П.В. М иронов, Е.В. Ала удинова, В.В. Тарнопольская МОДЕЛИРОВАНИЕ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Красн оярск 2017 МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВО «Сибирский государственный аэрокосмический университет имени академика М.Ф. Решетнева» П.В. Миронов, Е.В. Алаудинова, В.В. Тарнопольская МОДЕЛИРОВАНИЕ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Утверждено редакционно-издательским советом университета в качестве учебного пособия для магистрантов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» всех форм обучения Красноярск 201 7 УДК 561.284.579.61 ББК 30.16 М Авторы: П. В. Миронов, Е. В. Алаудинова, В. В. Тарнопольская Рецензенты: доктор химических наук, профессор С. Р. Лоскутов (института Леса СО РАН); кандидат технических наук, доцент Н.С. Решетова (Сибирский государственный аэрокосмический университет имени академика М. Ф. Решетнева) Миронов, П. В. Моделирование и масштабирование биотехнологических процессов: учебное пособие для магистрантов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» всех форм обучения / П. В. Миронов, Е. В. Алаудинова, В. В. Тарнопольская. – Красноярск : СибГАУ. – 2017. – 138 с. В учебном пособии изложены вопросы создания математических моделей роста микроорганизмов в условиях периодического и непрерывного культивирования. В пособии также отражены основные способы масштабирования процессов микробного роста. Материал книги поможет приобрести навыки создания и анализа математических моделей роста микробных популяций, грибного мицелия, тканей растений, что, в свою очередь, обеспечит формирование соответствующих компетенций в области моделирования, разработки технологических процессов и проектирования биотехнологических производств у магистрантов направления 19.04.01 «Биотехнология». УДК 561.284.579.61 ББК 30.16 © ФГБОУ ВО «Сибирский государственный аэрокосмический университет имени академика М.Ф. Решетнева», 2017 © Миронов П.В., Алаудинова Е.В., Тарнопольская В.В. Оглавление Предисловие ……………………...........…………………....................... 1. Методы исследования биотехнологических систем.......................... 1.1. Основные принципы системного анализа. …………………. 1.2. Принципы построения математической модели биохимического реактора. ……................................................................................................ 2. Модели кинетики роста микроорганизмов в биохимических реакторах.............................................................................................................. 2.1. Рост и развитие микробной популяции.............................................. 2.2. Модели зависимости скорости роста микроорганизмов от концентрации субстрата.................................................................................... 2.3. Модели зависимости скорости роста микроорганизмов от концентрации продукта метаболизма............................................................. 2.4. Многофакторные модели..................................................................... 3. Модели кинетики роста микроорганизмов в биореакторах периодического действия...................................................................................................................... 3.1. Замедление скорости роста – модель Ферхюльста....................... 3.2. Модель роста, учитывающая потребление субстрата...................... 3.3. Оптимизация продолжительности процесса периодического культивирования................................................................................................... 4. Модели роста микроорганизмов в биореакторах непрерывного действия.............................................................................................................. 4.1. Условия непрерывного культивирования микроорганизмов........... 4.2. Теория хемостатного культивирования....................................... 4.3. Способы определения параметров роста культуры из экспериментальных данных хемостатного культивирования............................... 4.4. Ингибирование продуктами метаболизма в условиях хемостатного культивирования.................................................................................. 4.5. Непрерывное культивирование с рециркуляцией биомассы............ 4.6. Автоселекция в процессе хемостатного культивирования.............. 4.7. Сравнение производительности по биомассе периодического и непрерывного процессов............................................................................. 5. Масштабирование биотехнологических процессов............................. 5.1. Постановка задачи масштабирования................................................. 5.2. Подход к масштабированию на основе учета концентрации растворенного кислорода: аэрация при культивировании микроорганизмов... 5.3. Влияние концентрации растворѐнного в среде кислорода на рост микроорганизмов......................................................................................... 5.4. Абсорбция кислорода в биореакторах периодического и непрерывного действия при культивировании микроорганизмов............................ 5.5 Абсорбция кислорода в биореакторе непрерывного действия при культивировании микроорганизмов 5.6. Методы определения параметра KLa в аппаратах различного масштаба..................................................................................................... 6. Стехиометрия в процессах биотехнологии........................................... 6.1. Вывод «формулы» биомассы микроорганизмов................................ 6.2. Расчет выхода биомассы на углеродный субстрат............................ 6.3. Расчет тепла, выделяемого в биохимическом процессе............................ Послесловие.................................................................................................. Библиографический список ……………………………………………… Приложение 1 Перечень ключевых слов …………….............................. Предисловие Согласно определению Европейской ассоциации биотехнологов (третий съезд, Мюнхен, 1984 г), биотехнология - это интегрированное использование биохимии, микробиологии и инженерных наук с целью технологического применения способностей микроорганизмов. Она создает возможность получения с помощью легкодоступных и возобновляемых ресурсов тех веществ и соединений, которые важны для жизни и благосостояния людей. В промышленном масштабе подобная биотехнология представляет собой уже биоиндустрию. Последняя включает в себя, с одной стороны, отрасли, в которых биотехнологические методы могут с успехом заменить широко используемые в настоящее время традиционные методы, а с другой – отрасли, в которых биотехнология играет ведущую роль. Современный технический прогресс в микробиологической промышленности, в биотехнологии и смежных отраслях связан с созданием новых высокоинтенсивных производств, использованием агрегатов большой единичной мощности, разработкой безотходных технологических процессов с замкнутыми энергетическими и сырьевыми циклами. Решение этих задач становится невозможным при использовании лишь интуиции научных работников и инженеров или качественных характеристик систем и требует достаточно точного и строгого количественного анализа. Значительную роль в решении такого рода задач играют методы математического моделирования и системного анализа. Количественные представления элементарных процессов и их взаимосвязь, основанные на использовании фундаментальных законов физики, химии и биохимии, формируются в виде математических моделей отдельных стадий технологического процесса и системы в целом. Точность таких моделей, их адекватность реальному сложному процессу зависят от точности и правильности представлений закономерностей, описывающих элементарные процессы и их взаимосвязь. Развитие прикладных биотехнологий, гибких автоматизированных производственных систем и устройств и других быстро развивающихся наукоемких отраслей привели к дальнейшему усложнению разрабатываемых и эксплуатируемых технических устройств, биотехнологических процессов, аппаратов и систем. Их экспериментальная отработка требует все больших затрат времени и материальных ресурсов, а в ряде случаев ее проведение в полном объеме превратилось в проблему, требующую нестандартных решений. В этих условиях существенно увеличилось значение расчетно-теоретического анализа характеристик ферментационных аппаратов, технологий и систем. Очевидно, что во всех проблемах биотехнологии математическое моделирование должно играть первостепенную роль. Например, без математического моделирования невозможно осуществить оптимизацию любых технологических процессов. В простейшем случае даже выбор наиболее благоприятного режима работы биореактора, при котором микробная культура достаточно хорошо развивается, требует знания закономерностей роста культуры. В целом, математическое моделирование любого биотехнологического процесса, аппарата или системы сводится к оценке скорости протекания биохимических процессов, которая определяется скоростью биохимической деятельности (роста) микрообъектов в зависимости от одного или нескольких параметров среды, обеспечивающей протекание метаболических процессов. В качестве основных видов биохимической деятельности микрообъектов, используемых в биотехнологии, как правило, выступают следующие: - рост клеточной массы биореагентов, которые и представляют собой продукт. К данному классу процессов относится получение пекарских дрожжей в пищевой промышленности, кормовых дрожжей в сельском хозяйстве, вакцин в медицине; - биосинтез в процессе роста и развития клеток ценных биохимических продуктов – некоторые из которых выделяются в среду (внеклеточные продукты), некоторые накапливаются в биомассе (внутриклеточные продукты). В этих случаях производство существует ради получения таких продуктов, а не самой биомассы, которая часто является балластом; - биотрансформация – процесс, в результате которого под воздействием биологической деятельности микроорганизмов или ферментов происходит изменение химического состава исходного химического вещества. Примером процесса биотрансформации является превращение глюкозы во фруктозу под воздействием фермента глюкоизомеразы или глицерина в диоксиацетон под воздействием глюконобактерий; - потребление микроорганизмами из жидких сред различных веществ, которые являются загрязнителями. В ходе данных процессов биомасса микроорганизмов является промежуточным агентом. Такие процессы применяют при биохимической очистке сточных вод; - выщелачивание с помощью микроорганизмов, т.е. перевод в растворенное состояние некоторых веществ, находящихся в твердых телах. Примером данных процессов является микробиологическое выщелачивание металлов из руд в добывающей и металлургической промышленности; - использование биохимической деятельности микроорганизмов с целью образования газов и за счет этого создания, например, пористых материалов. Данные процессы такжешироко используются в пищевой промышленности при приготовлении хлеба, пива или шампанского. Кроме того, при переходе от лабораторных исследований к аппаратам большего объема в производственной практике практически всегда возникает проблема масштабирования. Оказывается, что результаты лабораторных исследований процессов биосинтеза по производительности, по выходу продуктов существенно различаются для аппаратов большого объема, иногда в несколько раз. Отсутствие научно обоснованных критериев масштабирования предопределяет многоступенчатость опытно-технологических работ, существенно замедляет внедрение полученных в полупроизводственных условиях технологических результатов и требует проведения дорогостоящих и длительных экспериментов непосредственно на крупномасштабном оборудовании. Сложность определения условий масштабного перехода, с одной стороны, и важность изучения этих условий - с другой, приводят к необходимости применения системного подхода, суть которого в данном случае состоит в том, что вся информация, получаемая на лабораторных, опытных и промышленных установках, последовательно накапливается и обогащается в процессе разработки полной математической модели биореактора. Построенная таким образом математическая модель позволяет наиболее достоверно осуществлять масштабный переход и решать задачи оптимального проектирования биореакторов. Эффективная работа биореактора во многом определяет техникоэкономические показатели всего производства. При этом существует тесная взаимосвязь вопросов аппаратурного и технологического оформления процессов биосинтеза, в частности, рассмотрение вопросов гидродинамики и массопередачи являются определяющими при реализации процессов в крупнотоннажных ферментаторах. В настоящее время масштабный переход от лабораторного биореактора к промышленным аппаратам – ферментаторам без промежуточных этапов иногда возможен лишь для отдельных узлов. На каждом этапе увеличения масштаба ферментации решаются конкретные задачи отработки режимов ведения процесса и его оптимизации. Для этой цели разработано большое количество упрощенных и достаточно сложных математических моделей, без которых проблему масштабирования биотехнологических процессов решить невозможно. Цель данного учебного пособия – способствовать становлению профессиональной компетентности магистрантов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» через формирование у них знаний и умений в области моделирования биотехнологических процессов; приобретение навыков исследования и моделирования кинетики роста микроорганизмов, а также навыков масштабирования и расчета основного технологического оборудования. Для организации процесса усвоения знаний пособие обеспечено перечнем ключевых слов, а каждый раздел пособия – контрольными вопросами и заданиями. 1. Методы исследования биотехнологических систем При исследовании биотехнологических систем в настоящее время широко применяются методы системного анализа и математического моделирования, без которых невозможно получение исходных данных для технологического проектирования биотехнологических производств. 1.1. Основные принципы системного анализа К основным положениям системного анализа, позволяющим решать задачи исследования биотехнологических систем, можно отнести: - четкую формулировку цели исследования, постановку задачи по реализации этой цели и определение критерия эффективности решения задачи; - разработку развернутого плана исследования с указанием основных этапов и направлений в решении задачи; - пропорционально-последовательное продвижение по всему комплексу взаимно-связанных этапов и возможных направлений; - организацию последовательных приближений и повторных циклов исследований на отдельных этапах; - принцип нисходящей иерархии анализа и восходящей иерархии синтеза в решении составных частных задач и общей задачи в целом. Центральным понятием системного анализа является понятие системы. Биотехнологическая система (БТС) – это совокупность взаимно связанных технологическими потоками аппаратов, в которых осуществляется определенная последовательность операций (подготовка сырья и ми- неральных солей, засевной биомассы, выращивание микроорганизмов, их выделение из жидкой фазы и т. д.) до получения товарного продукта. Продуктами биосинтеза могут быть биомасса микроорганизмов, биологически активные вещества и т.п. Элементами БТС являются технологические аппараты, такие, например, как, инокулятор – аппарат для получения засевной биомассы (инокулята); биохимический реактор (биореактор, ферментатор, культиватор) – аппараты для проведения собственно процесса ферментации; аппараты для выделения и сгущения биомассы, выпарные, сушильные установки и т. д. Между элементами БТС имеется функциональная взаимосвязь. Элементы взаимодействуют между собой и с окружающей средой в виде материального, энергетического и информационного обмена. Для примера на рис. 1.1 показана упрощенная типовая схема получения белковой биомассы. Засевная биомасса Охлаждение Культивирование (ферментация) Аэрация Субстрат Сгущение биомассы Сушка биомассы Сушильный агент Биологическая очистка Готовый продукт Сточные воды Рис. 1.1. Типовая технологическая схема получения биомассы микроорганизмов Технологический процесс обычно включает стадию подготовки сырьевых материалов, таких как углеродсодержащий субстрат, мине-ральная питательная среда, а также стадию подготовки засевной биомассы. Подготовленное сырье и засевная биомасса далее поступают на стадию ферментации, технологически выполненную из нескольких параллельно или последовательно работающих биохимических реакторов, где в условиях аэрации и перемешивания происходит интенсивный рост и размножение микроорганизмов. Затем суспензия микроорганизмов поступает на стадию сгущения. Здесь используются сепараторы, флотаторы, центрифуги, фильтры, выпарные и сушильные аппараты. В производстве используется свежая вода, поступающая на стадии подготовки питательной среды, засевной биомассы и ферментации. В то же время, в технологической схеме часть свежей воды может быть заменена на отработанную культуральную жидкость, полученную при концентрировании суспензии микроорганизмов на стадии сгущения (оборотная вода). Неиспользованная непосредственно в технологическом процессе культуральная жидкость подвергается биологической очистке. Небольшая часть микроорганизмов уходит из технологических аппаратов с воздушным потоком (из ферментеров при аэрации, из сушильной установки с сушильным агентом и т. д.). Это количество биомассы также необходимо вернуть на стадию сгущения. Таким образом, на этой упрощенной схеме нетрудно проследить взаимное влияние элементов системы. Одна из основных стадий – стадия ферментации будет работать эффективно лишь в том случае, если качественно функционируют стадии подготовки сырья и засевной биомассы. В то же время процесс ферментации во многом определяет работу последующих стадий сгущения и сушки. Имеющиеся замкнутые циклы по жидкостным и газовым потокам создают возможность обратного влияния на процесс ферментации процессов подготовки сырья, сгущения и обработки биомассы. Использование, например, отработанной культуральной жидкости на стадии ферментации представляется выгодным и целесообразным с точки зрения минимизации потребления свежей воды. Однако повторное потребление культуральной жидкости в известной степени ухудшает работу стадии ферментации, так как в этой воде содержатся продукты метаболизма, не утилизируемый субстрат и т. п. Из рассмотренного примера следует, что анализ и синтез оптимальной технологической схемы, отвечающей высоким требованиям к современному производству, невозможен без рассмотрения работы системы в целом, без учета взаимодействия элементов системы. Последнее возможно только при высокой степени формализации функционирования системы с использованием количественных оценок. При этом эффективность производства будет определяться как условиями взаимодействия между элементами системы – технологическими аппаратами, так и качеством функционирования самих аппаратов. При рассмотрении основного элемента БТС – биохимического реактора – также целесообразно использовать принцип системного подхода. Анализ работы любого технологического аппарата показывает, что качество его функционирования зависит от взаимодействия комплекса физико-химических и биохимических процессов, протекающих в нем. Уровень сложности аппарата как системы определяется многообразием элементарных физико-химических и биохимических эффектов, насыщенностью взаимных связей между ними, совмещенностью и взаимодействием явлений различной природы в локальном объеме пространства и в аппарате в целом. 