Из Института вирусологии
Центр
инфекционной медицины Университет ветеринарной медицины
Ганновера
О патогенезе классической чумы свиней:
Анализы нарушений свертываемости крови
ИНАУГУРАЦИОННАЯ ДИССЕРТАЦИЯ
Для получения степени
Доктор ветеринарной
медицины (Dr. med. vet.)
через Ветеринарный колледж Ганновера
, представленный
Сандрой Блом
из Херне
Ганновер, 2006 г.
Научное сопровождение:
Профессор, доктор Фолькер Менниг
1. Рецензент:
Профессор, доктор Фолькер Менниг
2. Рецензенты:
Профессор, доктор Инго Нольте
День устного экзамена: 31.05 2006 г.
Докторская диссертация была профинансирована за счет гранта
Фонда евангелических исследований Э. В. Виллигста
В благодарность моей семье
1
ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................... 1
2
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 2
2.1
Вирус классической чумы свиней .............................................................................................. 2
2.1.1 Таксономия ........................................................................................................................................... 2
2.1.2 Морфология и организация генома ................................................................................................. 2
2.1.3 Вирусные белки ..................................................................................................................................... 3
2.2
Классическая чума свиней ..................................................................................................................
2.2.1 3 Пути передачи и эпидемиология ................................................................................................ 4
2.2.2 Основные формы классической чумы свиней ................................................................................... 5
2.2.3 Патология ............................................................................................................................................ 8
2.2.3.1
Макроскопические изменения ................................................................................................ 8
2.2.3.2
Микроскопические и ультраструктурные изменения................................................................ 9
2.2.4 Патогенез........................................................................................................................................ 10
2.3
Вирусная геморрагическая лихорадка
2.3.1 .............................................................................................................
Классические представители
18
2.3.2 Патогенез
...........................................................................................................................
вирусной геморрагической лихорадки ..............................................................................
19
20
2.4
Гемостаз и компоненты гемостаза ........................................................................................... 23
2.4.1 Клеточные компоненты ........................................................................................................................ 24
2.4.2 Эндотелий ............................................................................................................................................. 25
2.4.3 Плазменная система свертывания крови ................................................................................................. 26
2.4.3.1
Внешний путь активации............................................................................................ 27
2.4.3.2
Внутренний путь активации ............................................................................................ 27
2.4.3.3
Общий конечный маршрут и регулирование ................................................................................. 28
2.4.4 Фибринолиз ......................................................................................................................................... 30
2.4.5 Диагностика плазматической системы свертывания крови - глобальный тест
.......................................................
2.4.6
Концентрация фибриногена31
....................................................................................................................
2.4.7 Диссеминированное
внутрисосудистое свертывание крови
32
................................................................................................. 33
2.5
Фармакологическое влияние на систему свертывания
2.5.1 крови................................................................
Антикоагулянты прямого действия .....................................................................................................
36
36
2.5.1.1
Гирудин...................................................................................................................................... 36
2.5.2 Ингибиторы агрегации тромбоцитов и антиагрегантов, соответственно. –функция
.............................................................
2.5.2.1 Ацетилсалициловая
37
2.5.2.2
Абциксимаб
................................................................................................................................
37
кислота.....................................................................................................................
37
2.5.2.3
Тирофибан ................................................................................................................................... 38
2.5.2.4
Клопидогрель ............................................................................................................................... 38
3
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.......................................................................... 39
3.1
Животные и
3.1.1 материалы................................................................................................................................
Животные и экспериментальная
39
3.1.2 Фармакологически
эффективные вещества ............................................................................................
44
установка..................................................................................................................
39
3.1.3 Сбор и подготовка образцов крови................................................................................... 45
3.1.4 Вирусы .................................................................................................................................................. 45
3.1.5 Диагностические антитела .................................................................................................................. 46
3.1.6 Клеточные линии ............................................................................................................................................
3.1.7 Другие
46
материалы .......................................................................................................................... 47
3.2
Методы ...............................................................................................................................................
3.2.1 48Лечение подопытных животных и клинические параметры .................................................................... 48
3.2.1.1
Применение и дозировка используемых фармацевтических препаратов
3.2.1.2
Определение
клинической оценки по
...........................................................
48данным MITTELHOLZER et al. (2000)....................................
3.2.1.3
48
Определение
температуры тела............................................................................................... 49
3.2.1.4
Выявление патологоанатомических изменений............................................................. 49
3.2.2 Вирусологические методы....................................................................................................................., 49
3.2.2.1
Метод культивирования клеток
3.2.2.2
......................................................................................................................
Размножение
и сбор вирусов .............................................................................................
49
50
3.2.2.3
Выделение вируса ......................................................................................................................... 51
3.2.2.4
Титрование вирусов ............................................................................................................................ 52
3.2.2.5
Тест на нейтрализацию вируса ............................................................................................................
3.2.2.6
53
Прямое
иммуноокрашивание (анализ, связанный с пероксидазой,
3.2.2.7
ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay).........................................................................
55
PLA)..........................................................
54
3.2.2.8
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).............................................................................................. 56
3.2.3 Гематологические методы................................................................................................................. 58
3.2.3.1
Параметры анализа белой крови.............................................................................................. 58
3.2.3.2
Параметры тромбоцитов........................................................................................................... 58
3.2.4 Гемостазиологические методы.......................................................................................................... 59
3.2.4.1
Протромбиновое время (быстрый тест)...................................................................................................
3.2.4.2
Активированное
частичное тромбопластиновое время (aPTT)
59
3.2.4.3
.......................................................................
Тромбиновое
время ............................................................................................................................
60
61
3.2.4.4
Определение фибриногена............................................................................................................. 62
3.2.4.5
Тест на гелеобразование этанола (EGT)
3.2.4.6
Тест
на агрегацию тромбоцитов.................................................................................................
65
...................................................................................................
64
3.2.5 Фармакокинетика ................................................................................................................................ 67
3.2.6 Статистика .............................................................................................................................................. 69
3.2.7 Другие методы............................................................................................................................. 69
3.2.7.1
Ecarin Clotting Time ................................................................................................................ 69
3.2.7.2
Определение отдельных факторов .......................................................................................................
3.2.7.3
Гистопатологические
исследования ........................................................................................ 71
70
4
РЕЗУЛЬТАТЫ................................................................................................... 73
4.1
Предварительное обследование на предмет течения инфекции штаммом KSPV CSF0634
4.1.1 ...............................
Клиническая оценка
73 и температура тела ................................................................................................ 73
4.1.2 Патологоанатомические данные ................................................................................................... 76
4.1.3 Гистопатология .................................................................................................................................. 76
4.1.4 Обнаружение вирусов, антигенов и антител ......................................................................................... 78
4.1.5 Гематологические параметры................................................................................................................. 79
4.1.6
Гемостазиологические параметры.......................................................................................................... 84
4.2
Исследования роли плазменной системы свертывания крови с помощью ПЭГ-Гирудин
4.2.1 .............
Определение
93
терапевтического уровня ПЭГ-гирудина......................................................................... 93
4.2.2 Обнаружение инфекции ...................................................................................................................... 93
4.2.3 Изменение температуры тела.................................................................................................... 93
4.2.4 Документирование клинических симптомов ......................................................................................... 94
4.2.5 Сбор патологоанатомических данных........................................................................... 96
4.2.6 Результаты гематологических исследований ............................................................................. 98
4.2.6.1
Общее количество лейкоцитов..............................................................................................................
4.2.6.2
Количество
тромбоцитов и параметры тромбоцитов..................................................................... 99
98
4.2.6.3
Гемостазиологические параметры .............................................................................................. 101
4.3
Предварительные фармакокинетические испытания в пробирке и в естественных условиях
.................................................................... 105
4.4
Исследования роли Взаимодействие тромбоцитов с помощью клопидогрела и АСК .................
4.4.1 107
Доказательство эффекта..................................................................................................................... 107
4.4.2 Обнаружение инфекции .................................................................................................................... 107
4.4.3 Эволюция температуры тела.................................................................................................. 108
4.4.4 Документирование клинических симптомов ....................................................................................... 108
4.4.5 Сбор патологоанатомических данных......................................................................... 110
4.4.6 Результаты гематологических исследований ........................................................................... 110
4.4.6.1
Общее количество лейкоцитов............................................................................................................
4.4.6.2
110
Количество
тромбоцитов .................................................................................................................. 112
4.4.6.3
Гемостазиологические параметры .............................................................................................. 113
5
ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................................. 116
5.1
Отбор и вирулентность изолята KSPV........................................................................................ 117
5.2
Характеристики инфекции KSPV изолятом CSF0634 .............................................................. 117
5.3
Эффекты ингибирования системы свертывания плазмы .......................................... 123
5.4
Эффекты антиагрегантной терапии .............................................................. 124
5.5
Выводы ............................................................................................................................. 128
5.5.1 Роль плазматической системы свертывания крови и диссеминированного внутрисосудистого
5.5.2 Роль
тромбоцитов
и взаимодействия
тромбоцитов .............................................................. 131
свертывания
крови....
128
5.6
Перспективы
............................................................................................................................................... 134
6
РЕЗЮМЕ .................................................................................. 135
7.
СПРАВОЧНИК ПО ЛИТЕРАТУРЕ ............................................................................
139
8
ВЛОЖЕНИЯ ...................................................................................................... 167
8.1
Таблицы и рисунки................................................................................................................. 167
8.2
Состав используемых сред и реагентов ....................................................... 173
8.2.1 Среда для культивирования
8.2.2 Растворы
клеток..............................................................................................................................
и реагенты ...............................................................................................................
173 174
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
Другие химические вещества
......................................................................................................................... 177
Фармакологически эффективные
вещества........................................................................................... 178
Коммерческие реагенты и наборы ..................................................................................................
179
Бытовая техника и предметы
обихода................................................................................................... 180
Расходные материалы
................................................................................................................................ 183
Каталог иллюстраций........................................................................................................................
185
Табличный каталог ............................................................................................................................
187
ДЕНЬ БЛАГОДАРЕНИЯ
..................................................................................................... 189
Сокращенный
каталог A. bidest.
Aqua bidestillata, двойная дистиллированная вода
ADP
Аденозиндифосфат
AEC
3-Amino-9-Ethylcarbazol
α
alpha
α1-PI
α1-Ингибитор протеазы
α2-AP
α2-Antiplasmin
α2-MG
α2-Makroglobulin
APACT
automated platelet and coagulation tracer
aPTT
aktivierte partielle Thromboplastinzeit
ASP
Африканская чума свиней
ASPV
Вирус африканской чумы свиней
Ацетилсалициловая кислота
ATV
adjusted trypsin-versen
BD
Border Disease
BDV
Border Disease Virus
BMHC-Zellen
bone marrow hematopoietic cells
bp
Basenpaare
Бычий сывороточный альбумин BSA
Вирусная диарея крупного рогатого скота BVD
BVDV
Вирус диареи крупного рогатого скота, вирус
кДНК
, комплементарная ДНК
, CO
2
, диоксид
углерода, циклооксигеназа ЦОГ
CS
Clinical Score
CSFV
Классический вирус свиной лихорадки, вирус классической
чумы свиней
Да
Далтон
DIC
disseminated intravascular coagulation, disseminierte
intravasale Gerinnung
DIF
прямое иммуноокрашивание
DIN
Немецкий институт стандартизации
Краткий справочник
DNA
Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTPs
Didesoxynukleotidtriphosphate
ЭСТ
Ecarin Clotting Time
ЭДТА
Этилендиаминтетрауксусная кислота
Эдульб
EGT
EMEM модифицирован в соответствии с DULBECCO и
FREEMAN
Тест на гелеобразование этанола
ЭЛИЗА
Enzyme linked immunosorbent assay
ЭМЕМ
Eagle´s Minimum Essential Medium
et al.
et alii, и другие
eu
Европейский Союз
EURL
Европейская справочная лаборатория по классическим
клеткам почек плода теленка от чумы свиней FKN
FKS
сыворотка плода
теленка fl
фемтолитр
г
Постоянная притяжения Земли
G
Гига
GPIIb / IIIa
Гликопротеин IIb / IIIa, интегрин
мембраны
тромбоцитов
H
2O
вода
H2O2
перекись водорода
HE
Hämatoxylin/Eosin
HE-окраска
Окрашивание гематоксилин-эозином
HMWK
High Molecular Weight Kininogen
i.v.
intravenös
IL
интерлейкин
κ
каппа
κb
килобазы
ДЕТСКАЯ
50
культурная инфекционная
доза
50
КСП
Классическая чума
свиней KSPV
Вирус классической чумы
свиней Lnn.
Лимфоузлы,
журнал
лимфатических узлов 10
логарифм до основания 10
ЛПС
Липополисахарид
Краткий справочник
М
Молярность
мАк
моноклональное антитело
мкл
микролитр
мкм
микрометр
мин
минута
Среднее значение МВт
N
Нормальность
NaCl
Хлорид
натрия nAk
нейтрализующее антитело
Нао
Каустическая сода
Доза нейтрализации ND
50
50
NFkB
Ядерный фактор
κB (фактор транскрипции)
нм
нанометр
nt
нуклеотиды
Нетранслируемый регион NTR
Международное бюро эпидемиологии
, международное
МЭБ ветеринарное бюро
ОРФ
Открытая рамка считывания, открытая
рамка считывания p.i
. после заражения, после заражения
p.o
. через ОС
Pa
Pascal
Фактор, активирующий тромбоциты PAF,
PAI
Ингибитор
активатора плазминогена PALS
периартериальные лимфатические влагалища
PBS
фосфатный физиологический раствор
с
КОЛЫШЕК
буферным солевым раствором PBSM фосфатный
физиологический раствор с буферным солевым раствором
-полимеразная цепная реакция, полимеразная цепная
минус
реакция
Полиэтиленгликоль
ПК(15)А
Porzine Zelllinie, porcine kidney (15) Amsterdam
PLA
peroxidase linked assay
pmol
Пикомол
ПЦР
Пероксидаза ПО
PPP
platelet poor plasma, plättchenarmes Plasma
Краткий справочник
PRP
РНК
плазма, богатая тромбоцитами, плазма, богатая
тромбоцитами
-рибонуклеиновая кислота, рибонуклеиновая кислота
Обратная транскриптаза RT
RT-PCR
reverse transcription polymerase chain reaction
sec
Sekunde
Линия клеток тимуса постоянного стержня SFT-R
TF
Tissue factor, Gewebefaktor
TFPI
Tissue Factor Pathway Inhibitor
TNF-α
Tumornekrosefaktor α
t-PA
tissue-type plasminogen activator
TXA2
Thromboxan A2
ut-PA
urokinase-type plasminogen activator
VEGF
vascular endothelial cell growth factor
VNT
Тест
на нейтрализацию вируса Фактор Виллебранда vWF
1
Введение
Классическая чума свиней (КСП) - это эпидемия животных, вызывающая большие потери
во всем мире, имеющая большое торгово-политическое и экономическое значение. Это
одно из заболеваний,
подлежащих регистрации в Международном ветеринарном бюро, Международном
управлении ветеринарии (МЭБ) и во
всех европейских государствах. КСП заменяется небольшим, закрытым
РНК-вирус, выделенный из рода Pestivirus. Естественными хозяевами вируса являются
исключительно домашние и дикие свиньи.
Острая форма течения вирусной инфекции KSP (KSPV) сочетается с клиническими
Сопутствующие симптомы и патологоанатомические данные вирусной геморрагической
лихорадки
, которые также можно наблюдать при лихорадке Эбола или хантавирусных инфекциях
. На сегодняшний день патогенез этого заболевания недостаточно изучен.
человека
Клинические симптомы KSP были описаны в 1970-х годах в терминах
диссеминированного внутрисосудистого свертывания или кровоизлияния соответственно.
коагулопатией потребления. Однако совсем
недавно было показано, что задействованы и другие механизмы, и
нарушение регуляции системы свертывания плазмы,
обычно связанное с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, по-видимому,
не является основной причиной возникновения
кровотечений.
В рамках этой работы она направлена на более детальное изучение и характеристику
патогенетических механизмов нарушений свертываемости крови, а
также кожных и органных кровотечений. К этому
С этой целью были выбраны два экспериментальных подхода, предусматривающих
фармакологическое вмешательство на
разных участках гемостаза.
2
Обзор литературы
2.1
Вирус классической чумы свиней
2.1.1
Таксономия
Вирус классической чумы свиней (KSPV) объединен с возбудителями пограничной
болезни
овец (BD) и вирусной диареи крупного рогатого скота (BVD) в род Pestivirus семейства
Flaviviridae eingruppiert (WENGLER et al., 1995; RICE, 1996; PRINGLE, 1999).
Семейство Flaviviridae, помимо рода Pestivirus, включает роды Flavivirus и
Hepacivirus (PRINGLE, 1999). Род гепацивирусов содержит исключительно вирус
гепатита С (BARTENSCHLAGER and LOHMANN, 2000). В род флавивирусов входят
, в частности, вирус денге, вирус раннего летнего менингоэнцефалита, вирус Западного
Нила.
Были сгруппированы вирус и вирус желтой лихорадки, а также ветеринарно значимый
вирус
болезни Лупинга. Некоторые из этих состояний могут сопровождаться геморрагическими
симптомами
. Классические вирусные геморрагические лихорадки включают, помимо прочего,
лихорадку денге
Геморрагическая лихорадка и желтая лихорадка (BRAY, 2005).
2.1.2 Морфология и организация генома
KSPV - это икосаэдрический РНК-вирус в оболочке. Диаметр полного
Длина вирусной частицы составляет от 40 до 60 нм (HORZINEK et al., 1967; МЕННИГ и
ПЛАГЕМАНН, 1992a; ВЕНГЛЕР и др., 1995).
Геном представляет собой одноцепочечную линейную молекулу РНК, которая
имеет ориентацию по плюсовой цепи. Геном имеет среднюю длину 12,5
т.п.н. и кодирует в одной открытой рамке считывания („open reading frame“ - ORF)
гипотетический полипротеин размером ок. 4000 аминокислот, который подвергается
посттрансляционной и
котрансляционной обработке. После этапов обработки вирусными и клеточными
Ферменты содержат одиннадцать вирусных белков. ORF окружен двумя
нетранслируемыми областями
(NTR) (РЮМЕНАПФ и др., 1991; COLLETT, 1992; РЮМЕНАПФ и др., 1993;
МЕЙЕРС и ТИЛЬ, 1996).
2 Обзор литературы
pro
N
C
3
rns
E
E1
E2
p7
NS2-3
NS4A
NS4B
NS5A-B
3´
5´
NS2
NS5A NS5B
NS3
Структурные белки
Рисунок 2-1: Геномная организация чумных вирусов. Структурные белки показаны темно
-синим цветом, неструктурные белки - светло-синим (модифицировано по МЕЙЕРСУ и ТИЛЮ, 1996).
Разная ширина прямоугольников, без прямого или косвенного масштабирования, символизирует
разную длину белков в геноме.
2.1.3
Вирусные белки
Геном кодирует с 5-го по 3-й конец белки N
pro
rns
, C, E , E1, E2, p7,
NS2-3, NS4A, а также NS5A и NS5B (рис. 2-1). Структурные белки, образующие
rns
вирусную частицу, включают белки C, E , E1 и E2. В то время как основной белок C
rns
образует нуклеокапсид, вирусная оболочка состоит из гликопротеинов
, E1 и E2
E
(THIEL et al., 1991).
pro
Неструктурный белок N
характерен для рода Pestivirus и обладает
автопротеолитической активностью (WISKERCHEN et al, 1991; STARK et al, 1993;
TRATCHIN
et al, 1998). Другие неструктурные белки p7, NS2-3, NS4A, а также NS5A и NS5B
выполняют различные, иногда не известные подробно функции в
репликации вируса (MEYERS et al, 1989; GREISER-WILKE et al, 1992a; ELBERS et
al, 1996; STEFFENS et al, 1999; ХАРАДА и др., 2000; ТАУЦ и др., 2000).
2.2
Классическая чума свиней
КСП входит в число основных болезней животных во всем мире, поэтому его необходимо
регистрировать как во всех государствах
Европейского Союза (ЕС), так и в МЭБ. Вирус
распространен по всему миру, но в некоторых странах с ним успешно борются. Так,
например, Австралия
, Новая Зеландия и США не содержат KSPV (VAN OIRSCHOT, 1999; EDWARDS et al.,
2000). Актуальная информация была взята из статуса мобильного телефона МЭБ
(http://www.oie.int/hs2/report.asp
, посетил 18.12.2005).
2 Классическая чума свиней
4
Происхождение KSP точно установить невозможно (VAN OIRSCHOT, 1999), отчет
Бюро животноводства (Министерство сельского хозяйства США) за 1887 год
однако указывает на то, что KSP впервые был официально зарегистрирован в Огайо, США,
в 1833 году
(LIESS, 1981). В 1903 году возбудитель был обнаружен как фильтруемый вирус (RU
ШВАЙНИЦ и ДОРСЕТ, 1904).
Естественными хозяевами KSPV, которые заболевают KSP, являются исключительно
домашние и
дикие свиньи (LIESS, 1981; LADDOMADA, 2000). Сообщалось также о субклинических
инфекциях
у телят, коз, овец, оленей и пекари (LOAN and STORM,
1968).
2.2.1 Пути передачи и эпидемиология
В естественных условиях ороназальная инфекция KSPV, по-видимому, представляет собой
наиболее важный
путь передачи (DUNNE, 1970; ПАТОН и ГРЕЙЗЕР-УИЛКЕ, 2003b).
Искусственное осеменение или оплодотворение, соответственно. прикрытие также
представляет возможные пути заражения
(FLOEGEL et al., 1998; DE SMIT et al., 1999), что также предполагает ретроспективные
исследования
В 1997/98 гг. В Нидерландах (HENNECKEN et al., 2000).
Вирус выделяется со всеми выделениями и экскрементами, такими как моча, кал,
слюна и слезная жидкость, в ходе заболевания и может проникать через плацентарный
барьер у инфицированных свиноматок-переносчиков
и, таким образом, инфицировать плод в матке (DAHLE
and LIESS, 1992a; VAN OIRSCHOT, 1999).
Прямой контакт между инфицированными и восприимчивыми свиньями
следует рассматривать как основной путь распространения вируса (RIBBENS et al, 2004).
Как (незаконная) подача
недостаточно нагретых пищевых отходов, так и механические переносчики, такие как
транспортные
средства и навесное оборудование, также играют роль в распространении KSPV (ФУРГОН
ОИРШОТ, 1999). Ретроспективный анализ эпидемии КСП в Нидерландах
в 1997/98 году, а также количественная оценка скорости передачи показали, что
наибольшее значение придавалось транспортировке живых животных, за которой
следовали транспортные средства и
контакт с людьми (STEGEMAN et al., 2002).
В странах с эндемичным заболеванием KSP среди популяции
кабанов проникновение вируса в поголовье домашних свиней инфицированными кабанами
играет
важную роль (DAHLE and LIESS, 1992a; КАДЕН, 1998; КЕРН и др., 1999;
2 Обзор литературы
5
ЛАДДОМАДА, 2000; ФРОЛИХ и др., 2002). Помимо вышеупомянутого незаконного
кормления пищевыми отходами, прямой или косвенный контакт с инфицированными
дикими кабанами является наиболее частой причиной первичных вспышек КСП в
поголовье домашних свиней
(FRITZEMEIER et al, 2000). Поэтому зараженные кабаны представляют собой постоянную
Представляет опасность заражения для популяции домашних свиней (MOENNIG, 2000).
2.2.2 Основные формы классической чумы свиней
KSP может сопровождаться широким спектром симптомов, которые проявляются крайне
разнообразно и едва ли являются специфическими. На проявление симптомов влияют
различные факторы
как хозяина, так и вируса. Таким образом, клиническая картина сильно зависит от
возраста
пораженных животных. К другим факторам относятся вирулентность штамма
KSPV, а также факторы хозяина, такие как иммунный статус и вторичные инфекции (VAN
OIRSCHOT, 1999;
МЕННИГ и др., 2003). Инкубационный период составляет около недели для отдельного
животного,
с возможными периодами от двух до десяти дней или даже дольше.
В принципе, можно выделить три формы течения КСП: острую,
хроническую и пренатальную формы. В полевых условиях эти формы течения не
всегда хорошо поддаются разделению, поскольку различные клинические
картины могут сосуществовать в одном запасе (DEPNER et al., 1996a).
Острая форма течения
Острая форма течения в первую очередь поражает пятнистых поросят и молодых
откормленных свиней, когда они
контактируют с умеренными или высоковирулентными штаммами KSPV. Среди первых
Признаки острой инфекции KSPV включают высокую температуру (часто выше 41 ° C),
вялость, снижение потребления пищи и конъюнктивит (DUNNE,
1970). Многие животные встают, когда их поднимают, с согнутой спиной и опущенной
головой
(VAN OIRSCHOT, 1999), и быстро снова ложатся,
укладываясь друг на друга кучками в поисках тепла. Увеличенные лимфатические узлы,
которые становятся заметными, особенно в
области паха, а также респираторные симптомы, такие как кашель, чихание и
шумы при дыхании. Во время первой фазы высокой температуры у
пораженных животных часто наблюдается рвота, гиперемия кожи и запор (ВАН
ОИРШОТ, 1999). По мере прогрессирования развивается сильная диарея. В ходе
2 Классическая чума свиней
6
Заболевание могут возникать симптомы центральной нервной системы, которые могут
проявляться слабостью задних конечностей,
несогласованными движениями, параличом или судорогами (MOENNIG et al,
2003). На поздней стадии заболевания могут быть точечные (петехии) и плоские
(Экхимозы) кровоизлияния в кожу, а также нерегулярное сине-красное изменение цвета
на ушах,
хвосте, а также в области конечностей и нижней части живота (VAN OIRSCHOT,
1999; MOENNIG et al., 2003). Пораженные животные обычно умирают от десяти до 20
Через несколько дней после заражения.
Лабораторно диагностируется тяжелая лейкопения. Обусловленное этим
Иммуносупрессия является причиной частичных тяжелых вторичных инфекций легких и
легких соответственно.
желудочно-кишечного тракта (ШМИДТ и КААДЕН, 1968; ВАН ОИРШОТ, 1999). Эта
Симптомы
часто накладываются
на типичныеПризнаки чумы свиней,
что
под
Полевые условия могут привести к проблемам в диагностике (DEPNER et al., 1999;
МЕННИГ и др., 2003). Наряду с лейкопенией возникает тяжелая тромбоцитопения
(DUNNE, 1970).
При смертельных инфекциях KSPV не образуется или образуется небольшое количество
нейтрализующих антител, которые могут быть обнаружены непосредственно перед
смертью животных
(RESSANG, 1973a; LIESS et al., 1977; DEPNER et al., 1994).
В дополнение к этой типичной форме острого течения, также встречаются перакутная,
подострая и подострая формы соответственно.
переходные градиенты на. Острая форма течения может возникнуть у молодых поросят,
которые
внезапно умирают после непродолжительного периода высокой температуры (DUNNE,
1970). При осмотре
этих животных обычно наблюдаются исключительно
симптомы шока (TRAUTWEIN, 1988). Переходные, часто субклинические, течения,
заканчивающиеся полным
выздоровлением животных, наблюдаются у пожилых откормленных свиней или
племенных животных, а также в
контексте слабовирулентных штаммов вируса. После непродолжительного периода легких
клинических симптомов у этих животных формируется эффективный иммунный ответ. В
то время
как антиген и антиген- соответственно Если обнаружение вируса в этих случаях возможно
временно, клинические
данные не указывают на инфекцию KSPV. Это обстоятельство привело к обозначению
„нетипичных“
Сохранена форма градиента (DAHLE and LIESS, 1992b; DEPNER et al., 1996a).
2 Обзор литературы
7
Хроническая форма течения
Хроническая форма течения возникает, когда пораженные животные не могут выработать
адекватный и эффективный иммунный ответ. Он характеризуется
продолжительностью заболевания более 30 дней (MENGELING and PACKER, 1969) и часто
ассоциируется с умеренно вирулентными штаммами KSPV (VAN OIRSCHOT, 1999). Во
время
заболевания, которое в этом случае протекает длительно, у животных
чередуются фазы острого клинического заболевания и периодического улучшения
(DEPNER et
al., 1996a; DEPNER et al., 1996b). Хронически больные свиньи могут
выживать в течение нескольких месяцев, но заболевание всегда заканчивается летальным
исходом (MENGELING and PACKER, 1969;
ВАН ОИРШОТ, 1999). Неспецифические признаки заболевания, такие как вялость и
нежелание есть,
повторяющиеся вспышки лихорадки, изменения кожи, хроническое воспаление
кишечника и
прогрессирующее истощение, наблюдаются по мере прогрессирования заболевания.
Молодняк нарушен в
своем развитии и нуждается в уходе (VAN OIRSCHOT, 1999; MOENNIG et al., 2003).
Пренатальная инфекция
KSPV способен проникать через плацентарный барьер свиноматок-переносчиков (VAN
ОИРШОТ и ТЕРПСТРА, 1977). Хотя инфекция у свиноматки часто протекает в легкой или
субклинической форме, последствия для плода зависят от стадии развития и
вирулентности патогена (MOENNIG and PLAGEMANN, 1992b). На ранних сроках
беременности инфекция KSPV чаще всего приводит к аборту или родоразрешению,
соответственно. Мертворождение, но также приводит к
мумификации и уродствам. Инфекция между 50 и 70 днями
беременности может привести к рождению постоянно инфицированных поросят (ВАН
ОИРШОТ и
ТЕРПСТРА, 1977; МЕЙЕР и др., 1981). Эти поросята могут казаться здоровыми при
рождении
, но по мере их развития у них будет проявляться так называемая поздняя форма
(„позднее начало“)
КСП, и в конечном итоге они погибнут. Задержка роста, уход, конъюнктивит,
воспаление кожи и двигательные расстройства находятся на переднем крае этого
процесса. Животные,
пораженные поздней формой, могут выживать до одиннадцати месяцев и постоянно
выделяют большое количество
вируса, что делает их серьезной опасностью для других свиней (ВАН
ОИРШОТ и ТЕРПСТРА, 1977). После 85 лет. Поросята, инфицированные в день
беременности
, обычно рождаются невиремическими (МЕННИГ и ПЛАГЕМАНН, 1992b).
2 Классическая чума свиней
2.2.3
Патология
2.2.3.1 Макроскопические изменения
8
Выраженность патологической картины зависит от возраста животных, времени
заражения и вовлеченного штамма KSPV. Типичная
патологоанатомическая картина острой инфекции KSPV характеризуется
множественными кровотечениями
различной степени тяжести практически во всех органах и
симптомами воспаления катарального, фибринозного и геморрагического характера,
обнаруживаемыми, в частности, в легких,
желудочно-кишечном тракте и мочеполовых путях (ROHRER and PEHL, 1960). Симптомы
воспаления нередко являются следствием вторичных инфекций (ВАН
ОИРШОТ, 1999). РЕРЕР и ПЕЛЬ (1960) описывают картину разреза как
геморрагическую сепсис, характерное кровотечение которого указывает на нарушение
проницаемости
кровеносной сосудистой системы.
Наиболее заметные находки обнаруживаются в лимфатических узлах и почках.
Лимфатические
узлы сильно увеличены, отечны и во многих случаях имеют геморрагический инфаркт. В
почках
часты петехиальные и экхиматозные кровотечения, поражающие в основном кору почек,
реже
мозговое вещество почек и воротную область, и часто сопровождающиеся глинистым
цветом
паренхимы (ROHRER and PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999).
Патологоанатомическим признаком, который считается почти патогномоничным для KSP
, но встречается не всегда, являются инфаркты края селезенки (ROHRER and PEHL, 1960;
ТРАУТВЕЙН, 1988; ВАН ОИРШОТ, 1999).
Некротические очаги, вызванные инфарктом, нередко возникают в миндалинах, где
они приводят к гнойному воспалению в результате бактериальной колонизации (DUNNE,
1970; VAN
OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000). Типичный вывод, который можно сделать с
помощью
Вторичными инфекциями, вызванными бактериальными возбудителями, являются
тяжелые
катарально-гнойные и фибринозные пневмонии, которые в некоторых случаях
сопровождаются интерстициальным
отеком (ROHRER and PEHL, 1960). Негнойный энцефалит выявляется почти
во всех случаях (ROHRER and PEHL, 1960; GRUBER et al., 1995).
У хронически больных свиней результаты менее выражены. Геморрагии и
инфаркты могут полностью отсутствовать. Характерными признаками являются атрофия
тимуса и
истощение лимфоцитов в периферических лимфатических органах (VAN OIRSCHOT, 1999).
Для
хронически больных животных характерна гиперплазия коры надпочечников
2 Обзор литературы
9
(ШЕВИЛЬ и МЕНГЕЛИНГ, 1969; ВАН ДЕР МОЛЕН и ВАН ОИРШОТ, 1981).
Некротические и язвенные изменения стенки кишечника также часто связаны с
хронической формой течения. Эти так называемые „бутоны“ появляются в основном в
слепой кишке и толстой кишке, образуя кратеровидные изъязвления. Дефекты
окостенения или деформации, соответственно. поражения в
области хрящево-костных соединений проявляются, в частности. на ребрах в виде
отчетливых
Выделяются участки со светлыми полосами (DUNNE, 1970; TEIFKE et al., 2002).
2.2.3.2 Микроскопические и ультраструктурные изменения
Степень гистопатологических изменений также связана с вирулентностью
вовлеченного штамма KSPV. Генерализованный васкулит и некроз
лимфоцитов, а также энцефалит характерны для инфекции высоковирулентными
штаммами
KSPV (NARITA et al, 2000). Упомянутые поражения могут
быть связаны с локализацией антигена. Истощение лимфоцитов, в частности, влияет на Влимфоциты
(SUSA et al., 1992; QUEZADA et al., 2000).
Описанные выше макроскопические изменения в лимфатических узлах коррелируют
с выраженным истощением лимфоцитов и ретикулярной гиперплазией в
гистопатологической
картине (VAN OIRSCHOT, 1999). В мельчайших сосудах могут наблюдаться тромбозы,
некрозы и фибриноидные отеки. С другой стороны, более крупные сосуды не поражаются
(ROHRER and PEHL, 1960).
Макроскопическим изменениям в почках соответствует утечка крови в
почечную паренхиму из интерстициальных капилляров, в то время как клубочки, повидимому, не
поражены. В капиллярных петлях могут наблюдаться фибриноидные изменения, что
приводит к вторичной
отечности клубочков (ROHRER and PEHL, 1960). QUEZADA et al. (2000)
опишите геморрагии и микротромбы, особенно в клубочковых капиллярах.
Инфаркты края селезенки проявляются в гистопатологической картине как смешанные
инфаркты с
ишемическим центральным некрозом и вторичным образовавшимся геморрагическим
двором.
Микротромбы и гиалинизирующие изменения в артериальном эндотелии были описаны в
этом контексте QUEZADA et al. (2000). В этой работе
также были обнаружены фибриновые сеточки в красной пульпе (QUEZADA et al., 2000).
Почти у всех свиней, инфицированных KSPV, наблюдается негнойный энцефалит,
основной характеристикой которого
являются периваскулярные инфильтраты (РОРЕР и ПИЛЬ, 1960;
GRUBER et al., 1995; VAN OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000).
2 Классическая чума свиней
10
Лейкоцитарные инфильтрации эпителия и
изменения лимфоидного клеточного вещества обнаруживаются в криптах миндалин,
которые на поздних стадиях заболевания становятся некротическими.
может иметь характер. Однако первыми изменениями являются гиперплазия фолликулов,
пролиферация клеток ретикулума и активация эндотелиальных клеток (RHRERER and
PEHL,
1960).
Гистопатологическим эквивалентом изменений на границе хрящевой кости
являются гипертрофированные хондроциты, расширенные лакуны, гиперемированные
капилляры и
мультифокальное кровоизлияние (TEIFKE et al, 2002). ТЕЙФКЕ и соавт. (2002)
также обнаружили почти полное отсутствие остеобластов и некроза остеоцитов в области
метафиза.
Возникающая там остеопоротическая зона была описана и другими авторами
(DUNNE et al., 1957).
Хронически больные животные проявляют гемопоэтическую активность в селезенке (VAN
OIRSCHOT
and TERPSTRA, 1977; САММЕРФИЛД и др., 1998a; НАРИТА и др., 2000).
Диссеминированный микротромбоз был описан в контексте острого течения KSPV
(HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; КЕСАДА и др., 2000).
2.2.4
Патогенез
Первичное размножение вируса происходит в миндалинах (DUNNE, 1970; RESSANG,
1973b;
ЛИСС, 1987). Оттуда происходит распространение вируса в окружающие
лимфоретикулярные ткани. Через лимфатические сосуды и кровеносные сосуды
соответственно. по
лимфатическому руслу вирус попадает в регионарные лимфатические узлы. Здесь
происходит выраженная репликация вируса с
последующим распространением по кровеносной сосудистой системе с массивной
виремией. Таким образом, вирус
попадает во вторичные места репликации. Вторичное размножение вируса происходит в
основном
в селезенке, костном мозге, висцеральных лимфатических узлах и лимфатических тканях
кишечника. (РЕРЕР и ПЕЛЬ, 1960; РЕССАНГ, 1973b). Основными клетками-мишенями
вируса являются
Makrophagen (SUMMERFIELD et al., 1998b; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001;
САНЧЕС-КОРДОН и соавт., 2003), эндотелиальные клетки (ТРАУТВЕЙН, 1988),
лимфоретикулярные
Клетки и эпителиальные клетки (MOENNIG, 2000). Через пять-шесть дней
распространение вируса в организме завершается (RESSANG, 1973b).
2 Обзор литературы
11
Клиническая картина острого КСП аналогична клинической картине других вирусных
геморрагических заболеваний,
в число которых входит, в частности, африканская чума свиней (АЧС). Оба заболевания
связаны с репликацией вируса в моноцитарных клетках и имеют сходный
патогенетический
Общий механизм, приводящий к характерным кровотечениям (ANDERSON, 1986;
GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Поэтому ниже следует обратить особое внимание на изменения в популяциях макрофагов,
возможныеПричины
лимфопении и
тромбоцитопении , а также
механизмы возникновения геморрагий во время острой
формы течения КСП.
Влияние инфекции KSPV на макрофаги
Изменения в количестве макрофагов во время инфекции KSPV происходят в смысле
кратковременного увеличения на начальной стадии заболевания и увеличения количества
макрофагов, соответственно. к дням падения в
дальнейшем. Инфекция, апоптотические процессы, фагоцитотическая и
секреторная активация происходят во всех популяциях макрофагов (ГОМЕСVILLAMANDOS et al., 2003a). Поражаются популяции макрофагов селезенки
(ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2001; САНЧЕС-КОРДОН и др., 2005b), костного
мозга (ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 1998; ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2003b),
почек (ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2000, 2001),
легких (CARRASCO et al., 2001), тимуса (SANCHEZ-CORDON et al., 2002),
кишечника (SANCHEZ-CORDON et al., 2003), а также печени (NUNEZ et al., 2005).
ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и соавт. (2001) продемонстрировали для селезеночных
макрофагов, что
фагоцитотическая и секреторная активность макрофагов увеличивается, а
апоптотическая активность увеличивается.
Процессы происходят. Считается, что макрофаги периартериальных
лимфатических оболочек (PALS) мигрируют в другие области. Фагоцитоз инфицированных
апоптотических телец (макрофагов, лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов) может
способствовать распространению вируса и может способствовать отсутствию
воспалительных изменений в
объяснить гибель клеток пораженных участков на ранней стадии инфекции (ГОМЕСVILLAMANDOS et al., 2003a).
Считается, что активированные и активированные устройства, соответственно.
качественно измененные макрофаги и их
медиаторы, которые они выделяют в различных локусах, играют главную роль в
патогенезе
2 Классическая чума свиней
12
случаев заражения KSPV (ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2003a). Прямой
Повреждение от KSPV было в значительной степени исключено для многих поражений,
возникающих как часть заболевания KSP
. Таким образом, ни лимфопения
(SUMMERFIELD et al, 1998b; SATO et al, 2000; SANCHEZ-CORDON et al, 2002), ни
описанные почечные геморрагии (GOMEZ-VILLAMANDOS et al, 2000) не могли быть
отнесены к
прямому вирусному воздействию. Для тромбоцитопении такой
патогенетический механизм также не может быть продемонстрирован (GOMEZVILLAMANDOS et
al, 1998). Скорее, разумно предположить, что разные цитокины могут быть причинно
вовлечены
. Эти медиаторы включают фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-1β (IL1β) и 1α (IL-1α) (SANCHEZ-CORDON et al, 2002), а также интерлейкин-6 ( IL-6).
