В. А. Терехова, Л. П. Воронина, А. П. Кирюшина, Е. В. Морачевская, К. А. Кыдралиева СТАНДАРТНЫЙ АЛГОРИТМ ИЗМЕРЕНИЙ ФИТОЭФФЕКТОВ учебное пособие Москва – 2021 1 УДК 57.02.631.4 ББК 28.5в6:40.3я86 Т35 Подготовлено в рамках Программы развития Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова "Будущее планеты и глобальные изменения окружающей среды" В. А. Терехова, Л. П. Воронина, А. П. Кирюшина, Е. В. Морачевская, К. А. Кыдралиева. СТАНДАРТНЫЙ АЛГОРИТМ ИЗМЕРЕНИЙ ФИТОЭФФЕКТОВ: учебное пособие. — М., 2021 г. — 58 с. Рецензент: О. А. Макаров – доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой эрозии и охраны почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова ISBN 978-5-9909558 Учебное пособие предназначено для изучения теоретических основ дисциплин, посвященных оценке и нормированию вредных воздействий на объекты окружающей среды на основе экологических стандартов, использования аттестованных методик биотестирования, и для сопровождения практических занятий. В пособии отражены основные подходы к выбору способов фитотестирования, их преимущества и недостатки, подробно изложен метод экспрессной оценки состояния объектов окружающей среды (твердых субстратов и жидкостей) по показателям острой фитотоксичности. Предназначено для студентов, обучающихся по направлениям 06.03.02 «Почвоведение» и 05.03.06 «Экология и природопользование». © Терехова В.А. с соавт., 2021 © Московский университет, 2021 2 Оглавление Оглавление .......................................................................................................... 3 Введение .............................................................................................................. 4 Раздел I. Биотестирование: общие положения и понятия ............................. 7 Раздел II. Фитотестирование в диагностике экологического качества .......... 10 Раздел III. Стандартный алгоритм измерений фитоэффектов ..................... 16 Методика измерений биологической активности почв, субстратов для растений, гуминовых веществ методом фитотестирования ................... 16 1. Назначение и область применения методики ............................................. 16 2. Метод измерений ........................................................................................... 17 3. Метрологические характеристики ................................................................ 18 4. Требования к средствам измерений, вспомогательным устройствам, реактивам и материалам .................................................................................. 18 5. Требования безопасности ............................................................................. 20 6. Требования к квалификации лиц, проводящих фитотестирование ........... 20 7. Условия проведения фитотестирования ..................................................... 20 8. Подготовка к выполнению измерений .......................................................... 21 9. Выполнение измерений. Процедура фитотестирования .......................... 29 10. Обработка результатов измерений ............................................................ 32 11. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории....................................................................................................... 33 Раздел IV. Практические рекомендации по выполнению фитотестирования 34 Вопросы для самоконтроля .............................................................................. 42 Задачи для практических занятий .................................................................... 44 Приложение А .................................................................................................... 49 Приложение Б .................................................................................................... 50 Приложение В .................................................................................................... 51 Литература ......................................................................................................... 54 3 Введение Под стандартами в широком смысле понимают нормативные документы, характеризующие особенности разработки и способы использования, направленные на решение определенной задачи, на достижение конкретной цели. Экологические стандарты — нормативные документы, устанавливающие определенные правила и последовательности действий для выявления уровня экологической безопасности, безопасности жизни и здоровья животных и растений. Несмотря на очевидную единую цель, существует подразделение на экологические стандарты разного уровня — международные, региональные, национальные, отраслевые. Семейство международных экологических стандартов ISO 14000, разработанное техническим комитетом международной организации по стандартизации — International Organization for Standardization (ISO), устанавливает критерии для системы эффективного экологического менеджмента, нацеленного на улучшение качества окружающей среды. ISO рекомендует использование подходов и методик из каталога стандартов, предложенных этой организацией (https://www.iso.org/home.html). В систему национальных экологических стандартов, обязательных для соблюдения государственными органами управления на территории Российской Федерации, включены такие, как например, ГОСТ 17.4.2.03-86. Охрана природы. Почвы. Паспорт почвы; ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ; ГОСТ 17.1.3.12-86. Охрана природы. Гидросфера. Общие правила охраны вод от загрязнения при бурении и добыче нефти и газа на суше; ГОСТ 20286-90. Радиоактивное загрязнение и дезактивация. Термины и определения; и другие (https://www.rst.gov.ru/portal/gost). Уже из этого перечня стандартов видно, что достижение поставленной в них цели предполагает стандартный алгоритм определения загрязняющих веществ в воздушной, водной и почвенной средах. Такой стандартный алгоритм (или последовательность действий) необходимый для сопоставимых измерений экологического качества объектов окружающей среды в РФ прописывается в стандартных аттестованных методиках, зарегистрированных в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений РФ (http://fundmetrology.ru/). 4 В настоящее время аттестованные методики активно внедряются в биологические исследования по контролю экологического качества, в биологическую диагностику природных сред и техногенных объектов, промышленных продуктов, отходов. Основу биологической диагностики экологического качества объектов окружающей среды составляют биоиндикация и биотестирование. Биоиндикация, как описательный метод, фиксирует определенное состояние биологических объектов в природных условиях по уже проявившимся (индицируемым) признакам. Биотестирование в опережающем режиме до проявления видимых эффектов позволяет устанавливать негативные воздействие на представителей биоты по реакции лабораторных тесторганизмов с известной чувствительностью к токсикантам. Результаты биотестирования позволяют эффективно предотвращать экологические риски возникновения чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера. В настоящее время лабораторный подход биотестирования имеет довольно широкий набор метрологически аттестованных методик – стандартных алгоритмов измерений эффектов, отражающих состояние живых систем. Продуктивность, и качество фитомассы — важнейшие характеристики плодородия почв. На этом основании оценка эффектов, стимулирующих или ингибирующих рост высших растений, является неотъемлемой характеристикой экологического состояния почв. В данном пособии излагаются основы фитотестирования и последовательность действий для определения фитоэффектов при экологической оценке объектов окружающей фитотестирования результаты, среды. Отраженные полученные в в протоколах аккредитованных лабораториях, служат основанием для принятия важных практических решений природоохранными контролирующими и управленческими органами согласно стандартам РФ. Учебное пособие подготовлено коллективом авторов – научными сотрудниками и преподавателями, использующими различные вариации методов фитотестирования в научных исследованиях и в педагогической практике. В нем содержится необходимая теоретическая информация общего характера, схемы и алгоритм биологического анализа и обработки данных, вопросы для самоконтроля и рекомендуемая литература. Представлены основные понятия, относящиеся к биотестированию, этапы проведения экспрессного фитотестирования пока еще не очень широко 5 применяемой в нашей стране удобной контейнерной технологии, согласно методическому стандарту – аттестованной методики с широкой областью применения, официальное название которой «Методика измерений биологической активности почв, субстратов растений, гуминовых веществ методом фитотестирования. Фитоскан-2». Методика, зарегистрирована в реестре МВИ (методик ФР.1.31.2020.38716 выполнения измерений) предприятием под «Всероссийский номером научно- исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП «ВНИИМС»). ФГУП «ВНИИМС» оформлено свидетельство об аттестации методики измерений № 205-09/RA.RU.311787/2020 от 30 ноября 2020 года в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-2009. Подготовленный в соответствии с действующими стандартами тест методики дает представление об основных разделах и требованиях к аттестации методик (согласно ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Методики (методы) измерений» и ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений»). Практическое значение представляет раздел, посвященный подробному описанию процедур подготовки проб почв, вод и других природных и техногенных объектов, для фитотестирования аппликатным и элюатным способами. Учебное аспирантов, пособие предназначено специализирующихся для по бакалавров, магистров направлениям и 05.03.02 «Почвоведение» и 05.03.06 «Экология и природопользование», а также будет полезно широкому кругу специалистов в областях экологического контроля, агроценологии и физиологии растений, слушателям программ повышения квалификации, реализуемых как на факультете почвоведения МГУ, так и в других организациях экологического и биологического профиля. 