту (М 36,6) - 3,4 мл на 100 мл (0,4 М). Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Пипетки (дозаторы). 3. Колбы мерные (на 50,100 и 500 мл). 4. Штативы. 5. Стеклянный песок для гомогенизации проб. 6 . Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 7. Центрифуга. 8 . Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 9. Спектрофотометр. Ход работы Экстракция водорастворимых антиоксидантов Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают в ступке с 1 мл 50 %-го этанола с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку несколько раз небольшим (0,5 мл) количеством этанола. Общий объем пробы составляет 3 мл. Центрифугируют в течение 10 мин при 1 0 0 0 0 g. Построение калибровочного графика Для построения калибровочного графика используют 2 ряда пробирок по 5 пгг. в каждом. Первый ряд используют для разбав­ ления исходного раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 200 мкг/мл (табл. 2). Второй ряд пробирок служит для проведения качественной реакции. После разбавления из каждой пробирки первого ряда отби­ рают по 0 , 2 мл калибровочного раствора и вносят последователь­ но в расположенные напротив пробирки второго ряда. Затем во все пробирки второго ряда последовательно добавляют по 0 , 2 мл 25 %-го раствора о-фенантролина, 2,4 мл 96 %-го раствора этано­ ла и по каплям приливают 0,2 мл раствора FeCh. После переме­ шивания пробирки второго ряда выдерживают в темноте 1 0 мин (время проведения реакции). Реакцию останавливают добавлени­ ем 1 мл раствора НС1. Таблица 2 Подготовка калибровочных растворов и измерение оптической плотности № п/п Объем Объем исходного 50 %-го раствора раствора аскорбиновой этанола, мл кислоты, мл Концентрация аскорбиновой кислоты в пробирке, мкг/мл 1 0,5 2,0 2,0 2 1,0 1,5 4,0 3 1,5 1,0 6,0 4 2,0 0,5 8,0 5 2,5 0,0 10,0 Оптическая плотность Контрольной служит пробирка, в которую добавляют по 0,2 мл раствора о-фенантролина, 2,6 мл 96 %-го раствора этанола, 0,2 мл раствора FeCl3 и 1 мл раствора НС1. Измерение оптической плотности растворов калибровки про­ водят при 505 нм, записывая показания в табл. 2. Реакцию с опытными растворами проводят следующим обра­ зом. В опытную пробирку последовательно вносят 0,2 мл экс­ тракта (объем вносимого образца можно изменять в пределах от 0,05 до 0,5 мл в зависимости от содержания антиоксидантов в ис­ следуемой пробе), 0 , 2 мл раствора о-фенантролина и по каплям приливают 0,2 мл раствора FeCl3 Затем объем доводят до 3 мл 96 %-м раствором этанола, перемешивают, и пробу выдерживают в темноте 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 1 мл 0,4 М раствора НС1. Контрольной служит пробирка, в которую добавляют по 0,2 мл раствора о-фенантролина, 2 , 6 мл 96 %-го раствора этанола, 0 , 2 мл раствора FeCl3 и 1 мл раствора НС1. Если экстракт имеет окраску, то в отдельную пробирку вно­ сят объем экстракта, равный взятому для определения (0 , 2 мл), и затем доводят общий объем содержимого пробирки до 4 мл 96 %-м раствором этанола. Оптическую плотность экстракта из­ меряют против раствора 96 %-го этанола при 505 нм. Величина разности оптических плотностей опытной пробы и экстракта ис­ пользуется для определения концентрации аскорбиновой кислоты по калибровочному графику. Содержание антиоксидантов (в рас­ чете на аскорбиновую кислоту) в опытной пробе определяют по формуле АО = (С • F| ■Ѵ3)/(т ■Ѵ2• 1 0 0 0 ), где АО - содержание водорастворимых антиоксидантов, мг/г сырого веса; С - концентрация антиоксиданта, определенная по калибро­ вочному графику, мкг/мл; т - навеска сырого растительного материала, г; Ѵ\ - объем, взятый для экстракции, мл; Ѵг - объем экстракта, вносимого в пробирку, мл; Уз - конечный объем пробы в пробирке, мл. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ Z-аскорбиновая кислота (аскорбат, витамин С) находится в большом количестве в растительных тканях и играет очень важ­ ную роль: оказывает существенное влияние на многие физиоло­ гические процессы растений, включая рост, дифференциацию тканей и органов и метаболизм. Функция аскорбата - восстанов­ ление многих свободных радикалов и минимизация разрушитель­ ных воздействий окислительного стресса. Синтез аскорбиновой кислоты происходит в цитозоле из D-глюкозы в несколько стадий. Сначала происходит окисление 1 С атома глюкозы, затем - формирование двойной связи между 2 и 3 атомами С. Как антиоксидант аскорбат реагирует с супероксидом кисло­ рода, пероксидом водорода и радикалом токоферола, при этом окисляясь до монодегидроаскорбиновой кислоты (МДГА) или до дсгидроаскорбиновой кислоты (ДГА). Окисленные формы пре­ вращаются в аскорбат с помощью редуктаз МДГА и ДГА соот­ ветственно. В первом случае используется восстановительный эквивалент НАДФН + FT, а во втором - глутатион. Аскорбиновая кислота может прямо (без апофермента) и в ка­ честве кофактора аскорбатоксидазы инактивировать свободные радикалы, выполняя сходную роль с супероксидцисмутазой: 2 0 ~ 2 + 2Н* + аскорбат —►2Н2 0 2 + ДГА, а также косвенно принимать участие в детоксикации, восстанав­ ливая токоферол. Витамин С найден в хлоропластах, цитозоле, вакуолях, вне­ клеточных компартментах клетки. В клеточной стенке содержится аскорбатоксидаза, катализирующая реакцию с синглетным кисло­ родом ‘0 2: ’0 2 + FT + 2аскорбат —►2ДГА + 2Н20 В хлоропластах мезофилла листа находится около 20-40 % аскорбата. Там же содержатся все ферменты регенерации восста­ новленной аскорбиновой кислоты из окисленных форм. Было вы­ яснено, что Н2 0 2 обезвреживается в хлоропластах в аскорбат- глутатионовом цикле при участии аскорбатпероксидазы. При воздействии стрессовых условий на растение за счет отдачи элек­ тронов аскорбатом на апофермент возможно усиление ее активно­ сти, что позволяет клеткам противостоять усилению окислительно­ го стресса и обезвреживать АФК. Ферменты цикла присутствуют также и в цитозоле. Данный цикл имеет наибольшее значение для хлоропластов. В процессе фотосинтеза образуются синглетные молекулы и супер­ оксиды кислорода из триплетных. Они имеют высокую реакцион­ ную способность и окисляют липиды мембраны до перекисей, дестабилизируя ее. За основу взят метод спектрофотометрического определения аскорбиновой кислоты Hewitt с соавт. [14]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов На дистиллированной воде готовят: а) метафосфорную кислоту - 2 г на 1 0 0 мл ( 2 %-й р-р); б) Na3 P0 4 (М 164) - 33 г фосфата натрия растворить в 100 мл. Из полученных растворов готовят смесь кислоты и фосфата в соотношении 3 : 2 . Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Пробирки мерные на 10 мл. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Штативы. 5. Центрифуга. 6 . Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 7. Спектрофотометр. 8 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 9. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. Ход работы Растительный материал (0,3-0,5 г сырых листьев) гомогени­ зируют с 3 мл 2 %-го раствора метафосфорной кислоты. Гомогенат переносят в мерную пробирку и доводят смесью НР0 3 и Na3 P04, взятых в соотношении 3 : 2 (ѴІѴ, pH 7,3-7,4) до 10 мл. Экстракт центрифугируют 15 мин при 3 ОООg. Оптическую плот­ ность раствора измеряют на спектрофотометре при 265 нм против стандарта - вышеуказанных растворов НР0 3 и Na3 P 0 4, взятых в том же соотношении (3 : 2). Результаты вычисляют по формуле, используя коэффициент молярной экстинции для аскорбиновой кислоты при 265 нм: АК = (Д265 - т і , 6 5 5 - 104 т ) , где АК - содержание аскорбиновой кислоты, мМ аскорбата/г сы­ рого веса; 1,655 • 104 - коэффициент молярной экстинции аскорбата, моль- 1 см-1; Дгб5 - оптическая плотность опытного раствора при длине волны 265 нм; V- объем пробы общий, мл; т - навеска сырого растительного материала, г. Для пересчета содержания аскорбиновой кислоты в мг на грамм сырого веса необходимо умножить соответствующее зна­ чение на коэффициент, равный величине молярной массы аскор­ биновой кислоты (М 176). ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА Глутатион - это маленький пептид, состоящий из трех ами­ нокислотных остатков (у-глу, цис, гли), у-глутамилцистеинилглицин. Глутатион защищает тиольные группы белков, инактиви­ рует радикальные частицы, разрушает перекисные соединения, реагирует с активными формами кислорода. Он может стабили­ зировать мембранные структуры, удаляя ацильные пероксиды, образующиеся в ходе ПОЛ. При этом восстановленная форма глутатиона Г-SH превращается в окисленную FS-Sr. Глутатион является кофактором ферментов глутатионпероксидазы (I'll) восстанавливает Н2 О2 до воды при окислении глутатиона: 2r-SH + Н2 О2 rS -S r + ги ге и глугатионредуктазы (ГР), которая постоянно находится в клетке в активном состоянии, катализируя восстановление окисленного глутатиона при участии НАДФН + Н4: НАДФН + ИГ + rS -S r -*■ 2r-SH + НАДФН4. Глутатион участвует в восстановлении дегидроаскорбиновой кислоты в аскорбиновую в аскорбат-глутатионовом цикле: дегидроаскорбат + 2Г-БН —>аскорбат + TS-Sr. Глутатион также может восстанавливать дегидроаскорбиновую кислоту без апофермента при pH > 7 в клетке и концентрации глутатиона >1 мМ. Способность глутатиона перехватывать свободные радикалы обусловливает его противодействие окислительному стрессу. Кроме того, в условиях стресса, вызванного тяжелыми металла­ ми, растения синтезируют металлосвязывающие белки, такие как фитохелатины. Использование Г-SH в антиоксидантной защите у разных ви­ дов может происходить по разным механизмам: с преобладанием процессов его ресинтеза или активного участия в окислительно­ восстановительных процессах. Второй механизм метаболизма является более уязвимым, так как в условиях стресса при загряз­ нении ресурс глутатиона истощается. Это может привести к на­ рушению функционирования глутатионзависимой антипероксидной системы клеток. Для определения аскорбиновой кислоты и глутатиона из од­ ной навески за основу взята методика Чупахиной [3]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов На дистиллированной воде готовят: а) трихлоруксусную кислоту (ТХУ; М 163) - 5 г на 100 мл (5 %-й р-р); б) 2 ,6 -дихлорфенолиндофенол (0 , 0 0 1 н) - 60 мг краски на 2 0 0 мл; в) ЮОз (М 214) - 0,3568 г калия йодата на 1 л (0,001 н); г) крахмал ( 1 %-й р-р) - 1 г крахмала растворить в 1 0 0 мл. Для определения титра краски готовят: д) серную кислоту (М 98) - в 98 мл НгОдист влить 2 мл кон­ центрированной серной кислоты ( 2 %-й р-р); е) аскорбиновая кислота (кристаллическая); ж) КГ (йодистый калий кристаллический). Оборудование 1. Конические колбы. 2. Мерные колбы. 3. Воронки. 4. Фильтровальная бумага. 5. Весы. 6 . Пипетки (дозаторы). 7. Микробюретки. 8 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 9. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. Ход работы Растительный материал (2 г сырых листьев или 300 мг сухого растительного материала) растирают в маленькой фарфоровой ступке с 10 мл 5 %-го раствора ТХУ. Для лучшего измельчения материала в ступку добавляют кварцевого песка или битого стекла. Растирание продолжают в течение 3-5 мин до получения одно­ родной массы. Далее все содержимое ступки через воронку с ши­ роким горлышком количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доливают до черты ТХУ. При этом той же кислотой тща­ тельно обмывают ступку и пестик. Мерную колбу закрывают пробкой и тщательно встряхивают в течение 5 мин. После этого содержимое колбы фильтруют в сухую колбу. Из фильтрата отбирают по 5 мл в 4 конические колбочки для проведения титрования из микробюреток. В первых двух колбоч­ ках раствор титруют 0 , 0 0 1 н раствором 2 ,6 -дихлорфенолиндофенола до ясно-розовой окраски от 1 капли краски. В двух других колбочках титрование проводят 0 , 0 0 1 н раствором йодата калия до появления фиолетовой окраски от 1 капли. В колбочки, где тит­ рование проводят йодатом калия, добавляют 3 капли раствора крах­ мала в качестве индикатора и несколько кристалликов йодистого калия, вес которых не должен превышать 5-10 мг. Добавлять большое количество йодистого калия недопустимо, так как при высоких концентрациях этой соли сильно тормозится окисление аскорбиновой кислоты йодатом. При титровании краской идет окисление одной аскорбино­ вой кислоты, при титровании йодатом калия наряду с аскорби­ новой кислотой имеет место окисление глутатиона. Разница меж­ ду объемами йодата калия и краски, пошедшими на титрование ис­ следуемого раствора, характеризует количество глутатиона. Расчет содержания аскорбиновой кислоты и глутатиона ведут по следующим формулам: СА = (А • Т • Ѵ\)І(т • Ѵ2), СГ = (0,307 • (В - А) • К • Ѵх)І(т ■Ѵ2), где СА - содержание аскорбиновой кислоты, мг/г; СГ - содержание глутатиона, мг/г; А - объем краски, пошедшей на титрование исследуемого раствора, мл; В - объем KJO3 , пошедшего на титрование исследуемого рас­ твора, мл; Ѵ\ - количество растворителя - ТХУ, мл; т - навеска растительного материала, г; Ѵ2 - объем исследуемого раствора, взятого для титрования краской или KJO3 , мл; Т - титр краски по аскорбиновой кислоте, мл; К - объем KJO 3 , мл /объем краски, мл; 0,307 означает, что 1 мл 0,001 н KJ0 3 соответствует 0,307 мг Г-SH. Установка титра краски Метод установления титра краски основан на параллельном титровании раствора аскорбиновой кислоты краской и раствором KJO3 . Поскольку 1 мл 0,001 н раствора KJO3 эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты, то легко рассчитать титр краски. Перед установлением титра краски растворяют несколько кристалликов (примерно 1-1,5 мг без взвешивания) аскорбиновой кислоты приблизительно в 50 мл 2 %-го раствора серной кислоты. Берут в две колбочки по 5 мл этого раствора и титруют его из микробюретки: в одной колбочке - индикатором (0 , 0 0 1 н раство­ ром краски), в другой - 0,001 н раствором KJO 3 , предварительно добавив в колбочку 5-10 мг йодистого калия (KJ) и 5 капель 1 %-го раствора крахмала. Расчет титра краски проводят по следующей формуле: Т = 0,088 • А/В, где Т - титр краски, мг; А - объем 0,001 н раствора KJ03, мл; В - количество раствора краски, мл; 0,088 означает, что 1 мл 0 , 0 0 1 н раствора Ю0 0,088 мг аскорбиновой кислоты. 3 соответствует ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ Флавоноидами называется группа природных биологически активных соединений - производных бензо-у-пирона, в основе ко­ торых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из Сб-Сз-Сб углеродных единиц. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце. Под термином «флавоноиды» объединены различные соеди­ нения, генетически связанные друг с другом и обладающие сход­ ными свойствами. Свое название флавоноиды получили от латин­ ского flavus - желтый, так как первые выделенные из растений соединения имели желтую окраску. Однако позднее выяснилось, что большинство из них - бесцветные соединения. Это самый обширный класс фенольных соединений, к которому относятся и антоцианиды. Флавоноиды широко распространены, в большем или меньшем количестве их содержат почти все высшие расте­ ния. Особенно богаты флавоноидами семейства розоцветных, бо­ бовых, гречишных, сложноцветных, яснотковых. Флавоноиды находятся в разных частях растений, но чаще в надземных: цвет­ ках, листьях, плодах. Значительно меньше их - в стеблях и под­ земных органах. Наиболее богаты ими молодые цветки и незре­ лые плоды. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем оно составляет 0,5-5 %. Будучи постоянными и универсальными компонентами рас­ тительных тканей, флавоноиды несут значительную функцио­ нальную нагрузку: участвуют в процессах дыхания и онтогенеза; играют важную роль в окислительно-восстановительных реакци­ ях; защищают растительные ткани от избыточной солнечной ра­ диации; влияют на проницаемость мембран; являются субстрата­ ми ряда ферментов. При определении флавоноидов в растительном материале за основу взята методика Рогожина [2]. Для максимального извлечения флавоноидов из биологическо­ го материала используется 1 %-й раствор тритона Х-100 в 96 %-м растворе этанола, способного извлекать из мембранных структур не растворимые в воде соединения. За счет формирования мицеллярных структур в тритоне Х-100 могут растворяться гидрофоб­ ные соединения. В основе реакции лежит способность флавоноидов из расти­ тельных тканей реагировать с лимоннокислым борным реакти­ вом, образуя окрашенный устойчивый комплекс с максимумом поглощения при 420 нм. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Приготовление экстрагирующего раствора. 1 %-й раствор тритона Х-100 в 96 %-м растворе этанола: 1 мл тритона Х-100 растворяют в 99 мл 96 % -го раствора этанола. Приготовление лимонно-борного реактива. На растворе для экстракции, отдельно готовят, нагревая на водяной бане: а) лимонную кислоту (М 192) - 10 г на 50 мл (20 %-й р-р); б) борную кислоту (М 61,8) - 2,5 г на 50 мл (5 %-й р-р). Непосредственно перед определением смешивают получен­ ные растворы в соотношении 1 : 1 . Отдельно на 96 %-м растворе этанола готовят: в) раствор рутина (М 610) с концентрацией 0,1 мг/мл (10 мг на 1 0 0 мл); г) раствор лимонной кислоты (М 192) 20 %-й (20 г на 100 мл), нагревая на водяной бане. Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Пробирки мерные на 10 мл. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Штативы. 