ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ Блок 1. Систематика и таксономическое положение бактерий, вирусов, грибов. Морфология бактерий, вирусов. Виды микроскопических исследований. Простые и сложные методы окраски. В Российской Федерации принята классификация патогенных для человека микроорганизмов, согласно которой патогенные биологические агенты (ПБА) по степени биологической опасности разделены на четыре группы: I группа – возбудители особо опасных инфекционных болезней. II группа – возбудители высоко контагиозных эпидемических заболеваний человека. III группа – возбудители инфекционных болезней. IV группа – патогенные микроорганизмы, оппортунистических инфекций. относящиеся к возбудителям Основные нормативно-методические документы по организации и проведению лабораторной диагностики инфекционных болезней с целью соблюдения биологической безопасности при работе с ПБА: · СП «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)». · Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». · Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок выдачи санитарноэпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I–IV групп патогенности (опасности), генноинженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами»; · Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I–IV групп патогенности»; · Методические указания «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами I–IV групп патогенности». · Методические указания по лабораторной диагностике соответствующих нозологий. Правила работы в микробиологической лаборатории Рекомендуется: · С инфицированным материалом работать только с помощью инструментов (пинцетов, петель, корцангов и др.) · Перед работой тщательно проверять целостность стеклянной посуды, проходимость игл и надежность поршней шприцев · При посеве материала делать надпись на пробирках, чашках Петри, колбах, флаконах с названием номера анализа (даты и времени его забора) и даты посева · В пробирки и чашки Петри материал высевать вблизи от огня горелки с обжиганием петли, шпателя, краев пробирки · Во время работы все чашки с посевами помещать в кюветы или на подносы, пробирки – в штативы · Растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, набирать пипеткой с помощью резинового баллона · Центрифугирование инфекционного материала проводить специально обученному персоналу · Термостаты и термостатные комнаты, предназначенные для выращивания патогенных микроорганизмов, дезинфицировать не реже одного раза в месяц · Оттаивание холодильника, предусмотренное совмещать с его дезинфекцией правилами эксплуатации нужно · Переносить материал из одной лаборатории в другую на территории учреждения нужно в специально приспособленной посуде (металлических биксах, ящиках, баках) · В лаборатории должна быть обязательно укомплектованная аптечка для экстренной медицинской помощи, включающая этиловый спирт, настойку йода, перевязочные средства, набор необходимых антибиотиков Запрещается: · Прикасаться руками к исследуемому материалу и конденсату, в засеянных чашках Петри · Насасывать ртом и переливать растворы из сосуда в сосуд · По окончании работы оставлять на рабочих столах нефиксированные мазки, чашки Петри, пробирки и другую посуду с инфицированным материалом · В комнатах, предназначенных для работы с инфекционным материалом проводить другие работы, выращивать цветы, держать домашних животных, принимать пищу, пить, курить, хранить продукты питания Таблица 1 Таксономические категории, применяемые при классификации микробов Таксономические категории Домен (Domain) Царство (Kingdom) Тип (Phylum) Класс (Class) Порядок (Order) Семейство (Femily) Род (Genus) Вид (Spesies) Подвид (Subspesies) Пример для Пример для бактерий Пример для грибов вирусов Bacteria Vira Proteobacteria Gammaprotobacteria Thiotrichales Francisellaceae Francisella Francisella tularensis Eukarya Fungi (Eumycota) Ascomycota Archiascomycetes Mononegavirales Rhabdoviridae Lyssavirus Pneumocystidales Pneumocystis Pneumocystis Rabies virus jiroveci F. tularensis subsp.tularensis Домен Bacteria включает 23 типа, из которых медицинское значение имеют нижеизложенные. Грамотрицательные бактерии тип Proteobacteria. Тип Proteobacteria подразделен на 5 классов: • Класс Alphaproteobacteria (роды Rickettsia, Orientia, Erlichia, Bartonella, Brucella) • Класс Betaproteobacteria (роды Вordetellа, Burholderia, Neisseria, Spirillum) • Класс Gammaproteobacteria (представители семейства Enterobacteriaceae, роды Francisella, Legionella, Coxiella, Pseudomonas, Vibrio) • Класс Deltaproteobacteria (род Bilophila) • Класс Epsilonproteobacteria (роды Campilobacter, Helicobacter). Грамотрицательные бактерии входят также в следующие типы: тип Chlamydiae (роды Chlamydia, Chlamydophila) тип Spirochaetes (роды Spirocheta, Borrelia, Treponema, Leptospira) тип Bacteroides (роды Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas). Грамположительные бактерии входят в следующие типы: Тип Firmicutes включает · класс Clostridium (роды Clostridium, Peptococcus), · класс Bacilli (Listeria, Staphylococcus, Lactobacillus, Streptococcus). · класс Mollicutes (роды Mycoplasma, Ureaplasma), которые являются бактериями, не имеющими клеточную стенку; Тип Actinobacteria (роды Actinomyces, Micrococcus, Corynebacterium, Bifidobacterium, Propionibacterium, Mobiluncus). Mycobacterium, Gardnerella, Морфология микробов По форме бактерии могут быть: палочкивидные, кокковидные, нитевидные, извитые (рис. 1). Рис. 1. Формы и расположение бактериальных клеток Основным признаком прокариотической клетки (эубактерий и архебактерий) является отсутствие еще оформленного ядра, а есть лишь его предшественник – нуклеотид (табл. 2). Таблица 2 Основные признаки прокариотической и эукариотической клеток Прокариоты (эубактерии и архебактерии) Эукариоты Рибосомы Рибосомы Нет оформленного ядра, а лишь – нуклеоид Ядро Нет ядрышка Ядрышко Клеточная стенка содержит пептидогликан Нет пептидогликана Нет митохондрий или хлоропластов Митохондрии или хлоропласты Аэробные или анаэробные микроорганизмы Аэробы Обязательными компонентами бактериальной клетки являются: цитоплазматическая мембрана, окружающая цитоплазму, в которой содержаться рибосомы и нуклеотид (рис. 2). Рис. 2. Строение бактериальной клетки Дополнительными компонентами бактериальной клетки являются: капсулы, жгутики, пили, споры, включения. По строению и способности усваивать красители бактериальные клетки подразделены на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Грамположительные бактерии имеют толстую клеточную стенку, основным компонентом которой является пептидогликан. С пептидогликаном клеточной стенки ковалентно связаны тейхоевые кислоты, а с цитоплазматической мембраной гидрофобно связаны липотейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии имеют тонкую клеточную стенку, в состав которой входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном расположен липополисахарид. Белки матрикса (порины) пронизывают ее, образуя гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы (рис. 3). Рис. 3. Строение клеточной стенки и цитоплазматической мембраны грамположительных и грамотрицательных бактерий (https://www.studentlibrary.ru/book/ISBN9785970427989.html) При изучении химического состава, строения и роли капсулы и споры определяется, что: Капсулы – это наружный верхний слизистый слой клетки различной толщины фибриллярной или глобулярной структуры. Она состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов. Капсула выполняет защитную функцию, предохраняя клетку от высыхания, а в организме хозяина – от фагоцитоза. Споры (эндоспоры) – покоящиеся формы некоторых видов грамположительных бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды (характерно для бацилл и клостридий). Под действием внешних физических факторов бактерии могут превращаться в протопласты, сферопласты, L-формы бактерий и микоплазмы. Протопласты – бактерии, полностью лишенные клеточной стенки. Сферопласты – бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. L-формы – бактерии сферопластного или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов. Микоплазмы – мелкие (0,3–0,8 мкм) бактерии, не имеющие клеточной стенки, а только цитоплазматическую мембрану, в состав которой входят стеролы. Лауреат Нобелевской премии Д. Балтимор предложил систему балтиморской классификации, основанной на механизме синтеза мРНК. Эта классификация размещает вирусы в 7 группах. Таблица 3 Классификация вирусов, основанная на механизме синтеза мРНК Семейство/ Репликация генома Представители подсемейство ферменты Группа I: ДНК (двунитиевые) вирусы Вирусы натуральной Вирусная ДНКПоксвирусы оспы, вакцины, оспы зависимая обезъян, ДНКконтагиозного (Poxviridae) полимераза моллюска Вирусы герпеса Вирусная ДНКГерпесвирусы (типы 1, 2, 5, 6, 7, 8), зависимая Эпштейна-Барр, ДНК(Herpesviridae) ветряной оспы полимераза Вирусная ДНКАденовирусы Аденовирусы зависимая человека ДНК(Adenoviridae) полимераза Клеточная Папилломавирусы ДНКПапилломавирусы зависимая человека ДНК(Papillomaviridae) полимераза Клеточная Полиомавирусы ДНКПолиомавирусы зависимая человека ДНК(Polyomaviridae) полимераза Группа II: ДНК (однонтиевые) вирусы Парвовирусы Парвовирус Клеточная человека В19 ДНК- локализация Цитоплазма Ядро Ядро Ядро Ядро Ядро зависимая ДНКполимераза Клеточная ТТ-вирус (TTV), ДНКРод Anellovirus зависимая ДНКSEN-вирус, TLMV полимераза Группа III: РНК (двунитиевые) вирусы Вирусы Кемерово, колорадской Вирионная клещевой РНК-зависимая Реовирусы (Reoviridae) лихорадки, РНКротавирусы полимераза человека Группа IV: РНК (плюс-однонтиевые) вирусы Вирусы полиомиелита, Вирусная РНКПикорнавирусы Коксаки А и В, зависимая ЕСНО, гепатита А, РНК(Picornaviridae) риновирусы полимераза человека Вирусная РНКНоровирусы, вирусы зависимая Калицивирусы (Caliciviridae) гастроэнтерита РНКгруппы Норволк полимераза Вирусная РНКзависимая Гепевирусы (Hepeviridae) Вирус гепатита Е РНКполимераза Вирусная РНККоронавирусы зависимая Коронавирусы (Coronaviridae) человека РНКполимераза Вирусы желтой Вирусная РНКлихорадки, зависимая Флавивирусы (Flaviviridae) клещевого РНКэнцефалита, полимераза гепатита С Вирусы краснухи, Вирусная РНКкарельской зависимая Тогавирусы (Togaviridae) лихорадки, РНКэнцефаломиелита полимераза Группа V: РНК (минус-однонтиевые) вирусы Вирионная Борнавирусы Вирус болезни РНК-зависимая Борна РНК(Bornaviridae) полимераза Вирусы Марбург, Вирионная Филовирусы ((Filoviridae) Эбола РНК-зависимая (Parvoviridae) Ядро Цитоплазма Цитоплазма Цитоплазма Цитоплазма Цитоплазма Цитоплазма Цитоплазма Ядро Цитоплазма РНКполимераза Вирусы кори, Вирионная парагриппа, РНК-зависимая Парамиксовирусы (Paramixoviridae) эпидемического РНКпаротита, РС полимераза Вирионная Вирусы бешенства, РНК-зависимая Рабдовирусы (Rhabdoviridae) везикулярного РНКстоматита полимераза Вирионная Ортомиксовирусы Influenzavirus РНК-зависимая РНК(Ortomyxoviridae) A, B, C полимераза Вирусы Хантааи, Вирионная Буньявирусы