презОПТИМИЗАЦИЯ ПРОТОКОЛА ЭКСТРАКЦИИ ДНК ИЗ ЛИСТЬЕВ ГЛЕДИЧИИ ТРЕХКОЛЮЧКОВОЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗАентация к докладу (2)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АГРОЭКОЛОГИИ, КОМПЛЕКСНЫХ
МЕЛИОРАЦИЙ И ЗАЩИТНОГО ЛЕСОРАЗВЕДЕНИЯ
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК» (ФГБНУ ФНЦ АГРОЭКОЛОГИИ РАН)
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОТОКОЛА ЭКСТРАКЦИИ ДНК ИЗ
ЛИСТЬЕВ ГЛЕДИЧИИ ТРЕХКОЛЮЧКОВОЙ ДЛЯ
ПРОВЕДЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА
Докладчик: ведущий научный сотрудник –
лабораторией молекулярной селекции,
к. ф.н.
Содокладчик
А.Ф.Рябуха
Иванова Е.Д.
2
ЦЕЛЬ:
сравнение четырех протоколов выделения и очистки ДНК из листьев гледичии трехколючковой и выбор
оптимального протокола для дальнейших исследований с применением ДНК-маркирования
ЗАДАЧИ:
1.Провести выделение ДНК из шледичии трехколючковой с использованием четырех различных протоколов
2. Оценить качество выделенной ДНК методами спектрофотометрии, горизонтального электрофореза и ПЦР в реальном времени
3. Провести электрофорез полученных продуктов ПЦР с ISSR праймерами
3
Материалы и методы
ДНК выделяли из листьев гледичии трехколючковой, полученных от сеянцев, выращенных в лабораторных условиях.
Измельчение материала и экстракцию ДНК проводили на гомогенизаторе Precellys 24(Франция).
Электрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза Bio-Rad (Америка).
Амплификацию проводили на термоциклере Applied Biosystems QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США). Для
проведения полимеразной цепной реакции использовали готовую смесь 5x qPCRmix-HS SYBR+LowROX буфер,
праймеры ITS1 и ITS2, psbK и psbI (Евроген, Россия).
Проверка качества выделенной ДНК проводилась методами спектрофотометрии и горизонтального электрофореза.
Концентрацию (нг/мкл) полученной ДНК определяли на спектрофотометре Spectrostar (Labtec) в кювете с объемом
ячейки 50 мкл и толщиной поглощающего слоя 10 мм. Оценку качества выделенной ДНК проводили методом
горизонтального электрофореза, используя 2,5% агарозный гель, буферный раствор на основе трис-ацетата при
напряжении в 50В, время проведения анализа 90 мин. Амплификацию проводили в присутствии красителя ROX.
Использовали два типа праймеров:
1. Ядерные последовательности ITS, применяемые для определения межгенных спейсеров ITS1 и ITS2
(некодирующие последовательности ДНК, расположенные как внутри, так и между кластерами генов.
Прямой праймер-ITS1- TCCGTAGGTGAACCTGCGG;
Обратный праймер-ITS 4- TCCTCCGCTTATTGATATGC.
2. Хлоропластные маркеры psbK и psbI, являющиеся продуктом секвенирования межгенного спейсера.
Данный фрагмент амплифицируется с помощью праймеров:
psbK- TTAGCCTTTGTTTGGCAAG
psbI-AGAGTTTGAGAGTAAGCAT.
5
Гледичия трехколючковая (Gleditsia tricanthos L.)
как компонент защитных лесополос, ценный источник БАВ
Гледичия трехколючковая признана
перспективным видом для
внедрения во вновь создаваемые
барьерные зоны защитных лесных
насаждений в степных и
предгорных районах в связи с
высокой засухоустойчивостью
древесина гледичии декоративна и
обладает высокой способностью
поддаваться полировке и
вощению, используется для
изготовления шпал, столбов, так
как долго не поддается гниению в
почве
Большая часть разновидностей гледичии
относится к медоносам, при этом они
привлекают пчел. Такой мед имеет нежную
консистенцию, обладает приятным запахом
и вкусом, а еще он длительное время не
загустевает. С 1 га гледичии пчелы
способны собрать около 250 килограмм
меда.
В сырье G. triacanthos обнаружены 8 флавоноидов,
включая 6 флавоноидных гликозидов: виценин-II,
люценин, изоориентин, ориентин, витексин,
изовитексин вместе с двумя агликонами, а именно
лютеолином и апигенином. Широкий спектр
фармакологического действия растений рода
Gleditsia L. подтвержден многолетним опытом
китайской и корейской народной медицины,
коренными жителями Северной Америки и
современными научными данными.
Разными авторами в
условиях in vitro для
сырья Gleditsia L.
подтверждены
спазмолитическая и
цитотоксическая
активность,
противовоспалительное,
антимутагенное и
антимикробное действие.
6
Основные этапы протоколов экстракции ДНК
Этап
получения
ДНК
Гомогенизац
ия
.