В инфицированных KSPV альвеолярных макрофагах (в пробирке) и лимфатических узлах
более инфицированных
Свиньям удалось обнаружить повышенную экспрессию TNF-α и TNF-α соответственно.
может быть обнаружен белок TNF-α
(CHOI et al., 2004). TNF-α способен вызывать апоптоз в различных
Запускать клеточные популяции (ZHENG et al., 1995; NAGATA, 1997) и, таким образом,
может быть
индуктором лейкопении. Пораженные клетки представляют собой преимущественно
лейкоциты, в частности, макрофаги, согласно морфологическим критериям. Кроме того,
они могли
ЧОЙ и соавт. (2004) обнаруживают апоптотические процессы как в KSPVинфицированных, так и
в неинфицированных лимфатических клетках. Результаты этой работы показывают, что
KSPV может вызывать апоптоз как прямым, так и косвенным путем (CHOI et
al., 2004). Как инфекция KSPV стимулирует выработку TNF-α, до сих пор недостаточно
изучено. Однако присутствие антигена KSPV в TNF-α- позитивных макрофагах
позволяет предположить, что вирусные компоненты посредством связывания с
рецептором на поверхности
клетки или механизмами внутри клетки обеспечивают триггер для синтеза TNFα (CHOI et al, 2004).
Помимо TNF-α, IL-1 и IL-6 также могут индуцировать апоптоз у различных видов
клеток. Это уже было продемонстрировано для других вирусных заболеваний (РАЗВИ и
УЭЛШ, 1993; ГОМЕС ДЕЛЬ МОРАЛЬ и др., 1999). Для КСП роль
TNF-α и IL-1 (SANCHEZ-CORDON et al., 2002). Повышенный уровень ИЛ-1Продукция после инфекции KSPV также была показана в пробирке (KNOETIG et al, 1999),
в данном случае в сочетании с повышенной продукцией простагландина Е2. Вовлечение
TNF-α или IL-6 не может быть прослежено в пробирке (KNOETIG et al., 1999).
2 Обзор литературы
13
Для печеночных макрофагов было показано, что в ходе острого КСПВИнфекция наряду с активацией фагоцитоза происходит сверхэкспрессия
провоспалительных цитокинов. И TNF-α, и IL-6, и IL-1α были
повышенно экспрессированы (NUNEZ et al., 2005). В частности, течение продукции IL-1α
показало
связь с появлением клинических симптомов и патологоанатомически
обнаруживаемых геморрагий (NUNEZ et al, 2005).
Влияние KSPV на лимфоциты и патогенез лимфопении
Инфекция KSPV, особенно в острой форме, вызывает тяжелую
Лимфопения и связанная с ней иммуносупрессия обнаруживаются еще до появления
первых симптомов (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al., 1998). Одна
Истощение различных популяций лимфоцитов может быть продемонстрировано еще до
появления
обнаруживаемой виремии (SUMMERFIELD et al, 2001a). В
лимфоретикулярных органах наблюдается выраженное истощение лимфоцитов, особенно
популяции В- лимфоцитов (SUSA et al., 1992; NARITA et al., 2000; КЕСАДА и др., 2000).
Прямого повреждения лимфоцитов вирусом обнаружить
не удалось (SATO et al, 2000; SUMMERFIELD et al, 2001b; SANCHEZ-CORDON et al,
2002), хотя некроз лимфоцитов может быть вызван прямым вирусным воздействием
(NARITA
et al, 1996) и некрозом лимфатических клеток соответственно. Индукция апоптоза
вирусными компонентами (BRUSCHKE et al, 1997)
обсуждались. Феномен чрезвычайно ранней лейкопении связан с косвенно
индуцированным апоптозом лимфатических клеток (SATO et
al., 2000, SUMMERFIELD et al., 1998). Однако как прямая, так и
косвенная индукция апоптоза с помощью KSPV могут играть роль (CHOI et al., 2004). Одна
Возможность прямого воздействия заключается в воздействии вирусных белков на
окружающие клетки.
rms
БРУШКЕ и соавт. (1997) показали, что гликопротеин E
вызывает апоптоз в
лимфоцитах
рнк E
самых разных видов. Поскольку
доставляется в значительных количествах
в окружающую
среду инфицированных клеток, она может
играть роль в этом контексте (BRUSCHKE et al., 1997; CHOI et al., 2004). Было показано,
что
истощение лимфоцитов тимуса и селезенки совпало по времени с увеличением
числа макрофагов, содержащих фагоцитированный клеточный мусор (макрофаги с
„покалывающим
телом лимфоцитов сопровождалось явными признаками
“). Кроме того, истощение
в
2 Классическая чума свиней
14
сопутствующих апоптотических изменений, таких как ядерный пикноз и кариорексис
(САНЧЕСCORDON et al., 2005a). Количественные изменения в популяциях Т-лимфоцитов, а также
качественные изменения в экспрессии цитокинов этими клетками были оценены
САНЧЕСОМКОРДОН и соавт. (2005) интерпретируется в смысле клеточно-опосредованного иммунного
ответа 1-го типа
, который в дальнейшем сменяется иммунным ответом 2-го типа.
Помимо выраженной лимфопении, в ходе заражения KSPV
также наблюдается выраженная гранулоцитопения (SUSA et al, 1992; SUMMERFIELD et al,
1998a; САММЕРФИЛД и др., 1998b). Истощение гранулоцитов, которое происходит уже
через три дня
после заражения, поражает как зрелые гранулоциты крови, так и незрелые
Клетки-предшественники в костном мозге (SUMMERFIELD et al, 2000). Это могло быть от
САММЕРФИЛД и соавт. (2000), показано, что как апоптотические, так и
некротические изменения играют роль в костном мозге. Для каспаз 3 и 9
повышенная активность может быть обнаружена, особенно на седьмой день инфекции,
причем
последнее свидетельствует об участии митохондриального пути индукции апоптоза
(BUDIHARDJO et al., 1999). Способность к дифференцировке и, следовательно
, гранолитопоэзу не нарушалась в клетках костного мозга инфицированных животных на
протяжении всего течения
заболевания. Незрелые гранулоциты, условно говоря, увеличивались в течение
периода инфекции. Повреждение или повреждение клеток, соответственно. Индукция
апоптоза с помощью KSPVИнфекция сама по себе в этом контексте кажется маловероятной, поскольку количество
апоптотических и апоптотических инфекций, соответственно, увеличивается. мертвых
клеток намного превышало количество инфицированных клеток, особенно в начале
инфекции (SUMMERFIELD et al, 2000). Другое наблюдение
пробирке модель на клеткахгемопоэтических клеток костного мозга (BMHC)
заключалась в том, что у
большинства инфицированных клеток не было признаков апоптоза, и, соответственно, у
большинства инфицированных клеток не было признаков апоптоза. почти все
апоптотические клетки не были инфицированы KSPV. Таким образом, кажется, что
косвенный
Играть ведущую роль в механизме индукции апоптоза (SUMMERFIELD et al.,
2001b). В пробирке, в отличие от результатов
в естественных условиях (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b), Саммерфилд и соавт.
(2001b) не смогли обнаружить вовлечение макрофагов,
цитокинов или активных форм кислорода.
2 Обзор литературы
15
Влияние инфекции KSPV на тромбоциты
Характерным симптомом при прогрессировании острого КСП является высокая степень
Тромбоцитопения, начало которой коррелирует с появлением лихорадки и измеримой
виремией
(HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС
и др., 1998). В принципе, тромбоцитопения может быть вызвана уменьшением или
отсутствием
Тромбоцитопоэз (нарушение образования), повышенный периферический износ в
результате потребления,
потери или повреждения,
Разрушение
(Нарушение
соответственно.
или потеря дохода)
или
изменение
Могут быть вызваны распределением тромбоцитов (нарушение распределения) (BAUTISTA
et al., 2002).
Различные механизмы обсуждаются как причина тромбоцитопении в контексте инфекции
KSPV. ХОФФМАНН и соавт. (1971) и КАЛЬДЕРОН и соавт. (1998) приписали
это явление массивной дегенерации мегакариоцитов в костном
мозге. HEENE et al. (1971) и HOFFMANN et al. (1971) привели к появлению
Кроме того, тромбоцитопения сопровождается последствиями коагулопатии или
коагуляции потребления, соответственно.
в сочетании с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием. ВАЙС и соавт. (1973)
обнаружили вирус в
тромбоцитах остро больных свиней и связали тромбоцитопению
с предшествующей инфекцией мегакариоцитов и последующим
разрушением тромбоцитов.
ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и соавт. в 1998 году смогли показать, что лишь небольшое число
Мегакариоциты (2-4%) инфицированы, и постулировали, что интенсивность
тромбоцитопении не может быть адекватно объяснена разрушением мегакариоцитов в
результате инфекции.
БАУТИСТА и соавт. (2002) описывают клеточные изменения на
второй и четвертый день после заражения в селезенке и печени, что указывает на
активацию и агрегацию
тромбоцитов, а также секреторную и фагоцитотическую активацию резидентных
Предполагают макрофаги. В связи с этим массовая активация и
последующиеФагоцитоз
тромбоцитов,
вызванный высвобождением
тромбоцит-активирующих факторов активированными макрофагами, обсуждается как
первичная причина
массивной тромбоцитопении в ходе КСП. Вышеупомянутые авторы исключают активацию
и
агрегацию тромбоцитов тканевым фактором (TF, тканевым фактором) из
-за отсутствия отложений фибрина в пораженных органах
, в то время как диссеминированное внутрисосудистое свертывание исключено на том
основании
, что микротромбы могут образовываться только в заключительная фаза заболевания, то
есть после
Эта
2 Классическая чума свиней
16
Случаев тромбоцитопении (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Морфологические признаки повреждения эндотелия или других тканей, вызывающего
Системы свертывания крови, также не могли быть обнаружены BAUTISTA et
al. (2002).
Различные исследования показали, что наблюдаются выраженные
изменения в костном мозге свиней, инфицированных KSPV, но их можно обнаружить
только после
возникновения тромбоцитопении (ГОМЕС-ВИЛЛАМАНДОС и др.,
1998; ГОМЕС-ВИЛЛАМАНДОС и др., 2003a; ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2003b).
Дегенеративные изменения мегакариоцитов, описанные HOFFMANN et al. (1971) и
CALDERON et al. (1998)
, также могут быть показаны в этих исследованиях как
„обнаженные ядра мегакариоцитов“, но рассматриваются здесь в смысле
последовательности
(Попытка восстановить нормальное количество тромбоцитов) обсуждается (ГОМЕСVILLAMANDOS et al., 2003b).
В пробирке было показано, что в KSPV-инфицированных эндотелиальных
клетках активируется транскрипционный фактор NFκB, который отвечает за контроль
активации эндотелиальных
клеток
.
Это происходит
в дополнение
к
увеличению
Экспрессия
провоспалительных (IL-1α, IL-6 и IL-8) и прокоагулянтных факторов
(BENSAUDE et al, 2004). Экспрессия как
тканевого фактора, так и фактора роста эндотелиальных клеток, VEGF (фактора роста
эндотелиальных клеток сосудов) и
молекулы адгезии клеточной поверхности Е-селектина, были повышены в пробирке. Таким
образом
, активированные эндотелиальные клетки могут играть важную роль в возникновении
гемостазиологических
Воспроизведение расстройств (BENSAUDE et al., 2004). НУНЬЕС и др. (2005) смогли
Обнаруживать агрегаты тромбоцитов и активированные тромбоциты в печени
инфицированных животных, которые находились в
непосредственной близости от клеток фон Купфера. Обсуждается, играет ли продукция IL1
клетками фон Купфера роль в развитии тромбоцитопении
(NUNEZ et al., 2005), поскольку было показано, что IL-1 может приводить к активации
тромбоцитов
(REALE et al., 1996).
Патогенез геморрагий при протекании острой инфекции KSPV
Кровоизлияния, особенно в лимфатические узлы и почки, являются частью классической
картины
острой инфекции KSPV (РЕРЕР и ПЕЛЬ, 1960; ВАН ОИРШОТ, 1999).
2 Обзор литературы
17
основные патогенетические механизмы обсуждались в различных направлениях
(GOMEZ-VILLAMANDOS et al, 2003a). Эти механизмы включают
прямое повреждение эндотелия KSPV (HEENE et al., 1971), причинно-следственную
Вовлечение тромбоцитопении через измененные тромбоциты (WEISS et al, 1973) и
диссеминированное внутрисосудистое свертывание (HOFFMANN et al, 1971a; GRUBER et
al, 1995;
BENSAUDE et al., 2004) и BENSAUDE et al., соответственно. диффузная активация системы
свертывания крови в результате
повреждения эндотелия (TRAUTWEIN, 1988). ТРАУТВЕЙН (1988)
также обсуждает, что повреждение эндотелия, вызванное микротромбами, может быть
причиной
потери плазмы и периваскулярной геморрагии. Петехии, которые
чаще всего возникают в сочетании с капиллярами, были обнаружены в почках свиней с
острым заболеванием КСП, начиная
с седьмого дня после заражения, в сочетании с эритродиапедезом (утечка
эритроцитов из кровеносных сосудов через щели в стенке сосуда)
(ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2000; РУИС-ВИЛЬЯМОР и др, 2001). С
описанным
Эритродиапедезсопровождается
увеличением
просвета капилляров,
мононуклеарными инфильтратами и увеличением
количества тучных клеток и их дегрануляцией (ГОМЕС-ВИЛЬЯМАНДОС и др., 2000;
РУИС-ВИЛЬЯМОР и др., 2001; ГОМЕС-ВИЛЬЯМОР и др., 2001).
VILLAMANDOS et al., 2003a). Ультраструктурные и морфометрические исследования
в этом контексте показали, что наблюдается выраженное расширение сосудов и
уменьшение толщины стенки эндотелия (GOMEZ-VILLAMANDOS et al, 2000).
Мононуклеарные инфильтраты, возникающие в связи с почечными геморрагиями
, в основном характеризовались как Т- и В-лимфоциты, макрофаги
были обнаружены только в небольшом количестве (GOMEZ-VILLAMANDOS et al, 2000).
Как расширение
капилляров, так и повышение проницаемости, а также миграция
эритроцитов и лейкоцитов из капилляров могут быть опосредованы цитокинами
(MANTOVANI et al, 1992). Макрофаги, которые являются
одними из основных клеток-мишеней KSPV (RESSANG, 1973a; TERPSTRA, 1991), участвуют
в
периваскулярных инфильтратах в области почечного геморрагии, хотя и в незначительной
степени (ГОМЕСВИЛЬЯМАНДОС и соавт., 2000), но обладают выраженной емкостью, сосудистой
на проницаемость, что также может быть продемонстрировано в контексте других
вирусных
геморрагических лихорадок (BRAY, 2005). В ходе КСПВ
инфекции они проявляют секреторную активацию и, таким образом, могут играть важную
роль в
2 Вирусные геморрагические лихорадки
18
играют роль в механизме возникновения KSPV-индуцированных геморрагий (ГОМЕСVILLAMANDOS et al., 2000; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Другие патогенетические механизмы
В качестве патогенетического триггера гипоксический некроз остеокластов и
остеобластов вызывается поврежденным эндотелием капилляров (PALMER 1992,
цитируется по
ТЕЙФКЕ и соавт. 2002) и др. остановка разрушения и окостенения хряща в результате
Обсуждалась потеря остеобластной активности, вызванная KSPV (TEIFKE et al., 2002).
Повышенная выработка цитокинов и медиаторов воспаления, связанных с
заболеваниями костей различного генеза, причинно связана с повышенной
остеокластической
Активность, но также связана с апоптозом остеобластов (BOYCE et al,
1999).
В почках свиней, инфицированных KSPV, во время хронического течения инфекции и
инфекции, соответственно, не могли быть обнаружены какие-либо изменения в почках.
с десятого дня после заражения обнаруживаются иммунные комплексы (CHEVILLE
et al., 1970; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), состоящие из иммуноглобулинов M и G и
фактора комплемента C1q; вирусный антиген не был обнаружен как компонент этих
комплексов (RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Ведутся споры о том, будут ли эти
Иммунные комплексы возникают в результате перепроизводства неспецифических
антител, описанных
для стойко инфицированного BVDV крупного рогатого скота (HEWICKER et al, 1987).
2.3
Вирусная геморрагическая лихорадка
Вирусные геморрагические лихорадки, которые также включают острую форму течения
КСП,
несмотря на различный генез, имеют некоторые общие черты, особенно отраженные в
патогенезе заболеваний (GOMEZ-VILLAMANDOS et al, 2003a).
Следовательно, для понимания патогенетических механизмов KSP можно также
Внести свой вклад в понимание, полученное при других вирусных заболеваниях,
сопровождающихся
симптомами геморрагической лихорадки. Вот почему дается краткое
представление о патогенетических механизмах, известных классическим представителям
вирусных
геморрагических лихорадок.
2 Обзор литературы
2.3.1
19
Классические представители
Возбудители характерных вирусных геморрагических лихорадок встречаются в
семействах вирусов Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae и Filoviridae (FELDMANN et al.,
1996; ЧЕН и КОСГРИФФ, 2000). Упомянутые семейства содержат вирусы с
одноцепочечной РНК в оболочке (BRAY, 2005). Вирус ASP (ASPV) представляет собой
, чем это ДНК-вирус из семейства Asfarviridae (DIXON
et al., 2004). К первому семейству относятся, например, возбудители лихорадки Ласса
(лассавирус),
аргентинскогогеморрагического
Лихорадка
(джунинвирус)
и
боливийская
геморрагическая лихорадка (мачуповирус) (OLDSTONE, 2002a; OLDSTONE, 2002b; JAY et
al., 2005). Представители семейства Bunyaviridae включают, среди прочего, хантаановирус
и вирус Синномбре, а также вирус крымско-Конго геморрагической лихорадки (СИММОНС и
RILEY, 2002; LEDNICKY, 2003; TAI et al., 2005). Эти вирусы часто вызывают у
людей тяжелые лихорадочные заболевания с геморрагическими симптомами, которые
, в зависимости от типа вируса, также могут сопровождаться тяжелыми почечными и
легочными заболеваниями.
Могут сопровождаться сопутствующими симптомами (WHITEHOUSE, 2004).
Флебовирус,
вирус
лихорадки Рифт-Вэлли,
Представитель
рода
также может вызывать геморрагическую лихорадку у людей в редких случаях (GERDES,
2004). Лихорадка Рифт-ВэллиВирус имеет ветеринарное значение, поскольку, помимо зоонозного потенциала, он
вызывает
серьезные заболевания у жвачных животных, сопровождающиеся желудочно-кишечными
симптомами,
гепатитами и чумными абортами (GERDES, 2004).
Семейство Flaviviridae включает в роды Flavivirus (NEYTS et al., 1999;
СОЛОМОН и МАЛЛЕВА, 2001) и вирус пестицида (БЕЙКЕР, 1995; ГОМЕСВИЛЬЯМАНДОС и соавт., 2003a) Состояния, которые
могут сопровождаться геморрагическими симптомами. Геморрагические заболевания
рода Flavivirus включают
геморрагическую лихорадку денге (JOHN, 2003; MALAVIGE et al, 2004) и тяжелую
Прогрессирующая форма желтой лихорадки (MONATH, 2001). В роду Pestivirus инфекции
, связанные с KSPV и BVDV, могут сопровождаться симптомами геморрагической
лихорадки.
Возбудители наиболее тяжелых геморрагических лихорадок встречаются в семействе
филовирусов
(FELDMANN et al., 1996; ПЕТЕРС и ХАН, 1999; КАСИЛЬЯС и др., 2003). Вирусы
Эбола и вирус Марбург вызывают самые тяжелые заболевания с высокой смертностью
(30-80%).
2 Вирусные геморрагические лихорадки
2.3.2
20
Патогенез вирусной геморрагической лихорадки
Общей чертой вирусной геморрагической лихорадки является первичная репликация
вируса в
моноцитах и венах соответственно. Makrophagenpopulationen (GOMEZ-VILLAMANDOS et
al., 2003a;
БРЕЙ, 2005) и их сродство к эндотелиальным клеткам. Исключением являются
хантавирусы,
которые реплицируются в первую очередь в эндотелиальных клетках. Хотя некоторые из
этих вирусов также оказывают прямое
действие, повреждающее клетки, большинство клинических проявлений обусловлено
Реакции иммунной системы и вызванные медиаторами инфицированных макрофагов
(BRAY, 2005). Возбудители почти всех геморрагических лихорадок способны инфицировать
самые
разные типы клеток (GEISBERT and JAHRLING, 2004).
Исследования патогенеза эболавирусной инфекции показали, что взаимодействия
вируса с макрофагами и дендритными клетками играют важную роль в развитии
широкого спектра различных поражений (GEISBERT et al., 2003b; GEISBERT et al., 2003c;
GEISBERT et al., 2003d). Возбудители вирусных геморрагических лихорадок не только
способны обходить неспецифическую защитную систему, но и способны размножаться в
макрофагах, которые
фактически должны бороться с вторгающимися патогенами, и использовать их
в качестве транспортных средств к паренхиматозным органам. Торможение типа 1
Выработка интерферона играет в этом вспомогательную роль (BRAY, 2005). Инфекция
активирует секреторную активность макрофагов, которые секретируют цитокины и другие
медиаторы. Это вызывает повышение температуры и может повлиять на сосудистую
систему в смысле
Влияет на активацию
Система
свертывания
эндотелиальных крови
клеток.
переходит в
прокоагулянтное состояние (HENSLEY et al, 2002; ГЕЙСБЕРТ и ДЖАРЛИНГ,
2004; ХЕНСЛИ и ГЕЙСБЕРТ, 2005). Для вируса Эбола было показано, что он вызывает
активацию внешнего пути свертывания крови, индуцированную инфицированными
макрофагами
. Сверхэкспрессия TFs, по-видимому, играет здесь ключевую
роль (GEISBERT et al, 2003c). ГЕЙСБЕРТ и соавт. (2003) также видят параллели между
Эболавирусной инфекции и септического шока (апоптоз лимфоцитов, нарушение
регуляции
провоспалительных цитокинов, активация каскада свертывания крови в смысле
диссеминированного внутрисосудистого свертывания).
Инфицированные дендритные клетки, по-видимому, нарушают свою способность
активировать наивные лимфоциты. В сочетании с эффектами, вызванными медиаторами
, это может способствовать массивному апоптозу лимфоцитов, наблюдаемому при
прогрессировании заболевания
2 Обзор литературы
21
(GEISBERT et al., 2000; GEISBERT et al., 2003b; MAHANTY und BRAY, 2004; BRAY
und GEISBERT, 2005).
В отличие от KSPV, филовирусы индуцируют прямой цитопатический эффект,
проявляющийся
как в инфицированных макрофагах и дендритных клетках, так и в паренхиматозных
клетках печени, надпочечников и других органов. Механизм
до сих пор в значительной степени не объяснен. Образующийся некротический клеточный
мусор усиливает системную
Воспалительная реакция и высвобождение цитокинов из активированных клеток (БРЕЙ и
МАХАНТИ, 2003; ХОТЧКИСС и КАРЛ, 2003; БРЕЙ, 2005).
Косвенные эффекты инфекций, вызванных указанными вирусами, были изучены, в
частности
, на основе эболавирусной инфекции.
Репликация вирусов в макрофагах приводит к взаимодействию одноцепочечной
вирусной РНК, двухцепочечной промежуточной РНК и других вирусоспецифичных
веществ
с трансмембранными белками типа 1, толл-подобными рецепторами, а также другими
молекулами распознавания образов неспецифической иммунной системы. Это нацелено
на NFκB,
факторы, регулирующие интерферон, и другие пути активации, соответственно. Эта
активация приводит
к высвобождению провоспалительных медиаторов, таких как IL-1, IL-6, TNF-α и оксид
азота
(ХОТЧКИСС и КАРЛ, 2003; БРЕЙ, 2005).
Дендритные клетки выделяют хемокины, которые вызывают дополнительные моноциты и
дендритные клетки.
Заманить клетки в места репликации вируса. Таким образом, дополнительные
восприимчивые клетки
попадают в места репликации вируса и способствуют распространению вируса (HENSLEY
et al,
2002; MAHANTY et al, 2003; BRAY and GEISBERT, 2005).
Нарушения проницаемости сосудов и коагулопатии часто
объяснялись прямым воздействием вируса на инфицированные эндотелиальные клетки в
более ранних исследованиях (ПЕТЕРС и
ЗАКИ, 2002; ШНИТТЛЕР и ФЕЛЬДМАНН, 2003). Однако совсем недавно было показано
, что репликация вируса в эндотелиальных клетках становится обнаруживаемой только на
заключительной стадии заболевания
, когда нарушения свертываемости крови и симптомы шока уже выражены
. Таким образом, возникающее расширение сосудов, повышенная проницаемость сосудов,
а также экспрессия
молекул адгезии в области эндотелия связаны с действием
различных медиаторов воспаления (MAHANTY and BRAY,
2004; BRAY, 2005).
2 Вирусные геморрагические лихорадки
22
Системный воспалительный ответ тесно связан с
активацией системы свертывания крови. Медиаторы воспаления, такие как IL-6, могут
инициировать синтез TFs
и, таким образом, могут включать мощный активатор свертывания крови (BRAY, 2005).
Отложения фибрина также могут быть обнаружены (GEISBERT et al, 2003c).
Значимая взаимосвязь между вирусной инфекцией, воспалительной реакцией и
свертыванием
крови может быть доказана экспериментально (GEISBERT et al, 2003a).
Для инфекций, вызванных возбудителями вирусной геморрагической лихорадки,
характерен выраженный апоптоз
преимущественно неинфицированных лимфатических клеток, приводящий к массивной
Иммуносупрессия приводит. Индукция апоптоза, по-видимому, индуцируется цитокинами
инфицированных моноцитарных клеток во всех случаях (MAHANTY and BRAY, 2004;
БРЕЙ, 2005; БРЕЙ и ГЕЙСБЕРТ, 2005).
2 Обзор литературы
2.4
23
Гемостаз и компоненты гемостаза
Ниже приведены для лучшего понимания патологических процессов при тяжелых
Вирусные инфекции вкратце представлены физиологические процессы, происходящие в
процессе свертывания
крови. Более подробные описания можно найти, в частности, у ТРОЯ (1988) и ДОДДСА
(1988) и Доддса (1988)
соответственно.
в
соответствующих медицинских Монографии (НАВРОТ,
1998;
ХАРБРЕХТ, 1998; ГАВАЗ, 1999) и обзорные публикации (БЛУМ,
1990; БУН, 1993; НАРАЯНАН и ХАМАСАКИ, 1998; СТАССЕН и др., 2004; ЮРК
и КЕРЕЛЬ, 2005).
Гемостаз включает процессы, которые в неповрежденной сосудистой сети вызывают
непрерывный
Обеспечить кровоток и, в случае необходимости, то есть в случае травм и нарушений
этой системы, активировать быстрый гемостаз и ограничить его до места происшествия
(TROY, 1988). Таким образом, в физиологических условиях постоянные
Антикоагулянтные и коагуляционные процессы. Антикоагулянтная терапия основана на
специальных
Свойства интактного, не смачиваемого эндотелия, неагрегация неактивного
Подтверждается тромбоцитами и неактивностью ферментов свертывания,
присутствующих в виде проферментов
(BARTHELS and VON DEPKA, 2003a). Активаторы свертывания
крови расположены во внесосудистой области. Гемостаз, поскольку компоненты не
нужно синтезировать, а нужно только активировать, может происходить с низким
энергопотреблением и быстро. Важными
процессами в этом процессе являются сокращение стенок артерий, активация
тромбоцитов
и клеток поврежденных клеточных поверхностей, а также фибринолитическая активность
Системы. Оба процесса, то есть процессы свертывания крови и фибринолиз, должны
быть ограничены местом действия, что, в частности, обеспечивает инактивация
ферментов их
физиологическими ингибиторами (ЛЬЮИС, 1996; НАВРОТ, 1998).
После Вирхова выделяют три области гемостаза (триада Вирхова, названная
в честь Рудольфа Вирхова, описавшего эти области в 1856 году): тромбоциты (клеточные
компоненты), сосудистая система (эндотелий) и плазматическая система свертывания
крови.
2 Гемостаза и компоненты гемостаза
2.4.1
24
Клеточные компоненты
Неактивные тромбоциты представлены в виде дисков диаметром 1-5 мкм и
циркулируют близко к эндотелию на краю кровотока (BARTHELS and VON DEPKA, 2003a).
Они генерируются в костном мозге путем выделения из мегакариоцитов. Их количество
указано для домашних свиней с очень широким диапазоном от 220 до 620 г / л
(HAHN et al., 1996; МИШКЕ, 1999a).
Ингредиенты тромбоцитов включают активные коагулирующие фосфолипиды, серотонин
и
Аденозиндифосфат (АДФ). Неактивный тромбоцит не выводит эти вещества
наружу, активные коагулирующие фосфолипиды находятся в мембране тромбоцитов. При
одном
Повреждение эндотелия происходит за счет адгезии и агрегации тромбоцитов с
образованием
первичной тромбоцитарной пробки и, следовательно, уплотнения сосудистого дефекта
(BARTHELS
and VON DEPKA, 2003a). Субэндотелиальный коллаген
, обнажающийся при повреждении сосудов, образует точку прикрепления циркулирующих
тромбоцитов, которые в
дальнейшем агрегируются. В ходе этих процессов тромбоциты активируются и
теперь представляют наружу активные коагулирующие фосфолипиды мембраны
тромбоцитов. Через этот
Механизм срабатывания мембраны тромбоцитов создает матрицу для процессов
свертывания, которые происходят впоследствии
(HARBRECHT, 1998; GAWAZ, 1999).
Связи между свертывающей системой и тромбоцитами осуществляются через рецепторы
на активированной поверхности тромбоцитов, такие как гликопротеиновый (GP) рецептор
IIb / IIIa, который
связывает фибриноген и фактор фон Виллебранда (vWF) (GAWAZ, 1999). Активация
тромбоцитов может быть разделена на различные части. Первично
, помимо субэндотелиального коллагена, решающее значение имеет тромбин.
Вторичная активация связана с метаболизмом тромбоцитов, который обеспечивает
2,
тромбоксан А
АДФ и фактор, активирующий тромбоциты (PAF) (БАРТЕЛЬС и ФОН
DEPKA, 2003a). Связь между эндотелием и тромбоцитами опосредуется, среди прочего,
фактором
фон Виллебранда через рецептор тромбоцитов GPIIb / IIIa.
Согласно БАРТЕЛЬСУ и ФОН ДЕПКЕ (2003), соответствующие компоненты тромбоцитов
включают
перечислены в таблице 2-1.
2 Обзор литературы
25
Таблица 2-1: Рецепторы и другие соответствующие компоненты тромбоцитов, важные для
свертывания крови (по БАРТЕЛЬСУ и ФОН ДЕПКЕ, 2003). В правом столбце указана основная
функция, связанная со свертыванием крови.
Компонент
функции
рецептора GPIIb / IIIa и IIIa соответственно.
связывание
Integrin
фибриногена
α
и vWF
IIbβ3
рецептора GPIb/IX/V
Связывание vWF
фосфолидидный слой
Связывание факторов свертывания,
в частности протромбинового комплекса,
фактора V, фактора VIII
Простагландины и конечный
Агрегация тромбоцитов
продукт тромбоксан соответственно
2.4.2
Эндотелий
Помимо его стимулирующих поток свойств из-за отсутствия смачиваемости,
эндотелий содержит ряд веществ, которые играют роль в гемостазе. Таким
образом, простациклин, мощный ингибитор агрегации тромбоцитов, происходит из
эндотелия.
Гепараны (гепарансульфат), оксид азота и простагландин
I
в антикоагуляции
2 играют роль
эндотелия (STASSEN et al., 2004). Высвобождение активатора плазминогена тканевого
типа
t-PA приводит к фибринолизу посредством активации плазминогена с образованием
плазмина. Ингибитор
активатора плазминогена PAI является антагонистом и ингибирует фибринолиз. Вступить
Если в области эндотелия возникают нарушения или травмы, они возникают из-за
воздействия коллагена и vWF и vWF соответственно. TF, высвобождаемый из клеток
поврежденной ткани, превращается в
Активация свертывания крови (СТАССЕН и НИСТРОМ, 1997; БАРТЕЛЬС и ФОН
DEPKA, 2003a; STASSEN et al., 2004). В таблице 2-2 показаны соответствующие
компоненты
эндотелия и ткани.
2 Гемостаза и компоненты гемостаза
26
Таблица 2-2: Вещества эндотелия и субэндотелия, влияющие на свертываемость крови (по
БАРТЕЛЬСУ и ФОН ДЕПКЕ, 2003).
Вещество
как коллаген
простациклин
Гепарансульфат
, функционирующее
Адгезия и агрегация тромбоцитов
Ингибирование агрегации тромбоцитов
Антикоагуляция на эндотелии
Thrombomodulin
vWF
ТФ
t-PA и ut-PA
ПАЙ-1
2.4.3
Активация белка С как кофактора
тромбина
связующее звено между субэндотелием и
тромбоцитами. Защищает фактор VIII от преждевременной
деградации (антиген, связанный с фактором VIII)
Активация плазматической
системы свертывания крови (внешний путь) посредством
образования комплексов с
фактором VIIфибринолиза
Активаторы
Ингибитор фибринолиза
Плазменная система свертывания крови
Согласно общепринятому представлению, активация плазматического свертывания
протекает в форме
тонко регулируемого каскада (NAWROTH, 1998). Хотя распространенные обучающие
модели не
соответствуют ситуации в естественных условиях (HOFFMAN, 2003), они обеспечивают
хорошую основу для
возможности диагностики возникающих нарушений свертываемости крови в пробирке
(БАРТЕЛЬС и ФОН
DEPKA, 2003a).
В процессе свертывания крови активируются неактивно присутствующие факторы
ферментного каскада,
ряд сериновых протеаз (NORRIS, 2003), что приводит к активации центрального
фермента свертывания крови тромбина, который превращает фибриноген в фибрин (TROY,
1988;
НОРРИС, 2003). Образование тромбина происходит через два пути реакции,
внешний и внутренний, оба из которых соединяются в общий конечный участок.
Строгого разделения между системами не существует (RADCLIFFE et al., 1977; ТРОЙ,
1988). Ниже перечислены активированные факторы, обозначенные буквой
а, проставленной после римской цифры. Сильно схематизированный обзор обоих путей
активации показан
на рисунке 2-2.
2 Обзор литературы
27
2.4.3.1 Внешний путь активации
Внешний путь обычно активируется повреждением сосудов (БАРТЕЛЬС и
ФОН ДЕПКА, 2003а). При нарушении целостности сосудов происходит высвобождение
TF. Он образует комплекс с протеазным фактором VII. Этот комплекс стимулирует
активацию фактора X и образование протромбиназного комплекса, который является
общим
Конечная стадия свертывания (ТРОЙ, 1988; МАНН, 1999; МОРРИССИ, 2001). С помощью
механизма
обратной связи фактор VII определяется как возникающим TF-фактором, так и
Комплекс VII, а также усиленно активируется фактором Ха. Фактор VIIa - это
сериновая протеаза, которая сама по себе малоэффективна и оказывает оптимальное
действие, когда TF превращается в свертывающую активность.
Фосфолипидов поврежденных клеточных мембран (NAWROTH, 1998; МАНН,
1999). Помимо активации фактора X, фактор VIIa также активирует фактор IX, фактор
IXa, в свою очередь, фактор X. Антагонистом этого пути является ингибитор пути
тканевого фактора
TFPI, который, образуя комплекс с фактором Ха и комплексом фактора VII TF
, быстро сдерживает процесс активации (BARTHELS and VON DEPKA, 2003a).
2.4.3.2 Внутренний путь активации
Внутренний путь определяется через контактные факторы фактор XII, фактор XI,
прекалликреин и
Высокомолекулярный кининоген (HMWK) инициируется с прекалликреином и фактором
XI
, связанным с кофактором HMWK. Эти факторы связываются с отрицательно
заряженными
Поверхности, такие как тромбоцитарные мембраны, коллаген, а также стекло, каолин,
эллаговая кислота или
другие искусственные поверхности (БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003a). Контактные
факторы, в частности фактор XIIa и калликреин, также способны влиять на
VII, чтобы активировать или активировать соответственно. инициировать собственный
фибринолиз (МАНН, 1999). Центральным
элементом этой системы является так называемый комплекс теназы, который состоит из
фактора IXa, его кофактора VIII
, а также фосфолипидов и ионов кальция (TROY, 1988). этот комплекс активирует
Фактор X и, таким образом, присоединяется к общему конечному маршруту. В „петле
Джоссо“ существует
взаимодействие между внутренним и внешним путями плазматического
свертывания. Она описывает активацию фактора IX комплексом TF-фактор-VII
и обратную связь через фактор Xa (MANN, 1999).
2 Гемостаз и компоненты гемостаза
28
2.4.3.3 Общий конечный маршрут и регулирование
Конечной точкой свертывания является превращение водорастворимого фибриногена в
фибрин
ферментом тромбином (TROY, 1988). Тромбин вырабатывается в результате активности
так называемого тромбина.
Протромбиназный комплекс из неактивного предшественника протромбина.
Помимо активированного фактора X (Xa), этот комплекс содержит его ускоритель, фактор
V, а также ионы кальция и
фосфолипиды (NAWROTH, 1998; БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003a). В
реакции, катализируемой тромбином, фибринопептиды A и B выводятся из областей
Аа и Bβ-цепи фибриногена (см. 2.4.6) отщепляются, освобождая
сайты связывания, которые обеспечивают взаимодействие различных молекул фибрина.
Сборка
молекул фибрина, активируемых тромбином, первоначально приводит к образованию
Фибриновые мономеры, которые в результате дальнейшего наращивания превращаются в
фибриновые волокна.
Ковалентное сшивание происходит только в реакции, катализируемой фактором XIII, и,
следовательно,
Стабилизация фибриновой сетки (MOSESSON, 1998). Активация фактора XIII
происходит непосредственно через тромбин (МАНН, 1999). На рисунке 2-3 показана
сильно схематизированная
Отображено изображение образования фибрина.
Контроль образования тромбина является одним из наиболее важных процессов гемостаза
из-за
и
активации
его важности
тромбоцитов.
для образования
Генерацияфибрина
тромбина контролируется посредством инактивации с обратной связью через системы
тромбомодулин / белок C
и S, а также прямого ингибирующего действия антитромбина (NAWROTH,
1998). Антитромбин также ингибирует фактор Ха, а также, с меньшей активностью,
другие
факторы свертывания крови (BARTHELS and VON DEPKA, 2003a). К эндотелиальному
фактору
Связанный с тромбомодулином тромбин активирует белок С, который в сочетании со
своим кофактором белком S может протеолитически инактивировать факторы Va и VIIIa
(BARTHELS and VON DEPKA, 2003a).
Этот комплекс также ингибирует ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) и обладает
профибринолитической активностью в этом отношении. Система тромбмодулин / белок С
регулируется
гепарин-зависимым ингибитором белка Са PAI-3 и гепарин-независимым ингибитором α1протеазы α1-PI (DOLAN et al., 1989).
Объединение в сеть
2 Обзор литературы
29
Внутренний путь
Внешний путь
Отрицательно заряженные поверхности
XIa, XIIa, калликреин
2+
IXa + VIIIa + фосфолипиды + Ca
Комплекс
петля Джоссо
2+
теназы IXa + VIIIa + фосфолипиды + Ca
Повреждение сосудов / эндотелия
Комплекс фактора VIIa TF
+ VIIa + фосфолипиды + Ca 2+
X
Xa
Va
ионы кальция
протромбиназный комплекс
фосфолипиды
Протромбин Тромбин
FXIII
ФибриногенФибрин (полимер)
FXIIIa
Fibrin
Рисунок 2-2: Схематическое изображение внутреннего и внешнего путей плазматического
свертывания крови. Схема изменена по БАРТЕЛЬСУ и ФОН ДЕПКЕ (2003).
Протромбин
Thrombin
αβγ
γβα
F XIII
-S--S-
XIIIa
Мономеры фибрина
Полимеризация
Фибрин
Рисунок 2-3: Сильно схематизированное изображение образования фибрина. Расщепление
фибринопептидов А и В (не проиллюстрированных подробно) высвобождает сайты связывания в
молекуле,
которые позволяют полимеризировать образующиеся таким образом мономеры фибрина. Образование
фибриновых волокон происходит за счет боковой ассоциации
фибриновых мономеров, структура
которых стабилизируется поперечным сшиванием, катализируемым фактором XIII.