Крым-Конго РНК-зависимая геморрагической РНК(Bunyviridae) лихорадки полимераза РНКРод Deltavirus Вирус гепатита D полимераза Вирионная Вирусы ЛХМ, РНК-зависимая Аренавирусы (Arenaviridae) Ласса, Гуанарито, РНКХунин и Мачупо полимераза Группа VI: РНК вирусы (обратнотранскрибирующиеся) Вирус Вирионная Ретровирусы (Retroviridae) иммунодефицита ревертаза человека Группа VII: ДНК вирусы (обратнотранскрибирующиеся) Гепадновирусы Вирионная ревертаза Вирус гепратита В (Hepadnoviridae) Цитоплазма Цитоплазма Ядро Цитоплазма Ядро Цитоплазма Ядро / цитоплазма Ядро / цитоплазма Таблица 4 Роль микроорганизмов полости рта Положительная Отрицательная Способствуют перевариванию пищи, Продуцируют органические кислоты, синтезу витаминов способствующие развитию кариеса зубов Обеспечивают накопление в биопленке зуба Оказывают мощное модулирующее адъювантов и иммуносупрессорных агентов, воздействие на иммунную систему оказывающих токсическое воздействие на ткани организма десны и перидонт Являются сильнейшими Сами способны к инвазии и дессиминации с антагонистами патогенной последующим развитием серьезных заболеваний микрофлоры Важнейшие принципы современной классификации микроорганизмов полости рта: · Морфологический · Биохимический · Хемотаксономический · Серологический · Молекулярно-генетический Морфологический принцип – основан на изучении морфологии микроорганизмов, позволяющий изучить формы бактерий – кокки, палочковидные, извитые, дифференциальные признаки по строению бактериальной стенки (грамположительные и грамотрицательные бактерии), определение споровых форм (бацилл и клостридий) при окрашивании по Ожешко, по Бурри-Гинсу – выявление капсулы. Принцип является одним из важнейших в ориентировочной классификации. Биохимический принцип – основан на определении типа дыхания бактерий и аэротолерантности (устойчивости к О2), а также способности продуцировать каталазу, пероксидазу, супероксиддисмутазу и др. ферменты. Хемотаксономический принцип – основан на определении ферментативной активности бактерий (хемовар - биохимические свойства бактерий). Характерный для семейства, рода, а иногда и вида, определяется по спектру. Серологический принцип – основан на определении сероваров (серотипов), т.е. на антигенных свойствах бактерий. Молекулярно-генетический принцип основан на сопоставлении видоспецифических последовательностей гена 16S РНК. В настоящее время известно более 125 тыс. бактериальных последовательностей 16S-последовательностей ДНК. Созданы базы данных GenBank Ribosomal и Database Project, в которых с помощью поисковой системы BLAST (процесс поиска назван «бластинг») по ДНК-последовательности гена 16S можно идентифицировать неизвестные бактерии. Классификация и номенклатура бактерий совершенствуется и официальное признание бактерий, основанное на изучении культуральных свойств, считается состоявшимся при публикации в специальном международном журнале International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Облигатно-анаэробные бактерии микробиоценоза полости рта Морфология Окрашивание по Граму Хемотаксономия Род Peptostreptococcus Плохо ферментируют углеводы Peptococcus Peptoniphilus Грам+ Micromonas Кокки, не образуют спор Грам– Грам+ Активно ферментируют углеводы Продуцируют уксусную и пропионовую кислоты Продуцируют уксусную и масляную кислоты Плохо ферментируют углеводы Продуцируют пропионовую кислоту Riminicoccus Veilonella Acidaminococcus Dialister Actinomices Eubacterium Propionibacterium Bifidobacterium Активно ферментируют углеводы Палочки, не образуют спор Грам– Продуцируют только молочную кислоту Продуцируют преимущественно масляную кислоту Продуцируют разнообразные жирные кислоты Палочки, образуют споры Грам+ Lactobacillus Leptotrichia Fusobacterium Bacteroides Porphyromonas Prevotella Tannerella Активно ферментируют углеводы Clostridium Микроскопический метод диагностики относится к одному из основных методов и предполагает изучение морфологии микробов с использованием специальной микроскопической техники. Виды микроскопических исследований в стоматологии · Фазово-контрастная, или темнопольная · Световая микроскопия иммерсионным объективом · Иммунофлуоресцентная · Сканирующая Фазово-контрастная, или темнопольная Применяется для дифференциации жгутиковых и извитых (спиралевидных) форм микроорганизмов. Позволяет различить морфотипы подвижных и неподвижных микроорганизмов. Позволяет сразу в присутствии пациента оценить состояние воспалительного процесса. Инвертированные микроскопы дают возможность изучать структурные особенности и архитектонику биопленок, взятых с разных поверхностей полости рта. Световая микроскопия иммерсионным объективом Проводится с фиксированными препаратами или в мазках из чистых культур. Мазки окрашивают по: · Граму (для выявления Грам+ и Грам– бактерий) · Цилю-Нильсену (для выявления кислотоустойчивых бактерий) · Ожешко (для выявления спор) · Нейссеру (для выявления включений) · Бурри-Гинсу (для выявления капсулы) Позволяет длифференцировать на Грам+ и Грам– бактерии. Бактероиды, превотеллы, порфиромонады и актинобациллы – Грам– палочки. Вейлонеллы – Грам– кокки. Лактобактерии, бифидобактерии, эубактерии, актиномицеты и пропионабактерии – Грам+ плеоморфные палочки. Пептококки и пептострептококки – Грам+ кокки. Не позволяет идентифицировать бактерии. Иммунофлуоресцентная Применяется очень редко. Предполагает использование антител, соединенных с флуорохромом (АТ получают путем иммунизации животных соответствующими бактериями). Флуоресцентная гибридизация in situ Позволяет визуализировать бактерии с помощью флуоресцирующих олигонуклеотидных зондов (16S рРНК). Проводят на предметных стеклах или в микроскопических лунках с просмотром монослоя клеток под люминесцентным микроскопом. Сканирующая Дает представление о связях между многочисленными группами микроорганизмов в биопленке. Позволяет использовать ряд видоспецифичных зондов, каждый из которых помечен флуорохромами разного по цвету свечения. Позволяет на компьютере воссоздать трехмерное изображение материала. Изучают биопленки с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Этапы приготовления мазка из бактериальной культуры, выращенной на скошенном МПА 1. На предметное стекло нанести каплю физ. раствора. 2. Прокалить бактериологическую петлю в пламени горелки, охладить, прикоснувшись к внутренней поверхности пробирки. 3. Набрать петлей питательной среды. небольшое количество микробной массы с поверхности 4. Диспергировать микроорганизмы в капле физ. раствора, приготовить мазок – распределить микробную взвесь по предметному стеклу. 5. Просушить мазок в потоке горячего воздуха и зафиксировать – три раза медленно пронеся через пламя горелки. 6. Проконтролировать качество фиксации, прикоснувшись к тыльной поверхности кисти. Простые и сложные способы окраски мазков для микроскопической диагностики Простые способы окраски мазков позволяют определить форму микроорганизмов и их расположение. При этом применяется одна краска – водный фуксин (1–2 мин) или метиленовый синий (3–5 мин). Сложные способы окрашивания предполагают последовательное нескольких красителей различного химического состава. применение При сложных способах окрашивания возможно выявление различных структур бактериальной клетки: · Окраска спор по методу Ожешко · Окраска включений волютина по Нейссеру · Окраска по Граму-Синеву химическому составу) (различное строение бактериальной клетки по · Обнаружение капсул по методу Бури · Окраска по Романовскому-Гимзе (позволяет бактериальных клеток и гранулы волютина) выявить ядерные элементы Окраска бактерий по Граму-Синеву, механизм и практическое значение Грамположительные бактерии при окрашивании приобретают темно-фиолетовый цвет (у бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов). В результате окрашивания образуется прочный химический комплекс с генцианвиолетом и йодом, не разрушающийся при кратковременном действии спирта. Грамотрицательные бактерии легко обесцвечиваются действием спирта и в ходе дополнительной окраски фуксином они принимают красный цвет. Метод окрашивания по Граму-Синеву 1. На фиксированный мазок нанести генцианвиолетом (окрашивание 2–5 мин). фильтровальную бумагу, пропитанную 2. Бумагу удалить бактериологической петлей. 3. Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин). 4. Раствор Люголя слить и нанести на мазок несколько капель 96% спирта на 30–40 с, осторожно покачивая стекло. 5. Спирт смыть тщательно водой. 6. Окрасить водным фуксином (2 мин); 7. Промыть водой и высушить между слоями фильтровальной бумаги. Окраска бактерий по Цилю-Нильсену, механизм и практическое значение Микобактерии туберкулеза устойчивы к кислотам, спиртам и щелочам. Они плохо окрашиваются обычными красками (это связано с наличием в клеточной стенке и цитоплазме большого количества липидов – воскоподобных веществ). Их окрашивают по методу Циля-Нильсена концентрированными растворами красок с подогревом. Метод позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Выявление спор и капсулы у бактерий Анаэробные бактерии могут образовывать внутриклеточные (эндогенные) споры, которые отличаются от вегетативной части клетки меньшим количеством воды и высоким содержанием липидов и кальция. Окрашивают споры по Граму (спора остается бесцветной), по методу Ожешко или Цилю-Нильсену (споры окрашиваются в красный, а вегетативные формы – синий). Для улучшения проницаемости оболочки споры по методу Ожешко или Цилю-Нильсену используют концентрированный раствор краски с подогревом или горячую соляную кислоту. Некоторые бактерии образуют капсулу, в состав которой входят полисахариды, а у некоторых и полипептиды. Так как капсулы имеют консистенцию геля, то для их обнаружения применяют негативную окраску (краситель заполняет пространство вокруг бактерий, а капсулы выглядят светлыми частицами на темном фоне). Капсулы окрашивают по методу Бурри, Бурри-Гинсу или Романовскому-Гимзе. Блок 2. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Асептика и антисептика. Методы стерилизации и дезинфекции. Д. Листер основал учение об антисептике, а его современники под антисептикой понимали меры по уничтожению возбудителей воспалительного процесса с помощью химических веществ в ране, во всех объектах внешней и внутренней среды, соприкасающихся с раной. В настоящее время под антисептикой подразумевается применение антимикробных веществ на интактных и поврежденных поверхностях кожи и слизистых оболочках с целью предупреждения развития инфекционных заболеваний. Применение же антимикробных веществ, для микробной деконтаминации объектов внешней среды, с целью предупреждения развития инфекционных заболеваний рассматривают как дезинфекцию. На микроорганизмы могут оказывать влияние физические, химические и биологические факторы (рис. 4 ). Рис. 4. Факторы, влияющие на микроорганизмы В грунте и воде на выживание патогенных микроорганизмов действуют биологические факторы – микробы-антагонисты, продуценты антибиотических веществ, бактериофаги и другие элементы экосистемы. Природные антибиотики действуют на бактерии бактериоцидно или бактериостатически. Бактериофаги литически (разрушающе) действуют на бактерии. Понятие об асептике и антисептике Асептика – это комплекс профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания микроорганизмов и их спор в рану, ткани больного при хирургических операциях, операциях и т.