6 Раздел I. Биотестирование: общие положения и понятия Основные понятия в биотестировании Биотестирование представляет собой процедуру установления качества объектов исследования, объектов окружающей среды (ООС), с помощью биосенсоров или живых организмов (тест-организмов), сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций. Суть такой процедуры в определении воздействия испытуемых веществ на специально подобранные организмы в контролируемых условиях с регистрацией различных поведенческих, физиологических, биохимических или других ответов (тест-реакций) в стандартной тест-системе. Тест-система включает ограниченную определенным пространством (объемом) комбинацию чувствительных биологических элементов (сенсоров), или целых организмов и исследуемой среды, в которой они находятся. Для обозначения основных элементов, составляющих тест-систему, применяются термины «тест-объект» и «тест-организм» (или «тесткультура»). При этом тест-объектом является проба или образец, который подвергается исследованию и оказывая воздействие, вызывает тестреакцию у тест-организма (или выделенного из него чувствительного элемента). Тест-реакцию закономерно (или тест-функцию) возникающих ответных определяют реакций одну из тест-организмов как на воздействие в тест-системе. Количественным выражением тест-реакции является тест-параметр. Конечным результатом тестирования (endpoint — в англоязычной литературе) является значение тест-параметра, на основании которого делают вывод о том или ином воздействии, которое может быть как ингибирующим (отрицательным, токсичным), так и стимулирующим (положительным). В случае ингибирующих воздействий, приводящих к гибели тесткультуры, результат биотестирования традиционно выражают в показателях LD (lethal dose) или LC (lethal concentration) — летальная доза или летальная концентрация вещества. Обычно измеряют LD50 (LC50), LD10 (LC10) вызывающие 50%-ную или 10%-ную гибель тест-организмов в тест-системе. 7 Нередко в биотестах фиксируемой тест-функцией является не смертность (летальность) организмов, а какая-либо другая, например, гашение биолюминесценции бактерий или снижение энергии прорастания семян. Поэтому в общем виде говорят об определении действующей или эффективной концентрации — EC (effective concentration). Например, ЕС50, ЕС10, вызывающую 50%-ное или 10%-ное изменение значения тест-функции в опыте относительно контроля. Самая низкая установленная концентрация тестируемого вещества, при который вещество оказывает эффект, или наименьшая эффективная концентрация обозначается LOEC (lowest observed effect concentration). Максимальная концентрация при которой не наблюдается статистически значимого эффекта, недействующая концентрация, или безвредная, не вызывающая даже минимального эффекта — NOEC (no observed effect concentration). Для определения действующих концентраций исследуемого объекта применяют разбавление. Как правило, оно применяется к жидким пробам, но возможно разбавление почв и прочих твердых образцов незагрязненными аналогами, искусственной почвой. И в таком случае количественные характеристики токсичности, в частности, определяют по показателю БКР — безвредная кратность разбавления. Пороговым значением безопасного воздействия назначают чаще всего уровень БКР10, основываясь на положении о том, что ингибирование тест-функции в пределах 10 % не является критичным и функция может восстановиться до исходного состояния. Хотя, для микроводорослей и высших растений значение безвредной кратности разбавлений принимается 20%, т.е. БКР20. Таким образом, биотестирование можно определить как способ анализа степени негативного воздействия физических, химических и биологических неблагоприятных факторов среды, потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений биологически значимых показателей используемых тест-культур с последующей оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности. В зависимости от того, какое взаимодействие тест-организмов с исследуемым объектом анализируется, прямое или опосредованное, биотесты разделяют на контактные и элюатные. 8 При постановке контактных биотестов (которые называют также аппликатными), происходит непосредственное воздействие исследуемого объекта (образца) на тест-организм. В этом случае оценивается действие как растворимых веществ, так и ассоциированных с твердыми компонентами формы токсикантов или веществ, стимулирующих тест-функции. В элюатных биотестах из твердого образца (или жидкого образца с содержанием твердой массы 70% и более) делается водная вытяжка (экстракт выщелачивания). Экстракты готовятся в соотношении 1:4 или 1:10 (твердая масса:вода), соответственно, для почв или отходов. Экспонируются взвеси установленный период (например, 2 ч для почв или 7 ч для отходов) на шейкере, а затем жидкость сифонируется, фильтруется и исследуется в тест-системе. Полученные результаты в этом случае экстраполируются на исследуемый объект в целом, поскольку считается, что лишь водорастворимые компоненты исследуемого объекта (образца) являются биодоступными, а значит, воздействуют на организмы. 9 Раздел II. Фитотестирование в диагностике экологического качества Формирование почвенных ресурсов невозможно представить без растений и без сообществ микроорганизмов, трансформирующих растительные и другие органические остатки в органическое вещество почв. Взаимодействие в системе «почва-растение» составляет основу агроценологии. Обеспечение опоры и питания для растений, депонирование и сохранение всхожести семян относят к важнейшим экологическим функциям почв. Помимо урожайности культур, необходимы качественные характеристики и оценка безопасности продукции, что напрямую зависит от степени химического загрязнения почв. Фитодиагностика или диагностика с помощью растительных организмов, представляет объективный способ оценки не только плодородия, но и экологических функций почвы. Показатели развития растений дают информацию об изменении свойств почвы и нарушении разнообразных экологических функций, о степени пригодности почвы для растений и наличии загрязняющих веществ. Фитодиагностика включает два методических подхода к мониторингу и контролю экологического качества почв и других объектов окружающей среды: фитоиндикацию, основанную на изучении состояния растений по различным признакам, учет которых проводится in situ, в естественных природных условиях или агроценозах, и фитотестирование, которое проводится в контролируемых условиях лабораторного или вегетационного эксперимента на тест-растениях по известным и поддающимся учету характеристикам. Некоторые авторы (Николаева и Терехова, 2017) отмечают, что информативность и привлекательность высших растений для решения задач экологического контроля связаны с такими их свойствами как: - эукариотическое клеточное строение, структурное и морфологическое сходство Х-хромосомы с хромосомами млекопитающих; - чувствительность к мутагенам; - короткий жизненный цикл; - возможность масштабирования исследований; - относительная дешевизна исследований. 10 Достоинствами методов фитотестирования считают экспрессность, доступность, простоту в постановке экспериментов и экономичность, а основные требования воспроизводимости, стандартных достоверности и методик заключаются объективности в полученных результатов. Масштабирование фитотестов В агроценотической и природоохранной практике, в зависимости от масштаба и цели заложенного эксперимента, выделяют лабораторный, вегетационный (в сосудах) и микроделяночный (на экспериментальных площадках) способы фитотестирования. Лабораторный способ, как наиболее оперативный и дешевый, имеет некоторые преимущества перед остальными. Он получил широкое распространение как в исследовательских проектах, так и при решении практических задач. Многие исследователи отмечают высокую чувствительность и информативную значимость лабораторных методов тестирования, для определения фитотоксичности, тогда как вегетационные и микроделяночные эксперименты (опыты) являются методической основой агрохимических исследований. Постановка вегетационного эксперимента в сосудах, выполненная в контролируемых условиях, естественно, не позволяет установить значение отдельных факторов на рост, развитие и урожайность сельскохозяйственных культур в природных условиях. В вегетационных и микроделяночных экспериментах проводят оценку хронической фитотоксичности или испытание стимулирующих рост растений веществ в более продолжительном периоде, до стадии цветения или созревания семян в контрольных вариантах. В России действующий нормативный документ ГОСТ Р ИСО 22030-2009 для варианта Государственным хронического научным фитотестирования учреждением подготовлен "Всероссийский научно- исследовательский институт агрохимии имени Д.