Лекция №1-2 Введение в протозоологию. Строение клетки простейших. Цитоплазма: ее органеллы и включения. Скелетные и фибриллярные образования. Органеллы и типы движения 1. Терминология и история систематики простейших. Исторический обзор протозоологических исследований. Протисты 3 века считались – парафилетической (происходящих от разных групп) совокупностью мелких преимущественно микроскопически организмов образующих единственную группу группу. Исследователи не сходились в едином мнении , т.к. данные по организмам отличались. 1818 г. Гольдфус ввел термин Protozoa(первые живые существа, животные) Окончание -zoa, сражу же стало границей отделяющей растения от животных. Однако деление анималькулей (зверушек) : похожие на растения (фототрофные) и похожие на животные(гетеротрофные) породило споры. Поэтому протисты стали считать одноклеточными эукариотами,но и это было спорным определением ,т.к. многие организмы обьеденяются в синтиции (вампереллиды) или же кратковременно обьеденяются для добычи или пищеварения (солнечники),образуют колонии (вольвокс),кроме того есть сложно устроенные многоклеточные простейшие со специализированными клетками (Myxozoa). В связи с этим все простейшие было принято подразделять на Protozoa и Protista Была принята соответствующая номенклатура разграничивающая понятия протисты и другими организмами. 1.Зверушки-(Animalcula)- термин ввел в 1676 Антонио ван Левенгук. Собирательный термин, охватывающий все микроскопические существа, которые можно обнаружить в лужах, реках, озерах и т.д. 2.Монады- 1714 год Готфрид Лейбниц Мельчайшие, неделимые, простые единицы из которых состоят все существа. Монадами называли сперматозоидов и жгутиконосцев использовали для названий таксонов. 3. Инфузории (наливочные животные)-Мартин Ледимюллер,1760г. Зверушки настоя сена или наливочные зверушки.К этой категории относили всех животных ,которые после высыхания воды вновь оживали, если она там появлялась, т.е устойчивые к высыханию. 4. Urthiere - Лоренц фон Окен, 1805г., термин отграничения одноклеточных растений и животных. от высших 5. Protozoa-Георг Август Гольдфус,1818г. Использовался для обозначения губок, книдарий и мшанок и инфузорий. Как термин «простейшие» стали использовать в 1845 году, когда Карл фон Зибольд дал ему полное определение: ПРОСТЕЙШИЕ - ЭТО ЖИВОТНЫЕ, КОТОРЫЕ УМЕНЬШЕНЫ ДО УРОВНЯ ЕДИНСТВЕННОЙ КЛЕТКИ. 6. Микроскопические животные Animalia и Microscopica. Жан Батист Бори де Сент-Винсент,1826 г. В качестве синонима инфузорий. 7. Оозоа - Oоzoa, Карл Густав Краус, 1832 г. Организмы сохранившие черты простейших на начальных стадиях развития. 8.Archezoa – Максимельян Перти,1852г. Примитивные существа. 9.Microzoaires- Эмиль де Фроминтель,1874г. Микроскопические одноклеточные. 10.Acrita- Ричард Оуэн,1861г. Царство недифференцированных особей которое содержит не только протистов но и мелких многоклеточных. 11. Протоктисты-Protoctista, Джон Хогг,1861г. Микроскопичесие и макроскопические эукариоты, которые остаются после исключения: •Всех животных развивающихся из бластулы •Всех растений, которые имеют эмбриональную стадию в жизненном цикле •Всех грибов, не имеющих жгутиковой стадии в жизненном цикле 12. Protista, Эрнест Геккель,1866г. Эукариотные организмы с одноклеточной организацией (классические простейшие, одноклеточные фототрофы (диатомовые водоросли) и низшие грибы) В современном мире встречаются не все из них, только: •Protozoa •Protista •Archezoa •Protoctista Исторический обзор протозоологических исследований. Период 1: Использование микроскопов для обнаружения мелких невидимых организмов или клеток А. Левенгук (1675) Фактически был первым кто обнаружил и зарисовал простейших и назвал их Animalcula Период 2: Таксономические исследования Г. Гольдфус (G.A. Goldfuss) (1818): Protozoa А. Д’Орбиньи (A. D’Orbigny) (1826): Foraminifera Х. Эренберг (Chr. G. Ehrenberg) (1838): свободноживущие и ископаемые простейшие Период 3: Осознание протистов как одноклеточных организмов С. Зибольд (C.T. von Siebold) (1845):Животные с неопределенной формой и простой организацией, у которых различные системы органов