д. Антисептика – это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в ране, а также на предупреждение или ликвидацию инфекционного процесса. Для антисептики применяют растворы кислородсодержащих препаратов на основе перекисных соединений или перекиси водорода, спирты и другие вещества с дезинфицирующими свойствами. Антисептические средства – это лекарственные препараты, применяемые для уничтожения возбудителей инфекционных заболеваний наружно на поверхности тела. Разделение антисептиков по химическому строению традиционно и наиболее удобно (табл. 4 ). Таблица 4 Группы химических антисептиков Группы антисептиков Детергенты (поверхностноактивные вещества) Спирты Окислители Хлорсодержащие соединения Антисептические средства Анионные: щелочные мыла, сульфанол Катионные: дегмин Гуанидины: хлоргексидин 70% этанол (Этиловый спирт) 70% изопропиловый спирт Пероксид водорода Перманганат калия Хлорамин Гипохлорид натрия Действие на бактериальную клетку Вызывают необратимые повреждения клеточной стенки микроорганизмов, изменение проницаемости мембран Вызывают коагуляцию белков бактериальной клетки Вызывают нарушения ферментативных систем клетки Вызывают повреждения белков 3-5% спиртовый р-р йода Йодофоры: Йодсодержащие препараты Йодинол (йод+(калия йодид +поливиниловый спирт)) Йодонат (йод+(калия йодид +алкилсульфонат+фосфорная кислота) Вызывают коагуляцию белков бактериальной клетки Препараты серебра Красители Серебра протеинат (Протаргол) Серебро коллоидное (Колларгол) Бриллиантовый зеленый Метиленовый синий Вызывают коагуляцию клеточных белков Взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, нарушая их функции Дезинфекция Дезинфекция (от лат. infectia – инфекция и франц. отрицательной приставки des) – это мероприятия, направленные на полное обеспложивание микроорганизма на объектах окружающей среды с помощью химических веществ. Дезинфицирующие средства – это лекарственные препараты, применяемые для уничтожения возбудителей инфекционных заболеваний во внешней среде (табл. 5). Таблица 5 Группы дезинфицирующих средств Если дезинфекции подвергаются изделия медицинского назначения – эндоскопы, катетеры и т. д., то после окончания дезинфекции они обязательно должны быть промыты водой от дезинфектанта. Виды дезинфекции Текущая дезинфекция – проводят постоянно в виде влажной ежедневной или генеральной уборки помещений. Плановая дезинфекция – проводят систематически для уменьшения микробной обсемененности и предотвращения распространения микроорганизмов. Заключительная дезинфекция – проводят однократно. Методы дезинфекции Физический метод сводится к механической очистке объектов (орошение, мытье, чистка, вытряхивание и выколачивание, влажная уборка, вентиляция помещений). Он не позволяет достигнуть полного обеззараживания обрабатываемых объектов. Однако физические способы дезинфекции приводят к значительному уменьшению числа патогенных микроорганизмов во внешней среде. В микробиологической практике широкое применение нашли способы химической дезинфекции (рук, рабочего места, отработанного патологического материала, градуированных и пастеровских пипеток, стеклянных шпателей, стекол). Стерилизация – полное уничтожение всех микроорганизмов и их спор с помощью физических, химических и механических способов. Методы стерилизации 1. Термический А. Паровой · Нагревание насыщенным паром под 119–121°С (1,0–1,1 атм) в течение 8–15 мин) давлением в автоклаве (при · Однократное нагревание текучим паром в паровом стерилизаторе или автоклаве (при 100°С в течение 30–60 мин) · Тиндализация – нагревание в воде (при 60–65°С в течение 1 ч 5 раз) Б. Воздушный · Нагревание горячим воздухом в сушильном шкафу или подобных ему аппаратах (при 180°С в течение 20–60 мин) 2. Стерилизация фильтрованием Бактериальная фильтрация в асептических условиях через микропористые фильтры с диаметром пор 1–2 мкм – фильтр Зейтца. 3. Химический (газовый и стерилизация растворами) Для растворов термолабильных веществ предусмотрено добавление 0,5% фенола или 0,3% трикрезола или хлорбутанолгидрата и нагревание при 80°С не менее 30 мин. 4. Лучевая стерилизация (ультрафиолетовыми лучами, γ-лучами или нейтронами) Блок 3. Выделение чистой культуры аэробных бактерий. Питание, дыхание, размножение бактерий. Классификация питательных сред. Изучение культуральных и биохимических свойств бактерий. Таблица 6 Этапы бактериологического метода исследования Характеристика процессов роста и размножения у бактерий. Фазы развития бактериальной популяции Фазы роста бактерий: · Лаг-фаза · Фаза положительного ускорения · Фаза логарифмического роста · Фаза отрицательного ускорения · Стационарная фаза · Фаза ускоренной гибели · Фаза логарифмической гибели · Фаза уменьшения скорости гибели Изучение метаболизма патогенных и условно-патогенных бактерий необходимо для лучшего понимания патогенеза инфекционных болезней, а также для диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Типы метаболизма бактерий I. Окислительный, или дыхание. II. Бродильный, или ферментативный. III. Смешанный. I. Дыхание – процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования. Классификация бактерий По отношению к молекулярному кислороду: Облигатные аэробы – растут и размножаются только в присутствии кислорода. Облигатные анаэробы не используют метаболизма – бродильный). кислород для получения энергии (тип Подразделяются на 2 группы: строгие анаэробы – молекулярный кислород для них токсичен (энергию получают маслянокислым брожением); аэротолерантные микроорганизмы могут существовать в присутствие кислорода, но не используют его для получения энергии. Факультативные анаэробы – растут и размножаются как в присутствии кислорода, так и при его отсутствии. В зависимости от усвояемого углерода: Аутотрофы – для построения клеток используют неорганический углерод в виде СО2. Гетеротрофы – используют органический углерод: сапрофиты – питаются мертвым органическим материалом и независимы от других организмов; паразиты – гетеротрофные микроорганизмы, зависимые в получении питательных веществ от макроорганизма: – облигатные паразиты – полностью лишены возможности жить вне клеток организма; – факультативные паразиты – могут жить и без хозяина и размножаться как сапрофиты. По способам получения энергии: Фототрофы – источник энергии – свет. Хемотрофы – энергию получают за счет окислительно-восстановительных реакций: литотрофы – способны использовать неорганические доноры электронов (H2, NH3, H2S, Fe2+ и др.); органотрофы – доноры электронов – органические соединения. При конструктивном метаболизме органические компоненты бактерий синтезируются в реакциях полимеризации из: аминокислот, фосфатов, сахаров, пуриновых и пиримидиновых оснований, органических кислот. Среди бактерий выделяют следующие группы: Прототрофы – синтезируют все компоненты клетки из одного источника углерода и энергии. Ауксотрофы – бактерии, которым необходимы факторы роста. Таблица 7 Классификация ферментов бактерий Ферменты бактерий Их характеристика Конститутивные синтезируются в течение всего клеточного цикла Индуцибельные их синтез индуцируется соответствующим субстратом Репрессибельные синтез ферментов прекращается из-за избыточного накопления продукта реакции Эндоферменты образуются бактериальной клеткой и находятся внутри клетки Экзоферменты (гиалуронидаза, коллагеназа и др.) выделяются в окружающую среду, некоторые ферменты находятся в периплазматическом пространстве бактериальной клетки Питательные среды необходимы для диагностике инфекционных заболеваний. культивирования микроорганизмов при По происхождению питательные среды могут быть – искусственные и естественные; по консистенции – плотные, полужидкие, жидкие; по составу – белковые, безбелковые, минеральные; по назначению – простые, специальные или элективные, селективные, дифференциально-диагностические. Для качественной диагностики инфекционных подобрать соответствующую питательную среду. заболеваний важно правильно Основные требования, предъявляемые к питательным средам: · Должны содержать воду. · Для гетероорганотрофных бактерий необходим органический источник углерода и энергии. · Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и др. минеральные вещества, в т.ч. микроэлементы. · Необходима определенная рh среды. · Должно быть определенное осмотическое давление. · Должны быть стерильными. Классификация питательных сред по назначению 1. Универсальные (базовые) – среды, на которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий (МПА, МПБ). 2. Специальные – среды, специально приготовленные для получения роста тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах (кровяной МПА, Левенштейна-Йенсена, Мак-Коя-Чепика). 3. Элективные (син. селективные, избирательные) – среды, содержащие химические вещества, используемые микроорганизмами одного вида и не благоприятствующие росту других (Мюллера, селенитовая, Рапопорт, 1% пептонная вода, ЖСА). 4. Дифференциально-диагностические – среды, позволяющие отличить одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфит агар). 5. Накопления (обогащения) – среды, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов. В них добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон) для повышения питательной ценности среды (Мюллера, селенитовая, Рапопорт, 1% пептонная вода и др.). 6. Консервирующие – среды, предназначенные для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Они содержат добавки для предупреждения размножения и гибели микроорганизмов (глицериновая смесь (среда Тига), гипертонический раствор, фосфатно-буферная смесь). Блок 4. Этапы взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой. Типы взаимодействия. Культивирование вирусов на культуре клеток и курином эмбрионе Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты, не имеющие клеточного строения, собственного аппарата синтеза биополимеров. Проникая в клетку, вирус эксплуатирует ее. Зараженная клетка начинает функционировать не по программе собственного, а по программе вирусного генома, т.