1.2. Принципы построения математической модели биохимического реактора Создание математической модели биохимического реактора является достаточно сложной задачей. Решение этой задачи в полном объеме в настоящее время невозможно, так как в ряде случаев не удается надежно описать элементарные процессы, не говоря уже об условиях их взаимосвязи. Рассмотрим принципиальную структурную схему модели биохимического реактора, представленную на рис. 1.2. Модель роста единичной клетки Модель транспорта и превращений субстрата в клетке Физиологобиохимическая модель клетки Кинетическая модель роста популяции микроорганизмов Модель микросмешения Модель массообмена Модель макросмешения Модель гидродинамики Модель теплообмена Модель биореактора Рис. 1.2. Принципиальная структурная схема математической модели биореактора Данная схема включает ряд иерархических уровней (I – V). В основе описания I уровня лежат соотношения, учитывающие биохимические явления, протекающие в клетке. Задачей исследований этого уровня является расшифровка механизмов сложных внутриклеточных процессов и представление их в обобщенной форме, описывающей развитие отдельной клетки, а затем клеточной популяции. Выполненные в настоящее время исследования показали, что процессы, протекающие в клетках, настолько сложны, что использование этих знаний для практических целей весьма затруднительно. Поэтому при моделировании биохимического реактора используется обобщенная кинетическая модель роста популяции микроорганизмов – II уровень, формируемая на основе модели I уровня, включающей модель роста единичной клетки, модель транспорта и превращения субстрата в клетке, физиологобиохимическая или возрастная модель клеток. Исследование кинетических закономерностей популяции микроорганизмов осуществляют при условии идеального перемешивания среды в аппарате без ограничения роста микроорганизмов скоростью транспорта питательных веществ и условиями теплообмена. Последующие уровни иерархии процессов в биохимическом реакторе связаны с разработкой элементов общей математической модели на макроуровне функционирования. Адекватность этих элементов и значения необходимых констант оцениваются на опытных или опытно-промышленных установках. В этих исследованиях изучают влияние на биохимический процесс условий организации потоков ввода сырья, условий аэрирования, влияние тепловых и диффузионных эффектов. Таким образом, следующий этап разработки математической модели связан с осуществлением формализации III уровня иерархии во взаимосвязи с кинетической моделью. На этом этапе устанавливаются соотношения, определяющие условия перемешивания среды в реакторе, степень агрегации в системе. При этом учитывается, что в общем случае в системе находятся как агрегаты включений, так и отдельные включения, в связи с чем, необходимо составить количественные соотношения для обоих состояний включений. На рис. 1.2 эти соотношения представлены блоками – модель микросмешения и модель макросмешения. Совершенно ясно, что предпочтительное использование этих моделей для расчета реального процесса будет связано в основном со степенью турбулизации ферментационной среды, с организацией структуры потоков. Качественный и количественный анализ показывает, что повышение степени турбулизации способствует разрушению агломератов и система сдвигается в область микросмешения. Модели микро- и макросмешения ферментационной среды формируют модель IV уровня – модель гидродинамики, обобщѐнно учитывающую эти эффекты. Оказывая непосредственное влияние на процессы транспорта вещества и энергии, условия микро- и макросмешения определяют также конкретный вид уравнений моделей массообмена и теплообмена, представленных соответствующими блоками на схеме. Математическое описание моделей каждого блока может быть достаточно сложным. Так, модель массообмена включает в общем случае описание процессов транспорта субстрата из газовой или малорастворимой жид- кой фазы в культуральную среду, транспорт питательных элементов к клеточной оболочке одиночной клетки или к клеточному агломерату, диффузию внутрь агломерата и т. д. Естественно, что построение моделей для этих трех блоков связано с необходимостью учета градиентов концентраций, температуры и скоростей потоков (потенциалов ∆с, ∆т и ∆v) с одной стороны, учета условий диспергирования и коалесценции дисперсной фазы, а также условий характера движений потоков в аппарате, теплообмена и массообмена с окружающей средой. Учет потенциалов ∆с, ∆т и ∆v определяет представление движущих сил в уравнениях сохранения массы энергии и импульса. Условия диспергирования и дробления формируют распределение по размерам дисперсной фазы, что в свою очередь влияет на величины потенциалов. Характер движения ферментационной среды, условия теплообмена и массообмена с окружающей средой определяются конструктивными параметрами аппарата. Модель биохимического реактора в целом – V уровень иерархической схемы – формируется на основе рассмотренных блоков IV уровня (моделей гидродинамики, массообмена и теплообмена) с учетом II уровня (модели кинетики роста популяции микроорганизмов). Модель V уровеня отражает особенности процесса ферментации в конкретном типе реактора с определенными условиями аэрации и перемешивания среды и может использоваться для оптимизации технологических и конструктивных параметров. В соответствии с выше изложенным, можно выделить следующие три основные этапа исследования биотехнологических систем. Первый этап – микрокинетические исследования. На первом этапе определяются микробиологические, биохимические и физико-химические характеристики процесса на микроуровне. Основная задача подобных исследований заключается в определении наиболее вероятного механизма протекания процесса с выбором модели кинетики и оценкой констант. На этом же этапе решается задача выбора эффективных культур микроорганизмов и задача оптимизации питательных сред. Наиболее быстрое решение указанных задач возможно лишь с использованием вычислительной техники, с помощью которой удается быстро просматривать конкурирующие механизмы протекания процесса биосинтеза, оценить кинетические константы и выбрать оптимальный состав питательных сред. В настоящее время использование вычислительной техники на этом этапе исследований позволяет в некоторых случаях автоматизировать эксперимент, что существенно увеличивает эффективность научных исследований. Второй этап – макрокинетические исследования. Основная задача макрокинетических исследований состоит в том, чтобы получить математическую модель процесса в условиях, приближенных к промышленным, и определить оптимальные характеристики проведения процесса для данно- го конкретного аппарата. Выходом из решения этой задачи должны быть рекомендации по проектированию и конструированию аппаратуры. При этом знания кинетики процессов позволяют классифицировать аппаратуру и определить оптимальные условия проведения процесса с использованием лишь формальных проработок, не проводя дополнительных экспериментальных исследований. На этом этапе экспериментальной проверке подлежат только конечные, полученные в результате решения, оптимальные варианты. Третий этап – разработка микробиологических технологических систем. Основными задачами, решаемыми на этом этапе, являются задачи выбора структуры технологических связей между элементами системы (технологическими аппаратами) и задачи реализации планов функционирования систем в обстановке возникновения ситуаций, не предусмотренных при проектировании. Таким образом, решение этой задачи связано непосредственно с созданием автоматизированной системы управления технологическим процессом (АСУТП). Синтез технологической схемы практически невозможен без использования вычислительной техники, без применения специальных методов синтеза, позволяющих упростить задачу, без просмотра большого числа возможных вариантов синтеза, учитывающих вопросы утилизации промежуточных, побочных продуктов и вопросы очистки сточных вод и газовых выбросов. Реализация всех трех этапов исследования БТС органически увязывает научные исследования с инженерными решениями в виде готовых проектов на создание аппаратуры и целых производств. Поэтому ускоренное внедрение научных разработок в промышленность требует автоматизации всего процесса создания промышленного предприятия. Таким образом, каждый из этапов исследования должен решать не только некоторую конкретную задачу, но и давать классифицированный материал для системы автоматизированного проектирования. Создание последней должно быть также увязано с решением вопросов стандартизации технологического оборудования . Контрольные вопросы и задания 1. Назовите основные принципы системного анализа в приложении к биотехнологическим системам. 2. Охарактеризуйте типовую технологическую схему получения микробной биомассы. 3. Охарактеризуйте основные стадии разработки математической модели биореактора. 4. Для чего необходимо создавать математическую модель биореактора? 5. Назовите основные факторы и процессы, которые должны быть учтены в модели биореактора. 6. Назовите и охарактеризуйте три основных этапа исследования биотехнологических систем, необходимых для создания промышленного производства. 7. Перечислите основные задачи, решаемые на этапе разработка микробиологических технологических систем. 8. С каким этапом разработки микробиологических технологических систем связано создание автоматизированной системы управления технологическим процессом для производства? 2. Модели кинетики роста микроорганизмов в биохимических реакторах В соответствии со структурной схемой математической модели биохимического реактора (рис. 1.2) основу первого уровня составляют кинетические модели роста популяции микроорганизмов. Рассмотрим в этой связи основные факторы, определяющие кинетику роста микроорганизмов. Кинетика процессов ферментации изучает закономерности изменения скорости роста микроорганизмов и биосинтеза продуктов метаболизма в зависимости от текущих концентраций субстратов, биомассы, продуктов метаболизма, температуры и рН. 2.1. Рост и развитие микробной популяции Решающую роль при осуществлении процессов микробиологического синтеза в биохимических реакторах играет популяция микроорганизмов. Характерной особенностью микробных популяций является большая численность клеток, составляющих популяцию, и их малый размер (1 – 50 мкм для большинства бактериальных и дрожжевых клеток). При этом основные закономерности роста микробной популяции, как правило, не зависят от вариаций внутриклеточных процессов в каждой из клеток и характеризуются обобщенными показателями. Рост и развитие микробных клеток в процессе их культивирования происходит под воздействием большого числа факторов, определяемых условиями окружающей среды. Главными из этих факторов являются: состав и концентрация компонентов питательных сред, в том числе вид и концентрация углеродсодержащих субстратов, концентрация растворенного в среде кислорода, а также физико-химические факторы (рН, температура, давление и др.). Углеродсодержащие субстраты. В качестве источников углерода для роста микроорганизмов могут использоваться различные углеродсодержащие соединения. К наиболее благоприятным источникам углерода относят углеводы. В Советском Союзе успешно работали производства получения кормовой микробной биомассы на основе использования парафиновых углеводородов (белковый продукт – паприн), природного газа (гаприн). С середины 40-х годов двадцатого века несколько десятков биохимических (гидролизных) заводов выпускали кормовые дрожжи и биоэтанол. В качестве субстратов в этом случае использовались гидролизаты растительного сырья – отходов деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства. Исследованиями по изучению кинетики потребления н-алканов с разной молекулярной массой установлено, что скорость потребления их уменьшается с увеличением молекулярной массы. Изучение влияния индивидуального состава н-алканов углеводородного субстрата на процесс выращивания дрожжей показало, что с изменением длины углеродной цепи н-алканов изменяется как максимальная скорость роста микроорганизмов, так и удельный расход субстрата на единицу биомассы. Однако в настоящее время нет единого мнения о механизме поступления и потребления малорастворимого углеводородного субстрата клетками. Одни авторы считают, что потребление углеводородов осуществляется при прямом контакте микробных клеток с каплями субстрата, а другие полагают возможным диффузионное потребление растворенных углеводородов. В ряде работ подчеркивается, что основная роль в питании клеток принадлежит субмикронным каплям, что в определенной мере противоречит условиям гидродинамического диспергирования капель в аппарате до этих размеров. Указанное выше различие в объяснении механизма транспорта углеводородов находит свое отражение и в разных подходах к моделированию этих процессов. Так, если в работе предлагается модель роста, учитывающая механизм взаимодействия капли с клеткой за счет непосредственного контакта, то в работе рассматривается модель, предлагающая наличие в аппарате зоны микро смешения, в которой субстрат находится в виде гомогенной среды. Наличие в ферментационной среде малорастворимой в воде жидкой фазы – углеводородов отражается на условиях роста микробных популяций. В этих условиях наличие клеточных агломератов и глобул – скоплений капель парафина и дрожжевых клеток отрицательно сказывается на ходе процесса ферментации. При этом в некоторых гидродинамических условиях ферментационную среду можно рассматривать как полностью сегрегированную систему. В последнее время большое внимание уделено таким источникам углеродного питания клеток, как этанол, метанол и метан. Полная раство- римость этанола и метанола в воде практически обеспечивает осуществление процесса роста микроорганизмов без ограничения по транспорту углерода к клеткам. При ферментации на этих субстратах в качестве микроорганизмов используют дрожжи и бактерии. К преимуществу использования бактериальных культур относятся большая скорость их роста (до 0,5 ч-1) и высокое содержание белка в биомассе (до 83 – 85 %). Однако ряд трудностей, связанных с дальнейшей обработкой бактериальной суспензии, осложняют применение бактерий. Специфика культивирования микроорганизмов на природном газе, содержащем метан, состоит в том, что основные питательные вещества (метании и кислород) поступают в процесс в газообразном состоянии, в связи, с чем транспорт малорастворимых газов в жидкую фазу является основным фактором, ограничивающим рост клеток в процессе. При выращивании метанокисляющих бактерий важно выбрать оптимальную по составу газовую питательную среду, содержащую и углерод и кислород. На сегодня уже исследован ряд газовых сред, однако вопрос выбора оптимального состава среды остается актуальным. В то же время состав газовой питательной среды оказывает существенное влияние на продуктивность процесса, скорость роста и концентрацию микроорганизмов, а также на расходные коэффициенты по кислороду и метану. Кислород. Кислород участвует в процессе дыхания аэробных микроорганизмов в качестве акцептора электронов в дыхательной цепи клетки. Его также можно рассматривать как компонент субстрата, входящего в состав клеточной массы. В ряде случаев кислород выступает в роли ингибитора роста микроорганизмов. Влияние кислорода отражается как на скорости роста микроорганизмов, так и на составе клеток. Ограничение роста клеток при низких концентрациях кислорода характерно для многих дрожжевых и бактериальных культур. Установлен ряд соотношений между парциальным давлением кислорода и биохимическими и морфолого-физиологическими свойствами культуры. В частности показано, что требования по насыщению среды кислородом различны для процесса, обеспечивающего максимальный прирост биомассы, и для процесса, обусловливающего максимальный синтез компонента биомассы. Так, например, для биосинтеза лизина требуется низкое насыщение среды кислородом, а накопление биомассы происходит быстрее при высоких значениях парциального давления кислорода. При использовании в качестве субстрата метанола ограничение роста культуры начинается при парциальном давлении кислорода 399,9 Па (3 мм. рт. ст.), при меньшем парциальном давлении 133,3 Па (1 мм. рт. ст.) культура ослабевает. При снижении парциального давления кислорода требуется больший расход аденозинатрифосфата (АТФ) в клетке, что связано с дополнительной затратой энергии. В то же время, при высоком пар- циальном давлении кислорода также требуются дополнительные затраты энергии, что свидетельствует о наличии диапазона концентраций кислорода, в котором характер метаболизма клеток не меняется. У целого ряда бактерий, дрожжей и грибов имеется широкий диапазон концентраций кислорода, когда последний не влияет на метаболизм клетки, а изменение в ее состоянии наступает при снижении парциального давления кислорода ниже критического уровня, составляющего примерно 133,3 Па (1 мм. рт. ст.). Удельный расход кислорода на единицу синтезируемой биомассы (расходный коэффициент) различен для разных микроорганизмов и используемых субстратов, а также различных условий культивирования. Удельное потребление кислорода клетками зависит от скорости их роста, и определяется потребностью эндогенного метаболизма клетки – затратами на образование клеточной структуры и энергетическим обменом. Так, для дрожжей, растущих на н-парафиновых углеводородах показано, что в зависимости от соотношения расхода кислорода на структурное образование клетки и ее энергетический обмен удельный расход кислорода на единицу синтезируемой биомассы меняется: при соотношении 0,5 : 0,5 расходный коэффициент составляет 2,28 кг кислорода/кг биомассы; при соотношении 0,6 : 0,4 – 1,6 кг кислорода/кг биомассы; при соотношении 0,4 : 0,6 – 3,23 кг кислорода/кг биомассы. Таким образом, можно условно разделить расход кислорода на расход, связанный с потреблением его в ростовых процессах клеткой, и на расход, связанный с процессами поддержания жизнедеятельности клетки. Зависимость для расходного коэффициента по кислороду, учитывающую эти моменты, можно представить в виде a O2 a b , O2 (2.1) где a – расходный коэффициент по кислороду, кг О2/кг биомассы; а – коэффициент, учитывающий расход кислорода на ростовые процессы, кг О2/кг биомассы; b – коэффициент, учитывающий расход кислорода на поддержание жидкости, кг/кг · ч; μ – удельная скорость роста микроорганизмов, ч-1. Минеральная питательная среда. Из окружающей клетку ферментационной среды, микроорганизмы получают большую часть веществ для процессов биосинтеза, а также все вещества, необходимые для их роста и энергетического обмена. К необходимым элементам минерального питания относятся азот, фосфор, магний, калий, железо, цинк, марганец. Кроме того, питательная минеральная среда содержит еще целый ряд элементов, присутствующих в микроколичествах: молибден, медь, кобальт, кальций, никель, серу, хлор, натрий и т. д., которые, в большинстве случаев, находятся в виде примесей и специально в среду могут не добавляться. Элементы минерального питания, несмотря на относительно низкое содержание их в ферментационной среде, существенным образом влияют на физиолого-морфологические и биохимические особенности развития клеточной популяции. Недостаток в питательной среде какого-либо элемента минерального питания приводит к заметным изменениям в развитии клеток и в их составе. Так, ограничение в питании азотом приводит к снижению скорости размножения клеток. Например, уменьшение концентрации азота в ферментационной среде до 0,004 % приводит к резкому сокращению выхода дрожжевой биомассы. В то же время значительный избыток азота в среде приводит к торможению клеточного роста. Следует также отметить, что с изменением концентрации азота в среде изменяются содержание белка, липидов, соотношение аминокислот и витаминов в биомассе. Недостаток в минеральной питательной среде фосфора приводит к прекращению утилизации углеродсодержащего субстрата. Необходимое количество фосфора, входящего в клеточные соединения и участвующего в энергетических процессах клетки, зависит от используемого субстрата и условий культивирования. Так, потребность дрожжей в фосфоре при их развитии на углеводах приблизительно в два раза ниже по сравнению с углеводородной ферментацией. Увеличение концентрации фосфора в культуральной среде способствует улучшению показателей процесса выращивания биомассы, однако, начиная с определенной концентрации, утилизация фосфора уменьшается и наблюдается снижение выхода биомассы, что позволяет сделать вывод о необходимости поддержания рабочей концентрации фосфора в определенном диапазоне. Существенно, также влияние и других элементов минерального питания. Для расчета необходимых концентраций элементов минерального питания можно использовать обычные зависимости, учитывающие балансовые соотношения элементов питания в процессе и их потребление микроорганизмами, например: C i C0i a i x i i V v, (2.2) где C , C0 – исходная и остаточная концентрация элемента питания,кг/м3; аi – расходный коэффициент по данному элементу, кг/кг; х – концентрация клеток, кг/м3; V – рабочий объем аппарата, м3; v – проток через аппарат, м3/ч; μ – удельная скорость роста микроорганизмов, ч -1. 