2 Компонента гемостаза и гемостаза
30
2.4.4 Фибринолиз
Фибринолиз, то есть повторное растворение сгустка, происходит за счет
протеолитического
Фермент плазмин. Плазмин может расщеплять как фибрин, так и фибриноген. самый
маленький
Продуктом распада фибрина в процессе фибринолиза является водорастворимый D-димер.
Плазмин образуется из неактивного предшественника плазминогена в результате
ферментативного действия
активаторов плазминогена (PRIGLINGER and BINDER, 1998).
Существует два типа сериновых протеаз, которые действуют как активаторы
плазминогена (ПА).
Это тип ткани (t-PA), которая высвобождается из эндотелиальных клеток, а также
тип урокиназы (ut-PA). Антагонистами, которые немедленно инактивируют свободный
плазмин, являются α2Антиплазмин (α2-AP) и неспецифический α2-макроглобулин (α2-MG). На стадии
активаторов плазминогена опосредованный плазмином протеолиз контролируется
четырьмя ингибиторами (PAI-1
до 4), причем PAI-1 является основным ингибитором (PRIGLINGER and BINDER,
1998). PAI-1 также содержится в соответствующих количествах в тромбоцитах (GAWAZ,
1999).
Значительно упрощенное изображение фибринолиза можно найти на рисунке 2-4.
Плазминоген
t-PA, ut-PA
Kallikrein
Faktor XIIa
ПАЙ-1
плазмин
Фибриноген / Фибрин
α2-Antiplasmin
α2-Makroglobulin
Продукты деления, D-димеры
Рисунок 2-4: Схематическое изображение системы фибринолиза. Активация
плазминогена контролируется
плазминогена
t-PA и t-PA соответственно.
инициирует utкалликреини активаторами
фактор XIIa
.
Противниками
являются
PA,
а также активатора плазминогена (здесь представлен наиболее важный из них, PAI-1)
ингибиторы
,контактные
а на уровнефакторы
плазмина - α2-антиплазмин и α2-макроглобулин. Конечным
продуктом фибринолиза являются D-димеры.
2 Обзор литературы
31
2.4.5 Диагностика плазменной системы свертывания крови Глобальные тесты
свертывания крови включают, помимо тромбопластинового времени (синонимы: QuickTest, протромбиновое время), активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT)
и
тромбиновое время (BARTHELS and VON DEPKA, 2003b).
Тромбопластиновое время
Тромбопластиновый период был введен в диагностику свертывания крови еще в 1935 году
(QUICK et al., 1935), и в медицине человека он регулируется стандартом 58910, частью 1-4
Немецкого института стандартизации (DIN).
У людей и домашних животных тромбопластиновое время используется в качестве
скрининговоготеста на
внешний путь свертывания крови (стр. 2.4.3.1).
Таким образом, принцип тестирования основан на добавлении тканевого тромбопластина
и
ионов кальция в цитратную плазму с низким содержанием тромбоцитов. Посредством
осуществляемой таким образом активации
внешнего пути свертывания крови происходит образование фибрина, первый из которых
Происходит автоматически фиксируется и указывается в секундах (МИШКЕ, 1999а;
БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003b). В медицине человека и, реже, в
ветеринарии, полученное значение в секундах переводится в так называемые значения в
секундах.
Преобразуется в значение Quick, которое указывает на свертывающую активность в
процентах (МИШКЕ, 1999a; БАРТЕЛЬС
и ФОН ДЕПКА, 2003b).
Активированное частичное тромбопластиновое время
АЧТВ - это независимый от тромбоцитов глобальный тест, который выявляет факторы
внутреннего
пути (PROCTOR and RAPAPORT, 1961). Помимо факторов свертывания крови VIII, IX,
XI, XII, прекалликреина и HMWK, он также определяет факторы X, V и протромбин, а
также
Фибриноген и здесь пересекается с быстрым тестом (LUSHER, 1996; БАРТЕЛЬС
и ФОН ДЕПКА, 2003b). aPTT указан в медицине человека в соответствии со стандартом
DIN
58908. он находит применение как в медицине, так и в ветеринарии, особенно в
диагностике гемофилии, дефицитных состояний фактора XI и фактора XII (БАРНА и
ТРИПЛЕТ, 1989; МИШКЕ, 1993). Кроме того, поскольку тест зависит от гепарина и, в
некоторой степени
, от гирудина, он используется при наблюдении за терапией с помощью прямых
Используются антикоагулянты (БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003b). сила высказывания,
2 Гемостаза и компоненты гемостаза
32
специально для терапии гирудином назначается только в более низком диапазоне
концентраций, в то время
как в диапазоне высоких и токсичных концентраций он теряется, соответственно (NOWAK,
2001).
Принцип тестирования основан на инкубации цитратной плазмы с низким содержанием
тромбоцитов с частичными
Тромбопластины и поверхностно-активные вещества, которые
могут быть преобразованы в их активированную форму в течение инкубационного
периода. После добавления
ионов кальция происходит свертывание, и время, необходимое для образования фибрина
, измеряется в секундах (JOHNSTONE, 1988).
Тромбиновое время
По тромбиновому времени оценивается образование фибрина из фибриногена.
Измеренное
время показывает, сколько времени требуется стандартизированному раствору тромбина
для растворения в бедном тромбоцитами растворе.
Цитратная плазма вызывает свертывание (ЮРГЕНС, 1952). Таким образом, этот тест
обходит
восходящее образование тромбина через внешний или внутренний путь
свертывания крови. Ионы кальция не являются необходимыми для реакции тромбинфибриноген,
но они ускоряют полимеризацию фибрина (JOHNSTONE, 1988; БАРТЕЛЬС и ФОН
DEPKA, 2003b). Тест дает представление о свертываемости фибриногена и
, следовательно, о нарушениях образования фибрина. Кроме того, он подходит в качестве
теста на зависимость при подозрении на
тяжелые состояния дефицита фибриногена (MISCHKE, 1999a).
2.4.6 Концентрация фибриногена
Концентрация фибриногена также регулярно определяется в ветеринарии в рамках
гемостазиологических исследований (CADE and ROBINSON, 1975; МИШКЕ
и НОЛЬТЕ, 1992). Дефицит фибриногена часто является приобретенным и связан
с
повышеннымвнутрисосудистым
Доход
или прибыль
Потеря.
соответственно
Одна
Повышение
концентрации фибриногена является неспецифическим маркером воспалительных
процессов (MISCHKE,
1999a), поскольку фибриноген относится к белкам острой фазы, скорость синтеза которых
увеличивается за счет TNF-α, а
также IL-1 и IL-6. Таким образом, как острое, так и хроническое воспаление
часто сопровождается повышением уровня фибриногена (MOSESSON, 1998).
Эталонный диапазон для свиньи составляет 1,6-3,9 г / л (метод КЛАУССА, 1957)
и 3,2-7,2 г / л (гравиметрия) соответственно (МИШКЕ, 1999а). Измерение проводится
различными полуколичественными методами, в которых указывается либо количество
свертываемого
2 Обзор литературы
33
Фибриногена (например, CLAUSS, 1957; STRASSLE, 1981), или количество молекулы
фибриногена
как таковой (например, РАТНОФФ и МЕНЗИ, 1951; ИНГРЭМ, 1952).
2.4.7
Диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови
Диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром) - это
приобретенный сложный синдром, который
может возникать при различных заболеваниях (ШИФЕР и СИРСИ, 1975; МАММЕН, 2000).
Это динамический
процесс, который запускается дисбалансом между про- и антитромботическим
потенциалом
системы гемостаза (MADLENER and PETZSCH, 1998). В немецком
В разговорной речи часто встречается синоним потребительская коагулопатия (LASCH et
al.,
1971). ДВС-синдром - это всегда вторичное явление, которое проявляется в умеренных,
компенсированных
Формы течения часто протекают бессимптомно, но в тяжелых формах могут
сопровождаться высокой
смертностью (BARTHELS and VON DEPKA, 2003c). Все аспекты - от
определения до патофизиологических взаимосвязей - являются предметом споров
(MADLENER and PETZSCH, 1998).
Отличительным признаком ДВС-синдрома является аномальное внутрисосудистое
образование
тромбина, которое может привести к диффузному образованию фибрина, особенно в
микроциркуляции, то есть в мельчайших капиллярах конечного
пути (CAREY and RODGERS, 1998). Это диффузное образование фибрина приводит к
высокому обороту („расходу“) тромбоцитов, фибриногена, факторов свертывания крови и
ингибиторов свертывания (MULLER-BERGHAUS et al, 1999). Высокое потребление
ингибиторного потенциала, а также начальное частое снижение фибринолитической
активности усиливают этот
процесс (MULLER-BERGHAUS, 1989).
Воспалительные и особенно септические процессы являются одними из основных причин
ДВС-синдрома,
причем в основном все патогены способны вызывать ДВС-синдром (ЛЕВИ и Тен
КЕЙТ, 1999). Однако часто именно грамотрицательные бактерии или их эндотоксины,
соответственно, приводят к
экспрессии TFs и, следовательно, к активации внешнего пути
свертывания крови (MADLENER and PETZSCH, 1998). Экспериментальные исследования с
использованием очищенного липополисахарида (ЛПС) грамотрицательных бактерий
показали, что вскоре
после инфузии наблюдается повышение уровня провоспалительных цитокинов TNF-α и IL1,
а немного позже и IL-6. LPS и TNF-α индуцируют экспрессию TF на
Эндотелиальные клетки и моноциты и, таким образом, обеспечивают триггеры для
активации свертывания крови
Одна
2 Гемостаза и компоненты гемостаза
34
dar (VAN DER POLL et al., 1995; BIEMOND et al., 1995a; BIEMOND et al., 1995b;
ESMON, 1999; MAMMEN, 2000; LEVI et al., 2003). IL-6 участвует в индукции синтеза
белков острой фазы, таких как фибриноген, и, по-видимому, также играет важную роль в
инициации свертывания
крови в контексте ДВС-синдрома (STOUTHARD et al, 1996;
МАДЛЕНЕР и ПЕТЦШ, 1998). Исследования с использованием антагонистов рецепторов
IL-1 на
модели животных (модель бабуина) смогли продемонстрировать, что IL-1 также
способствует
активации свертывания крови (FISCHER et al, 1992). Те, которые выделяются
макрофагами
Цитокины представляют собой связующие звенья с другими медиаторными системами,
совокупное действие
которых приводит к общему воспалительному ответу эндотелия
(MADLENER and PETZSCH, 1998).
Клинические симптомы ДВС-синдрома очень сильно зависят от степени выраженности и
могут включать в тяжелых случаях тромботическую окклюзию конечного пути с
выпадением
соответствующих областей и / или генерализованную склонность к кровотечениям (TEN
CATE et
al, 1999; LEVI and TEN CATE, 1999). В то время как острый, декомпенсированный ДВС
-синдром сопровождается выраженными клиническими симптомами, хронический и
хронический ДВС-синдром, соответственно, остаются хроническими. компенсированный
-синдром часто не диагностируется или диагностируется только на основании
ДВС
лабораторных данных (MAMMEN,
2000). Аномальное внутрисосудистое образование тромбина приводит к увеличению
Продукты активации свертывания крови. Наряду с этим наблюдается тромбоцитопения
и снижение уровня фибриногена, а также факторов свертывания крови и антитромбина,
когда
потребление превышает скорость синтеза. Обычно в ходе ДВС
-синдрома фибринолиз также усиливается (МАДЛЕНЕР и ПЕТЦШ, 1998; БАРТЕЛЬС и ФОН
ДЕПКА,
2003c).
ДВС-диск можно схематически разделить на три фазы (LASCH et al., 1971; МЮЛЛЕРБЕРГХАУС, 1989), к которым с клинической точки зрения можно добавить еще четвертую
фазу, фазу
выздоровления (БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003c). Первый этап
компенсированного
Активация
кровоостанавливающего
Systems идет с
одним
Снижении уровня тромбоцитов, повышенной (или псевдонормальной) концентрации
фибриногена,
Повышение активности факторов V и VIII, расход антитромбина и белка
С, а также повышенную концентрацию продуктов активации свертывания крови. Обычно
на этом этапе время свертывания глобальных тестов сокращается или остается
нормальным (MADLENER and PETZSCH, 1998; БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003c).
2 Обзор литературы
35
Снижение фибринолитического потенциала на этой стадии считается благоприятным
фактором
для развития полностью выраженного ДВС-синдрома (MULLER-BERGHAUS, 1989;
МЮЛЛЕР-БЕРГХАУС и др., 1999; ЛЕВИ и ТЕН Кейт, 1999). Вторая фаза
декомпенсированной активации системы гемостаза и, возможно, измеримого дефицита
потенциала свертывания крови сопровождается усилением снижения уровня тромбоцитов,
снижением фактора V, снижением уровня фибриногена и увеличением
времени свертывания крови в глобальных тестах aPTT и Quick-Test. Продукты активации
свертывания, а также растворимый фибрин повышены в плазме.
Микротромбы могут возникать в микроциркуляции на этом этапе и приводить к
дисфункции органов, в частности почек, печени и легких (МАДЛЕНЕР и
ПЕТЧ, 1998). Третья фаза соответствует полному изображению ДВС-диска. Часто на
позднейтретьейстадии возникает
синдром дефибринации
с
неизмеримыми
Фибриногена, потому что активация
системы фибринолиза происходит в качестве контррегуляции внутрисосудистого
свертывания. Продукты распада фибрина (огена) значительно повышены.
В этой ситуации наблюдается склонность к кровотечению, закупорка сосудов затруднена
из-за истощения
Фибринолизный потенциал часто необратим и приводит к повреждению органов в
терминальной
фазе. Время свертывания крови в глобальных тестах значительно увеличивается или
становится неизмеримым. Тромбоциты, фибриноген, а также факторы V и VIII
значительно
снижены. Как продукты активации свертывания, так и фибрин (оген)Продукты разложения значительно увеличиваются (БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003c).
Если
третья фаза переживается, на четвертой стадии значения восстанавливаются из-за
адекватного
противодействия (БАРТЕЛЬС и ФОН ДЕПКА, 2003c).
2 Фармакологическое влияние на систему свертывания крови
36
2.5
Фармакологическое влияние на систему свертывания крови
2.5.1
Антикоагулянты прямого действия
Помимо гепарина и гепариноидов, к антикоагулянтам прямого действия относятся
гирудин (GLUSA et al., 2001).
2.5.1.1 Гирудин
Гирудин является селективным ингибитором сериновой протеиназы тромбина,
первоначально полученного из
слюны медицинской пиявки Hirudo medicinalis (NOWAK, 1998).
Гирудин представляет собой одноцепочечный полипептид с молекулярной массой около
7000 Да, состоящий
из 65 аминокислот. Внутримолекулярная стабильность обеспечивается дисульфидными
мостиками (MARKWARDT et al., 1982; MARKWARDT, 1991). Гирудин и тромбин
образуют высокоаффинный одновалентный стехиометрический комплекс в соотношении
1: 1
(NOWAK, 1998), который является исключительно стабильным (GLUSA et al., 2001).
При этом тромбин теряет как свою каталитическую активность в системе свертывания
крови, так и способность связываться
с клеточными рецепторами. При соответствующей дозировке весь тромбин в крови
необратимо ингибируется, при этом другие протеазы не подвергаются воздействию даже в
микромолярном
диапазоне концентраций (GLUSA et al., 2001).
Гирудин становится эффективным только после парентерального применения, поскольку
полипептид
разрушается в желудочно-кишечном тракте (MARKWARDT et al, 1982). Период
полувыведения после подкожного введения составляет от двух до четырех часов. при этом
гирудин
инактивируется и выводится почками. При связывании с
высокомолекулярным носителем, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), фармакокинетика
значительно изменяется. ПЭГ-гирудин имеет восьмикратный увеличенный период
полувыведения из организма и
с задержкой всасывается из депо подкожных инъекций (GLUSA, 1988; NOWAK, 1998).
Антитромботическая эффективность была продемонстрирована на различных моделях
тромбоза, хотя для настоящей работы особенно важна эффективность в контексте
экспериментально индуцированного внутрисосудистого свертывания (NOWAK и
МАРКВАРДТ, 1980c; MARKWARDT et al., 1982; НОВАК и МАРКВАРДТ, 1991).
2 Обзор литературы
37
НОВАК и соавт. в 1980 году смогли продемонстрировать, что гирудин способен влиять на
образование
Полностью прекратить ДВС-синдром после инфузии эндотоксина.
Терапевтический контроль может быть основан на так называемом терапевтическом
контроле. Времени свертывания экарина, так как этот
тест на свертывание
в
терапевтическом
крови проводится
Область
Гирудинапредставляет
линейную
Показано
собой
соотношение дозавремя свертывания крови (НОВАК и БУЧА, 1996; НОВАК, 2003).
2.5.2
Ингибиторы агрегации тромбоцитов и антиагрегантов, соответственно. –
функция
Используемые и используемые в рамках этой работы соответственно активные
ингредиенты, предварительно протестированные, должны
быть кратко представлены ниже.
2.5.2.1 Ацетилсалициловая кислота
Ацетилсалициловая кислота (АСК) была впервые получена в химически чистой форме в
1897 году. Помимо
обезболивающего, жаропонижающего и противовоспалительного действия, РАС обладает
Ингибирующее действие на агрегацию тромбоцитов (CRAVEN, 1950). Эффект основан на
ингибировании циклооксигеназы (ЦОГ), которая, в принципе, существует в двух
изоформах, ЦОГ-1
и ЦОГ-2. Обе изоформы ингибируются РАС,
но только ЦОГ-1 имеет отношение к тромбоцитам (PATRONO, 1994).
Это происходит из-за необратимого ацетилирования ЦОГ, что приводит к ингибированию
Образование A2 (TXA2) (РОТ и МАЙЕРУС, 1975; РОТ и др., 1975). Поскольку бессемянные
тромбоксан
тромбоциты имеют ограниченный аппарат синтеза белка, способность ЦОГ к
повторному синтезу ограничена. Таким образом, происходит почти необратимое
торможение.
Параллельный синтез простациклина имеет второстепенное значение, поскольку
простациклин
быстро повторно синтезируется эндотелиальными клетками (REILLY and FITZGERALD,
1988;
PATRONO, 1994).
2.5.2.2 Абциксимаб
Образование стабильных агрегатов тромбоцитов опосредуется связыванием фибриногена с
рецептором GPIIb / IIIa, локализованным в мембране тромбоцитов. Это взаимодействие
Точка атаки Fab-фрагмента химерного моноклонального антитела 7E3 (абциксимаб,
ReoPro®), который практически необратимо блокирует рецептор (FAULDS and SORKIN,
1994;
COLLER et al., 1995). Абциксимаб необходимо вводить внутривенно; при этом
2 Фармакологическое влияние на систему свертывания крови
38
биологический период полураспада значительно дольше, чем период полураспада в
плазме, который составляет от десяти до 30
мин (ROSOVE, 2004).
2.5.2.3 Тирофибан
Тирофибан (Агграстат®) является непептидным антагонистом рецептора GPIIb / IIIa.
Это вещество также необходимо вводить парентерально, период полураспада составляет
1,4-1,8 часа
(ARTOIS et al., 2002). Тирофибан также нашел применение на моделях свиней (SHEN et al.,
2000).
2.5.2.4 Клопидогрель
Клопидогрель, производное тиенопиридина, необратимо ингибирует связывание АДФ с
АДФРецептор Р2 тромбоцитов. Это химический аналог тиклопидина (Куинн и
ФИЦДЖЕРАЛЬД, 1999). Оба этих агента становятся эффективными только в
метаболизированной форме
и должны активироваться системой цитохрома Р450 печени (SAVI et al.,
1994). На животных моделях было показано, что комбинация с АСК усиливает действие
клопидогрела и тиклопидина соответственно (HERBERT et al., 1996; HERBERT et al.,
1998; HARKER et al., 1998).
3
Материал и методы
3.1
Животные и материалы
3.1.1
Животные и экспериментальная установка
Для всех экспериментов, проведенных в загонах Европейской справочной лаборатории
классической чумы свиней (EURL) в Ганновере, использовались бегуньи свиньи
немецкой породы ландрас. Животные были получены в результате разведения в учебном и
исследовательском комплексе Высшей ветеринарной школы Ганновера, Шеферсберг,
Руте. На
момент помещения в клетку животным было от восьми до десяти недель, и при
клиническом обследовании в день помещения у них не было никаких клинических
отклонений. Для
индивидуальной маркировки использовались ушные бирки и цветная маркировка.
животных содержали без подстилки в условиях строгой безопасности при отрицательном
давлении
воздуха -100 Па и кормили коммерчески доступным кормом один раз в день
(Зернистый корм для поросят S 110, братья Дихтер, Алжир, Миссисипи). Подача воды
производилась
по желанию с помощью автоматического устройства для поения. Все животные были
проверены
в начале эксперимента на наличие нейтрализующих антител к чумным вирусам и
оказались отрицательными. В ходе эксперимента животных с клинической оценкой более
20 были отобраны из
В целях благополучия животных убивают безболезненно путем эвтаназии (внутривенное
введение
передозировки пентобарбитала). То же самое относится и к животным, у
которых наблюдались неоправданные страдания при более низком клиническом балле.
Посмертное исследование было проведено на всех животных для оценки
патологоанатомических данных.
В предварительных испытаниях, проводимых в помещениях Рабочей группы (АГ)
„Фармакологические
В исследовании, проведенном “Гемостазиология" Медицинского факультета Йенского
университета,
использовались свиньи-бегуны немецкой породы ландрас и гибридные свиньи. Животные
были получены в весовой категории 10-18 кг на коммерческой ферме по откорму свиней
в Тюрингии. Эти животные также были подвергнуты скринингу перед началом
Проходит
обследование.
клинических
испытаний.
3 Животные и материалы
40
В конюшнях EURLs в Ганновере были проведены следующие испытания на
животных в соответствии с указаниями и целями, перечисленными ниже:
А) В соответствии с разделом 8a Закона о защите животных от 25.05.1998 г. обязательные
к показаниям испытания на животных с
целью характеристики патогенеза полевых вирусных изолятов KSP под
регистрационным знаком 01A 78:
1. Исследования патогенеза КСП: гематологические, гемостазиологические и
гистопатологические исследования.
Для этого были отобраны семь бегунов и рандомизированы на две группы. Группа 1
включала пять животных, инфицированных высоковирулентным изолятом KSPV CSF0634.
Заражение происходило пятью мл вируссодержащего супернатанта культуры клеток. Доза
вируса
составила
3,5
10 КИД
Группа
инфекциях
2 служила отрицательным контролем и
50 (доза для культивирования
50) на мл.при
включала двух животных, которые не были инфицированы. Забор крови проводился на
третий, седьмой, одиннадцатый и 14-й дни после
заражения. Образцы были переданы на гематологические,
гемостазиологические и вирусологические исследования. Клинические симптомы
, включая температуру тела, регистрировались,
оценивались и документировались с помощью стандартизированной схемы оценки. Этот
так называемый Клиническая оценка, измененная в соответствии с MITTELHOLZER et
al. (2000), оценивает возникающие симптомы с помощью оценки, сложение
которой позволяет оценить симптоматику, и более подробно описано в разделе 3.2.7.1.
Продолжительность
эксперимента определялась клиническим течением заболевания и составляла 21
день. Материал органов (почки, печень, легкие, селезенка, лимфатические узлы)
фиксировали в формалине
и обрабатывали для световой микроскопии.
2. Предварительное исследование свертываемости крови в ходе классической чумы
свиней.
Для этого экспериментального проекта также было отобрано семь бегунов и случайным
образом разделено на два
Группы разделены. Группа 1 включала пять животных, получавших высоковирулентный
изолят KSPV.
CSF0634, группа 2 содержала двух контрольных животных, содержавшихся в одинаковых
условиях, но не инфицированных. Чтобы свести к минимуму стресс животных от
обследований и принудительных мер, а также связанные с этим изменения
гематологических и гемостазиологических параметров, был
дан 14-дневный период адаптации. Кровь отбирали у животных ежедневно в течение
первых четырех дней эксперимента
, после чего интервал отбора проб составлял три
3 Материал и методы
Выборы проводились
41
и четыре дня соответственно. Взятая кровь была подготовлена для исследования с
помощью
гематологических и гемостазиологических методов. В этом эксперименте
дополнительно проводилось исследование плазмы в тесте на гелеобразование этанола.
В нулевой,
четвертый, седьмой и десятый дни после заражения были получены лейкоциты и с
помощью
Выделение вируса проверено на наличие KSPV. Клинические симптомы, включая
температуру
тела, регистрировались и
документировались с помощью стандартизированной схемы оценки. Продолжительность
эксперимента определялась клиническим течением заболевания
и составляла 24 дня. Материал органа был зафиксирован в формалине и промыт
соответственно. замораживают при -80 ° C.
Б) В соответствии с разделом 8 Закона о защите животных от 25.05.1998 г. испытания на
животных, подлежащие разрешению:
1. Испытания на животных с пометкой:
Исследование патогенеза классической чумы свиней (КСП): фармакологическое
воздействие на плазматическую систему свертывания крови с помощью
гирудина с целью
выяснения роли плазматической системы свертывания крови. Проект
находился в ведении
окружного правительства Ганновера под регистрационным знаком 04/899.
Целью этого эксперимента было оценить роль плазменной системы свертывания крови в
патогенезе классической чумы свиней. С этой целью было проведено
фармакологическое вмешательство с использованием ПЭГ-гирудина, специфического
ингибитора тромбина
(антикоагулянты), а не. Этот препарат подавляет
конечный этап свертывания плазмы крови и находит применение в медицине человека. в
профилактике
тромбоэмболических осложнений и используется на диализе, когда пациент
не переносит или перестает переносить стандартный препарат гепарин. Для обеспечения
терапевтического уровня в плазме необходим мониторинг с использованием времени
свертывания экарина (ЭСТ)
. Это стандартизированная процедура для определения и
мониторинга уровня гирудина в плазме. Метод более подробно описан в разделе 3.2.7.2,
а точная процедура, применяемая в экспериментах на животных, - в разделе 3.2.1.
Экспериментальная установка заключалась в интраназальном заражении двух групп по
пять бегунов
свиней высоковирулентным изолятом KSPV CSF0634 (на пять мл вирусосодержащего
4,75
Супернатант клеточной культуры). Инфекционная
КИД
доза
мл.
составляла
группа (группа
10
50 на
2) остался без лечения в качестве положительного контроля, который был передан другой
группе (группа 1).
3 Животные и материалы
ПЭГ-гирудин вводят подкожно 42 раза в день. Дозирование ПЭГ-гирудина проводилось
с использованием ЭСТ с целью получения уровня гирудина в плазме 0,5 -1,5 мкг / мл.
У животных обеих групп ежедневно отбирали около пяти мл венозной крови из наружной
яремной
вены.
Параметры
дифференциального
количество
анализатромбоцитов,
кровиобъем
(количество лейкоцитов,
и распределение
тромбоцитов) были
крови. Затем (цитратную) плазму извлекали и использовали в ЭСТ,
первоначально
определены
на
а также в различных анализах свертывания крови (глобальные тесты свертывания
крови,
основе собранной
определение содержания фибриногена). Кроме того, перед началом эксперимента,
на
цельной
десятый день после
заражения и в день эвтаназии было взято небольшое количество крови с ЭДТА (ок.
Затем его вводили для вирусологической диагностики (тесты на нейтрализацию вируса,
обнаружение вируса
с помощью клеточной культуры и полимеразной цепной реакции). Клинические симптомы
, включая температуру тела, регистрировались
и документировались с помощью стандартизированной схемы оценки. Продолжительность
эксперимента была определена клиническим течением заболевания
определено и составило 18 дней, измеренных со дня заражения. Материал органов (почки,
печень,
легкие, селезенка, лимфатические узлы) отбирали для последующей обработки для
световой
микроскопии и хранили в формалине.
2. Испытания на животных с пометкой:
Исследование патогенеза классической чумы свиней (КСП): фармакологическое
влияние на агрегацию тромбоцитов с помощью блокаторов АДФ-рецепторов и
ЦОГ-1Ингибиторы с целью выяснения роли взаимодействий тромбоцитов в
патогенезе классической чумысвиней.
Проект был зарегистрирован в окружном правительстве Ганновера под регистрационным
знаком 04/835
проведен. Целеполагание проекта можно охарактеризовать следующим образом:
Фармакологическое вмешательство с применением препаратов АСК и клопидогрела
(стр. 3.1.2) должно было оценить роль тромбоцитарных взаимодействий в патогенезе KSP
. Оба препарата необратимо ингибируют
агрегацию тромбоцитов различными путями и находят применение в медицине человека в
профилактике
тромбоэмболических осложнений, таких как сердечный приступ.
Мониторинг с помощью теста на агрегацию тромбоцитов был необходим для обеспечения
терапевтического уровня в плазме
. Это турбидиметрический метод, используемый для измерения
3 Материал и методы
растворимых
Индукторы срабатывалиАгрегация
43
тромбоцитов
стандартных
в
условиях. Более подробное описание метода приведено в разделе 3.2.4.7, точное описание
Процедура, описанная в разделе 3.2.1 об экспериментах на животных.
В ходе четырехдневного предварительного испытания эффективность активных
ингредиентов клопидогрела должна быть
(Iscover®) и АСК (АСК ратиофарм®), и должен быть разработан
режим дозирования. Для этой цели были помещены три
бегущие свиньи, которых лечили клопидогрелем и РАС в течение трех дней подряд (стр.
3.2.1). Эффективность была
проверена с помощью измерения агрегации тромбоцитов (стр. 3.2.4.7). На основе
полученных результатов был составлен график дозирования и переведен в режим,
указанный ниже
Проект интегрирован.
Экспериментальная установка основного испытания заключалась в интраназальном
заражении двух групп по шесть бегунов-свиней
немецкой породы ландрас высоковирулентным штаммом KSPV
CSF0634. Заражение происходило пятью мл вируссодержащего супернатанта культуры
клеток. Доза
4,5
вируса составила 10
КИД
50 на мл. Животные были рандомизированы по прибытии. в два
Группы разделены. Одну группу ежедневно лечили РАС и клопидогрелем, в то время
как контрольная группа не получала никаких лекарств. Обеим группам ежедневно
забирали около пяти мл
венозной крови из наружной яремной вены.
Гематологические параметры были первоначально определены из цельной крови,
полученной до центрифугирования.
Из
цитратной плазмы
а
и использовался в тестах на агрегацию
также в дальнейших
тромбоцитов,
исследованиях анализа свертываемости крови (глобальные тесты свертываемости крови,
определение содержания фибриногена). Кроме того, перед началом эксперимента, на
десятый день после
заражения и в день эвтаназии были взяты небольшие количества ЭДТА-крови и
нативной крови (ок. два мл), которые затем используются для вирусологической
диагностики в смысле
Были назначены тесты на нейтрализацию вируса и обнаружение вируса. Клинические
Симптомы , включаятемпературу
тела
, оценивались
с помощью стандартизированного
Схема оценки зафиксирована и задокументирована. Продолжительность эксперимента
была определена клиническими
Течение заболевания определено и составило 18 дней отмерено от дня заражения.
Материал органов (почки, печень, легкие, селезенка, лимфатические узлы) отбирали для
последующей обработки
для световой микроскопии и хранили в формалине.
3 Животные и материалы
44
В) Предварительные испытания, проведенные в помещениях АО „Фармакологическая
гемостазиология“
Медицинского факультета Йенского университета.
Для определения методов гемостазирования, выбора подходящих активных ингредиентов
и изучения фармакокинетики выбранных активных ингредиентов были проведены
предварительные
испытания в сотрудничестве с AG „Фармакологическая гемостазиология“ Медицинского
факультета
Йенского университета. Эффективность гирудина у свиней уже
была доказана (NOWAK and MARKWARDT, 1980b), активные ингредиенты, влияющие
на взаимодействие тромбоцитов, а также методы мониторинга, должны были быть
предварительно
протестированы.
Таким образом, различные
активные ингредиенты, обычно используемые в медицине
человека, были сначала протестированы в
пробирке, а затем в различных составах, типах применения и дозировках
на свиньях, находящихся под наркозом, и их эффекты были изучены с помощью тестов на
агрегацию тромбоцитов
с использованием различных индукторов.
При этом постоянно контролировались параметры системы свертывания крови и
гематологические параметры. Только фармакологически
эффективные вещества с достаточной эффективностью у свиней продолжали
тестироваться.
Испытанные активные ингредиенты и используемые экспериментальные подходы более
подробно описаны в разделе 3.2.5
.
3.1.2
Фармакологически эффективные вещества
Коммерчески доступные препараты, полученные в медицине человека, были
использованы в экспериментальном проекте с использованием клопидогрела и
АСК. Клопидогрель использовался в
составе фармацевтической компании Bristol-Myers Squibb Pharma EEIG, Хаунслоу,
Великобритания
. Таблетки с пленкой, доступные под торговой маркой Iscover®, содержали по
75 мг клопидогрела в виде клопидогрела гидросульфата каждая. АСС нашел применение в
рецептуре компании
Fa. Ratiopharm GmbH, Ульм. Таблетки ASS-ratiopharm® 500 содержали
по 500 мг ацетилсалициловой кислоты в каждой.
ПЭГ-гирудин, использованный в эксперименте, а также
экарин, необходимый для проверки уровня в плазме, были любезно предложены
профессором Дж. Предоставлено Гетцем Новаком
(ООО „Фармакологическая гемостазиология“ Медицинского факультета Йенского
университета).
Из экарина готовили готовый к использованию реагент экарин, который хранили в
лиофилизированном
и охлажденном виде до готовности к применению (стр. 3.2.7.2).
3 Материал и методы
3.1.3
45
Сбор и подготовка образцов крови
Коммерчески доступные
®
пробирки для забора крови и адаптерные системы Fa. KABE
Компания
были разработаны
Labortechnikдля
GmbH,
забора
крови из яремной вены.
Nümbrecht-Elsenroth, использовала. Для забора крови животных использовали два
Вспомогательные лица зафиксированы на спине. В зависимости от предполагаемого
использования кровь, взятая без загрязнения, всасывалась в соответствующие пробирки
для забора крови
и, таким образом, получалась нативная кровь, ЭДТА или цитратная кровь.
Образцы крови с ЭДТА для определения дифференциального анализа крови были сданы в
тот же день
без дальнейшего уточнения результатов обследования. Переработка ЭДТАОбразцы крови для сбора лейкоцитов для выделения
вируса описаны в разделе 3.2.2.3. Образцы крови для получения сыворотки из нативной
крови центрифугировали при
1215 x г в течение 15 мин, полученную сыворотку помещали в криотрубки (см. Выше).
Гринер, Нюртинген)
и хранить при -80 ° C до дальнейшей обработки. Для глобального анализа
свертываемости, а также для определения уровня фибриногена (стр. 3.2.4.1-3 и 3.2.4.5)
образцы цитратной крови центрифугировали при 437 x г в течение 10 мин, а супернатант
разделяли
на криотрубки. Для исследования параметров свертывания плазму можно было
подвергнуть глубокой заморозке при -80 ° C
в течение нескольких недель, но для теста на гелеобразование этанолом (стр. 3.2.4.6) ее
необходимо было
немедленно обработать. Образцы цитратной крови для анализа
на агрегацию тромбоцитов сначала центрифугировали для получения богатой
тромбоцитами плазмы при 31 x g в течение 20 мин (без торможения)
. Супернатант осторожно удаляли, а остаток
центрифугировали при 941 x g в течение 15 мин для получения плазмы с низким
содержанием тромбоцитов. Полученный там супернатант
также подвергали дозированию и разливали в криогенные пробирки.
3.1.4
Вирусы
Для всех попыток заражения в рамках этой работы использовался изолят KSPV с
номером базы данных CSF0634. Этот изолят был выделен в 1999
году от домашней свиньи из Нижней Саксонии и отнесен к генотипу 2,3 * Кельцен
(WONNEMANN et al., 2001). База данных EURL, защищенная паролем, доступна в
Интернете
по адресу:
http://viro08.tihohannover.de/eg/eurl.virus.db.htm в
данным о происхождении, он также содержит информацию
дополнение ко генетической
классификации, а также последовательности
3 Животные и материалы
46
выбранных участков вирусного генома. Изолят CSF0634 был классифицирован как
высоковирулентный (FLOEGEL-NIESMANN et al., 2003).
В качестве эталонного штамма в тестах на нейтрализацию вируса и в качестве
положительного контроля в выделениях
вируса был использован штамм KSPV Alfort 187 . Этот вирус можно найти в базе данных
под
номером CSF0902 и относится к генотипу 1.1. Тесты на нейтрализацию вируса включают
Обнаружение перекрестно реагирующих антител проводили с использованием
лабораторного штамма BVDV NADL и
штамма BDV Moredun.
3.1.5
Диагностические антитела
Обнаружение KSPV в клеточных культурах проводилось с использованием
моноклонального,
Антитела
специфичного
(мАК) для
BVDпептивируса
/ C16.
Антитело
направлено
против
неструктурного белка NS2-3 всех пестивирусов (GREISER-WILKE et al., 1992b) и
было получено в Институте вирусологии Высшей ветеринарной школы Ганновера
(ПЕТЕРС
et al., 1986; MOENNIG et al., 1987). Он обычно используется в EURL
для диагностики чумы свиней. Для этого моноклональное антитело
(mAk) вводят в сочетании с пероксидазой (конъюгат C16-PO).
3.1.6
Клеточные линии
Для всех работ по культивированию клеток с использованием KSPV и KSPV
была использована
соответственно.
дляпостоянная
серологических
линияисследований
клеток свиньи PK (15) A (percine kidney (15)
Amsterdam)
. Линия эпителиоидных клеток обычно используется в EURL при диагностике KSP
. Она была получена в 1974 году путем клонирования отдельных клеток (ЛЕСС, личный
Уведомление). Клеточная линия регулярно проверяется на наличие микоплазмы и не
содержит
пестивирусов. Выращивание описано в разделе 3.2.2.1.
Серологические исследования для выявления нейтрализующих антител к BDV
проводились на линии клеток тимуса постоянного вала (SFT-R), которая была получена из
банка клеток Института Фридриха Леффлера (Федеральный исследовательский институт
здоровья животных)
и хранится там под каталожным номером 43.
Серологическая проверка подопытных животных на наличие антител к BVDV проводилась
на
первичных клетках почек плода теленка (FKN) (FREY and LIESS, 1971).
3 Материал и методы
3.1.7
47
Прочие материалы
Рецепты используемых сред, буферов, растворов и реагентов, а также
происхождение необходимых для этого химических веществ перечислены в Приложении
ниже и 8.3.
Коммерчески доступные реагенты для диагностики коагуляции,
наборы для иммуноферментного анализа (ИФА), а также реагенты для анализа агрегации
тромбоцитов
можно найти в приложении под номером 8.5. Перечень оборудования и
предметов использования указан под номером 8.6. Расходные материалы составлены в
соответствии с пунктом 8.7
.
3 Методы
3.2
Методы
3.2.1
Лечение подопытных животных и клинические параметры
48
3.2.1.1 Применение и дозировка используемых фармацевтических препаратов
Клопидогрель и АСК вводили животным перорально. Для обеспечения всасывания
таблетки были мелко измельчены и пропущены через одноразовый шприц объемом 20 мл.
®
(Терумо , Terumo Германия ГмбХ, Эшборн) вводится с помощью ОС. Дозировка была
снижена до 500 мг ацетилсалициловой кислоты и 75 мг клопидогрела на дозу в
соответствии с рекомендациями предварительных испытаний.
Животное и день установлены. После предварительной настройки в основном
эксперименте на животных было обнаружено,
что эта дозировка была установлена слишком низкой в долгосрочной перспективе. Таким
образом, дозировка
ацетилсалициловой кислоты была увеличена до 1000 мг на животное в день, а доза
клопидогрела - до
150 мг на животное в день.
ПЭГ-гирудин вводили в виде подкожной инъекции в брюшную стенку и брюшную полость
соответственно. аппликируется в
области шеи. Для аппликации был использован одноразовый шприц объемом два мл с
насадкой 22 г
®
Канюля (обе терумо, Terumo Германия ГмбХ, Эшборн). Через два часа
после введения ПЭГ-гирудина был взят образец крови для определения
уровня гирудина в плазме и исследован с помощью ЭСТ (стр. 3.2.7.1). Дозировка
ежедневно корректировалась индивидуально в зависимости от уровня гирудина в плазме.