е. отличается паразитизмом на генетическом уровне. Формы существования вирусов: • Вирион (вирусная частица) – внеклеточная, покоящаяся, не проявляющая свойств живого форма вируса, выполняющая функцию переноса его генома из одной клетки в другую. • Вегетативная (внутриклеточная, репродуктивная) форма. • Провирус – форма интеграции (встраивания) вирусного генома с геномом клетки хозяина, при которой репродукции вируса не происходит. Типы взаимодействия вируса с восприимчивой клеткой: • продуктивный тип – репродукция завершается образованием вирусного потомства; • абортивный тип – новые вирусные частицы не образуются, так как инфекционный процесс прерывается на одном из этапов; • интегрированный тип (вирогения) – встраивание вирусной ДНК в геном клетки хозяина. Репродукция вирусов В цикле репродукции любого вируса можно выделить несколько стадий, которые будут иметь особенности у различных вирусов. Используется схема репродукции парамиксовирусов (сложный вирус с однонитевой отрицательной РНК): 1. Адсорбция – специфическое связывание вирионных белков с клеточными рецепторами. Необратимая адсорбция наступает при установлении множественных связей. 2. Проникновение вируса в клетку посредством одного из двух механизмов: слияния суперкапсида с мембраной клетки либо эндоцитоза с образованием внутриклеточной вакуоли. Слияние обеспечивается белками капсида или суперкапсида. 3. Раздевание (депротеинизация) вирионов – освобождение нуклеиновой кислоты от капсида при помощи вирусных или клеточных ферментов. 4. Сборка вирусных частиц происходит самопроизвольно благодаря «узнаванию» белками и нуклеиновыми кислотами друг друга путем нековалентных взаимодействий (гидрофобных, водородных, ионных), местами окончательной сборки являются мембраны ЭПС и комплекса Гольджи; полностью созревают на этом этапе только простые вирусы. 5. Выход вирионов из клетки происходит у простых вирусов путем накопления большого их числа и «взрыва» клеточной мембраны с гибелью клетки. У сложных – путем почкования, в процессе которого вирус приобретает суперкапсид (за счет участка клеточной мембраны), а также М-белок и гликопротеиновые шипы/нити, которые «ожидают» нуклеокапсид сложного вируса у мембраны; клетка при этом обычно не гибнет. Инфицирование клетки вирусом может иметь следующие последствия: • Разрушение клетки (некроз) в результате цитоцидной инфекции, т.е. репродукция вируса приводит к цитоцидному действию (в культуре клеток происходит цитопатический эффект – клетки округляются, отделяются от соседних клеток, образуются многоядерные гигантские клетки, вакуоли и включения). • Разрушение клетки (апоптоз) в результате инициации вирусом програмированной клеточной гибели, при этом вирусный репликативный цикл часто прерывается. • Разрушение клетки в итоге не самим вирусом, а иммунными реакциями организма. • Вирус находится внутри клетки, но не разрушает ее (латентная инфекция). • Вирус трансформирует клетку организма в раковую клетку. Присутствие вируса в исследуемом материале определяют с помощью методов индикации и идентификации. Вирусы культивируют в куриных эмбрионах (КЭ), культурах клеток (КК) и в лабораторных животных. Этот метод является длительным, трудоемким и затратным, но в то же время считается «золотым стандартом» диагностики. Универсальной тестсистемой для культивирования вирусов является культура клеток. Индикация вирусов, т.е. неспецифическое обнаружение факта инфицирования, основано на выявлении биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками. Идентификация означает установление вида или типа вируса. Она осуществляется в основном с помощью иммунных реакций или молекулярногенетических методов (ПЦР и др.). Моделью культивирования вирусов являются куриные эмбрионы (5-12-дневные), которых заражают исследуемым материалом в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Свидетельством репродукции вирусов в куриных эмбрионах являются специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), гибель эмбриона, положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, полученной из полостей зараженного зародыша. Часто вирусы культивируют на культуре клеток. Метод культур клеток был впервые разработан в 1949 г. Дж. Эндерсом и соавт., получившими за разработку техники культивирования вируса полиомиелита Нобелевскую премию в 1954 г. Культуру клеток выращивают с соблюдением оптимальной температуры (36–38,5°С) роста клеток и асептических условий в специальной лабораторной посуде (пробирки, флаконы, матрасы) или в реакторах для получения биотехнологической продукции. При этом используют сложную питательную среду Игла, среду 199 и другие среды, содержащие необходимые для роста клеток аминокислоты, минеральные соли, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные растворы для поддержания стабильного рН. Для подавления роста посторонней микрофлоры в среды для культивирования клеток добавляют антибиотики. Различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток. Клетки однослойной культуры клеток прикрепляются и размножаются на поверхности лабораторной посуды в виде монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии. Клетки суспензионных культур клеток размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или вращающегося барабана. Метод применяют для получения большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин. Органные культуры применяются ограниченно. Они представляют собой цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие при культивировании исходную структуру. По свойствам жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: · Первичные культуры клеток размножаются только в первых генерациях, т.е. выдерживают не более 5–10 пассажей после выделения из тканей. Их получают при обработке кусочков тканей (эмбриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, которые разрушают межклеточные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток. · Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т.е. выдерживают многочисленные пассажи. Их получают преимущественно из опухолевых или эмбриональных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культурами: продолжительность их культивирования, высокая скорость размножения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном состоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злокачественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клетками в процессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида культур, в частности их нельзя применять в производстве вирусных вакцин. · Полуперививаемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40–50 пассажей. Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, характерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественную трансформацию. Поэтому полуперививаемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин. О репродукции вирусов в культуре клеток, зараженных материалом, можно судить на основании следующих феноменов: вируссодержащим • цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, или цитопатического эффекта (ЦПЭ), • образования внутриклеточных включений, • образования бляшек, • реакций гемадсорбции и гемагглютинации; цветной реакции. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ. ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Открыто с: Среда, 13 марта 2024, 18:16 Закрывается: Понедельник, 25 марта 2024, 23:59 Отметить как выполненный К настоящему времени Вы заработали баллов: 0 из 0 возможных. Блок 1. Антагонизм бактерий. Антибиотики. Методы определения чувствительности к антибиотикам (диско-диффузионный метод, метод серийных разведений, Е-тест). Определение маркеров резистентности. Бактериофаги (применение для диагностики, профилактики, лечения). Впервые термин «антибиотики» (от др.-греч. ἀντί «против» βίος «жизнь») ввел в 1942 г. С. Ваксман. Под антибиотиками следует понимать химические вещества, образуемые микроорганизмами, которые обладают способностью подавлять рост или даже разрушать бактерии и другие микроорганизмы. Это вещества природного происхождения, обладающие выраженной биологической активностью. Они могут быть получены из микробов, растений, животных тканей и синтетическим путём. Требования, которым должны отвечать химиопрепараты: Минимальная органотропность – минимальное токсическое действие на органы, ткани, организм больного. Максимальная этиотропность – высокое токсическое действие на возбудителя инфекционной болезни. Этиоспецифичность – способность определённых химиопрепаратов действовать избирательно на определённый вид возбудителя инфекционного заболевания. Классификация антибиотиков По биологическому происхождению: · Антибиотики, образуемые эубактериями (грамицидины, полимиксины) · Антибиотики, образуемые микроорганизмами рода Streptomyces (стрептомицин, новобиоцин, тетрациклины, актиномицины) · Антибиотики, образуемые совершенными грибами (пенициллин, гризеофульвин, цефалоспорин) · Антибиотики, левомицетин) образуемые актиномицетами (аминогликозиды, макролиды, · Антибиотики, образуемые растениями (фитонциды) · Антибиотики животного происхождения (лизоцим, интерферон, экмолин) По механизму ингибирующего действия на микробную клетку: · Антибиотики, ингибирующие синтез клеточной стенки (пенициллины, ванкомицин, цефалоскорины, карбонемы) · Антибиотики, нарушающие функционирование цитоплазматической (грамицидины, нистатин, альбомицины, трихомицин, полимиксины) мембраны · Антибиотики, избирательно подавляющие синтез (обмен нуклеиновых кислот) (гризеофульвин, канамицин, неомицин, новобиоцин) · Антибиотики, подавляющие синтез белка на рибосомах (макролиды, азитромицины, левомицетин, неомицин, канамицин) · Антибиотики – ингибиторы дыхания (антимицины, патулин, пиоцианин) Антибиотики оказывают на бактерии в основном бактериостатическое действие, особенно в терапевтических дозах. Бактерицидное действие характерно для пенициллинов и аминогликозидных антибиотиков. По химическому составу: · Азотосодержащие, гетероциклические, имеющие В-лактамное кольцо (пенициллины, цефалоспорины) · Ароматические (левомицетин) соединения, производные · Тетрациклины, содержащие четыре цикла (тетрациклин и его производные) диоксиаминофенил конденсированных пропана шестичленных · Аминогликозидные соединения (стрептомицин, мономицин, гентамицин и др.); макролиды, содержащие макроциклическое лактамное кольцо, связанное с аминосахарами (эритромицин, олеандомицин, рифамицины) · Ациклические соединения с несколькими сопряженными двойными связями – (CH=CH) – (полиеновые соединения – нистатин, леворин) Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам Диско-диффузный метод: 1. Берут чашку Петри с предварительно налитым мясопептонным агаром. 2. Подбирают флаконы с дисками, пропитанными разными антибиотиками. 3. Приготавливают пробирку с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой питательной среде, и стерильную пастеровскую пипетку с грушей. 4. Наливают взвесь микроорганизмов в количестве 1°мл в чашку Петри с МПА. 5. Распределяют равномерно культуру микроорганизмов по всей поверхности среды путем покачивания чашки (посев «газоном»). 6. Отбирают пастеровской пипеткой избыток жидкости (обязательно пользоваться резиновой грушей!). 7. Закрывают и отставляют на 5–10°мин чашку Петри для просушивания поверхности среды. 8. Располагают стерильным пинцетом 5 бумажных дисков, пропитанных разными антибиотиками, на поверхности засеянной питательной среды (на равном расстоянии один от другого и на расстоянии 2 см от края) 9. Закрывают чашку Петри, подписывают и помещают в термостат (t = 37 °C) на сутки. 