2.2. Модели зависимости скорости роста микроорганизмов от концентрации субстрата Необходимо отметить, что нахождение уравнений, описывающих зависимость концентрации биомассы или ее общей скорости от времени недостаточно для полной характеристики и понимания процесса. Необходимо получить уравнение, в которое в явном виде входит скорость изменения концентрации биомассы и текущие концентрации субстрата. Наибольшее распространение получили модели, описывающие кинетику роста в зависимости от концентрации лишь одного субстрата, который называют лимитирующим; другие субстраты или компоненты питательной среды при этом полагаются находящимися в избытке и не влияющими на скорость роста. Мы уже рассматривали модель экспоненциального роста культуры микроорганизмов, которая следует из самого определения удельной скорости роста. Уравнение роста микробной культуры при постоянстве концентрации субстрата представляет собой дифференциальное уравнение первого порядка с разделяющимися переменными: dX X , dt (2.3) где Х – концентрация биомассы, г/л; t – время, ч; – удельная скорость роста микроорганизмов, ч–1. Решением этого уравнения является выражение, позволяющее рассчитывать накопление биомассы в экспоненциальной фазе роста: Х(t) = Xoe t. (2.4) В полулогарифмических координатах это уравнение имеет вид: ln Х(t) = ln Xo + t. (2.5) Это уравнение может быть использовано для определения удельной скорости роста. В координатах ln X – t экспоненциальная фаза роста представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона которой численно равен величине удельной скорости роста. По линейному участку кривой роста в полулогарифмических координатах можно определить границы экспоненциальной фазы и по формуле (2.6) вычислить величину удельной скорости роста: ln X 2 ln X 1 , t2 t1 (2.6) Неявно предполагается, что величина здесь постоянна; однако это не так – удельная скорость роста она строго зависит от концентрации лимитирующего субстрата. Как известно, постоянной величина сохраняется только на стадии экспоненциального роста, которая составляет лишь незначительную по времени часть кривой роста, когда изменением концентрации субстрата можно пренебречь. Задача как раз в том и состоит, чтобы найти зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата. В зависимости от вида и штамма микроорганизма, а также и субстрата связь между и S – концентрацией субстрата – может иметь самый различный характер. Рассмотрим некоторые модели, отражающие зависимости от S. Модель Кобозева. Эта простейшая модель дает аналогию с химической кинетикой: dX KSX или: = KS. dt (2.7) где К – константа скорости реакции. Графически эта модель в координатах от S представляет собой прямую, исходящую из начала координат с тангенсом угла наклона равным К. Модель Моно. Гиперболическая зависимость удельной скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата была обнаружена в ходе экспериментальных исследований на большом числе микробных культур. Эта зависимость описывается уравнением уравнением Моно, аналогичным уравнению Михаэлиса-Ментен для кинетики ферментативных реакций m S KS S (2.8) где m – максимально возможная скорость роста микроорганизмов при достаточно высоких концентрациях субстрата; Ks – субстратная константа или константа насыщения, численно равна такой концентрации субстрата, при которой удельная скорость роста составляет половину от максимально возможной m; S – концентрация субстрата. . График зависимости удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата имеет следующий вид (рис. 2.1.). Рис. 2.1. Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата Сродство субстрата к ферментам, которые отвечают за транспорт субстрата через клеточную мембрану, характеризует субстратная константа. Она показывает, насколько полно может быть извлечѐн субстрат из среды. Важнейшими характеристиками промышленных штаммов, необходимыми при расчѐтах любых биотехнологических процессов, являются параметры m и Ks. Величина Ks может быть определена экспериментально, аналогичные эксперименты используются в энзимологии, когда определяется начальная скорость роста культуры в среде с различными концентрациями субстрата. Одновременно в таких опытах определяется и величина m (рис. 2.2). Отмытые от субстрата клетки из культуры в экспоненциальной фазе роста помещаются в среды с различными (очень низкими) концентрациями исследуемого субстрата. Через короткий промежуток времени t2 – t1 измеряется концентрация биомассы и вычисляется величина удельной скорости роста по формуле ln X 2 ln X 1 . t2 t1 (2.9) Промежуток времени должен быть минимальным, так как необходимо измерить скорость роста при данной концентрации субстрата и избежать периода еѐ замедления в результате его использования. Рис. 2.2. Способ определения констант уравнения Моно Ks и m После отбора проб культура продолжает расти с максимальной скоростью, а в отобранных пробах для острых опытов скорость роста лимитирована количеством заданного субстрата. По результатам этих опытов строят график зависимости от S. По аналогии с уравнением Михаэлиса-Ментен для кинетики ферментативных реакций параметры m и Ks могут быть определены графическим методом на основе линеаризации уравнения Моно (графический метод Лайнуивера и Бэрка): 1 1 Ks 1 m m S . (2.10) Соответствующий график представлен на рис. 2.3. В данных координатах это прямая линия с тангенсом угла наклона, равным Ks/m. По оси ординат отсекается отрезок, равный 1/m, а по оси абсцисс – отрезок, равный -1/Ks. Рис. 2.3. Линеаризация уравнения Моно в обратных координатах (метод Лайнуивера и Бэрка) Кроме метода Лайнуивера и Бэрка (или метода двойных обратных координат) линеаризацию уравнения Моно можно проводить и другими способами, например: m K s (2.11) S или S Ks m S m . (2.12) Соответствующие графики приведены на рис. 2.4. а б Рис. 2.4. Линейные анаморфозы уравнения Моно: а – зависимость удельной скорости роста от /S; б – зависимость S/ от S/m В связи с существованием экспериментальных погрешностей в определении скоростей и концентраций компонентов необходимо проводить не менее 5 – 10 измерений скорости роста при концентрациях субстрата, соизмеримых с Ks. После этого для каждой пары измерений вычисляют значения m и Ks, а затем проводят статистическую обработку результатов, определив среднее значение и среднеквадратичное отклонение параметра от среднего. Модель Мозера. Эта модель учитывает сигмоидальный характер зависимости = (S): SK m KS S K (2.13) Здесь К – новый параметр по сравнением с Ks из уравнения Моно, причем К > 1. Модель Перта учитывает зависимость = (S) не для лимитирующего, а для «стимулирующего» субстрата и описывается уравнением S 0 m KS S (2.14) Из уравнения (2.14) следует, что при S = 0 = 0, т.е. не равно 0. Это значит, что даже при отсутствии данного субстрата уже есть некоторый рост микроорганизмов. Видимо, в среде есть некий другой субстрат. Дальнейшее увеличение удельной скорости роста описывается вторым членом уравнения (2.14), который похож на уравнение Моно. Модель Андрюса учитывает ингибирование повышенными концентрациями субстрата и описывается уравнением 2.15. В этом случае субстрат, который при относительно низких концентрациях увеличивает скорость роста популяции, при более высоких концентрациях может быть эффективным ингибитором роста микроорганизмов. Уравнение для удельной скорости роста микроорганизмов при ингибировании процесса избытком субстрата имеет следующий вид: m So K sэфф S o (1 S o / K iэфф ) . (2.15) Ингибирующее влияние избытка субстрата на рост микроорганизмов показано на рисунке 2.5. Рис. 2.5. Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации субстрата для случая ингибирования избытком субстрата Для определения числовых значений параметров, если Kiэфф и Ksэфф существенно различаются, например, Ksэфф/Kiэфф 0,1; с достаточной степенью точности можно использовать асимптотические приближения. При относительно низких концентрациях субстрата, когда S Ksэфф, уравнение (2.12) трансформируется к виду: m So K sээф S o , (2.16) т. е. представляет собой обычное уравнение Моно, из которого стандартными способами могут быть найдены параметры m и Ks. При высоких концентрациях субстрата (S Ksэфф) скорость роста микроорганизмов будет описываться уравнением m 1 S o / K i эфф . Это уравнение может быть представлено в линейной форме (2.17) 1 1 1 So , m m Kiээф (2.18) что позволяет стандартным методом найти параметры m и Kiэфф. 2.3. Модели зависимости скорости роста микроорганизмов от концентрации продукта метаболизма Рост микроорганизмов зависит не только от концентрации субстрата S, но также и от концентрации продуктов метаболизма Р. Причем чаще всего накопление продуктов снижает (ингибирует) скорость роста. Это ингибирование учитывается различными моделями. Модель Хиншельвуда. Наиболее простым является линейное уравнение, предложенное Хиншельвудом: = m – KP (2.16) В графическом выражении этого уравнения при Р = 0 = m, при = 0 Р = m /К, что позволяет легко определять кинетические параметры m и К по пересечению прямой с осями (рис. 2.6). Рис. 2.6. Ингибирование продукта метаболизма – модель Хиншельвуда Модель Иерусалимского. Эта модель, подобно модели Моно основана на ферментативной кинетике и описывается уравнением: m 1 P / K p , (2.17) или . m K P , P KP (2.18) где Кр – константа ингибирования; m – максимальная удельная скорость роста микроорганизмов. Графическое выражение зависимости представлено на рис. 2.7. Рис. 2.7. Ингибирование продуктом метаболизма – модель Иерусалимского Характерные точки зависимости: при Р = 0 = m; при Р = Кр = 0,5m Уравнение (2.17) можно преобразовать к линейному виду в координатах Лайнуивера и Бэрка: 1 1 m 1 P. m K P (2.19) По величине отсекаемого отрезка можно определить параметр m, а по тангенсу угла наклона прямой – константу ингибирования Кр. Модель Бергтера. Уравнение Бергтера учитывает сигмоидальный характер зависимости = (Р) m 1 1 PK / KP , К > 1. На рис. 2.8 приведен соответствующий график: (2.20) Рис. 2.8. Ингибирование продуктом метаболизма – модель Бергтера Таким образом, ингибирование скорости роста микроорганизмов от концентрации продуктов метаболизма можно учесть с помощью различных моделей, что чрезвычайно актуально при разработке технологических процессов для биотехнологических производств. 2.4. Многофакторные модели До сих пор мы рассматривали кинетические уравнения, в которых на скорость роста влиял только один фактор – субстрат, продукт или биомасса. Но в реальности часто на процесс влияет не один, а несколько факторов. Предложено значительное количество многофакторных зависимостей, и, прежде всего – многосубстратных моделей. «Многосубстратные» уравнения. Чаще всего приходится учитывать влияние двух субстратов. Например, углеродного и азотного или углеродного и кислородного. Такие уравнения бывают четырех основных типов: 1. Мультипликативные уравнения – функция является произведением однофакторных зависимостей: f1 (S1 ) f 2 (S2 ) (2.21) . Здесь каждый фактор автономен и может иметь свою собственную зависимость. Например, один субстрат имеет зависимость по Моно, а второй – с ингибированием по Андрюсу: m S1 S2 K1 S1 K 2 S 2 S 22 / K 22 . (2.22) Чаще всего, конечно, встречаются мультипликативные зависимости типа Моно-Моно. Возможны и другие варианты – в зависимости от ситуации могут иметь место многочисленные виды однофакторных зависимостей (S), из которых можно создать подходящую комбинацию. 2. Аддитивные уравнения – многофакторная функция является суммой однофакторных. Такие зависимости встречаются довольно редко, чаще для двух субстратов одного назначения. Например, два углеродных субстрата: глюкоза и лактоза, глюкоза и крахмал и т.д.: 1S1 S 2 2 K1 S1 K 2 S 2 (2.23) . 3. Альтернативные уравнения – многофакторная зависимость подчиняется принципу кинетического минимума: = min[ (Si)] при i от 1 до k (2.24) Это уравнение показывает, что для каждого субстрата существует зависимость (Si), когда лимитирующим фактором является только этот субстрат. Реально же микроорганизмы растут со скоростью, которая является наименьшей из всех возможных (Si). 4. Уравнения с неразделяющимися переменными. Все три выше рассмотренных варианта, несмотря на кажущееся различие, сходны в одном – они формируются из однофакторных зависимостей. Однако возможны и более сложные случаи, когда многофакторную зависимость трудно разбить на однофакторные. Например, существует уравнение конкурентного торможение вторым субстратом: m S1 K s S1 S2 / Ki (2.25) Многофакторные уравнения со смешанными факторами. До сих пор мы рассматривали многофакторные уравнения с факторами одного типа (двухсубстратные). Однако довольно часто встречаются неоднородные многофакторные уравнения, в которых участвуют, например, такие пары, как субстрат и продукт, субстрат и биомасса. Среди неоднородных многофакторных уравнений наиболее распространены уравнения типа Моно-Иерусалимского: m S 1 Ks S 1 P / K p , (2.26) или уравнения типа конкурентного торможения продуктом метаболизма: m S . Ks S P / K p (2.27) Интерес также представляет уравнение Контуа, учитывающее влияние концентрации биомассы на вид зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата: m S KX S (2.28) Графическое выражение уравнения Контуа представлено на рис. 2.9. Эта зависимость «искажается» по сравнению с уравнением Моно при изменении концентрации биомассы. Чем больше биомасса, тем выше кажущееся значение величины КХ. Рис. 2.9. Зависимость скорости роста микроорганизмов от концентрации субстрата по модели Контуа при различных концентрациях биомассы: Х1<Х2<Х3 Таким образом, именно многосубстратные модели способны наиболее полно учесть все факторы, оказывающие влияние на скорость роста микроорганизмов в условиях производства. Контрольные вопросы и задания 1. Что такое кинетические уравнения? 2. В чем состоит сходство модели Михаэлиса-Ментен для ферментативных реакций и модели Моно для роста микроорганизмов? 3. Проанализируйте модель Моно, приведите соответствующий график. 4. Охарактеризуйте параметры уравнения Моно. 5. Как в эксперименте определить параметры уравнения Моно? 6. Охарактеризуйте метод Лайнуивера и Бэрка для определения констант уравнения Моно. 7. Охарактеризуйте альтернативные модели роста и их применимость. 8. Напишите уравнения Моно для случаев конкурентрого и неконкурентного ингибирования роста. 9. Расскажите о многофакторных уравнениях со смешанными факторами. 10. Какое уравнение учитывает влияние концентрации биомассы на вид зависимости удельной скорости роста микроорганизмов при различных концентрациях субстрата? Напишите его. 3. Моделирование кинетики роста микроорганизмов в биореакторах периодического действия Технология любого микробиологического процесса основана на знании свойств микроорганизма-продуцента. Прежде всего, необходимо предварительное изучение характера питания продуцента, его физиологических и биохимических особенностей, условий потребления кислорода, влияния на рост различных химических и физических факторов – ингибиторов, активаторов, рН, температуры и др. Каждый штамм-продуцент должен быть охарактеризован определѐнным набором количественных параметров роста, необходимых для оптимизации микробиологического процесса. Максимальный выход целевого продукта можно получить только при создании оптимальных для данного вида микроорганизмов условий. Источником всей необходимой информации о свойствах микроорганизма-продуцента является его культивирование в контролируемых и управляемых условиях. Периодический способ культивирования до настоящего времени широко применяется в микробиологической промышленности, в том числе и для получения посевного материала. Поэтому изучение любого процесса микробного биосинтеза, в первую очередь, начинается с исследования динамики роста культуры в периодическом режиме. Выше уже рассматривалась фаза экспоненциального роста и соответствующая модель роста, а также рассматривались методы определения основных количественных параметров роста культур микроорганизмов. Кривая роста. Рассмотрим закономерности роста культуры микроорганизмов в более широком интервале времени (рис. 3.1). Рис. 3.1. Кривая роста микроорганизмов при периодическом культивировании: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания Как известно за экспоненциальной фазой следует фаза линейного роста, переходящая в фазу замедленного роста. При периодическом культивировании, как правило, рост популяции останавливается на некотором предельном уровне, который может быть охарактеризован предельной максимальной концентрацией клеток Хт. Кинетический анализ позволяет получить уравнения, описывающие поведение микробной популяции во всем интервале времени развития культуры. 3.1. Замедление скорости роста – модель Ферхюльста Одна из первых попыток объяснить уменьшение скорости роста культур микроорганизмов и достижение предельного уровня концентрации популяции была предпринята Ферхюльстом. (см. Печуркин Н. С., Терсков И. А., 1975). Предполагалось, что уравнение скорости накопления биомассы содержит дополнительный отрицательный член, квадратичный по биомассе: dX X2 X dt Xm . (3.1) Качественно это означает, что при малых значениях Х происходит увеличение скорости роста культуры, при больших Х – уменьшение за счѐт квадратичного члена. Уравнение (3.1) после разделения переменных примет вид: dX X X 1 X m t . (3.2) Интегрирование этого уравнения при t = 0, Х = xo, приводит к уравнению ln X / xo X m xo t . X m / xo X / xo xo (3.3) Это уравнение можно записать в виде: X m t x 1 e , X m / xo x xo (3.4) где х=Х/хо. Из последнего уравнения можно х можно выразить как явную функцию времени: х(t)= beμt/(1 + aeμt), где 1 а = X / x 1, m o X m xo b = X / x 1. m o (3.5) (3.6) (3.7) Рассмотрим свойства уравнения (3.5). В начальный момент времени t = 0 х = Х/х о = 1. Общее количество биомассы в системе равно засевной концентрации хо. При t → ∞ х(t)= b/a = Xm/xo. Концентра- ция клеток достигает предельного уровня. При относительно малых μt временах процесса, когда ae «1, имеет место экспоненциальный рост числа клеток: х(t) ≈ beμt. (3.8) Обычно культивирование микроорганизмов проводят в условиях, когда Xm/xo » 1. При этом а = xo/Xm, b = 1. Соответственно кинетика накопления биомассы будет представлена логистическим уравнением х(t) ≈ beμt/(1 + xo/Xm) eμt. (3.9) На рис. 3.2 приведены зависимости х(t) при различных значениях параметров кривых xo/Xm и μ. Видно, что значение xo/Xm определяет предел накопления биомассы, а μ – скорость развития процесса. а б Рис. 3.2. Зависимости х(t) при различных начальных соотношениях xo/Xm (а) и различных значениях μ (б) Кривые (рис. 3.2) называются логистическими. Эти кривые симметричны относительно времени τ, при котором скорость развития процесса максимальна. Время τ, при котором концентрация биомассы достигает половины предельного значения, можно вычислить по уравнению (3.5), приравняв x=Xm/2xo: τ = (ln Xm/xo)/μ; соответственно μ = (ln Xm/xo)/τ. Можно также сравнить экспериментальные результаты изучения кинетики роста с данной моделью. Экспериментальным критерием соответствия наблюда- емой кинетической кривой роста данной модели может служить линеаризация экспериментальных данных в координатах уравнения (3.4). Логистические кривые часто используют для описания популяционной динамики роста микро- и макроорганизмов. В ряде случаев наблюдается хорошее соответствие между теоретическими кривыми и данными экспериментов. Однако необходимо иметь в виду, что это описание имеет чисто формальный характер, так как введение в дифференциальное уравнение роста отрицательного квадратного члена не имеет ясного молекулярнобиологического обоснования. 