Н. Прянишникова" (ГНУ "ВНИИА"). Он идентичен международному стандарту ИСО 22030:2005* "Качество почвы. Биологические методы. Хроническая токсичность высших растений" (ISO 22030:2005 "Soil quality. Biological methods. Chronic toxicity in higher plants", IDT). Этот стандарт описывает метод оценки качества почв различного происхождения, содержащих неизвестные загрязнения. После 11 небольшой модификации метод может также применяться для измерения токсичности установленных химических соединений в почве. Согласно ГОСТ Р ИСО 22030-2009, оценка угнетения развития и хронической фитотоксичности основана на определении параметров прорастания, вегетативного роста и способности к размножению не менее двух видов растений на промежуточном этапе развития через 14 дней после посева и на конечном этапе вегетации растений. В микроделяночном опыте фитотестирования растения в большой большой степени подвержены воздействию внешних факторов (температура, влажность, вредители, возбудители болезней растений), напрямую не связанными с качеством анализируемой почвы. В разных направлениях использования фитотестирования почв (экологическая оценка почв агроценозов, в городской среде, в импактной зоне промышленных предприятий или в ходе рекультивации) решаются конкретные методические вопросы. Они касаются, прежде всего, выбора тест-культур и анализируемых параметров, учета особенностей свойств почв и их возможного влияния на токсичность (что продиктовано целью исследования и особенностями объекта). Выбор тест-культур Протоколом фитотестирования предусмотрена работа с семенами разных культур и даже среди видового разнообразия иногда отдается предпочтение определенным сортам растений. Выбор конкретных видов тест-культур зачастую четко прописан в методике. Во многом точность эксперимента зависит и от тщательной подготовки семян тест-культур к процедуре фитотестирования. Во многих исследованиях показана эффективность применения мелких семян растений. Они достаточно быстро расходуют собственные запасы питательных веществ и вскоре после прорастания рост таких растений становится очень зависимым от присутствующих в аналитическом образце компонентов. По этой причине большой популярностью в разных методиках пользуется культура кресс-салата (Lepidium sativum). В некоторых зарубежных и российских рекомендациях обосновывается зональный подход к использованию тест-видов растений. Так, для анализа загрязненных черноземов предлагается использовать семена наиболее характерных для исследуемого типа почв возделываемых культур, а именно, пшеница (Triticum spp.) (Колесников и др., 2006). 12 Бельгийские разработчики методики фитотестирования рекомендуют использовать одновременно три вида тест-растений: одно однодольное – сорго сахарное Sorghum saccharatum и два двудольных – кресс-салат Lepidium sativum и горчицу белую Sinapis alba (http://www.microbiotests.be/toxkits/phytotestkit.pdf). Но допускают применение других видов, характерных для тех почв, которые подвергаются исследованию. Согласно международному стандарту ISO 11269-1 для биотестирования рекомендуется использовать ячмень обыкновенный Hordeum vulgare сорта СV Triumph, хотя также допускается применение и семян других видов. В другом международном стандарте ISO 11269-2 регламентируется выбор минимум двух видов растений. В нормативном документе по обоснованию класса опасности отходов производства и потребления (МР 2.1.7.2297-07) в лабораторных фитотестах рекомендуется применять семена овса Avena spp., поскольку они, по мнению разработчиков, давали результаты сравнению по наиболее с стабильные семенами и других воспроизводимые культур таких как представители родов Pisum, Cucumis, Triticum, Daucus и др. Кафедра агрохимии МГУ рекомендует метод определения токсичности почвы с использованием семян редиса (р. Raphanus), что обосновывается высокой степенью их отзывчивости на присутствие поллютантов (Практикум по агрохимии, 2001). При решении задач экологического почвоведения фитотестирование проводится не только для оценки безопасности или степени загрязнённости почв, но и для суммарной оценки качества продукции и ее обогащённости жизненно важными макро- и микроэлементами. В целом большинство авторов рекомендуют использовать не один вид, а набор видов, состоящий из однодольных и двудольных растений. Об избирательной чувствительности тест-культур Совершенно естественно, что разные виды растений обладают разной чувствительностью к поллютантам. Об избирательной чувствительности разных растений к внешним воздействиям свидетельствует целый ряд примеров. В одних публикациях отмечается избирательная чувствительность семян салата, сорго и горчицы, выращенных на грунтах, загрязненных комплексом полиароматическими тяжелых углеводородами 13 металлов, (ПАУ). нефтепродуктами Ряд видов и растений, соответствующий снижению их чувствительности к указанным токсикантам в исследованных грунтах, располагают в следующем порядке: Lepidium sativum — Sinapis alba — Sorghum saccharatum. Высокой чувствительностью двудольные растения Lepidium sativum и Sinapis alba по сравнению с однодольными растениями Sorghum sp., отмечали при тестировании доннных отложений, загрязненных тяжелыми металлами и пестицидами (Sumorok et al., 2005). В то же время вид сорго сахарное Sorghum saccharatum характеризовался наибольшей чуствительностью к загрязнению почвы нефтепродуктами (Baran et al., 2009). Есть данные, указывающие на большую чувствительность семян риса Oryza sativa по сравнению с семенами редиса Raphanus sativa при тестировании фосфогипса (Каниськин с соавт., 2007). Хорошо воспроизводимые результаты получены при тестировании фосфогипса, биогрунтов, наноматериалов с использованием семян горчицы белой Sinapis alba (Терехова и др., 2009]) При проведении фитотестирования важно учитывать влияние факторов среды. В большинстве работ показана прямая связь между уровнем загрязнения почвы и ее фитотоксичностью. Однако в некоторых случаях фитотоксический эффект на рост растений проявляли почвы с меньшей концентрацией поллютанта, по сравнению с более загрязненными почвами. Очевидно, что реакция тест-растений складывается из собственно реакции на поллютанты и реакции на другие компоненты, присутствующие в исследуемом образце. Наличие питательных элементов в анализируемой пробе существенно нивелирует токсичность, присутствующих в почве поллютантов. Установлено также, что с увеличением содержания гумуса фитотоксичность почв уменьшается (Верхошенцева, Галактионова. 2014; Терехова и др., 2021). Результат информационно-логического анализа, включающего рассмотрение множества почвенных факторов, дает возможность судить о снижении уровня фитотокчичности и ранжировать их действие следующим образом: гумус, нитратный азот, CО2 карбонатов, кислотность почв, потенциальный микробный токсикоз почв. (Шпис и Ананьева.2010). На оценку степени фитотоксичности почвы большое влияние оказывает гранулометрический состав. В частности, при одном и том же уровне загрязнения фитотоксичность легких песчаных почв, как правило, выше по сравнению с тяжелыми глинистыми почвами (Czerniawska-Kusza et al., 2006). Все это важно иметь ввиду для правильной интерпретации результатов фитотестирования. 14 15 Раздел III. Стандартный алгоритм измерений фитоэффектов Методика измерений биологической активности почв, субстратов для растений, гуминовых веществ методом фитотестирования По результатам результатов, предприятием метрологической проведенной экспертизы Федеральным "Всероссийский экспериментальных Государственным унитарным научно-исследовательский институт метрологической службы" (ФГУП "ВНИИМС") на методику измерений биологической активности набора объектов окружающей среды методом фитотестирования (ФИТОСКАН – 2) выдано свидетельство об аттестации № 205-09/RA.RU.311787/2020 от 30 ноября 2020 года (Приложение A), регистрационный код методики измерений в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений ФР.1.31.2020.38716. Представленная методика со всеми необходимыми разделами подготовлена в соответствии с действующими стандартами, а именно, ГОСТ Р 8.563-2009 «Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Методики (методы) измерений» и ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». 1. Назначение и область применения методики Настоящий документ устанавливает методику экспрессной оценки субстратов для растений и биологически активных веществ, по изменению энергии прорастания, длины корней и ростков у проростков семян двудольных и однодольных растений при их проращивании в вертикально расположенных прозрачных пластиковых планшетах в лабораторных условиях. Методика распространяется на оценку экологической безопасности почв, субстратов для растений, отходов, биологически активных веществ, включая гуминовые, и выявление фитотоксичности, обусловленной избыточным содержанием гуминовых компонентов или загрязняющих 16 химических веществ. Методика измерений позволяет проанализировать действие исследуемых объектов на проростки семян как в виде водных растворов и экстрактов (элюатный способ), так и при контакте семян с твердой массой образца (аппликатный способ). Методика рекомендована для установления эффективных стимулирующих и/или токсичных (ингибирующих) эффектов почв, твердых субстратов, значений массовой концентрации биологически активных веществ. Диапазоны измерений энергии прорастания, длины корней и ростков семян относительно холостого опыта представлены в таблице 1. Таблица 1. Показатель Показатель промежуточной воспроиз- Диапазон Показатель прецизионности водимости измерений точности (относительное (относительное Наименование относительно (границы среднеквад- среднеквад- тест-параметра холостого относительной ратическое ратическое опыта, % погрешности), отклонение отклонение δ, % промежуточной воспроиз- при Р=0,95 прецизионности), водимости), σI(TO), % σR, % 40 17 20 40 17 20 40 17 20 Энергия прорастания Длина корней Длина ростков От 0 до 150 вкл. От 0 до 200 вкл. От 0 до 200 вкл. 2. Метод измерений Методика основана на современной технологии фитотестирования в прозрачных пластиковых двухкамерных планшетах. Семена помещают в 17 планшеты на подложку из фильтровальной бумаги, пропитанную исследуемой пробой или дистиллированной водой (холостой опыт). Затем регистрируют изменение энергии прорастания семян, длины корней и ростков проросших семян относительно холостого опыта. Измерения проводят с помощью линейки непосредственно в планшетах, что исключает трудоемкие манипуляции с извлечением семян и проростков из сосудов для прямого измерения длины корней и побегов. 