10. Учитывают результат через 18–24°ч путем измерений линейкой диаметров зон задержки роста микробов вокруг бумажных дисков (включая и диаметр самого бумажного диска) с точностью до 1°мм. Интерпретация размеров зон задержки роста согласно международной системе CLSI (рис. 1) Рис. 1. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (дисков и серийных разведений) Метод серийных разведений Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений позволяет определять минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост изучаемого микроорганизма. Для разведения антибиотиков служат стандартные питательные среды (МПБ), бульон на переваре Хоттингера (РН 7,2–7,4). В приготовленные разведения антибиотиков вносят бульонные культуры микроорганизмов в логарифмической или ранней стандартной фазе роста (16–18 ч) в объеме 1 мл в каждое разведение. При этом концентрация антибиотика в пробирке становится в 2 раза ниже. После внесения микробной культуры штатив с пробирками помещают в термостат при 37°C на 16–20 ч. Учитываются результаты, отмечая последнюю пробирку с отчетливо видимой задержкой микробного роста, где количество антибиотика представляет собой минимальную ингибирующую (действующую) концентрацию для испытуемого штамма и определяет степень чувствительности его к данному антибиотику. В настоящее время разработан и производится ряд типов автоматических установок, предназначенных для определения чувствительности микробов к антибиотикам, таких как МIC-2000 фирмы «Dynatek Laboratories», «Autobac-1» фирмы «Pfizer», «MS-2» (США), «Difer-ential III», «Cobas Bact» фирмы «Roche», «Avantage» фирмы «Abbott Laboratories» и др. В основе этих приборов лежат лазерная техника, фотометрия, микроколориметрия и другие методические приемы. Деление микроорганизмов на устойчивые и чувствительные осуществляется на основании соотношения минимальной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации препарата (определенной в лабораторных условиях) и концентрации этого же препарата, создаваемой в очаге инфекции при введении терапевтических доз. При соотношении: МИК (минимальная ингибирующая концентрация) / К (концентрация препарата в очаге инфекции) <1,0 можно говорить о чувствительности возбудителя к исследуемому антибиотику. По степени чувствительности к антибиотикам патогенные микроорганизмы подразделяются на: 1. Чувствительные (терапевтические дозы). 2. Средне чувствительные (повышенные дозы антибиотиков). 3. Умеренно устойчивые (введение антибиотиков в очаг инфекции). 4. Устойчивые (нет лечебного эффекта). Лекарственная устойчивость бактерий 1. Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком. Она присуща всем представителям данного вида и не зависит от первичного контакта с данным антибиотиком, в ее основе нет никаких специфических механизмов, чаще всего, эта резистентность связана с недостаточностью мишеней для данного антибиотика, обусловленной очень слабой проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Если низкая проницаемость существует к нескольким антибиотикам, она будет обуславливать полирезистентность таких бактерий. 2. Приобретенная устойчивость возникает в результате мутаций в хромосомных генах, контролирующих синтез компонентов клеточной стенки, ЦПМ, рибосомальных или транспортных белков. Чаще всего приобретенная устойчивость возникает в результате переноса R-плазмиды, контролирующей множественную устойчивость бактерий к двум, трем и более антибиотикам. Бактериофагия Что же характерно для фага, какова его природа? Это группа вирусов, которые имеют одну особенность – размножаться в бактериальной клетке. Классификация фагов: 1. По химическому строению РНК, ДНК. 2. По морфологическим признакам: · Ниткообразные бактериофаги · Фаги, имеющие аналоги отростков · Фаги, имеющие короткий отросток · Фаги с длинным не сокращающимся отростком · Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен сокращаться Морфология бактериофагов С помощью электронного микроскопа удалось хорошо изучить морфологию фага. Морфология их исследовалась преимущественно на Т-фагах Escherichia coli. Фаги имеют головастикообразное или сперматозоидное строение. Фаг состоит из головки длиной 100 ммк и отростка или «хвоста», примерно такой же длины. Головка (с кубической симметрией) довольно ригидна и состоит из белковой оболочки и заключенного в ней генетического материала ДНК. Количество белка и ДНК примерно одинаково. Отросток фага имеет более сложное строение. В нем можно различить не менее 3 частей: полный стержень, окружающий его сократительный чехол и находящуюся на дистальном конце стержня базальную пластинку с шипами и нитями (от последних зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине). Антигенные свойства Фаги обладают различными антигенами – групповыми (для родственных) и типоспецифическими (строго специфическими для определенного вида или даже типа). По антигенным свойствам фаги разделяются на серологические типы: · Полифаги – лизируют родственные бактерии · Монофаги – лизируют бактерии одного вида · Типовые – лизируют только определенный тип одного вида Механизм взаимодействия фага с бактериями Подобно другим вирусам, фаги неподвижны. При смешивании суспензии свободных фагов с суспензией бактерий фаговые частицы в результате «случайных» столкновений с клетками прикрепляются к их поверхности. В клеточной стенке бактерий расположены рецепторные участки, на которых и адсорбируются соответствующие фаги. Клеточные рецепторы для различных фагов в химическом отношении оказываются неодинаковыми. Практическое применение фагов обусловлено их строгой специфичностью. Фаги используют для терапии, профилактики инфекционных заболеваний, а также при лабораторной диагностике (типовые наборы) для определения вида и типа микроорганизмов, источника инфекции и путей передачи. Блок 2. Учение об инфекции. Инфекционный процесс. Патогенность и вирулентность бактерий. Основные факторы патогенности. Инфекционный процесс – процесс динамического взаимодействия восприимчивого макроорганизма и патогенного (или условно-патогенного) микроорганизма в определенных условиях внешней (в том числе и социальной) среды, характеризующийся развитием комплекса типовых патологических реакций, системных функциональных нарушений, расстройств гормонального статуса, специфических иммунологических механизмов защиты и факторов неспецифической резистентности. Возникновение, течение и исход инфекционного процесса зависят от трех групп факторов: 1. Микроорганизм должен обладать способностью проникать через входные ворота (ткани со сниженной физиологической защитой против данного возбудителя), адгезировать и колонизировать чувствительные клетки и, как правило, проникать во внутреннюю среду макроорганизма. Размножившись, должен вызывать патологические реакции в организме хозяина своими продуктами метаболизма. Имеет значение и инфицирующая доза. 2. Восприимчивость макроорганизма зависит от возраста, пола человека, характера обмена веществ, наличия у него хронических заболеваний, состояния его защитных механизмов – факторов врожденного и адаптивного иммунитета. 3. Условия окружающей среды (географическое положение, температура, влажность, сезонность, климат, химическая загрязненность воздуха, воды и почвы, радиация), включая социальные условия жизни (санитарные, жилищные, характер питания), экстремальные ситуации (стихийные бедствия, катастрофы и др.), ведущие к миграции населения, скученности, снижению уровня жизни, влияют на развитие инфекционного процесса, оказывая воздействия на микро- и макроорганизмы. Инфекционные болезни особенностями: отличаются от других болезней некоторыми · Наличию определенного живого возбудителя. · Заразности, т. е. способности передаваться от больного к здоровому. · Четко выраженной стадийности: наличию определенного инкубационного периода и характерной последовательной смене периодов в течении болезни. · Наличию ряда общих клинических симптомов: лихорадки, общей интоксикации, вялости, адинамии и т.д. · Наличию иммунного ответа (невосприимчивости после перенесенного заболевания, развитию аллергии при наличии возбудителя в организме и др.). В развитии инфекционного процесса выделяют несколько стадий (рис.1). Рис. 8.1. Стадии инфекционного процесса Условия развития инфекции Инфицирующая (патогенная) доза – это минимальное количество микробных клеток, способных вызвать инфекционный процесс, определяемое в каждом конкретном случае видовой принадлежностью возбудителя, его вирулентностью и состоянием резистентности организма. Большое значение имеет не столько абсолютное число микробов, попавших в макроорганизм, сколько их плотность на единицу поверхности и наличие рецепторов у эукариотических клеток. Многих возбудителей отличает тропизм (от греч. τροπος – рост, направление) к определённым тканям. Ткани, лишенные физиологической защиты против конкретного вида микроорганизма, служат местом его проникновения в макроорганизм, или входными воротами инфекции. Проникнув в организм, возбудитель начинает размножаться в месте внедрения (формируя первичный аффект), либо диссеминирует в другие органы и ткани. Входные ворота определяют локализацию возбудителя в организме, патогенетические и клинические особенности заболевания. Патогенность – видовой признак, передающийся по наследству, закрепленный в геноме микроорганизма, в процессе эволюции паразита, т. е. это генотипический признак, отражающий потенциальную возможность микроорганизма проникать в макроорганизм (инфективность) и размножаться в нем (инвазионность), вызывать комплекс патологических процессов. Патогенность может быть по-разному выражена у различных штаммов. Фенотипическим признаком патогенного микроорганизма является его вирулентность, т.е. свойство микроба, которое проявляется в определенных условиях (при изменчивости микроорганизмов, изменении восприимчивости макроорганизма и т.