3.2. Модель роста, учитывающая потребление субстрата Анализ кинетики роста микроорганизмов в системах с истощением субстрата (см. ниже) показывает, что в некоторых частных случаях кинетика роста строго описывается уравнением логистической кривой, однако физическая сущность этого связана не с взаимным ингибированием роста, а с расходом в системе лимитирующего субстрата. Рассмотрим рост популяции микроорганизмов по модели Моно. В этой модели можно учесть расход концентрации лимитирующего субстрата, исходя из того, что в замкнутой системе между концентрацией биомассы и количеством субстрата имеется линейная связь. Уравнение экспоненциального роста культуры имеет вид (см. уравнение 2.3): dS dX X или X Y s dt . dt Знак минус показывает, что субстрат расходуется в процессе роста. Коэффициент Ys – экономический коэффициент (Ys = ∆Х/∆S). Отсюда можно получить: X – xo = Ys(So – S) или S = So – (X – xo)/Ys. (3.10) Последние уравнения справедливы для всех механизмов роста, в том числе характеризуемых многостадийностью превращения субстрата при отсутствии осложняющих факторов, таких как ингибирование избытком субстрата или продуктом биосинтеза. Если в уравнение Моно m S KS S подставить выражение для S в соответствии с уравнением (3.10), то получим дифференциальное уравнение первого порядка с разделяющимися переменными. С учѐтом уравнения 2.3 получим: 1 Ys K s dX X X S X x m t . o o (3.11) Решением этого уравнения является выражение YK X YK Y S x X 1 s s ln s s ln s o o m t . Y S x x Y S x Y S s o o o s o s o (3.12) Это уравнение известно как уравнение Моно в интегральной форме (иногда также это уравнение называют моделью Перта). Если перейти к безразмерной форме х=Х/хо и обозначить N = YsKs/(YsSo + xo), то уравнение 3.12 можно представить в виде ln x N ln 1 a ax m t , 1 N 1 N (3.13) где а = хо/ YsSo. Принципиально важны два следующих режима функционирования системы: 1. Условия малого накопления биомассы и небольшого расхода субстрата. В этом случае ах « 1 (X/xo « YsSo/x), тогда второй логарифмический m So m So член уравнения (3.13) близок нулю и lnX/xo = K s S o , т.е. X/xo = e K s So . Таким образом, имеет место экспоненциальный рост культуры и экспериментально проявляется экспоненциальная фаза роста. 2. Режим, близкий к истощению субстрата. Ks В этом случае ах → 1. При этом условии K S ln 1 ax » s o ln x, тогда m So Ks ln 1 ax ≈ K s So t K s So (3.14) m So Ks и 1 – ах ≈ e . При t → ∞ x = 1/a = YsSo/хо или Х = YsSo. Отсюда следует, что накопление биомассы в системе имеет предел, определяемый концентрацией субстрата. С учѐтом исходно внесѐнного инокулята в концентрации хо, предельное накопление биомассы будет определяться выражением: X = Хm = YsSo + хо. (3.15) Таким образом, уравнение (3.13) описывает наиболее характерные особенности кинетической кривой роста микробной популяции в закрытой системе: экспоненциальный рост на начальном этапе процесса, замедление скорости роста в связи с истощением субстрата и достижением предельной концентрации биомассы при его полном исчерпании. 3.3 Оптимизация продолжительности процесса периодического культивирования В производстве не всегда целесообразно проводить процесс культивирования до предельного уровня накопления биомассы. Возникает задача достижения максимальной производительности периодического процесса по биомассе или по продукту метаболизма (в зависимости от того, что является целевым продуктом). Для решения этой задачи определяется показатель средней продуктивности процесса. В простейшем случае этот показатель определяется выражениями: ПХ = ХК/tK или ПР = РК/tK (3.16) где ПХ и ПР – средние продуктивности по биомассе и продукту метаболизма соответственно; ХК и РК – концентрации биомассы и продукта в конце процесса ферментации (t = tK). Графически эти отношения представляют собой тангенс угла наклона прямой, связывающей начало координат и точку К на кривой X (t) t = tK (рис. 3.3). На рисунке эта прямая не проведена. Следует иметь в виду, что при этом время tK включает в себя как собственно время ферментации, так и время tп, затрачиваемое на подготовительные операции (мойка, подготовка аппарата, загрузка среды и засев). Практически продуктивность означает количество полученного продукта с единицы объема аппарата в единицу времени, размерность продуктивности г/(л•ч) или кг/(м3•ч). Рис. 3.3. Способ определения оптимального времени завершения процесса культивирования: К – точка максимального накопления продукта; М – точка максимальной продуктивности по биомассе Следует также отметить, что заканчивать ферментацию в точке К, когда достигнута максимальная концентрация биомассы (или продукта метаболизма) по продуктивности, нецелесообразно. Если провести из начала координат касательную к кривой X(t) (она проведена на рис. 3.3 пунктиром), то можно найти точку М (точку касания) и соответствующее ей время tм.Если закончить ферментацию в момент времени tм, то хотя концентрация биомассы Хм меньше, чем ХК, продуктивность процесса ПХ = Хм/tм будет значительно больше, чем ПХ = ХК/tK . Контрольные вопросы и задания 1. Дайте характеристику различных способов культивирования микроорганизмов. 2. Охарактеризуйте периодическое глубинное и непрерывное глубинное культивирование. 3. Назовите основные стадии роста микроорганизмов, дайте характеристику фаз роста. 4. Напишите уравнение роста в экспоненциальной фазе. 5. Дайте понятия удельной скорости роста, выхода биомассы, экономического коэффициента. 6. Дайте понятие о времени удвоения биомассы (период генерации). 7. Напишите уравнение Моно для кинетики роста микробной биомассы. 8. Дайте понятие принципа узкого места в кинетике микробного роста. 9. Опишите экспериментальные приѐмы определения констант уравнения Моно в условиях периодического глубинного культивирования. 10. Опишите способы определения количественных параметров роста микробных популяций по экспериментальным данным периодического культивирования. 11. Опишите принципы построения моделей роста микробных популяций, отражающих ход кривой роста. Модель Ферхюльста. 12. Приведите уравнение роста микроорганизмов в интегральной форме. 13. Дайте характеристику процессов ингибирования и активации роста микроорганизмов. 14. Приведите модели Моно, учитывающие конкурентное и неконкурентное ингибирование роста. 15. Опишите графические методы определения констант уравнения Моно при конкурентном и неконкурентном ингибировании. 16. Охарактеризуйте модели ингибирования роста микроорганизмов в условиях избытка субстрата и продуктами метаболизма. 17. Какое влияние оказывают температура и концентрация водородных ионов на рост микроорганизмов? 4. Моделирование кинетики роста микроорганизмов в биореакторах непрерывного действия При периодическом культивировании в полной мере способность микроорганизмов к максимальному размножению не используется. Период самой активной жизнедеятельности – экспоненциальная фаза – занимает лишь небольшую часть производственного цикла, а значительная часть времени уходит на лаг-фазу и период замедленного роста. При периодическом культивировании клетки все время находятся в меняющихся условиях. Вначале в питательной среде имеются в достаточном количестве все питательные вещества, а затем, постепенно наступает недостаток питания и накопление продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, ингибирующих рост клеток. Если ввести в питательную среду сразу большое количество питательных веществ, то происходит ингибирование роста культуры избытком субстрата. Постепенным введением этого же количества питательных веществ в течение всего процесса можно избежать ингибирования роста микроорганизмов. Такой метод получил название культивирование микроорганизмов с дробным дозированием субстрата. При добавлении источников питания в ходе культивирования происходит изменение объѐма питательной среды. Чтобы сохранить объѐм среды постоянным и снизить концентрацию продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в среде, часть культуральной жидкости можно через определѐнные промежутки времени удалять из аппарата. Такой периодический процесс культивирования называется отъѐмно-доливным. Отличие его от предыдущего метода заключается в том, что часть культуры периодически удаляется при постепенном поступлении свежей среды. В данном случае основные параметры процесса – объѐм, скорость разбавления, удельная скорость роста – не являются постоянными, и культура находится в квазистационарном состоянии. 4.1. Условия непрерывного культивирования микроорганизмов Непрерывное культивирование заключается в непрерывной подаче питательных веществ в биореактор (ферментатор) в таком количественном и качественном соотношении, которое необходимо для поддержания микроорганизмов в экспоненциальной фазе развития. В этих условиях достигается подвижно-равновесное состояние, при котором клетки непрерывно и однородно размножаются со скоростъю, соответствующей притоку питательных веществ. Одновременно часть культуральной среды вместе со взвешенными в ней клетками с той же скоростью непрерывно вытекает из ферментатора, однако количество микроорганизмов, поддерживающее непрерывный процесс, остаѐтся в ферментаторе постоянным. Одной из важных характеристик характеристик непрерывного культивирования является скорость разбавления, т. е. скорость обмена питательной среды в ферментаторе D = v/V, (4.1) где D – скорость разбавления, ч –1; V – объѐм ферментатора, л; v – скорость поступления среды (скорость протока), л/ч. Удельная скорость роста микроорганизмов равна (см. уравнение 2.3) 1 dX X dt отсюда мгновенный прирост концентрации микроорганизмов во время культивирования равен Х. В условиях непрерывного культивирования мгновенный прирост биомассы Х компенсируется еѐ уносом со средой DX, т. е. Х – DX = 0 или ( – D) × X = 0. Следовательно, = D (4.2). Это равенство является основным условием поддержания установившегося режима при непрерывном культивировании микроорганизмов. В этом случае все технологические и физиологические показатели сохраняются постоянными. К технологическим показателям относится концентрация компонентов культуральной жидкости, а к физиологическим – скорость роста клеток и их структурно-биохимические особенности. Саморегулирующая способность микроорганизмов в процессах непрерывного культивирования. Установившийся (стационарный) режим при непрерывном культивировании, т. е. когда скорость разбавления находится в равновесии с удельной скоростью роста, необходимо контролировать и поддерживать притоком свежей питательной среды. Однако система непрерывного культивирования микроорганизмов обладает способностью саморегулирования. Это проявляется в том, что при изменении состава среды или скорости еѐ подачи, система выходит из равновесия и возникает ряд взаимосвязанных изменений еѐ параметров. Предположим, что скорость разбавления стала меньше удельной скорости роста микроорганизмов, т. е. D. При этом разность – D становится положительной величиной. В связи с этим время пребывания среды в ферментаторе увеличивается и концентрация биомассы Х начинает повышаться, что приводит к убыли питательных веществ и накоплению продуктов обмена. Все это неблагоприятно отражается на скорости роста, и она начинает падать. Вследствие этого разность – D стремится к нулю, а система – к установлению нового подвижного равновесия. При этом концентрация биомассы стабилизируется на новом более высоком уровне по сравнению с первоначальным, а концентрация субстрата – на более низком уровне. Если скорость разбавления увеличится и на некоторое время станет выше удельной скорости роста D, то разность –D станет отрицательной величиной и концентрация биомассы в системе начнѐт снижаться. Питательные вещества меньше расходуются, концентрация их возрастает, что положительно влияет на удельную скорость роста – она увеличивается. В результате система приходит к новому установившемуся режиму, соответствующему более высокой концентрации питательных веществ и более низкой концентрации биомассы. Таким образом, изменяя скорость потока или состав питательной среды можно переводить систему из одного стационарного состояния в другое. Из этого следует, что непрерывные процессы обладают саморегулирующей способностью при условии m. Когда скорость разбавления превысит максимальную удельную скорость роста, то через определѐнный период времени все микроорганизмы будут вымыты из ферментатора. 4.2. Теория хемостатного культивирования При гомогенно-непрерывном культивировании можно осуществить ограничение роста культуры одним элементом питания при нелимитируемых количествах других компонентов. Такое непрерывное культивирование называется хемостатным, так как рост микроорганизмов регулируют химические факторы среды (рис. 4.1). 4 1 6 7 3 5 2 Рис. 4.1. Принципиальная схема хемостата: 1 – регулятор подачи лимитирующего компонента; 2 – датчик концентрации лимитирующего компонента; 3 – лимитирующий компонент; 4 – питательная среда; 5 – культуральная жидкость; 6 – аэрация; 7 – перемешивающее устройство Хемостатная культура представляет собой полностью перемешиваемую суспензию биомассы, в которую с постоянной скоростью подаѐтся среда и из которой с той же скоростью отбирается культуральная жидкость вместе с клетками. Компоненты среды подбирают таким образом, чтобы один элемент питания был в недостатке, тогда плотность популяции определяется его концентрацией. Все остальные элементы питания даются в избытке, а условия культивирования (температура, рН, аэрация) поддерживаются оптимальными. Скорость разбавления в хемостате заранее задана и контролируется концентрацией лимитирующего компонента. Микроорганизмы в зависимости от этого сами поддерживают собственную концентрацию. Скорость разбавления D можно менять в широких пределах, но она не должна превышать величину m. Теория хемостатного культивирования. Хемостатное культивирование – это вариант гомогенного непрерывного (проточного) культивирования с заданным коэффициентом разбавления (D). При этом задаѐтся также фактор, который обусловливает ограничение концентрации образующейся в аппарате биомассы. Концентрация биомассы определяется одним определѐнным компонентом питания. При низком коэффициенте разбавления лимитирование будет значительным, при высоком – относительно слабым. То же самое наблюдается и в отношении воздействия на микроорганизмы ингибиторов роста: при низком коэффициенте разбавления клетки дольше находятся в среде с ингибитором и его воздействие проявляется в большей степени; при высоком значении D эффект ингибирования менее выражен. Однако при высокой скорости роста клетки могут быть более чувствительны к ингибитору. Хемостатный метод культивирования незаменим в лабораторных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тканей. В промышленности он широко применяется в процессах производства микробной биомассы. Для хемостатной культуры существуют определѐнные количественные зависимости между концентрацией биомассы Х, концентрацией субстрата S и скоростью роста . Скорости изменения концентрации биомассы субстрата при хемостатном культивировании определяются следующими уравнениями: dX X DX ; dt (4.3) dS DSo DS X / Ys ; dt (4.4) dP X DP , dt YP (4.5) где So – исходная концентрация субстрата, являющегося лимитирующим фактором; DSo – приток субстрата в ферментатор; DS – унос неутилизированного субстрата из ферментатора; Х/YS – расход субстрата на рост микроорганизмов; Х/YР – биосинтез продукта метаболизма; YS, YР – экономические коэффициенты по биомассе и продукту соответственно. В стационарном состоянии концентрации биомассы и неутилизированного субстрата являются постоянными, т. е. при Х = DX или = D концентрация биомассы Х = const и S = const. В этом случае в соответствии с уравнением Моно зависимости удельной скорости роста микроорганизмов от концентрации лимитирующего субстрата можно записать: mS = D=K S . s (4.5) Последнее уравнение позволяет вычислить значения стационарных концентраций субстрата и биомассы в зависимости от скорости разбавления: KsD Sст = D ; m (4.7) KsD Xст = Ys(So – Sст) = Ys(So – D ). m (4.8) Концентрация субстрата и биомассы, г/л В стационарном состоянии рост культуры характеризуется хемостатными кривыми, изображающими зависимость концентрации клеток Х и концентрации субстрата S от скорости разбавления D. Соответствующие графики зависимостей стационарных концентраций субстрата и биомассы от скорости разбавления (хемостатные кривые) приведены на рис. 4.2. 12 10 2 1 8 3 6 4 2 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Рис. 4.2. Зависимости стационарных концентраций биомассы (1) субстрата (2) и производительности (3) от скорости разбавления: 1 - биомасса; 2 – субстрат; 3 - производительность по биомассе Из графиков хорошо видно, что с ростом скорости разбавления значения стационарных концентраций биомассы уменьшаются. При определѐнном значении D, называемом критической скоростью разбавления разбавления (Dкр), микроорганизмы вымываются из аппарата, при этом значение стационарной концентрации субстрата достигает величины So, т. е. становится равной концентрации субстрата, вводимого в аппарат. Величина критической скорости разбавления определяется выражением: Dкр = mSo/(Ks+So). (4.9) Это значение близко величине m, однако, в условиях хемостатного культивирования биомасса вымывается из ферментатора при несколько меньшей скорости разбавления. Производительность ферментатора по биомассе определяется уравнением (кривая 3 рис 4.2): П = DX . (4.10) Видно, что при определенной скорости разбавления (протока) Dопт производительность хемостата по биомассе имеет максимальное значение П = Пmax. Величину Dопт можно определить из условия равенства нулю производной dП/dD (dП/dD = 0). Можно показать, что в этом случае Dопт определяется выражением: DO m 1 K S / K S S 0 1/ 2 (4.11) Таким образом, определив основные параметры, характеризующие культуру микроорганизмов (m, Ks, Ys), можно рассчитать стационарные концентрации субстрата и биомассы, а также величину производительности аппарата для любых возможных значений скорости разбавления. Аппаратура для хемостатного культивирования в лабораторных условиях обычно включает ферментатор ѐмкостью от 0,5 до 2,0 л или больше, имеющий систему термостатирования, снабжѐнный мешалкой с регулируемым числом оборотов и подачей воздуха с регулируемой скоростью. Кроме того, ферментатор обеспечен электродами для измерения рН с устройством для автоматического поддержания заданного уровня рН; электродами для измерения концентрации в среде кислорода. Показания датчиков температуры, рН и кислорода могут регистрироваться автоматически самописцами или компъютером. Скорость разбавления задаѐтся дозирующим насосом для подачи свежей питательной среды. Иногда применяются дополнительные насосыдозаторы для подачи некоторых компонентов среды отдельно. Вся аппаратура размещается на стенде. Такая установка для хемостатного культивирования создает условия для решения различных задач по физиологии и биохимии микроорганизмов. В зависимости от стоящих вопросов возможно упрощение установки вплоть до использования небольшого стеклянного сосудика с магнитной мешалкой и сосудом Мариотта, обеспечивающими постоянство потока среды. Таким образом, метод хемостатного культивирования в лабораторных условиях позволяет установить особенности физиологического состояния клеток, изучить влияние недостатка компонентов питания, ингибиторов и активаторов роста и многих других факторов. 