3. Метрологические характеристики При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешностей (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице 1. 4. Требования к средствам измерений, вспомогательным устройствам, реактивам и материалам 4.1. Средства измерений. • • Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427-75. Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ Р 53228-2008. • рН-метр с диапазоном измерения pH от 0 до 14 ед. рH, с пределами допускаемой абсолютной погрешностью измерений ±0,2 ед. рH. • Цилиндры мерные вместимостью 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770-74. • Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770-74. • Пипетки мерные с одной отметкой 1-2-1, 1-2-2, 1-2-5, 1-2-10, 1-2-25 по ГОСТ 29169-91. • Автоматические дозаторы вместимостью от 0,1 до 0,2 см3, с относительной погрешностью измерений ± 1,0 %, производства фирмы Thermo. 4.2. Вспомогательные устройства. • Пробирки П-1-21-200, П-2-25-250, П-1-30-270 по ГОСТ 25336-82. 18 • Пинцет по ГОСТ 21241-89. • Сушильный шкаф электрический общелабораторного назначения по ТУ 64-1-909-80. • Термостат суховоздушный электрический по ТУ 64-1-1382-83. • Ступка №2 по ГОСТ 9147-80. • Пестик №1 по ГОСТ 9147-80. • Чашки Петри по ГОСТ 25336-82. • Планшеты прозрачные пластиковые одноразовые, производства фирмы MicroBio Test Inc. или ООО «Фелица». • Стакан химический термостойкий В-1-250 ТС ГОСТ 25336-82. • Шпатель химический лабораторный металлический по ГОСТ 19126-2007. • Кристаллизатор лабораторный стеклянный по ГОСТ 1097-75-3. • Баня водяная лабораторная по ТУ 10-23-103-88. • Эксикатор по ГОСТ 25336-82. Воронка Бюхнера по ГОСТ 9147-80. • Мешалка лабораторная (ТУ 25-05-2160-76Е) или аппарат для встряхивания (ТУ 25-052160-76), или мешалка магнитная (ТУ 2511-834-73), или перемешивающее устройство ПЭ-6410 М (ТУ 3614008-23050963-99). • Насос вакуумный любого типа, например, водоструйный стеклянный по ГОСТ 25336-82 с приемником объемом 1000 см3. • Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание при температуре минус 20 °С. • Чашка выпарительная фарфоровая №3 по ГОСТ 9147-80. • Сито для просеивания диаметром 2 мм по ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1-90). 4.3. Реактивы и материалы. • Семена сельскохозяйственных растений по ГОСТ Р 52325-2005. • Вода, дистиллированная по ГОСТ 6709-72. • Кислота азотная, квалификации "х.ч." по ГОСТ 4461-77. • Фильтры бумажные обеззоленные "белая лента" по ТУ 6-09-167895. • Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-82. • Бумага крафтовая. Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с метрологическими и техническими характеристиками, не хуже приведенных выше. 19 5. Требования безопасности • При проведении работ с химическими реактивами соблюдают требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021-75. • Безопасность при работе с электроустановками обеспечивают по ГОСТ 12.1.019- 2017 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию. • Организацию обучения работников безопасности труда проводят по ГОСТ 12.0.004-2015. • Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности труда по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. • Измерения проводят в спецодежде, пользуются резиновыми перчатками, тщательно убирают рабочее место, дезинфицируют руки спиртом после работы. 6. Требования к квалификации лиц, проводящих фитотестирование 6.1. К самостоятельной работе в лаборатории допускаются специально подготовленные лица не моложе 18 лет, прошедших медицинское освидетельствование, проверенных в установленном порядке на знание правил, норм и инструкций по технике безопасности, пожарной безопасности и прошедших первичный инструктаж на рабочем месте. 6.2. К проведению анализов по настоящей методике допускаются лица с квалификацией не ниже лаборанта, освоивших методические приемы в области токсикологии и фитотестирования. 7. Условия проведения фитотестирования 7.1. Анализ проводят при нормальных лабораторных условиях по ГОСТ 15150-69. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. 7.2. Температура окружающего воздуха в лаборатории от 18 °С до 25 °С. 7.3. Температура в термостате для биотестирования (22±2) °С. 7.4. Относительная влажность воздуха не более 80 %. 20 7.5. Атмосферное давление от 84 до 106 кПа (от 630 до 800 мм рт. ст.). 7.6. При использовании электроприборов частота переменного тока 50±1 Гц и напряжение в сети 220 В. 7.7. Освещение помещения естественное или искусственное, не ограниченное особыми требованиями. 8. Подготовка к выполнению измерений 8.1. Приготовление раствора азотной кислоты с массовой долей 10 %. Мерным цилиндром вместимостью 100 см3 отбирают 70 см3 концентрированной азотной кислоты с плотностью 1,4 г/см 3. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают примерно 500 см3 дистиллированной воды и осторожно приливают из цилиндра азотную кислоту в воду. Доводят объем раствора дистиллированной водой до метки. Тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 1 год. 8.2. Подготовка посуды. Для отбора и хранения проб применяют емкости, изготовленные из полимерных материалов и одноразовую посуду пластика. из стекла. Рекомендуется Посуда для использовать отбора проб и фитотестирования должна быть химически чистой. Стеклянную посуду промывают азотной кислотой с массовой долей 10 %. Стенки посуды осторожно смачивают азотной кислотой, после чего на 2-3 ч посуду оставляют, затем тщательно промывают водопроводной водой, споласкивают дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается использовать синтетические поверхностно-активные вещества и органические растворители. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, в сушильном шкафу при температуре 105 °С в течение 1 ч. Химически чистую посуду для биотестирования хранят с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах. 8.3 Требования к качеству семян растений и проверка их всхожести. 21 Для фитотестирования используют набор семян из не менее трех видов растений. Выбирают два представителя двудольных растений из следующий видов: горчица белая Sinapis alba, редис посевной Radish sativa и кресс салат Lepidium sativa, и одного представителя однодольных растений из следующий видов: овес посевной Avéna sátiva и сорго Sorgum saccharatum. В экспериментах используют сухие неповрежденные семена, которые могут различаться по качеству. Проводят проверку всхожести семян из каждой используемой партии по ГОСТ 12038-84. Из каждой партии берут на проверку всхожести не менее 50 семян. Используют партии семян, всхожесть которых составляет не менее 95 %. 8.4. Приготовление растворов биологически активных веществ (БАВ). 8.4.1. Приготовление раствора БАВ с массовой концентрацией 1 г/дм3 (раствор А). 8.4.1.1. Приготовление раствора БАВ с массовой концентрацией 1 г/дм3 из порошковых препаративных форм. Навеску 0,25 г БАВ помещают в мерную колбу вместимостью 250 см 3, приливают небольшое количество дистиллированной водой, встряхивают для максимального растворения. Доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. 8.4.1.2. Приготовление раствора БАВ с массовой концентрацией 1 г/дм3 из жидких препаративных форм. В предварительно взвешенный термостойкий химический стакан (результат взвешивания в г фиксируют до второго десятичного знака) вносят 100 см3 раствора БАВ. Взвешивают стакан с раствором (результат взвешивания в г фиксируют до второго десятичного знака). Затем раствор БАВ выпаривают до постоянной массы (разность между повторными взвешиваниями не должна превышать 0,01 г) на водяной бане при температуре не более 80 ºС. Стаканчик с сухим остатком взвешивают (результат взвешивания в г фиксируют до второго десятичного знака) и рассчитывают массовую долю БАВ w, %, в растворе по формуле (1) 𝑤= 𝑐−𝑎 · 100, 𝑏−𝑎 (1) где с – масса стаканчика с высушенным остатком, г, 22 a – масса пустого стакана, г, b – масса стакана с раствором, г. Рассчитывают объем БАВ V, см3, для приготовления анализируемого раствора по формуле (2): 𝑉= 0,25·100 𝑤 , (2) где w – массовая доля БАВ, %. Рассчитанный объем БАВ по формуле (2) вносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. 8.4.2. Приготовление раствора БАВ с массовой концентрацией 100 мг/дм3 (раствор Б). В мерную колбу вместимостью 100 см3 переносят пипеткой 10 см3 раствора А, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. 8.4.3. Приготовление раствора БАВ с массовой концентрацией 10 мг/дм 3 (раствор В). В мерную колбу вместимостью 100 см3 переносят пипеткой 10 см3 раствора Б, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. 8.4.4. Приготовление раствора БАВ с массовой концентрацией 1 мг/дм3 (раствор Г). В мерную колбу вместимостью 100 см3 переносят пипеткой 10 см3 раствора В, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. 8.4.5. Срок хранения растворов А, Б, В и Г не более 5 дней в холодильнике. 8.5. Подготовка почв. В лаборатории почву сначала разрыхляют вручную металлическим шпателем и освобождают от материала, заведомо относящегося к инородным (случайным) механическим включениям (возможные промышленные, строительные бытовые отходы и т.