Начальная доза составляла
пять мг ПЭГ-гирудина для всех бегунов. Терапевтический уровень гирудина в плазме
должен
составлять от 0,5 до 1,5 мкг / мл.
3.2.1.2 Определение клинической оценки по данным MITTELHOLZER et al. (2000)
Оценка и документирование клинических симптомов проводились ежедневно в ходе
испытаний в
соответствии со стандартным протоколом, который используется в EURL.
Схема обследования основана на документировании клинических проявлений
с использованием балльной системы (MITTELHOLZER et al, 2000). Это включало девять
соответствующих KSP параметров (бодрость, осанка, состояние питания, дыхание,
походка, кожа,
глаза / конъюнктива, аппетит и объем фекалий), в зависимости от степени выраженности,
с оценкой
от нуля до трех (без особых результатов (о.Б.Б., +, ++ и ++++). Сложение
начисленных баллов дало клинический балл (clinical score) животного. максимальная
3 Материал и методы
49
оценка составила 27 баллов. Клинический балл (CS) был рассчитан как для
отдельного животного, так и задокументирован как среднее значение по группе. Схема
исследования
МИТТЕЛЬХОЛЬЦЕР и соавт. (2000) включает десятый параметр, „корм в кормушке“,
который
невозможно было рассчитать для отдельного животного из-за
условий содержания (группового содержания) и, таким образом, обычно не
документировался.
3.2.1.3 Определение температуры тела
Температуру тела измеряли один раз в день у каждого животного с помощью цифровой
шкалы.
Жаропонижающий термометр (Geratherm®plus, Geratherm Medical AG, Geschenda)
обнаружен
и задокументирован ректально.
3.2.1.4 Выявление патологоанатомических изменений
По аналогии с определением КС
, стандартизированная схема обследования использовалась для сбора
патологоанатомических данных. В соответствии с данными, разработанными
FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003) для расчета патологической оценки
Схема обследования все системы органов были обследованы и приведены в соответствие с
EURL
Протокол по умолчанию зафиксирован. Особое внимание уделялось коже, подкожной
клетчатке и серозам,
лимфатическим узлам, миндалинам, селезенке, почкам, подвздошной кишке, включая
илеокаэкальный клапан, прямую кишку, а также
Сердце и дыхательные пути.
3.2.2
Вирусологические методы
3.2.2.1 Метод культивирования клеток
Для рутинных процедур вирусологической и серологической диагностики были назначены
ПК (15) А
2
Клетки выращивают и пассируют. Культивирование клеточной линии проводили на
расстоянии 75 см
Пластиковые бутылки для культивирования клеток с использованием Eagles Minimum
Essential Medium
(EMEM) с добавлением 5% сыворотки плода теленка (FKS) в инкубаторе при 37 ° C.
FKS был выпущен на свободу перед использованием от чумных вирусов и был направлен
против них.
Исследованы антитела. Культуру клеток контролировали макроскопически и
микроскопически через регулярные промежутки
времени. Через три-четыре дня клеточный дерн был слит, и
можно было провести еще одну пассировку. Для пассирования поддерживающую
среду удаляли и промывали клеточную дернину пятью мл скорректированного трипсина
vers (ATV)
. Была проведена вторая стадия промывки с использованием пяти мл ATV с короткой
инкубацией.
3 метода
50
После ок. Примерно через 30 секунд квадроцикл был удален и заменен двумя мл свежего
квадроцикла.
Теперь была проведена инкубация при 37 ° C в течение 15-20 минут для отслоения
клеточного дерна.
Теперь отделенные клетки ресуспендировали в восьми мл культуральной среды (EMEM с
5% FKS)
и по возможности полностью разделяли путем многократного пипетирования вверх и
вниз.
Количество ячеек определяли с помощью счетной палаты Thoma (Heiland Vet GmbH,
Гамбург).
6
Целевое количество ячеек для посева в новую бутылку составлялоСоты.
1,6 x 10
Соответствующий объем клеточной суспензии, содержащий желаемое количество клеток,
переносили
в новую культуральную колбу и наполняли примерно 20 мл поддерживающей среды.
Для посева клеточной суспензии в пробирки для культивирования клеток, макро- или
микротитровые
планшеты соответствующий объем клеточной суспензии сначала доводили до
необходимого
Общий объем заполняют питательной средой и вместе с ней отправляют в
соответствующие сосуды для культивирования.
Культивирование клеточной линии SFT-R проводилось аналогично культивированию
клеток PK (15) A, но с использованием поддерживающей среды EDulb (EMEM,
с
использованием поддерживающей
среды EDulb
(EMEM,клетки,
модифицированной
по образцу
модифицированной
по образцу DULBECCO
и FREEMAN).
но
DULBECCO и FREEMAN
[1959]) и надбавкой в размере десяти% ФКС.
Клетки FKN выращивали из первичных культур, замороженных при-80 ° C.
Пассирование проводилось в течение трех-четырех дней для готовой к употреблению
культуры.
Для этого клетки отделяли 0,125% раствором трипсина Версена, однократно промывали
фосфатно-солевым раствором минус (фосфатно-солевой раствор без кальция и магния,
PBSM), центрифугировали при 200 x г в течение 10 мин и помещали клеточные гранулы в
EDulb
Поддерживающая среда ресуспендирована. Затем ячейки были помещены в счетную
камеру после
Thoma (Heiland Vet GmbH, Гамбург) отсеивают и высевают в соответствующие
емкости для культивирования и добавляют консервирующую среду.
3.2.2.2 Размножение и сбор вирусов
Для использования в экспериментах на животных или в экспериментах на животных,
соответственно. в тестах на нейтрализацию вируса для
серологической диагностики, изолят KSPV CSF0634 необходимо было размножать и
накапливать.
2
Культивирование вируса осуществляли на PK (15)A клетки
флаконах
в 25 см для культивирования
клеток. Посев
5
ячеек производился с размерами
Соты. На
4,2полусогнутую
x 10
клеточную дернину флакона для
культивирования клеток, нанесенного накануне
, после удаления среды наносили один мл вирусосодержащей жидкости.
3 Материал и методы
51
Супернатант клеточной культуры, верифицированный. В течение одного-двух часов
адсорбции при
37 ° C флакон несколько раз переворачивали. для достижения равномерного
распределения и
адсорбции вируса. Затем добавляли около семи мл поддерживающей среды.
(EMEM с 10% FKS) и помещают культуру в инкубационный период при 37 ° C в течение 72
часов
. Для высвобождения вируса из клеток включался цикл замораживания-оттаивания.
Для этого флакон с культурами клеток замораживали при температуре -80 ° C
и быстро размораживали не ранее, чем через час. Смесь клеток и вирусов теперь
переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 4 ° C в течение 15 мин
при 437 x g для отделения клеточных компонентов
. Супернатант сцеживали и замораживали порциями по 0,5 мл при -80 ° C.
Перед использованием полученной таким образом вирусной партии в исследованиях на
животных было проведено
трехкратное титрование вируса для определения титра вируса (стр. 3.2.2.4).
3.2.2.3 Выделение вируса
Выделение вируса из фракции лейкоцитов на сегодняшний день остается „золотым
стандартом“ для
лабораторного диагностического выявления KSPV (АНОНИМ,2004). Отделение фракции
лейкоцитов происходит путем добавления раствора ЭДТА-декстрана. Лейкоциты
связываются с декстраном и остаются в супернатанте после осаждения эритроцитов, где
их
можно удалить.
Через Верификация
восстановленной
суспензии лейкоцитов (S.u.) на PK(15)A клетки осуществляли размножение и обнаружение
вируса, который мог присутствовать. Обычно размножение происходит в течение двух
Отрывки выполнены.
Для отделения фракции лейкоцитов к примерно десяти мл крови с ЭДТА добавляли 0,5 мл
стерильного раствора
Добавлен раствор ЭДТА-декстрана. Осторожное перемешивание
перемешало ингредиенты. Затем этот подход инкубировали при комнатной температуре в
течение одного-трех часов
, пока не осела отчетливая яркая фаза. Этот
супернатант, содержащий лейкоциты, осторожно удаляли с помощью пипетки и
переносили в пробирку. После десятиминутного центрифугирования при 437 x g
лейкоциты были видны в виде гранул на
дне пробирки. После удаления супернатанта гранулу ресуспендировали в трехпяти мл PBSM и снова центрифугировали в вышеуказанных условиях.
Процесс повторялся в общей сложности три раза. Наконец, гранулу лейкоцитов помещали
в два мл PBSM, разделяли на две порции и замораживали при-80 ° C в
криогенных пробирках.
3 метода
52
Первый пассаж для размножения вируса произошел в пробирках для культивирования
клеток.
Для этой цели в пробирки для культивирования клеток высевали клетки PK (15) A и
инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Посев ячеек, по подсчетам счетной палаты
Тома,
составил примерно 8,5 раз
4
10 Соты. После удаления поддерживающей среды полусферическую клеточную дерновину
обрабатывали
200 мкл повторно размороженной суспензии лейкоцитов инокулируют. В качестве
положительного контроля
6,5были
взяты две пробирки с культурой,
ребенка.
содержащие
штамма
около 10
Alfort 187 (CSF0902) инокулировали,
50 эталонного
две пробирки несли в качестве отрицательного контроля без инокуляции. После одного
Время адсорбции от одного до двух часов при 37 ° C каждую пробирку для
культивирования промывали дважды
1,5 мл PBSM, а затем промывали одним мл питательной среды (EMEM с
с добавлением антибиотиков и 10% FKS). Инкубационный период 72 часа
после этого был проведен цикл замораживания-оттаивания для высвобождения
размноженного вируса. Для этого
культуру клеток замораживали при-80 ° C не менее чем на час. После быстрого
В процессе оттаивания пробирки центрифугировали при 941 x g в течение десяти минут.
Для второго пассажа выделения вируса затем каждые 200 мкл супернатанта помещали в
лунки макротитировочной пластины, в которую клетки PK (15) A
6
высевали накануне. Посев клеток составил
Соты.ок.
В дополнение
1,6 х 10
к проверке положительного
контроля из первого пассажа, около 10
6,5
KID50 Alfort 187 были снова инокулированы в
две полости
. Инокулированные и обработанные культуральной средой (EMEM с добавлением
антибиотиков и 10%
Макротитировочные планшеты с наполнителем (FKS) инкубировали при 37 ° C в
инкубаторе в течение 72 часов с
фумигацией
CO
KSPV проводили на термофиксированной макро2(4%). Обнаружение
титровальной пластинке с помощью прямого иммунного (пероксидазного) окрашивания
(DIF) (стр. 3.2.2.6).
3.2.2.4 Титрование вирусов
Для определения титра вируса вирусной суспензии титрование проводили методом
конечного разведения в микротитровых планшетах. Ряды разведения
Выложено от
-8 -1
были записаны
в журнал
из 10 до 10 и протестировано в четырехкратном подходе. Для этого
10-Этапы
каждые четыре полости микропланшета были заполнены по 100 мкл разбавленного
раствора в каждой.
Поставляются вирусные суспензии. Для проведения контроля клеток в каждую из четырех
колонок
микропланшета вводили 100 мкл среды (EMEM с 10% FKS и добавлением антибиотиков)
6
в виде пипеток. После этого каждые 50 мкл добавляли по одному,
Клетки прекращают,
до 1,6 x 10
добавляют клеточную суспензию. Инкубацию проводили во влажной камере при 37 ° C в
инкубаторе с 4%-ной атмосферой
CO
72 часов. По истечении этого времени
2в течение
3 Материал и методы
53
микропланшета подвергают термофиксации при 80 ° C в течение трех часов и удаляют
вирусный антиген с помощью DIF
(3.2.2.6) доказано. Расчет титра в ДЕТСТВЕ
50 на 100 мкл было получено по оценочной
формуле КЕРБЕРА (1931).
log KID.
50= L
1,0 - Lint (S-0,5)
С:
Л1,0 = Логарифм наивысшей степени разбавления со скоростью реакции 1,0
Лint = Логарифм интервала разведения
S = Сумма скоростей реакции, начатых при последней скорости реакции, которая
составляет 1,0
Партии вирусов, предназначенные для использования в экспериментах
на животных, титровали и рассчитывали в течение трех разных дней.
3.2.2.5 Тест на нейтрализацию вируса
Качественное и количественное обнаружение нейтрализующих антител (nAk) к
вирусу KSP в сыворотке крови экспериментальных животных проводили с помощью теста
на нейтрализацию вируса (VNT)
. Принцип тестирования основан на инкубации серии разведений тестируемого
Сыворотки с определенным количеством вируса. После верификации вирусносывороточной смеси в
восприимчивую клеточную культуру обнаружение вируса проводится методом DIF (стр.
3.2.2.6). Если в образце
сыворотки присутствовал nAk, вирус был полностью нейтрализован или до определенной
степени разбавления, то есть обнаружение вируса в DIF было невозможно. Затем,
основываясь на
серииразведений
, можно
определить титр
выраженный
антител, в
нейтрализационной
дозе.
50 (ND
50), с использованием формулы КЕРБЕРА (1931 г.)
рассчитать. ND
- это разведение, при котором все еще остается 50% восприимчивого
вещества.
Клеточная культура защищена от заражения соответствующим тестируемым вирусом.
50
В ходе испытаний VNT использовался для двух различных целей.
С одной стороны, в начале эксперимента было продемонстрировано, что соответствующие
животные не обладают nAk
против пестивирусов, с другой стороны, сыворотку
тестировали на наличие nAk со дня эвтаназии.
Только что отремонтированный или отремонтированный соответственно. оттаявшую
сыворотку разбавляли непосредственно в микропланшете
для титрования. Все тесты проводились с использованием двойного подхода. Для первой
стадии
разведения использовали 80 мкл поддерживающей среды (EMEM с 10% FKS и
добавлением антибиотиков) и 20 мкл
3 метода
54
Сыворотку помещают в каждую из двух лунок первого ряда микропланшета и
хорошо перемешивают, пипетируя вверх и вниз. Таким образом, начальное разведение
составляло 1: 5.
50 мкл среды вводили во все необходимые дополнительные лунки планшета для
микротитрирования.
Теперь с помощью двенадцатиканальной2-пипетки
Серия разведения
был создансыворотки
журнал наносится таким
образом, что за раз отбирается 50 мкл из предыдущей стадии разведения, и в следующую
Ряд полостей были пипетированы. Таким образом, после выброса 50 мкл из последнего
ряда
полостей образовался ряд разведения сыворотки от 1: 5 до 1:640. соответствующий
Тестируемый вирус был настолько поглощен в среде (EMEM с 10% FKS и добавлением
антибиотиков),
что суспензия вируса составляла
около
50около
µl,
200d.h.
КИД.
100 KID
Онмкл.
содержал
50/100
50, теперь
были добавлены к сывороточным разбавителям. После одного часа инкубационного
периода при 37 ° С
в инкубаторе с 4% атмосферой
CO камере
2во влажной
6.
к суспензии клеток добавляли 50 мкл, доведенной
Количество
до клеток
1,6 x 10/ мл было скорректировано.
Одна
Был проведен отрицательный контроль, содержащий исключительно среду (EMEM с 10%
FKS и добавлением антибиотиков)
и клетки. Чтобы проверить достоверность теста
0
, введенную вирусную суспензию подвергли обратному титрованию, то есть
до применяли
4
серию
разведений
от 10в каждую из 4 полостей в соответствии с принципами, описанными
10 и вводили
по одной
выше.
Вирусное титрование (стр. 3.2.2.4). Выявленное таким образом, фактически
использованное
Доза вируса считалась допустимой, если у вас было от 30 до 500 детей.
50/50 мкл лаг.
Наряду с этим обратным титрованием было проведено вирусное титрование развернутой
вирусной партии. для сопоставления значений и выявления любых источников ошибок.
Пластины помещали во влажную камеру при 37 ° C в инкубаторе в течение 72 часов с
4% CO 2инкубируется в атмосфере. После термофиксации замкнулся прямой
Иммуноокрашивание (стр. 3.2.2.6). Расчет НД
50
было произведено по формуле после
КЕРБЕР (1931).
3.2.2.6 Прямое иммуноокрашивание (анализ, связанный с пероксидазой, PLA)
Обнаружение антигена KSPV проводилось в термофиксированных микро- и
микроэлементах, соответственно. Макропланшеты для
прямого окрашивания иммунопероксидазой (SAUNDERS, 1977) конъюгатом PO mAks
BVD / C16, который специфичен для пептивируса (стр. 3.1.5).
Для термофиксации питательную
среду удаляли из полостей соответствующих пластин с помощью вакуумного насоса, а
дерн для клеток промывали 1/3 PBS
(физиологический раствор сфосфатным буфером, физиологический раствор с
фосфатным буфером) один раз. Фиксация
3 Материал и методы
55
пластин затем помещали в стерилизатор горячим воздухом при температуре 80 ° C в
течение трех часов.
Перед окрашиванием газон с остывшими клетками снова смачивали PBS-твином (PBS с
добавлением
0,1% Tween20) перед процессом окрашивания. Теперь на каждую лунку микропланшета
было пипетировано 50 мкл, а на каждую
лунку макропланшета - 200 мкл используемого конъюгата. Разведение
конъюгата было направлено после партии конъюгата BVD / C16-PO и
варьировалось от 1:150 до 1:500 в режиме анимации PBS. После инкубационного периода
продолжительностью один
час при 37 ° C конъюгат удаляли, а клеточный дерн промывали три раза с помощью PBSTween, а
также один раз с помощью Aqua bidestillata (A. bidest.) для
удаления несвязанного конъюгата. Раствор хромогенного субстрата содержал 3-амино-9этилкарбазол (AEC) в
Исходный раствор диметилформамида AEC, буфер ацетата натрия, а также 3% перекись
водорода
(H
2O2), и каждый из них был свежеприготовленным. Полости пластин были
заполнены
50 мкл (микротитровальная пластина) и 50 мкл в каждой соответственно. 200 мкл
(макротитировочная пластина) этого раствора субстрата
покрывают слоем и выдерживают при комнатной температуре от десяти
до 20 минут.
2O2
Таким образом, H
служил субстратом пероксидазы. Превращение субстрата привело к образованию краснокоричневого цвета
Осаждение в области цитоплазмы инфицированных клеток. Оценку пластин
проводили в световой микроскоп после удаления раствора субстрата, промывки два раза и
заполнения A. bidest. Полость считалась „положительной“, если цитоплазма одной или
двух полостей была заполнена соответственно.
несколько клеток, но ядро клетки было неокрашенным.
3.2.2.7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Помимо
теста
на нейтрализацию
проведены
ИФА
вируса,
два
антител
были
к
Обнаружение антител используется в образцах сыворотки. Это были:
• ЧЕКИТ-CSF-Sero (ранее Dr. Bommeli AG, Либефельд-Берн, Швейцария)
• Classical Swine Fever Virus (CSFV) Antibody Test Kit, HerdChek (IDEXX
Лаборатории, Веррштадт)
Оба тестовых набора использовались в соответствии со спецификациями производителя.
В
рамках
предварительных
испытаний
также было проведено
ИФА антигена
следующее
после
Используемый протокол производителя:
• Набор для тестирования на антиген CSFV, HerdChek (IDEXX Laboratories,
Веррштадт)
3 метода
56
Значения экстинкции образцов и контролей измеряли в считывателе ELISA (Spectra II,
Lab Instruments, Австрия), оценивали и проверяли в соответствии со спецификациями
производителя.
3.2.2.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
В экспериментах с ограниченным объемом
выборки по соображениям благополучия животных доказательства успешной инфекции
были получены с помощью ПЦР. Поскольку доказательства
отсутствия пестицидов были
®
начала испытаний, было обнаружено исключительно одно
Проведена
SYBR зеленая
получены до
полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦРс обратной транскрипцией) в реальном времени с
праймерами панпести 324 и 326
(VILCEK, 1994), которая амплифицировала фрагмент размером 288 п.н. 5`-NTR области
генома пест-вируса. Вся ПЦР была выполнена на ПЦР-машине MX 4000 (Стратагена, ЛаХойя,
Калифорния, США). Ампликон, полученный во время ПЦР, анализировали в
®
режиме реального времени
Окрашивали
с помощью
в зеленый
SYBR. цвет и измеряли возникающую
флуоресценцию на
длине волны 520 нм. Ожидаемая температура плавления ампликона
составляла 85 ° C. Ниже более подробно описаны выделение РНК, обратная транскрипция
и ПЦР
.
Выделение РНК
Выделение РНК из образцов ЭДТА и ДНК, соответственно. Образцы цитратной крови были
взяты с использованием крови QIAamp
Мини-комплект (Qiagen GmbH, Hilden) по спецификации производителя.
Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Синтез комплементарной ДНК (кДНК) и ПЦР проводили в одном подходе (
однотрубная двухферментная система). Праймеры, согласно VILCEK et al. (1994),
обладали следующими последовательностями
(в скобках указаны локализации праймеров в геноме пест-вируса (нуклеотиды, nt)
):
Грунтовка 5`-ATG-CCC-(AT)TA-GTA-GGA-CTA-GCA-3`
324
(nt 107-127)
Primer 3265`-TCA-ACT-CCA-TGT-GCC-ATG-TAC-3` (nt 376-396)
3 Материал и методы
57
®
Основная смесь содержала следующие компоненты для каждого образца: 25 мкл
количественного SYBR
Green RT-PCR Mastermix (Qiagen GmbH, Hilden), по одному мкл (30 пмоль) праймеров
324 и 326, 0,5 мкл обратной транскриптазы и 16,5
мкл
мкл
H тщательно перемешанной
2O. 44
основной смеси и шесть мкл РНК помещали в реакционные сосуды и помещали в ПЦР.
Машина потрачена впустую. Условия реакции выглядели следующим образом:
50 ° C
30 мин
Обратная транскрипция
95 ° C
15 min
Aktivierung der Polymerase
95°C
15 sec
56°C
30 sec*
72°C
30 sec
81°C
15 sec*
x 40 Zyklen
* Messung der Fluoreszenz
Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte computergestützt.
3 Methoden
3.2.3
58
Hämatologische Methoden
3.2.3.1 Parameter des weißen Blutbildes
In den Experimenten zur Untersuchung der klinischen, hämatologischen, hämostaseologischen sowie (histo-)pathologischen Veränderungen wurden die Parameter des weißen
Blutbildes mit dem halbautomatischen Sysmex F-800 System (Sysmex Deutschland GmbH,
Norderstedt) erhoben. Gleiches gilt für das Versuchsvorhaben zur Rolle des plasmatischen
Gerinnungssystems.
Für das Versuchsvorhaben zur Untersuchung der Thrombozyteninteraktionen wurden die
Messungen mit dem mölab Hämatologie-System Modell 8702/6 (Fa. Mölab, Hilden)
durchgeführt. Mit diesem System wurde ausschließlich die Gesamtleukozytenzahl in [G/l]
nach Herstellerangaben bestimmt. Die Dokumentation und Auswertung der ausgegebenen
Ergebnisse erfolgte manuell.
3.2.3.2 Thrombozytenparameter
Die Messung der Thrombozytenparameter erfolgten mit dem halbautomatischen Sysmex
F-800 System (Sysmex Deutschland GmbH, Norderstedt) Die ermittelten Parameter und
Referenzbereiche sind in Tabelle 3-1 dargestellt.
Tabelle 3-1: Thrombozytenparameter, die im Rahmen der Versuchsvorhaben mittels Sysmex F-800
untersucht wurden. Der Parameter Large Platelets wird auch im deutschsprachigen Bereich nicht
übersetzt, daher wird auch hier der englische Begriff verwendet.
Parameter
Einheit
3
Referenzbereich
Thrombozytenzahl (PLT)
10 /µl
138,2 – 467,8
Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV)
fl
6,8 – 12,6
Large Platelets
3
10 /µl
nicht bekannt
Im Rahmen des Versuchsvorhabens zur Untersuchung der Thrombozyteninteraktionen
wurden die Messungen mit dem mölab Hämatologie-System Modell 8702/6 (Fa. Mölab,
Hilden) durchgeführt. Es wurde ausschließlich die Thrombozytenzahl in [G/l] nach
Herstellerangaben bestimmt.
3 Material und Methoden
3.2.4
59
Hämostaseologische Methoden
Global- bzw. Gruppentests der Blutgerinnung
Die Global- oder Gruppentests sind Screeningmethoden, die bestimmte Bereiche des
plasmatischen Gerinnungssystems überprüfen, d.h. intrinsischen und extrinsischen Pfad sowie
die gemeinsame Endstrecke. Zur Beurteilung der verschiedenen Anteile werden
stellvertretend der Quick-Wert (Synonyme: Thromboplastinzeit bzw. Prothrombinzeit) für
den extrinsischen Pfad, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit für den intrinsischen Pfad
und die Thrombinzeit für die gemeinsame Endstrecke gemessen.
Für die Durchführung der Globaltests wurde das Kugelkoagulometers KC 4 A der Fa.
Amelung, Lemgo. Bei dieser Meßmethode befindet sich der Gerinnungsansatz in leicht
schräg gelagerten Küvetten, die sich um die eigene Achse drehen. Eine dem Ansatz
zugegebene kleine Edelstahlkugel läuft vor Eintritt der Gerinnung an vorgegebener Stelle.
Gerinnt der Ansatz, verbleibt die Kugel nicht mehr an dieser Stelle, sondern wird durch die
Fibrinfasern mitgezogen. Die Lageänderung der Kugel wird von einem magnetischen Sensor
aufgenommen und elektronisch registriert.
3.2.4.1 Prothrombinzeit (Quick-Test)
Die Messung der Prothrombinzeit erlaubt eine Einschätzung des extrinsischen Weges der
Blutgerinnung. Dabei werden die Faktoren II, V, VII und X erfasst. Das Testprinzip beruhte
auf der Gerinnungsaktivierung durch die Inkubation der Plasmaproben mit einer definierten
Menge Thromboplastin und Calcium. Es wurde die Zeit bis zur Bildung eines
Fibringerinnsels gemessen.
Zur Bestimmung der Prothrombinzeit im Citratplasma der Schweine wurde Thromborel® S
der Fa. DADE Behring (Marburg) in einem nach MISCHKE modifizierten Protokoll
eingesetzt (MISCHKE, persönliche Mitteilung). Für die Testdurchführung wurde das frisch
entnommene Citratblut zentrifugiert aliquotiert, und bis zum Verbrauch bei -80°C gelagert.
Direkt vor dem Test wurden die Proben rasch im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und innerhalb
®
einer Stunde gemessen. Das Thromborel
S Reagenz wurde durch Zugabe der vom Hersteller
angegebenen Menge A. bidest. rekonstituiert und vor Gebrauch auf 37°C vorgewärmt sowie
mindestens 30 min bei dieser Temperatur gehalten.
3 Methoden
60
Zur besseren Differenzierung des physiologischen und pathologischen Bereichs wurde eine
Verdünnung der Plasmaproben mit Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (Fa. DADE
Behring, Marburg) vorgenommen (NOWAK; MISCHKE, persönliche Mitteilungen). Zu
diesem Zweck wurden die Proben nach Optimierung anhand einer Eichkurve 1:10 mit der
Pufferlösung verdünnt. Um trotz Verdünnung des Plasmas die Bildung eines ausreichend
festen Gerinnsels zu gewährleisten, wurde dem Gerinnungsansatz plasminogenarmes
humanes Fibrinogen (FIB 1 der Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen) in einer Konzentration
von 2 g/l zugesetzt (MISCHKE, persönliche Mitteilung). Dazu wurde das lyophilisierte
Fibrinogen unter ständigem Rühren vorsichtig in A. bidest. gelöst und in 1000 µl Aliquots bei
–20°C eingefroren. Erst direkt vor dem Gebrauch wurde es rasch wieder aufgetaut und
eingesetzt.
Der eigentliche Testansatz sah folgendermaßen aus: 100 µl der verdünnten Probe wurden mit
100 µl Fibrinogenlösung eine min bei 37°C inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 100 µl
®
Thromborel S wie auch die Messung und Protokollierung der Gerinnungszeit. Zur
Evaluierung des Tests wurden täglich die Gerinnungszeiten an humanem Kontrollplasma und
gepooltem Plasma gesunder Schweine überprüft (Kontroll-Plasma N, Fa. DADE Behring,
Marburg).
3.2.4.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)
Die Messung der aPTT erlaubte eine schnelle Aussage zur Funktion des intrinsischen Pfades
des plasmatischen Gerinnungssystems; sie erfasst die Faktoren VIII und IX sowie die
Kontaktfaktoren. Das Prinzip der Meßmethode beruhte auf der Aktivierung des intrinsischen
Pfades durch Inkubation des Plasmas mit Phospholipiden und einem Oberflächenaktivator.
Durch Zugabe von Calcium-Ionen wurde der Gerinnungsvorgang ausgelöst.
Zur Bestimmung der aPTT im Citratplasma der Schweine fanden zwei verschiedene
®
Reagenzien Verwendung. Zum einen das Pathromtin
der Fa. DADE Behring (Marburg),
®
zum anderen das Actin FS derselben Firma. Der Wechsel der Reagenzien war darin
®
begründet, dass die Fa. DADE Behring Pathromtin
zugunsten eines Nachfolgeproduktes
®
vom Markt nahm. Das neue Testsystem (Pathromtin SL ) war jedoch nicht für
Schweineplasma geeignet.
3 Material und Methoden
61
Für die Testdurchführung wurde das frisch entnommene Citratblut bei 1215 x g für zehn min
zentrifugiert und danach sofort in kleinen Aliquots (600-1000 µl) bei –80°C eingefroren.
Direkt vor dem Test wurden die Proben rasch aufgetaut und innerhalb einer Stunde gemessen.
Die Verwendung von Pathromtin® erfolgte nach Herstellerangaben. Das aufgeschüttelte
Aktivator-Reagenz wurde in das Fläschchen mit Pathromtin® überführt, um damit das
Lyophilisat zu lösen. Nach fünf min bei Raumtemperatur war das Reagenz einsatzbereit. Der
Gerinnungsansatz wurde als Doppelansatz in eine, auf 37°C vorgewärmte Küvette pipettiert:
100 µl Citratplasma wurden mit 100 µl Pathromtin® gemischt und für zwei min bei 37°C
inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Calciumchlorid-Lösung (0,025 mol/l) wurde die Messung
gestartet und das Ergebnis protokolliert.
®
Bei der Verwendung von Actin FS
wurde eine Verdünnung der Plasmaproben nach Vorgabe
®
einer im Vorfeld für jede Actin Charge
FS
erstellten Eichkurve mit Diäthylbarbiturat-AcetatPufferlösung (Fa. DADE Behring, Marburg) vorgenommen, um die Gerinnungszeiten des
physiologischen und pathologischen Bereichs besser abgrenzen zu können. Die weitere
Vorbereitung der Proben und der Reagenzien sowie die Messung der Gerinnungszeit erfolgte
®
nach Herstellerangaben. 100 µl Actin wurden
FS
mit 100 µl der verdünnten Plasmaprobe
gemischt und bei 37°C für drei Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 1002-Lösung
µl CaCl
wurde die Gerinnungszeit gemessen.
3.2.4.3 Thrombinzeit
Die Thrombinzeit erlaubt eine Einschätzung der Endstrecke der Gerinnung, die allerdings
auch im Rahmen der oben genannten Tests erfasst wird. Das Testprinzip beruht auf der
Zugabe von Thrombin und nachfolgender Messung der Umwandlung des in der Probe
enthaltenen Fibrinogens in Fibrin.
Zur Bestimmung der Thrombinzeit im Citratplasma der Schweine wurde Test-ThrombinReagenz der Fa. DADE Behring (Marburg) verwandt. Für die Testdurchführung wurde das
frisch entnommene Citratblut (ein Teil Natriumcitrat-Lösung, neun Teile venöses Blut) wie
für die aPTT und Prothrombinzeit beschrieben zentrifugiert und aliquotiert. Direkt vor dem
Test wurden die Proben rasch im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und innerhalb einer Stunde
gemessen. Die Vorbereitung des Testreagenz ebenso wie die Messungen erfolgte nach
Herstellerangaben. Für den Gerinnungsansatz wurden 100 µl Citratplasma eine Minute bei
37°C inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl Test-Thrombin-Reagenz und die
3 Methoden
62
Messung der Gerinnungszeit. Auch für diesen Test erfolgte die interne Kontrolle mit
humanem Kontrollplasma (Kontroll-Plasma N, DADE Behring, Marburg).
3.2.4.4 Fibrinogenbestimmung
Photometrische Fibrinogenbestimmung im Plasma nach RATNOFF und MENZIE (1951)
Testprinzip: Durch Zusatz von Thrombin und Calciumionen wurde das in der
Citratplasmaprobe enthaltene Fibrinogen zum Gerinnen gebracht. Das ausgefallene
Fibringerinnsel wurde aus der Probe extrahiert, zur Beseitigung von Plasmaresten gewaschen
und in NaOH (0,75 mol/l) hydrolysiert. Der Proteinanteil im Hydrolysat wird unter
Ausnutzung der Biuretreaktion photometrisch bestimmt. Die Intensität der Färbung verhielt
sich zur Peptidbindungszahl linear und erlaubt eine quantitative Aussage zur
Proteinkonzentration. Die Ermittlung der Fibrinogengehalte in g/l erfolgt anhand einer
Fibrinogenstandardkurve. Ein Vorteil dieser Methode ist die Tatsache, dass die Messwerte
durch Fibrinogen-Degradationsprodukte nicht beeinflusst werden (BARTHELS u. VON
DEPKA, 2003). Das verwendete Testprotokoll wurde freundlicherweise von der AG
Pharmakologische Hämostaseologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena zur Verfügung
gestellt.
Zur Erstellung der Standardkurve wurde eine Fibrinogenverdünnungsreihe angelegt. Der
100 % Wert entsprach 12 mg Fibrinogen (F-4883 der Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen) in
einem ml Lösung. Für die gesamte Kurve wurden drei ml der 100 %igen Lösung benötigt.
Dazu wurde lyophilisiertes Fibrinogen in ein Polystyrol-Röhrchen eingewogen und bei 37°C
im Wasserbad unter vorsichtigem Schwenken in A. bidest. gelöst. Aus der Ausgangslösung
Tabelle
wurden unter Zugabe einer Sicherheitsmarge die restlichen Standardwerte
hergestellt (
3-1):
Tabelle 3-2: Fibrinogenverdünnungsreihe (Standardkurve).
75% Wert mit 9 mg/ml
825 µl Ausgangslösung
275 µl NaCl-Lösung
50 % Wert mit 6 mg/ml
550 µl Ausgangslösung
550 µl NaCl-Lösung
25 % Wert mit 3 mg/ml
275 µl Ausgangslösung
825 µl NaCl-Lösung
12,5 % Wert mit 1,5 mg/ml
137,5 µl Ausgangslösung
962,5 µl NaCl-Lösung
3 Material und Methoden
63
Für die Thrombinlösung wurde Thrombin in ein Polystyrol-Röhrchen eingewogen und in
NaCl-Lösung dergestalt gelöst, dass eine Lösung mit 100 U/ml entstand.
Die Gerinnungsansätze wurden in Polystyrol-Röhrchen unter Beachtung folgender
Mengenverhältnisse vorbereitet (Tabelle 3-3):
Tabelle 3-3: Gerinnungsansätze für die Fibrinogenbestimmung aus Plasma.
Prüfansatz
Standardwerte
Plasmaprobe
0,5 ml
-
Fibrinogenstandards
-
0,5 ml
NaCl (154 mmol/l)
1,5 ml
1,5 ml
CaCl2 (50 mmol/l)
1,5 ml
1,5 ml
Thrombinlösung (100 U/ml) 0,5 ml
0,5 ml
Die Gerinnungsansätze wurden mit einem Deckel verschlossen und eine Stunde bei 37°C im
Wasserbad inkubiert. Das entstandene Fibringerinnsel wurde mit Hilfe eines rauhen
Holzstabes (Schaschlik-Stäbchen der Firma Fackelmann, Hersbruck) auf den Stab
aufgewickelt und am Röhrchenrand ausgedrückt. Plasmareste wurden durch mehrfaches
Abspülen mit NaCl und Abrollen des aufgewickelten Gerinnsels auf Filterpapier entfernt.
Nach dem Waschvorgang wurde das Gerinnsel vom Stab abgerollt und in ein neues Röhrchen
überführt. Zur Hydrolyse des Gerinnsels wurden nun zwei ml NaOH zugegeben. Das
verschlossene Röhrchen wurde über Nacht bei Raumtemperatur bzw. für eine Stunde bei
37°C im Wasserbad inkubiert. Nach vollständiger Lyse des Gerinnsels wurden vier ml BiuretGebrauchslösung zugegeben und ohne Schaumbildung untergemischt. Als Leerwert wurden
zwei ml NaOH mit vier ml Biuret-Gebrauchslösung gemischt. Nach 30 bis 60 min wurden die
Ansätze durch eine Filtrationseinheit in ein neues Gefäß gegeben und unverzüglich am
Photometer (Ultraspec 2000, Amersham, Freiburg) bei einer Wellenlänge von 546 nm gegen
den Leerwert gemessen. Die Standardwerte wurden in eine Microsoft Excel Tabelle überführt
und in einem x,y-Diagramm unter Hinzufügen einer Trendlinie und der abgeleiteten Formel
2
graphisch dargestellt. Das Bestimmtheitsmaß
sollte
R im günstigsten Fall eins betragen. Die
3 Methoden
64
Fibrinogenkonzentrationen der Plasmaproben konnten dann anhand dieser Standardkurve,
bzw. der daraus abgeleiteten Formel, rechnerisch ermittelt werden.
Da im Versuchsvorhaben zur Rolle der Thrombozyteninteraktionen die verhandene
Plasmamenge aus Tierschutzgründen limitiert war, wurde der Ansatz für dieses Experiment
halbiert. Der Ansatz der Fibrinogenstandardkurve wurde diesen Bedingungen angepasst.
Bestimmung des gerinnbaren Fibrinogens nach CLAUSS (1957)
Abweichend von der oben beschriebenen Methode wurden die Fibrinogenbestimmungen in
den Vorversuchen nach den Vorgaben der Methode nach CLAUSS (1957) durchgeführt. Die
Methode nach CLAUSS ist in der Humanmedizin über die DIN 58 906-Fib1 festgeschrieben
und beruht auf einer Variation der Thrombinzeit. Nach Zugabe einer standardisierten Menge
Thrombins ist die gemessene Gerinnungszeit der Fibrinogenkonzentration proportional
(HOFFMAN und GREENBERG, 1987). Anhand einer Bezugskurve, die mit verschiedenen
Verdünnungen eines Plasmas bekannter Fibrinogenkonzentration erstellt wurde, konnte der
Fibrinogengehalt in g/l errechnet werden.
3.2.4.5 Ethanol-Gelation-Test (EGT)
Das Testprinzip beruht auf der Beobachtung, dass Fibrinmonomere und kleine
Fibrinpolymere in der Gegenwart einer niedrigen Ethanolkonzentration präzipitieren
(GODAL und ABILDGAARD, 1966; BREEN und TULLIS, 1968). Das Probenmaterial war
Citratplasma, welches durch zehnminütige Zentrifugation bei 1750 x g aus der mit
Natriumcitrat versetzten Blutprobe isoliert wurde. Der vorliegende Testansatz eignete sich nur
für frische, nicht für gefrorene Plasmaproben. Es fanden zwei Testprotokolle Anwendung:
Protokoll 1: In einem Glasröhrchen wurden 500 µl der Plasmaprobe für drei min bei 37°C
inkubiert. Danach wurden 150 µl Ethanol zugegeben und der Ansatz für weitere zehn min bei
37°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde der Ansatz makroskopisch auf die Bildung von
Fibringel untersucht. Der Test wurde als negativ betrachtet, wenn keine Reaktion eintrat oder
eine körnige Ausfällung stattfand. Im Falle einer Gelierung oder beim Sichtbarwerden von
definitiven Fibrinsträngen wurde der Test als positiv erachtet.