4.2 Способы определения параметров роста культуры из экспериментальных данных хемостатного культивирования Определение таких параметров как YS , YР, m, KS необходимо при описании роста микроорганизмов в режиме хемостатного культивирования. Наиболее просто могут быть найдены экономические коэффициенты YS и YР данным о стационарных концентрациях субстрата, продукта метаболизма и биомассы. YS может быть найден из уравнения 4.8 как тангенс угла наклона зависимости Xст от (So – Sст). YР можно определить из уравнения 4.5. Для стационарного режима Рст = Xст/YР или YР = Xст/Рст, т.е. этот параметр можно определить как тангенс угла наклона зависимости Xст от Рст. Предполагается, что экономические коэффициенты YS и YР постоянны в течение развития процесса и не зависят от скорости протока (его разбавления). Параметры m и KS могут быть найдены из зависимости стационарной концентрации субстрата от скорости протока (разбавления) по уравнению 4.7. Для этого можно воспользоваться линейными анаморфозами (метод Лайнуивера и Бэрка): 1 1 1 m S CT K S D K S (4.12) или D = m – KS (D/Scn) (4.13) Согласно уравнению (4.12) зависимость 1/Scn от 1/D представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона m/KS, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен -1/KS. Значение m может быть найдено из длины отрезка, отсекаемого прямой на оси абсцисс. Использование уравнения (4.13) также позволяет графически найти значения m и KS. Тангенс угла наклона дает значение KS, отрезок, отсекаемый по оси ординат D, дает значение m. Из отдельно полученных значений Sст хотя бы при двух значениях скорости протока D1 и D2 – соответственно S1 и S2 используя уравнение (4.7) можно вычислить KS : KS = (D1 – D2)/(D2/S2 – D1/S1). (4.14) Аналогично может быть вычислено значение m. Если экспериментально установлены значения стационарных концентраций биомассы Xст в зависимости от скорости протока D, то используя уравнение (4.8) с помощью выше описанных приемов можно также определить значения YS, m, KS. 4.3 Ингибирование продуктами метаболизма в условиях хемостатного культивирования Рассмотрим закономерности культивирования микроорганизмов в хемостате с учетом эффектов ингибирования роста образующимися продуктами метаболизма для двух основных механизмов ингибирования: конкурентного и неконкурентного: Соответствующая система уравнений аналогична уравнениям (4.3 – 4.5). Удельная скорость роста как функция концентрации субстрата и продукта метаболизма будет иметь вид - для случая конкурентного ингибирования: m S P S K S 1 KP - для случая неконкурентного ингибирования: (4.15) m S P 1 K S S K P . (4.16) В качестве примера, рассмотрим конкурентное ингибирование продуктом в режиме хемостатного культивирования. В стационарном состоянии в условиях dX/dt = 0, dS/dt = 0, dP/dt = 0 первое уравнение системы уравнений (4.3 – 4.5) может быть представлено в виде: m S CT D . PCT S CT K S 1 K P (4.17) Учитывая, что Рст = Xст/YР = (S0 – Sст)YS/YР и подставляя это выражение для Рст в уравнение (4.15) получим выражение: m S CT Y K S 1 S S 0 S CT S CT YP K P D . (4.18) Это уравнение может быть решено относительно Sст: Sст = . (4.19) Уравнение (4.19) описывает зависимость стационарной концентрации субстрата от концентрации вводимого субстрата S0, скорости протока D, кинетических параметров m, KS, экономических коэффициентов по субстрату и продукту YS, YР и константы ингибирования КР продуктом. Из этого уравнения следует, что в случае ингибирования продуктом стационарный уровень концентрации субстрата является функцией начальной его концентрации. Это отличает процесс с ингибированием про- дуктом от процесса с неосложненным ростом. Очевидно, что поскольку S0 ≥ Scт, то D ≤ m S/(KS + S). Отсюда следует, что существует критическая скорость протока для системы с конкурентным ингибированием продуктом. Эта критическая скорость та же, что и для неосложненного процесса (см. уравнение 4.9). Для того, чтобы идентифицировать механизм ингибирования и определить все параметры роста культуры микроорганизмов, необходимо провести изучение стационарных уровней субстрата, биомассы или продукта в зависимости от скоростей протока и начальных концентраций субстрата. В качестве примера рассмотрим способы определения параметров на основе экспериментальным данным о стационарных концентрациях субстрата. Уравнение (4.19) можно преобразовать к виду: K S Sст = m S 0 D 1D , (4.20) где α = YS KS/YРKР – безразмерный параметр, характеризующий относительную эффективность ингибирования продуктом. Из уравнения (4.20) видно, что Sст линейно зависит от S0 и обратно пропорционально (гиперболически) от D. Его можно записать в форме: KS Sст = / D 1 / D 1 S0 . m m (4.21) Из уравнения (4.21) видно, что Sст линейно зависит от S0 при данной постоянной скорости протока (разбавления) D. При этом параметры прямой линии определяются следующими функциями: a KS m / D 1 ; (4.22) m D 1 . (4.23) tg Если α = 0, т. е. ингибирование продуктом метаболизма отсутствует, то стационарная концентрация субстрата не зависит от S0. Это соответствует кинетике неосложненного роста. Для определения параметров α , m, KS необходимо экспериментально установить значения а и tgφ при нескольких (как минимум при двух) различных значениях скорости протока D. В этом случае можно построить графики в соответствии с уравнениями: 1 m 1 1 KS D KS ; (4.24) 1 m 1 1 tg D . (4.25) Параметры этих прямых позволяют определить значения α , m, KS. Если получены экспериментальные данные по стационарным концентрациям субстрата при различных скоростях протока D в режиме двух или нескольких концентраций вводимого субстрата S0, то аналогичный анализ можно провести также с использованием уравнения (4.21). Для этого его нужно преобразовать к виду: m 1 1 1 S ST K S S 0 D K S S 0 . (4.26) При конкурентном ингибировании экспериментальные данные должны линеаризоваться в координатах этого уравнения 1/Sст от 1/D. Определив графически величины а и tgφ, затем можно построить прямые в координатах 1/а и 1/tgφ в зависимости от 1/S0. Эти линейные анаморфозы также позволят определить параметры α , m, KS. Неконкурентное ингибирование продуктом метаболизма в режиме хемостатного культивирования. В отличие от конкурентного ингибирования неконкурентные ингибиторы прямо снижают удельную скорость роста (см. уравнение 4.16). Подставляя это выражение в уравнение (4.3) можно получить уравнение зависимости Sст от параметров α, m, KS. Можно показать, что при малых значениях S0 и малых скоростях протока D будет иметь место приближенное выражение для Sст: K S S 0 Sст ≈ / D 1 1 m . (4.27) Уравнение (4.27) похоже на уравнение (4.21), описывающее кинетику с конкурентным ингибированием продуктом. Таким образом, для определения параметров роста культуры в условиях неконкурентного ингибирования можно воспользоваться теми же методами и подходами, которые применялись для механизма конкурентного ингибирования. Однако необходимо иметь в виду, что это уравнение имеет приближенный характер и в связи с этим тем точнее описывает решение, чем ниже скорость протока и ниже концентрация вводимого субстрата. Ингибирование ионами водорода. При культивировании микроорганизмов достаточно часто в качестве побочных продуктов метаболизма синтезируются органические кислоты, например уксусная или молочная кислоты, которые смещают рН культуральной жидкости в область низких значений и тем самым снижают удельную скорость роста культуры. Если ингибирование ионами водорода достаточно сильное, то без специальных приемов вообще невозможно реализовать рост культуры в режиме хемостатного культивирования. В такой ситуации для предотвращения ингибирования кислотным продуктом в биореактор можно вводить с постоянной скоростью v0 нейтрализующий кислоту раствор щелочи. Известно, что кислоты обычно являются неконкурентными ингибито+ рами. Однако с целью упрощения анализа предположим, что протон Н является конкурентным ингибитором роста. Тогда получим (см. уравнение 4.17): D m S CT H KS 1 Kp . (4.28) С другой стороны, уравнение (4.5) для стационарного режима примет вид: YS v0 S S 0 CT Рст = Н = Y D. P + (4.29) При подстановке этого выражения в уравнение (4.28) получим: v0 K S D KP , m / D 1 K S S 0 Sст = (4.30) где α = YS KS/YРKР. В отличие от рассмотренного ранее уравнения для случая ингибирования без нейтрализации уравнение (4.30) содержит в числителе дополнительный член (-v0KS/DKP). Этот член приводит к тому, что при нейтрализации кислого продукта стационарная концентрация субстрата ниже и, соответственно, концентрация биомассы выше, чем для процесса без нейтрализации. Дополнительный прирост биомассы при нейтрализации кислотного продукта имеет вид: KS KP 1D . v0 ∆Хст = YS m (4.31) Из этого уравнения видно, что прирост биомассы при нейтрализации тем выше, чем выше скорость подачи нейтрализующего агента. При снижении скорости протока прирост биомассы увеличивается, а при увеличении – снижается. Из уравнения (4.30) следует, что КS + αS0> -v0KS/DKP . Это условие будет хорошо выполняться при высоких концентрациях субстрата или при высоких скоростях протока. Критическая скорость протока, которую можно вычислить из условия равенства нулю числителя уравнения (4.30), имеет следующий вид: v0 Dкр = S . K P 1 0 KS (4.32) Ниже этого значения скорости протока (Dкр) стационарного роста в хемостате не будет. Для определения параметров роста культуры в условиях нейтрализации кислотного продукта необходимо провести экспериментальное исследование стационарных концентраций субстрат и (или) биомассы при различных концентрациях вводимого субстрата и различных скоростях протока. После этого, применяя изложенные выше методы, определить параметры α, m, KS. 4.5. Непрерывное культивирование с рециркуляцией биомассы Одним из недостатков хемостата является его склонность к вымыванию культуры. Действительно, для получения высокой производительности необходимо работать при оптимальной скорости разбавления Doпт, близкой к критической Dкр. В таких условиях при случайном уменьшении концентрации субстрата на входе или неточном задании протока D может начаться необратимое вымывание культуры из аппарата. Для борьбы с этим явлением предложено использовать комплекс «биореактор – сепаратор» (рис. 4.3). В этом комплексе выходящая из ферментатора жидкость сгущается на сепараторе; часть сгущенного потока непрерывно возвращается в ферментатор, остальная часть идет как товарный продукт. Осветленная жидкость сбрасывается в стоки. Свежая среда поступает с расходом v0 и концентрацией субстрата S0 в ферментатор с объемом рабочей жидкости V0, где концентрация биомассы x1 субстрата S1 и удельная скорость роста μ1 одинаковы в каждой его точке. Из-за рециркуляции жидкости из сепаратора C (которую рассмотрим позже) поток из ферментера больше, чем входной; он равен v1 c концентрацией биомассы x1. v0, S0 μ1, x1,S1 V0 v2, x2 C v1, x1, S1 v0, x, S1 Рис. 4.3. Схема потоков в хемостате с рециркуляцией биомассы На сепараторе биомасса сгущается в b раз, т. е. ее концентрация x2 в выходном потоке равна b x1. Концентрация же субстрата при этом не меняется и составляет S1. Из сепаратора выходят два потока: один – сгущенная биомасса с расходом v2, второй – культуральная жидкость с концентрацией биомассы x и расходом v0. При этом b = х2/х1 ≥ 1, а отношение потоков а = v2/ v0 ≤ 1. Таким образом, можно записать: v2x2 + μ1 x1 V0 = x1 v1 (4.33) x1 v1 – v2x2 = v0 x (4.34) v1 – v2 = v0 (4.35) Учитывая, что D = v0/V0 решением системы этих уравнений будет выражение: Dоб = μ/[1 – а(b-1)]. (4.36) - Таким образом, общая скорость протока Dоб будет в [1 – а(b-1)] 1 раз больше, чем удельная скорость роста μ. Рассмотрим уравнение для производства биомассы в стационарном режиме: D(S0 – Sст) = μх1/YS . (4.37) Отсюда получим: П = μх1 = μ YS(S0 – Sст)/[1 – а(b-1)] , (4.38) Следовательно, производительность хемостата по биомассе также увели-1 чивается в [1 – а(b-1)] раз. 4.6. Автоселекция в процессе хемостатного культивирования В ходе процесса культивирования под воздействием космических лучей и различных мутагенных факторов в культуре происходят изменения, в результате которых может появиться штамм, имеющий более высокую удельную скорость роста, чем исходный. С этого момента оба штамма начинают конкурировать за субстрат (рис. 4.4). Рис. 4.4. Изменение концентрации остаточного субстрата при замещении штамма 1 штаммом 2: μ1 и μ2 кинетические зависимости для штаммов 1 и 2 Если процесс протекает при скорости разбавления D1, то исходный штамм обеспечивает саморегулирование процесса при концентрации S1. Если вначале процесс стабилизирован на уровне S1, то для штамма-мутанта μ2(S1) = D2 значительно больше D1. Следовательно, концентрация биомассы этого штамма будет расти: dX2/dt = [μ2(S1) – D1] X > 0. (4.39) При этом рост происходит до тех пор, пока концентрация субстрата снизится до S2. В этих условиях исходный штамм будет вымываться из аппарата, поскольку μ1(S2) < D1 и тогда dX1/dt = [μ1(S2) – D1] X < 0. (4.40) Если наблюдать за концентрацией биомассы в непрерывном процессе культивирования, то можно заметить постепенное повышение концентрации, свидетельствующее о самопроизвольной селекции (автоселекции) новых мутантных штаммов с более высокой удельной скоростью роста. Таким образом, длительный непрерывный процесс культивирования может быть использован для отбора штаммов, обеспечивающих более высокую удельную скорость роста биомассы микроорганизмов. Надо отметить, что улучшение штаммов по удельной скорости их роста не всегда полезно. При этом иногда происходит ухудшение качества белка и других компонентов клетки, а также снижение ее способности к биосинтезу полезных метаболитов. 4.7. Сравнение производительности по биомассе периодического и непрерывного процессов При сравнении дадим преимущества периодическому процессу. Предположим, что после загрузки и до самого конца процесса биомасса растет с максимальной скоростью μ = μ т. Однако учтем, что рост начинается после подготовки аппарата, загрузки среды и посевного материала и лаг-фазы, т.е. с момента времени t0. Рост биомассы описывается уравнением экспоненциального роста dX/dt = μ тХ (при t > t0); (4.41) Здесь Х = Х0 ехр[μ т(t – t0)], (4.42) и тогда ln Х = Х0 + μ т(t -t0). (4.43) Предположим, что рост идет до некоей максимальной для данного аппарата концентрации биомассы Хт (концентрация биомассы не может возрастать до бесконечности, так как при этом возникают ограничения по массообменным возможностям аппарата; каждый аппарат имеет свой предел). Достижение этой концентрации происходит в момент времени tк (для периодического процесса). Графически картина роста биомассы при принятых допущениях представлена на рисунках 3.1 и 3.2. Подставляя Х = Хт и t = tк в уравнение (4.43), получим: ln Хт = Х0 + μ т(tк – t0). (4.44) Отсюда можно найти tк и производительность по биомассе Пх: Пх = Хт/tк = Хт μ т/(ln Хт/Х0 + t0 μ т). (4.45) Для хемостата максимальная производительность по биомассе определяется выражением (4.10) Пх = DоптX. Dопт, в свою очередь, определяется уравнением (4.11). Примем, что Dопт = 0.7μ т, и X = 0.7Хт как наиболее вероятные значения в непрерывных процессах. Из уравнения (4.10) получим Пх ≈ 0.5 Хт μ т. Теперь можно определить отношение Пнепр/Ппер: Пнепр/Ппер = 0.5 Хт μ т/ [Хт μ т/(ln Хт/Х0 + t0 μ т)] ≈ ≈ 0.5(ln Хт/Х0 + t0 μ т). (4.46) С учетом реальных соотношений Хт/Х0 = 20, ln20 = 3. После подстановки в выражение (4.46) получим Пнепр/Ппер = 0.5(3 + t0 μ т). Примем t0 = 10 ч (это время подготовки аппарата к следующей ферментации). Для быстро растущих культур (бактерии, дрожжи) получим при μ т = 0.5 ч-1 Пнепр/Ппер ≈ 4. Для медленно растущих культур (грибы, актиномицеты) при μ т = 0.05 ч-1 Пнепр/Ппер ≈ 1.7. Таким образом, непрерывное культивирование имеет значительно более высокую производительность по биомассе по сравнению с периодическим процессом. Контрольные вопросы и задания 1. Дайте характеристику систем непрерывного культивирования: условия непрерывного культивирования; саморегулирующая способность микроорганизмов в условиях непрерывного культивирования. 2. Расскажите об открытых одноступенчатых гомогенно-непрерывныех системах. 3. В чем отличие принципов работы хемостата и турбидостата? 4. Напишите уравнение кинетики хемостатного культивирования для биомассы. 5. Дайте понятие о стационарных режимах. 6. Напишите систему уравнений, описывающих зависимости стационарных концентраций биомассы, субстрата и продукта метаболизма от скорости разбавления (протока). 7. Что такое производительность хемостата по биомассе? 8. Как можно оптимизировать производительность хемостата? 9. Как определить количественные параметры неосложнѐнного роста по экспериментальным данным стационарных состояний хемостатного культивирования? 10 Расскажите о расчѐтных и графических методах определения параметров роста по экспериментальным данным стационарных состояний хемостатного культивирования. 5. Масштабирование биотехнологических процессов Изучение процессов ферментации в лабораторных условиях происходит сначала в колбах, затем в ферментерах лабораторного масштаба объемом 1 – 10 л, далее происходит испытание в опытных установках объемом 50, 100, 1000 л и более. Объемы промышленных установок зависят от вида продукта и от потребности в нем. Обычно речь идет уже о десятках кубометров – 10, 20, 50, 60, 100, отдельные аппараты имеют объемы свыше 1000 м3 (для получения кормовых дрожжей). Обычно в аппаратах разного масштаба используют одинаковые микроорганизмы и одинаковый состав питательных сред. Можно было бы ожидать, что в пересчете на единицу объема (миллилитр, литр, кубометр) количество получаемого продукта (биомассы или продуктов метаболизма) будет одинаковым или почти одинаковым в аппаратах разного масштаба. Действительность, однако, не оправдывает таких прогнозов. Наоборот, очень часто в аппаратах разного масштаба и конструкции результаты процесса различаются, иногда в несколько раз. В связи с этим в производственной практике возникает проблема масштабирования. 