д.). Вирулентность является мерой патогенности. Количественные показатели вирулентности могут быть выражены в DLM (минимальная летальная доза), DL 50 (доза, вызывающая гибель 50 % экспериментальных животных). При этом учитывают вид животных, пол, массу тела, способ заражения, срок гибели. Вирулентность может быть искусственно снижена, повышена, полностью утрачена. Аттенуация – процесс искусственного стойкого снижения вирулентности. Лежит в основе создания живых вакцин. Разработан Л. Пастером. К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности (колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факторам защиты организма (агрессия). Адгезия – способность адсорбироваться на определенных, чувствительных к данному микробу клетках макроорганизма с последующей колонизацией. Колонизация – способность закрепления и последующего размножения патогенных микроорганизмов в зоне инфицирования. Инвазивность – способность микробов проникать через слизистые, кожу, соединительно-тканные барьеры во внутреннюю среду организма и распространяться по его тканям и органам. Проникновение микроорганизма в клетку обеспечивается продукцией ферментов (напр., гиалуронидаза, нейраминидаза), а также факторов, подавляющих клеточную защиту (коагулаза, протеазы). Под агрессивностью понимают способность возбудителя противостоять защитным факторам макроорганизма. К факторам агрессии относятся: протеазы – ферменты, разрушающие иммуноглобулины; лецитиназа – фермент, действующий на фосфолипиды мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток. Важнейшее значение в вирулентности имеет способность микроорганизмов синтезировать токсины (яды). По биологическим свойствам бактериальные токсины делятся на экзотоксины и эндотоксины. Экзотоксины – иммуногенные белки с высоким молекулярным весом, продуцируемые как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями при их жизни: · Действуют в минимальных дозах · Служат единственным фактором вирулентности микроорганизма · Обладают свойствами ферментов и избирательным фармакологическим действием · Термолабильны · Обладают потенцированием Экзотоксины обладают высокой токсичностью и органотропностью. Например, столбнячный токсин поражает двигательные центры спинного мозга, а дифтерийный токсин – мышцу сердца, кору надпочечников и т. д. Сила действия токсинов: в 1 мл токсина Cl. tetani – 50–75×106 DLM для мышей; токсин Cl. botulinum – 220×106 DLM для мышей. Летальная доза экзотоксина ботулизма для человека – 0,3–3 мкг. Токсическое действие экзотоксинов снимается, если блокировать активный центр яда, воздействуя на него химическими и физическими факторами. При действии 0,4% формалина, выдерживании в условиях 39–40°С температуры в течение 3–4 нед экзотоксины утрачивают токсические свойства, но сохраняют антигенные. Такие препараты готовят как вакцинные, называют анатоксинами и применяют для профилактики заболевания столбняка, гангрены, ботулизма, дифтерии, а также используются в виде антигенов для иммунизации животных с целью получения антитоксических сывороток. Эндотоксины по своей химической структуре являются липополисахаридами, которые содержатся в клеточной стенке грамотрицательных бактерий и выделяются в окружающую среду только при лизисе бактерий. Эндотоксины не обладают специфичностью (проявления однотипны: обычно общие явления интоксикации – лихорадка, головная боль, нарушение кровообращения и т.д.), термостабильны, менее токсичны и иммуногенны, чем экзотоксины. При поступлении в организм больших доз эндотоксины угнетают фагоцитоз, функцию гранулоцитов и моноцитов, увеличивают проницаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки. Возможно развитие токсикосептического шока. Микробные липополисахариды разрушают лейкоциты крови, вызывают дегрануляцию тучных клеток с выделением вазодилататоров, активируют фактор Хагемана, что приводит к лейкопении, гипертермии, гипотонии, ацидозу, дессиминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВК). Эндотоксины стимулируют синтез интерферонов, активируют систему комплемента по классическому пути, обладают аллергическими свойствами. При введении небольших доз эндотоксина повышается резистентность организма, усиливается фагоцитоз, стимулируются В-лимфоциты. Сыворотка животного иммунизированного эндотоксином обладает слабой антитоксической активностью и не нейтрализует эндотоксин. Токсигенность измеряется в тех же единицах, в которых оценивается вирулентность, – DLM и LD 50. Для постановки проб подбирают животных, наиболее чувствительных к исследуемому токсину. Силу антитоксической сыворотки определяют по известному токсину с помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином (реакция флоккуляции). Для инфекционного заболевания характерны определенные стадии развития: 1. Инкубационный период – время, которое проходит с момента заражения до начала клинических проявлений болезни. Инкубационный период может колебаться от нескольких часов до нескольких месяцев и даже лет. 2. Продромальный период – время появления первых клинических симптомов общего характера, неспецифических для данного заболевания. 3. Период острых проявлений заболевания – разгар болезни. В это время проявляются типичные для данного заболевания симптомы. 4. Период реконвалесценции – период симптомов и клинического выздоровления. угасания и исчезновения типичных Исходом инфекционного заболевания, помимо выздоровления, могут быть переход в хроническую форму, инвалидность, летальный исход. Носительство – форма инфекционного процесса, при которой паразитирование возбудителей заразных болезней в организме человека и животного протекает без клинических проявлений и сопровождается выделением возбудителя в окружающую среду. Виды инфекций По длительности течения различают острые и хронические инфекции. Острые инфекции протекают короткое время, они могут переходить в хронические, которые состоят из периодов ремиссии и рецидивов. По проявлению наряду с клинически выраженными инфекционными болезнями, когда основные симптомы заболевания типичны и выявляются четко, часто возникают стертые, атипичные и бессимптомные формы инфекций. Наличие скрытой (латентной), инфекции имеет большое значение при изучении вирусных болезней. Возможна длительная персистенция без проявления симптомов заболевания и без выделения патогена в окружающую среду (вирус герпеса). Также могут быть медленные инфекции с длительным инкубационным периодом (несколько лет), с постепенным прогрессированием заболевания, поражением определённой системы органов и летальным исходом болезни. По происхождению, в зависимости от способа проникновения микроба в макроорганизм, инфекционные болезни могут быть экзогенными, когда заражение происходит из окружающей среды (дизентерия, холера, грипп, и др.), и эндогенные, возбудителями которых являются условно-патогенные микробы – представители нормальной микрофлоры. Разновидность эндогенной инфекции – аутоинфекция – развивается в результате переноса сочлена микробиоценоза в другой биотоп (напр., кишечная палочка попадает в кровь). По характеру локализации и путей распространения микроорганизмов различают инфекции очаговые и генерализованные. При генерализованной инфекции патоген распространяется по организму, преодолевая защитные барьеры кожи, соединительной ткани, лимфы, гематоэнцефалический барьер и др. Если возбудитель распространяется с током крови, но не размножается в ней, то такое явление называют бактериемией, вирусемией или фунгемией. Когда микроорганизмы размножаются и циркулируют в крови, возникает сепсис (от sepsis – гниение), а при образовании вторичных гнойных очагов во внутренних органах – септикопиемия. Циркуляция экзотоксина в крови называется токсинемией. По числу патогенов: · Если заболевание вызывается каким-то одним видом микроорганизмов, принято говорить о моноинфекции. · Если 2–3 видами – смешанной (микст) инфекции, которая, как правило, протекает более тяжело. Нередко основное инфекционное инфекцией, вызываемой другим микробом. заболевание осложняется вторичной Реинфекция – повторное заражение тем же видом микроба после выздоровления. Суперинфекция – новое заражение тем же возбудителем при наличии еще не окончившегося заболевания. Рецидив – возврат клинических проявлений болезни без повторного заражения за счет оставшихся в организме возбудителей. Эколого-эпидемиологическое разделение всех инфекционных болезней человека должно учитывать среду обитания (резервуар) возбудителя в природе. Существуют 3 главные специфические среды обитания: организм человека (антропонозы), организм животного (зоонозы), внешняя среда (сапронозы). При антропонозах человек – единственный резервуар возбудителя в природе и источник заражения. При более детальной классификации антропонозов придерживаются общепринятого деления на кишечные, кровяные, респираторные, инфекции наружных покровов и вертикальные (от матери плоду) инфекции. При зоонозах основным резервуаром возбудителя в природе служат животные, преимущественно млекопитающие и членистоногие. Именно они обеспечивают существование возбудителя как биологического вида и вызывают эпизодическое заражение человека. Зоонозы делятся на эколого-эпидемиологические группы: болезни домашних (сельскохозяйственных, пушных) и синантропных (в основном грызуны) животных, а также болезни диких животных. Зооантропонозы – заболевания, при которых источником являются животное и больной человек, в том числе трупы умерших (чума, сибирская язва, туберкулез, риккетсиозы). При сапронозах основной резервуар возбудителя – субстраты внешней среды (почва, вода и др.), которые способны сами по себе обеспечить устойчивое его существование в природе. Сапропозоонозы – болезни, возбудители которых, помимо сапрофитического существования, ведут паразитический образ жизни в организме животных. Эта группа инфекций экологически близка к зоонозам, отличаясь, однако, возможностью длительного автономного обитания возбудителей во внешней среде. Заражение человека возможно, как от почвы, воды, растительных субстратов, так и от животных. Механизм передачи возбудителя Существует шесть основных механизмов передачи возбудителя инфекции: · Аэрогенный (аэрозольный) · Контактный · Трансмиссивный · Фекально-оральный (алиментарный) · Вертикальный (в том числе трансплацентарный) · Гемоконтактный При аэрогенном механизме передачи инфекции возбудители локализуются в слизистой оболочке дыхательных путей инфицированного организма и переносятся в макроорганизм через воздух. Реализуется 2 путями передачи: · Воздушно-капельным (при кашле, чихании и т. п.) · Воздушно-пылевым (возбудитель попадает в макроорганизм с частицами пыли, например возбудитель туберкулеза) При контактном механизме передачи инфекции возбудители выделяются на коже и её придатках, на слизистой оболочке глаз, полости рта, половых органов, на поверхности ран, поступают с них на поверхность различных предметов и при контакте с ними восприимчивого человека (чаще при наличии микротравм) внедряются в его организм. Пути реализации: · Прямой (рукопожатия, объятия, поглаживания и т. п., то есть контакт с источником инфекции) · Непрямой или опосредованный (через предметы обихода, бытовую технику, игрушки, посуду, столовые приборы, дверные ручки, предметы гигиены и т.