Da dieses Protokoll keine Differenzierung zwischen positiven und falsch positiven
Ergebnissen erlaubt, wurde es im Verlaufe der Untersuchungen durch das Originalprotokoll
3 Material und Methoden
65
von BREEN und TULLIS ersetzt. Der Aufbau des dort beschriebenen Tests beinhaltet die
Herstellung eines alkalischen Reaktionsmilieus (pH > 7,70), was eine Differenzierung
ermöglicht. Dieses Protokoll (Protokoll 2) sah folgende Verfahrensweise vor:
Neun Tropfen Plasma wurden mit einem Tropfen 0,1 N NaOH sowie drei Tropfen 50 %
Ethanol gemischt. Der Testansatz wurde vorsichtig gemischt und für eine Minute bei
Raumtemperatur inkubiert. Trat eine Gelformation binnen einer min auf, wurde der Test als
positiv betrachtet. Später auftretende Präzipitate bzw. Gelformationen in den folgenden neun
min wurden durch Zugabe eines weiteren Tropfens 0,1 N NaOH überprüft. Unspezifische
Präzipitate lösten sich unter diesen Bedingungen wieder auf, während Fibringele erhalten
blieben.
3.2.4.6 Thrombozytenaggregationstest
Testprinzip und Vorarbeiten:
Die Thrombozytenaggregation ist ein in zwei Phasen verlaufender Prozess, der am Ende zur
irreversiblen Zusammenballung der Plättchen führt. Bei dem eingesetzten Verfahren zur
Messung der Aggregation, der turbidimetrischen Bestimmung von Zellsuspensionen im
Verfahren nach BORN (1962), wurde die Trübungsabnahme im plättchenreichen
Citratplasma nach Zusatz verschiedener Induktorsubstanzen wie ADP, Arachidonsäure,
Ristocetin oder Kollagen photometrisch, im vorliegenden Versuchsansatz durch das APACT
(automated platelet and coagulation tracer) System (LABiTec GmbH, Ahrensburg) erfasst
und ausgewertet. Das Plasma wurde für die Messung auf 37°C vorgewärmt und durch einen
Magnetrührer in Bewegung gehalten. Die Methode beruht auf der Eigenschaft, dass die
optische Dichte einer Partikelsuspension abhängig von der Partikelzahl und nicht der
Partikelgröße ist. Während plättchenreiches Plasma (PRP) nur eine geringe Durchlässigkeit
für langwelliges Licht besitzt, ist plättchenarmes Plasma (PPP) nahezu vollständig
durchlässig. Die prozentuale Lichtdurchlässigkeit diente als Maß für die Aggregation, in
deren Verlauf sich die Partikelgröße erhöhte, die Partikelzahl jedoch reduzierte. Die
Transmissionsänderung wurde zur Betrachtung und Auswertung kontinuierlich aufgezeichnet
und als Kurve ausgegeben. Zur Erlangung einer ausreichenden Vergleichbarkeit und
Reproduzierbarkeit erfolgte der Test mit einer standardisierten Thrombozytenzahl. Der
3 Methoden
66
Ausgleich der Transmissionsunterschiede wurde durch Einstellung des PRP als 0%-Wert und
des PPP als 100%-Wert erreicht.
Durch tierartspezifische Unterschiede lassen sich für das Schwein nicht alle Induktoren
verwenden. In Vorversuchen wurde daher die Eignung der verschiedenen Induktoren in
verschiedenen Konzentrationen getestet. Für die weiteren Untersuchungen wurden ADP und
Kollagen eingesetzt. Die physiologische Aggregationskurve nach ADP-Zugabe sollte wie
folgt aussehen: Zunächst stellte sich eine Formveränderung der Thrombozyten ein (shape
change), die als kurze Abnahme der Transmission zu sehen war. Danach folgte ein Anstieg
der Aggregationskurve (primäre Aggregation) auf ca. 55-60 %, die im Verlauf entweder eine
rückläufige Tendenz zeigte (Desaggregation), oder nach dem Erreichen eines Plateaus in die
zweite Phase der Aggregation überging (sekundäre Aggregation). Der Verlauf war u.a. von
der Konzentration des Induktors abhängig. Die Kollagen-induzierte Aggregationskurve wies
keine shape change Phase auf und erreichte eine maximale Aggregation von bis zu 85 %.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das beschriebene Verfahren eingesetzt, um die Wirkung des
Clopidogrels und der Acetylsalicylsäure zu überwachen. Die Wirkung des Clopidogrels liess
sich an der ADP-induzierten Aggregationskurve, die der Acetylsalicylsäure an der Kollageninduzierten Aggregationskurve ablesen, da die genannten Stoffe Inhibitoren dieser
Aggregationswege sind.
Testdurchführung:
Das PRP wurde durch niedertourige Zentrifugation für 20 min bei 31 x g gewonnen. Der
Überstand wurde sofort mit einer Plastikpipette abgenommen und in ein verschließbares
Plastikröhrchen verbracht. Der Rückstand wurde zur Herstellung des PPP erneut zentrifugiert
(2200 x g, 15 min) und das so gewonnene PPP aliquotiert. Sowohl das Citratblut, als auch das
PRP und PPP wurden mit dem mölab Hämatologie-System 8702/6 (Fa. Mölab, Hilden) auf
ihren Thrombozytengehalt untersucht. Die Messung der Thrombozytenzahl aus Citratblut
erfolgte nach Angaben des Geräteherstellers aus der 1 : 45000 Verdünnung des Blutes in
Cello Ton (Fa. Mölab, Hilden). Für die Messungen wurde das PRP mit autologem PPP auf
500.000 Thrombozyten/µl eingestellt. Die Einstellung des Plasmas wurde durch
Thrombozytenzählung mit oben genanntem Gerät überprüft; die Toleranzgrenze lag bei
500.000 ± 10.000 Thrombozyten pro µl. Da die Messung plättchenreichen Plasmas nicht
3 Material und Methoden
67
unter Standardtestbedingungen des Gerätes durchführbar war, wurde nach einer Testreihe mit
verschiedenen Verdünnungsmethoden und –stufen eine Vorverdünnung des Plasmas mit
Diäthylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (Fa. DADE Behring, Marburg) im Verhältnis 1 : 7
vorgenommen. Die Messung der Plättchenzahl erfolgte sodann nach Erstellung der
Messlösung in der Primärverdünnungsstufe des zum mölab Hämatologie-System gehörenden
Diluters. Die Aggregationsmessung erfolgte innerhalb von zwei Stunden nach der
Blutentnahme. Da die Tiere im Verlauf der KSP Infektion eine hochgradige
Thrombozytopenie entwickelten, wurde das Plasma zu den späteren Messzeitpunkten auf
250.000 bzw. 125.000 Thrombozyten pro µl eingestellt.
Nach der Vorwärmphase des APACT Gerätes, der Rekonstitution der lyophilisierten
Reagenzien mit destilliertem Wasser sowie dem Starten der Software, erfolgten die
Messungen dergestalt, dass nach einer Abgleichung des Gerätes ohne Küvetten zunächst das
PPP als 100 %-Wert bzw. PRP als 0 %-Wert gesetzt wurden. Danach erfolgte die eigentliche
Messung unter Zugabe des entsprechenden Induktors. Dazu wurden 200 µl des eingestellten
PRPs 2-3 min bei 37°C inkubiert und dann mit 50 µl ADP Reagent (AMAX, Trinity Biotech,
Ireland) bzw. 100 µl Collagen Reagent (AMAX, Trinity Biotech, Ireland) versetzt. Kontrolle
und Auswertung der Aggregationskurven erfolgten mit der APACT-Software.
Die Aggregation errechnete sich aus folgenden Werten:
Aggregatio
n=
Messwert−PRP
×100%
PPP −PRP
Die Messkurven ergaben folgende Parameter: Maximale Aggregation, maximale Steigung der
Kurve, Steigung der Desaggregation, Desaggregationswert, Flächeninhalt des Shape Change
und Flächeninhalt unter der Kurve.
3.2.5
Pharmakokinetik
Für den Wirkstoff PEG-Hirudin waren sowohl ein Therapieschema als auch eine Methode
zum Monitoring im Schweinemodell etabliert. Dosierungsschemata und das entsprechende
Protokoll für die Therapieüberwachung wurden freundlicherweise von Prof. Goetz Nowak zur
Verfügung gestellt und vor Versuchsbeginn am EURL etabliert und kalibriert.
3 Methoden
68
Um einen geeigneten Thrombozytenaggregationshemmstoff zu finden, wurden im Vorfeld in
vitro und in vivo unterschiedliche, in der Humanmedizin gebräuchliche Substanzen getestet
und anhand ihrer Wirkung und Kinetik ausgewählt. Für die ersten Testschritte wurden die
Substanzen zunächst in verschiedenen Konzentrationen einem frisch gewonnenen
Schweineplasma in vitro zugesetzt. Dieses wurde anschließend in Thrombozytenaggregationstests (siehe 3.2.4.6) mit den zuvor ausgewählten löslichen Induktoren, ADP und
Kollagen, überprüft. Folgende Substanzen wurden in vitro getestet: Der chimäre monoklonale
®
Antikörper Abciximab (Reopro ), das nicht-peptidische Tyrosinderivat Tirofiban
®
®
(Aggrastat) und der Cyclooxigenase-Hemmstoff Acetylsalicylsäure (Aspisol
).
®
Aufbauend auf die in vitro Untersuchungen wurden nachfolgend Tirofiban (Aggrastat
),
®
Acetylsalicylsäure (ASSratiopharm) und der Hemmstoff der ADP-induzierten Plättchenaggregation Clopidogrel in vivo getestet. Die letzteren Substanzen wurden zusätzlich in
Kombination getestet. Die pharmakokinetischen Untersuchungen in vivo wurden am
narkotisierten Schwein über einen Zeitraum von acht bis zwölf Stunden durchgeführt. Die
Narkose wurde über einen venösen Zugang am Ohr mit Pentobarbital-Natrium (Narcoren®,
Merial GmbH, Hallbergmoos) eingeleitet (20 mg/kg in NaCl-Lösung) und mit Ethylurethan
25% vertieft und erhalten. Ethylurethan wurde intraperitoneal nach Wirkung appliziert. Der
Venenzugang zur Entnahme der Blutproben und Applikation der pharmakologisch wirksamen
Substanzen wurde an der freipräparierten Vena jugularis durch einen eingelegten
Verweilkatheter (Heiland Vet, Hamburg) gewährleistet. Nach der Entnahme der
Nullwertprobe und Applikation des Medikaments fand eine Blutentnahme und Auswertung
der Messergebnisse nach 15 min, 30 min sowie 60 min statt. Danach wurden stündliche
Intervalle gewählt. Neben der Thrombozytenaggregation wurden die Parameter des weißen
und roten Blutbildes sowie die Thrombozytenzahlen überprüft. Nach Beendigung der
Untersuchungen wurden die Tiere durch eine Überdosis Ethylurethan schmerzlos getötet.
3 Material und Methoden
3.2.6
Statistik
69
Die Versuchsvorhaben waren als Orientierungsstudien angelegt und wurden aufgrund der
Gruppengröße nicht statistisch ausgewertet. Zur Abschätzung der Tendenzen wurden
Gruppenmittelwerte und deren Standardabweichungen berechnet. Alle Untersuchungen zur
Bestimmung der Gerinnungsparameter wurden mindestens im Doppelansatz ausgeführt, die
dokumentierten Werte verstehen sich als Mittelwerte dieser Ansätze.
3.2.7
Sonstige Methoden
3.2.7.1 Ecarin Clotting Time
Die ECT wurde zur Überwachung des Hirudinspiegels im Blut der behandelten Schweine
eingesetzt. In Gegenwart von Hirudin wandelt das, der zu untersuchenden Plasmaprobe
zugegebene Ecarin, Prothrombin hochspezifisch in Meizothrombin um. Meizothrombin wird
durch Hirudin inaktiviert. Erst wenn das Hirudin der Plasmaprobe verbraucht ist, kann das
freigesetzte Meizothrombin (bzw. dessen Aktivierungsprodukt) die Gerinnung induzieren
(NOWAK, 2003). Die Gerinnung kann mit Koagulometern erfaßt werden. Mit steigendem
Hirudinspiegel verlängerte sich die Ecarin Clotting Time.
Für die Messung der ECT wurde zunächst Ecarin-Reagenz vorbereitet, welches aus Ecarin
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Goetz Nowak, Jena), Calcium und
Puffersubstanzen bestand. Zur Herstellung von einem ml Ecarin-Reagenz wurden 800 µl Tris
mit 3 % BSA (Tris 0,05 M, pH 7,5 bei 37°C in 0,1 M NaCl), 100 µl 0,12-Lösung
M CaCl und
100 µl Ecarin-Lösung (10 U/ml in 0,9 % NaCl) durchmischt und bei –80°C eingefroren.
Um eine Interpretation der ECT Werte zu ermöglichen und die Vergleichbarkeit zu
gewährleisten, wurde eine Kalibrationskurve für das Ecarin-Reagenz erstellt. Zu diesem
Zweck wurde eine Hirudin-Verdünnungsreihe wie folgt hergestellt:
Eine PEG-Hirudin-Ausgangslösung mit 10 mg/ml PEG-Hirudin (freundlicherweise zur
Verfügung gestellt von Prof. Goetz Nowak, Jena) wurde mit 0,9 %iger NaCl-Lösung auf
200 µl/ml verdünnt. Für einen Plasmahirudinwert von zwei µg/ml wurden zehn µl der PEGHirudin-Verdünnung mit 990 µl Plasma gemischt und im Weiteren geometrisch bis zu einer
Konzentration von 0,0625 µg/ml verdünnt. Der Gerinnungsansatz am KC 4A (Amelung,
Lemgo) sah wie folgt aus: 100 µl Plasma wurden nach einer Inkubationszeit von zwei min bei
3 Methoden
70
37°C mit 100 µl vorgewärmtem Ecarin-Reagenz gemischt und die Gerinnungszeit
protokolliert. Die ermittelten Gerinnungszeiten für die verschiedenen Plasmakonzentrationen
wurden in eine Microsoft Excel© Tabelle übertragen und graphisch dargestellt. Aus einer
unbekannten Plasmaprobe konnte nun der PEG-Hirudin-Spiegel ermittelt werden, indem die
Formel der Kalibrationskurve umgestellt und eingesetzt wurde.
Die Probenentnahme und –aufbereitung fand folgendermaßen statt: Neun Teile venöses Blut
wurden mit einem Teil 0,11 mol/l Natriumcitrat gemischt und baldmöglichst bei 1215 x g für
10 min zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wurde sofort in Kunststoffröhrchen aliquotiert
(500 µl pro Kryoröhrchen) und entweder unverzüglich gemessen oder bei –80°C bis zum
endgültigen Verbrauch eingefroren. Eingefrorene Proben wurden vor der Messung rasch bei
37°C im Wasserbad aufgetaut und nach 15 min bei Raumtemperatur gemessen. Die
Überprüfung der Methode fand täglich mit humanem Kontrollplasma (Kontrollplasma N der
Fa. DADE Behring, Schwalbach) und gepooltem Plasma gesunder Schweine statt.
3.2.7.2 Einzelfaktorenbestimmung
Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden die Aktivitäten der Faktoren II und V mittels
koagulometrischer Verfahren untersucht. Untersuchungsmaterial war plättchenarmes
Citratplasma. Die Untersuchungsmethode wurde als Modifikation der Prothrombinzeit (siehe
3.2.4.3) durchgeführt. Die Probe wurde dabei durch eine vorverdünnte Probe in Kombination
mit einem kommerziellen Mangelplasma (Fa. DADE Behring, Schwalbach) ersetzt.
Grundprinzip war, dass durch diesen Aufbau die Gerinnungszeit der Testansätze nur von der
Aktivität des zu messenden Faktors in der Probe abhing. Der Testablauf erfolgte wie für die
Prothrombinzeit beschrieben. Mit Verdünnungsstufen eines Poolplasmas gesunder Schweine
wurde eine Referenzkurve erstellt und die Ergebnisse anhand dieser Kurve in Prozent der
Norm ausgedrückt.
Die Aktivität des Inhibitors der Serinproteasen des Gerinnungssystems, Antithrombin III
(AT III), wurde mittels eines chromogenen Substrats in plättchenarmem Citratplasma
bestimmt. Das Reagenz (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) enthält Heparin und eine
definierte Menge Thrombin. Heparin bildet mit AT III einen Komplex und katalysiert die
Inaktivierungsreaktion. Das AT III der Probe geht mit dem zugesetzten Thrombin eine
3 Material und Methoden
71
Verbindung ein, das dann für die thrombininitiierte Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem
chromogenen Substrat nicht mehr zur Verfügung steht und somit die Extinktion verringert.
Aus der Restaktivität des Thrombins lässt sich der AT-III-Gehalt der Probe berechnen. Der
Test wurde nach Herstellerangaben mit der Ausnahme durchgeführt, dass die Vorverdünnung
des Plasmas höher (1:80 in NaCl) gewählt wurde. Zur Kalibrierung des Testsystems wurde
gepooltes Schweineplasma verwendet. Die Ergebnisse wurden anhand der Werte für das
Poolplasma in Prozent der Norm ausgedrückt.
3.2.7.3 Histopathologische Untersuchungen
Für die histopathologischen Untersuchungen wurden formalinfixierte Organproben in Paraffin
eingebettet. Daraus erstellte Mikrotomschnitte wurden vollautomatisch (Varistain 24-3, Fa.
Shandon, Frankfurt) mit Hämatoxylin/Eosin (HE) gefärbt und im Lichtmikroskop
begutachtet.
Fixierung der Organe:
Bei der Sektion wurden die Organe zunächst grob zerteilt und in eine 10 %ige, gepufferte
Formalinlösung für mindestens 24 Stunden eingelegt. Die auf diese Weise fixierten Proben
wurden daraufhin mit einem Skalpell so zugeschnitten, dass sie in standardisierte
Einbettungskassetten passten.
Einbettung in Paraffin:
Die Einbettung der Gewebestücke erfolgte mit dem Gewebeeinbettungsautomaten
Hypercenter II der Fa. Shandon, Frankfurt. Zur Entwässerung wurden die Proben, nach einer
mindestens einstündigen Nachfixierung in frischem Formalin, zunächst mit Leitungswasser
gespült und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 85 %, 96 %) dehydriert. Durch
anschließende Isopropanol- und Essigsäure-n-Butylester-Schritte wurden die Proben sodann
wieder vom Alkohol befreit und für die Paraffineinbettung vorbereitet. In Metallschalen
wurden die Präparate mit 60°C warmem Paraffin (Paraplast, Fa. Shandon, Frankfurt)
ausgegossen und auf einer Kühlplatte bei -5°C zum Erstarren gebracht.
3 Methoden
72
Anfertigung der Schnitte und Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Aus den Paraffin-eingebetteten Präparaten wurden mit dem Schlittenmikrotom (Fa. Mikrom,
Heidelberg) ca. vier µm dicke Schnitte angefertigt und nach Streckung im Wasserbad bei ca.
55°C auf Glasobjektträger (Fa. Engelbrecht, Edermünde) aufgezogen. Zur Entfernung des
überschüssigen Paraffins wurden die Schnitte für ca. 30 min in einen 60°C Wärmeschrank
(Fa. Medite, Burgdorf) verbracht. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) erfolgte im
Färbeautomaten Varistain 24-3 der Fa. Shandon, Frankfurt. Nach der Färbung wurden die
Deckgläser mittels Eindeckautomaten auf die Objektträger gebracht. Die Eindeckung erfolgte
mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel).
Die HE-Färbung ist eine Routine-Übersichtsfärbung. Sie färbt die Zellkerne dunkelviolett, die
anderen Gewebestrukturen rötlich an. Vor der eigentlichen Färbereaktion wurden die Schnitte
in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert. Abschluss der Entparaffinierung bildete
ein Spülschritt mit A. bidest.
Der erste Färbeschritt wurde in einer Hämalaun-Lösung nach MAYER für 15 min
durchgeführt. Anschließend wurde überschüssiger Farbstoff durch einen 20-minütigen
Spülschritt mit Leitungswasser entfernt, und die Schnitte abschließend eine min in 1 %iger
Eosin-Lösung gefärbt. Nach der Eindeckung und Trocknung erfolgte die Begutachtung im
Axiostar plus Lichtmikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen).
4
Ergebnisse
4.1 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPVStamm CSF0634
Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden zwei Tierexperimente mit je sieben
Läuferschweinen durchgeführt. Für beide Untersuchungen wurden jeweils fünf
Läuferschweine mit dem als hochvirulent eingestuften KSPV-Stamm CSF0634 intranasal
3,5
infiziert (10 KID50 pro Tier). Je eine Gruppe mit zwei Schweinen diente als negative
Kontrolle.
Diese Versuche sollten eine Übersicht über die zu erwartenden klinischen, hämatologischen,
hämostaseologischen, pathologisch-anatomischen und histopatholgischen Befunde erbringen
nach einer Infektion mit CSF0634 erbringen und zeigen, ob sich dieser Stamm für weitere
Untersuchungen eignete. Die Ergebnisse wurden für die weitere Versuchplanung eingesetzt.
Im zweiten Vorversuch wurde besonderes Augenmerk auf die Frühphase (Tag 0 - 4 post
infectionem, p.i.) der Erkrankung gelegt, da in diesem Bereich gemeinhin die ersten
Veränderungen der hämatologischen und hämostaseologischen Parameter, vor allem der
Leukozyten- und Thrombozytenzahlen, auftreten (DUNNE, 1970). Ziel war es, diese
Ereignisse mit Befunden der Gerinnungstests und Fibrinogenbestimmungen zu korrelieren.
4.1.1 Clinical Score und Körpertemperatur
Neun KSP-relevante klinische Parameter wurden täglich nach Vorgabe des am EURL ge-
bräuchlichen Erfassungsbogens untersucht und die Ausprägung der Symptome mit einer
Punktzahl von null bis drei belegt. Die Addition ergab die klinische Punktzahl Clinical Score
(CS) eines Tieres. Zusätzlich wurde täglich die rektale Körpertemperatur erfasst und
dokumentiert.
Die Tiere 153, 156 und 157 entwickelten das klassische Bild der akut-letalen KSPV-Infektion
mit hohem Fieber, gastrointestinalen und respiratorischen Symptomen sowie zentralnervösen
Ausfallserscheinungen. Diese Tiere entwickelten ab dem 14. Tag p.i. petechiale Blutungen.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
74
Tier 154 erkrankte zunächst ebenfalls an der akuten KSP, erholte sich jedoch ab dem 14. Tag
p.i. wieder. Das Tier 155 zeigte schwere, unspezifische Allgemeinsymptome. Der maximale
CS der Einzeltiere lag zwischen 15 und 21. Die Kontrolltiere zeigten über den gesamten
Versuchsverlauf weder eine erhöhte Körpertemperatur noch andere Krankheitsanzeichen.
Die Tiere 176, 178 und 179 entwickelten schwere, klassische Symptome einer KSPVInfektion und erreichten einen maximalen CS von 17 (Tiere 176 und 179) bzw. 16 (Tier 178).
Diese Tiere entwickelten in der Finalphase der Erkrankung (ab 14 Tage p.i.) petechiale
Blutungen im Bereich der Akren. Tier 175 zeigte im Versuchsverlauf schwere
Allgemeinsymptome ohne hämorrhagische Erscheinungen und erreichte einen maximalen CS
von 10. Milde Allgemeinsymptome mit Fieber, geringgradiger Konjunktivitis und Diarrhoe
konnten bei Tier 177 verzeichnet werden, sein maximaler CS betrug 7. Die Kontrolltiere
zeigten zu keinem Zeitpunkt klinische Auffälligkeiten, die auf eine Infektion mit KSPV
hindeuteten. Kontrolltier 181 zeigte eine hochgradige Entzündung des rechten Sprunggelenks,
die am zweiten Tag des Versuches sichtbar wurde und bis zum Versuchsende ausheilte.
Charakteristische KSP-Symptome sind in Abbildung 4-1 und Abbildung 4-2 dargestellt. Die
Fotographien zeigen exemplarisch für Tier 179 die unterschiedlichen Ausprägungen
klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-Infektion.
Abbildung 4-1: Die Abbildung zeigt das Tier 179, links 14 und rechts 15 Tage p.i.
Hämorrhagische Symptome entwickelten sich in der Finalphase der KSPV-Infektion
innerhalb von wenigen Stunden.
4 Ergebnisse
75
Abbildung 4-2: Unterschiedliche Ausprägungen klinischer Symptome im Verlauf der KSPVInfektion. Exemplarisch sind hier unterschiedliche Krankheitsstadien für das Tier 179 dargestellt.
Das obere Bild wurde an Tag zehn p.i. aufgenommen. Das Tier zeigte zu diesem Zeitpunkt
Apathie, Konjunktivitis, einen aufgekrümmten Rücken, Diarrhoe, ein struppiges Borstenkleid,
leichte respiratorische Symptome und hohes Fieber. Das untere Bild wurde an Tag 15 p.i. erstellt
und zeigt, dass hämorrhagische Symptome in den Vordergrund traten. Das Tier war hochgradig
abgemagert, auffallend blass, zeigte zentralnervöse Ausfallserscheinungen und Somnolenz.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
76
4.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde
Alle Tiere wurden nach der Euthanasie einer pathologisch-anatomischen Untersuchung nach
dem Protokoll des EURL unterzogen. Die Tiere 153, 155, 156 und 157 zeigten typische KSPBefunde mit vergrößerten, hämorrhagisch infarzierten Lymphknoten im gesamten
Organismus, petechiale Blutungen in der Nierenrinde und der äußeren Haut (exklusive Tier
155), eine katarrhalische Enteritis sowie eine katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
unterschiedlichen Schweregrades. Bei der Untersuchung des Tieres 154 wurden
ausschließlich eine Pneumonie und mittelgradig vergrößerte Lymphknoten gefunden. Die
Kontrolltiere zeigten keine augenfälligen pathologisch-anatomischen Veränderungen.
KSP-typische Veränderungenmit
generalisiertenLymphknotenschwellungen
und
-hämorrhagien sowie petechialen Blutungen in den Nieren, der Blasenwand und der äußeren
Haut sowie Sekundärinfektionen der Lunge konnten bei den Tieren 176, 178 und 179
gefunden werden. Zwei dieser Tiere zeigten zudem Milzrandinfarkte. Während Tier 175
vergrößerte Lymphknoten und eine Bronchopneumonie aufwies, zeigte Tier 177 keine KSPtypischen Befunde zum Zeitpunkt des Versuchsendes. Die Kontrolltiere waren, abgesehen
von einer geringgradigen Spitzenlappenpneumonie, ohne besonderen Befund zum Zeitpunkt
der Euthanasie. Charakteristische Veränderungen, die im Rahmen der Infektion mit dem
KSPV-Isolat CSF0634 auftraten, sind in Abbildung 4-3 gezeigt.
4.1.3 Histopathologie
Paraffin-eingebettete Organschnitte der Leber, der Lunge, der Nieren sowie eines
Lymphknotens der Tiere 153 – 159 wurden HE-gefärbt und im Lichtmikroskop ausschließlich
auf das Vorhandensein sichtbarer Thromben untersucht. In keinem der angefertigten Schnitte
konnten unter diesen Bedingungen Thromben nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse
77
Abbildung 4-3: Charakteristische pathologisch-anatomische Befunde. In der ersten Reihe sind
hochgradig vergrößerte und hämorrhagische Darmlymphknoten abgebildet. Reihe zwei zeigt
hämorrhagische Hautveränderungen im Bereich der distalen Hintergliedmaßen. Ein vergrößerter,
hämorrhagischer Mandibularlymphknoten sowie multiple Milzinfarkte sind in Reihe drei von
rechts nach links dargestellt. In der unteren Reihe sind die Veränderungen in den Nieren sichtbar.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
78
4.1.4 Virus-, Antigen- und Antikörpernachweis
Zur Bestätigung der erfolgreichen Infektion und zum Nachweis der Virusfreiheit der
Kontrolltiere wurde für die Tiere 153 – 159 eine Virusisolierung aus Leukozyten (s. 3.2.2.3)
am Tag vor der Infektion und am Tag des Todes bzw. der Euthanasie vorgenommen.
Zusätzlich wurde ein Antigen-ELISA (s. 3.2.2.7) an den Tagen zehn und 14 p.i. durchgeführt.
Alle Tiere erwiesen sich als negativ in der Virusisolierung am Tag vor der Infektion. Positive
Ergebnisse wurden am Tag der Euthanasie in der Virusisolierung für die Tiere 153, 155, 156
und 157 erzielt. Sowohl die Kontrolltiere (158 und 159) als auch Tier 154 waren negativ. Der
Antigen-ELISA ergab positive Ergebnisse für alle infizierten Tiere an Tag zehn p.i., während
die Kontrolltiere negativ waren. An Tag 14 p.i. waren positive Ergebnisse für die Tiere 153,
155, 156 und 157 zu verzeichnen, Tier 154 erwies sich als negativ. Alle Kontrolltiere zeigten
auch hier eine negative ELISA-Reaktion. Die
Ergebnisse der Virus- bzw.
Antigennachweisese sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-1 aufgeführt.
Für die Tiere 175 – 181 wurde die Virusisolierung an den Tagen vier, sieben, zehn und 14 p.i.
durchgeführt. Alle infizierten Tiere waren positiv an den Tagen sieben und zehn p.i.. Während
die Tiere 175, 176, 178 und 179 an Tag 14 p.i. ebenfalls positiv reagierten, erwies sich Tier
177 als negativ. Die Kontrolltiere blieben im gesamten Versuchsverlauf negativ. Die
Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-2 dargestellt.
Um die Immunantwort der Tiere zu beurteilen, wurden am Tag der Euthanasie
Antikörpernachweise geführt. Zur quantitativen Einschätzung der Antikörperproduktion
wurden VNTs nach Vorgabe der Standardmethoden des EURLs mit den diagnostischen
Referenzstämmen CSF0902 (Alfort 187), BVDV NADL und BDV Moredun einerseits, und
dem homologen KSPV-Stamm CSF0634 andererseits durchgeführt. Zusätzlich wurden
ELISA-Testkits (s. 3.2.2.7) zum qualitativen Antikörpernachweis eingesetzt. Die Ergebnisse
dieser Untersuchungen sind für die Tiere 153 - 159 im Anhang 8.1 in Tabelle 8-3 dargestellt.
Tier 154 entwickelte einen niedrigen Antikörpertiter von 40
ND
CSF0902 sowie
50 gegen
einen moderaten Antikörpertiter (120
gegen den homologen Stamm CSF0634. In den
50) ND
differentialdiagnostischen VNTs mit den oben aufgeführten Pestiviren, konnten bei diesem
Tier kreuzreagierende Antikörper gegen BDV Moredun festgestellt werden. Tier 155 zeigte
ausschließlich einen niedrigen Antikörpertiter 50
(30
) gegen
ND das homologe Virus. Sowohl
4 Ergebnisse
79
Tier 154, als auch Tier 155 reagierten positiv im Antikörper-ELISA. Beide AntikörperELISAs befundeten Tier 156 als fraglich. Die Kontrolltiere sowie alle anderen Tiere
reagierten in allen Tests negativ.
Für die Tiere 175 – 181 wurden am Tag der Euthanasie die oben genannten VNTs sowie ein
Antikörper-ELISA durchgeführt. Die Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-4
aufgeführt. Tier 177 entwickelte einen Antikörpertiter von 480
ND das homologe
50 gegen
Virus und einen niedrigen Antikörpertiter (30
gegen den Referenzstamm CSF0902.
50)ND
Dieses Tier wies zudem kreuzreagierende Antikörpertiter gegen BDV auf. Tier 178 wies
einen niedrigen Antikörpertiter (40
gegen das homologe Virus auf. Alle anderen Tiere
50)ND
zeigten in den durchgeführten VNTs negative Ergebnisse. Die Tiere 177 und 178 wurden
auch im Antikörper-ELISA positiv befundet, fragliche Reaktionen zeigten die Tiere 175 und
179. Die Kontrolltiere waren negativ in allen durchgeführten Antikörpernachweisen.
4.1.5 Hämatologische Parameter
Aus den EDTA-Blutproben aller Tiere wurden sowohl die Leukozyten- als auch
Thrombozytenzahlen bestimmt. Zusätzlich erfolgte für die Tiere des zweiten Vorversuches
(Tiere 175 – 181) eine Untersuchung des Plättchenvolumens über den Parameter MPV.
Die Leukozytenzahlen der Tiere 153 bis 157 zeigten eine Depletion im Verlauf des
Experiments. Bereits ab dem dritten Tag p.i. war bei den Tieren 153, 154, 156 und 157 ein
anhaltender Abwärtstrend feststellbar, der zu einer Reduktion der Leukozytenzahlen um
80-90% führte. Durchschnittlich fielen die Leukozytenzahlen im Versuchsverlauf von
23,2 G/l auf 4,5 G/l ab. Tier 154 zeigte zu Versuchsende wieder einen leichten Aufwärtstrend
von 4,9 G/l an Tag 14 p.i. auf 6,7 G/l an Tag 17 p.i.. Die Leukozytenzahlen der Kontrolltiere
blieben, abgesehen von intraindividuellen Schwankungen, im Normbereich. Die
Entwicklungen der Leukozytenzahlen sind in Abbildung 4-4 dargestellt.
Alle infizierten Tiere des zweiten Vorversuches zeigten nach der Infektion eine deutliche
Leukopenie, wobei die Leukozytenzahlen beginnend an Tag drei p.i. durchschnittlich von
22,4 G/l auf 7,9 G/l abfielen. Dies entsprach einer Reduktion der Leukozytenzahlen um
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
80
70-90 % für die einzelnen Schweine. Abweichend von den Verläufen der anderen infizierten
Tiere, zeigten die Leukozytenzahlen der Tiere 175 und 177 eine Erholung zum Versuchsende.
Während Tier 175 jedoch mit 6,5 G/l unter dem Normalbereich blieb, kehrte Tier 177 nach
dem zehnten Tag p.i. in den Normalbereich zurück. Zu Versuchsende lag die Leukozytenzahl
für dieses Tier bei 13,8 G/l (Tag 21 p.i.). Die Kontrolltiere wiesen zu keinem Zeitpunkt eine
Leukopenie auf. Tier 181 zeigte jedoch eine Leukozytose, die zwischen dem zweiten und
vierten Tag des Versuches ihr Maximum erreichte. Die Leukozytenzahlen sind in Abbildung
4-5 dargestellt.
Analog zu den Entwicklungen der Leukozytenzahlen begann bereits drei Tage p.i. ein Abfall
der Thrombozytenzahlen für die Tiere 153, 155, 156 und 157. Diese Tendenz verstärkte sich
bis zum Versuchsende. Durchschnittlich fielen die Thrombozytenzahlen von 583 G/l auf 102
G/l an Tag 17 p.i., was einer Abnahme von 82,5 % entsprach. Für Einzeltiere konnte eine
prozentuale Abnahme von 93 % (Tier 157) bzw. 98 % verzeichnet werden (Tier 153). Die
Thrombozytenzahlen des Tieres 154 folgten zunächst diesem Trend, zeigten jedoch
beginnend an Tag zehn p.i. eine Normalisierung bis hin zu Normalwerten (307 G/l) an Tag 17
p.i.. Die Thrombozytenzahlen der Kontrolltiere zeigten ausschließlich Schwankungen im
Normalbereich. Die Darstellung der Thrombozytenzahlen für die Tiere 153 bis 159 ist in
Abbildung 4-6 zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der Thrombozytenzahlen war festzuhalten, dass die Werte der Tiere 175,
177, 179 und 181 bei Ermittlung des Referenzwertes vor der Infektion unter dem
Normalbereich lagen. Die Werte an Tag eins p.i. lagen jedoch für alle Tiere im
Normalbereich. Die Tiere 175, 176, 178 und 179 zeigten einen anhaltenden Abwärtstrend der
Thrombozytenzahlen ab Tag zwei bzw. vier p.i., der sich bis zur Euthanasie der Tiere
fortsetzte. Die Thrombozytenzahlen sanken durchschnittlich auf 100 G/l an Tag 17 p.i.. Der
maximale Abfall war bei Tier 176 mit 96 % zu verzeichnen. Die Thrombozytenzahlen für
Tier 177 zeigten einen Abfall bis Tag sieben p.i., erholten sich jedoch wieder vollständig
(616 G/l an Tag 21 p.i.). Die Kontrolltiere zeigten deutliche intraindividuelle Schwankungen,
blieben jedoch über den gesamten Versuch im Referenzbereich bzw. darüber. Die ermittelten
Werte sind in Abbildung 4-7 festgehalten.
4 Ergebnisse
81
Der Parameter MPV zeigte große intra- und interindividuelle Schwankungen. Ein Anstieg des
Thombozytenvolumens war für infizierte Tiere zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. zu
verzeichnen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich von 6,8 – 12,6 fl wurde
mit geringfügigen Ausnahmen nicht verlassen. Tier 181 unterschritt den unteren Referenzwert
zu Beginn des Versuches, das andere Kontrolltier, Tier 180, zum Ende des Versuchs. Tier 176
zeigte zudem am Tag der Euthanasie einen Abfall des MPV auf 6,4 fl. Das MPV ist für die
Tiere 175 - 181 in Abbildung 4-8 dargestellt.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
82
Leukozytenzahlen
Tier 153
30
Tier 154
25
Tier 155
]
/l
20
[G
n
te15
zy
o
k 10
eu
L
5
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Ref. 1
Ref. 2
0
0
3
7
10
14
17
Tage pi
Abbildung 4-4: Leukozytenzahlen der Tiere 153 - 159 im Versuchsverlauf. Tiere, die mit dem
hochvirulenten KSPV-Stamm CSF0634 infiziert wurden, zeigten, beginnend an Tag drei bzw.
sieben p.i. (Tier 155) eine deutliche Leukozytendepletion. Die Kontrolltiere 158 und 159 sind in
dunkelgrau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom Gerätehersteller mit 11,3 – 22,8 G/l
angegeben und ist durch die gestrichelten Linien verdeutlicht (Ref. 1 für den unteren, Ref. 2 für
den oberen Referenzwert).
Leukozytenzahlen
50
45
] 40
/l
35
[G
n 30
te25
zy
o 20
k
15
eu
L
10
5
0
Tier 175
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Ref. 1
Ref. 2
0
1
2
3
4
7
10
14
17
21
Tage pi
Abbildung 4-5: Leukozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf. Alle infizierten Tiere
zeigen eine Leukozytendepletion. Die Werte des Tieres 177 erreichen zu Versuchsende den
Normbereich. Die Kontrolltiere 180 und 181 sind in dunkelgrau dargestellt. Der Referenzbereich
wurde vom Gerätehersteller mit 11,3 – 22,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien
verdeutlicht (Ref. 1 für den unteren, Ref. 2 für den oberen Referenzwert).
4 Ergebnisse
83
Thrombozytenzahlen
1000
900
Tier 153
800
Tier 154
]
/l 700
[G
n 600
te
zy 500
o
b
m 400
ro
Th300
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
Ref. 1
Ref. 2
200
100
0
0
3
7
10
14
17
Tage pi
Abbildung 4-6: Thrombozytenzahlen der Tiere 153 bis 159 im Verlauf des Experiments. Die
Kontrolltiere 158 und 159 sind in grau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom
Gerätehersteller mit 138,2 – 467,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien im
Diagramm gekennzeichnet (Ref. 1 und Ref. 2).
Thrombozytenzahlen
1000
900
Tier 175
800
Tier 176
]
/l 700
[G
n 600
te
zy 500
o
b
m 400
ro
Th300
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 180
Ref. 1
Ref. 2
200
100
0
0
1
2
3
4
7
10
14
17
21
Tage pi
Abbildung 4-7: Thrombozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf. Die Kontrolltiere
180 und 181 sind in grau dargestellt. Der Referenzbereich wurde vom Gerätehersteller mit
138,2-467,8 G/l angegeben und ist durch die gestrichelten Linien im Diagramm gekennzeichnet
(Ref. 1 und Ref. 2).
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
84
Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV)
13
Tier 175
12
l]
[f
11
en
m
lu10
o
v
n
te 9
Tier 176
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
zy
o 8
b
m
ro 7
Th
6
Tier 181
Ref. 1
Ref. 2
5
0
1
2
3
4
7
10
14
17
21
Tage pi
Abbildung 4-8: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere 175 bis 181 im Versuchsverlauf.
Der Referenzbereich (6,8 – 12,6 fl) liegt zwischen den gestrichelten Linien (Ref. 1 und Ref. 2).
4.1.6 Hämostaseologische Parameter
Neben den Globaltests der Gerinnung wurde für alle Tiere die Fibrinogenkonzentration im
Plasma bestimmt. Da unterschiedliche Methoden zum Einsatz kamen, konnte der Vergleich
ausschließlich auf Ebene der Verläufe und der prozentualen Veränderungen stattfinden.