5.1 Постановка задачи масштабирования Масштабирование – это воспроизведение результатов, полученных на оборудовании одного размера (или одной конструкции), при проведении того же процесса в аппаратах другого (обычно большего) размера или другой конструкции. Кинетические модели роста популяции микроорганизмов, состав-ляя основу общей математической модели процесса в биохимическом реакторе, отражают всю сложную совокупность биохимических процессов, происходящих в клетке, и взаимное влияние клеток в микробной популяции. В зависимости от метода построения кинетической модели, «глубины» рассмотрения и «охвата» влияющих факторов математическое описание моделей различно по своей сложности. В то же время, учитывая, что кинетическая модель является в свою очередь составной частью общей модели, целесообразно применение менее сложных, отражающих основные закономерности роста популяции кинетических моделей. Рассмотренные ранее принципы системного подхода, предусматривающие соподчиненность в виде иерархической структуры, требуют учета при переходе на высшую ступень иерархии только наиболее существенных и важных закономерностей, характеризующих нижнюю ступень. Так, далее будет показано, что только переход от рассмотрения процесса роста микроорганизмов в идеализированном аппарате полного смешения к реальной гидродинамической обстановке промышленного биореактора существенно усложняет математическое описание процесса биосинтеза даже при использовании простейшей модели кинетики роста микроорганизмов. В настоящее время известно большое количество математических моделей кинетики роста микробных популяций. В связи с этим при описании конкретного микробиологического процесса важное значение приобретает задача идентификации различных моделей и постановка специальных дискриминирующих экспериментов. Разработка кинетических моделей, инвариантных относительно масштаба реактора, представляет определенную сложность из-за существенного влияния эффектов массопередачи и гидродинамической обстановки на рост популяции микроорганизмов. В этих условиях наиболее важным моментом при построении кинетических моделей является постановка экспериментальных исследований в кинетической области протекания процесса. Это позволит исключить бесконечные корректировки моде- ли кинетики при проведении процесса в различных аппаратурных условиях. Например, нередко отмечаемые исследователями искажения классической S-образной кривой роста микроорганизмов – короткий экспоненциальный участок и быстрый переход к линейной зависимости и замедлению роста может свидетельствовать не о каком-то специфическом эффекте растущей популяции, а о переходе процесса в диффузионную область с ограничением, в частности, по транспорту кислородного субстрата. Кроме того, параметры ферментационного процесса значительно меняются в зависимости от гидродинамической обстановки, что также может исказить получаемые кинетические зависимости. Так, в зависимости от режима макроперемешивания по жидкой фазе концентрации питательных веществ, клеток и продуктов метаболизма либо будут оставаться практически постоянными в различных точках аппарата за период времени ферментации, либо будут меняться по объему реактора или со временем протекания процесса. Неидеальность макроперемешивания ферментационной среды – наличие застойных зон, байпасных потоков не позволит точно оценить кинетику утилизации субстрата в связи с возможным его проскоком с байпасным потоком или уменьшенным потреблением субстрата в застойной зоне. Возможно также образование в застойных зонах инфицирующей микрофлоры, ингибирующей процесс роста. Не меньшее влияние на кинетику процесса микробиологического синтеза оказывают условия микроперемешивания. Отмечаемое целым рядом исследователей образование в ферментационной среде при определенных условиях перемешивания крупномасштабных скоплений – клеточных агломератов, глобул приводит к снижению общей скорости роста микроорганизмов, уменьшает степень использования субстрата. «Кажущиеся» кинетические константы, определенные в таких условиях, значительно отличаются от действительных, что приводит к созданию неадекватных процессу роста микроорганизмов кинетических моделей. 5.2. Подход к масштабированию на основе учета концентрации растворенного кислорода: аэрация при культивировании микроорганизмов Поскольку ход процесса определяется микроорганизмами, различия в ходе ферментации в аппаратах разного масштаба и конструкции следует искать в макро- и микроокружении микробных клеток. Концентрации питательных веществ, продуктов метаболизма, температура и рН вряд ли существенно зависят от масштаба. Более естественным выглядит предположение о различии в концентрациях растворенного кислорода С. Аэробные микроорганизмы не могут развиваться в отсутствие кислорода. Однако растворимость кислорода воздуха в воде очень невелика и составляет всего 7 мг/л при 20 °С. Если жидкость (или среду) полностью насытить кислородом воздуха, а затем прекратить аэрацию, то многие промышленные культуры микроорганизмов «съедают» этот запас за 5 – 10 с. Поэтому требуется непрерывная подача воздуха в аппарат – аэрация. Необходимо отметить, что растворимость кислорода зависит еще и от давления воздуха, а вернее, от парциального давления кислорода в газовой фазе. Если, например, повысить давление воздуха в 2 раза, то и концентрация растворенного кислорода при насыщении жидкости воздухом также повысится в 2 раза. Если вместо воздуха для насыщения среды использовать чистый кислород, то концентрация растворенного кислорода возрастет почти в 5 раз – пропорционально парциальному давлению кислорода в воздухе и газообразном кислороде: (100 %) / (21 %) = 4,8. Этот показатель – концентрацию растворенного кислорода – можно измерять с помощью специального датчика растворенного кислорода. Это очень важный прибор для процессов ферментации, хотя в обычных системах контроля и автоматизации химических производств он используется довольно редко. Как отмечалось выше, растворимость кислорода в культуральной среде незначительна и составляет около 7 г О2 на 1 м3 (7 мг/л) при давлении воздуха, равном 1105 Па при 20 °С. Это концентрация в равновесном состоянии, при насыщении. Многие микроорганизмы, используемые в промышленности, нуждаются для роста в наличии молекулярного кислорода для окисления в процессе аэробного дыхания субстратов до двуокиси углерода и воды. Кроме того, кислород может включаться в процессы конструктивного метаболизма клеток, обеспечивая синтез ими некоторых соединений. В реальном процессе происходит непрерывное потребление растворенного кислорода из жидкости и одновременно его непрерывное растворение – массопередача из пузырей воздуха. Надо иметь в виду важную особенность микробиологических процессов. Микроорганизмы не способны потреблять кислород напрямую из газовых пузырей. Они потребляют лишь растворенный кислород, т. е. кислород переходит в клетку микроорганизма через две ступени: массопередача из газа в жидкость и затем потребление в процессе диффузии в клетки уже растворенного кислорода из жидкости. Поэтому при культивировании таких микроорганизмов необходимо непрерывно растворять в жидкой питательной среде кислород, что достигается еѐ постоянной аэрацией в ферментаторе. Необходимость постоянного поддержания в среде концентрации О 2, при которой аэробный процесс не лимитируется, определяет выбор конструкции и характеристики (главным образом, массообменные) биореактора для каждого конкретного процесса. 5.3. Влияние концентрации растворѐнного в среде кислорода на рост микроорганизмов Между удельной скоростью роста микроорганизмов и концентрацией растворѐнного в культуральной среде кислорода существует зависимость, которую можно выразить уравнением Моно mc C Kc C , (5.1) где – удельная скорость роста микроорганизмов при концентрации растворѐнного в культуральной среде О2 (С), ч-1; mc – предел, к которому стремится при увеличении концентрации растворѐнного в культуральной среде О2 до максимального уровня, ч-1; Кс – константа, численно равная той концентрации растворѐнного в культуральной среде О2, при которой = 0,5mc; С – текущая (рабочая) концентрация О2, растворѐнного в культуральной среде, кг О2/м 3. Значение константы Кс в уравнении (5.1) для подавляющего большинства микроорганизмов очень мало. Например, для дрожжевых культур при выращивании их на средах с углеводами Кс 510-5 кг О2/м3. На рис. 5.1 приведена построенная по уравнению (5.1) кривая, выражающая изменение величины удельной скорости роста культуры дрожжей в зависимости от концентрации растворѐнного в культуральной среде кислорода при значении Кс = 510-5 кг О2/м3. /mc Рис. 5.1. Зависимость удельной скорости роста культуры дрожжей от концентрации растворѐнного в среде кислорода Значение удельной скорости роста выражено в долях mc; отмечено значение равновесной концентрации растворѐнного в культуральной среде кислорода при температуре 30 °С с кислородом воздуха при атмосферном давлении Ср = 6,80∙10-3 кг О2/м3 и значение 0,1СР = 0,68∙10-3 кг О2/м3. В этом случае значения удельной скорости роста незначительно изменяются при концентрациях растворѐнного кислорода, больших 0,1Ср. Изменениям концентраций кислорода от 0,68∙10-3 до 6,80∙10-3 кг О2/м3 соответствуют изменения относительных значений удельных скоростей роста /mc от 0,927 до 0,992, т. е. менее чем на 7 %. Концентрацию растворѐнного в среде кислорода, меньше которой быстро снижается удельная скорость роста микроорганизмов, принято называть критической (Скр). Значение критической концентрации находят опытным путѐм и это значение не является строго определѐнной величиной. Обычно Скр меньше 0,1СР, поэтому заведомо с запасом можно принимать Скр ~ 0,1СР. В то же время известно, что на некоторые микроорганизмы кислород, растворѐнный в среде в концентрациях выше определѐнных, оказывает ингибирующее действие. Поэтому при изучении физиологии каждого микроорганизма необходимо определить значение Синг, выше которого их рост подавляется. Таким образом, можно сделать вывод, что при значениях концентраций растворѐнного в среде кислорода, больших Скр (~ 0,1Ср) и меньших тех, которые оказывают на изучаемый микроорганизм ингибирующее действие, отношение /mc мало отличается от единицы. При организации процесса культивирования микроорганизмов необходимо обеспечить аэрацию среды так, чтобы концентрация растворѐнного в среде кислорода находилась в указанных пределах: Скр< С < Синг. Транспорт кислорода из воздуха в культуральную среду и в клетки микроорганизмов. Для поддержания необходимой концентрации растворѐнного кислорода в культуральной среде с микроорганизмами необходимо обеспечить постоянное растворение строго определѐнного количества кислорода воздуха, подаваемого на аэрацию. Содержащийся в пузырьках воздуха кислород диффундирует к поверхности раздела фаз газжидкость, проходит через эту поверхность, диффундирует от поверхности раздела фаз в жидкость и к клеточной стенке микроорганизма. При этом кислород преодолевает диффузионные сопротивления, значительно отличающиеся по величине. Из теории абсорбции известно, что для трудно растворимых газов, каким является кислород, диффузионным сопротивлением в газовой фазе можно пренебречь по сравнению с диффузионным сопротивлением в жидкой фазе. Пренебречь также можно диффузионным сопротивлением транспорта кислорода в жидкости к клеточной стенке. С учѐтом этого уравнение массопередачи для абсорбции кислорода культуральной средой можно записать в виде dМ = КL(Cp – C)dFdt, (5.2) где М – количество кислорода, переходящего из воздушного потока в культуральную среду, кг; КL – коэффициент массопередачи при абсорбции кислорода, кг О2/м2∙ч; С, Ср – соответственно рабочая концентрация в культуральной среде и равновесная концентрации кислорода, кг О2/м3; F – поверхность контакта фаз, м2; t – время абсорбции, ч. Равновесная концентрация Ср определяется выражением Ср = р, (5.3) где р – парциальное давление кислорода в газовой фазе, Па; – константа фазового равновесия, кг О2/м3Па–1. При барботаже бывает весьма затруднительно определить поверхность фазового контакта, поэтому коэффициент массопередачи относят к 1 м3 культуральной среды. Обозначив поверхность фазового контакта в 1 м3 среды через а (м2/м3), можно рассмотреть произведение КL а, которое представляет собой коэффициент массопередачи, отнесѐнной к 1 м 3 культуральной среды, кг О2/м3∙ч. Уравнение массопередачи с объѐмным коэффициентом массопередачи можно представить в виде dМ/dVpdt = КL а(Cp – C), (5.4) где dVp – элементарный объѐм культуральной среды, м3. Уравнение (5.4) даѐт представление о количестве кислорода, абсорбируемого в единице объѐма за единицу времени. Обозначив Q = dМ/dVpdt, (5.5) Q = K L a(Cp – C). (5.6) получим Величина Q, (кг О2/м3∙ч ) , как следует из уравнения (5.6), может быть увеличена соответствующим увеличением любого из сомножителей KLa или (Cp – C). Увеличения движущей силы абсорбции (Cp – C) можно достигнуть повышением давления воздуха в аппарате (увеличивается значение Ср,) или подачей в аппарат вместо воздуха чистого кислорода или обогащѐнного кислородом воздуха (также увеличивается Ср). Вместе с тем, следует сказать, что повышение скорости абсорбции кислорода любым из двух указанных способов в настоящее время не получило широкого распространения. Движущая сила процесса абсорбции, определяемая разностью равновесной и рабочей концентраций растворѐнного кислорода, возрастает с уменьшением рабочей концентрации. Для того чтобы обеспечить большую движущую силу процесса абсорбции и больший поток растворѐнного кислорода из воздуха в культуральную жидкость, целесообразно вести процесс с наименьшей рабочей концентрацией кислорода при соблюдении условия С >Скр. Для области, ограниченной условием С >Скр, уравнение (5.4) можно преобразовать к виду: Q = K L a(Cp – Cкр). (5.7) При осуществлении транспорта кислорода в соответствии с уравнением (5.7) абсорбция кислорода культуральной средой не будет лимитировать процесс выращивания микроорганизмов. В соответствии с уравнением (5.7) скорость абсорбции кислорода воздуха культуральной средой рационально регулировать в аппарате изменением величины коэффициента массопередачи в зависимости от потребностей микроорганизмов. Значение KLa можно повысить турбулизацией культуральной среды, что достигается введением в неѐ достаточной энергии при перемешивании. Культивирование микроорганизмов может успешно осуществляться только при условии достаточно интенсивного массообмена во всех точках рабочего объѐма аппарата, т.е. в аппарате полного смешения по жидкой фазе, когда во всѐм рабочем объѐме аппарата для каждого произвольно выбранного момента времени любой из параметров процесса, включая коэффициент массопередачи, принимает одно и то же значение. 5.4. Абсорбция кислорода в биореакторах периодического действия при культивировании микроорганизмов Для биореактора полного смешения (т.е. для случая постоянства коэффициента массопередачи по всему рабочему объѐму аппарата) процесс абсорбции кислорода воздуха средой в периодически действующем аппарате при культивировании микроорганизмов можно описать простой математической моделью. Рассмотрим наиболее важный для практики случай, когда абсорбция кислорода культуральной средой не лимитирует процесс роста микроорганизмов (концентрация растворѐнного кислорода составляет величину не ниже Скр). Для этого случая значение удельной скорости роста микроорга- низмов можно принять постоянным. Тогда концентрация биомассы микроорганизмов для любого момента времени за период экспоненциального роста может быть найдена по уравнению Х = Хо е t, (5.8) где Хо – концентрация биомассы микроорганизмов в аппарате в начальный момент времени (t = 0). Предполагается, что потребление микроорганизмами растворѐнного в культуральной среде кислорода постоянно для всего процесса культивирования и принимается равным общему метаболическому коэффициенту по кислороду q. Изменение концентрации растворѐнного в культуральной среде кислорода за интервал времени dt происходит в результате двух процессов: абсорбции кислорода из воздуха и потребления кислорода растущими по экспоненциальной зависимости микроорганизмами. Соответствующее уравнение материального баланса может быть записано в виде dC/dt = K L aCpн – K L aC – q Хо е t, (5.9) где, кроме ранее принятых обозначений, Срн – начальная равновесная концентрация растворѐнного в культуральной среде кислорода, кг О2/м3. Решением уравнения (5.9) является выражение С = (Cpн – qμХо е t/K L a) [1 – е -(KLa t )]. (5.10) При решении уравнения (5.9) принимали: при t = 0 (начало процесса) C = Сн = 0, а также K L a . Уравнение (5.10) позволяет определить концентрацию растворѐнного в культуральной среде кислорода в биореакторе периодического действия при культивировании микроорганизмов для любого момента времени в период экспоненциального роста. Второй сомножитель правой части уравнения (5.10) характеризует изменение концентрации растворѐнного в среде кислорода при его абсорбции, когда в аппарате не происходит культивирования микроорганизмов, т.е. при условии Хo = 0. В этом случае получим С = Cpн [1 – е -(K L a t)]. (5.11) Как следует из данного уравнения, при определѐнных значениях КLa достижение равновесных концентраций теоретически наступит по прошествии достаточно больших промежутков времени, так как при этом еxp(–KLat) 0. Практически примем, что равновесие достигается в том случае, когда рабочая концентрация С отличается от равновесной на 3 %, т.е. когда значение еxp(–KLa∙t)становится менее 0,03. На рис. 5.2 приведены зависимости изменения рабочих концентраций растворѐнного в среде кислорода с течением времени в аппаратах, работающих с различными коэффициентами массопередачи KLa. Рис. 5.2 Рис.5.2. Зависимости рабочих концентраций растворѐнного в среде кислорода от продолжительности аэрации для биореакторов с различными коэффициентами массопередачи КLа (построены по уравнению 5.11): значения КLа для кривых, ч-1: 1 – 50; 2 – 100; 3 – 200; 4 – 1000; 5 – 2000 Рабочая концентрация С выражена в долях равновесной концентрации CpH. Область выше пунктирной линии представляет собой диапазон концентраций, отличающихся от равновесных не более, чем на 3 %, т.е. это область практически равновесных концентраций. Из рисунка 5.2 следует, что аппараты обеспечивают достижение практически равновесных концентраций за период времени от 5 с до 5 мин в зависимости от величины коэффициентов массопередачи. Кривые 1 и 2 соответствуют абсорбции кислорода в барботажных аппаратах с различными расходами воздуха (кривая 1 – для незначительного расхода воздуха). Кривая 3 характеризует изменение концентрации растворѐнного кислорода при его абсорбции в барботажном ферментаторе с дополнительным механическим перемешиванием среды. Кривые 4 и 5 построены для абсорбции кислорода в аппаратах с очень интенсивным перемешиванием среды. Именно по величине коэффициента массопередачи делают вывод об эффективности массообменных процессов в биореакторах различного типа. Основным количественным показателем газовой фазы является еѐ удельная поверхность а (м2/м3). Этот показатель связан с величиной газосодержания культуральной среды формулой а = 6Ф/dг,, (5.12) где Ф – газосодержание культуральной среды, %; dг – средний диаметр пузырьков газа (обычно 3-5 мм). При Ф = 20-50 % диаметр пузырьков газа составляет 3-5 мм; удельная поверхность раздела газовой и жидкой фаз – в пределах 200-1000 м2/м3. При подводе в культуральную среду энергии диспергирования 2-4 кВт/м3 величина а составляет 200-500 м2/м3, а при вводе энергии 10-12 кВт/м3 достигает величины приблизительно 1000 м2/м3. Дальнейший рост удельных затрат энергии практически не увеличивает значений а. В промышленных биореакторах эрлифтного типа осуществляется культивирование дрожжей при коэффициенте заполнения аппарата средой около 30 %. С точки зрения гидродинамики при таком типе аэрации осуществляется пенно-эмульсионный режим при газосодержании около 70 %. Пенная эмульсия обладает динамической устойчивостью (т.