п.), а также галечника, обломков камней, корневищ, веток. Перед фитотестированием пробы доводят до воздушно-сухого состояния. Для этого пробу подсушивают в 23 вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении, размещая ее (в зависимости от массы и естественной влажности) в стеклянных кристаллизаторах подходящей вместимости, на стекле или на чистых листах плотной бумаги. Размещенные таким образом пробы выдерживают открытыми не менее двух часов при комнатной температуре и влажности воздуха (ГОСТ 5180-2015 "Грунты. Методы лабораторного определения физических характеристик"). Подготовленную пробу распределяют на ровной поверхности слоем толщиной не более 1 см и отбирают ложкой или шпателем из 5-ти точек методом конверта. Предназначенные для исследования пробы не должны подвергаться тепловой обработке, поэтому гигроскопическую влажность пробы определяют в отдельном образце. Затем пробу делят на две равные части: для биотестирования и для определения гигроскопической влажности после высушивания до постоянной массы, что необходимо для пересчета воздушно-сухой пробы на абсолютно-сухую массу. Определяют гигроскопическую влажность стандартным методом. В предварительно взвешенный сушильный стаканчик помещают среднюю пробу анализируемого субстрата в количестве от 8 до 20 г (результат взвешивания в г фиксируют до второго десятичного знака). Пробу сушат в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре от 100 ºС до 105 ºС в течение 5-8 часов. После сушки пробы помещают в эксикатор с CaCl 2 на дне, охлаждают 20 – 30 мин и затем взвешивают. Расхождение в массе после повторной сушки при высокой влажности допускается не больше 0,05 г, при средней и низкой влажности – 0,03 г. В случае невозможности охлаждения пробы в эксикаторе, пробу взвешивают в этот же день, категорически не допускается взвешивание на следующий день. Данные, полученные при определении влажности, заносят в таблицу. Значение массы воды 𝑎 в отобранной пробе рассчитывают по формуле (3): 𝑎 = 𝑚 − 𝑚с , (3) где m – масса стаканчика с сырой почвой до высушивания, г, mс — масса стаканчика с сырой почвой после высушивания, г. Значение массы абсолютно сухой навески почвы 𝑝𝑐 , г, рассчитывают по формуле (4): 𝑝𝑐 = 𝑚с − 𝑚ст , 24 (4) где mс — масса стаканчика с сырой почвой после высушивания, г, mст — масса пустого стаканчика, г. Содержание влаги 𝑊 , %, рассчитывают по формуле (5): 𝑎 𝑊 = 𝑝𝑐 · 100, (5) где a – масса воды в отобранной пробе, г, которую рассчитывают по формуле (3), рс — массы абсолютно сухой навески почвы, г, которую рассчитывают по формуле (4). Содержание влаги используют для расчета массы воздушно-сухой пробы, предназначенной для приготовления водной вытяжки. Обычно требуется 120 – 200 г воздушно-сухой массы пробы. После выщелачивания 100 г абсолютно-сухой массы пробы будет получено приблизительно 900 см 3 водной вытяжки, учитывая это, рассчитывают общее необходимое минимальное количество отбираемой порции пробы с учетом процедуры сокращения пробы. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта для проведения фитотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний. Пробу образцов в воздушно-сухом состоянии взвешивают так, чтобы абсолютно-сухая масса была 100 ± 1 г. Фиксируют значения массы и содержания влаги и помещают в сосуд для выщелачивания. 8.6. Подготовка экстрактов из образцов почв, субстратов для растений. Водную вытяжку из образцов для фитотестирования готовят в соотношении: 1 часть почвы (с учетом гигроскопической влажности) и 4 части дистиллированной воды. Для приготовления водной вытяжки из почвы взвешивают от 100 до 200 г пробы почвы в воздушно-сухом состоянии, пересчитав на абсолютно-сухую массу. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта при проведении фитотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний. Навеску почвы помещают в колбу вместимостью 1000 см3 и приливают 4-кратное количество дистиллированной воды. Далее на аппарате для встряхивания жидкости полученную смесь встряхивают в течение 2-х часов, после чего 25 отстаивают в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сифонируют, а затем фильтруют через бумажные обеззоленные фильтры "белая лента" или через мембранные фильтры с диаметром пор 3,5 мкм (фильтры предварительно промывают и кипятят в дистиллированной воде не менее 10 мин). Бумажный фильтр помещают в воронку Бюхнера диаметром от 15 до 20 см. Перед тем как вылить вытяжку на фильтр, содержимое склянки или колбы встряхивают, чтобы взмутить присутствующие взвешенные частицы почвы. На фильтр стараются перенести всю взвесь. При выливании струю суспензии направляют на боковую двойную стенку бумажного фильтра, но не на дно фильтра, так как при выливании на дно бумага может легко порваться. Фильтрацию осуществляют с помощью вакуумного водяного или электрического насоса. Для фильтрации применяют слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.). 8.7. Подготовка экстрактов из образцов отходов. 8.7.1. Приготовление водной вытяжки из осадков сточных вод, отходов. Водную вытяжку из осадков сточных вод и отходов готовят из соотношения твердая фаза:жидкость равным 1:10. В качестве жидкости используют дистиллированную воду. 8.7.1.1. Твердые отходы и осадки сточных вод. Пробу тщательно перемешивают перекатыванием на гладкой, гибкой и плотной подстилке, затем совком. Для пробоподготовки пробы отходов требуется 2,5 кг, пробы осадков сточных вод — 1 кг. Общий объем отобранной пробы (5 кг отходов или 2 кг осадков сточных вод) делят на представительные половины, одну из частей возвращают в сосуд для хранения, оставшуюся часть разрыхляют и тщательно просматривают. В случае обнаружения частиц более 10 мм их осторожно измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Затем пробу высушивают до воздушно-сухого состояния. При плохом высыхании отхода экспозицию высушивания допускается увеличивать до 24 часов. После этого пробу сокращают в 3 – 4 раза методом квадратирования. Тщательно перемешанную пробу разравнивают на гладкой ровной поверхности на крафт бумаге, клеенке или полиэтиленовой пленке и с помощью линейки или специальной решетки делят на равные квадраты. Затем из квадратов в шахматном порядке отбирают порции, обеспечивая захват всей толщины слоя, и объединяя порции в пробу с минимальной абсолютно-сухой массой 26 200 г представительной пробы, которую делят на две части и назначают для биотестирования и определения влажности. Влажность проб определяют по 8.5. Измеренную характеристику влажности используют для расчета массы воздушно-сухой пробы, предназначенной для приготовления водной вытяжки. Обычно требуется 120–200 г воздушно-сухой массы пробы. После выщелачивания 100 г абсолютно-сухой массы пробы будет получено приблизительно 900 см3 водной вытяжки. Принимая это во внимание, следует определить общее необходимое минимальное количество отбираемой порции, с учетом процедуры сокращения пробы. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта для проведения биотестирования во всех предполагаемых разведениях с учетом контрольных испытаний. Пробу осадков, отходов в воздушно-сухом состоянии взвешивают так, чтобы абсолютно-сухая масса была 100 ± 1 г. Фиксируют значения массы и содержания влаги и помещают в сосуд для выщелачивания. 8.7.1.2. Шламы. Шламы с большим содержанием твердой фазы, не разделяющиеся самостоятельно, обрабатывают также как твердые отходы. Отдельно определяют содержание влаги. Масса шлама, эквивалентная 100 ± 1 г абсолютно-сухой массы используют для приготовления водной вытяжки. Шламы с большим содержанием жидкости (влажность более 70 %) обрабатывают следующим образом. Жидкость фильтруют через вакуумный фильтр 0,45 мкм и собирают 300 г влажно-твердого материала. Если такого количества пробы недостаточно для получения 200 г абсолютно-сухого вещества, собирают столько, сколько необходимо. Пробы высушивают до воздушно-сухого состояния по 8.5. При плохом высушивании время экспозиции увеличивают до 24 ч. Пробу делят на две части, в одной определяют содержание влаги, а другую часть, составляющую 100 ± 1 г абсолютно-сухой массы, переносят в сосуд для выщелачивания. В рабочем журнале регистрируют массу остатка и содержание влаги в нем. Твердые шламы выщелачивают культивационной водой в пропорции (1:10). 8.7.1.3. Жидкие отходы. Отходы и осадки сточных вод, жидкие и содержащие менее 1 % взвешенного материала не подвергают выщелачиванию, а испытывают прямо на фитотоксичность после фильтрации через фильтр "белая лента". 8.7.2. Выполнение процедуры подготовки экстракта выщелачивания. 