Im Rahmen des ersten Vorversuches wurde zusätzlich eine Einzelfaktorenbestimmung der
Gerinnungsfaktoren II und V sowie von Antithrombin III durchgeführt (Tiere 154 – 159).
Die aPTT zeigte im Versuchsverlauf Schwankungen von maximal 20% für alle Tiere.
Ähnliches galt für die Thrombinzeit, deren Schwankungen mit einer Ausnahme ebenfalls
unter 20% lagen und alle Tiere betrafen. Tier 157 zeigte ausgeprägtere Schwankungen, die
sich vor allem in einem Anstieg um 28 % zwischen den Tagen drei und sieben p.i. sowie
einem nachfolgenden Abfall bis auf 43 % des Maximalwertes an Tag 14 p.i. manifestierten.
Die Verläufe sind in Abbildung 4-9 (aPTT) und Abbildung 4-10 (Thrombinzeit)
wiedergegeben.
4 Ergebnisse
85
Für die Prothombinzeit war ab dem zehnten Tag p.i. bis zum Tag der Euthanasie ein Anstieg
bei den infizierten Tiere, abgesehen von Tier 154, feststellbar. Die Werte stiegen dabei um 70
(Tier 156) bis 94 % (Tier 157), wobei der durchschnittliche Anstieg 83 % betrug. Die
Kontrolltiere zeigten nur geringfügige Schwankungen (mit wenigen Ausnahmen unter
zehn Prozent) in allen durchgeführten Globaltests. Die Prothrombinzeit ist in Abbildung 4-11
gezeigt.
Die unter 3.2.4.2 genannten Inkompatibilitäten in den Reagenzien zur aPTT-Bestimmung
führten, da das Plasma für eine erneute Bestimmung mit dem neuen Reagenz nicht ausreichte,
dazu, dass die aPTT-Ergebnisse des zweiten Vorversuchs erst ab dem vierten Tag p.i.
aufgezeichnet werden konnten. In allen Globaltests wurde ein kommerzielles, humanes
Kontrollplasma mitgeführt.
Bei den Werten der aPTT kam es zu Schwankungen von weniger als 20% bei allen Tieren.
Abweichend zeigte Tier 176 einen Anstieg von ca. 30% vom zehnten auf den 14. Tag p.i. Das
mitgeführte humane Kontrollplasma gab über den gesamten Versuchsverlauf Werte im vom
Hersteller vorgegebenen Referenzbereich. Die ermittelten Werte sind in Abbildung 4-12
dargestellt.
Die Probenaliquots der Tage 14 bis 24 p.i. zur Bestimmung der Thrombinzeit und
Prothrombinzeit für die Tiere 175 bis 181 wiesen nach dem Auftauen teilweise gelartige
Konsistenzveränderungen auf. Standen keine weiteren Proben zur Verfügung, wurden diese
Aliquots versuchsweise eingesetzt.
Die Thrombinzeit zeigte intra- und interindividuelle Schwankungen in den Werten aller Tiere
von Tag null bis zehn p.i., die im Bereich zwischen <10 % (Tiere 175, 180, 181) und 26%
(Tier 176) lagen. Das Plasma der Tiere 176, 178 und 179 wies an den Tagen 14, 21 und 24
p.i. die oben genannten Veränderungen auf und wurde nicht in die Auswertung einbezogen.
Für die Tiere 175 und 177 war ein Anstieg an Tag 21 p.i. zu verzeichnen, dessen Werte
jedoch nur acht bzw. 13 % über dem Ausgangswert an Tag null p.i. lagen. Die Kontrolltiere
wiesen über den gesamten Versuchsverlauf ausschließlich Schwankungen unter 10 % auf.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
86
Das humane Kontrollplasma zeigte durchgängig Werte im angegebenen Referenzbereich. Die
Verläufe sind in Abbildung 4-13 zu finden.
Die Bestimmung der Prothrombinzeit wurde durch Konsistenzveränderungen einiger
Plasmaaliqouts erschwert. Das Plasma der Tiere 176, 178 und 179 wurde an den Tagen 14, 21
und 24 p.i. nicht in die Auswertung einbezogen. Die Plasmaaliquots der Tage eins p.i. für Tier
179 bzw. drei p.i. für Tier 180 zeigten ähnliche Veränderungen. Die Prothrombinzeit wies
einen leichten Anstieg an Tag zehn p.i. für die Tiere 177, 178 und 179 bzw. 14 Tage p.i. für
die Tiere 175 und 176 auf, allerdings war auch für Kontrolltier 180 ein Gipfel zehn Tage p.i.
nachweisbar. Im Vergleich mit dem Nullwert lagen die genannten Verlängerungen unter 10 %
bzw. lagen noch unter den absoluten Zahlen der Nullwerte. Die auswertbare Messwerte der
Kontrolltiere (Tiere 180, 181) zeigten geringe Schwankungen (<10 %). Das humane
Kontrollplasma lag stets im zuvor laborintern ermittelten Bereich für das modifizierte
Protokoll zur Prothrombinzeitbestimmung. Die Darstellung der ermittelten Werte ist in
Abbildung 4-14 abgebildet.
4 Ergebnisse
87
aPTT
25
20
Tier 153
Tier 154
][s15
T
T
P 10
a
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
5
Tier 159
0
0
3
7
10
14
17
Tage pi
Abbildung 4-9: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Die aPTT im Verlauf der KSPVInfektion.
Thrombinzeit
Tier 153
30
]
[s25
it
ze20
in15
b
m10
ro
h 5
T
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
0
0
3
7
10
14
17
Tage pi
Abbildung 4-10: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Thrombinzeit im Verlauf der KSPVInfektion.
Prothrombinzeit
Tier 153
] 50
[s
it 40
ze
in30
b
m20
ro
th10
ro
P 0
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
0
3
7
10
14
17
Tier 159
Tage pi
Abbildung 4-11: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Prothrombinzeit im Verlauf der
KSPV-Infektion.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
88
aPTT
Tier 175
Tier 176
] 35
[s
t 30
ei
sz
g 25
n
u
n 20
in
er15
G
10
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Kontrolle
4
7
10
14
17
21
24
Tage pi
Abbildung 4-12: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der aPTT-Bestimmung. Die Werte für
das humane Kontrollplasma sind hellgrau dargestellt.
Thrombinzeit
Tier 175
18
Tier 176
] 16
[s
it
ze14
in
b
m12
ro
h
T 10
Tier 177
Tier 178
Tier 179
s
Tier 180
Tier 181
Kontrolle
8
0
1
2
3
4
7
10
14
17
21
24
Tage pi
Abbildung 4-13: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Thrombinzeitbestimmung. Die Werte
für das humane Kontrollplasma sind hellgrau dargestellt.
Prothrombinzeit
26
Tier 175
Tier 176
] 24
[s
it 22
ze20
in
b 18
m
16
ro
th14
ro12
P
Tier 177
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
Kontrolle
10
0
1
2
3
4
7
10
14
17
21
24
Tage pi
Abbildung 4-14: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Prothrombinzeitbestimmung. Die
Werte des humanen Kontrollplasmas sind hellgrau dargestellt.
4 Ergebnisse
89
Die Ergebnisse der Fibrinogenbestimmungen für die Tiere beider Vorversuche sind in
Abbildung 4-15 (Tiere 153 – 159) und Abbildung 4-16 (Tiere 175 – 181) dargestellt. Die
absoluten Werte waren nur in der Tendenz vergleichbar, da sie mit unterschiedlichen
Methoden ermittelt wurden (s. 3.2.4.4).
Die Fibrinogenkonzentrationen wiesen für die Tiere 153 – 159 ausgeprägte interindividuelle
Schwankungen auf, welche jedoch für die infizierten Tiere deutlicher ausfielen. Der
Referenzbereich der Methode nach CLAUSS wird von MISCHKE (1999) mit 1,6 – 3,9 g/l
angegeben. Somit sank die Konzentration für keines der Tiere unter den Referenzbereich. Die
oberen Referenzwerte wurden von allen infizierten Tieren im Versuchsverlauf überschritten,
wobei der prozentuale Anstieg, bezogen auf den Vergleich zwischen Nullwert und
Maximalwert, 40,7 (Tier 155) bis 64,1 % (Tier 156) betrug. Tier 157 bildete insofern eine
Ausnahme, als dass bereits der Nullwert über dem Referenzbereich lag.
Die Tiere 176, 178 und 179 zeigten einen erkennbaren Anstieg der Fibrinogenkonzentration
beginnend mit leichten Schwankungen ab dem vierten Tag p.i.. Gleiches galt für die Tiere
175 und 177, deren Werte jedoch daraufhin wieder sanken. Für Tier 177 war zu Versuchsende
der Ausgangswert wieder erreicht, Tier 175 blieb deutlich darüber. Für das Tier 179 konnte an
Tag eins p.i. nur ein hämolytisches Plasma gewonnen werden, welches zudem bereits
Gerinnsel enthielt. Der Anstieg für die infizierten Tiere lag zwischen 32,9 (Tier 177) und
41,9 % (Tier 159) gemessen am Verhältnis zwischen Nullwert und Maximalwert. Für die
Kontrolltiere waren nur geringe Schwankungen erkennbar. Ein Poolplasma der Versuchstiere
vor der Infektion erbrachte Werte von 2,5 ± 0,4 g/l.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
90
Fibrinogenkonzentration
(Methode nach CLAUSS)
5,5
5
]
/l 4,5
[g
en 4
g
o
n 3,5
ri
ib 3
F
Tier 153
2,5
Tier 159
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
2
0
3
7
10
14
17
18
21
Tage pi
Die Bestimmungen erfolgten für die Tiere 153 bis
Abbildung 4-15: Fibrinogenkonzentrationen.
159 mit der Methode nach CLAUSS (Referenzbereich 1,6 – 3,9 g/l).
Fibrinogenkonzentration
(Methode nach RATNOFF und MENZIE)
5,5
5
Tier 175
] 4,5
Tier 176
/l
[g
Tier 177
en 4
g
o
n 3,5
ri
ib
F 3
Tier 178
Tier 179
Tier 180
Tier 181
2,5
2
0
1
2
3
4
7
10
14
17
21
24
Tage pi
Abbildung 4-16: Fibrinogenkonzentrationen. Die Bestimmungen erfolgten für die Tiere 175 bis
181 mit der Methode nach RATNOFF und MENZIE (Normalwert für Poolplasma 2,5 ± 0,4 g/l).
4 Ergebnisse
91
Für den Gerinnungsfaktor II (Prothrombin) war bereits vor der Infektion eine große
interindividuelle Schwankungsbreite zu verzeichnen. Für die Tiere 153, 154 und 155 sowie
in geringerem Ausmaß auch für Tier 156 war ein Gipfel an Tag sieben p.i. zu verzeichnen,
der sich nicht bei den Kontrolltieren fand. Der prozentuale Anstieg lag für diesen Gipfel,
bezogen auf den vorangegangenen Wert bei 38 (Tier 153), 53 (Tier 154) und 48 % (Tier
155), für Tier 156 bei 15 %. Die Werte erreichten Tag 14 p.i. jedoch wieder annähernd den
Wert des vorangegangenen Entnahmetages (Tag drei p.i.). Tier 156 zeigte auf den Gipfel
folgend eine Abnahme der Aktivität, die bis zum Tag der Euthanasie anhielt. Die Aktivität
halbierte sich in dieser Phase. Dieser Abfall war auch für Tier 157 zu verzeichnen. In diesem
Fall sank die Aktivität um mehr als 50 %. Die Verläufe sind in Abbildung 4-17 abgebildet.
Der für den Faktor II beschriebene Gipfel an Tag sieben p.i. fand sich auch in der Aktivität
des Gerinnungsfaktors V. Hier zeigten besonders die Tiere 154 und 155 eine Steigerung der
Aktivität auf Werte von fast bzw. über 300 %. Eine geringere Aktivitätssteigerung war auch
für die Tiere 153 (50 %) und 156 (24 %) zu verzeichnen, deren Faktor-V-Aktivitäten im
Folgenden absanken. Tier 157 zeigte ausschließlich einen Aktivitätsabfall beginnend an Tag
zehn p.i., der zu einer Halbierung der Aktivität führte. Die Kontrolltiere zeigten
Aktivitätsschwankungen bis zu 25 %, wobei die Werte durchschnittlich zwischen 80 und
110 % lagen. Die ermittelten Werte sind in Abbildung 4-18 dargestellt.
Die Aktivität des Antithrombins III nahm bei allen Tieren der infizierten Gruppe im
Versuchsverlauf ab. Besonders ausgeprägt war dieser Verlauf bei den Tieren 153, 155 und
157, bei denen sich die Aktivität halbierte. Kontrolltier 158 wies einen leichten Abwärtstrend,
jedoch keine auffallenden Schwankungen auf, während die Werte von Tier 159 zwischen
110 % und 85 % schwankten. Die Verläufe sind in Abbildung 4-19 abgebildet.
Der EGT, der ausschließlich für die Tiere 175 – 181 durchgeführt wurde, zeigte positive
Reaktionen für die Tiere 175 und 176 an Tag 17 p.i. und für das Tier 179 an den Tagen 14
und 15 p.i. Alle verbleibenden Tiere reagierten über den gesamten Versuchsverlauf negativ.
4 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV- Stamm CSF0634
92
Aktivität des Gerinnungsfaktors II
Tier 153
140
] 120
[%
t 100
ä
it 80
v
ti
k 60
A
40
Tier 154
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
20
0
3
7
10
14
17
18
21
Tage pi
Abbildung 4-17: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-II-Aktivität.
Aktivität des Gerinnungsfaktors V
350
Tier 153
300
Tier 154
] 250
[%
t 200
ä
it
v 150
ti
k
A 100
Tier 155
Tier 156
Tier 157
Tier 158
Tier 159
50
0
0
3
7
10
14
17
18
21
Tage pi
Abbildung 4-18: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-V-Aktivität.
Aktivität des Antithrombins III
120
Tier 153
110
Tier 154
] 100
[% 90
t
ä
it 80
v
ti 70
k
A 60
Tier 155
50
Tier 159
Tier 156
Tier 157
Tier 158
40
0
3
7
10
14
Tage pi
17
18
21
Abbildung 4-19: Einzelfaktorenbestimmung. Antithrombin-III-Aktivität.
4 Ergebnisse
93
4.2 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels
PEG-Hirudin
Die zehn Läuferschweine für dieses Experiment, die nach dem Zufallsprinzip in zwei
4,5
Gruppen aufgeteilt worden waren, wurden mit 5 xKID
10 50 des KSPV Isolats CSF0634
intranasal infiziert. Gruppe I, bestehend aus den Tieren 182 - 186, erhielt täglich PEG-Hirudin
als subkutane Injektion. Gruppe II, die Tiere 187-191 umfassend, diente als unbehandelte
Kontrolle.
4.2.1 Nachweis des therapeutischen PEG-Hirudinspiegels
Der Plasmahirudinspiegel der Tiere 182 – 186 (Gruppe I) wurde täglich mittels ECT
bestimmt, um zu gewährleisten, dass der Plasmahirudinspiegel im therapeutischen Bereich
(ca. 0,5 – 1,5 µg/ml) lag, ohne jedoch toxische Werte zu erreichen. Die Messung erfolgte aus
Citratplasma. Alle Tiere der Gruppe I zeigten über den gesamten Versuch einen den oben
genannten Kriterien entsprechenden PEG-Hirudinspiegel. Die Kalibration der ECT und die
gemessenen Werte für die Einzeltiere befinden sich im Anhang unter 8.1 in Abbildung 8-1
und Abbildung 8-2.
4.2.2 Nachweis der Infektion
Für den Nachweis der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 wurde an Tag zehn nach der
Infektion eine EDTA-Blutprobe gewonnen und die daraus gewonnenen Leukozyten in der
Virusisolierung untersucht. Alle Tiere erwiesen sich als KSPV positiv an Tag zehn p.i. Die
Ergebnisse sind im Anhang unter 8.1 in Tabelle 8-5 dargestellt.
4.2.3 Entwicklung der Körpertemperatur
Die rektale Körpertemperatur der Schweine wurde einmal täglich erfasst und dokumentiert.
Als Fieber wird nachfolgend eine Körpertemperatur über 40°C verstanden. Nach der Infektion
mit dem KSPV-Isolat CSF0634 entwickelten die Tiere der Gruppe I zwischen dem vierten
und siebten Tag Fieber, das bei allen Tieren auf Werte über 41°C anstieg.
Die Tiere der Gruppe II zeigten zwischen dem fünften und sechsten Tag nach der Infektion
erstmals febrile Temperaturen. Die durchschnittliche Maximaltemperatur betrug 41,5°C.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin
94
Der Verlauf der Körpertemperaturen beider Gruppen wurde anhand der Gruppenmittelwerte
verglichen. Wie aus Abbildung 4-20 zu ersehen ist, ergaben sich nur geringfügige
Abweichungen in den Kurvenverläufen.
Gruppenmittelwerte der Körpertemperaturen im Versuchsverlauf
43
42
°C
in
r 41
tu
a
er40
p
m
Te
39
Gruppe I
Gruppe II
38
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Abbildung 4-20: Temperaturkurven dargestellt als Gruppenmittelwerte (Mittelwerte ±
Standardabweichung) der Gruppen I und II.
4.2.4 Dokumentation der klinischen Symptome
Die Dokumentation der klinischen Symptome wurde nach der Inkubationszeit (Zeit zwischen
Infektion und dem Auftreten der ersten Symptome, hier Fieber) gemäß den
Standardprotokollen des EURLs zur Erfassung des CS modifiziert nach MITTELHOLZER
vorgenommen.
Die Tiere der Gruppe I entwickelten nach vier bis sieben Tagen zunächst unspezifische
Krankheitssymptome. Dazu gehörten Apathie, Konjunktivitis, Fressunlust, Diarrhoe und
Obstipation. Tier 182 zeigte bereits neun Tage p.i. schwerste Allgemeinsymptome,
hochgradige Dyspnoe, Ataxie und Hautblutungen und wurde daraufhin moribund
euthanasiert. Bei den anderen Tieren aus Gruppe I entwickelten sich erste Hautblutungen und
zentralnervöse Symptome zwischen dem elften (Tier 183) und 15. Tag p.i. (Tier 185). Alle
Tiere zeigten die akute Verlaufsform der KSP mit hämorrhagischen Symptomen, die sich v. a.
in petechialen Blutungen im Bereich der Akren äußerten, sowie zentralnervöse Symptome.
4 Ergebnisse
95
Vier der fünf Tiere zeigten Anzeichen einer schweren Atemwegsinfektion. Die Euthanasie der
Tiere wurde zwischen dem neunten und 17. Tag nach der Infektion durchgeführt. Der
Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die Tiere der Gruppe I 17,6.
Desgleichen entwickelten alle Tiere der Gruppe II die akute Verlaufsform der KSP. Nach
einer anfänglichen Phase mit unspezifischen Symptomen (s. o.) entwickelten alle Tiere
hämorrhagische Symptome unterschiedlicher Ausprägung. Erste Hautblutungen traten
zwischen dem elften (Tier 189) und 14. Tag p.i. (Tier 190) auf. Wie die Tiere der Gruppe I,
entwickelten auch diese Tiere unterschiedlich ausgeprägte zentralnervöse Symptome. Alle
Tiere zeigten respiratorische Symptome. Die Euthanasie erfolgte zwischen dem 15. und 18.
Tag nach der Infektion. Der Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die
Tiere der Gruppe II 21,6.
Um die Krankheitsverläufe zu vergleichen, wurde der CS auch als Gruppenmittelwert
dokumentiert. Die Gruppenmittelwerte und die entsprechenden Standardabweichungen sind
in Abbildung 4-21 zu sehen. Wie aus der Abbildung ersichtlich wird, zeigten die Tiere der
Gruppe I einen geringfügig niedrigeren CS, die Verläufe präsentierten sich jedoch sehr
ähnlich.
Entwicklung der klinischen Symptome
(Gruppenmittelwerte)
25
20
15
Gruppe I
S
C
Gruppe II
10
5
0
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Tage pi
Abbildung 4-21: Gruppenmittelwerte für den CS beider Tiergruppen. Die Angabe des CS erfolgt
in Punkten von maximal 27. Gruppe I erhielt täglich Hirudin, Gruppe II diente als
Positivkontrolle. Die Erfassung begann mit dem Auftreten erster klinischer Symptome.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin
96
4.2.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde
Die Erfassung und Dokumentation der pathologisch-anatomischen Befunde erfolgte nach dem
Standardprotokoll des EURLs in Anlehnung an das von FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003)
erarbeitete Verfahren.
Die Tiere der Gruppe I wurden zwischen dem neunten und 17. Tag p.i. euthanasiert. Alle
Tiere zeigten in den postmortalen Untersuchungen klassische Befunde, die gemeinhin mit der
KSPV-Infektion in Verbindung gebracht werden. In unterschiedlicher Ausprägung zeigten die
Tiere petechiale und ekchymatöse Blutungen im Bereich der Akren und des ventralen
Abdomens sowie in den Nieren. Alle Tiere wiesen vergrößerte, zum großen Teil
hämorrhagisch-infarzierte Lymphknoten auf. Bei den Tieren 185 und 186 waren
Milzrandinfarkte zu verzeichnen. Schwere Sekundärinfektionen des Respirationstraktes
zeigten die Tiere 183, 184, 185 und 186. Tier 185 zeigte zudem eine purulente Pyelonephritis.
Die Tiere der Gruppe II wurden zwischen dem 15. und 18. Tag nach der Infektion
euthanasiert. Die Sektion zeigte bei allen Tieren klassische Befunde der KSPV Infektion.
Ohne Ausnahme, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung, zeigten die Tiere hämorrhagische
Symptome. Hochgradig vergrößerte Lymphknoten im gesamten Körper konnten ebenfalls bei
allen Tieren gefunden werden. Milzrandinfarkte zeigten die Tiere 187 und 191. Die Tiere 187,
188, 189 und 190 zeigten schwere Sekundärinfekionen des Respirationstraktes, die Tiere 187
und 188 wiesen zudem eine hochgradige Pyelonephritis auf.
Die vergleichende Betrachtung der pathologisch-anatomischen Befunde beider Gruppen zeigt
keine Unterschiede in der Ausprägung oder der Art der Befunde.
Einige Bilder charakteristischer pathologisch-anatomischer Befunde sind in Abbildung 4-22
festgehalten.
4 Ergebnisse
97
A
B
C
E
D
F
Abbildung 4-22: Pathologisch-anatomische Veränderungen, die während der postmortalen
Untersuchungen der Tiere beider Gruppen erhoben wurden. Bild A: Hämorrhagisch-infarzierte
Dünndarmlymphknoten des Tieres 190. Bild B: Charakteristische Hautveränderungen im Bereich
der Ohren. Bild C: Petechien im Verlauf der Herzkranzgefäße und im Myokard. Bild D:
Multifokale Petechien in der Nierenrinde. Bild E: Eitrige Tonsillitis. Bild F: Sekundärinfektion
der Lunge.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin
98
4.2.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen
4.2.6.1 Gesamtleukozytenzahl
Im Verlauf der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 zeigten alle Tiere der Gruppe I eine
hochgradige Leukopenie. Die durchschnittliche Leukozytenzahl sank von 25,58 G/l auf
3,61 G/l. Der Abfall betrug für die Einzeltiere zwischen 48 (Tier 182, neun Tage pi) und 86 %
(Tier 186, 16 Tage pi).
Auch die Tiere der Gruppe II entwickelten eine ausgeprägte Leukopenie im Verlauf der
KSPV-Infektion. Die durchschnittliche Leukozytenzahl betrug zu Beginn des Versuchs 22,68
G/l. Unter der Infektion verringerte sie sich auf 9,85 G/l. Der prozentuale Abfall lag zwischen
32 (Tier 187, 17 Tage p.i.) und 87,2 % (Tier 188, 16 Tage p.i.).
Der Vergleich der beiden Gruppen macht deutlich, dass die Leukopenie in Gruppe II etwas
weniger ausgeprägt war, wobei der Verlauf jedoch einen nahezu parallelen Charakter zeigte
(Abbildung 4-23).
Leukozytenmittelwerte
40
] 35
/l
30
[G
n 25
te20
zy
o 15
k
u 10
Le
5
0
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 14 15 16 17
Tage pi
Abbildung 4-23: Gruppenmittelwerte (MW ± Standardabweichung) für die Leukozytenzahlen
beider Gruppen. Der Referenzbereich ist durch die gestrichelten Linien (Ref. 1 und Ref. 2)
dargestellt.
4 Ergebnisse
99
4.2.6.2 Thrombozytenzahl und Thrombozytenparameter
Alle Tiere entwickelten im Infektionsverlauf eine ausgeprägte Thrombozytopenie. Zwischen
dem zweiten und fünften Tag bzw. dem sechsten und neunten Tag nach der Infektion zeigten
beide Gruppen Gipfel in den Thrombozytenwerten, die der Verlaufkurve ein wellenförmiges
Aussehen verlieh. Die inter- und intraindividuellen Schwankungen waren ausgeprägt.
Die durchschnittliche Thrombozytenzahl sank für die Tiere der Gruppe I von 549 G/l zu
Versuchsbeginn auf 39 G/l, bzw. für das letzte verbleibende Tier (184) auf 13 G/l ab.
Prozentual lag der Abfall für die Einzeltiere zwischen 75 (Tier 182, zehn Tage p.i.) und 96 %
(Tier 184, 17 Tage p.i.). Für Gruppe II war ein Thrombozytenabfall von 395 G/l auf 106 G/l
zu verzeichnen, wobei die prozentuale Änderung, bezogen auf den Nullwert, 30 (Tier 190, 17
Tage p.i.) bis 96 % (Tier 188, 16 Tage p.i.) betrug. Im Vergleich der Maximalwerte mit den
Minimalwerten lag die prozentuale Änderung zwischen 79 (Tier 190) und 97 % (Tier 188).
Die Thrombozytenmittelwerte, deren Verläufe quasi parallel waren, finden sich in unten
stehender Abbildung (Abbildung 4-24).
Thrombozytenzahlen
800
] 700
/l
[g600
n
te500
zy400
o
b
m300
ro200
h
Gruppe 1
Gruppe 2
Ref. 1
Ref. 2
T 100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
14 15 16
17
Tage pi
Abbildung 4-24: Thrombozytenmittelwerte (MW ± Standardabweichung) für die Tiere beider
Gruppen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich ist durch die gestrichelten
Linien gekennzeichnet.
Das MPV zeigte inter- und intraindividuelle Schwankungen, die Gruppenmittelwerte
spiegelten den Verlauf wieder. Die Darstellung befindet sich in Abbildung 4-25.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin
100
Gruppe I zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem Gipfel zwischen dem fünften und
sechsten Tag p.i. und einem zweiten Gipfel zwischen dem 14. und 16. Tag p.i.. Der obere
Referenzwert von 12,6 fl wurde dabei von den Tieren mit Ausnahme des Tieres 185 für den
ersten Gipfel erreicht (Tier 186) bzw. um 0,2 und 2,5 fl (Tiere 182 und 186) überschritten.
Alle Tiere, die zu diesem Zeitpunkt noch lebten, überschritten den oberen Referenzwert
zwischen dem 14. und 16. Tag p.i. um 0,5 (Tier 185) bis 1,9 fl (Tier 184).
Die MPV-Verläufe der Gruppe II stellten sich ähnlich dar. Alle Tiere zeigten, unterschiedlich
ausgeprägt, einen Gipfel zwischen Tag fünf und sechs p.i. sowie einen ähnlichen Gipfel an
Tag 14 p.i.. Tier 187 zeigte dabei ausgeprägte Schwankungen und erreichte fünf Tage p.i. ein
MPV von 20 fl. Tier 188 zeigte einen ersten Gipfel von 14,8 fl und einen nur sehr flach
ausgeprägten Gipfel an Tag 14, der den Referenzbereich nicht verließ. Für die Tiere 189 und
191 konnte zwischen dem fünften und sechsten Tag p.i. kein Blut gewonnen werden, daher
fehlen Informationen über den Verlauf in diesem Bereich. Der erste Gipfel verließ nur bei
Tier 187 den Normalbereich. Für den zweiten Gipfel waren es die Tiere 187, 189 und 191.
Tier 188 unterschritt an den Tagen 15 und 16 p.i. den Referenzbereich. Die Verläufe beider
Gruppen waren somit annähernd parallel.
Mittleres Thrombozytenvolumen
20
18
16
Gruppe I
l] 14
[f
V 12
P
M 10
8
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
6
4
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tage pi
9
10 11 14 15 16 17
Abbildung 4-25: Mittleres Thrombozytenvolumen (MW ± Standardabweichung) für die Tiere
beider Gruppen. Der vom Gerätehersteller angegebene Referenzbereich ist mit gestrichelten
Linien angedeutet (Ref. 1 und Ref. 2).
4 Ergebnisse
101
Der Parameter Large Platelets zeigte für alle Tiere einen Gipfel an Tag fünf bzw. sechs p.i.
Große intra- und interindividuelleSchwankungenwaren zu
beobachten, die
Gruppenmittelwerte geben jedoch den Verlauf wieder. Insgesamt lagen die Maxima für die
Gruppe I zwischen 42000 (Tier 182) und 66000 (Tier 186) Large Platelets pro µl, für die
Gruppe II zwischen 40000 (Tier 191) und 81000 (Tier 187) Large Platelets pro µl. Die
Gruppenmittelwerte sind in Abbildung 4-26 wiedergegeben.
Large Platelets
l] 70
/µ
3
* 60
0
[150
ts40
le
te30
la
P 20
e
rg10
Gruppe I
Gruppe II
La 0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
14
15
16
17
Tage pi
Abbildung 4-26: Large Platelets (MW ± Standardabweichung) für die Tiere beider Gruppen.
4.2.6.3 Hämostaseologische Parameter
Die Verläufe der Gruppenmittelwerte für die Globaltests der Gerinnung sind in Abbildung
4-27 (aPTT), Abbildung 4-28 (Thrombinzeit) und Abbildung 4-29 (Prothrombinzeit)
abgebildet.
Im Vorfeld dieses Versuches wurde die aPTT so kalibriert, dass die eingesetzte
Plasmaverdünnung in Diäthylbarbituratacetatpuffer im physiologischen Bereich eine
Gerinnungszeit von 30 ± 3 sec aufwies (Kalibrierungsdaten sind im Anhang unter 8.1 in
Abbildung 8-3 zu finden). Das gepoolte Plasma wurde im Versuchsverlauf zur Überprüfung
der Methode eingesetzt.
Die aPTT zeigte für beide Gruppen einen leichten Anstieg zwischen dem vierten und sechsten
Tag p.i.. Die Werte der Gruppe I lagen durchschnittlich zehn sec über denen der Gruppe II,
die Werte zeigten jedoch ansonsten einen annähernd parallelen Verlauf. Die Tiere der
Gruppe II wichen vom laborinternen Normalwert an den Tagen drei bis sechs, acht und 16 p.i.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin
102
ab, wobei Verlängerungen der Gerinnungszeit zwischen 1,3 und 6,6 sec zu verzeichnen
waren. Die prozentualen Schwankungen der Gruppenmittelwerte im Versuchsverlauf
betrugen maximal 25 % für Gruppe I und 31 % für Gruppe II. Das Kontrollplasma ergab über
den gesamten Versuchsverlauf Werte im laborinternen Referenzbereich.
Die Gabe des Thrombininhibitors Hirudin machte die Messung der Thrombinzeit für die Tiere
der Gruppe I unmöglich, daher wurde dieser Test nur für die Tiere 187 – 191 durchgeführt
(Gruppe II). Der Verlauf zeigte Gipfel an den Tagen fünf und acht p.i. An Tag fünf p.i.
wurden Gerinnungszeiten gemessen, die drei bis vier sec über dem Ausgangswert lagen. Für
den zweiten Gipfel an Tag acht p.i. lagen die Werte drei bis 3,5 sec darüber. Die Werte
erreichten zu Versuchsende annähernd den Ausgangwert. Das mitgeführte Poolplasma ergab
Thrombinzeiten von 15,5 ± 0,3 sec.
Die Prothrombinzeit zeigte nach einem Abfall an den Tagen eins und zwei p.i. einen bis zum
Versuchsende andauernden Anstieg, dessen Verlauf für die Tiere beider Gruppen quasi
parallel war. Gruppe I lag dabei immer etwas über den Werten der Gruppe II und erreichte zu
Versuchsende einen ca. 7 sec höheren Wert. Im Versuchsverlauf war für die Gruppe I ein
durchschnittlicher Anstieg von fast 20 sec (110 %) zu verzeichnen. Der Ausgangswert lag
durchschnittlich bei 17,8 sec. Die Tiere der Gruppe II zeigten einen durchschnittlichen
Anstieg von 17,4 sec auf 30,2 sec (73,5 %). Das mitgeführte Poolplasma zeigte Werte von
13,1 ± 0,5 sec.
4 Ergebnisse
103
Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
60
55
50
] 45
[s
40
TT
P
a 35
Gruppe I
Gruppe II
Ref.
30
25
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Abbildung 4-27: aPTT für die Tiere der Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Der
laborintern an gepooltem Schweineplasma vor der Infektion ermittelte Standard ist in grau
dargestellt.
Thrombinzeit
24
] 22
[s
it 20
ze
in18
b
m16
ro
14
Th
12
Gruppe II
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Abbildung 4-28: Thrombinzeit für die Tiere der Gruppe II (MW ± Standardabweichung). Da
Hirudin als spezifischer Thrombininhibitor die Messung der Thrombinzeit bei den behandelten
Tieren unmöglich machte, ist hier nur die Kontrollgruppe dargestellt.
4 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin
104
Prothrombinzeit
40
]
[s35
it
ze30
in
b
m25
ro
th20
ro
P
15
Gruppe I
Gruppe II
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Abbildung 4-29: Prothrombinzeit für die Tiere der Gruppen I und II. Dargestellt sind die
Gruppenmittelwerte (MW ± Standardabweichung).
Die Fibrinogenkonzentration ist als Gruppenmittelwert für beide Gruppen in Abbildung 4-30
festgehalten. Die Werte beider Gruppen zeigten einen anhaltenden Aufwärtstrend ab dem
dritten Tag p.i.. Der Ausgangswert von ca. 2,25 g/l erhöhte sich dabei durchschnittlich auf
2,85 g/l für die Tiere der Gruppe I und auf 3,15 g/l für die Tiere der Gruppe II. Der
Gruppenmittelwert der Gruppe I erreichte seinen Gipfel von 3,07 g/l an Tag 13 p.i. und fiel
daraufhin wieder geringfügig ab. Das Maximum für die Gruppe II wurde an Tag elf mit
3,37 g/l erreicht. Zu Kontrollzwecken wurde ein kommerzielles humanes Plasma mitgeführt.
Dieses Plasma zeigte über den gesamten Versuchsverlauf Werte von 2,01 bis 2,12 g/l und lag
damit im unteren Referenzbereich des Herstellers. Die Kalibrationskurve zur Errechnung der
Fibrinogenkonzentration ist im Anhang 8.1 beispielhaft in Abbildung 8-4 dargestellt.
4 Ergebnisse
105
Fibrinogenkonzentration
4,5
] 4
/l
[g3,5
en
g 3
o
n
ri2,5
ib
F 2
1,5
Gruppe I
Gruppe II
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tage pi
Abbildung 4-30: Fibrinogenkonzentration für die Tiere der Gruppen I und II (MW ±
Standardabweichung).
4.3 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo
Eine Vorprüfung der verfügbaren Wirkstoffe in vitro ergab, dass Tirofiban und ASS zu einer
Hemmung der Thrombozytenaggregation in Schweineplasma führten. Diese Wirkstoffe
wurden daraufhin in vivo getestet. Dabei stellte sich heraus, dass Tirofiban aufgrund seiner
Kinetik nicht für den Einsatz in einem längeren Experiment geeignet war. Nach subkutaner
Gabe des Wirkstoffs konnte eine 20 %ige Hemmung erreicht werden, die sich jedoch nicht
aufrechterhalten ließ. Nach einer Stunde konnte keine Hemmwirkung mehr in der
Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden. Dieser Wirkstoff wurde daher nicht weiter
geprüft. ASS zeigte bei intravenöser (i.v.) Gabe nach 60 Minuten eine irreversible Hemmung
der Kollagen-induzierten Thrombozytenaggregation; die ADP-induzierte Aggregation blieb
dabei fast unbeeinflusst. Der monoklonale Antikörper Abciximab zeigte weder in vitro noch
in vivo eine messbare Wirkung und wurde daher nach ersten Versuchen ausgeschlossen. Das
oral zu verabreichende Clopidogrel wurde ausschließlich in vivo getestet und erwies sich in
diesem Vorversuch als wirksam.
Clopidogrel und ASS wurden daraufhin kombiniert in einem dreitägigen Experiment in vivo
eingesetzt. Es kamen orale Formulierungen der Wirkstoffe zum Einsatz, deren Dosierungen in
Tabelle 4-1 aufgeführt sind. Den Tieren wurde nach der Nullwertprobe vor Versuchsbeginn
zweimal täglich Blut entnommen, einmal vor der erneuten Wirkstoffapplikation und einmal
vier bis sechs Stunden danach. Es zeigte sich im Thrombozytenaggregationstest, dass die
4 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo
106
ADP-induzierte Thrombozytenaggregation durch eine einmal tägliche Applikation der oben
genannten Kombination dauerhaft um 30 – 50 % gehemmt wurde. Die Kollagen-induzierte
Thrombozytenaggregation konnte bei zwei von drei Tieren über die gesamte Versuchsdauer
um ca. 30% gehemmt werden. Für das Tier 229 traten starke Schwankungen auf, eine
kontinuierliche Hemmung konnte nicht erreicht werden. Insgesamt zeigte die Kollageninduzierte Thrombozytenaggregation stärkere Schwankungen. Die zu Kontrollzwecken
untersuchten Thrombozytenzahlen zeigten im Versuchsverlauf keine nennenswerten
Änderungen.
Die verwendeten Wirkstoffe, Monitoringverfahren, Dosierungen und Ergebnisse sind
zusammenfassend in Tabelle 4-1 dargestellt.
Tabelle 4-1: Wirkstoffe, Monitoringmethoden, Dosierungen und Ergebnisse der pharmakokinetischen
Vorversuche. Abkürzungen i.v. für intravenös, p.o. für per os.
Wirkstoff
(Handelsname)
Tirofibanhydrochlorid
(Aggrastat®)
Methode zur Überprüfung Dosierung
Wirksamkeit
der Wirksamkeit
Thrombozytenaggregationstests
0,4 mg/kg s.c. Hemmung der
(ADP)
Aggregation nur
kurzfristig und nicht
ausreichend
Abciximab (ReoPro®) Thrombozytenaggregationstests
0,4 mg/kg i.v. Keine Wirkung
(ADP)
Acetylsalicylsäure
Thrombozytenaggregationstests
150 mg/kg i.v. Hemmung der Kollagen(Aspisol®)
(Kollagen)
induzierten Aggregation
irreversibel ab 60 min
post injectionem, keine
bzw. geringfügige
Beeinflussung der ADPinduzierten Aggregation
Clopidogrel
(Iscover®)
Thrombozytenaggregationstests
150 mg/Tier
(ADP)
p.o.
Clopidogrel
(Iscover®)
+
Acetylsalicylsäure
(ASS ratiopharm®)
Thrombozytenaggregationstests
150 mg/Tier
(ADP und Kollagen)
Clopidogrel
p.o.
+
500 mg ASS
Hemmung in der ADPinduzierten Aggregation
um 30 – 40%
Hemmung der ADP- und
Kollagen-induzierten
Aggregation im
Vorversuch über 3 Tage
4 Ergebnisse
107
4.4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels
Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
Das Experiment umfasste zehn Läuferschweine, die nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen
aufgeteilt wurden. Gruppe I, bestehend aus den Tieren 248 - 253, erhielt täglich eine orale
Clopidogrel- und ASS-Gabe. Gruppe II umfasste die Tiere 254 und 256 - 258 und diente als
Kontrolle. Die Einstellung der Medikamentengabe erfolgte eine Woche vor Beginn des
4,5
Infektionsversuches. Die Infektion der Tiere wurde mit 5 xKID
10 50 des KSPV-Isolats
CSF0634 intranasal durchgeführt.