е. она устойчива при процессе диспергирования). При отключении перемешивания происходит расслоение среды на жидкость и пенный слой, а затем и пена осаждается. Максимальное, критическое содержание воздуха в пенной эмульсии составляет величину Ф 74 %; при этом в жидкости обеспечивается практически плотная упаковка пузырьков воздуха. При увеличении газосодержания больше критического значения происходит разрушение пенной эмульсии. Таким образом, в промышленных реакторах пена находится в состоянии, близком к критическому. Гидродинамика процесса культивирования при пенно-эмульсионном режиме описывается моделью идеального смешения с байпасом. Это означает, что только около 10 % воздуха циркулирует в системе в виде отдельных мелких пузырьков пенной эмульсии, обеспечивающих насыщение среды кислородом. Основное же количество воздуха (до 90 %) в виде относительно крупных пузырьков однократно проходят через реактор (байпасный поток), обеспечивая перемешивание, но не участвуя в массообмене. Сравнение уравнений (5.10) и (5.11) показывает, что при наличии микроорганизмов в культуральной жидкости не может быть достигнута равновесная концентрация Срн растворѐнного кислорода. Рассмотрим процесс абсорбции кислорода с момента включения аэрации (t = 0, Сн = 0 и Х = Х 0 ) . Время достижения установившегося по абсорбции кислорода режима, при котором кислород расходуется только на потребление микроорганизмами, для рассматриваемого случая соt ставляет от 5 с до 5 мин. В течение этого времени значение е в уравнении (5.10) практически остаѐтся равным единице и для режима, не установившегося по абсорбции кислорода, будет справедливо уравнение С = (Cpн – qμХо /K L a) [1 – е -(KLa t)]. (5.13) По уравнению (5.13) на рисунке 5.3 построены кривые изменения с течением времени концентраций кислорода, растворѐнного в культуральной жидкости без микроорганизмов (для кривой 1 Х0 = 0) и с микроорганизмами (для кривой 2 Х0 = 1 кг сух. биомассы/м3). Расчѐты приведены применительно к выращиванию Candida sp. на гидролизных средах. Интервал времени достижения установившегося по абсорбции режима незначителен по сравнению с продолжительностью всего микробиологического периодического процесса, протекающего сутками или в лучшем случае часами. Поэтому в уравнении (5.10) может быть исключѐн член, учитывающий режим, переходный по абсорбции кислорода. Соответственно уравнение (5.10) для установившегося по абсорбции кислорода режима может быть представлено в виде С = (Cpн – q мХо е t/K L a). (5.14) На рис. 5.4 показаны построенные по уравнению (5.14) кривые зависимости рабочих концентраций растворѐнного в культуральной жидкости кислорода от продолжительности еѐ аэрации. В аппаратах (рис. 5.5) с высокими значениями коэффициентов массопередачи KLa процесс выращивания дрожжей без существенного снижения их физиологической активности протекает в течение значительно большего периода времени, чем в аппаратах с меньшими значениями КLа. Большему периоду времени проведения процесса соответствуют более высокие конечные концентрации биомассы. Рис. 5.4. Зависимости рабочих концентраций растворѐнного в культуральной жидкости кислорода от продолжительности еѐ аэрации: q = 0,228 кг О2/кг∙ ч сух. биомассы; = 0,09 ч-1; Х0 = 1 кг сух. биомассы/м3; Срн = 6,8010-3 кг О2/м3; K L a =100 ч -1 Рис. 5.5. Зависимости рабочих концентраций растворѐнного в культуральной жидкости кислорода от продолжительности культивирования дрожжей Candida sp.: значения K L a для кривых, ч -1 : 1 – 50; 2 – 100; 3 – 200; 4 – 1000; 5 – 2000 ч -1 ; q = 0,228 кг О2/кг∙ч сух. биомассы; = 0,09 ч-1; Х0 = 1 кг сух. биомассы/м3; Срн = 6,8010–3 кг О2/м3 5.5 Абсорбция кислорода в биореакторах непрерывного действия при культивировании микроорганизмов На основании материального баланса процесса культивирования микроорганизмов представляется возможным определить минимальное значение коэффициента массопередачи по кислороду, обеспечивающее достижение конструктивными особенностями и режимом работы вновь создаваемого непрерывно действующего аппарата заданной стационарной концентрации биомассы в условиях абсорбции, не лимитирующей процесс. Изменение концентрации растворѐнного в среде кислорода за интервал времени dt в непрерывно действующем аппарате происходит в результате трѐх процессов: абсорбции кислорода из барботирующего через среду воздуха, потребления кислорода микроорганизмами и вывода из аппарата растворенного кислорода с потоком микробной суспензии. Принимаем содержание растворѐнного кислорода в поступающей в аппарат исходной среде С = 0. Соответственно уравнение материального баланса будет иметь вид: dC/dt = KLaCpн – KLaC – q Х – DC, (5.15) где D – скорость разбавления, ч-1; С – стационарная концентрация растворѐнного в культуральной среде кислорода, кг О2/м3; Х – стационарная концентрация биомассы микроорганизмов в культуральной среде, кг сух. биомассы/м3. При установившемся режиме dC/dt = 0 и уравнение (5.15) для этого случая принимает вид: KLa(Cpн – C) – qХ – DC = 0. (5.16) Для реальных процессов KLa на несколько порядков превышает D, т.е. KLa >D, а (Cpн – C)одного порядка с С. При указанных условиях членом DC в уравнении (5.16) можно пренебречь: KLa(Cpн – C) – qХ = 0. (5.17) Уравнение (5.17) позволяет записать зависимость для определения минимального значения коэффициента массопередачи KLa, обеспечивающего достижение конструкцией и режимом работы вновь создаваемого непрерывно действующего аппарата заданной стационарной концентрации биомассы микроорганизмов в условиях абсорбции кислорода, не лимитирующей процесс: KLa = qμ Х/(Cpн – C). (5.18) При организации непрерывного процесса культивирования в имеющемся аппарате с массообменной характеристикой (KLa)АП максимальное значение стационарной концентрации биомассы, которое можно получить в этом аппарате при условии отсутствия лимитирования по кислороду роста микроорганизмов, составит Х = (KLa)АП(Cpн – C)/q D). (5.19) Сегодня выполнено много работ по масштабированию массообменных процессов, включая процессы абсорбции кислорода в культуральных средах. Удовлетворительные расчѐтные данные дают формулы, полученные на основе экспериментов для аналогичных по конструкции аппаратов. 5.6. Методы определения параметра KLa в аппаратах различного масштаба При масштабировании возникает проблема реализации необходимого значения KLa в аппаратах любого типа и размера. Для этого и нужны формулы, связывающие величину KLa с размерами мешалки, аппарата, числом ярусов, частотой вращения, скоростью подачи воздуха на аэрацию. Подобные формулы для различного вида аппаратов можно найти в специальной литературе. Например, для аппаратов с мешалкой N KLa = ni V 0.95 F b S 0.67 , (5.20) где α и δ – коэффициенты; ni – число ярусов мешалки; N – мощность, расходуемая на перемешивание жидкости; Fb – расход воздуха; S – поперечное сечение аппарата. В курсе «Биореакторы» приводятся такие формулы для аппаратов разной конструкции. Возникает вопрос, как определить влияние величины KLa на результат процесса при проведении лабораторных опытов в ферментаторах малого объема или в колбах? Прежде всего, можно менять частоту встряхиваний качалки (лабораторный микробиологический шейкер). На рисунке 5.6 представлена зависимость величины KLa от частоты качаний для двух типов колб – обычных полых колб и колб с отбойниками. Отбойники различной конструкции вставляются в колбы для создания сопротивления движению потока и улучшения условий перемешивания и массопередачи. Колбы с отбойниками позволяют моделировать аппараты более высокой интенсивности. Рис. 5.6. Влияние частоты качаний (встряхиваний) качалки на величину KLa при экспериментах на колбах Довольно часто устройства для встряхивания колб (качалки) не имеют приспособлений для регулирования скорости. В этом случае можно использовать для создания различных значений KLa прием, заключающийся в проведении экспериментов с различными объемами жидкости в колбе. На рис. 5.7 представлена зависимость коэффициента KLa от объема жидкости в колбе. В микробиологической практике используют колбы разного объема и разной конструкции. Даже при их постоянной степени заполнения величина KLa зависит от объема сосуда. Рис. 5.7. Зависимость коэффициента KLa от объема жидкости в колбе V Рис. 5.8. Влияние объема колбы на величину KLa На рис. 5.8 представлен характер изменения величины KLa в колбах разной вместимости при их заполнении на 1/10 объема. Графики позволяют приблизительно оценить величину KLa для колб разного объема с разной степенью заполнения и с разной частотой качаний. На практике же при решении реальных задач масштабирования с использованием колб целесообразно провести соответствующие эксперименты по сульфитной методике, в которой скорость массопередачи кислорода определяют по скорости реакции окисления сульфита в сульфат. 5.7. Другие критерии масштабного перехода Хотя использование величины KLa в качестве критерия масштабного перехода наиболее обоснованно, в практике часто используют более простые критерии масштабного перехода, связанные с величиной KLa. Такими критериями являются удельная мощность, фиктивная линейная скорость газа, удельный объемный расход воздуха. Удельная мощность Nуд, расходуемая на перемешивание жидкости в аппарате, равна: Nуд = N/V. (5.21) Как отмечалось выше, величина N/V входит в формулу (5.4) для определения KLa, хотя в формуле есть и другие члены. Отсюда вытекает, что масштабирование по удельной мощности перемешивания оказывается удачным для аппаратов, не слишком различающихся своей конструкцией и масштабом. Поскольку измерение или расчет удельной мощности выполнить просто, этот показатель довольно распространен. Однако из формулы (5.3) видно, что он очень уязвим из-за пренебрежения интенсивностью аэрации: получается, что удельная мощность может быть реализована даже без аэрации, только перемешиванием; величина же KLa при этом падает очень сильно. Конечно, это крайний случай, никто не предполагает отключения аэрации. Но пренебрежение ее величиной и различными значениями коэффициентов а и 5 в формуле приводит к изменению связи KLa и Nуд и к неправильному масштабированию. Фиктивная линейная скорость газа, также присутствующая в приведенной выше формуле для расчета KLa, равна: FS=F/S. (5.21) По поводу этого параметра можно высказать те же предостережения, что и по величине Nуд. Здесь получается, что KLa, наоборот, не зависит оттого, производится ли механическое перемешивание. Удельный объемный расход воздуха равен: Fyд = F/V, (5.22) где V– объем жидкости в аппарате. В некоторых формулах для KLa используют Fyд вместо Fs. Но ограничения для использования Fyд вместо KLa те же. Движущая сила массообмена по кислороду. Когда мы рассматривали формулу для определения концентрации растворенного кислорода, то не акцентировали внимание на равновесной концентрации кислорода при насыщении, приняв эту величину одинаковой для любых масштабируемых аппаратов. Реально же в производственных аппаратах величина Срн зависит от давления в аппарате Р и гидростатического давления столба жидкости в нем Hρg. Тогда равновесная концентрация кислорода в производственном аппарате Спр будет отличаться от Срн в лабораторном аппарате, даже если равны давления над зеркалом жидкости. Связь между ними имеет вид Срн= (Рпр – Hρg/2) Срн/Рл (5.23) где Рпр и Рл – давление над зеркалом жидкости в производственном и лабораторном аппаратах соответственно; Н – высота слоя жидкости в производственном аппарате; ρ – плотность жидкости; g – ускорение свободного падения. В этой формуле принято, что среднее давление Рпр в производственном аппарате больше давления в лабораторном аппарате Рл на величину давления половины высоты гидростатического столба жидкости в нижней точке аппарата. Таким образом, для выравнивания условий по массопередаче кислорода в лабораторном аппарате необходимо поддерживать давление в нем Рл в соответствии с зависимостью Pл = Pnp + Hpg/2. (5.24) Концентрация растворенного диоксида углерода. В некоторых процессах ферментации на результат процесса влияет не только кислород, но и растворенный диоксид углерода. Теоретически необходимой скорости массопередачи кислорода Qo2 можно достичь, сильно увеличив перемешивание и подняв давление в аппарате. При этом можно значительно уменьшить расход воздуха. Так иногда поступают, чтобы уменьшить пе- нообразование, которое сильно зависит от расхода подаваемого воздуха. В этом случае, однако, сильно возрастет концентрация СО2 в выходящем газе, а с ней и концентрация растворенного диоксида углерода, который может ингибировать процесс. Для некоторых процессов известны критические значения концентрации СО2 в газе (гСсо2) и в жидкости (жССО2), выше которых наблюдается ингибирование процесса ферментации. Для таких процессов при масштабировании необходимо учитывать ограничение по концентрации СО2. Если известна интенсивность дыхания на единицу объема QСО2 и на весь объем аппарата Gco2 Gco2=VQco2, (5.25) то концентрацию СО2 в выходящем газе гСсо2 можно определить по формуле гСсо2 = Qco2V/FВ, (5.26) где FB – общий объемный расход воздуха через аппарат. Поскольку для таких процессов должно соблюдаться соотношение гСсо2 ≤ гСсо2кр , (5.27) отсюда можно получить ограничение для расхода воздуха: Fв ≥ VQСО2max/гСсо2кр (5.28) где QСО2ma – максимальная интенсивность дыхания в процессе ферментации; CQQкр – критическое значение концентрации СО2 в выходящем из ферментера воздухе. Ограничение (5.28) показывает, что в процессах, где есть ингибирование роста и развития культуры повышенными концентрациями диоксида углерода, нельзя снижать расход воздуха до сколь угодно малого значения. Механическое воздействие мешалки на клетки. Усилия сдвига, действующие у краев мешалки, отбойников, могут механически воздействовать на клетки микроорганизмов, вызывая их разрушение. Различные клетки по-разному реагируют на одно и то же воздействие. Бактерии, имеющие небольшие размеры (0,5 ... 1 мкм), практически нечувствительны к механическим воздействиям. Более чувствительны мицелиальные микроорганизмы и в особенности растительные и животные клетки, для которых перемешивание должно быть особенно мягким. Экспериментально оценить механическое воздействие перемешивающих устройств разного типа на микробные клетки довольно трудно. На практике обычно проводят экспозицию исследуемой культуры клеток в течение определенного времени в изучаемом аппарате, затем отбирают пробу жидкости и осуществляют прямой рассев ее на агаризованные среды, где определяют содержание живых клеток по сравнению с контролем. Более быстрым способом является определение изменения оптической плотности жидкости при длине волны 260 нм за время перемешивания в аппарате (∆Е260). Это изменение показывает степень выхода в раствор содержимого клетки. Такой способ, однако, трудно применить в аппарате большого размера. Практически для оценки механического воздействия на клетки используют показатель, называемый окружной скоростью мешалки vn: vn = πndM, (5.29) где п – частота (угловая скорость) вращения мешалки, об/с; dM – диаметр мешалки, м. Обычно окружная скорость мешалки составляет от 3 до 6 м/с. Превышение величины 8 м/с приводит к явлениям кавитации и воздействию на микробные клетки. Для мицелиальных, растительных и животных клеток ограничения по скорости могут быть еще больше: они индивидуальны для разных клеток и могут достигать 0,5 м/с. В аппаратах, предназначаемых специально для культивирования животных клеток, используют весьма низкие окружные скорости мешалок и, к тому же, стараются создавать рабочие органы мешалок с обтекаемыми поверхностями без острых кромок. Масштабирование «снизу вверх» и «сверху вниз». Обычно осуществляют масштабирование «снизу вверх». Результат, полученный в лабораторных условиях, переносят на аппарат большего размера, стараясь воспроизвести в этом аппарате все те критерии, которые выбраны для масштабирования. В мировой литературе такое масштабирование обозначают термином «Scale-up». Это не всегда приводит к успешным результатам, поскольку обычно в промышленном аппарате невозможно создать условия гидродинамики и массопередачи, идентичные условиям в аппаратах малого масштаба. При этом рекорды производительности, полученные в колбах, оказываются нереалистичными и служат только для победных отчетов научных работников перед производством. Более реально использовать масштабирование «сверху вниз» («Scaledown»). При этом сразу ориентируются на те промышленные аппараты, которые есть в производстве. Эти аппараты изучают с учетом массообменных характеристик и других критериев масштабирования и уже ла- бораторные условия подгоняют под критерии, имеющиеся в производственных аппаратах. Соответственно и в колбах процесс изучают сразу при нужном значении KLa (т. е. при определенном объеме среды). И хотя на такой установке обычно результаты хуже по технико-экономическим показателям, чем можно было бы получить, стремясь выжать максимум из лабораторного оборудования, все же так работать выгоднее, поскольку менее вероятно возникновение трудностей при переходе на промышленное оборудование. Полученные результаты без большого труда переносятся на промышленные аппараты. Конечные показатели технологического процесса в производстве при этом не хуже, а часто и лучше, чем при масштабировании типа «Scale-up». Контрольные вопросы и задания 1. Что такое масштабирование процесса ферментации? 2. Можно ли использовать растворенный кислород как параметр масштабирования для аэробных процессов? Преимущества и недостатки этого способа. 3.Объясните связь концентрации растворенного кислорода с коэффициентом массопередачи по кислороду. 4. Что такое KLa? Расскажите о нем как о параметре масштабирования. 5. Охарактеризуйте уравнение Моно для кислорода как лимитирующего субстрата. 6. Опишите системы диспергирования воздуха для различных объемных коэффициентов массопередачи. 7. Опишите способы определения параметра KLa. 8. Напишите уравнение для расчета концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости при периодическом культивировании. 9. Дайте определение равновесной и рабочей концентраций растворенного кислорода. 6. Стехиометрия в процессах биотехнологии Экономический и метаболический коэффициенты выхода продукта по субстрату и биомассе – это в простейшем виде стехиометрические коэффициенты. Они нужны для того, чтобы по одной из известных величин (например, ∆S), рассчитать и другие характеристики процесса (например, ∆Х, ∆Р). Если в химии в результате взаимодействия реагентов A и В получаются продукты С и D и выделяется тепло ∆Н, то можно записать с помощью стехиометрических коэффициентов vА, vВ, vС, vD и vH следующее стехиометрическое уравнение: vА A + vВB = vС C + vDD + vH∆Н. (6.1) Как известно, стехиометрические коэффициенты подбирают таким образом, чтобы выразить фундаментальный закон природы – закон сохранения материи. Количество атомов любого элемента, входящего в вещества А, В, С и D, не должно изменяться в процессе превращения веществ. В биологии также действует закон сохранения материи. В ходе биологических превращений в клетке перегруппировываются атомы углерода, азота, фосфора, водорода, кислорода и других жизненно важных химических элементов. Но общее количество каждого из этих элементов, включенное в структуры клетки, в точности равно количеству, взятому клеткой из питательной среды. Процесс ферментации можно представить как систему, в которой происходит преобразование исходных реагентов (субстратов) в продукты (клетки и продукты метаболизма). В аэробных процессах в число субстратов входит кислород 02, а в число продуктов – диоксид углерода СО2. Другие субстраты и продукты в разных процессах различные, но стехиометрические соотношения между ними должны соблюдаться. По аналогии со стехиометрией в химии можно записать стехиометрическое уравнение для микробиологического процесса: vc [углеродный субстрат] + vN [азотный субстрат] + + vф [фосфорный субстрат] + vО2 [О2] +.... = vx [биомасса] + + vP [продукт метаболизма] + vСО2 [СО2] +.... + vН2О [Н2О] + vH∆Н. (6.2) Первое замечание по данному уравнению состоит в том, что хотя биомасса микроорганизмов является продуктом «реакции», она же будет и «исходным реагентом» Действительно, как бы мы не смешивали и что бы мы не делали с исходными субстратами, из них никогда не получится биомасса. Правильно было бы записать биомассу в качестве «субстрата», а в числе продуктов биомассу указать с коэффициентом (vx+1) – большим, чем коэффициент при «биомассе-субстрате». Учитывая это, можно все же использовать представленное выше результирующее уравнение, в котором биомасса записана только как продукт. Следует отметить, что такие реакции, в которых образовавшийся продукт является катализатором реакции, в химии называют автокаталитическими. 