27 В сосуд для выщелачивания, где находится взвешенная воздушно-сухая масса отхода или осадка сточных вод с абсолютно-сухой массой 100 ± 1 г, добавляют дистиллированную воду. Воду добавляют в сосуд для выщелачивания в соотношении сухая масса : жидкость - 1:10. Обычно это 1000 см3 воды на 100 г абсолютно-сухой массы. Если используют меньшее количество пробы, уменьшают количество жидкости. Нельзя использовать для выщелачивания менее чем 20 г твердого вещества и 200 см 3 воды. Объемы воды более 10 см3 измеряют мерным цилиндром, объемы меньше 10 см3 мерной пипеткой. Смесь перемешивают на мешалке в течение 7 – 8 часов таким образом, чтобы твердое вещество находилось во взвешенном состоянии. Используют большую лопасть механической мешалки или магнитную мешалку, а скорость перемешивания должна быть наименьшей, при которой материал поддерживается во взвешенном состоянии (не более 70 об/мин). После окончания перемешивания раствор с осадком оставляют на ночь на 12-18 ч для отстаивания. Затем жидкость над осадком сифонируют. Если после отстаивания жидкость становится прозрачной, фильтрование не требуется, если же имеется какой-либо видимый взвешенный материал, то жидкость фильтруют. В случае применения фильтрования это отмечают в рабочем журнале. Фильтрацию осуществляют через фильтр "белая лента" на воронке Бюхнера. Для фильтрации применяют слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.) с помощью водяного или электрического насоса такой же мощности. Вакуум выключают немедленно после прохождения всей жидкости через фильтр, во избежание дегазации фильтрата. Затем жидкость над осадком сифонируют. Полученный экстракт выщелачивания исследуют на фитотоксичность. Процедуру фитотестирования начинают не позднее, чем через 6 ч после приготовления вытяжки из осадка, отхода. Если это невозможно, допускают хранение экстракта в холодильнике не более 48 ч при температуре 4 °С. Перед биотестированием измеряют рН в полученном экстракте. Значения рН фиксируют в лабораторном журнале. Если осадки сточных вод или отходы были разделены на жидкую и твердую фракции, результаты исследования жидкой фракции и экстракта выщелачивания из твердой фракции указывают в отчете отдельно. Если одна из этих частей была признана токсичной, токсичным признается весь отход. 8.8. Подготовка планшетов к экспозиции семян. Экспозицию семян проводят в одноразовых пластиковых двухкамерных планшетах с крышкой (размер 18х12см). Нижнюю камеру заполняют почвой, субстратом для растений или другим анализируемым твердым образцом (аппликатный способ), либо фильтровальной бумагой, пропитанной 28 анализируемым раствором БАВ, экстрактом из твердых анализируемых образцов (элюатный способ). Аппликатный способ. Применяется для анализа твердых образцов или опосредованного действия растворов БАВ, внесенных в модельную почву. В качестве модельной почвы используют стандартную почвенную смесь согласно ИСО 11268-1, состоящую из каолина, торфа и песка в объемном соотношении 20:10:70. Почву измельчают, просеивают через сито с диаметром ячеек 2 мм, высыпают в камеру планшета. Для увлажнения 90 см 3 почвы добавляют 30 см3 дистиллированной воды (холостой опыт). Воздушно-сухие образцы (почва, субстраты, отходы) измельчают в ступке (максимальный размер частиц не должен превышать в диаметре 0,5 см) и высыпают в нижнюю камеру планшета. Нижнюю камеру планшета накрывают фильтровальной бумагой и на нее в верхней части камеры на равном расстоянии раскладывают от 9 до 15 семян, в зависимости от размера. Элюатный способ. Применяется при анализе водных растворов БАВ, экстрактов (элюатов) из образцов почв, субстратов, отходов. Анализ проводят с помощью фильтровальной бумаги, увлажненной 10 см 3 раствора БАВ, экстрактов или дистиллированной воды (холостой опыт), которую помещают в нижнюю камеру планшета (три слоя). Затем в верхней части нижней камеры на фильтровальную бумагу на равном расстоянии раскладывают от 9 до 15 семян, в зависимости от размера. Пластиковые планшеты с семенами (Приложение Б) закрывают прозрачной крышкой, маркируют в правом нижнем углу с указанием даты постановки эксперимента, вида семян и номером анализируемой пробы. Первые сутки планшеты выдерживают в горизонтальном положении, чтобы семена не попали в нижнюю часть камеры и были достаточно увлажнены исследуемыми растворами. Затем планшеты устанавливают вертикально в коробки и экспонируют при температуре (22±2) °С в термостате. Освещенность не имеет значения. Общий срок экспозиции семян, как правило, − 96 ч. 9. Выполнение измерений. Процедура фитотестирования 9.1. Рекогносцировочный опыт проводят для определения значений фитоэффективной массовой концентрации БАВ и направленности фитоэффекта (ФЭ) (стимуляция или ингибирование). Фитоэффект определяют по 29 изменению значений тест-параметров: энергии прорастания семян (Е), длины корней (Lк) и длины ростков (Lр), под действием анализируемых растворов БАВ в сравнении с холостым опытом. В рекогносцировочном опыте анализируют растворы БАВ со значениями массовой концентрации в диапазоне от 1 до 1000 мг/дм 3 и выявляют диапазон стимулирующих и/или ингибирующих значений массовой концентрации БАВ. 9.2. Основной опыт проводят с целью установления параметров фитоэффекта. В основном опыте тестируют растворы БАВ со значениями массовой концентрации, отличающимися в 2-3 раза от фитоэффективных значений массовой концентрации, установленных на первом этапе фитотестирования. Для приготовления раствора БАВ с массовой концентрацией в 2-3 раза меньше фитоэффективной массовой концентрации приливают от 25 до 50 см3 раствора БАВ с фитоэффективной массовой концентрацией в колбу вместимостью 100 см3, доводят объем раствора до метки дистиллированной С, водой, перемешивают. Массовую концентрацию полученного раствора мг/см3, рассчитывают по формуле (6): С= 𝐶ф ·𝑉ф 100 (6) , где Сф – фитоэффективная массовая концентрация, мг/см 3, Vф – объем раствора БАВ с фитоэффективной массовой концентрацией, см3. В экспериментах анализируют не менее трех растворов БАВ с разными значениями массовой концентрации в не менее чем трех планшетах. Фиксируют результаты измерений. 9.3. Измерение тест-параметров. Все измерения проводят через 96 ч после начала фитотестирования в планшетах. 9.3.1. Оценка энергии прорастания. Энергия прорастания (ЭП) семян характеризует способность семян к быстрому дружному прорастанию. Через 96 ч фиксируют количество проросших семян m, шт., в каждом планшете. 9.3.2. Определение длины корня. У двудольных растений линейкой измеряют главный корень, выделяю30 щийся толщиной и длиной среди придаточных и боковых корней. У однодольных растений линейкой измеряют длину самого длинного корня. Значение длины корня фиксируют в мм. 9.3.3. Определение длины ростка. При определении развития вегетативной части проростка с помощью линейки измеряют длину молодого стебля (ростка), т.е. расстояние от корневой шейки1 до вершины проростка (Рисунок 1). Полученные данные (число проросших семян, длина корней и ростков каждого семени) заносят в соответствующие графы таблицы Excel для последующей статистической обработки и вычисления средних показателей (Приложение В). Рисунок 1. Морфология проростков семян двудольных растений: (А — фасоли) и однодольных (Б — пшеницы и В — кукурузы) 1 — растущий эпикотиль (первое междоузлие главного побега), 2 — узел семядолей, 3 — растущий гипокотиль, 4 — корневая шейка, 5 — главный корень, 6 — боковые корни, 7 — придаточные 1 Корневая шейка (cóllum rádicis), зона перехода от корня к стеблю, отделяющая у растения подсемядольное колено (гипокотиль) от главного корня. У двудольных росток может быть представлен эпикотилем – надсемядольным и гипокотилем — подсемядольным участками проростка. У однодольных (злаковых) этот участок проростка получил название колеоптиле, или, колеоптиль (от греч. koleós — ножны и ptílon — перо), влагалищный лист, первый (бесцветный, зелѐный или красноватый) лист злаков, не имеющий листовой пластинки и представляющий собой замкнутую трубку. 31 корни. 10. Обработка результатов измерений 10.1. Энергию прорастания 𝐸 , %, для каждого планшета рассчитывают по формуле (7): 𝑚 𝐸 = 𝑀 · 100, (7) где m – число проросших семян, шт., M — общее число семян, использованных для анализа, шт. 10.2. Среднее арифметическое значение 𝑥𝑖 для i-ого тест-параметра из трех планшетов рассчитывают по формуле (8): 𝑥̅𝑖 = ∑ 𝑥𝑖,𝑗 𝑛𝑖 , (8) где хi,j – значение i-ого тест-параметра, ni – количество полученных значений i-ого тест-параметров из трех планшетов, j – номер планшета. 10.3 Фитоэффект ФЭ𝑖 , %, для каждого среднее арифметического значения i-ого тест- параметра рассчитывают по формуле (9): ФЭ𝑖 = 𝑥̅ 𝑖𝑜 −𝑥̅ 𝑖𝑥 𝑥̅ 𝑖𝑥 · 100, (9) где 𝑥̅𝑖𝑜 , 𝑥̅𝑖𝑥 среднее арифметическое значение i-ого тест-параметра в опыте и в холостом опыте, соответственно. Если значение фитоэффекта положительное, то наблюдают эффект стимуляции. Если значение фитоэффекта отрицательное, то наблюдают эффект ингибирования. Биологическую активность БАВ устанавливают по растворам со значениями массовой концентрации, стимулирующими или ингибирующими развитие семян растений (Приложение А). 10.4 Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде, 32 ФЭ𝑖 ± 0,01 · 𝛿𝑖 · ФЭ𝑖 при P=0,95, где ФЭi –значение фитоэффекта для i-ого тест-параметра, %, рассчитанное по формуле (9); i – границы относительной погрешности измерений i –ого тест параметра, % (таблица 1). 11. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности по 6.2.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории. Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30. При неудовлетворительных результатах контроля, например, превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора. 33 Раздел IV. Практические рекомендации по выполнению фитотестирования 1. Фитотестирование применяется для определения как фитостимулирующих эффектов, так и для установления токсичности. 2. Фитотоксичность регистрируют по изменениям ростовых и морфологических характеристик растений: всхожести семян, длины и биомассы всего растения или его наземной или подземной части. 3. При выборе семян с целью определения токсичности проб предпочтительны мелкие семена с небольшим запасом питательных веществ одинакового размера и массы. 4. При выборе видов тест-растений рекомендуется руководствоваться следующими принципами: - растения должны быть чувствительны к широкому спектру поллютантов и демонстрировать надежные и воспроизводимые данные; - применять зональный подход — использовать растения, для которых тестируемая почва является естественной средой обитания; - одновременно использовать однодольные и двудольные растения, как минимум, по одному из каждой группы, так как они обладают различной чувствительностью к поллютантам; - выбирать возделываемые либо дикорастущие виды в зависимости от целей исследования. 