4.4.1 Nachweis der Wirkung
Im Versuchsverlauf konnte eine Hemmung der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation
um durchschnittlich 20 – 30% erreicht werden. Die Darstellung der Gruppenmittelwerte ist im
Anhang unter 8.1 in Abbildung 8-5 zu finden. Bis zum siebten Tag pi verliefen die Werte für
die Gruppen I und II in oben genanntem Abstand von 20 – 30 % quasi parallel, die Werte für
beide Gruppen näherten sich jedoch bis zum Tag elf p.i. an. Zu Versuchsende konnte für drei
Tiere (Tiere 249, 250 und 257) keine Aggregation mehr induziert werden.
Die Ergebnisse für die Kollagen-induzierte Thrombozytenaggregation wiesen sowohl für die
behandelten als auch die Kontrolltiere ausgeprägte intra- und interindividuelle Schwankungen
auf. Ein eindeutiger Verlauf oder Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht zu
erkennen.
4.4.2 Nachweis der Infektion
Für den Nachweis der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 wurde an Tag neun p.i. eine
RNA-Isolierung aus EDTA-Blut vorgenommen und das gewonnene Material in der RT-PCR
untersucht. Für alle Tiere war der KSPV-Nuleinsäurenachweis positiv (siehe Tabelle 8-6).
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
108
4.4.3 Entwicklung der Körpertemperatur
Alle Tiere der Gruppen I und II zeigten Fieber (Temperatur >40°C) am vierten Tag p.i.. Die
Temperatur stieg für alle Tiere durchschnittlich bis zum sechsten oder siebten Tag an und
erreichte danach ein Plateau von durchschnittlich 41 bis 41,5°C. Die febrilen Temperaturen
waren bis zum Zeitpunkt der Euthanasie feststellbar, wobei Tiere, die moribund euthanasiert
wurden, einen Temperaturrückgang zeigten. Es konnten keine augenfälligen Unterschiede
zwischen den Gruppen festgestellt werden. Der Verlauf der Temperaturentwicklung ist in
Abbildung 4-31 als Darstellung der Gruppenmittelwerte festgehalten.
Körpertemperatur im Versuchsverlauf
43
] 42
C
[°
r 41
tu
a 40
er
p 39
m
Te38
Gruppe I
Gruppe II
37
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14
15
16
Tage pi
Abbildung 4-31: Körpertemperatur im Versuchsverlauf für die Gruppen I und II.
(Gruppemittelwerte und deren Standardabweichungen).
4.4.4 Dokumentation der klinischen Symptome
Die Dokumentation der klinischen Symptome wurde nach der Inkubationszeit gemäß den
Standardprotokollen des EURLs zur Erfassung des CS modifiziert nach MITTELHOLZER et
al. (2000) vorgenommen.
Die Tiere der Gruppe I entwickelten nach sieben Tagen zunächst unspezifische
Krankheitssymptome. Dazu gehörten Apathie, Konjunktivitis, Fressunlust, Obstipation und
Diarrhoe. Alle Tiere der Gruppe I entwickelten im weiteren Verlauf unterschiedlich
ausgeprägte zentralnervöse Symptome wie
Schwäche in
der
Nachhand,
Koordinationsprobleme und Krampfneigungen. Hautblutungen im Bereich der Akren traten
4 Ergebnisse
109
bei allen Tieren zwischen dem 13. und 14. Tag auf. Alle Tiere zeigten zudem respiratorische
Symptome ab dem achten bzw. neunten Tag p.i.
Die ersten Krankheitssymptome zeigten die Tiere der Gruppe II fünf Tage p.i.. Nach einer
Phase mit unspezifischen Symptomen entwickelten auch diese Tiere typische Symptome einer
KSPV-Infektion mit zentralnervösen Symptomen und Hautblutungen unterschiedlichen
Ausmaßes. Die Hautblutungen wurden ab dem zehnten (Tier 254) bis 14. Tag p.i. (Tier 256)
offensichtlich. Auch diese Tiere zeigten respiratorische Symptome ab dem achten Tag p.i..
Der CS stieg für die Tiere der Gruppe II etwas früher und bis Tag elf p.i. zudem etwas steiler
an. Danach verliefen die Gruppenmittelwerte der Gruppen I und II quasi parallel. Der
maximale CS für ein Einzeltier der Gruppe I betrug 21 (Tier 253), der maximale
Gruppenmittelwert 17. Für die Gruppe II lag der maximale Einzelwert bei 18 (Tier 257), der
maximale Gruppenmittelwert bei 15.
Die Euthanasie der Tiere wurde zwischen dem 13. und 16. Tag p.i. durchgeführt. Der
Mittelwert des CS zum Zeitpunkt der Euthanasie betrug für die Tiere der Gruppe I 16,67, für
die Tiere der Gruppe II 15,75. Die Gruppenmittelwerte und die entsprechenden
Standardabweichungen sind in Abbildung 4-32 dargestellt.
Clinical Score
25
20
S
C
Gruppe I
15
Gruppe II
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tage pi
10
11
12
13
14
15
16
Abbildung 4-32: Clinical Score für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Die
Darstellung erfolgt in Punkten von 27.
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
110
4.4.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde
Die Erfassung und Dokumentation der pathologisch-anatomischen Befunde erfolgte nach dem
Standardprotokoll des EURLs in Anlehnung an das von FLOEGEL-NIESMANN et al. (2003)
erarbeitete Verfahren.
Alle Tiere zeigten in den postmortalen Untersuchungen klassische Befunde, die gemeinhin
mit der KSPV-Infektion in Verbindung gebracht werden, eine augenfällige Differenz
zwischen den Gruppen gab es nicht.
In unterschiedlicher Ausprägung zeigten die Tiere petechiale und ekchymatöse Blutungen im
Bereich der Akren und des ventralen Abdomens sowie in den Nieren. Alle Tiere wiesen
vergrößerte, zum großen Teil hämorrhagisch-infarzierte Lymphknoten auf.
Schwere Lungenentzündungen wiesen die Tiere 248, 249 und 250 auf. Multifokale
Milzrandinfarkte wurden bei den Tieren 248 und 251 gefunden. Tier 252 zeigte auffällige
petechiale Blutungen in der Magen- und Darmwand, die mit einem kaffeesatzartigen Inhalt
vergesellschaftet waren; dieses Tier wies zudem nekrotische Veränderungen im Bereich der
Ileocaecalpapille auf. Tier 258 zeigte ähnliche Veränderungen der Magen- und Darmwand.
4.4.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen
4.4.6.1 Gesamtleukozytenzahl
Bei der Bewertung der ermittelten Leukozytenzahlen wurde in Ermangelung eines
gerätespezifischen Referenzbereiches für Schweineblut der von MISCHKE (1999)
angegebene Referenzbereich von zehn bis 22 G/l zugrunde gelegt.
Im Verlauf der Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 zeigten alle Tiere eine hochgradige
Leukopenie. Die Leukozytenzahlen begannen bereits nach dem ersten Tag p.i. zu sinken und
ausschließlich die Leukozytenzahlen des Tieres 256 zeigten gegen Versuchsende wieder
einen Aufwärtstrend. Die in Abbildung 4-33 abgebildeten Gruppenmittelwerte zeigten einen
annähernd parallelen Verlauf.
Für die Tiere der Gruppe I sank die durchschnittliche Leukozytenzahl von 19,5 G/l auf
4,7 G/l, was einem prozentualen Abfall von 76 % entsprach. Der maximale Rückgang war für
Tier 253 zu verzeichnen, dessen Leukozytenzahlen im Verlauf der Infektion von 14 G/l um
4 Ergebnisse
111
89 % auf 1,6 G/l absanken. Am geringsten ausgeprägt war die Leukozytendepletion bei
Tier 252 mit einem Rückgang um 50 % von 13,1 G/l auf 6,5 G/l.
Durchschnittlich sanken die Leukozytenzahlen der Tiere aus Gruppe II um 74 % von 25,4 G/l
auf 6,55 G/l. Abweichend von diesen Verläufen zeigte Tier 256 nach einem Rückgang der
Leukozytenzahlen von 23,7 G/l auf 6,7 G/l an Tag elf p.i. eine Normalisierung der Werte bis
auf 10,4 G/l an Tag 16 p.i.. Der Rückgang der Leukozytenzahlen war bei Tier 258 mit 91 %
von 32 G/l auf 2,9 G/l am stärksten ausgeprägt. Die Verläufe der Gruppenmittelwerte sind in
Abbildung 4-33 dargestellt.
Leukozytenzahlen
35
30
] 25
/l
[G
n 20
te
zy
o 15
k
eu
L 10
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Tage pi
Abbildung 4-33: Leukozytenzahlen für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichungen). Als
Referenzbereich wurde der von MISCHKE (1999) angegebene Bereich von zehn bis 22 G/l
zugrunde gelegt. Dieser ist in der Graphik mit gestrichelten Linien markiert (Ref. 1, Ref. 2).
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
112
4.4.6.2 Thrombozytenzahl
Für die Bewertung der Thrombozytenzahlen wurde der von MISCHKE (1999) angegebene
Referenzbereich für Schweineblut von 220 bis 620 G/l zugrunde gelegt.
Alle Tiere entwickelten im Infektionsverlauf eine ausgeprägte Thrombozytopenie. Die
Gruppenmittelwerte beider Gruppen zeigten einen nahezu parallelen Verlauf mit einem ersten
Abfall der Thrombozytenzahlen ab dem dritten Tag p.i., einem leichten Anstieg zwischen den
Tagen vier und sieben p.i. und darauf folgendem Abfall bis zum Versuchsende.
Der Gruppenmittelwert für Gruppe I sank von 449 G/l auf 79 G/l (durchschnittlicher Abfall
von 82 %). Der Abfall lag zwischen 67 % (Tier 251) und 89 % (Tier 252).
Die Tiere der Gruppe II zeigten einen durchschnittlichen Abfall um 90 % von 582 G/l auf
58 G/l. Die Verluste lagen zwischen 72 % (Tier 254) und 95 % (Tier 258).
Thrombozytenzahlen
800
700
] 600
/l
[G
n 500
te
zy400
o
b
m300
ro
h
T200
Gruppe I
Gruppe II
Ref. 1
Ref. 2
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
Tage pi
Abbildung 4-34: Thrombozytenzahlen für die Gruppen I und II im Versuchsverlauf (MW ±
Standardabweichung). Als Referenzbereich wurde der von MISCHKE (1999) angegebene
Bereich von 220 bis 620 G/l zugrunde gelegt. Dieser Bereich ist mit gestrichelten Linien (Ref. 1,
Ref. 2) angedeutet.
4 Ergebnisse
4.4.6.3 Hämostaseologische Parameter
113
Die Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung sind in Abbildung 4-35 (aPTT), Abbildung
4-36 (Thrombinzeit) und Abbildung 4-37 (Prothrombinzeit) festgehalten.
Im Vorfeld dieses Versuches wurde die aPTT wiederum so kalibriert, dass die eingesetzte
Plasmaverdünnung in Diäthylbarbituratacetatpuffer im physiologischen Bereich eine
Gerinnungszeit von 30 ± 3 sec aufwies (Kalibrierungsdaten sind im Anhang unter 8.1 in
Abbildung 8-6 zu finden).
Die aPTT zeigte für die Tiere der Gruppe II nur geringfügige Schwankungen, die mit wenigen
Ausnahmen den für das Poolplasma gesunder Schweine ermittelten Wertebereich nicht
verließen. An Tag fünf und sechs p.i. war ein Anstieg um 40% zu beobachten, der sich an den
Tagen 16 und 17 für das einzige verbleibende Tier (256) wiederholte.
Die Werte der Tiere aus Gruppe I lagen im Versuchsverlauf etwas über denen der Gruppe II,
folgtem dem Verlauf jedoch im Wesentlichen. Der Gruppenmittelwert zeigte einen Anstieg an
Tag zwei p.i. um sieben sec (24 %) und zwischen den Tagen 13 und 15 p.i. einen
zweigipfeligen Anstieg um maximal 44 % bezogen auf den Ausgangswert.
Das zu Kontrollzwecken mitgeführte Humanplasma zeigte Werte zwischen 32,1 und 33,3 sec
und lag damit im vom Hersteller angegebenen Referenzbereich (25,5 – 34,5 sec).
Die Thrombinzeit zeigte einen nahezu parallelen Verlauf der Gruppenmittelwerte bis Tag 14
p.i. mit maximalen Schwankungen von 32 % (ca. 5,5 sec). Tier 250 zeigte 14 Tage p.i. einen
Anstieg der Thrombinzeit um fast 250 % und darauf folgend einen rapiden Abfall. Das
humane Kontrollplasma zeigte Thrombinzeiten von 18,65 – 19,9 sec und lag damit über den
gesamten Versuch im Referenzbereich des Herstellers (14,3 – 21,5).
Die Prothrombinzeit zeigte einen parallelen Verlauf der Gruppenmittelwerte mit geringen
Schwankungen von maximal 15 % bis Tag elf p.i.. Zwischen dem zwölften und 14. Tag p.i.
zeigten die Tiere der Gruppe I einen Anstieg um nahezu 200 %, wobei der Maximalwert für
Tier 249 mit einem Anstieg um über 700 % zu verzeichnen war.
Der Anstieg konnte auch für die Tiere der Gruppe II gezeigt werden. Hier stieg der
Gruppenmittelwert zwischen dem zwölften und 17. Tag p.i. um ca. 600 %.
4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
114
aPTT
80
70
60
]
[s50
T 40
T
P 30
a
20
10
0
Gruppe I
Gruppe II
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tage pi
10 11 12 13 14 15 16 17
Abbildung 4-35: aPTT für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung). Der Test wurde
anhand eines Poolplasmas gesunder Schweine kalibriert. Die Werte für das Poolplasma lagen bei
30 ± 3 sec.
Thrombinzeit
60
] 50
[s
it40
e
z
in30
b
m
o
r 20
h
T
10
Gruppe I
Gruppe II
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Abbildung 4-36: Thrombinzeit für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung).
Prothrombinzeit
160
140
]
[s 120
it
e 100
z
in
b 80
m 60
o
r
Gruppe I
Gruppe II
th 40
o
r
P 20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Abbildung 4-37: Prothrombinzeit für die Gruppen I und II (MW ± Standardabweichung).
4 Ergebnisse
115
Die Fibrinogenkonzentration der Gruppen I und II zeigten einen annähernd parallelen Verlauf
mit einem Anstieg ab Tag sechs bis sieben p.i.. Die Gruppenmittelwerte spiegelten die
individuellen Verläufe wider. Der durchschnittliche Anstieg der Fibrinogenkonzentration
betrug für Gruppe I ca. 45 % (von 4,78 auf 6,92 g/l), für Gruppe II ca. 52 % (von 4,97 auf
7,56 g/l). Die Werte für das mitgeführte humane Kontrollplasma lagen mit 3,0 ± 0,4 g/l im
oberen Referenzbereich. Die Verläufe der Gruppenmittelwerte sind in Abbildung 4-38
dargestellt.
Fibrinogenkonzentration
9
8
]
/l 7
[g
6
en
g
o
Gruppe I
n5
ri
ib4
F
Gruppe II
3
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Abbildung 4-38: Fibrinogenkonzentration (MW ± Standardabweichung) für die Gruppen I und II.
5 Diskussion
Die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen kann v. a. bei jungen Tieren zu einem
akuten Krankheitsbild führen, das durch hämorrhagische Symptome gekennzeichnet ist, die
dem Bild eines klassischen viralen hämorrhagischen Fiebers entsprechen (GOMEZVILLAMANDOS et al., 2003a). Gemeinsamkeiten mit anderen viralen hämorrhagischen
Fiebern wie z. B. der Ebolavirusinfektion betreffen sowohl die klinischen Symptome als auch
die Zielzellen des Virus und die pathogenetischen Mechanismen (GOMEZ-VILLAMANDOS
et al., 2003a).
Bisher konnten weder die Genese der hämorrhagischen Symptome, die im Verlauf der akuten
KSPV-Infektion auftreten, noch die der Thrombozytopenie und Leukopenie hinreichend
aufgeklärt werden. Während Thrombozytopenie und Hämorrhagien in den 1970er Jahren im
Sinne einer DIC bzw. Verbrauchskoagulopathie gedeutet wurden (HEENE et al., 1971;
HOFFMANN et al., 1971a), werden gegenwärtig v. a. Makrophagen und deren Zytokine für
die Symptomatik verantwortlich gemacht (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die pathogenetischen Mechanismen, die den
hämorrhagischen Symptomen und hämostaseologischen Veränderungen zugrunde liegen,
näher charakterisiert werden. Nach Vorversuchen zur Auswahl des geeigneten KSPV-Isolates
und zur Untersuchung des Verlaufs klinischer, pathologisch-anatomischer, hämatologischer
und hämostaseologischer Parameter wurden dazu zwei Ansätze gewählt, welche eine
pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen des Hämostasesystems vorsahen.
Es wurde einerseits die Endstrecke der plasmatischen Gerinnung und andererseits die
Thrombozytenaggregation gehemmt. Zu diesem Zweck wurden der Thrombininhibitor PEGHirudin und die Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
verwendet.
5 Diskussion
117
5.1 Auswahl und Virulenz des KSPV-Isolates
Für die Zielsetzung dieser Arbeit war es unabdingbar, die Tierversuche mit einem
hochvirulenten KSPV-Stamm durchzuführen, der in der Lage war, die KSP-typischen
Hämorrhagien zu induzieren.
Aus vorangegangenen Versuchen am EURL war bekannt, dass das KSPV-Isolat CSF0634
anhand des modifizierten Untersuchungsschemas nach MITTELHOLZER et al. (2000) mit
einem CS >14 als hochvirulent eingestuft werden konnte (FLOEGEL-NIESMANN et al.,
2003). Mit diesem Isolat infizierte Tiere zeigten zudem reproduzierbar unterschiedlich
ausgeprägte hämorrhagische Symptome.
Das Isolat wurde für die vorliegende Arbeit zunächst im Rahmen der Vorversuche eingesetzt.
Da alle infizierten Tiere (n = 10) an der akuten Verlaufsform der KSP erkrankten und die
überwiegende Mehrzahl (80 %) unterschiedlich ausgeprägte Hämorrhagien entwickelte,
wurde das Isolat als geeignet eingeschätzt und in den Hauptversuchen eingesetzt. Alle Tiere
der Hauptversuche erkrankten ebenfalls akut und zeigten hämorrhagische Symptome sowie
einen CS ≥ 14.
5.2 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634
Neben den klinischen Symptomen wurden in allen Versuchen die pathologisch-anatomischen
Befunde sowie hämatologische und hämostaseologische Parameter bewertet.
Die erhobenen pathologisch-anatomischen Befunde entsprachen mit vergrößerten,
hämorrhagisch-infarzierten Lymphknoten im gesamten Organismus, hämorrhagischen
Veränderungen in den Nieren und anderen inneren Organen, entzündlichen Veränderungen
des Respirationstraktes sowie Milzrandinfarkten den Ergebnissen, die von RÖHRER und
PEHL (1960) und VAN OIRSCHOT (1999) für die akute Verlaufsform der KSP beschrieben
wurden.
In einer Übersichtsfärbung (HE) wurde an Paraffin-eingebetteten Organschnitten von fünf
infizierten Tieren versucht, eine Thrombosierung der kleineren bis mittelgroßen Gefäße
nachzuweisen, die zu den histopathologischen Äquivalenten der oben beschriebenen
makroskopischen Veränderungen gehören sollten (RÖHRER und PEHL, 1960; HEENE et al.,
5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634
118
1971; HOFFMANN et al., 1971a; QUEZADA et al., 2000). In den großen Gefäßen wurden,
den Berichten in der Literatur entsprechend, keine Thromben gefunden (RÖHRER und
PEHL, 1960; HOFFMANN et al., 1971a).
Während HOFFMANN et al. (1971) eine Thrombosierung kleiner und mittlerer Gefäße
verschiedener Organe in der HE-Färbung Paraffin-eingebetteter Organschnitte nachwies,
konnte dieser Befund in der vorliegenden Studie nicht nachvollzogen werden.
Für diese Diskrepanz der Befunde sind mehrere Erklärungen denkbar. Zum einen sind
Mikrothromben und Plättchenaggregate in Kapillaren auch mit spezifischen Färbemethoden
sehr schwer nachweisbar, da sie von unterschiedlichsten Proteasen des fibrinoytischen
Systems und leukozytärer Zellen aufgelöst und durch aktivierte Makrophagen phagozytiert
werden (SCHIEFER und SEARCY, 1975). Diese Prozesse laufen auch postmortal weiter und
beeinflussen die Aussagekraft negativer Befunde. Daher ist nicht auszuschließen, dass eine
perimortale Auflösung der Thromben den Nachweis unmöglich machte. Eine Hemmung des
proteolytischen Abbaus könnte zur Abklärung sinnvoll sein, dieser Ansatz ließ sich jedoch
unter den gegebenen Umständen nicht umsetzen.
Zum anderen ist die HE-Färbung als Nachweismethode kritisch zu hinterfragen, da die HEFärbung nur eine Übersichtsfärbung ist, die aus Praktikabilitätsgründen durchgeführt wurde.
Kleinste Thromben und Fibrinablagerungen wären mit Färbungen wie der PTAH-Färbung
(phosphotungstic acid-hematoxilin) besser und sicherer nachweisbar gewesen, jedoch waren
diese Färbungen unter den gegebenen Möglichkeiten nicht durchführbar. Wie oben erwähnt,
waren Thrombosierungen in der Studie von HOFFMANN et al. (1971) allerdings auch in der
HE-Färbung nachweisbar.
Des Weiteren ist die Rolle des verwendeten Virusstamms zu betrachten. Die Versuche in den
1970er Jahren wurden mit einem anderen KSPV-Stamm durchgeführt, der u. U. andere
pathologisch-anatomische Befunde induzierte. Leider ist der Publikation von HOFFMANN et
al. (1971) die genaue Beschreibung des Virusstammes nicht zu entnehmen, es hat sich jedoch
gezeigt, dass in den letzten Jahrzehnten ein Wandel in der Virulenz und Klinik der KSPStämme zu beobachten war (WILLIAMS und MATTHEWS, 1988; KOENEN et al., 1996;
PATON und GREISER-WILKE, 2003a). Das KSPV-Isolat CSF0634, welches für die
vorliegende Studie verwendet wurde, gehört zu den aktuellen Stämmen der 1990er Jahre und
könnte daher abweichende Charakteristika aufweisen.
5 Diskussion
119
Der Virus- bzw. Antigennachweis, der zum Beweis der Infektion mit dem KSPV
durchgeführt wurde, zeigte, dass alle Tiere erfolgreich infiziert werden konnten. Negative
Antigen- und Virusnachweise für zwei der 30 Tiere zu Versuchsende zeigen, dass diese Tiere
trotz der hohen Virulenz des KSPV-Isolates in der Lage waren, das Virus zu eliminieren und
in die Phase der Rekonvaleszenz eintraten; diese Tiere zeigten zudem auch eine moderate
Antikörperproduktion und Normalisierung der Blutparameter. Für die vorliegende Arbeit
waren Rekonvaleszenten für eine weitere Auswertung nicht mehr nutzbar. Ihr Auftreten
zeigte jedoch, dass die Virulenz des Erregers stark von der Konstitution des betroffenen
Tieres abhängt.
Alle Tiere entwickelten im Verlauf der KSPV-Infektion eine markante Leukopenie, die
sowohl in ihrem Verlauf als auch in der Ausprägung den für die akute Verlaufsform der
KSPV-Infektion publizierten Beobachtungen entsprach (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al.,
1998; SUMMERFIELD et al., 2001a).
Alle infizierten Tiere entwickelten eine Thrombozytopenie, die für einige Tiere zum fast
vollständigen Verlust der Thrombozyten führte (Absinken um 98 %). Die Verläufe der
Thrombozytenzahlen entsprachen ebenfalls den publizierten Daten (HEENE et al., 1971;
HOFFMANN et al., 1971a), wobei im vorliegenden Fall die von GOMEZ-VILLAMANDOS
et al. (1998) postulierte direkte Korrelation zwischen dem Auftreten der ersten Symptome und
dem Absinken der Thrombozytenzahlen nicht nachvollziehbar war. Dies könnte u. U. daran
liegen, dass diese Arbeitsgruppe ein KSPV-Isolat verwendete, das früher zu klinischen
Symptomen führte. Während diese Autoren für den KSPV-Stamm „Quillota“ vom ersten
Auftreten klinischer Symptome an Tag zwei p.i. berichten, traten die ersten Symptome mit
dem Isolat CSF0634 vier bis sieben Tage p.i. auf, was den allgemeinen Beobachtungen
entspricht (FLOEGEL-NIESMANN et al., 2003).
Auffällig war, dass der Referenzbereich des Geräteherstellers (Sysmex Deutschland,
Norderstedt) für Thrombozytenwerte des Schweins bei 16 von 24 Tieren an den ersten Tagen
überschritten wurde. Da dies sowohl für die Einzeltiere als auch für das gepoolte Plasma
gesunder Schweine der Fall war, ist die Gültigkeit der oberen Grenze des Referenzbereiches
kritisch zu hinterfragen. Legte man den Referenzbereich nach MISCHKE (1999) zugrunde,
lägen über 95% der Tiere im Normalbereich.
5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634
120
Trotz fehlender Referenzbereiche für Schweinethrombozyten in der Literatur wurden die
Thrombozytenparameter MPV und Large Platelets in die hämatologischen Untersuchungen
und Auswertung einbezogen, da sie als Marker für die Aktivität der Thrombozyten gelten. Für
das MPV lagen Referenzbereiche des Geräteherstellers vor, nach denen sich die Auswertung
richtete. Ein Anstieg des MPV wird als regenerative Veränderung gedeutet, die durch den
Nachschub junger, größerer Thrombozyten aus dem Knochenmark entsteht. Sie ist somit
indirekt auch ein Anzeiger kompensierter Verbrauchsreaktionen (mit funktionsfähigem
Knochenmark). Im Verlauf der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 zeigte sich eine sehr
große intra- und interindividuelle Schwankungsbreite. Es war jedoch bei den infizierten
Tieren ein tendenzieller Anstieg zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. zu verzeichnen.
Der Parameter Large Platelets zeigte einen gleichsinnigen Gipfel. Betrachtet man diese
Tendenzen zusammen, ist anzunehmen, dass eine regenerative Kapazität des Knochenmarks
vorhanden war, und vermehrt junge Thrombozyten freigesetzt wurden. Das Auftreten dieser
Thrombozyten ist jedoch auch als Indiz einer Verbrauchsreaktion zu werten.
Die Globaltests der Gerinnung aPTT, Thrombinzeit und Prothrombinzeit wurden als
Screeningtests des plasmatischen Gerinnungssystems durchgeführt. Die aPTT diente dabei
der thrombozytenunabhängigen Untersuchung des intrinsischen Weges der Blutgerinnung
(MISCHKE, 1999a; MISCHKE, 1999b; BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Abgesehen
von den in 5.3 genannten Verschiebungen durch die Hirudintherapie, zeigte die aPTT hier nur
moderate Schwankungen (bis 20%). Einzelwerte, die deutlich außerhalb des erwarteten
Bereichs lagen, konnten eindeutig mit Problemen bei der Blutentnahme und zu langen
Auftauzeiten in Verbindung gebracht werden. Kam es bei der Blutentnahme durch Verletzung
des Endothels zu einer verstärkten lokalen Aktivierung der Gerinnung, wurde häufig eine
Verkürzung der Gerinnungszeiten beobachtet. Es zeigte sich zudem, dass sowohl die
Auftaugeschwindigkeit als auch die Temperatur des Diäthylbarbituratacetatpuffers wichtige
Einflussgrößen auf die Aussagekraft und Reproduzierbarkeit der Gerinnungszeiten
darstellten. Die besten Ergebnisse wurden mit vorgewärmtem Puffer und rasch aufgetauten
Proben erzielt. Dabei war dem schnellen Auftauen im Wasserbad bei 37°C gegenüber dem
Auftauen bei Raumtemperatur der Vorzug zu geben.
5 Diskussion
121
Der Verlauf der aPTT im Infektionsgeschehen legt nahe, dass dem intrinsischen Weg des
plasmatischen Gerinnungssystems keine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese der
KSP zukommt. Eine dekompensierte DIC geht gemeinhin mit einer Verlängerung der aPTT
einher, die im vorliegenden Fall nicht in Erscheinung trat. Auch die Verkürzung der aPTT,
die für die kompensierte Phase einer DIC charakteristisch ist, trat nicht auf.
Die Thrombinzeit gilt als Suchtest bei Verdacht auf Fibrinogenmangelzustände und beurteilt
die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung, die auch von aPTT und Prothrombinzeit
abgedeckt wird (MISCHKE, 1999a). Die Thrombinzeit zeigte analog zu den Werten der aPTT
nur moderate Schwankungen. Einige Werte mit ausgeprägten Abweichungen konnten mit
Konsistenzveränderungen der Plasmaaliquots korreliert werden, was die Bedeutung der
Probenqualität für die Aussagekraft dieses Tests unterstreicht.
Markante Änderungen traten ausschließlich in den Werten der Prothrombinzeit auf, die als
Screeningtest für den extrinischen Weg der Blutgerinnung (BARTHELS und VON DEPKA,
2003b) gilt. Für alle infizierten Tiere zeigte sich ein Anstieg ab dem zehnten Tag pi, der
jedoch unterschiedlich ausgeprägt war. Wie die oben genannten Gerinnungstests reagierte
auch die Prothrombinzeit empfindlich auf Änderungen der Entnahme-, Lagerungs- und
Auftaubedingungen.
Für die Prothrombinzeit ist bekannt, dass sie im Verlauf einer DIC häufig erhöht ist
(BARTHELS und VON DEPKA, 2003c). Die in der vorliegenden Arbeit gemessenen Werte
zeigten, dass es in der Finalphase der Erkrankung zu einem Verbrauch der Faktoren des
extrinsischen Systems kommt. Dieser Befund entsprach den Befunden, die in den 1970er
Jahren erhoben wurden (HEENE et al., 1971).
Die Fibrinogenbestimmung zeigte einen Aufwärtstrend für alle infizierten Tiere, der in
seinem Verlauf mit den Befunden von HEENE et al. (1971) übereinstimmte.
Die Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere des ersten Vorversuches zeigten ausgeprägte
Schwankungen, die eine exakte Auswertung nicht zuließen. Die in diesem Vorversuch
durchgeführte Methode nach CLAUSS erwies sich als störanfällig und war für den
Versuchskomplex mit Hirudin nicht geeignet (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Sie
wurde durch die Methode nach RATNOFF und MENZIE ersetzt, die zwar arbeits- und
zeitintensiv ist,
jedoch
weder durch
Gerinnungshemmernoch
Fibrinogen-
Degradationsprodukte beeinflusst wird (BARTHELS und VON DEPKA, 2003b).
5 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634
122
Fibrinogen kann als Akutphaseprotein schnell und in großer Menge bereitgestellt werden und
ist daher bei inflammatorischen Prozessen erhöht. Es ist zudem von wesentlicher Bedeutung
bei der Thrombozytenaggregation, wo es über die Bindung an den GPIIB/IIIa Rezeptor die
Verbindung der aktivierten Thrombozyten realisiert.
Die auftretenden, moderaten Erhöhungen können als Anpassungs- bzw. Regenerationsversuch
nach einem erhöhten Verbrauch gewertet werden. Der für eine dekompensierte DIC häufig
charakteristische Abfall der Fibrinogenkonzentration (BATEMAN et al., 1999) konnte im
Verlauf der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 nicht nachgewiesen werden.
Das Auftreten löslicher Fibrinmonomere im Plasma wurde mit dem EGT überprüft, der als
Schnelltest eine rein qualitative Auskunft gibt. Erhöhte Konzentrationen werden bei
gesteigerter intravasaler Gerinnung und Gefäßverschlüssen erwartet (BARTHELS und VON
DEPKA, 2003d). Der EGT wurde bei den Tieren des zweiten Vorversuchs durchgeführt und
erbrachte positive Ergebnisse erst in der Finalphase der Erkrankung bei drei von fünf
infizierten Tieren. Der Test erwies sich als störanfällig. Da lösliches Fibrin sehr instabil ist,
eine Fehlinterpretation durch präanalytische Fehler (Thrombinbildung bei der Entnahme)
relativ häufig auftritt sowie Kreuzreaktionen mit plasmininduzierten Fibrin(ogen)derivaten
gegeben sein können (BARTHELS und VON DEPKA, 2003d), gibt der Test nur einen ersten
Anhaltspunkt. Dennoch sind die positiven Ergebnisse als Indiz dafür zu werten, dass eine
überschießende Aktivierung des Gerinnungssystems in der Finalphase der KSP-Erkrankung
vorlag.
Einzelfaktorenbestimmungen wurden für die Tiere des ersten Vorversuches für die Faktoren
II, V und Antithrombin III durchgeführt. Gerinnungsfaktor II (Prothrombin) zeigte
ausgeprägte Schwankungen und konnte nur in einer Trendanalyse ausgewertet werden. Vier
von fünf infizierten Tieren zeigten im Gegensatz zu den Kontrolltieren einen deutlichen
Anstieg an Tag sieben p.i.. Diese Aktivitätssteigerung indiziert eine Aktivierung des
Gerinnungssystems, die jedoch kompensiert zu sein scheint, da auffällige Entsprechungen in
den Globaltests nicht nachweisbar waren.
Die Faktor-V-Aktivität stellt einen besonders sensiblen Indikator für intravasale
Thrombinaktivität und damit eine Verbrauchskoagulopathie dar (HEENE et al., 1971), wobei
eine erhöhte Faktor-V-Aktivität in der Phase I einer Verbrauchskoagulopathie zu erwarten ist
(BARTHELS und VON DEPKA, 2003b). Die Messwerte für Faktor V reagierten empfindlich
5 Diskussion
123
auf eine Aktivierung des Gerinnungssystems bei Blutentnahmeproblemen im Sinne eines
falsch erhöhten Spiegels. Dessen ungeachtet, zeigte Faktor V gleiche Veränderungen wie
Faktor II. Der Gipfel an Tag sieben p.i. ist Anzeichen einer kompensierten
Gerinnungsaktivierung, während der Abfall gegen Ende des Versuchs für eine
Verbrauchsreaktion spricht.
Antithrombin III ist der natürliche Inhibitor der Gerinnungsfaktoren und zeigt verminderte
Aktivität v. a. im Rahmen einer Hyperfibrinolyse und in der dekompensierten Phase einer
DIC (MISCHKE, 1999a). Die Antithrombin-III-Aktivität nahm bei allen infizierten Tieren ab,
wobei sich die Werte bei drei von fünf Tieren in etwa halbierten. Diese Reaktion korreliert
mit den oben genannten Befunden und ist hinweisend für eine Verbrauchssituation.
5.3 Auswirkungen der Hemmung des plasmatischen Gerinnungssystems
auf den Infektionsverlauf
Der Thrombininhibitor PEG-Hirudin wurde gewählt, um die Endstrecke der plasmatischen
Gerinnung zu hemmen und damit den Einfluss dieses Systems auf den Krankheitsverlauf
näher zu untersuchen. Die Wirksamkeit von Hirudin war bereits in einem Versuch zur
Prävention der endotoxininduzierten DIC im Schweinemodell belegt worden (NOWAK und
MARKWARDT, 1980a). Für das Experiment in der vorliegenden Arbeit wurden zehn
Läuferschweine mit dem KSPV-Isolat CSF0634 infiziert. Fünf Schweine (Gruppe I) erhielten
eine tägliche, subkutane PEG-Hirudininjektion, fünf unbehandelte Schweine dienten der
Kontrolle. Im Versuchsverlauf wurden klinische, hämatologische und hämostaseologische
Parameter erhoben und für beide Gruppen verglichen. Gleiches galt für die Ergebnisse der
postmortalen Untersuchung nach der Euthanasie der Tiere.
Mittels ECT konnte über den gesamten Versuchsverlauf gezeigt werden, dass ein
therapeutischer Plasmahirudinspiegel von ca. 0,5 – 1,5 µg/ml bei allen Tieren der behandelten
Gruppe erreicht und erhalten werden konnte, ohne in den toxischen Wertebereich zu
kommen.
Alle infizierten Tiere entwickelten die akute Verlaufsform der KSP mit unterschiedlich
ausgeprägten hämorrhagischen Symptomen und pathologisch-anatomischen Befunden, wobei
die hämorrhagischen Erscheinungen durch eine PEG-Hirudingabe über das erste Auftreten
5 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den Infektionsverlauf
124
petechialer Blutungen hinaus, nicht negativ beeinflusst wurde. Die Ausprägung der
Hämorrhagien zeigte keine Korrelation mit der Gruppenzugehörigkeit.
Der Vergleich beider Gruppen hinsichtlich des Krankheitsverlaufs und der hämatologischen
und hämostaseologischen Parameter zeigte keinen augenfälligen Einfluss der PEGHirudingabe auf die erhobenen Parameter. Auch die Gruppenmittelwerte für die Parameter
Körpertemperatur, CS, Globaltests der Gerinnung, Leukozyten- und Thrombozytenzahlen,
MPV, Large Platelets und Fibrinogen zeigten einen nahezu parallelen Verlauf. Eine
Ausnahme bildete die aPTT, deren Verläufe der Gruppenmittelwerte sich versetzt parallel
darstellten. Die aPTT-Werte der behandelten Gruppe lagen über den gesamten
Versuchsverlauf ca. zehn sec über denen der Kontrollgruppe, was durch die Wirkung des
PEG-Hirudins zu erklären ist. Es ist bekannt, dass die aPTT im unteren therapeutischen
Konzentrationsbereich eine nahezu lineare Korrelation zwischen Hirudinkonzentration und
Verlängerung der Gerinnungszeit zeigt. Sie wurde deshalb zur Überwachung der
Hirudintherapie in der Humanmedizin herangezogen (MONREAL et al., 1995; BARTHELS
und VON DEPKA, 2003d; GOSSELIN et al., 2004) und von den Herstellern teilweise noch
immer dafür empfohlen. Die mangelnde Linearität im oberen und toxischen
Konzentrationsbereich sowie ihre großen interindividuellen Unterschiede machen sie jedoch
für eine aussagekräftige Überwachung ungeeignet (NOWAK, 2001). Dennoch belegen die
aufgetretenen Verlängerungen der aPTT und der parallele Verlauf zu den Werten der
Kontrollgruppe die Hirudinwirkung und ihre Konstanz.
Die Thrombinzeit war durch die Gabe des direkten Inhibitors PEG-Hirudin so ausgeprägt
verlängert, dass eine Messung mit den etablierten Methoden unmöglich war. Für die
Kontrollgruppe ergab sich ein Anstieg der Thrombinzeit zwischen dem fünften und achten
Tag p.i., der jedoch vor dem Hintergrund, dass Referenzwerte für die Thrombinzeit beim
Schwein mit einer Spannbreite von mehreren Sekunden angegeben werden (KARGES et al.,
1994), zu vernachlässigen zu sein scheint.
5.4 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den
Infektionsverlauf
In Vorversuchen wurde in vitro und in vivo ein geeigneter Wirkstoff zur Hemmung der
Thrombozytenaggregation gesucht, dessen Wirksamkeit sich über einen Aggregationstest
5 Diskussion
125
nachweisen ließ. Da der Thrombozytenaggregationstest für Schweineplasma nicht etabliert
war, musste die Anwendbarkeit der gebräuchlichen Aggregationsinduktoren zunächst getestet
werden. Als Vergleichswert wurde humanes Plasma eingesetzt. Von den Induktoren ADP,
Kollagen, Ristocetin und Arachidonsäure zeigten nur die beiden ersten eine zufriedenstellende
Induktion der Thrombozytenaggregation.
Wirkstoff der ersten Wahl zur Thrombozytenaggregationshemmung wäre der monoklonale
Antikörper Abciximab gewesen, da er über die Hemmung des GPIIb/IIIa-Rezeptors nicht nur
die Thrombozyteninteraktionen, sondern auch die Interaktionen mit polymorphkernigen
neutrophilen Granulozyten gehemmt hätte (HABAZETTL et al., 2000). Der Interaktion der
Thrombozyten mit neutrophilen Granulozyten über den GPIIb/IIIa-Rezeptor wird in der
Humanmedizin v. a. eine Rolle in der Pathogenese thrombotischer Ereignisse beigemessen, da
diese Interaktion die Thrombusbildung fördert und zur weiteren Plättchenaktivierung führen
kann (DE GAETANO et al., 1999; ANDREWS und BERNDT, 2004). Im Zusammenhang mit
dieser Studie wäre die Hemmung der Plättchenaktivierung das Ziel gewesen.