6.1 Вывод «формулы» биомассы микроорганизмов Разница между «истинной» стехиометрией и микробиологической в том, что наряду с веществами, имеющими определенную химическую формулу, в нее входит биомасса, состоящая из множества индивидуальных веществ – белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и так далее, многие из которых даже не идентифицированы. Все эти вещества записывают целой совокупностью. Отсюда следует, что какой-то существующей в природе истинной «формулы» биомассы нет. Однако, для работы со стехиометрическим уравнением и подбора коэффициентов какой-то, хотя бы фиктивный, эмпирический вид «формулы» биомассы нужен. За основу при этом можно выбрать элементный состав сухой биомассы. Существуют приборы элементного анализа, с помощью которых путем сжигания образца можно определять элементный состав органических субстанций. Такие измерения проводились многими исследователями. Естественно, что есть некоторые различия в содержании тех или иных элементов в зависимости от вида микроорганизма и типа используемых субстратов. Однако эти различия не очень велики. В табл. 6.1. представлен элементный состав для «средних» бактерий, дрожжей и (с определенной погрешностью) вообще для «усредненных микроорганизмов». Таблица 6.1 Элементный состав биомассы микроорганизмов Тип микрооргаЭлементный состав, % низма С Н О N P Дрожжи 47.0 6.5 30.0 7.5 1.5 Бактерии 53.0 7.0 20.0 12.0 3.0 «Усредненный» 50.0 8.0 20.0 14.0 3.0 Зола 6.5 4.0 4.0 S 1.0 4.0 4.0 Пользуясь результатами анализа элементного состава получим «формулу» биомассы. Если взять 100 г сухой биомассы, то состав, выраженный в табл. 6.1 в процентах, будет отражать массу соответствующего элемента в граммах. Разделив эту массу на атомную массу соответствующего элемента, получаем количество грамм-атомов в 100 г сухой биомассы (табл. 6.2). Таблица 6.2 Расчет числа грамм-атомов элементов в 100 г сухой биомассы Тип микрооргаЭлементный состав, % низма С/12 Н/1 О/16 N/14 P/31 Дрожжи 3.92 6.5 1.88 0.54 0.05 S/32 0.03 Бактерии «Усредненный» 4.42 50.0 7.0 8.0 1.25 1.25 0.86 1.0 0.1 0.1 0.03 0.03 Таким образом, в первом приближении «формулу» дрожжей можно записать как С3.92Н6.501.88N0.54Р0.05S0.03; бактерий - С3.92Н7.001.25N0.86Р0.1S0.03, «усредненной» биомассы – С4.17Н8.001.25N1.0Р0.1S0.03 Сравнение этих «формул» показывает, что состав биомассы микроорганизмов различных классов различается незначительно.. Интересно, что «молекулярная масса» для каждой из этих «формул» будет 100 или около того (неучтенной золой можно пренебречь). На первый взгляд следует ожидать, что в гипотетической «молекуле» биомассы не может быть дробных атомов углерода, серы и т.д. Поэтому, чтобы придать видимость правдоподобия «формуле», ее умножают на какоето очень большое число, чтобы все коэффициенты оказались целыми числами. Самое простое в данном случае - умножить на 100. Однако никакой беды в дробных коэффициентах или в молекулярной массе, умноженной или разделенной на то или иное число, нет. Надо учесть, что в конечном счете стехиометрическое уравнение нужно просто для расчета соотношения между массами элементов, и это соотношение вполне можно вычислять и без целочисленных коэффициентов атомных индексов в «формуле» биомассы и стехиометрических коэффициентов в самом уравнении. Кроме того, в стехиометрических расчетах обычно пренебрегают элементами, составляющими малую часть состава биомассы. В «формуле» отбрасывают, таким образом, фосфор и серу, а иногда и азот. Выше отмечалось, что в стехиометрическом уравнении все члены можно умножить или разделить на одно и то же число. Значит, без ущерба для расчетов можно произвольно «принять» «молекулярную массу» для биомассы какой угодно, лишь бы потом мы пересчитали все стехиометрические коэффициенты в уравнении. Удобно принимать такую «молекулярную массу», чтобы в ней оказался только один атом (грамм-атом) углерода. Для этого в ранее вычисленных «формулах» биомассы достаточно все индексы при атомах разделить на индекс при атоме углерода. Такой условный моль, приведенный к одному атому углерода, называют С-молъ. В приведенных выше примерах: дрожжи: СН1.66О0.48N0.14; бактерии: СН1.58О0.30N0.24; «усредненная» биомасса: СН1.92О0.28N0.19. Однако для «усредненной» биомассы более часто используется формула, предложенная Стоутхамером для С-моля: СН1.8О0.5N0.2 Из-за простоты эту формулу часто применяют в расчетах. Рассчитаем «молекулярную массу» С-моля по формуле Стоутхамера: М = 1∙12 + 1∙1,81 + 0,5∙16 + 0,2∙14 = 24,6. Имея теперь брутто-формулу биомассы, можно проводить и стехиометрические расчеты, как в химических уравнениях. 6.2. Расчет выхода биомассы на углеродный субстрат Обычно наибольший интерес с учетом выхода составляет самый дорогостоящий субстрат - углеродный. Выше отмечалось, что в качестве углеродного субстрата могут использоваться разные вещества: глюкоза, крахмал, этанол, метанол, парафины нефти, метан и другие. Эти вещества можно также пересчитать на С-моль (т.е. оставить в молекуле только один атом углерода). Например, для глюкозы с формулой С6Н12Об С-моль будет иметь формулу СН2О, для крахмала с формулой (С6Н12О6)„ вид С-моля не изменится. Вот почему эти вещества определяются словом «углеводы». Рассчитав молекулярную массу С-моля субстрата и сравнив ее с массой С-моля биомассы, можно найти теоретический выход биомассы, если весь углерод субстрата перейдет в углерод биомассы (табл. 6.3). Таблица 6.3 Расчет стехиометрического выхода биомассы для различных субстратов Субстрат Химическая Молекулярная Молекулярная СтехиоФактически формула масса масса метрический измеренный субстрата С-моля выход выход субстрата биомассы, г/г биомассы, г/г Глюкоза С6Н12Об 180 30 0.82 0.5 Крахмал (С6Н12Об)n 180 n 30 0.82 0.5 Целлюлоза (С6Н12Об)n 180 n 30 0.82 0.5 Этанол С2Н5ОН 46 23 1.07 0.75 Метанол СН3ОН 32 32 0.77 0.5 н-алканы (СН2)n Н2 14 n +2 ~14 ~1.76 1.0 (парафины) Метан СН4 16 16 1.54 0.62 Из таблицы следует, что разные субстраты дают различный стехиометрический выход по биомассе. Последний столбец табл. 6.3 включает в себя данные о фактически измеренном выходе биомассы в реальных микробиологических процессах, проведенных на указанных в таблице субстратах. Из сравнения теоретического (стехиометрического) и фактического выходов видно, что прослеживается «тенденция»: максимальный выход – на парафинах, минимальный – на углеводах. Но при этом фактический выход как правило, меньше стехиометрического. Чтобы объяснить эти расхождения, ввели понятие «энергетический выход» биомассы. Это понятие базируется на том, что в каждом субстрате заключена энергия, которая зависит от степени восстановленности субстрата ys, которую легко определить, если известна формула вещества. При этом, как и в биомассе, учитывают основные элементы – углерод, водород, кислород и азот. Обобщенная формула субстрата CmHnOpNq. Степень восстановленности зависит от числа так называемых «доступных электронов», или «редоксонов». Принимают (и это легко объяснить исходя из строения атомов и даже просто из понятия химической валентности), что один атом углерода имеет 4 доступных электрона, один атом водорода – 1 доступный электрон. Кислород доступных электронов не имеет, а наоборот, как бы забирает на себя 2 электрона, т.е. имеет отрицательное число (-2) доступных электронов. То же и с азотом, который забирает 3 доступных электрона. Итак, для обобщенной формулы субстрата CmHnOpNq, степень восстановленности рассчитывают по формуле ys = 4m + n -2p -3q (6.3) Рассмотрим примеры: Метан (СН4) ys = 1 ∙ 4 + 4 = 8 Гексан (С6Н14) ys = 4 ∙ 6 + 14 = 38 Метанол (СН3ОН) ys = 4∙4 + 4 – 2∙1 = 6 Глюкоза (C6H12О6) ys = 4 ∙ 6 + 12 – 2 ∙ 6 = 24 Этанол (С2Н5ОН) ys = 4 ∙ 2 + 6 – 2∙1 = 12 н-Алканы (СН2)Н2 ys = 4 ∙ п + (2 п + 2) = 6 п +2 Щавелевая кислота (H2C2О4) ys = 4 ∙ 2 + 2 – 2∙ 4 = 2 Степень восстановленности различна, прежде всего, из-за разного числа углеродных атомов, а также и их соотношения с другими атомами (кислорода, азота, водорода). Для субстратов, как и для биомассы, можно ввести понятие С-моля и пересчитать для таких С-молей степень восстановленности. Это позволит сравнивать между собой различные субстраты. Биомасса, как и другие вещества, согласно «формуле» может быть оценена по степени восстановленности (обозначение уже не ys, а yх). Биомасса (СН1.8O0.5N0.2): ух= 4 ∙ 1 + 1,8 – 2∙ 0,5 – 3 ∙ 0,2 = 4,2. (6.4) В реальных процессах ферментации нужно учитывать, что в клетках одновременно протекают 2 процесса: катаболизм и анаболизм. В процессах катаболизма энергия выделяется и значительная ее часть запасается в форме молекул АТФ для нужд клетки. В качестве побочных продуктов образуется диоксид углерода, а часть тепла рассеивается. В процессах анаболизма энергия, запасенная в АТФ, преимущественно расходуется на процессы биосинтеза. Затраты энергии, а также молекул и атомов на анаболизм никогда не бывают равны разности энергетических уровней исходных и конечных веществ. Прежде всего, это вытекает из второго закона термодинамики (нужна энергия на осуществление биохимических превращений). С другой стороны, биохимические механизмы не идеальны, часть энергии и вещества расходуется на побочные продукты и тепло. Эти потери вещества учитываются реальными стехиометрическими (экономическими) коэффициентами, которые как раз и определяются из эксперимента – сравнением кривых изменения концентрации биомассы, субстрата и продуктов. При этом общее стехиометрическое соотношение для объединенного процесса, включающего катаболизм и анаболизм, может быть записано в виде: vsS+ v02 [02] + vN [NH3] → Х+ vP[P] + vC02 [C02] + v Н20[H20]. (6.5) Здесь биомасса выражена в С-молях, а субстрат - в обычных молях. С другой стороны, различия между стехиометрическим и фактическим выходом биомассы, заключается в следующем. В ходе процесса культивирования наряду с «конструктивными» биохимическими превращениями (образование биомассы и различных продуктов метаболизма) протекают также биохимические процессы, которые в совокупности можно назвать «поддержанием жизнедеятельности» микроорганизмов. При этом происходит синтез клеточных компонентов, которые естественным образом деградируют, и для сохранения жизнеспособности клеток нужна их «репарация». В принципе мы могли бы так подавать субстрат, чтобы его хватало только на поддержание жизнедеятельности, а новая биомасса микроорганизмов и продукты метаболизма при этом не образовывались. Ясно, что в таких процессах выход биомассы Yxs равен нулю. Этот выход биомассы (то, что в таблице 6.3 определено как «фактический» выход) не является постоянным и зависит от условий и скорости роста биомассы. Представленные цифры характеризуют максимально достигнутый выход, но и он далек от стехиометрического. Затраты субстрата на поддержание жизнедеятельности существуют всегда. Рассмотрим теперь вопрос о нахождении стехиометрических коэффициентов, указанных в объединенном стехиометрическом уравнении (6.5), если известны из эксперимента фактические данные по потреблению субстрата и образованию продуктов биохимического взаимодействия. Необходимо знать, по меньшей мере, количество израсходованного субстрата (в реальных мерах - граммы, килограммы и т. д.) и соответствующие данные по количеству образовавшейся биомассы микроорганизмов или продукта метаболизма - соответственно Gs, Gx и GP (в пересчете на весь аппарат) или для периодического процесса приращения их концентраций - соответственно ∆S, ∆Х и ∆Р. Разделив эти величины на молекулярные массы соответственно субстрата, биомассы или продукта, получаем для этих веществ количества г∙молей (или кг∙молей), которые и являются основой для последующих стехиометрических расчетов. Первый из этих расчетов - приведение всех количеств к одному Смолю биомассы. Мы уже упоминали, что все стехиометрические коэффициенты можно умножать или делить на одно и то же число. Поэтому условимся находить такие стехиометрические коэффициенты, которые дают стехиометрический коэффициент при биомассе (выраженной в С-молях) равным 1, как это и записано в уравнении (6.5). Таким образом, сразу можно найти vs и vP. Для определения коэффициентов по другим веществам (02, С02, NH3 и Н20) необходимо составить и решить систему уравнений элементного баланса, имея в виду, что каждое вещество (субстрат, биомасса, продукт, вода, кислород, диоксид углерода) может быть описано общей элементной формулой CmHnOpNq. При этом индексы в формуле субстрата обозначим как ms, ns, ps, q, а в формуле продукта - соответственно тР, пР, рР, qp Для биомассы соответствующие индексы тх= 1,п х = 1,8, рх = 0,5, qx= 0,2. Тогда уравнение баланса по углероду можно записать следующим образом: vs ms =1+vpmp+vco2 (6.6) То же для водорода: vs ns+ VNH3 ∙3 = 1,8 + vp nP+ vH20 ∙2. (6.7) Уравнение баланса по кислороду: vsPs+v02∙2 = 0,5+ vppp+ vco2∙2+vH2o∙l. (6.8) Уравнение баланса по азоту: vSqS + vNH3 = 0,2 + vPqP (6.9) Решение системы уравнений (6.6) - (6.9) позволит найти все стехиометрические коэффициенты для данного процесса ферментации. 6.3 Расчет тепла, выделяемого в биохимическом процессе В стехиометрическом соотношении (6.5), если произвести расчеты степени восстановленности веществ, указанных слева (субстратов) и справа (продуктов), часто получается все же определенная разница в пользу левой части равенства. Это говорит о том, что энергия в субстрате больше энергии, заключенной в биомассе и продуктах метаболизма. Именно эта разность энергий и преобразуется в тепловыделения, имеющие место в ходе микробиологического процесса. Определение величины тепловыделений в биотехнологии является важной задачей, которая нужна для расчета биореакторов. Это определение легко выполнить с помощью сравнения суммарной степени восстановленности субстратов, продуктов и образовавшейся биомассы с учетом соответствующих стехиометрических коэффициентов. Формула для расчета следующая: n m êÄæ ∆Н = vi S i X v j Pj 115 i 1 j 1 Ñ ìîëü , (6.10) где ∆Н - тепловыделение; vi - стехиометрический коэффициент для iго субстрата; vj - стехиометрический коэффициент для j-го продукта; т общее количество субстратов; п - общее количество продуктов; γSi — степень восстановленности j-го субстрата; γPj - степень восстановленности j го продукта; γX - степень восстановленности биомассы. Обычная же схема расчета тепловыделения, принятая в химии, включает определение теплот сгорания всех входящих в реакцию веществ: ∆Н = m v H i 1 i Si H X - v H j Pj , (6.11) где ∆HS, ∆HX, ∆HP - теплоты сгорания субстратов, биомассы, продуктов, т - общее число субстратов, п - общее число продуктов метаболизма. Для химических соединений (субстрата, продукта) есть данные по ∆H в справочниках или же можно их определить в «калориметрической бомбе». Для биомассы тоже сделаны такие измерения: для дрожжей ∆H = 20.4 кДж/г биомассы; для бактерий - ∆H = 21.0 кДж/г биомассы. Определены также теплоты сгорания для протеина (13,5 кДж/г), моносахаридов (15,7 кДж/г), дисахаридов (16,5 кДж/г), глицерина (18,1 кДж/г). В среднем для биомассы обычно принимают теплоту сгорания 22,0 кДж/г. Контрольные вопросы и задания: 1.Объясните обобщенное стехиометрическое уравнение микробиологического процесса по аналогии с химической реакцией. 2.Как определить условную «формулу» биомассы из ее элементного состава? 3.Поясните понятие С-моля биомассы. 4.Приведите формулу Стоутхамера для биомассы. Какова молекулярная масса С-моля? 5.Как рассчитать стехиометрический выход биомассы от используе- мого углеродного субстрата? 6.Что такое «доступные электроны» в субстратах и в биомассе? 7.Как рассчитать степень восстановленности субстратов, биомассы и продуктов метаболизма? 8.Как рассчитать стехиометрические коэффициенты процесса ферментации, зная количество израсходованного субстрата и образовавшихся продуктов и биомассы? 9.Какова степень восстановленности воды, диоксида углерода, аммиака, метана? 10.Как определить количество тепла, выделившегося в процессе ферментации, зная скорости потребления субстрата и образования продуктов метаболизма и самой биомассы? 11.Как определить интенсивность тепловыделения в процессе ферментации? Послесловие Основной и специфической стадией производства продуктов микробиологического синтеза является культивирование соответствующего штамма микроорганизма, ориентированное либо на накопление биомассы, либо продукта ее метаболизма. При технологическом исследовании стадии культивирования предполагается изучение совокупности механических, гидродинамических, диффузионных (массообменных), тепловых, химических, биохимических и биологических (микробиологических) процессов с целью определения наиболее эффективных режимов их осуществления в промышленном производстве при конкретных технико-экономических условиях. При культивировании микроорганизмов основным, определяющим процессом является процесс роста биомассы популяции. В связи с этим важнейшим этапом является исследование кинетики роста и биосинтеза, осложненных процессами переноса вещества и энергии, что, в свою очередь, лежит в основе макрокинетики микробиологического синтеза. Окончательным результатом такого исследования должно явиться создание математической модели, в которой отражены взаимосвязи всех указанных выше процессов. В данном пособии отражены основные приемы моделирования и масштабирования биотехнологических процессов, что необходимо для технологических расчетов и проектирования соответствующих производств. Библиографический список 1. Уилсон, К. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии / К. Уилсон, Д. Уолкер; пер. с англ. – М. : Бином, 2013 г. – 848 с. 2. Шмид, Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия / Р. Шмид; пер. с англ. – М. : Бином, 2014 г. – 580 с. 3. Миронов, П. В. Основы кинетики ферментативных и микробиологических процессов / П. В. Миронов, Е. В. Алаудинова. – Красноярск : СибГТУ, 2013 г. – 130 с. 4. Технология биоконверсии растительного сырья. Ч.2. Перспективные технологии микробиологической конверсии растительной биомассы: учеб. пособие для студентов / П. В. Миронов [и др.]. – Красноярск : СибГТУ, 2016. – 150 с. 5. Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза / А. Ю. Винаров [и др.]. – М. : ДеЛи принт, 2005. – 278 с. 6. Биореакторы: учеб. пособие / С. М. Воронин [и др.]. Красноярск : СибГТУ, 2000. – 76 с. 7. Бирюков, В. В. Основы промышленной биотехнологии: учеб. пособие / В. В. Бирюков. – М. : Колос, 2004. – 295 с. 8. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Издательство Сибирского отделения российской академии наук, 1999. – 252 с. 9. Пленочные биореакторы / Н. А. Войнов [и др.]. – Красноярск : Издательство «БОРГЕС», 2001. – 252 с. 10. Варфоломеев, С. Д. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов: учеб. пособие для биол. и хим. спец. вузов / С. Д. Варфоломеев, С. В. Калюжный. – М. : Высш. шк, 1990. – 296 с. 11. Кафаров, В. В. Моделирование и системный анализ биохимических производств / В. В. Кафаров, А. Ю. Винаров, Л. С. Гордеев. – М. : Лесн. пром-ть, 1985. – 280 с. 12. Перт, С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт. – М. : Мир, 1978. – 332с. 13. Гапонов, К. П. Процессы и аппараты микробиологических производств/ К. П. Гапонов. – М. : Легкая и пищ. пром-сть, 1981. – 240 с. 14. Кафаров, В. В. Моделирование биохимических реакторов / В. В. Кафаров, А. Ю. Винаров, Л. С. Гордеев. – М. : Лесн, пром-сть, 1979. – 344 с. Приложение 1 Перечень ключевых слов аэрация абсорбция кислорода биореактор биотехнологическая система гидродинамика движущая сила массообмена ингибирование - конкурентное -неконкурентное кинетическая модель роста кривая роста культивирование лимитирующий субстрат массообмен масштабирование масштабный переход математическое моделирование метаболический коэффициент метод Лайнуивера и Бэрка микробная популяция «многосубстратные» уравнения многофакторные модели модель Андрюса модель Бергтера модель Иерусалимского модель Кобозева модель Мозера модель Моно модель Перта модель Хиншельвуда модель Ферхюльста непрерывное культивирование оптимизация периодическое культивирование производительность по биомассе расходный коэффициент рециркуляция биомассы системный анализ скорость разбавления С-моль биомассы субстрат субстратная константа теплообмен удельная скорость роста уравнение Контуа ферментатор ферментационная среда хемостат хемостатные кривые экономический коэффициент Учебно-теоретическое издание Миронов Петр Викторович Алаудинова Елена Владимировна Тарнопольская Вероника Валентиновна МОДЕЛИРОВАНИЕ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Учебное пособие Редактор Т. Л. Полуэктова Оригинал-макет и верстка О. В. Булатниковой Подписано в печать 25.06.2017. Формат 60Ч84/16. Бумага офисная. Печать плоская. Усл. печ. л. 5,0. Уч.-изд. л. 5,1. Тираж 50 экз. Заказ С 71/15. Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П.000032.01.03 от 29.01.2003 г. Редакционно-издательский отдел Сиб. гос. аэрокосмич. ун-та. Отпечатано в отделе копировально-множительной техники Сиб. гос. аэрокосмич. ун-та. 660037, г. Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский рабочий», 31.