5. Центрифуга. 6 . Юоветы кварцевые объемом 3 мл. 7. Спектрофотометр. Ход работы Экстракция фпавоноидов Растительный материал (0,5-1 г сырых листьев) измельчают и заливают экстрагирующим раствором в соотношении 1 : 5. Экстрак­ цию флавонондов проводят путем настаивания в течение 24 ч. По истечении времени настаивания отмечают точный объем экстракта. Построение калибровочного графика Устанавливают в штатив 12 пробирок. В 6 пробирок последова­ тельно вносят разные объемы исходного 0 , 1 мг/мл раствора рутина и лимонно-борного реактива, как показано в табл. 3. В следующие 6 пробирок последовательно приливают разные объемы исходного 0,1 мг/мл раствора рутина и экстрагирующего раствора. Измерение первых шести калибровочных растворов проводят против экстраги­ рующего раствора, а остальных - против лимонно-борного реактива. Таблица 3 Подготовка калибровочных растворов и измерение оптической плотности Раствор рутина с реактивом Концен­ трация № Опти­ рутина Объем Объем п/п ческая в пробирке, рутина, реактива, плот­ мг/мл - 10-3 мл мл ность 1 2 4 0,2 8 12 0,4 3 4 5 20 6 24 16 0,6 0,8 1,0 1,2 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 Раствор рутина с экстрагирующим раствором Объем Опти­ Объем экстраги­ ческая рутина, рующего плот­ раствора, мл ность мл 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 Оптическую плотность калибровочных растворов измеряют через 15 мин на спектрофотометре при 420 нм. Результаты зано­ сят в табл.3. Величину оптической плотности известной концентрации ру­ тина вычисляют путем вычитания из оптической плотности рас­ твора рутина с лимонно-борным реактивом оптической плотности раствора рутина с экстрагирующим раствором. Проведение реакции В первую пробирку (опытная проба) последовательно вносят 0,5 мл супернатанта (объем вносимого образца можно изменять в пределах 0,05-0,6 мл в зависимости от содержания флавоноидов в исследуемой пробе), а затем объем доводят до 3 мл лимонно­ борным реактивом. Во вторую пробирку вместо реактива приливают 20 %-й раствор лимонной кислоты в 96 %-м растворе этанола. После перемешивания измерения проводят через 15 мин при 420 нм. Величину оптической плотности опытной пробы вычисляют путем вычитания из оптической плотности опытной пробы (с ли­ монно-борным реактивом) оптической плотности супернатанта с 2 0 %-м раствором лимонной кислоты. Концентрацию флавоноидов определяют по калибровочному графику. Содержание флавоноидов в исследуемом образце вычис­ ляют по формуле СФ = ( С - Ѵ г Ѵ 3) / ( т Ѵ 2), где СФ - содержание флавоноидов, мг/г сырого веса; С - концентрация флавоноидов, определенная по калибро­ вочному графику мг/мл; Ѵ\ - общий объем после экстракции, мл; Ѵ2 - объем супернатанта, вносимого в пробирку, мл; Ѵ3- конечный объем пробы в пробирке, мл. т - навеска растительного материала, г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТОЦИАНОВ Антоцианы - основные водорастворимые пигменты растений, обусловливающие окраску цветков, плодов, листьев в разнообраз­ ные цвета - от розового до фиолетово-черного. Окраска антоцианами цветков, плодов и других частей растений зависит от ряда факторов, многие из которых до конца не выяснены до сих пор. Следует отметить, что часто за окраску цветков ответственны не только антоцианы, но и другие пигменты. Например, коричневая окраска часто обусловлена сочетанием синевато-красного антоциана в вакуолях с желтыми каротиноидами в хромопластах. Метод определения антоцианов в растительной ткани осно­ ван на спектрофотометрическом определении экстракта антоциа­ нов в 1 %-м растворе соляной кислоты [ 1 ]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов На дистиллированной воде готовят: соляную кислоту (М 36,5) - 1 мл на 100 мл (1 %-й р-р). Оборудование 1. Пластиковые термостойкие пробирки с крышками (Falcon) объемом 15 мл или стеклянные пробирки с притертыми крышками. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Водяная баня. 5. Фильтры бумажные. 6 . Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 7. Спектрофотометр. Ход работы Навеску растительного материала (0,3-0,5 г сырых листьев) мелко измельчают (но не растирают), помещают в мерную про­ бирку, добавляют 1 0 мл 1 %-го раствора соляной кислоты и вы­ держивают на водяной бане при 40-45 'С в течение 20 мин. После охлаждения содержимое фильтруют через бумажный фильтр и из­ меряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длинах волн 510 нм и 657 нм. Содержание суммы антоцианов вычисляют по формуле СА = (Дяо - 0,33 • Дб57) • V/(453 • т), где СА - содержание антоцианов, % от сырого веса; V - объем экстракта, л; 453 - удельный показатель поглощения цианидин-3 ,5 -дигликозида при длине волны 510 нм в 1 %-м водном растворе со­ ляной кислоты; т - навеска растительного материала, г. В дальнейшем процентное содержание антоцианов переводят в мкг на г сырого веса, умножая СА (%) на 10 ООО. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОГО ПРОЛИНА Пролин (про, pro, Р) - гетероциклическая аминокислота (иминокислота). У многих растений она накапливается в услови­ ях биотического и абиотического стрессового воздействия. При этом пролин оказывает стабилизирующее действие на мембраны, уменьшает осмотический стресс, защищает белки от денатурации, участвует в передаче стрессового сигнала, регулирует redoxпотенциал клетки. Есть также данные, что он участвует в инакти­ вации свободных радикалов, образуя с ними долгоживущие конъюгаты. Аккумуляция пролина индуцируется в условиях стресса как за счет увеличения синтеза, так и за счет восстановления окис­ ленной аминокислоты. Было показано, что большая часть накоп­ ленного пролина в условиях стресса является результатом увели­ чения его синтеза из глутамата. Есть еще другой путь синтеза - из аргинина и орнитина. При стрессе часто происходит уменьшение окисления пролина, что приводит к увеличению его уровня. Следует отметить, что конечное звено синтеза пролина и на­ чальное звено его распада имеют разные ферменты, точно так же, как и синтеза/распада интермедиатов. В большинстве случаев при действии на растение стрессоров, таких как Cu, Cr, Cd, Со, Zn, Ni, Al, уровень пролина повышается. Но наблюдаются случаи, когда при действии неблагоприятных условий (например, тяжелых металлов - Cd и др.) уровень проли­ на уменьшается с увеличением нагрузки. Эго связывают с недос­ татком потенциала его синтеза. Хотя увеличение концентрации пролина в ответ на тяжелые металлы было описано многими ав­ торами, физиологическое значение накопления этой аминокисло­ ты в условиях стресса недостаточно объяснено. При определении свободного пролина в растительном мате­ риале за основу взята методика Bates [5]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов На дистиллированной воде готовят: а) пролин (М 115,1) - 23,1 мг на 100 мл (0,2 мМ); б) сульфосалициловую кислоту (М 138) - 3 г на 100 мл (3 %-й р-р); в) о/мио-фосфорную кислоту (М 98) - 41,9 мл 85 %-го раство­ ра орото-фосфорной кислоты до 100 мл ( 6 М). Ледяная уксусная кислота (М 60,1) - раствор уксусной кисло­ ты (70 %-й р-р); толуол (М 92,1). Ациднингидриновый реактив готовят, растворяя 1,25 г нингидрина в 30 мл ледяной уксусной кислоты и в 20 мл раствора орто-фосфорной кислоты при нагревании, до полного растворе­ ния. Реактив хранится в холодном месте (при температуре 4 °С), стабилен в течение 24 ч. Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Центрифуга. 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8 . Водяная баня. 9. Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 10. Спектрофотометр. Ход работы Навеску растительного материала (0,5-1 г сырых листьев) гомогенизируют в 8 мл раствора сульфосалициловой кислоты. Затем центрифугируют в течение 20 мин (15 000 g). Супернатант сливают и отбирают в пробирку для определения аликвоту 2 мл, добавляют к супернатанту 2 мл ациднингидринового реактива и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь реагентов нагревают на водяной бане при 100 °С в течение 1 ч. Реакцию останавливают, погружая пробирки в холодную воду (2 °С). Реакционную смесь экстрагируют толуолом (4 мл) при энер­ гичном встряхивании в течение 20-30 с. Хромофор, содержащий толуол, отделяют от водной фазы нагреванием до комнатной тем­ пературы. Измерение поглощения проводят при 520 нм, исполь­ зуя толуол в качестве контроля. Концентрацию пролина в супер­ натанте определяют по калибровочной кривой. Построение калибровочного графика Для его построения необходим стандартный раствор пролина с концентрацией 0,2 мкМ/мл (23,1 мг/л), разбавленный до сле­ дующих концентраций (табл. 4). Таблица 4 Подготовка калибровочных растворов № п/п Объем Концентрация Концентрация исходного пролина, пролина, стандартного мкМ/мл мкг/мл раствора пролина, мл 1 2 0,2 0,1 3 0,05 4 Объем воды, мл 2 1 0 1 5,75 0,5 1,5 0,025 2,875 0,25 1,75 5 0,0125 1,2375 0,125 1,875 6 0,00625 0,72 0,0625 1,9375 23,1 11,5 Реакцию с калибровочными растворами проводят аналогично реакции с опытными пробами. Содержание пролина в раститель­ ном материале рассчитывают по следующей формуле: СП = (С„ - F)/(115-5-m ), где СП - содержание пролина, мкМ /г сырого веса; Сп - концентрация пролина, определенная по калибровочно­ му графику, мкг/мл; V - объем толуола, мл; 115 - молярная концентрация пролина, мкг/мкМ; nt - навеска растительного материала, г. ОПРЕДЕЛЕНИЕ SH-ГРУПП С РЕАКТИВОМ ЭЛМАНА Проблема загрязнения окружающей среды различными поллютантами, в том числе тяжелыми металлами (ТМ), становится все более актуальной. В последнее время пристальное внимание уделяется изучению биологических механизмов аккумуляции и де­ токсикации избытка ТМ, поступающих в почву, атмосферу, вод­ ную среду. Одним из известных способов защиты растений от вредного влияния ТМ является биосинтез низкомолекулярных белков и пептидов, обогащенных SH-группами (металлотионеинов и фитохелатинов). Металлсвязывающие белки и пептиды синтезируются в норме в незначительном количестве. Их содер­ жание в клетке резко возрастает при действии ТМ и снижается в случае уменьшения их концентрации в питательном субстрате. Металлотионеины имеют низкую молекулярную массу (до 10 кД) и характеризуются высоким содержанием цистеина (около 30 %). В настоящее время выделено три типа металлотионеиноподобных генов растений, продукты которых различаются по рас­ положению остатков цистеина. Фитохелатины имеют общую структуру (y-Glu-Cys)„-Gly, где п - 2-11 и называются также металлотионеинами Ш класса. Из­ вестно, что синтезирующая их фитохелатинсинтаза напрямую активируется тяжелыми металлами. Реактив Элмаяа, или 5 ,5 -дитиобис(2 -нитробензойная) кисло­ та (ДТНБ), может вступать в реакцию с SH-группами белков и пептидов. Образующийся 5-тио-2-нитробензойный анион имеет интенсивную окраску желтого цвета. На этом основано количест­ венное определение SH-rpyim в растворимых и высокополимер­ ных соединениях клетки [ 1 1 ]. Реактивы и оборудование Приготовление буферных растворов Приготовление 0,1 М трис-НСІ буфера pH 7,8-8,0. Этот бу­ фер используют для приготовления среды выделения и реакцион­ ной среды при определении общего количества растворимых SHгрупп и мембранно-связанных SH-групп. Дня буфера необходим трис-(гидроксиметил)-аминометан (М 121) и 0,1 н НС1 (готовят из фиксанала): - трис - 1 , 2 1 г + 50 мл H2 0 OTCT; -НС10,1 н-ЗОмл. Растворы смешивают, корректируют pH, конечный объем до­ водят до 1 0 0 мл дистиллированной водой. Приготовление 0,25 М трис-HCl буфера pH 7,5. На этом бу­ фере растворяют реактив Элмана, или 5,5-дитиобис(2-нитробензойную) кислоту (ДТНБ): - трис - 3,025 г + 50 мл H2 0 OTCT; - HCl 0,1 н - 40,3 мл. Растворы смешивают, корректируют pH, конечный объем до­ водят до 1 0 0 мл дистиллированной водой. Приготовление 0,4 М трис-Ш2\ буфера pH 8,9. Данный буфер используют для приготовления реакционной смеси при определе­ нии небелковых растворимых тиолов: - трис - 4,84 г + 50 мл H2 0 OTCT; -H C l 0,1 н - 7 мл. Растворы смешивают, корректируют pH, конечный объем до­ водят до 1 0 0 мл дистиллированной водой. Приготовление реактивов Среду выделения готовят на 0,1 М трис-HCl буфере pH 7,8. На 100 мл трис-HCl буфера pH 7,8: - MgCl2 (6H2 0 ) (М 203) - 203 мг (1 мМ); - Na-ЭДГА (трилон Б; М 372,3) - 115 мг (0,3 мМ). Реактивы 1. Додецилсульфат натрия (SDS, М 288,2) - 1 г на 10 мл H2 0 OTCT ( 1 0 %-й р-р). 2. Раствор реактива Элмана (ДТНБ; М 396) - 19,8 мг (50 мкМ) на 5 мл 0,25 М трис-HCl буфера pH 7,5. Для лучшего растворения нагревают на водяной бане при 37 °С. 3. Трихлоруксусная кислота - 5 г на 10 мл НгОди* (50 %-й р-р). 4. Тритон Х-100 - 0,1 мл на 100 мл НгОдии (0,1 %-й р-р). 5. Глутатион-SH (М 303) - 30,3 мг на 100 мл Н2 ОдиСТ(ІмМ р-р). Раствор необходим для построения калибровочной кривой (гото­ вят непосредственно к каждому опыту). Из этого раствора готовят разведения концентрацией 0,5; 0,25; 0,125; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,01 мМ. Оборудование 1 . Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Стеклянные палочки. 5. Секундомер (таймер). 6 . Центрифуга (рефрижераторная). 7. Стеклянный песок для гомогенизации проб. 8 . Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 9. Охлаждающее устройство или жидкий азот. 10. Водяная баня. 11. Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 12. Спектрофотометр. Ход работы Выделение фракций, содержащих SH-группы Выделение общей растворимой клеточной фракции Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством среды выделения (1,5-2 мл) и с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в цен­ трифужную пробирку, обмывая ступку небольшим (0,5 мл) коли­ чеством среды. Общий объем используемой среды выделения 4 мл. Гомогенат центрифугируют в течение 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант сливают в пробирку, помещенную в стакан со льдом. К осадку, содержащему мембранные компоненты, прили­ вают еще 4 мл среды выделения и перемешивают стеклянной па­ лочкой. Затем центрифугируют снова в течение 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант, полученный после промывки, объединя­ ют с первым супернатантом, общий объем пробы составит около 8 мл. Полученную растворимую клеточную фракцию (РКФ) используют для выделения небелковой растворимой фракции (НРФ), а также для определения общего количества растворимых SH-rpynn и растворимых белков. Из осадка выделяют фракцию мембранно-связанных белков (МСБ) и определяют в них количе­ ство SH-rpynn. Выделение фракции мембранно-связанных белков К осадку, содержащему мембранные компоненты, добавляют 4 мл 0,1 %-го раствора тритона, перемешивают стеклянной па­ лочкой и оставляют на 15 мин. Затем центрифугируют в течение 20 мин (15 ОООg при 4 °С). Супернатант сливают в пробирку, по­ мещенную в стакан со льдом. Осадок промывают повторно, ис­ пользуя для этого 4 мл 0,1 %-го раствора тритона, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при ранее описанных условиях. Супернатант после вторичной промывки осторожно сливают в пробирку, объединяя с первым супернатантом, общий объем пробы должен составлять около 8 мл. В выделенной фрак­ ции определяют количество SH-групп с реактивом Элмана и мем­ бранно-связанные белки по Шактерле [18]. Выделение небелковой растворимой фракции Небелковую растворимую фракцию, используемую для опре­ деления небелковых тиолов, получают путем осаждения раство­ римых белков из общей растворимой клеточной фракции 50 %-й трихлоруксусной кислотой. Для этого к 3 мл общей растворимой фракции добавляют 2,4 мл НгОдист и 0,6 мл 50 %-й ТХУ, перемешивают, выдерживают 15 мин, затем центрифугируют в течение 20 мин при 15 000 g. Суперна­ тант осторожно сливают в чистую пробирку и используют для определения небелковых тиолов. Определение общих растворимых и мембранно-связанных SU-групп Определение SH-групп проводят в пробирках. Опытная проба: - 10 %-й р-р SDS - 300 мкл; - супернатант - 300 мкл. Контрольная проба: - 10 %-й р-р SDS - 300 мкл; - 0,1 М трис-НСІ буфер pH 7,8 - 300 мкл. В опытную и контрольную пробы вносят по 2 мл 0,1 М трисНС1 буфера pH 7,8. Измеряют оптическую плотность (Ао) опыт­ ной пробы против контрольной на спектрофотометре при длине волны 412 нм. После измерения пробы количественно переносят в соответствующие пробирки. В опытную пробу добавляют 0,2 мл раствора реактива Элмана (ДГНБ), перемешивают. В контрольную пробу вместо реакти­ ва Элмана добавляют 0,2 мл 0,1 М трис-НСІ буфера pH 7,8. Про­ бирки инкубируют в течение 1 ч на водяной бане при 37 °С. После этого снова измеряют оптическую плотность (Аі) против контрольной на спектрофотометре при длине волны 412 нм. Для расчета используют разность Аі - Ао = А. Для перевода А в мик­ ромоли SH-rpynn строят калибровочный график по глутатиону-SH. Реакцию с ДТНБ проводят так же, как с опытными пробами, только вместо супернатанта используют раствор глутатиона (0,5; 0,25; 0,125; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,01 мМ). Расчет SH-групп в растворимой фракции и мембранно-свя­ занной фракции можно осуществить двумя способами: Способ 1 Через калибровочную кривую (1 мкм восстановленного глу­ татиона соответствует 1 мкМ SH-групп). Конечный результат вы­ ражают в микромолях SH-групп на 1 мг белка - растворимого или мембранно-связанного. Содержание белков определяют по Шактерле [18]. Способ 2 Через