5. При выборе формы постановки фитотестирования целесообразно отдавать предпочтение субстрату в твердом виде, а не водным экстрактам, так как существует большое количество нерастворимых загрязняющих веществ (в частности, нефтепродукты). 6. При выборе тест-параметров, по которым судят о реакции растений на тестируемый объект, рекомендуется использовать не менее двух характеристик. Длина корня растения и всхожесть семян являются одними из наиболее информативных показателей. 7. При выборе почвенного образца в качестве контрольного (образца сравнения) следует предусмотреть сходство по ряду химических и физических свойств с испытуемыми образцами, в частности, рН среды, 34 гранулометрическому составу, содержанию органического вещества, а также по характеристике электропроводности раствора. 8. Минимальный набор посуды, материалов, приборов, необходимый для постановки эксперимента, должен включать: • стеклянные колбы (V=250 см3) • стеклянные стаканчики (V=75 см3) • цилиндры • пластиковый или фарфоровый шпатель • шейкер • весы • воронки • мерные пипетки • гомогенизатор, или другие приспособления для размельчения растительных образцов. • семена целевого растения • центрифуга • фильтровальная бумага или бумажные фильтры • климатостат • вода (дистиллированная) • ступки и пестики фарфоровые • вода водопроводная (после 10-15 мин кипения) • шпатели металлические • чашки Петри • пластиковые планшеты • сита почвенные • бумажные фильтры («белая лента») • линейка измерительная (с ценой деления 1 мм) • стандартная почвенная смесь (для разбавления почвенных образцов) 9. Анализу следует проводить свежеотобранные образцы (хранение при +2° — +4°С не более двух суток). Образцы с более длительным сроком хранения высушивают до воздушно-сухого состояния при температуре не выше 30 °С, растирают и просеивают через сито с отверстиями диаметром 1-2 мм. 10. Водная вытяжка из почвенного образца готовится в соотношении почва: вода — 1: 4. При устойчивом появлении окраски и повышенной мутности допускается приготовление вытяжки в соотношении 1: 10 (с учетом гигроскопической влажности). Суспензию встряхивают 2 часа, затем 30 мин отстаивают, затем фильтруют через фильтр «белая лента». 11. Фитотестирование в чашках Петри. В чашках Петри возможны два способа фитотестирования почвы – аппликатный и элюатный. Фитотестирование почвы (твердой фазы) аппликатным способом 35 В чашки Петри (минимум 3 чашки Петри для контроля и 3 — для тестируемого образца) вносят предварительно увлажненную до 60% от полной влагоемкости почву слоем высотой 1 см. В качестве контроля выбирают незагрязненную почву с аналогичным гранулометрическим составом и содержанием органического вещества. Во все чашки вносят семена в количестве от 10 до 30, в зависимости от размера, с целью обеспечить равномерное взаимодействие с почвой и отсутствие конкуренции за свет и питательные вещества при развитии растений. Чашки Петри закрывают крышками и размещают в термостат или фитотрон В течение опыта необходимо поддерживать влажность субстрата на одном и том же уровне, осуществляя регулярное взвешивание чашек и добавление воды с целью поддержания постоянного уровня влажности почвы. Фитотестирование почвы (водного экстракта) элюатным способом Чашки Петри с вложенными в них кружочками фильтровальной бумаги стерилизуются и охлаждаются. В каждую чашку помещается по 10-30 сухих семян. В опытные чашки вносят по 5 см3 экстракта или его разведений, в контрольные – 5 см3 дистиллированной воды. Все образцы помещаются в термостат (20-23°С). На 7-й день подсчитывают количество проросших семян и длину корней проростков в контрольных и опытных пробах. При анализе твердых проб корни растений отмывают от почвы водой. У двудольных растений линейкой измеряют главный корень, выделяющийся толщиной и длиной среди придаточных и боковых корней. У однодольных растений линейкой измеряют длину самого длинного корня, значение фиксируют в мм. 12. Анализ результатов. Результаты измерений оформляют в виде таблицы. Рассчитывают эффект торможения для параметров «всхожесть» и «длина корня» по формуле: Е т = L −L L к оп • 100% к , где Еm ― эффект торможения (%); Lоп ― средняя длина корней в опыте (мм); Lк ― средняя длина корней в контроле (мм). Результаты измерений оформляют в виде таблицы. 36 Аналогичная формула применяется для расчета эффекта торможения при анализе всхожести семян. Показателем токсического воздействия тестируемого объекта является снижение всхожести семян и/или уменьшение длины корней проростков по сравнению с контрольным вариантом. 13. При фитотестировании отходов (по МР 2.1.7.2297-07) и расчете класса опасности отхода выявляют кратность разведения пробы, при котором происходит подавление роста длины корней на 50 % (величина ER50), и далее устанавливается по табличным значениям (таблица 2). Для нахождения величины ER50 готовят серию последовательных разбавлений тестируемого вещества (набор 3-5 проб с разной концентрацией тест-объекта). В варианте работы с водными экстрактами разбавления исследуемого объекта осуществляются дистиллированной водой, а при работе с твердыми субстратами – кварцевым песком или субстратом того же состава, что и контроль. Определение ER50 основано на экспериментально установленной зависимости величины эффекта торможения от кратности разведения тестобъекта в соответствии с уравнением прямой общего вида: y = mx +b. Учитывая прямолинейный характер данной зависимости, принимая за «x» величину эффекта торможения, а за «y» логарифм разбавления экстракта, определение ER50 осуществляется с использованием регрессионной модели: LgR = -kEm + b, где где Em – эффект торможения, установленный в эксперименте; R – кратность разбавления отхода; k – коэффициент, соответствующий каждому значению эффекта торможения; b – коэффициент регрессии. Определив коэффициенты k и b и принимая Em = 50, можно рассчитать величину R и, соответственно, ER50. Соответствие класса и категории опасности отходов устанавливается по градациям кратности разбавления, приведенным в таблице 2. 37 Таблица 2. Класс опасности отхода, определяемый по подавлению роста длины корней при соответствующей кратности разбавления исследуемого образца Класс опасности 1 2 3 4 Категория Чрезвычайно Высоко Умеренно Мало опасности опасные опасные опасные опасные > 100 > 10–100 > 1–10 ≤1 Значения ER50 (кратность разведения пробы) 14. Фитотестирование в планшетах С помощью новых технологий на основе стандартного метода «Фитоскан-2» с расширенной областью применения решаются задачи по оценке безопасности почв, субстратов растений, отходов, биологически активных веществ, выявляется степень токсичности, обусловленная избыточным содержанием различных компонентов в субстратах для растений. Фитотестирование в прозрачных пластиковых планшетах (контейнерах), имеет целый ряд заметных преимуществ, в первую очередь благодаря тому, что они экспонируются вертикально, а корни и ростки ориентируются естественным образом. В чашках Петри для получения статистически достоверных результатов требуется анализировать по несколько сотен семян в одном опыте. Корешки проростков извлекаются по одному и проводятся измерения длины корней с помощью линейки для каждого проросшего семени. Очевидно, что такой способ обработки данных является весьма трудоемким. На процедуру измерения всей опытной партии требуется несколько часов. Кроме того, извлечение изогнутых и вросших в фильтровальную бумагу корней вносит большую погрешность в результаты измерений (рис. 2 а). При использовании контейнеров проросшие семена развиваются в них в «двумерном пространстве», корни проростков не скручиваются и не переплетаются, что существенно упрощает измерение их длины (рис. 2 б). В контейнерах (размером 18 х 12 см) раскладывают по 8-10 семян растений в нижнюю камеру планшета. Можно исследовать как водные экстракты из твердых субстратов, раскладывая семена на смоченную водным экстрактом фильтровальную бумагу, так и непосредственно твердые 38 субстраты, увлажненные и накрытые фильтровальной бумагой (желательно черного цвета, для лучшей контрастности с неокрашенными корешками). По истечении срока экспозиции планшетов с пробами и семенами, измеряют длину корней и ростков. Или же с помощью фотокамеры делают фотоснимки проростков, а затем переносят на компьютер. Цифровые фотографии изображений обрабатывают автоматически. с помощью Это компьютерных позволяет анализаторов существенно упростить процедуру обработки данных до нескольких минут, что делает тест более оперативным, надежным, свободным от ошибок исследователя. Данные автоматически архивируются и сохраняются на компьютере, к ним можно обратиться снова в нужный момент. Блок-схема дизайна эксперимента в планшетах в соответствии с методикой по определению биологической активности, в частности, гуминовых препаратов приведена на рисунке 3. а а б б 39 б в в Рис. 2. Способы проращивания семян при фитотестировании острой токсичности (а — в чашках Петри,,б — в пластиковых планшетах) и хронической токсичности (в — в вегетационных сосудах ) 40 Рис. 3. Блок-схема дизайна эксперимента в планшетах 41 Вопросы для самоконтроля 1. В чем отличие биотестирования от биоиндикации? 2. Дайте определение понятиям: тест-система, тест-функция тест-параметр, тест-объект, тест-культура. 3. Чем руководствуются при выборе тест-видов растений? 4. Какие требования предъявляются к качеству семян, используемых в фитотестестах? 