Экстракция
и
лизис
клеток
Протокол 1
Протокол 2
Протокол 3
Измельчение
Измельчение
100
мг Измельчение
100
мг листовой
пластинки
в 100
мг
листовой
буфере состава:
листовой
пластинки в в
100 mM трис-HCl, 50 пластинки
в
0,8 мл буфера mM ЭДТА, и 500mM 0,8 мл буфера
состава:
NaCl (pH 8,0). 1% (об/об) состава:100
100 mM трис- 2mM трис-HCl,
HCl, 50 mM меркаптоэтанола(добавл
50 mM ЭДТА,
ЭДТА,
и яется
непосредственно и 1,4М NaCl
500mM
NaCl перед экстракцией).
(pH
8,0),2%
(pH
8,0),2%
ПВП
10000,
ПВП
10000,
0,0028
М
0,2 % (об/об)
раствор
2дитиотреитол
меркаптоэтан
а (добавляется
ола
непосредствен
(добавляется
но
перед
непосредствен
экстракцией).
но
перед
экстракцией).
Добавление к гомогенату 100 мкл 20% додецилсульфата
натрия, инкубирование в твердотельном термостате при
65°С 15 минут. Пробу осторожно перемешивают, избегая
встряхивания, т.к. буфер пенится и ДНК фрагментируется.
Протокол 4
Измельчение
100 мг листовой
пластинки в 0,8
мл
подогретого
до 65 °С буфера
состава:
2%
ЦТАБ,
1,4М
NaCl,
0,1M
Трис-HCl,
pH
8,0,
20
mM
ЭДТА,2%
ПВП
10000,
2%
2меркаптоэтанол
(добавляется
непосредственно
перед
экстракцией).
Выдерживание
гомогената
в
твердотельном
термостате
при
65 °С 30 минут,
периодически
перемешивая, не
встряхивая.
Очистка
от Добавление 225 мкл 2М ацетата калия, осторожное Добавление
метаболитов перемешивание,
выдерживание
при
4°С
15
мин., смеси
(белков,
центрифугирование при 12000 g в течение 10 минут при хлороформполисахарид комнатной
температуре.
Отбирают
600-700
мкл изоамиловый
ов,
надосадочной жидкости.
спирт
(24:1),
полифенолов
перемешивание
)
20
минут,
центрифугирова
ние при 12000 g,
15 мин.
Получение
Добавление к надосадочной жидкости равного объема холодного 99%
ДНК
изопропанола, выдерживание в холодильнике 1 час, отделение ДНК
центрифугированием, дважды промыв осадка 70% спиртом, удаление спирта
при нагревании 10 минут до 45°С, растворение ДНК в 100 мкл ТЕ-буфера.
Полученную ДНК хранить при -20°С для последующего анализа.
7
Анализ генетического разнообразия некоторых пород
деревьев, используемых в агромелиорации, из популяций,
произрастающих в различных условиях окружающей среды
• Выделение ДНК из образцов гледичии трехколючковой
• Количественный анализ ДНК.
Пример – качественный анализ образцов ДНК
методом электрофореза в агарозном геле
• Качественный анализ ДНК.
Пример – количественный анализ образцов ДНК
№
протокол
а
Концентрация
ДНК, нг/мкл
Отношение
А260/А280
Отношение
А260/А230
Порог
амплифицируемости
(Ст)
1
76,14±20,38
1,42±0,07
0,97±0,06
18,58
2
289,17±37,68
1,53±0,03
1,56±0,14
20,35
3
86,62±29,4
1,75±0,03
1,7±0,21
21,66
4
108,3±37,46
1,70±0,05
1,70±0,21
21,68
Лунки 1-7- ДНК, полученная по протоколу 3, 814-ДНК, полученная по протоколу 2.
8
Анализ генетического разнообразия некоторых пород
деревьев, используемых в агромелиорации, из популяций,
произрастающих в различных условиях окружающей среды
Оценка генетического разнообразия
видов деревьев по ISSR-маркерам
Электрофореграмма ампликонов,
результате ПЦР с ISSR-маркерами
Malus domestica
некоторых
полученных в
для 10 образцов
Электрофореграмма ампликонов, полученных в результате
ПЦР с 6 ISSR-маркерами для Robinia pseudoacacia L.
9
Поиск селекционно-ценных форм и гибридов древесных пород,
применяемых в агролесомелиорации, с использованием молекулярных
маркеров
Селекционно-ценные формы и гибриды
древесных пород
Название растения с предположительно Количес
тво
ценным набором селекционных качеств
образц
ов
Предположительно гибрид между робинией 20
псевдоакацией
и
робинией
новомексиканской
Робиния псевдоакация с пирамидальной 2
формой кроны
Дуба черешчатый с пирамидальной формой 3
кроны
Дуба черешчатый с пирамидальной формой 6
кроны и неопадающими в зимний период
листьями
Электрофореграмма ампликонов, полученных в результате ПЦР с ISSRмаркерами для образцов Quercus robur L. и Robinia neomexicana L.
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