нечетко дифференцированы, могут быть представлены одной единственной клеткой. Простейших можно разделить на ризопод и инфузорий. Доктрина саркоды и теория протоплазмы: Ф. Дюжарден (F. Dugardin) (1835) и Х. Моль (H. von Mohl) (1846) Обоснование клеточной доктрины: М. Шульце (M. Schultze) (1861, 1863): клетка - это маленький комочек протоплазмы с ядром в центре. Изучение простейших объединяется с клеточной биологией и эмбриологией. Период 4: Объединение протозоологии с нарождающейся паразитологией Простейшие как патогены Е. Груби (E. Gruby) (1843): Trypanosoma (в лягушках) С. Нагели (C.W. von Naegeli) (1857): пебрина / нозематоз шелкопряда, Nosema bombycis - Ф. Лёш (F. L_sch) (1875): амебная дезинтерия (Entamoeba histolytica) Р. Лейкарт (R. Leuckart) (1879): Sporozoa А. Лаверан (A. Laveran) (1880): малярия и ее возбудитель (Plasmodium) О. Бючли (O. B_tschli) (1881): Myxosporidia (= Myxozoa) Ж. Бальбиани (G. Balbiani) (1882): Microsporidia (= Microspora), Sarcosporidia Ж. Даттон (J.E. Dutton) (1902): Trypanosoma gambiense / возбудитель сонной болезни Период 5: Организационное оформление науки протистологии Основание зоологических лабораторий протозоологами Германии О. Бючли (O. B_tschli), Гейдельбергский университет (1878) Ф.Е. Шульце (F.E. Schulze), Берлинский университет (1884) Р. Гертвиг (R. Hertwig), Мюнхенский университет (1885) Ф. Шаудин (F. Schaudinn) (1902): основатель и издатель первого протистологического журнала «Archiv fer Protistenkunde», с 1988 года продолжается как «Protist». Ф. Шаудин (1904): основание протозоологических лабораторий в Reichsgesundheisamt в Вerlin Lichterfelde, в 1906 году основание кафедры протозоологических исследований в институте морских и тропических болезней (сейчас Bernhard Nocht Institute) в Гамбурге. В.А. Догель (1908)1: основание протистологической школы в С.-Петербурге. М. Гартман (M. Hartmann) (1914): основание кафедры протистологии в Биологическом институте Кайзера Вильгельма в Berlin Dahlem. Организационное оформление протистологии на международном уровне 1947: в США основано Общество протозоологов, в настоящее время это международная организация с несколькими национальными секциями; с 1954года издает журнал «Journal of Protozoology» (в 1993 переименован в «Journal of Eukaryotic Microbiology»). 1963: основан польский журнал «Acta Protozoologica» 1968: основан французский журнал «Protistologica» (в 1987 продолжает издаваться в Германии как «European Journal of Protistology») 1972: основано Международное общество эволюционной протистологии (International Society of Evolutionary Protistology / ISEP) 1999: основан русский журнал «Protistology». 1961, Прага: созван Первый международный конгресс протозоологов, после которого конгрессы собирались каждые 4 года: 1965 в Лондоне, 1969 в Ленинграде, 1973 в Клермон Ферране, 1977 в Нью Йорке, 1981 в Варшаве, 1985 в Найроби, 1989 в Цукубе, 1993 в Берлине, 1997 в Сиднее, 2001 в Иерусалиме и Зальцбурге, 2005 в Гуанчжоу, 2009 в Рио де Жанейро. Основные методы изучения строения клетки простейших: светооптические, электронномикроскопические, молекулярно-биологические. Клетки очень малы по размерам и в тоже время сложно устроены. Поэтому для успешного изучения строения и функционирования клетки необходимо знать и владеть соответствующими экспериментальными методами. На первом этапе развития, единственным способом изучения клетки было световое микроскопирование. Микроскоп – это прибор, позволяющий получить увеличенное изображение мелких объектов, не видимых невооруженным глазом. В микроскопии принято использовать следующие единицы длины: микрометр (1 мкм – 10-6 м); нанометр (1 нм – 10-9 м); ангстрем (1Å – 10-10 м). Существуют световое и электронное микроскопирование. В световом микроскопе для получения увеличенного изображения используется свет, в электронном - поток электронов. Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Разрешающая способность – это наименьшее расстояние, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. Разрешающая способность человеческого глаза составляет около 100 мкм. Это означает, что невооруженным глазом с расстояния 25 см наблюдатель со средней остротой зрения может отличить одну точку от другой, если они отстоят друг от друга на расстоянии не менее 100 мкм. Если рассматриваемые точки находятся на расстоянии менее 100 мкм, то они кажутся одной расплывчатой точкой. Лучший современный световой микроскоп дает возможность рассмотреть структуры с расстоянием между элементами около 0,25 мкм, - электронный микроскоп - порядка 1,5 А. Световое микроскопирование это совокупность методов наблюдения микрообъектов с помощью различных оптических микроскопов. Эти методы существенно зависят от типа объектива микроскопа, вспомогательных приспособлений к нему, вида микрообъекта и способа подготовки его для наблюдения, а также от характера его освещения при наблюдении. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена размерами, сравнимыми с длиной световой волны (0,4–0,7 мкм для видимого света). Электронное микроскопирование. В электронном микроскопе для построения изображения вместо света используют поток электронов в вакууме, фокусировка электронного пучка производится электромагнитными полями. Изображение наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся в глубоком вакууме, поэтому предварительно их подвергают фиксации и специальной обработке. По этой причине с помощью электронного микроскопа можно изучать только убитые клетки. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается объектом. В этой связи в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, помещенные на тончайшие пленки. Авторадиография. Этот метод основан на применении меченными радиоактивными изотопами веществ. Если добавить в среду радиоактивный изотоп, поглощаемый клетками в процессе метаболизма, то его внутриклеточную локализацию можно впоследствии выявить с помощью авторадиографии. При использовании этого метода тонкие срезы клеток помещают на пленку. Пленка темнеет под теми местами, где находятся радиоактивные изотопы. В качестве изотопов используют фосфор (P32), железо (Fe59), серу (S35), углерод (С14), тритий (H3) и др. Центрифугирование. Начало методу было положено в 1926 г., когда Сведберг изобрел аналитическую центрифугу и использовал ее для определения молекулярной массы гемоглобина. Перед центрифугированием необходимо разрушить клеточную оболочку. Разрушение проводят, используя ультразвуковую вибрацию, осмотический шок, измельчение, продавливание через маленькое отверстие. При осторожном разрушении некоторые органоиды клетки сохраняются в интактном состоянии. Измельченные ткани с разрушенными клеточными оболочками помещают в пробирки и вращают в центрифуге с большой скоростью. Метод основан на том, что различные клеточные органоиды имеют разную массу и плотность. Более плотные органоиды осаждаются в пробирке при низких скоростях центрифугирования, менее плотные - при высоких. Эти слои изучают отдельно. Так ядра и неразрушенные клетки, быстро оседают при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высокой скорости выпадают в осадок митохондрии, а еще при более высоких скоростях и длительных периодах центрифугирования осаждаются рибосомы. Обычно такие очищенные компоненты сохраняют высокую биохимическую активность. Метод культуры клеток и тканей состоит в том, что из одной или нескольких клеток на специальной питательной среде можно получить группу однотипных клеток. Так клеточные культуры используют для выяснения закономерностей дифференцировки, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, трансформации и др. В биотехнологии клеточные культуры применяют при производстве вакцин и биологически активных веществ. В фармакологии их используют в качестве тест-объектов при испытании новых лекарственных препаратов. Основоположником этого метода является американский зоолог и эмбриолог Р. Гаррисон (1879-1959), которому в 1907 г. удалось культивировать клетки саламандры в искусственной среде вне организма. Впоследствии многие типы растительных и животных клеток выращивались in vitro, и этот метод позволил сделать ряд важных открытий в области физиологии клеток. Выражение in vitro (по-латыни «в стекле) означает, что