5. В чем преимущество планшетного способа фитотестирования перед фитотестированием в чашках Петри? 6. Какие образцы могут служить контролем при аппликатном методе фитотестирования почв? 7. Какие растения вы предложили бы для фитотестирования черноземов степной зоны России, руководствуясь зональным подходом? 8. Какие параметры растений позволяет определять стандартная методика Фитоскан? 9. В чем отличие элюатного способа измерений фитоэффектов от аппликатного? 10. Перечислить требования к приготовлению растворов биологически активных веществ, дать формулу расчета объем БАВ для приготовления анализируемого раствора. 11. Каковы особенности подготовки к фитотестированию образцов почв, субстратов для растений, перечислить основные? 12. Перечислить рекомендации к подготовке экстрактов из образцов отходов на примере жидких отходов или шламов. 13. Какие основные требования к подготовке планшетов к экспозиции семян для аппликатного и элюатного метода? 14. Что характеризует энергия прорастания (ЭП) семян и как ее определяют? 15. Как рассчитать ингибирующий фитоэффект? 42 Тестовое задание для самоконтроля Каково должно быть соотношение твердой массы и воды при приготовлении водной вытяжки (экстрактов выщелачивания) из почвенных образцов для фитотестирования? 1. 1:4 2. 1:10 3. 1:2 Какой набор компонентов входит в состав стандартной почвенной смеси? 1. каолинит, торф, суглинок 2. каолинит, песок, торф 3. каолинит, глина, керамзит С какой целью проводится определение влажности почвы при проведении фитотестирования? 1. для правильного соотношения почвы и воды при приготовления водной вытяжки 2. для контроля условий проведения эксперимента 3. для расчета фитоэффекта Что показывает отрицательное значение фитоэффекта? 1. эффект ингибирования 2. эффект стимулирования 3. нейтральный эффект исследуемого образца на тест-культуру Какие средства для мытья лабораторной посуды можно использовать при подготовке к постановке биотестов? 1. синтетические ПАВ 2. органические растворители 3. азотную кислоту Как измеряют ростовые показатели корневой системы у однодольных культур? 1. измеряют и суммируют длину всех корней 2. измеряют и суммируют длину самого длинного и самого короткого корня 3. измеряют длину самого длинного корня 43 Задачи для практических занятий Задача 1. (блок-схемы 1-3) Фитотестирование в планшетах элюатным способом: • подготовка водной вытяжки (взвешивание, экстракция, фильтрование, измерение рН.и минерализации), • выбор семян овса и редиса, • распределение в камере планшета на фильтровальной бумаге (3 слоя), увлажненной водной вытяжкой, • экспозиция 96 час. Задача 2. (блок-схемы 1-3) Фитотестирование в планшетах аппликатным способом: • подготовка образцов почв, • загрузка почвы в нижнюю камеру планшета, • выбор и распределение семян овса и редиса, • экспозиция 96 час. Задача 3. (блок-схема 4) Снятие показаний и обработка результатов. 44 Вспомогательные схемы разных этапов и способов фитотестирования Блок-схема 1. Выбор тест-видов растений и требования к качеству семян 45 Блок-схема 2. Подготовка образцов к элюатному и аппликатному фитотестированию 46 Блок-схема 3. Заполнение и экспозиция планшетов 47 , Блок-схема 4. Снятие показаний и обработка данных 48 Приложение А (обязательное) Эффект стимуляции БАВ почв, твердых субстратов наблюдают при увеличении энергии прорастания и/или длины корней и/или ростков проросших семян на 20 % и более относительно холостого опыта. Эффект ингибирования (токсический фитоэффект) наблюдают при снижении энергии прорастания и/или длины корней и/или ростков проросших семян на 20 % и более относительно холостого опыта. Массовая концентрация БАВ, при которой фитоэффект составляет 20 %, считается минимально эффективной стимулирующей или токсичной (ингибирующей) массовой стимулирующую или концентрацией. токсичную массовую Среднюю эффективную концентрацию (EC50) устанавливают по отклонению значений тест-функций (энергия прорастания и/или длины корней и/или ростков) на 50 % относительно холостого опыта. При характеристике БАВ рекомендуется указывать эффективные значения массовой концентрации, вызывающие 20 %-ный и 50 %-ный фитоэффект относительно холостого опыта. Регрессионный анализ экспериментальных данных проводят при наличии не менее трех значений биологически активной массовой концентрации гуминового препарата. С помощью программы "Microsoft Excel" строят график зависимости десятичного логарифма значений массовой концентрации БАВ от стимулирующего или ингибирующего фитоэффекта. По оси абсцисс откладывают значения фитоэффекта, по оси ординат – значения десятичного логарифма массовой концентрации БАВ. Находят линейное уравнение зависимости десятичного логарифма массовой концентрации БАВ от фитоэффекта. Оценку достоверности полученной зависимости проводят по значению коэффициента корреляции r. Линейное уравнение адекватно описывает экспериментальные данные, если коэффициент корреляции принимает значения (0,9-1,0). 49 Приложение Б (справочное) Таблица Б.1 — Этапы фитотестирования в планшетах Прозрачный двухкамерный планшет с крышкой Нижняя камера планшета заполнена анализируемой массой твердого образца (почвой, в которую добавлены БАВ). Таким образом реализуется аппликатный способ фитотестирования. При элюатном способе семена раскладывают на подложку из фильтровальной бумаги, пропитанную испытуемым раствором. Семена разложены в верхней части нижней камеры. Вертикальное расположение планшетов в коробках при экспонировании По окончании экспозиции (~96 ч.) производится измерение длины корней проростков линейкой или сканирование для автоматизированной обработки. 50 Приложение В (справочное) Форма записи в рабочем журнале результатов измерений Таблица В.1 – Пример записи в рабочем журнале результатов измерений длины корней (положительный фитоэффект – стимуляция роста корней) Длина корней, мм Массовая концентрация, мг/дм3 0 (холостой опыт) 10 100 200 400 1000 1 планшет 32 45 45 49 53 56 2 планшет 33 44 45 49 52 57 3 планшет 32 44 47 48 53 55 32,3 44,3 45,7 48,7 52,7 56,0 Среднее арифметическое значение 51 Приложение Г (справочное) 52 53 Литература Основная ФР.1.31.2020.38716. Методика измерений биологической активности почв, (ФИТОСКАН – 2); Федеральный закон "Об охране окружающей среды" (от 10.01.2002 N 7-ФЗ ред. от 21.11.2011, с изм. от 07.12.2011; Федеральный закон от 08.08.2001 N 128-ФЗ (ред. от 29.12.2010) "О лицензировании отдельных видов деятельности" (с изм. и доп., вступающими в силу с 01.01.2011); ГОСТ 17.1.3.12-86. Охрана природы. Гидросфера. Общие правила охраны вод от загрязнения при бурении и добыче нефти и газа на суше; ГОСТ 17.4.2.03-86. Охрана природы. Почвы. Паспорт почвы; ГОСТ 20286-90. Радиоактивное загрязнение и дезактивация. Термины и определения; и др. Практикум по агрохимии (под.ред. В.Г. Минеева). - М.: Изд. МГУ. 2001. 688.с. Обоснование класса опасности отходов производства и потребления по фитотоксичности. Методические рекомендации – Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, МР 2.1.7.2297-07., 2007. 15 с. Биологический контроль окружающей среды: Биоиндикация и биотестирование/ Мелехова О.П., Егорова Е.И., Евсеева Т.И. / Издательство Академия, 2007. – 288 с. Рекомендуемая Методика выполнения измерений всхожести семян и длины корней проростков высших растений для определения токсичности техногенно загрязненных почв /Капелькина Л.П., Бардина Т.В., Бакина Л.Г. и др., М-П-2006. ФР.1.39.2006.02264: СПб., 2009. 19 с. Николаева О.В., Терехова В.А. Совершенствование лабораторного фитотестирования для экотоксикологической оценки почв. Почвоведение, 2017, 9, С. 1141–1152. Воронина Л.П., Якименко О.С., Терехова В.А. Оценка биологической активности промышленных гуминовых препаратов. Агрохимия. 2-12. 6. С.45-52. 54 Методики биотестирования, разработанные при участии ЛЭТАП letap.msu@gmail.com ФР.1.39.2006.02506. ПНД Ф Т 14.1:2:3.13-06 (ПНД Ф Т 16.1:2.3:3.10-06) Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных, поверхностных и грунтовых вод методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg; ФР 1.39.2006.0250. ПНД Ф Т 14.1:2.14-06 (ПНД Ф Т 16.1:3.11-06) Методика определения токсичности высокоминерализованных поверхностных и сточных вод, почв и отходов по выживаемости солоноватоводных рачков Artemia salina L.; ФР.1.39.2007.04104. ПНД Ф Т 16.3.12-07 Методика определения токсичности золошлаковых отходов методом биотестирования на основе выживаемости парамеций и цериодафний; ФР.1.39.2006.02506 (ПНД Ф Т 14.1:2:3.13-06 (16.1:2.3:3.10-06) Методика определения токсичности почв, отходов, осадков сточных вод, сточных, поверхностных и грунтовых вод методом биотестирования на основе реакции клеток млекопитающих in vitro; ФР.1.37.2010.08619 (ПНД Ф Т 16.1.17-10) Методика выполнения измерений интенсивности потребления тест-субстратов микробными сообществами почв и почвоподобных объектов фотометрическим методом; ФР.1.39.2012.11560 Методика измерений биологической активности гуминовых веществ методом фитотестирования. 55 Учебное пособие Кафедра агрохимии и биохимии растений МГУ Кафедра земельных ресурсов и оценки почв МГУ Лаборатория изучения экологических функций почв ИПЭЭ РАН Московский авиационный институт Терехова Вера Александровна, МГУ Воронина Людмила Петровна, МГУ Кирюшина Анастасия Петровна ИПЭЭ РАН Морачевская Екатерина Викторовна, МГУ Кыдралиева Камиля Асылбековна, МАИ СТАНДАРТНЫЙ АЛГОРИТМ ИЗМЕРЕНИЙ ФИТОЭФФЕКТОВ Формат 60х90 1/16 Бумага офсетная 80 г/м². Печать цифровая Тираж 100 экз. Заказ № 4618 Отпечатано в типографии Отдел полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова 119192 Москва, Ломоносовский проспект 27 Тел. +7 495 939-3511