коэффициент экстинции 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) - 13,6 m N T ' c m “ 1. Определение небелковых SK-групп Опытная проба: - 0,4 М трис-НСІ буфер pH 8,9 - 2 мл; - супернатант - 1 мл. Контрольная проба: - 0,4 М трис-НСІ буфер pH 8,9 - 3 мл. В опытную и контрольную пробы вносят по 2 мл 0,4 М трисНС1 буфера pH 8,9. Измеряют оптическую плотность (Ао) опыт­ ной пробы против контрольной на спектрофотометре при длине волны 412 нм. После измерения пробы количественно переносят в соответствующие пробирки. В опытную пробу добавляют 0,05 мл раствора реактива Элмана (ДТНБ), перемешивают. В контрольную пробу добавляют 0,05 мл 0,4 М трис-НСІ буфера pH 8,9 и также перемешивают. Пробы инкубируют в течение 1 ч на водяной бане при 37 °С. По­ сле этого снова измеряют оптическую плотность опытной пробы (Аі) против контрольной на спектрофотометре при длине волны 412 нм. Для расчета используют формулу Ai - Ао = А. Для пере­ вода А в микромоли SH-rpyim строят калибровочный график по глутатиону-SH. Реакцию с ДТНБ проводят так же, как с опытной пробой, только вместо супернатанта используют растворы глутатиона (соответственно 0,5; 0,25; 0,125; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,01 мМ). Расчет SH-групп в небелковой фракции можно осуществить двумя способами: Способ 1 Через построение калибровочной кривой (1 мкм восстанов­ ленного глутатиона соответствует 1 мкМ SH-групп). При расчете необходимо учитывать разбавление супернатанта в 2 раза при осаждении белков. Конечный результат выражают в микромолях небелковых тиолов на грамм сухого веса. Способ 2 Через коэффициент экстинции 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) - 13,6 мМ^см“1. Содержание SH-групп в растворимых белках определяют, вычитая количество небелковых тиолов (в микромолях на милли­ литр) из общего количества сульфгидрильных групп в растворимой клеточной фракции (в микромолях на миллилитр), и выражают в микромолях SH-групп на миллиграмм растворимого белка. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДЦИСМУТАЗЫ Супероксидцисмутаза (СОД, ЕС 1.15.1.1) является важней­ шим ферментом антиоксидантной защиты растений. Она катали­ зирует реакцию восстановления супероксид-радикала до перок­ сида водорода. Механизм взаимодействия СОД с супероксидным радикалом точно не выяснен. Предполагают, что сначала одна молекула супероксида взаимодействует с активным центром фермента, при этом металл, входящий в активный центр, восста­ навливается с освобождением молекулярного кислорода: СОД-Ме^ + О Г -*• 0 2 + СОД-Ме(" ~1Н Затем при участии второй молекулы Ог^ происходит обрат­ ное окисление металла, при этом образуется пероксид водорода: СОД-Ме(л- 1>++ 0 2'~ -> Н20 2 + СОД-Ме^ СОД растений содержит в активных центрах ионы меди, цин­ ка, железа или марганца. Cu-Zn-СОД локализована в основном в цитоплазме, хлоропластах и пероксисомах эукариот, Мп-СОД в митохондриальных мембранах, тогда как Fe-СОД - в хлоропла­ стах большинства растений. У бактерий недавно была обнаруже­ на СОД, содержащая в своем активном центре молекулу Ni. Существует несколько методов определения общей актив­ ности фермента СОД. Здесь приведены два наиболее доступных метода. Первый метод основан на способности фермента инги­ бировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия. М е т о д 1 [6] Реактивы и оборудование Приготовление буферного раствора Для работы необходимо приготовить 0,1 М фосфатный буфер pH 7,8 (см. табл. 1). Приготовление реактивов Реакционную среду готовят на фосфатном буфере pH 7,8 не­ посредственно перед каждым опытом. Одна проба реакционной среды (3 мл) содержит: - L-метионин (М 149) - 5,82 мг (39 мкМ); - нитросиний тетразолий (М 817) - 0,204 мг (0,245 мкМ); - тритон Х-100 - 0,075 мл (1%-й р-р); - Na-ЭДТА (трилон Б; М 372) - 0,112 мг (0,3 мкМ). Отдельно готовят свежий раствор рибофлавина (4,4 мг на 100 мл НгОдист). Рибофлавин хранят в холодильнике в затемнен­ ной посуде. Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Затемненная камера (стакан). 6 . Лампа для освещения опытных проб (ДРЛ-500). 7. Центрифуга (рефрижераторная). 8 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 9. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 10. Охлаждающее устройство или жидкий азот. 11. Водяная баня. 12. Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 13. Спектрофотометр. Ход работы Выделение фермента Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством (1,5-2 мл) 0,1 М фосфат­ ного буфера pH 7,8 с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку небольшим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем использованного буфера составляет 5 мл. Гомогенат центрифугируют в течение 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант переносят в чистую, сухую про­ бирку, помещенную в стакан со льдом, и используют в качестве фермента при проведении реакции. В таком виде супернатант при необходимости хранят в холодильнике не более 2 ч. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) В каждом опытном варианте реакционные смеси готовят в трех пробирках: П е р в а я п р о б и р к а : Змл реакционной среды + 0,1 мл су­ пернатанта. Эта проба служит темновым контролем, против которого проводят измерение на спектрофотометре. В т о р а я п р о б и р к а : 3 мл реакционной среды + 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,8. Данная проба (без супернатанта) служит световым контролем к опытному варианту. Т р е т ь я п р о б и р к а : 3 мл реакционной среды + 0,1 мл су­ пернатанта (опытная проба). Для запуска ферментативной реакции во все три пробирки вносят по 0,05 мл рибофлавина, после чего вторую и третью про­ бирки помещают в условия освещения на 1 0 - 2 0 мин (время под­ бирают опытным путем), а первую - в темноту при температуре 30 °С. Реакцию останавливают, помещая вторую и третью про­ бирки в темноту. Оптическую плотность содержимого всех трех пробирок определяют при 560 нм на спектрофотометре. Опреде­ ление активности СОД (в относительных единицах на милли­ грамм белка) проводят трехкратно по следующей формуле: активность СОД = lg (Дг/Д0 )/(1§2 • С6), где Дс - оптическая плотность световой контрольной пробы; До - оптическая плотность опытной пробы; Сб - содержание белка в пробе, мг. Количество растворимого белка в супернатанте определяют по Брэдфорду [8 ] или Шактерле [18]. М е т о д 2 [17] Реактивы и оборудование Приготовление буферного раствора Для работы необходимо приготовить 0,1 М фосфатный буфер pH 7,4 (см. табл. 1). Приготовление реактивов Среду выделения готовят на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4. На 50 мл буфера: - поливинилпирролидон (ПВП; М 103) - 1 г (2%-й р-р); - Na-ЭДТА (трилон Б; М 372) - 19 мг (51 мкМ). Реактивы На 10 мл буфера: 1. Na-ЭДТА (трилон Б; М 372) - 558 мг (1,5 мМ), скорректи­ ровать pH до 7,4 (NaOH). 2. МпС12 (4Н2 0 ) (М 198) - 162 мг (0,8 мМ). Эти растворы смешивают в пропорции 1 : 1 непосредственно перед приготовлением реакционной среды. 3. НАДН(Н+) (М 709) - 5 мг (7 мкМ) на 1мл (готовят перед опытом). 4. Раствор меркаіггоэтанола (М 78) - 10 мкл на 14,2 мл Н2Од„ст (готовят непосредственно перед проведением реакции и хранят в плотно закрытой посуде). Реакционную среду готовят в кювете для спектрофотометра на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4 непосредственно перед каж­ дым измерением, для каждой повторности. Одна проба реакционной среды (общий объем 3 мл) содер­ жит: - 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,4) - 2,2 мл; - Na-ЭДТА/Мп (смесь 1 : 1) - 0,1 мл; -НАДН(Н+)-0 ,1 мл; - фермент (супернатант) - 0 , 1 мл. Оборудование 1. Пипетки (дозаторы). 2. Секундомер (таймер). 3. Центрифуга (рефрижераторная). 4. Стеклянный песок для гомогенизации проб. 5. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 6 . Охлаждающее устройство или жидкий азот. 7. Водяная баня. 8 . Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 9. Спектрофотометр. Ход работы Выделение фермента Растительный материал (0,6 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством среды выделения ( 1 ,5 - 2 мл) и с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центри­ фужную пробирку, обмывая ступку небольшим (0,5 мл) количе­ ством среды выделения. Общий объем использованной среды вы­ деления - 4 мл. Гомогенат центрифугируют 20 мин (15 ООО g при 4 °С). Супернатант переносят в чистую, сухую пробирку, поме­ щенную в стакан со льдом, и используют как фермент при прове­ дении реакции. В таком виде супернатант при необходимости хранят в холодильнике не более 2 ч. Определение активности супероксиддисмутазы Реакцию проводят в кюветах для СФ при температуре 30 °С. Для поддержания постоянной температуры реактивы помещают на водяную баню. В кювете готовят реакционную среду (как опи­ сано выше). Реакцию запускают добавлением 0,5 мл меркаптоэтанола. Смесь быстро встряхивают и измеряют на спектрофото­ метре изменение оптической плотности при длине волны 340 нм каждые 10 с в течение 3-5 мин. В контрольную пробу вместо меркаптоэтанола добавляют 0,5 мл фосфатного буфера. Показания снимают аналогичным спо­ собом. В опытном и контрольном вариантах определения прово­ дят не менее трех раз. Полученные данные используют для расче­ та скорости падения поглощения в течение определенного време­ ни на линейном участке кривой, т. е. А = АД It. Активность СОД определяют по ингибированию окисления НАДН(Н+) меркаптоэтанолом и выражают в единицах активности фермента на миллиграмм растворимого белка в супернатанте: активность СОД (ед./мг белка) = ((Aq/A*) • 100 %)/Сб, где Ао - АД Идля опытной пробы; Ак- АД It для контрольной пробы; Сб - содержание белка в пробе, мг. Количество растворимого белка в супернатанте определяют по Брэдфорду [8 ] или Шактерле [18]. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ Глутатионредуктаза (ГР, ЕС 1.6.4.2) является важным фер­ ментом антиоксидантной защиты растений. Она катализирует восстановление окисленного глутатиона при участии НАДФН(Н+) в глутатион-аскорбатном цикле. Пероксид водорода, возникающий при восстановлении супер­ оксид-радикала, разрушается в цитоплазме, хлоропластах и мем­ бранах глиоксисом с участием аскорбатпероксидазы. При этом происходит окисление аскорбата: 2Н2 0 2 + аскорбат —* дегидроаскорбат + 2Н20 + 0 2 Дегидроаскорбат восстанавливается аскорбатредукгазой с участием восстановленного глутатиона: 2Г-SH + дегидроаскорбат —►TS-Sr + аскорбат В свою очередь, окисленный глутатион (TS-Sr) регенериру­ ется глутатионредуктазой путем НАДФН(Н+)-зависимого восста­ новления: TS-Sr + НАДФН + Н* -►2r-SH + НАДФ+ Восстановленный глутатион участвует в нейтрализации ак­ тивных форм кислорода и в обезвреживании вторичных метабо­ литов окислительного обмена. Он не только регулирует окисли­ тельно-восстановительный баланс в клетке, но и выполняет сиг­ нальную роль в экспрессии генома. В основе приведенной методики определения активности глутатионредуктазы лежит метод Foyer, Holliwell [12,15]. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Среду выделения готовят на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4 (см. табл. 1 ). На 25 мл буфера: - поливинилпирролидон (М 103) - 0,5 г (2 %-й р-р); - Na-ЭДГА (трилон Б; М 372) - 9,3 мг (25 мкМ). Реакционную среду готовят на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4. Одна проба реакционной среды (1,8 мл буфера) содержит: - MgCl2 (6H2 0 ) (М 203) - 1,65 мг ( 8 мкМ); - глутатион окисленный (М 612,6) - 0,8 мг (1,3 мкМ); - НАДФН(Н+) - 1,5 мг на 1 мл буфера (готовят отдельно не­ посредственно перед опытом из расчета 1 мл реактива на пробу). Оборудование 1. Мерные пробирки объемом 10 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Центрифуга (рефрижераторная). 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8 . Охлаждающее устройство или жидкий азот. 9. Водяная баня. 10. Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 11 . Спектрофотометр. Ход работы Выделение фермента Растительный материал (0,6 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством (1,5-2 мл) 0,1 М фосфатного буфера pH 7,4 и с добавлением стеклянного песка. Гомогенат пе­ реносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку небольшим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем использованного бу­ фера составляет 4 мл. Гомогенат центрифугируют в течение 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант переносят в чистую, сухую про­ бирку, помещенную в стакан со льдом, для предотвращения потери активности. Его используют как фермент при проведении реак­ ции. В таком виде супернатант при необходимости хранят в хо­ лодильнике не более 2 ч. Проведение реакции Активность фермента оценивают по скорости окисления НАДФЩГГ) в реакции rS -S r + НАДФН + ЬС —►2Г-БН + НАДФ+ Определения проводят в кюветах для СФ при температуре 30 °С. Все растворы хранят в термостатированной ванне. В кювету (объемом 3 мл) приливают 1,8 мл раствора MgCl2 (6 H2 0 ) и TS-Sr, а также 1 мл раствора НАДФН(Н+). Реакцию запускают добавле­ нием 0,2 мл супернатанта. Смесь быстро встряхивают и измеряют на спектрофотометре изменение оптической плотности при длине волны 340 нм каждые 10 с в течение 2-3 мин. В контрольную пробу вместо супернатанта добавляют равный объем буфера. Показания снимают аналогичным способом. В опыт­ ном и контрольном вариантах определения проводят трехкратно. Полученные данные используют для расчета скорости падения максимума поглощения в интервале времени, соответствующем линейному участку кривой, при длине волны 340 нм (tg = АД/0Для перехода от тригонометрической функции (тангенса) к абсо­ лютным единицам активности фермента, выраженным в микро­ молях НАДФН(Н*) на миллиграмм белка в минуту, используют формулу активность ГР = (tg0 - tgK) • Ѵп/(6 , 2 2 • Сб), где ГР - глутатионредуктаза; tgo- АДIt для опытной пробы; tg* - АДIt для контрольной пробы; Ѵ„ - общий объем пробы (3 мл); 6,22 - коэффициент экстинции НАДФН(Н+), мКГ'см-1; Се - содержание белка в пробе, мг. Количество растворимого белка в супернатанте определяют по Брэдфорду [8 ] или Шактерле [18]. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГВАЯКОЛ-ПЕРОКСИДАЗЫ К пероксидазам (КФ 1.11.17) относят группу ферментов, ис­ пользующих в качестве окислителя пероксид водорода: НАДН-пероксидазу, НАДФН-пероксидазу, глутатион-пероксидазу, гваяколпероксидазу, аскорбат-пероксидазу и др. Все они работают по схеме АН2 + Н2 0 2 —►А + 2Н20 Пероксид водорода является одной из активных форм кисло­ рода, повреждающей многие важные системы клетки (мембраны, электрон-транспортные цепи, ферменты и т. д.). При избытке пе­ роксида водорода нейтрализация его в клетке осуществляется че­ рез путь Asada - Halliwell с участием ферментов аскорбат-пероксидазы, дегидроаскорбат-редуктазы и глутатион-редуктазы. Обнаружено, что пероксидазы обеспечивают нормальный ход окислительных процессов при различного рода неблагоприятных воздействиях на растение, например, под воздействием патоген­ ных агентов, тяжелых металлов и др. Активность пероксидазы можно определять с использовани­ ем различных субстратов: аскорбата, глутатиона, гваякола и др. В представленной методике использован гваякол. Активность оценивали по скорости полимеризации гваякола до тетрагваякола, сопровождаемой увеличением оптической плотности реакцион­ ной среды при Д4 7 0 . За основу принят метод Chance, Maehly [10] с некоторыми изменениями. Реактивы и оборудование Приготовление буферного раствора Для работы необходимо приготовить 0,1 М фосфатный буфер pH 6 ,8-7,0 (см. табл. 1). Приготовление реактивов Реакционную среду готовят на 0,1 М фосфатном буфере pH 6 ,8-7,0. На 50 мл буфера: - пероксид водорода (Н2 О2 , 33 %-й) - 51,5 мкл; - гваякол - 50 мкл. Оборудование 1. Мерные пробирки объемом 10 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Центрифуга (рефрижераторная). 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8 . Охлаждающее устройство или жидкий азот. 9. Водяная баня. 10. Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 11. Спектрофотометр. Ход работы Выделение фермента Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством (1,5-2 мл) 0,1 М фосфат­ ного буфера pH 6 ,0-7,0 и с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку не­ большим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем использо­ ванного буфера составляет 5 мл. Гомогенат центрифугируют в те­ чение 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант переносят в чистую, сухую пробирку, помещенную в стакан со льдом, для предотвра­ щения потери активности. Его используют в качестве фермента. В таком виде супернатант при необходимости хранят в холо­ дильнике не более 2 ч. Проведение реакции Активность пероксидазы определяют в кюветах для СФ при температуре 30 °С. Все растворы хранят в термостатированной ванне. В кювету (объем 3 мл) приливают 3 мл реакционной сре­ ды. Реакцию запускают добавлением 0,05 мл супернатанта. Смесь быстро встряхивают и измеряют на спектрофотометре изменение оптической плотности при длине волны 470 нм каждые 10 с в те­ чение 2-3 мин. В контрольную пробу вместо супернатанта добавляют рав­ ный объем буфера. Показания снимают аналогичным способом. В опытном и контрольном вариантах определения проводят трех­ кратно. Полученные данные используют для расчета скорости падения максимума поглощения в интервале времени, соответст­ вующем линейному участку кривой, при длине волны 470 нм (tg = АД//). Для перехода от тригонометрической функции (тан­ генса) к абсолютным единицам активности фермента используют формулу АП = (tgo - tgK) • F„/(26,6 • Сб), где АП - активность пероксидазы, мкМ гваякола/мг белка мин; tgo - АД // для опытной пробы; tgK- АД // для контрольной пробы; Ѵ„- объем реакционной среды в пробе (3,05 мл); 26,6 - коэффициент экстинции гваякола, мМ~‘см_1; С6 - содержание белка в пробе, мг. Количество растворимого белка в супернатанте определяют по Брэдфорду [8 ] или Шактерле [16]. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСКОРБАТПЕРОКСИДАЗЫ В представленной методике использован метод определения активности аскорбатпероксидазы по модифицированному методу Nakano, Asada [16], основанному на регистрации снижения опти­ ческой плотности раствора при окислении аскорбата. Реактивы и оборудование Приготовление буферного раствора Для работы необходимо приготовить 50 мМ фосфатного бу­ фера pH 7,0 (см. табл. 1). Приготовление реактивов На дистиллированной воде готовят: а) аскорбиновую кислоту (М 176) - 2 2 мг на 50 мл; б) пероксид водорода (М 36) - 11 мкл 30 %-го пероксида на 100 мл (1 мМ); в) Na-ЭДТА (трилон Б; М 372) - 7,31 мг на 50 мл (0,5 мМ). Оборудование 1. Мерные пробирки объемом 10 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Центрифуга (рефрижераторная). 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8. Охлаждающее устройство или жидкий азот. 9. Водяная баня. 10. Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 11. Спектрофотометр. Ход работы Выделение фермента Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством (1,5-2 мл) 50 мМ фос­ фатного буфера pH 7,0 и с добавлением стеклянного песка. Гомо­ генат переносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку небольшим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем использо­ ванного буфера составляет 5 мл. Гомогенат центрифугируют в те­ чение 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант переносят в чистую, сухую пробирку, помещенную в стакан со льдом, для предотвра­ щения потери активности. Его используют в качестве фермента. В таком виде супернатант при необходимости хранят в холодиль­ нике не более 2 ч. Проведение реакции Активность пероксидазы определяют в кюветах для СФ при температуре 30 °С. Все растворы хранят в термостатированной ванне. В кювету (объем 3 мл) приливают 1,5 мл фосфатного бу­ фера, 0,5 мл раствора аскорбиновой кислоты, 0,5 мл раствора пе­ роксида водорода, 0,1 мл раствора Na-ЭДТА. Реакцию запускают добавлением 0,4 мл супернатанта. Смесь быстро встряхивают и измеряют на спектрофотометре изменение оптической плотности при длине волны 290 нм каждые 1 0 с в течение 2-3 мин. Контрольная проба содержит: 1,5 мл фосфатного буфера; 1 мл дистиллированной воды; 0,4 мл экстракта; 0,3 мл Na-ЭДТА. Показания снимают аналогичным способом. В опытном и кон­ трольном вариантах определения проводят трехкратно. Получен­ ные данные используют для расчета скорости падения максимума поглощения в интервале времени, соответствующем линейному участку кривой, при длине волны 290 нм (tg = АД/0- Для перехода от тригонометрической функции (тангенса) к абсолютным едини­ цам активности фермента используют формулу АП = (tgo - tglt) • F„/(2,8 • Сб), где АП - активность пероксидазы, мкМ аскорбата/мг белка мин; tgo - АД// для опытной пробы; tgK- АДIt для контрольной пробы; Va- объем реакционной среды в пробе (3 мл); 2,8 - коэффициент экстинции аскорбата, мМ ’см'1; Сб - содержание белка в пробе, мг. Количество растворимого белка в супернатанте определяют по Брэдфорду [8 ] или Шактерле [18]. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ Каталаза (КФ 1.11.16) широко распространена в раститель­ ных тканях. Она обнаружена во всех аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов. Подобно пероксидазе и цитохромоксидазе каталаза относится к Fe-порфириновым фер­ ментам. Сущность каталитического действия каталазы состоит в раз­ ложении пероксида водорода с выделением молекулярного кисло­ рода. Реакция с участием каталазы требует двух молекул перок­ сида водорода, из которых одна действует как донор, а другая как акцептор электронов. Механизм каталитической реакции можно представить следующим образом: 2Н2 0 2 2Н20 + 0 2 FeOH + НООН FeOOH + Н20 FeOOH + НООН -+ FeOH + Н20 + 0 2 Пероксид водорода, образующийся в обменных реакциях, в известных концентрациях для клетки токсичен, в связи с чем нельзя недооценивать роль катапазы, активирующей процесс раз­ ложения пероксида водорода с образованием воды и неактивного кислорода. За основу определения активности каталазы принят метод Aebi [4] с некоторыми изменениями. Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Среда выделения представляет 0,1 М фосфатный буфер pH 6 ,8-7,0 (см. табл. 1). 6 Реакционную среду готовят на 0,1 М фосфатном буфере pH ,8-7,0. На 50 мл буфера: - пероксид водорода (Н 2О2 , 33 %-й) - 30 мкл. Оборудование 1 . Мерные пробирки объемом 10 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Центрифуга (рефрижераторная). 6 . Стеклянный песок для гомогенизации проб. 7. Гомогенизатор или фарфоровые ступки. 8 . Охлаждающее устройство или жидкий азот. 9. Кюветы кварцевые объемом 3 мл. 10. Спектрофотометр. Ход работы Выделение фермента Растительный материал (0,5 г сырых листьев) растирают на льду в ступке с небольшим количеством (1,5-2 мл) 0,1 М фосфат­ ного буфера pH 6 ,8-7,0 и с добавлением стеклянного песка. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку, обмывая ступку не­ большим (0,5 мл) количеством буфера. Общий объем использован­ ного буфера составляет 5 мл. Гомогенат центрифугируют в тече­ ние 20 мин (15 000 g при 4 °С). Супернатант переносят в чистую пробирку, помещенную в стакан со льдом, для предотвращения потери активности. Его используют как фермент при проведении реакции. В таком виде супернатант при необходимости хранят в холодильнике не более 2 ч. Проведение реакции Активность каталазы определяют в кюветах для СФ при тем­ пературе 30 °С. Все растворы хранят в термостатированной ванне. В кювету (объем 3 мл) приливают 2,8 мл реакционной среды. Ре­ акцию запускают добавлением 0,2 мл супернатанта. Смесь быст­ ро встряхивают и измеряют на спектрофотометре изменение оп­ тической плотности при длине волны 240 нм каждые 10 с в тече­ ние 2-3 мин. В контрольную пробу вместо супернатанта добавляют рав­ ный объем буфера. Показания снимают аналогичным способом. В опытном и контрольном вариантах определения проводят трех­ кратно. Полученные данные используют для расчета скорости па­ дения максимума поглощения в интервале времени, соответствую­ щем линейному участку кривой, при длине волны 240 нм (tg = = АД//). Для перехода от тригонометрической функции (тангенса) к абсолютным единицам активности фермента используют формулу AK = (tg0 - t g K)- Ѵп/(0,036 С6), где АК - активность каталазы, мкМ Н2 0 2/мг белка • мин; tgo - ДД/f для опытной пробы; tgK- ДД/r для контрольной пробы; Ѵ„ - общий объем пробы (3 мл); 0,036 мМ“'см“' - коэффициент экстинции Н2 0 2; Се - содержание белка в пробе, мг. Количество растворимого белка в супернатанте определяют по Брэдфорду [8 ] или Шактерле [18]. Активность каталазы можно рассчитать и другим способом, также через Дд^, приняв, что изменение Д ^ на одну единицу со­ ответствует 25 мкМ Н2 0 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРИМОГО БЕЛКА ПО БРЭДФОРДУ [8] Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Реактив Кумасси (Coomassi Brilliant Blue) - 100 мг Кумасси бриллиантовый синий растворяют в 50 мл 96 %-го раствора эта­ нола. Добавляют 100 мл 85 %-го раствора фосфорной кислоты. Реактив размешивают с использованием магнитной мешалки до полного растворения и разбавляют Н2 Одист до 1 л. Орто-фосфорная кислота (конц. 85 %). Свежий раствор альбумина (для калибровочного графика): 10 мг альбумина растворяют в 100 мл Н2 Олист. Хранят в холо­ дильнике не более 3 дней. Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл. 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 5. Спектрофотометр. Ход работы Перед проведением реакции супернатант, содержащий белок, разбавляют в 20-30 раз. Опытная проба: - разбавленный супернатант - 1 мл; - реактив Кумасси - 3 мл. Контрольная проба: НзОдист 1 мл, - реактив Кумасси - 3 мл. Не ранее, чем через 5 мин, и не позднее, чем через 1 ч, изме­ ряют поглощение на СФ при длине волны 595 нм против кон­ трольной пробы. Содержание белка в супернатанте рассчитывают, используя калибровочный график. Для его построения необходим раствор альбумина ( 1 0 0 мкг/мл), разбавленный до концентраций: 80; 60; 40; 20; 10; 5 мкг/мл. Окрашивание разных концентраций белка (альбумина) проводят по той же схеме, что и опытных белков. При расчете белков на 1 мл исходного супернатанта или 1 мг су­ хого веса листьев необходимо учитывать разбавление, которое производят перед определением количества белков. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРИМОГО И МЕМБРАННО-СВЯЗАННОГО БЕЛКА ПО ШАКТЕРЛЕ [18] Реактивы и оборудование Приготовление реактивов Медно-щелочной реактив. В 100 мл воды растворяют (обяза­ тельно в указанной последовательности): - CuSO4 (5H2 0) (M 250) - 80 мг (0,32 мМ); - K-Na-виннокислый (сегнетова соль; М 282) - 100 мг (0,35 мМ); - Na2 C 0 3 (М 106) - 10,0 г (94 мМ); - NaOH (М 40) - 2,0 г (50 мМ). Раствор хранится в холодильнике не более 5 дней. Рабочий раст вор реакт ива Ф олина : 0,1 н реактив Фолина разбавляют в 4 раза (1:3). Свежий раст вор альбумина (для калибровочного графика): 10 мг альбумина растворяют в 100 мл Н2 Од„ст. Хранят в холо­ дильнике не более 3 дней. Оборудование 1. Стеклянные пробирки объемом 10-15 мл (для проведения реакции). 2. Штативы. 3. Пипетки (дозаторы). 4. Секундомер (таймер). 5. Водяная баня. 6 . Кюветы стеклянные объемом 3 мл. 7. Спектрофотометр. Ход работы Перед проведением реакции супернатант растворимой и мем­ бранно-связанной фракции разбавляют в 25 раз. Опытная проба: - разбавленный супернатант - 1 мл; - медно-щелочной реактив - 1 мл. Контрольная проба: - Н2 Од„ст - 1 мл; - медно-щелочной реактив - 1 мл. После 15-минутного выдерживания при комнатной темпера­ туре в опытную и контрольную пробы добавляют по 4 мл рабоче­ го раствора реактива Фолина, пробирки помещают на водяную баню при 55 °С на 5 мин. Развитие окраски останавливают, по­ гружая пробирки в холодную воду (10 °С). Оптическую плотность опытной пробы измеряют против контрольной на СФ при длине волны 650 нм. Содержание белка в супернатанте рассчитывают, используя калибровочный график. Для его построения необходим раствор альбумина ( 1 0 0 мкг/мл), разбавленный до концентраций: 80; 60; 40; 20; 10; 5 мкг/мл. Окрашивание разных концентраций белка (альбумина) проводят по той же схеме, что и окрашивание опыт­ ных белков. При расчете белков на 1 мл исходного супернатанта или на 1 мг сухого веса листьев необходимо учитывать разбавле­ ние, которое производят перед определением количества белков. Список библиографических ссылок 1. Муравьева Д. А., Бубенчикова В. H., Беликов В. В. Спектро­ фотометрическое определение суммы антоцианов в цветках ва­ силька синего // Фармакология. 1987. Т. 36. С. 28-29. 2. Рогожин В. В. Практикум по биологической химии : учеб.метод. пособие. СПб.: Изд-во «Лань», 2006. 3. Чупахина Г. Н. Физиологические и биохимические методы анализа растений. Калининград : Изд-во Калинингр. ун-та, 2000. 4. Aebi H. Catalases // Methods of Enzymatic Analysis. 1971. Vol. 3. P. 273-286. 5. Bates L. S. Rapid determination of free proline for water stress studies // Plant Soil. 1973. Vol. 39. P. 205-207. 6 . Beauchamp C., Fridovich L. Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels // Anal. Biochem. 1971. Vol. 44. P. 276-287. 7. Bellincampi D., Dipierro N., Salvi G., Cervone F., De Loren­ zo G. Extracellular H2 0 2 induced by oligogalacturonidcs is not in­ volved in the inhibition of the auxin-regulated rolB gene expression in tobacco leaf explants // Plant Physiology. 2000. Vol. 122. P. 1379-1385. 8 . Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quanti­ tation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding// Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254. 9. Chaitanya K. S. K., Naithani S. C. Role of superoxide lipid per­ oxidation and superoxidc dismutation in membrane perturbation dur­ ing loss of viability in seeds of Shorea robusta Gaertn f. // New Phytol. 1994. Vol. 126. P. 623-627. 10. Chance B., Maehly A. C. Assay catalase and peroxidase. Methods in Enzymology. N. Y .: Academic Press, 1955. P. 764-775. 11. Ellman G. L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. P. 70-77. 12. Foyer C. H., Holliwell B. The presence of glutathione and glutathion reductase in cloroplasts: a proposed role in ascorbic acid me­ tabolism/ / Planta. 1976. Vol. 13. P. 21-25. 13. Health R. L, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. 1968. Vol. 125. P. 189-198. 14. Hewitt E. J., Dickes G. J. Spectrophotometric Measurements on ascorbic acid and their use for the estimation of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in plant tissuer // The Biochemical J. 1961. Vol. 78, Nr 2. P. 384-391. 15. Nagalakshmi N.. Prasad M. N. V. Responses of glutathione cycle enzymes and glutathione metabolism to copper stress in Scenedesmus bijugatus // Plant Sei. 2001. Vol. 160. P. 291-299. 16. Nakano Y., Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts // Plant Cell Physiol. 1981. Vol. 22. P. 867-880 17. Paoletti F., Macali A. Determination of superoxide dismutase activity by purely chemical system based on NAD(P)H oxidation // Methods Enzymol. 1990. Vol. 186. P. 209-220. 18. Shakterle T. R. A simplified method for the quantities assay of small amounts of protein in biological material // Analytical Bioch. 1973. Vol. 51, Nr 2. P. 654-655. 19. WolffS. Ferrous ion oxidation in presence of ferric ion indica­ tor xylenol orange for measurement of hydroperoxides // Methods En­ zymol. 1994. Vol. 233. P. 182-189. 20. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Anal. Biochem. 1978. Vol. 8 6 . P. 287-297. От составителей................................................................................................ 3 Раздел 1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЙ............... 4 Вопросы для самоконтроля ........................................................................ 15 Список рекомендуемой литературы ........................................................... 17 Раздел 2. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ............................................ 18 Определение перекисного окисления липидов........................................ 18 Определение супероксидного аниона......................................................... 22 Определение пероксида водорода................................................................24 Определение содержания водорастворимых антиоксидантов ................26 Определение аскорбиновой кислоты.......................................................... 29 Определение аскорбиновой кислоты и восстановленного глута­ тиона ......................................................................................................31 Определение флавоноидов ........................................................................... 35 Определение антоцианов ...............................................................................38 Определение свободного пролина ...............................................................40 Определение SH-групп с реактивом Элмана .............................................43 Определение активности супероксидцисмутазы...................................... 48 Определение активности глутатионредуктазы..........................................53 Определение активности гваякол-нероксидазы.........................................56 Определение активности аскорбатпероксидазы ........................................59 Определение активности каталазы ..............................................................61 Определение растворимого белка по Брэдфорду......................................63 Определение растворимого и мембранно-связанного белка по Ш актерле.............................................................................................. 64 Список библиографических ссылок ............................................................67 МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА РАСТЕНИЙ Учебно-методическое пособие Составители: Борисова Галина Григорьевна Малева Мария Георгиевна Некрасова Галина Федоровна Чукина Надежда Владимировна Зав. редакцией М. А. Овечкина Редактор В. И. Попова Корректор В. И. Попова Оригинал-макет Н. П. Сорокиной План выпуска 2012 г. Подписано в печать 25.09.2012. Формат 60x84Ѵ16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Уч.-изд. л. 3,9. Уел. печ. л. 4,18. Тираж 80 экз. Заказ 1388, Издательство Уральского университета 620000, г. Екатеринбург, пр. Ленина, 51. Отпечатано в ИПЦ УрФУ 620000, Екатеринбург, ул. Тургенева, 4. Тел.: + (343) 350-56-64, 350-90-13 Факс: +7 (343) 358-93-06 E-mail: [email protected] Для зам ет ок