исследование проведено не на живом организме, а в стеклянном сосуде того или иного рода. В противоположность первому выражению in vivo указывает на эксперимент с целым, живым организмом.. Можно осуществить слияние клеток одного или разных видов. Микрургия. Этот метод основан на использовании микроманипуляторов. Они представляют собой приборы, обеспечивающие точные движения микроинструментов в клетке. Микроинструменты обычно делают из стекла. Их форма определяется задачами микрургических операций. Они могут быть в виде игл, шприцев, пипеток, шпателей, скальпелей и т. д. С помощью микроманипуляторов над клетками можно производить разнообразные операции (инъекции в клетку веществ, извлечение и пересадка ядер, локальное повреждение клеточных структур и т.д.). Особенно хорошо микрургические операции удаются на крупных клетках (одноклеточные, яйцеклетки амфибий, клетки зародышей некоторых животных). Так клетку амебы удается разделить на три основных компонента – мембрану, цитоплазму и ядро. Затем эти компоненты можно вновь собрать и получить живую клетку. Таким путем могут быть получены искусственные клетки, состоящие из компонентов разных видов амеб. Микрургические операции производятся не только микроинструментами, но сфокусированным пучком ультрафиолетовых лучей (лучевой микроукол). Кроме названных методов при изучении клетки используют • хроматографию, • электрофорез Новые методы позволили достичь огромных успехов в изучении клетки. Однако следует помнить, что классические методы цитологии, основанные на фиксации, окрашивании и изучении клеток под световым микроскопом, по-прежнему сохраняют практическое значение. 3. Происхождение эукариотных клеток. В соответствии с общепринятыми теориями, предки современных протистов следовали тем же эволюционным путем, что и предки других современных прокариот и эукариот. Примерно 2500-1500 миллионов лет назад их пути разошлись, приведя, с одной стороны, • к эукариотным растениям, слизевикам и животным, • а с другой — к современным прокариотам. Принимая возраст Земли порядка 4550 млн лет, первые микробиальные экосистемы возникли, вероятно, около 4000 млн лет назад. Их фоссильным наследием служат так называемые строматолитовые известняки. Соотношение 13С/12С в этих биогенных осадках служит индикатором существования процессов автотрофной фиксации углерода. В то время только гидросфера была способна поддержать существование и эволюцию жизни. Предположительно, ее характеризовали следующие абиотические параметры: •парциальное насыщение кислородом в непосредственной близости от фотосинтетиков (возможно, предков современных цианобактерий); •в обилии присутствовали С02 не органического (вулканического) происхождения и калий — модель древнего «содового океана» («soda осеап»); •содержание ионов Са2* в море было крайне низким (10~7М по сравнению с современным 10~2 М), но все таки достаточным для осаждения некоторого количества биогенного карбоната; •рН океана была около 10 (в со временном океане 7-8); •растворимые соли двухвалентно го железа в результате насыщения атмосферы кислородом постепенно переходили в нерастворимые трехвалентные соединения (железная руда); •предположительно, температура была почти такая же, как сейчас, поскольку атмосферный углекислый газ вызывал парниковый эффект, который компенсировал меньшую светимость Солнца. Следует отметить три гипотезы происхождения эукариотических клеток: I. симбиотическая гипотеза, или симбиогенез, II. инвагинационная, III. химерная. Эукариотная клетка — это мультигеномная система. И возникла она в результате симбиоза, то есть взаимовыгодного сожительства разных организмов (точнее, эндосимбиоза, один из участников которого живет внутри другого). Соответствующие эволюционные ветви при этом, разумеется, слились. Такой взгляд на эволюцию получил название теории симбиогенеза. Рис. 1. Пути эволюции древнейших эукариот, согласно взглядам Линн Маргулис. Здесь показаны три симбиогенетических события — приобретение митохондрий, жгутиков и хлоропластов, — которые могли происходить в разных эволюционных ветвях в разном порядке. Тем не менее «верхний» и «нижний» пути эволюции ведут к одному и тому же состоянию: клетке, имеющей и ядро (происхождение которого тут оставлено «за кадром»), и митохондрии, и жгутики. У предков растений к этому добавляются еще и хлоропласты. Прокариотами называются все клеточные организмы, кроме эукариот, архезоями — гипотетические эукариоты, никогда не имевшие митохондрий. Согласно симбиогенезу такие органеллы эукариотических клеток как митохондрии, хлоропласты и жгутики произошли путем внедрения одних прокариот в другую, более крупную прокариотическую клетку, сыгравшую роль клетки-хозяина. В симбиотической гипотезе есть трудности при объяснении происхождения ядра эукариотических клеток и в вопросе, какой же все-таки прокариот выступил хозяином. Данные молекулярного анализа генома и белков эукариот показывают, что, с одной стороны, это был организм близкий к археям (раньше относились к бактериям, потом их выделили в отдельную ветвь). С другой стороны, в эукариотах имеются белки (и ответственные за их синтез гены), характерные для совершенной других групп прокариот. Согласно инвагинационной гипотезе происхождения эукариотических клеток их органоиды образовались путем впячивания цитоплазматической мембраны с последующим отделением этих структур. Образовывались что-то вроде шариков, окруженных мембраной и содержащих внутри цитоплазму и захваченные сюда соединения и структуры. В зависимости от того, что попало внутрь, сформировались разные органоиды. У прокариот нет настоящих органелл, их функции как раз и выполняют впячивания мембраны. Поэтому легко представить подобное ее отшнуровывание. Также в пользу инвагинационной гипотезы говорит схожесть цитоплазматической мембраны и двойных мембран органелл. Химерная гипотеза происхождения эукариотических клеток, говорит о большом размере их генома, который превосходит бактериальный в тысячи и более раз, а также разнообразие синтезируемых белков, встречающихся в разных группах прокариот. Понятно, что на протяжении эволюции эукариот их геном усложнялся, он удвоился, в нем появилось множество регулирующих генов. Но все же первоначальное увеличение размера генома могло произойти за счет объединения геномов нескольких прокариот. Возможно в древности некий прокариот приобрел способность к фагоцитозу и, питаясь таким образом, поглощал в том числе других прокариот, которые не всегда переваривались. Их геном содержал полезные для хозяина гены, и он включал их в свой геном. Возможно некоторые из оказавшихся внутри прокариот становились органеллами, что объединяет химерную гипотезу с симбиогенезом. Развитие систематики. Первоочередные цели зоологической систематики установить родственные отношения между таксонами, смоделировать исторические фазы эволюции организмов (филогения) и дать рациональное объяснение фундаментальным процессам и причинам филогенетического развития (эволюционная биология). Со времен Левенгука и вплоть до XXI века работы по систематике протистов осуществлялись преимущественно без выявления родственных связей; единственным доступным критерием принадлежности к одному таксону было морфологическое сходство организмов. Изучение строения протистов и анализ их филогении были начаты Эренбергом и Дюжарденом. Первые генеалогические деревья были построены под влиянием теории происхождения видов Чарльза Дарвина (с 1842 года), которую Геккель активно применил к протистам. В то время были созданы таксономические термины, многие из которых используются и по настоящее время: Polycystinea Ehrenberg, 1838; Rhizopoda von Siebold, 1845; Sporozoa Leuckart, 1879; Acantharea Haeckel, 1881; Myxosporidia Biitschli, 1881;Ciliata Perty, 1852; Flagellata Cohn, 1853; Radiolaria J. Mtiller, 1858; Suctoria Claparede et Lachmann, 1858/59; Mycetozoa de Вагу, 1859; Heliozoa Haeckel, 1866; Mastigophora Diesing, 1866; Sarcodina Schmarda, 1871; Filosea Leidy, 1879; Бючли был первым, кто предло жил систему Protozoa. Таблица 2. Система Бючли 1889 года Тип Protozoa Класс Подкласс Sarcodina Rhizopoda Heliozoa Radiolaria Mastigophora Sporozoa Gregarinida Myxosporidia Sarcosporidia Infusoria Ciliata Suctoria Хонигберг и