п.) Трансмиссивный механизм передачи осуществляется при посредстве насекомых. Подразделяется на: · Инокуляционный (при укусе возбудитель вводится со слюной) · Контаминационный (при втирании в поврежденную кожу фекалий переносчика) пути передачи. При фекально-оральном механизме передачи инфекции возбудитель локализуется преимущественно в желудочно-кишечном тракте, определяет его выведение из зараженного организма с испражнениями (фекалиями, мочой) или рвотными массами. Проникновение в восприимчивый организм происходит через рот. Реализуется 3 путями: · Водным · Алиментарным (или пищевым) · Контактно-бытовым (в основном у детей, при непосредственном сосании и облизывании пальцев, игрушек и т. д.) Вертикальный механизм передачи инфекции – механизм, при котором передача возбудителя происходит от матери к плоду во время прохождения им родовых путей. При трансплацентарном (внутриутробном) пути передачи инфекции возбудитель передается от матери к плоду во время беременности. Гемоконтактный механизм передачи инфекции обусловлен контактом с кровью зараженного человека. Подразделяется на: · Естественный (вертикальный, половой, непрямой) · Искусственный, связанный инъекциями, татуажем с медицинскими манипуляциями, внутривенными Понятие о патогенных, сапрофитных и условно-патогенных микробах По степени патогенности для макроорганизма человека, животного или растения микробы делятся на три группы: патогенные, сапрофиты и условно-патогенные. Патогенные (от греч. pathos – страдание и genos – рождение) микробы – это возбудители инфекционных болезней человека, животных и растений. Существование их в макроорганизме является необходимым условием сохранения микроба как биологического вида, несмотря на то, что они могут определенное время находиться вне макроорганизма. Сапрофиты (от греч. sapros – гнилой и phyton – растение) – непатогенные микробы, питающиеся мертвыми тканями растений и животных или продуктами их жизнедеятельности. Они не зависят от макроорганизма, им нужны лишь готовые органические вещества. Некоторые микробы, например, возбудитель сибирской язвы, ботулизма и столбняка, находясь в почве, ведут себя как сапрофиты. Патогенность их проявляется лишь после случайного проникновения в макроорганизм. Условно-патогенные (син.: потенциально патогенные) микробы оказывают болезнетворное воздействие на макроорганизм при определенных условиях, т.е. когда они попадают (пассивно проникают) во внутреннюю среду макроорганизма в больших количествах на фоне резкого снижения резистентности макроорганизма. Виды инфекционных заболеваний по особенностям эпидемиологии: Спорадическая заболеваемость – регистрация отдельных единичных случаев данной инфекции, не связанных между собой. Эпидемия – это широкое распространение инфекции в популяции с охватом больших территорий, характеризующееся массовостью заболеваний. Пандемия – эпидемия, охватывающая несколько стран, континентов или даже всю человеческую популяцию. Эндемичные заболевания (с природной очаговостью) – регистрируются на строго определенных территориях; тесно связаны с ареалом (местом) обитания животных – хозяев и переносчиков. К ним можно отнести эндемические риккетсиозы, клещевой возвратный тиф (боррелиоз), клещевые вирусные энцефалиты и другие. При возникновении заболевания в связи с пребыванием в медицинском учреждении инфекция называется госпитальной, или внутрибольничной. Источником её может быть медперсонал, инструменты, вода и пища в стационарах, хронические больные, инвазивные манипуляции (такая инфекция носит название ятрогенной). Конвенционные (старое название «карантинные» от итал. carante) болезни – это группа особо опасных инфекций, система информации и мер профилактики, обусловленных международными соглашениями (конвенцией), т.е. это болезни, подпадающие под действие международных медико-санитарных правил и подлежащие международному санитарно-эпидемиологическому надзору. Особенностью их является потенциальная возможность глобального распространения, они могут быть источником бактериологического (биологического) оружия в условиях войны. Список таких заболеваний сейчас значительно расширен и разделен на 2 группы: · «Болезни, любое событие с участием которых всегда оценивается как чрезвычайное, так как они продемонстрировали способность оказывать серьезное воздействие на здоровье населения и быстро распространяться в международных масштабах»: холера, легочная форма чумы, желтая лихорадка, геморрагические лихорадки Эбола, Ласса, Марбург, Западного Нила, COVID 19. Сюда же ММСП-2005 относят «болезни, вызывающие особую национальную и региональную обеспокоенность», напр., лихорадку Денге, лихорадку Рифт-Валли, менингококковую инфекцию. · «Болезни, случаи заболевания которыми являются необычными или неожиданными и могут оказать серьёзное воздействие на здоровье населения»: оспа; полиомиелит, вызванный диким типом; грипп (новый подтип); тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС или SARS). Роль окружающей среды и социальных условий в распространении заболеваний: · Климатические условия влияют на заболеваемость респираторными инфекциями в осенне-зимний период и кишечными инфекциями в летнее время года. · Ионизирующая радиация повышает восприимчивость к инфекциям. · Техногенное загрязнение окружающей среды. · В условиях войн, революций повышается инфекционная заболеваемость в связи с ухудшением санитарных условий труда и быта, отсутствием вакцинаций. Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний Методы исследования, связанные с применением животных, называются биологическими или экспериментальными, а используемые для этой цели животные – экспериментальными или лабораторными. Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение самого возбудителя (особенно при незначительном его содержании в исследуемом образце, при переходе в фильтрующиеся формы, при загрязнении исследуемых объектов посторонней микрофлорой, подавляющей рост возбудителя, или, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева – например, при вирусных и риккетсиозных заболеваниях). Методы предполагают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Кроме того, с помощью биопробы определяют вирулентность и токсигенность изучаемого штамма микроба (определение DLM-токсина, определение дермонекротического действия), активность приготовленных вакцин и их безвредность, эффективность антибиотиков, химиотерапевтических препаратов. Инфекционный процесс может быть искусственно воспроизведен путем экспериментального заражения лабораторных животных: кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных – важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействия внутри системы микроорганизм – макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных, определенной массы тела и возраста. Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, интраназально, внутритрахеально, интрацеребрально, внутрибрюшинно, введением в глаз. Блок 3. Молекулярно-генетический метод диагностики инфекционных заболеваний (ПЦР, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, лигазная цепная реакция, метод микрочипов и др.) Ход выполнения ПЦР 1. Инициализация. Смесь нагревается до 94–96°C от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг активирует ДНК-полимеразу и выполняется один раз, в начале процесса ПЦР. 2. Денатурация. Смесь нагревают при 94–98°C в течение 15–30 секунд. Этот этап "денатурирует", т.е. расщепляет ДНК на две отдельные нити. 3. Отжиг: На этапе отжига температура снижается до 50-65°C на 20-40 секунд. Эта температура позволяет праймерам и полимеразе связываться с интересующей нас областью амплификации. Обычно идеальная температура на несколько градусов ниже, чем "температура плавления" праймеров. 4. Элонгация/экстензия. На этом этапе температура повышается до 72-80°C на 20-40 секунд. При этой температуре полимераза активируется и начинает присоединять свободно плавающие dNTPs к одной нити ДНК. В результате образуются две новые части двойной нити ДНК. Продолжительность этого этапа зависит от того, какой длины мы хотим получить копию ДНК. Обычно ДНК-полимераза может копировать 1 000 пар оснований в минуту. 5. Окончательная элонгация: Необязательный, но рекомендуемый этап, на котором температура поддерживается на уровне 70-74°C в течение нескольких минут (обычно это та же температура, что и на этапе элонгации). Этот этап позволяет полимеразе закончить копирование нити, над которой она в данный момент работает. 6. Финальная выдержка: после завершения заданной программы термоциклер сохраняет конечный результат при температуре, предотвращающей деградацию, 412°C. Шаги со 2 по 4 представляют собой один цикл ПЦР, который повторяется 15-40 раз. Чем больше циклов выполняется, тем больше копий ДНК образуется, но после определенного количества циклов, т.е. более 40, праймеры и нуклеотиды могут закончиться, что приведет к проблемам с конечной ДНК в пробирке, кроме того, большое количество циклов снижает эффективность ПЦР из-за накопления побочных продуктов. Этапы RT-PCR в реальном времени 1. Выделенную РНК смешивают с ферментом обратной транскриптазы (RT) и искусственными нуклеотидами. Этот фермент синтезирует комплементарную нить ДНК (кДНК), которая будет соответствовать нити РНК. 2. Шаг денатурации такой же, как и в обычной ПЦР, - нагревание смеси до 95°C. 3. На этапе отжига праймеры и зонды sars-cov-2 прикрепляются к одноцепочечной ДНК (ssDNA), праймеры и зонды sars-cov-2 прикрепляются только в том случае, если РНК/кДНК содержит такие короткие последовательности. 4. На стадии расширения, когда полимераза синтезирует новые нити, если полимераза достигает прикрепленного зонда, зонд испускает флуоресцентный сигнал (свет), который фиксируется камерой и записывается программным обеспечением. 5. Программное обеспечение будет регистрировать сигналы зондов и их увеличение с каждым циклом. Рестрикционный анализ Метод основан на применении ферментов, носящих название рестриктазы. В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходиить разрыв двойной спирали ДНК. В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы. Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированного размера. Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарознос геле: мелкие фрагменты в геле перемещаются быстрее, чем более крупные, и длина их пробега больше. Гель окрашивают этидия бромидом и фотографируют в ультрафиолетовом (УФ) излучении. Таким способом можно получить рестрикционную карту определенного вида микроба. Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различных штаммов, можно определить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду, а также обнаружить участки, подвергнутые мутациям. Этот метод используется также, как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF) Масс-спектрометр состоит из трех основных компонентов: · Источника ионов для ионизации и переноса ионов молекул образца в газовую фазу. · Масс-спектрометра – устройства, разделяющего молекулы в зависимости от их массы. · Детектора – для мониторинга всех разделенных ионов. Ход исследования 1. Колонию бактериальной культуры, выращенной на питательной среде (можно использовать гемокультуру), помещают в специальный металлический планшет. 2. Добавляют матрикс (матрицу) – гомогенную коллоидную субстанцию, в качестве которой используют бензойную или коричную кислоту. 3. Планшет помещают в ионизационную камеру масс-спектрометра, где подвергают излучению лазера. 