десять его соавторов к созданию более современной системы в 1964 году. Тип Protozoa Подтип Класс Sarcomasti gophora Mastigophora Opalinata Sarcodina Sporozoa Telosporea Toxoplasmea Cnidospora Myxosporidia Microsporidia Ciliophora Ciliatea Ее отличия от системы Бючли заключались преимущественно в разделении старого таксона Sporozoa на Cnidospora (споры с филаментом) и так называемых новых Sporozoa (споры без филамента), а также в слиянии Mastigophora и Sarcodina с образованием нового подтипа Sarcomastigophora. Новые ультраструктурные исследования в последующие десятилетия позволили достичь нового уровня понимания проблемы. Осознание огромного многообразия одноклеточных организмов привело к идее о независимых филогенетических путях развития. 1. В 1980 году комитет по номенклатуре (Ливайн и 15 соавторов) предложил систему, в которой эта гетерогенность отражена в признании семи типов вместо типа Protozoa 2. Опубликованный Обществом протозоологов в 1985 году «Иллюстрированный атлас простейших» (The Illustrated Guide to the Protozoa) содержит в подцарстве Protozoa только 6 типов с 28 классами 3. «Руководство по протестам» (Hand book of Protoctista), опубликованное в 1990 году Маргулис, Корлисом, Мелконианом и Чапменом, насчитывает в пределах Protoctista, наряду с двумя сомнительными, 35 более или менее реальных типов 4. Система Кавалье-Смита(1998) и схема, представленная во втором издании «Иллюстрированного атласа простейших» (The Illustrated Guide to the Protozoa, 2000), отражает взгляды Маргулис и Корлиса. Строение эукариотной клетки. Империя EUKARYOTA Chatton,1925 (Eucarya) — Э У К А Р И О Т Ы Важнейшая черта организации эукариотной клетки — это подразделение ее на специфические отделы (компартменты). С морфологических позиций, главный разграничитель компартментов — это эндоплазматическая сеть, которая отделяет, например, цитозоль от кариоплазмы. Еще одна существенная черта организации эукариотной клетки — наличие цитоскелета, построенного из микрофиламентов (актиновых и иных) и микротрубочек. Цитоскелет отвечает за поддержание формы клетки и за ее локомоцию и также обеспечивает внутриклеточный транспорт. Жгутик эволюционировал из аппарата митотического веретена, которое, как известно, и структурно и функцио нально связано с ядром. Снабженная жгутиком клетка приобретает дополнительные возможности: она плавает активно и облавливает больший объем среды. В соответствии с гидродинамическими законами, для наиболее эффективного взаимодействия с окружающей жидкостью число жгутиков должно коррелировать с размерами клетки. Следует полагать, что первые свободноплавающие жгутиконосцы обладали одним или немногими жгутиками и принадлежали к низшему размер ному классу эукариот (2-10мкм); в современной биоте к этой размерной градации относится нанопланктон. Чаще всего один жгутик- локоматорный, второй – пищедобывающий. Другим принципиальным признаком эукариотной клетки является наличие митохондрий и, соответственно, способность к окислительному фосфорилированию. Даже в случаях вторичного перехода к микроаэробному образу жизни, при котором митохондрии преобразуются в гидрогеносомы, а цитохромы не выявляются, гены митохондриальных шаперонов присутствуют в ядре, указывая на то, что предки этих организмов обладали митохондриями. Кроме того, уникальна генетическая организация эукариот. В противоположность тому, что мы встречаем у Archaea и Eubacteria, ранние предки эукариот развили сложно организованную систему сплайсинга - процесс вырезания определённых нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК.. Разнообразны жизненные формы простейших, или морфоадаптивные типы. Наиболее широко распространенными формами являются: • амебоидные, которые ведут ползающий образ жизни на различных субстратах в воде или в жидкой среде в теле хозяина; •раковинные малоподвижные бентосные формы; •парящие в составе планктона радиальные, или лучистые, формы; •активно плавающие жгутиконосцы и ресничные, сидячие - стебельчатые, узкотелые или плоскотелые скважники субстратов интерстициалы, а также округлые неподвижные, покоящиеся формы (цисты, споры)