4. Сравнивая масс-спектр исследуемого образца бактериальной культуры со спектрами базы данных, проводят идентификацию исследуемой бактериальной культуры. Определение микрочипа. наличия микроба в исследуемом материале с помощью Микрочип представляет собой стеклянную пластинку, с которой связано от 100 до 100 молекулярных ДНК-зондов, представляющих последовательность нуклеотидов, специфичных для данной таксономической единицы, локализованных в определенных участках. Из исследуемого материала выделяют общую ДНК, которую можно амплифицировать по стабильной последовательности 16S РНК-гену. Выделенную ДНК метят флюорохромом или ферментом и обрабатывают ею микрочип, создавая условия для гибридизации. Отмывают несвязавшуюся ДНК, определяют локализацию молекулярных гибридов постановкой ИФА или денситометрией. Блок 4. Учение об иммунитете. Факторы неспецифической резистентности организма. Классы иммуноглобулинов и их функция. Определение и классификация антигенов. Серологический метод диагностики (РА и ее разновидности, ИФА, РИФ, РИА) Учение об иммунитете. Определение понятия «иммунитет» Иммунитет – это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ (антигенов экзогенного и эндогенного происхождения), направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма, биологической (антигенной) индивидуальности каждого организма и вида в целом. Иммунная система – это адаптивная, открытая, самоподдерживающаяся, комплексная, многоуровневая система способная к распознаванию, наблюдению и реорганизации на основании причинно-следственных связей (прямых, обратных и др.) и обладающей определённой автономией как самой её в целом, так и составляющих ее частей, иерархических уровней от других систем организма. Таблица Классификация видов иммунитета Иммунитет Видовой (врожденный, наследственный, генетический, конституциональный) Приобретенный Активный Пассивный (естественный, искусственный) (естественный, искусственный) Гуморальный Клеточный Местный Общий Стерильный Нестерильный Виды иммунитета антитоксический, противобактериальный, противовирусный, противогрибковый, противоопухолевый, трансплантационный, противогельминтный Особенности иммунитета при бактериальных инфекциях Иммунная система макроорганизма в ответ на бактериальную инфекцию в значительной степени определяется факторами патогенности микроба. Различают иммунитет: · антибактериальный – против структурных компонентов бактериальной клетки · антитоксический – против белковых токсинов. Основные факторы антибактериальной защиты – антитела и фагоциты. Антитела эффективно инактивируют биологически активные молекулы бактериальной клетки (токсины, ферменты агрессии и др.), маркируют их, запускают антителозависимый бактериолиз и иммунный фагоцитоз. Фагоциты непосредственно осуществляют фагоцитоз, в т.ч. иммунный, антителозависимый киллинг патогена с помощью ион-радикалов и ферментов. Важная роль в борьбе с грамположительными микробами принадлежит лизоциму, а с грамотрицательными – комплементу (альтернативный путь активации). Кроме того, существенное значение имеют белки острой фазы (С-реактивный и маннозосвязывающий). Ряд бактерий, относящихся к факультативным внутриклеточным паразитам, отличаются повышенной устойчивостью к действию комплемента, лизоцима и фагоцитов. К их числу относятся микобактерии, иерсинии, бруцеллы, сальмонеллы и некоторые другие. В такой ситуации макроорганизм вынужден переключать нагрузку на клеточное звено иммунитета, что ведет к формированию ГЗТ. Особое значение приобретают макрофаги и естественные киллеры, осуществляющие АЗКЦТ, а также γδТ-лимфоциты. Напряженность специфического антибактериального иммунитета оценивают в серологических тестах по титру (динамике титра) специфических антител, а также по состоянию клеточной иммунореактивности (напр., по результатам кожноаллергической пробы). Таблица Противомикробная защита организма в полости рта Уровни защиты Факторы защиты Барьерные функции слизистой оболочки I-й уровень Барьерные функции зубов Микробная биопленка слизистой оболочки и зубов Противомикробные свойства секретов Кариес и воспаление как тканевые реакции на инвазию патогенов II-ой уровень Клеточные реакции врожденного иммунитета на паттерны патогенов Противомикробные молекулярные факторы врожденного иммунитета Антитела как продукты В-клеток адаптивного иммунитета III-й уровень Регуляторные и цитолитические эффекты Т-клеточного адаптивного иммунитета Адаптивный иммунитет Адаптивный иммунитет включает гуморальные и клеточные факторы. Гуморальные факторы адаптивного иммунитета включают В-лимфоциты и иммуноглобулины IgM, IgG, IgM, IgE, IgD. В-лимфоциты можно однозначно отделить от других типов клеток благодаря их способности синтезировать антитела (иммуноглобулины). Лимфоциты В-ряда помимо мембранных иммуноглобулинов на своей поверхности несут HLA II класса и ряд дифференцировочных АГ (CD-кластеры дифференцировки). Виды адаптивного иммунитета 1. Активный адаптивный иммунитет (обусловлен контактом с антигеном и длительный – чаще всего образуется через 1–2 нед после контакта с антигеном и сохраняется годами или десятками лет): · Естественный (развивается при контакте с антигеном в результате естественной ситуации после перенесенного инфекционного заболевания). · Искусственный (формируется после введения в организм вакцин). 2. Пассивный адаптивный иммунитет (предполагает поступление в организм человека не антигена, а готовых антител, при этом длительность защиты, как правило, не превышает нескольких недель или месяцев): · Естественный (передается от матери плоду или ребенку через плаценту или с грудным молоком в виде антител к перенесенным матерью инфекционным заболеваниям). · Искусственный (создается путем введения в организм иммунных сывороток или гамма-глобулина, содержащих антитела против инфекционных агентов или токсинов). Типы иммунитета 1. Антибактериальный иммунитет. После проникновения бактерий в ткани организма активируются механизмы неспецифической защиты, и развивается специфический иммунный ответ. 2. Антитоксический иммунитет. Более 50 видов микроорганизмов обладают способностью вырабатывать экзотоксины. При попадании в организм человека происходит выработка антитоксинов (антител, обладающих способностью взаимодействовать с соответствующими токсинами и нейтрализовать их). 3. Противогрибковый иммунитет. При поверхностных микозах специфические защитные механизмы развиваются слабо, ограничение процесса происходит в результате неспецифической воспалительной реакции и других факторов. Глубокие, или системные, микозы развиваются у лиц с нарушением клеточного звена иммунитета, в частности при ВИЧ-инфекции/СПИДе. 4. Противовирусный иммунитет. Основными свойствами вирусов является абсолютный внутриклеточный паразитизм и неклеточное строение. Проникая в клетку, вирус репродуцируется в ней, что приводит к ее гибели или развитию латентной инфекции. Некоторые вирусы способны интегрировать свой геном в геном клетки. 5. Трансплантационный иммунитет. Осуществляют цитотоксические Т-лимфоциты. Особенности иммунитета при бактериальных инфекциях Иммунная система макроорганизма в ответ на бактериальную инфекцию в значительной степени определяется факторами патогенности микроба. Различают иммунитет: · антибактериальный – против структурных компонентов бактериальной клетки · антитоксический – против белковых токсинов. Основные факторы антибактериальной защиты – антитела и фагоциты. Антитела эффективно инактивируют биологически активные молекулы бактериальной клетки (токсины, ферменты агрессии и др.), маркируют их, запускают антителозависимый бактериолиз и иммунный фагоцитоз. Фагоциты непосредственно осуществляют фагоцитоз, в т.ч. иммунный, антителозависимый киллинг патогена с помощью ион-радикалов и ферментов. Важная роль в борьбе с грамположительными микробами принадлежит лизоциму, а с грамотрицательными – комплементу (альтернативный путь активации). Кроме того, существенное значение имеют белки острой фазы (С-реактивный и маннозосвязывающий). Ряд бактерий, относящихся к факультативным внутриклеточным паразитам, отличаются повышенной устойчивостью к действию комплемента, лизоцима и фагоцитов. К их числу относятся микобактерии, иерсинии, бруцеллы, сальмонеллы и некоторые другие. В такой ситуации макроорганизм вынужден переключать нагрузку на клеточное звено иммунитета, что ведет к формированию ГЗТ. Особое значение приобретают макрофаги и естественные киллеры, осуществляющие АЗКЦТ, а также γδТ-лимфоциты. Напряженность специфического антибактериального иммунитета оценивают в серологических тестах по титру (динамике титра) специфических антител, а также по состоянию клеточной иммунореактивности (напр., по результатам кожноаллергической пробы). Серологические реакции. Механизм реакций агглютинации Реакции иммунитета используются при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические исследования (от лат. serum – сыворотка + logos – учение) – методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген – антитело в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Различают следующие реакции: агглютинации на стекле с адсорбированной и неадсорбированной сывороткой, Видаля, а также реакции гемагглютинации (РГА), реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), реакцию обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА), реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), реакцию Кумбса. Перечисленные реакции отличаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления, как антител, так и антигенов. Реакция агглютинации (РА) на стекле с неадсорбированной сывороткой в разведении 1:25 носит ориентировочный характер в связи с невозможностью сразу исключить и групповую РА (рис.). Рис. 10.1. Реакция агглютинации на стекле и в пробирках Неадсорбированными называются сыворотки, содержащие полный спектр антител, в том числе и групповые. РА на стекле с адсорбированной сывороткой в разведении 1:25 носит диагностический характер. Адсорбированными называются сыворотки, из которых адсорбированы групповые (перекрестные) антитела. Для окончательной идентификации микроорганизма ставят развернутую реакцию агглютинации (РА Грубера) с иммунной сывороткой, разведенной до титра. Реакция агглютинации широко применяется в практике серологической диагностики брюшного тифа, паратифов А и В (реакция Видаля) (рис. 10.2). РГА – некоторые вирусы обладают агглютинирующими свойствами, что используется в реакции гемагглютинации. РПГА – эритроциты с адсорбированными на них антигенами становятся сенсибилизированными к соответствующей иммунной сыворотке. Под действием специфических антител сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок в виде «зонтика» с неровными краями, а в контроле осадок напоминает «пуговичку» с ровными краями. РПГА используется для диагностики брюшного тифа и других сальмонеллезных заболеваний. Рис. Реакция агглютинации Видаля РОПГА – эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами, и гемагглютинация происходит при добавлении или наличии в растворе антигена. РОПГА позволяет выявить в исследуемом материале микроколичества токсинов (ботулизма, столбняка). РТПГА – реакция основана на участии трех компонентов: антигенов, антител и эритроцитов с адсорбированными на них антигенами (или антителами). Реакция Кумбса – используется для выявления неполных антител (рис.10.3).