Da jedoch schon in vitro Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen zeigten, dass
Abciximab keine Wirksamkeit im Schwein besitzt, musste ein anderer Wirkstoff gefunden
werden. Für die GPIIb/IIIa-vermittelte Thrombozytenaggregation wurden speziesspezifische
Unterschiede nachgewiesen (JENNINGS et al., 1995), so dass die mangelnde Wirksamkeit
des chimären monoklonalen Antikörpers, der im entscheidenden Teil humane Spezifikationen
zeigt, auf dieser Grundlage erklärt werden kann.
Der GPIIb/IIIa-Rezeptorblocker Tirofiban, der bereits im Schweinemodell angewendet wurde
(SHEN et al., 2000), erwies sich nach den in vitro Studien zunächst als Erfolg versprechender
Kandidat, zeigte jedoch in vivo eine sehr ungünstige Kinetik und musste daher ebenfalls
ausgeschlossen werden. Es zeigte sich, dass Daten zu den Wirkstoffen, die in kurzfristigen
Studien an häufig narkotisierten Schweinen und bei überwachter intravenöser Gabe der
Substanzen gewonnen wurden, für die Anwendung außerhalb dieser Modelle nicht
übertragbar waren.
Der Wirkstoff Clopidogrel, welcher die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation hemmt,
wurde, da er oral zu verabreichen ist und erst in seiner metabolisierten Form wirksam wird,
ausschließlich in vivo getestet. Es zeigte sich, dass sich mit einer Dosierung von 150 mg/Tier
die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation um 30 bis 40 % hemmen ließ. 150 mg
5 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung auf den Infektionsverlauf
126
entsprechen der doppelten Dosis, die für einen erwachsenen Menschen pro Tag veranschlagt
wird. Diese Unterschiede in der Dosis-Wirkungsbeziehung könnten auf die unterschiedliche
physiologische Thrombozytenzahl zurückzuführen sein. Während der Referenzbereich für
einen erwachsenen Menschen bei 150 – 400 G/l liegt, liegen die physiologischen Werte für
das Schwein trotz großer individueller Schwankungsbreite bei 600 G/l und darüber. In
Tiermodellen wurde gezeigt, dass ASS die Wirkung des Clopidogrels potenzieren kann
(HERBERT et al., 1996; HERBERT et al., 1998; HARKER et al., 1998), daher wurde auch
die Wirksamkeit der ASS überprüft. Die Versuche mit ASS zeigten, dass sie sowohl in vitro
als auch in vivo eine Hemmung der kollageninduzierten Thrombozytenaggregation hervorrief.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die Kombination Clopidogrel und ASS in einem
dreitägigen in vivo Versuch getestet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kombination aus
150 mg/Tier/Tag Clopidogrel und 500 mg/Tier/Tag ASS zu einer stabilen Hemmung der
ADP- und kollageninduzierten Thrombozytenaggregation führte. Die Hemmung betrug ca.
30 – 50 % für die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation und ca. 30 % für die
kollageninduzierte Thrombozytenaggregation, wobei die Hemmung der kollageninduzierten
Aggregation nur für zwei von drei Tieren sicher belegt werden konnte, da das dritte Tier
starke Schwankungen zeigte, die eine Auswertung unmöglich machten.
Da sowohl ASS als auch Clopidogrel irreversible Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation
sind, ist es auffallend, dass derart hohe Dosierungen für ein Läuferschwein von ca. 15 kg
Lebendgewicht notwendig waren. Die hohen physiologischen Thrombozytenzahlen des
Schweins und die große Reservekapazität des Knochenmarks könnten jedoch eine Rolle dabei
spielen.
Da im Vorversuch eine kontinuierliche Hemmung der ADP-induzierten Aggregation erreicht,
und auch die ASS-Wirkung für die Mehrzahl der Schweine hinreichend gezeigt werden
konnte, wurde die Kombination aus Clopidogrel und ASS für den Infektionsversuch
ausgewählt.
Im Rahmen des Infektionsversuchs wurden zehn Läuferschweine mit dem KSPV-Isolat
CSF0634 intranasal infiziert. Sechs Schweine erhielten täglich eine orale Gabe der
Clopidogrel/ASS-Kombination, vier Schweine dienten als unbehandelte Kontrolle. Über die
Versuchsdauer wurde den Tieren täglich Blut zur Bestimmung hämatologischer und
hämostaseologischer Parameter, inklusive der Thrombozytenaggregationstests, entnommen
5 Diskussion
127
und die Ergebnisse zwischen den Gruppen verglichen. Zudem wurde die Entwicklung des
Krankheitsbildes sowie die pathologisch-anatomischen Befunde dokumentiert und
gegenübergestellt.
Die
Kontrolle der
Wirksamkeit des
Thrombozytenaggregation
erbrachte mit
Clopidogrels mittels ADP-induzierter
einer
kontinuierlichen Hemmung um
durchschnittlich 30 % ein zufriedenstellendes Ergebnis, die Wirksamkeit der ASS konnte
nicht hinreichend belegt werden. Die Tatsache, dass die Schweine des Hauptversuches nicht
aus dem Betrieb kamen, aus dem die Tiere des Vorversuches stammten, lässt die Vermutung
zu, dass es einen Zusammenhang der ASS-Wirksamkeit mit dem genetischen Hintergrund der
Schweine gibt. Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass es Menschen gibt, die eine ASSResistenz aufweisen (MASON et al., 2004; WONG et al., 2004; EIKELBOOM et al., 2005;
SCHNEIDER, 2005; SZCZEKLIK et al., 2005; ANGIOLILLO et al., 2006; HANJIS et al.,
2006) und es ist nicht auszuschließen, dass ein ähnliches Phänomen bei Schweinen existiert.
In einer humanmedizinischen Studie zur Langzeittherapie mit Clopidogrel und ASS wurde
gezeigt, dass 44 % der Studienteilnehmer eine ASS-Resistenz aufwiesen und wesentlich
schlechter auf die Kombinationstherapie ansprachen (ANGIOLILLO et al., 2006).
Ob es ein mit der ASS-Resistenz des Menschen vergleichbares Phänomen gab, kann aus den
vorliegenden Daten nicht schlüssig beantwortet werden. Eine mangelnde Aufnahme durch die
Tiere scheidet aus, da die Verabreichung mit Clopidogrel zusammen in Pulverform per
direkte orale Eingabe mittels Spritze erfolgte, und dieses durchweg eine Wirksamkeit zeigte.
Eine Dosiserhöhung erbrachte keine höheren Hemmwerte, was ebenfalls auf eine mögliche
Resistenz hindeuten könnte. Es ist festzuhalten, dass beide Testsysteme sehr empfindlich auf
Entnahmeprobleme und Lagerungszeiten reagierten. Hämolytisches Plasma war nicht
geeignet zur Messung in der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation und ergab nicht
auswertbare Ergebnisse. Da Erythrozyten bei der Zerstörung u. a. auch ADP in nicht
unerheblichen Mengen freisetzen (NOWAK, persönliche Mitteilung), ist eine vorzeitige
Aktivierung und Aggregation durch den physiologischen Induktor anzunehmen.
Blutentnahmeprobleme im Sinne eines Durchstechens der Vene beeinflussten die
kollageninduzierte Aggregation. Es ist anzunehmen, dass die bereits aktivierten
Thrombozyten nicht mehr für den Test zur Verfügung standen. Im Versuchsverlauf musste
die Zahl der eingestellten Thrombozyten halbiert werden, da der Wert von 500.000 /µl auch
5 Schlussfolgerungen
128
im PRP durch die markante Thrombozytendepletion nicht mehr erreicht wurde. Die
Thrombozytenzahl spielte somit zum Versuchsende eine bedeutende Rolle für das
Testsystem.
Der Vergleich der beiden Gruppen erbrachte keinen Hinweis bezüglich einer Beeinflussung
des Krankheitsgeschehens durch die pharmakologische Intervention. Alle klinischen,
hämatologischen und hämostaseologischen Parameter zeigten, abgesehen von unterschiedlich
ausgeprägten inter- und intraindividuellen Schwankungen, einen quasi parallelen Verlauf.
5.5 Schlussfolgerungen
5.5.1 Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems und einer disseminierten
intravasalen Gerinnung
Für die Infektion mit dem KSPV-Isolat CSF0634 konnte gezeigt werden, dass es zu
unterschiedlichen Veränderungen im plasmatischen Gerinnungssystem kam. Insbesondere
konnte eine Aktivierung des extrinsischen Weges der Gerinnung reproduzierbar anhand der
Prothrombinzeit in der Finalphase der Erkrankung nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der
aPTT legten nahe, dass der Aktivierung des intrinsischen Systems im Verlauf der KSPVInfektion keine wesentliche Bedeutung zukommt. Diese Ergebnisse konnten für drei bzw. vier
Tiere des ersten Vorversuchs mit deutlichen Veränderungen in den Einzelfaktorenaktivitäten
korreliert werden. Ab dem zehnten Tag p.i. konnte ein Verlust der Aktivität der Faktoren II, V
und Antithrombin-III gezeigt werden, der ebenfalls für eine Verbrauchsreaktion in der
plasmatischen Gerinnung sprach. In diesem Zeitraum konnte zudem für einige Tiere mittels
EGT eine erhöhte Fibrinmonomerkonzentration nachgewiesen werden.
Die genannten Befunde wurden in entsprechender Form auch von HEENE et al. (1971)
erhoben. Diese Autorengruppe interpretiert die Ergebnisse dahingehend, dass in der
Finalphase der Erkrankung eine dekompensierende intravasale Gerinnung zu einer
eindeutigen Verbrauchskoagulopathie führt. In der Arbeit von HEENE et al. (1971) konnten
diese Befunde mit den histopathologischen Nachweisen einer Mikrothrombosierung korreliert
werden. In der vorliegenden Arbeit konnte dies nicht nachvollzogen werden. Die Thromben,
die als histopathologisches Äquivalent der überschießenden Gerinnungsaktivierung bei einer
5 Diskussion
129
disseminierten intravasalen Gerinnung auftreten, wurden von anderen Arbeitsgruppen
ausschließlich und nur in geringem Maße in der Finalphase der Erkrankung gefunden
(GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Fibrinablagerungen in betroffenen Organen
fehlten in diesen Studien.
Neben den oben erwähnten Befunden wurde für vier von fünf Tieren des ersten Vorversuches
eine Erhöhung der Faktor-V- und Faktor-II-Aktivität an Tag sieben p.i. gefunden, was für
eine Aktivierung der Gerinnung zu diesem Zeitpunkt spricht. Die Ergebnisse konnten jedoch
nicht mit den Globaltests der Gerinnung korreliert werden, die zu diesem Zeitpunkt keine
deutlichen Veränderungen zeigten. Da die Globaltests keine sehr hohe Sensitivität aufweisen
und bei kompensierten Aktivierungs- und Verbrauchsreaktionen häufig im Normalbereich
bleiben, stehen diese Befunde nicht im Widerspruch zueinander. Im Rahmen weiterer Studien
wäre es sinnvoll, die Einzelfaktorenbestimmung für eine größere Anzahl Tiere durchzuführen,
nicht zuletzt, um durch Probleme bei der Blutentnahme bedingte Artefakte sicher
auszuschließen. Das Auftreten dieser Veränderungen ausschließlich bei infizierten Tieren,
und am gleichen Tag nach der Infektion, deutet jedoch stark darauf hin, dass es sich um eine
reelle Aktivitätssteigerung handelte. Für die Faktor-V-Aktivität ließ sich auch in der Arbeit
von HEENE et al. (1971) ein leichter Anstieg feststellen, der jedoch dort als nicht signifikant
bewertet wurde.
Die Aktivierung des Gerinnungssystems scheint über einen langen Zeitraum in kompensierter
Form zu verlaufen. Erst in der Finalphase der Erkrankung kommt es zu
Dekompensierungserscheinungen, die teilweise für eine DIC sprechen. Fraglich ist jedoch, ob
dieser Mechanismus für die klinischen Hämorrhagien verantwortlich ist.
Der initiale Mechanismus, der zur Entstehung einer DIC führt, ist die forcierte Ausschüttung
von TF durch geschädigte Endothelzellen oder aktivierte Monozyten, die zu einer
überschießenden Aktivierung der plasmatischen Gerinnung führt. Die vermehrte
Fibrinbildung durch systemisch zirkulierendes Thrombin führt im Folgenden zu einer diffusen
mikrovaskulären Thrombenbildung, die einerseits Thrombozyten und Gerinnungsfaktoren
verbraucht, jedoch auch andererseits die Fibrinolyse aktiviert (CAREY und RODGERS,
1998; LEVI und TEN CATE, 1999; MAMMEN, 2000). Das gleichzeitige Zirkulieren von
Thrombin und Plasmin in hohen Konzentrationen ist das Hauptcharakteristikum einer DIC
(BATEMAN et al., 1999).
5 Schlussfolgerungen
130
In den letzten Jahren wurde deutlich, dass die inadäquate Expression des TFs durch
zirkulierende Monozyten eine wichtige Rolle bei der Entwicklung unterschiedlichster
pathologischer Zustände mit überschießender Gerinnung spielt (ESMON, 2001). Auch für
virale hämorrhagische Fieber, v. a. die Ebolavirusinfektion, ist die TF-Expression durch
aktivierte Makrophagen als
Hauptmechanismusder
Pathogenese auftretender
Gerinnungsstörungen anzusehen (BRAY und MAHANTY, 2003; GEISBERT et al., 2003c;
BRAY, 2005). Die TF-Expression auf der Monozytenoberfläche, die beispielsweise durch IL1, IL-6 und TNF induziert werden kann, ermöglicht die Interaktion der Monozyten mit
aktivierten Thrombozyten und Endothelzellen über die Bindung von P-Selektin (CAREY und
RODGERS, 1998; SHEBUSKI und KILGORE, 2002) und fördert auf diesem Wege die
Thrombusbildung. Monozyten stellen auf diesem Wege ein wichtiges Bindeglied zwischen
Entzündungs- und Gerinnungsreaktionen dar (NAPOLEONE et al., 1997). GEISBERT et al.
(2003) stellten in diesem Zusammenhang heraus, dass sowohl die TF-Expression durch
Monozyten und Makrophagen als auch die hohen Level zirkulierender proinflammatorischer
Zytokine und die Lymphozytenapoptose bei viralen hämorrhagischen Fiebern und dem
septischen Schock gleichermaßen auftreten. Die Ähnlichkeiten zwischen diesen beiden
Krankheitsgeschehen könnten für die Erforschung der Pathogenese viraler hämorrhagischer
Fieber von Bedeutung sein (PETERS und ZAKI, 2002; BRAY und MAHANTY, 2003).
Analog zu den Befunden bei klassischen viralen hämorrhagischen Fiebern, geht auch die
KSPV-Infektion sowohl mit einer erhöhten Expression von TNF als auch IL-1 einher
(KNOETIG et al., 1999; SANCHEZ-CORDON et al., 2002; CHOI et al., 2004; NUNEZ et
al., 2005), wobei besonders die erhöhte IL-1-Synthese mit dem Auftreten klinischer
Symptome korrelierte (NUNEZ et al., 2005). In vitro konnte zudem eine erhöhte TFExpression nachgewiesen werden (BENSAUDE et al., 2004). In vivo existieren hierfür bisher
keine konkreten Daten, da jedoch eine Aktivierung des extrinsischen Weges der Gerinnung
nachweisbar war, ist davon auszugehen, dass der TF-Überexpression durch Monozyten auch
in vivo eine Rolle in der Entstehung der Gerinnungsstörungen zukommt. Eine Untersuchung
des Gerinnungspotentials und der Thrombingenerierung im Verlauf der KSPV-Infektion
könnte in diesem Bereich Aufschluss geben.
Bei der Beantwortung der Frage, ob es sich bei den festgestellten Veränderungen um eine
klassische DIC handelt, muss man sich vor Augen führen, dass das Bild einer DIC sehr
5 Diskussion
131
vielfältig sein kann und für die labordiagnostische Diagnose mehrere Parameter verändert
sein müssen. Die am häufigsten veränderten Parameter sind eine erniedrigte
Thrombozytenzahl, eine verlängerte aPTT, erhöhte Fibrinspaltprodukte und eine verlängerte
Prothrombinzeit (MISCHKE und NOLTE, 1992). Abgesehen von der aPTT sind diese
Befunde auch im Verlauf der KSPV-Infektion zu erheben.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Befunde in der Finalphase der
Erkrankung und die pathogenetischen Erkenntnisse auf molekularer Ebene für eine
Aktivierung und Verbrauchsreaktion des Gerinnungssystems sprechen. Dabei gleichen die
erhobenen Befunde in weiten Teilen den in der Literatur beschriebenen Erkenntnissen zur
Pathogenese viraler hämorrhagischer Fieber. Ihre Ausprägung stellt jedoch v. a. im
Zusammenhang mit dem zeitlichen Ablauf der klinischen Erkrankung keine befriedigende
Erklärung für die auftretenden Hämorrhagien dar. Die zum Zeitpunkt des Auftretens erster
Hämorrhagien erhobenen hämostaseologischen Befunde erklären nicht eine weitreichend
erhöhte Blutungsneigung, da sowohl die Anzeichen für ein Zusammenbrechen des
fibrinolytischen Systems als
auch eines Fibrinogenmangelsfehlten und
die
thrombozytenunabhängige aPTT keine Veränderungen zeigte. Für wenige Tiere sank die
Thrombozytenzahl so weit ab, dass dies alleine für eine Blutungsneigung verantwortlich sein
konnte. Die mangelnde Beeinflussbarkeit des Krankheitsverlaufs durch eine therapeutische
PEG-Hirudingabe ist ein Indiz dafür, dass der alleinigen Aktivierung des plasmatischen
Gerinnungssystems keine entscheidende Bedeutung im Krankheitsgeschehen zukommt. Ein
weiterer Hinweis ist die Tatsache, dass eine PEG-Hirudingabe nicht zu einer Verstärkung der
hämorrhagischen Symptome führte.
Auf der Grundlage der vorliegenden Ergebnisse und der in der Literatur publizierten Daten
kann postuliert werden, dass eine DIC an der Pathogenese der KSP beteiligt ist. Sie ist jedoch
nicht klassisch ausgeprägt und spielt als Ursache der Krankheitserscheinungen eine
untergeordnete Rolle. Die DIC ist somit mehr eine Folgeerscheinung anderer
pathogenetischer Mechanismen.
5.5.2 Rolle der Thrombozyten und Thrombozyteninteraktionen
Wie in der Literatur beschrieben (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; GOMEZVILLAMANDOS et al., 1998), kam es auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit zu einer
5 Schlussfolgerungen
132
hochgradigen Thrombozytopenie, wobei der erste Abfall der Werte schon vor dem Auftreten
klinischer Symptome zu verzeichnen war. Zum Ende der Versuche zeigten drei von 30 Tieren
Thrombozytenzahlen, die nach MISCHKE (1999) mit dem Auftreten lebensgefährlicher
Blutungen (< 30 G/l) bzw. Spontanblutungen (< 10 G/l) einhergehen könnten. Diese Tiere
zeigten deutlich ausgeprägte Hämorrhagien, an deren Ausmaß die extrem niedrige
Thrombozytenzahl höchstwahrscheinlich ursächlich beteiligt war.
Der frühe Abfall der Thrombozytenzahlen im Rahmen der KSPV-Infektion wurde von
verschiedenen Arbeitsgruppen mit massiven Degenerationen der Megakaryozyten im
Knochenmark in Verbindung gebracht (HOFFMANN et al., 1971b; CALDERON et al.,
1998). Eine schwerwiegende Störung der Thrombozytopoese erscheint in Zusammenhang mit
den vorliegenden Ergebnissen jedoch unwahrscheinlich, da die Anstiege in den Parametern
MPV und Large Platelets andeuten, dass eine regenerative Kapazität vorhanden war, und
vermehrt junge, reaktive Thrombozyten freigesetzt wurden. Das Auftreten der jungen
Thrombozyten zwischen dem vierten und zehnten Tag p.i. ist auch ein Indiz für eine
Verbrauchsreaktion, die durch vermehrte thrombozytopoetische Aktivität ausgeglichen
werden sollte. Die Kompensationsmöglichkeiten wurden im weiteren Krankheitsverlauf
jedoch offensichtlich überschritten und die Thrombozytenzahl nahm rasch ab. Es ist
anzunehmen, dass die hohe Reaktivität junger Thrombozyten den Vorgang beschleunigte.
Korreliert man diese Ergebnisse mit den Daten von GOMEZ-VLLAMANDOS et al. (1998),
die nachweisen konnten, dass nur eine geringe Anzahl Megakaryozyten KSPV-infiziert war,
kann die These, dass die Intensität der Thrombozytopenie nicht über eine Zerstörung
infizierter Megakaryozyten im Knochenmark zu erklären sei, gestützt werden.
Die von HEENE et al. (1971) und HOFFMANN et al. (1971) geäußerte Theorie, dass die
Thrombozytopenie mit der Entwicklung einer DIC ursächlich zu erklären sei, ist vor dem
Hintergrund, dass die Thrombozyten bereits lange vor dem Auftreten erster fassbarer
Veränderungen in den Gerinnungsparametern einen deutlichen Abfall zeigten, nicht
nachvollziehbar. BAUTISTA et al. (2002) zeigten, dass es zwei bis vier Tage p.i. zu einer
Thrombozytenaktivierung und -aggregation in Milz und Leber kommt, wobei dieses
Phänomen mit einer Aktivierung der residenten Makrophagenpopulation verbunden war.
Aktivierungsreaktionen aufgrund einer mutmaßlichen Zytokinwirkung (NUNEZ et al., 2005)
5 Diskussion
133
stellen eine plausible Erklärung für die auftretenden Thrombozytenverluste und die
nachfolgenden Regenerationsversuche durch das Knochenmark dar. Die Annahme, dass
kleinste Thrombozytenaggregate unter Einbeziehung von Fibrinogen in der Mikrozirkulation
entstehen, wird auch durch die Erhöhung des Fibrinogens im Plasma gestützt, da Fibrinogen
über die Bindung an den GPIIb/IIIa-Rezeptor der Thrombozytenmembran direkt an dem
Vorgang der Thrombozytenaggregation beteiligt ist (MOSESSON, 2005; LISMAN et al.,
2005). Der Verlauf der ermittelten Fibrinogenkonzentration im Plasma lässt sich im Sinne
einer Anpassungsreaktion auf einen Verbrauch in kleinsten Plättchenaggregaten deuten.
Auch diese Befunde wurden in gleichsinniger Form von HEENE et al. (1971) erhoben. Stellt
man dies in Zusammenhang mit der Gesamtheit der Befunde, fällt auf, dass der Anstieg der
Fibrinogenkonzentration nach dem ersten Abfall der Thrombozyten und in zeitlicher Nähe zu
den Spitzen der Einzelfaktorenaktivitäten auftrat, was die Theorie einer „Nachschub“Reaktion stützt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es zu einer Aktivierung der Gerinnung
bzw. der Thrombozytenaggregation in der frühen Phase der Infektion kommt, die durch die
Globaltests nicht fassbar ist.
Die Interaktionen aktivierter Thrombozyten spielen in der Pathogenese der KSP eine wichtige
Rolle. Der Versuch diese Interaktionen mit Hemmstoffen der Thrombozytenaggregation zu
beeinflussen, zeigte jedoch keine positive Beeinflussung des Krankheitsgeschehens. Die
Einflussmöglichkeiten waren aufgrund der Anwendbarkeit und Wirksamkeit der aus der
Humanmedizin stammenden Wirkstoffe beim Schwein limitiert und ließen eine optimale
Intervention nicht zu. So war die Hemmung der GPIIb/IIIa-vermittelten Aggregation unter
den gegebenen Umständen nicht möglich, obwohl sie ein sehr lohnender Angriffspunkt
gewesen wäre.
Thrombozyten verfügen über eine Vielzahl von Aktivierungsmöglichkeiten, von denen in der
vorliegenden Arbeit nur ein Bereich, nämlich die ADP-induzierte Aggregation, erfolgreich
gehemmt werden konnte. Die Hemmung dieses Weges um durchschnittlich 30 % reichte nicht
aus um einen sichtbaren oder messbaren Erfolg bezüglich der Symptome der Erkrankung zu
zeigen. Da die Hemmung der COX-1 nicht durchgängig erreicht werden konnte, standen den
Thrombozyten alle anderen Möglichkeiten der Aktivierung und Aggregation fast
uneingeschränkt zur Verfügung.
5 Ausblick
134
Nimmt man die in dieser Studie erhobenen Daten und die in der Literatur publizierten
Ergebnisse zusammen, wird deutlich, dass der vermutlich Zytokin-vermittelten Aktivierung
der Thrombozyten und deren Interaktionen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der
KSP zukommt. Die Bildung kleinster Thrombozytenaggregate ist als treibende Kraft der
KSPV-assoziierten Gerinnungsstörung anzusehen.
5.6 Ausblick
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass v. a. den Thrombozyteninteraktionen
eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Gerinnungsstörungen im Verlauf der akuten
KSP zukommt. Diese sind anhand der in der Literatur publizierten Daten mit
Zytokinwirkungen in Verbindung zu bringen, die durch aktivierte Makrophagenpopulationen
induziert werden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a; NUNEZ et al., 2005; SANCHEZCORDON et al., 2005b). An erster Stelle stehen dabei IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α
(BENSAUDE et al., 2004; CHOI et al., 2004; SANCHEZ-CORDON et al., 2005b). Diesen
proinflammatorischen und prokoagulatorischen Zytokinen wurden auch in der Pathogenese
der Ebolavirusinfektion eine entscheidende Bedeutung beigemessen (BRAY, 2005; BRAY
und GEISBERT, 2005). Allerdings werden diese Reaktionen dort nicht explizit mit
Thrombozyten und deren Interaktionen in Verbindung gebracht.
Die KSPV-Infektion weist sowohl auf der Ebene der Symptome als auch der
pathogenetischen Mechanismen Gemeinsamkeiten mit klassischen viralen hämorragischen
Fiebern auf (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a), daher sollte die Übertragbarkeit der in
diesem Zusammenhang gewonnenen Erkenntnisse geprüft werden. Beispielsweise konnten
die Mechanismen, die der Makrophagenaktivierung zugrunde liegen für die Ebolainfektion
bereits teilweise charakterisiert werden. Es wurde gezeigt, dass die Interaktion
einzelsträngiger viraler
RNA,
doppelsträngiger Replikationsintermediateund
virusspezifischer Substanzen mit Toll-like Rezeptoren bzw. pattern-recognition Molekülen
einen Trigger für NFκB, Interferon Regulationsfaktor 3 und andere Aktivierungswege
darstellt (BRAY, 2005). Diese Erkenntnisse sollten in weiterführende Studien zur
Erforschung der Mechanismen der Makrophagen- und Thrombozytenaktivierung bzw. der
involvierten Signalwege und Interaktionen im Rahmen der KSPV-Infektion einfließen.
6
Zusammenfassung
Sandra Blome
Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest:
Analysen der Blutgerinnungsstörungen
Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine weltweit vorkommende, verlustreiche Tierseuche
mit großer handelspolitischer und ökonomischer Relevanz. Sie zählt zu den Krankheiten, die
beim internationalen Tierseuchenamt, dem Office International des Épizooties (OIE),
anzeigepflichtig sind und wird durch ein kleines, behülltes RNA-Virus aus dem Genus
Pestivirus der Virusfamilie Flaviviridae hervorgerufen.
Die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen kann v. a. bei jungen Tieren zu einem
akuten
Krankheitsbild führen, das
durch
hämorrhagische Symptome und
Blutbildveränderungen gekennzeichnet ist, die dem Bild eines klassischen viralen
hämorrhagischen Fiebers entsprechen. Bisher konnte weder die Genese der hämorrhagischen
Symptome, die im Verlauf der KSPV-Infektion auftreten, noch die der Thrombozytopenie
und Leukopenie hinreichend aufgeklärt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die pathogenetischen Mechanismen, die den
hämorrhagischen Symptomen und hämostaseologischen Veränderungen zugrunde liegen,
näher charakterisiert. Nach Vorversuchen zur Auswahl des geeigneten KSPV-Isolates und zur
Untersuchung des Verlaufs klinischer, pathologisch-anatomischer, hämatologischer und
hämostaseologischer Parameter wurden zu diesem Zweck zwei tierexperimentelle Ansätze
gewählt, welche eine pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen des
Hämostasesystems vorsahen. Es wurde einerseits die Endstrecke der plasmatischen
Gerinnung mit PEG-Hirudin und andererseits die Thrombozytenaggregation durch eine
Kombination der Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel und Acetylsalicylsäure
gehemmt.
In beiden Experimenten wurden zwei Läuferschweingruppen mit dem hochvirulenten KSPVStamm CSF0634 infiziert. Während eine Gruppe täglich mit den erwähnten Medikamenten
6
136
behandelt wurde, diente die zweite Gruppe der Kontrolle. Es erfolgte eine tägliche
Blutentnahme und Durchführung gerinnungsanalytischer und hämatologischer Tests. Die
klinischen Symptome im Verlauf der Infektion wurden nach einem Punkteschema
dokumentiert und analysiert.
Alle Tiere entwickelten die akute Verlaufsform der KSP mit unterschiedlich ausgeprägten
hämorrhagischen Symptomen. Neben einer ausgeprägten Leuko- und Thrombozytopenie
konnte bei allen Tieren eine Verlängerung der Prothrombinzeit, die für einen Verbrauch der
Faktoren des extrinsischen Pfades spricht, reproduzierbar in der Finalphase der Erkrankung
gezeigt werden. Des Weiteren kam es zu einem Anstieg der Fibrinogenkonzentration sowie
zu einem Gipfel in den Parametern Large Platelets und mittleres Plättchenvolumen zwischen
dem vierten und zehnten Tag nach der Infektion. Der Vergleich der beiden Gruppen erbrachte
keine Anhaltspunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsgeschehens durch die
pharmakologische Intervention.
Obwohl es im Verlauf der KSPV-Infektion zu einer Aktivierung der Gerinnung und zu einem
Verbrauch der Faktoren des extrinischen Pfades kommt, bieten diese Vorgänge keine
schlüssige Erklärung für das Auftreten der Hämorrhagien bzw. der Thrombozytopenie, die
bereits vor den ersten Dekompensationsanzeichen auftreten. Die mangelnde Beeinflussbarkeit
des Geschehens durch die Gabe des Thrombininhibitors PEG-Hirudin unterstützt die
Annahme, dass das plasmatische Gerinnungssystem nicht die Hauptrolle in der Pathogenese
der KSP spielt.
Der Anstieg des Fibrinogens spricht zusammen mit der Thrombozytopenie für eine
kompensierte Verbrauchsreaktion, welche
durch
die
Bildung
kleinster
Thrombozytenaggregate in der Frühphase der Infektion zu erfolgen scheint. Über den
GPIIb/IIIa-Rezeptor vermittelt Fibrinogen die Aggregation aktivierter Thrombozyten und
wird in diesem Zusammenhang vermehrt umgesetzt. Für die Aktivierung der Thrombozyten
werden in der Literatur Makrophagenzytokine als auslösendes Moment diskutiert. Weitere
Studien sollten daher die Makrophagen-Thrombozyten-Interaktionen näher beleuchten, denen
eine wichtige Rolle in der Pathogenese der KSP zuzukommen scheint.
137
Summary
Sandra Blome
On the pathogenesis of classical swine fever:
Analyses of coagulation disorders
Classical swine fever (CSF) is one of the most important diseases of pigs with worldwide
distribution and high impact on trade and economy. CSF is caused by a small enveloped RNA
virus that is grouped into the genus Pestivirus within the Flaviviridae family. The disease is
notifiable to the OIE (Office International des Épizooties).
Especially in young animals, infections with highly virulent CSF virus (CSFV) strains may
lead to an acute clinical picture that is characterized by hemorrhagic lesions and changes in
blood count that resemble the signs seen with viral hemorrhagic fevers. So far, neither the
mechanisms underlying the hemorrhages occurring in the course of CSFV infections nor the
genesis of thrombocytopenia and leukopenia are sufficiently elucidated.
In the context of this project the pathogenetic mechanisms underlying the hemorrhagic lesions
and coagulation changes were investigated. After preliminary trials to select an adequate
CSFV strain and to investigate the course of clinical, pathological, hematological, and
hemostaseological parameters upon infection, two animal experiments were designed
targeting two parts of the coagulation system with direct pharmacological interventions. On
one hand the common final pathway of the plasmatic coagulation system was arrested using
direct thrombine inhibitor PEG-Hirudin and on the other hand platelet aggregation was
inhibited with a combination of Clopidogrel and Acetyl Salicylic Acid.
In both experiments, two groups of piglets were infected with highly virulent CSFV strain
CSF0634. While one group was treated daily with the above mentioned drugs, the second
group acted as control. Blood samples were taken daily and coagulation tests as well as blood
counts were performed. Clinical signs observed in the course of CSFV infection were
assessed using a clinical score scheme.
All animals developed acute CSF with variable hemorrhagic lesions. Beside marked
leukopenia and thrombocytopenia, all animals displayed prolongations of prothrombin time
during the final phase of the disease that are indicative for the consumption of coagulation
6
138
factors of the extrinsic pathway. Furthermore, an increase in fibrinogen as well as peaks in
parameters Large Platelets and Mean Platelet Volume between days four and ten post
infection were observed. Comparison of groups did not provide any indication for an
influence of the pharmacological interventions on the course of the disease.
Although activation of the coagulation system and consumption of coagulation factors of the
extrinsic pathway were observed upon CSFV infection, these processes do not provide a
conclusive explanation for the occurrence of hemorrhages and thrombocytopenia respectively,
as these signs occur prior to any decompensation. The lack of influence of PEG-Hirudin
corroborates the assumption that the plasmatic coagulation system does not play a major role
in the pathogenesis of CSF.
The increase in fibrinogen together with thrombocytopenia are indications for a compensated
consumption caused by generation of platelet microaggregates in the early phase of infection.
Fibrinogen mediates aggregation of activated platelets through binding to the GPIIb/IIIa
receptor and is consumed in this context. Cytokines released by activated macrophages are
discussed in literature as triggers for platelet activation. Further studies should therefore
elucidate interactions of macrophages and platelets that seem to play an important role in CSF
pathogenesis.
7
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8 Anhänge
167
8
Anhänge
8.1
Tabellen und Abbildungen
Tabelle 8-1: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion und des Antigen-ELISAs für
die Tiere 153 bis 159. Die Virusisolierung wurde vor der Infektion und am Tag der Euthanasie
durchgeführt, der Antigen-ELISA an den Tagen 10 und 14 p.i.
Tiernummer
Virusisolierung
Antigen-ELISA
Tag 0 Tag der Euthanasie Tag 10 p.i. Tag 14 p.i.
Tier 153
Tier 154
negativ
negativ
positiv
negativ
positiv
positiv
positiv
negativ
Tier 155
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 156
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 157
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 158
negativ
negativ
negativ
negativ
Tier 159
negativ
negativ
negativ
negativ
Tabelle 8-2: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion für die Tiere 175 bis 181. Die
Virusisolierung wurde an den Tagen vier, zehn und 14 p. i. durchgeführt (dpi = Tage nach der
Infektion).
Tiernummer 4 dpi
7 dpi
10 dpi
14 dpi
Tier 175
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 176
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 177
negativ
positiv
positiv
negativ
Tier 178
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 179
negativ
positiv
positiv
positiv
Tier 180
negativ
negativ
negativ
negativ
Tier 181
negativ
negativ
negativ
negativ
8 Anhänge
168
Tabelle 8-3: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 153 bis 159. Die
Untersuchung auf Antikörper ist für die Seren dargestellt, die am Tag der Euthanasie gewonnen
wurden. Der im VNT ermittelte Antikörpertiter ist in50ND
angegeben. ELISA 1 = Chekit-CSF-Sero
(Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Bern, Schweiz); ELISA 2 = Classical Swine Fever Virus Antibody Test
Kit, HerdChek (IDEXX Laboratories, Wörrstadt).
Tiernummer
Virusneutralisationstest
CSF0902 CSF0634 BVDV NADL
Antikörper-ELISA
BDV
ELISA 1
Moredun
<5
negativ
ELISA 2
Tier 153
<5
<5
<10
negativ
Tier 154
40
120
<10
15
positiv
positiv
Tier 155
<5
30
<10
<5
positiv
positiv
Tier 156
<5
<5
<10
<5
fraglich
fraglich
Tier 157
<5
<5
<10
<5
negativ
negativ
Tier 158
<5
<5
<10
<5
negativ
negativ
Tier 159
<5
<5
<10
<5
negativ
negativ
Tabelle 8-4:Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 175 bis 191. Die
Untersuchung auf Antikörper ist für die Seren dargestellt, die am Tag der Euthanasie gewonnen
angegeben. ELISA 1 = Chekit-CSF-Sero
wurden. Der im VNT ermittelte Antikörpertiter ist in50ND
(Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Bern, Schweiz).
Tiernummer
Virus Neutralisation Test
Antibody ELISA
Tier 175
<5
<5
BVDV
NADL
<10
Tier 176
<5
<5
<10
<5
negativ
Tier 177
30
480
<10
30
positiv
Tier 178
<5
40
<10
<5
positiv
Tier 179
<5
<5
<10
<5
fraglich
Tier 180
<5
<5
<10
<5
negativ
Tier 181
<5
<5
<10
<5
negativ
CSF0902 CSF0634
BDV
Moredun
<5
ELISA 1
fraglich
8 Anhänge
169
Eichkurve für die PEG-Hirudin-Bestimmung im
Citratplasma mittels ECT
250
PEG-HirudinVerdünnungsreihe
200
]
[s150
it
Ze100
Linear (PEG-HirudinVerdünnungsreihe)
50
y = 13,434x + 48,587
2
R = 0,9989
0
0
5
10
15
PEG-Hirudinkonzentration [µg/ml]
Abbildung 8-1: Eichkurve aus einer PEG-Hirudin-Standardverdünnungsreihe. Diese Eichkurve
2
wurde der Berechnung der ECT zugrunde gelegt. Rbeschreibt das Bestimmtheitsmass der
Kurve.
Ecarin Clotting Time für Gruppe I
80
75
Tier 182
Tier 183
] 70
[s
65
T
C60
E
Tier 184
55
Tier 187
Tier 185
Tier 186
50
Maximum
45
Minimum
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Tage pi
Abbildung 8-2: Ecarin Clotting Time für die Tiere 182 bis 186 (Gruppe 1). Diese Tiere wurden
mit PEG-Hirudin behandelt. Der therapeutische Dosisbereich von 0,5 bis 1,5 µg/ml PEG-Hirudin
ist durch die Kurven mit der Bezeichnung „Minimum“ und „Maximum“ eingegrenzt. Das
unbehandelte Tier 187 wurde als Kontrolle mitgeführt.
8 Anhänge
170
Tabelle 8-5: Nachweis der KSPV-Infektion. Ergebnisse der Virusislierung an Tag zehn p.i. für die
Tiere 182 bis 191 unter Angabe der Gruppenzugehörigkeit im Versuch zum Einfluss einer PEGHirudinbehandlung auf das Krankheitsgeschehen.
TiernummerGruppenzugehörigkeit
Virusisolierung
Tier 182
Gruppe 1
positiv
Tier 183
Gruppe 1
positiv
Tier 184
Gruppe 1
positiv
Tier 185
Gruppe 1
positiv
Tier 186
Gruppe 1
positiv
Tier 187
Gruppe 2
positiv
Tier 188
Gruppe 2
positiv
Tier 189
Gruppe 2
positiv
Tier 190
Gruppe 2
positiv
Tier 191
Gruppe 2
positiv
Poolplasma-Verdünnungsreihe für aPTT
50
45
]
[s
t
ei
sz
g
n
u
n
in
er
G
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
Konzentration in % des Poolplasmas
100
Abbildung 8-3: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
®
Messung der aPTT mit Actin
FS im Versuch zur Beeinflussung des plasmatischen
Gerinnungssystems. Die orange Linie zeigt den Bereich der gewünschten aPTT für Poolplasma
an. Die Ergebnisse wurden für die Auswahl des Verdünnungsverhältnisses verwendet.
8 Anhänge
171
Kalibrationskurve für Biuret-Methode
0,25
y = 0,0171x - 0,0026
2
R = 0,9995
0,2
z
n
a 0,15
Fibrinogen-Standard
rb
so
b 0,1
A
Linear (FibrinogenStandard)
0,05
0
0
3
6
9
12
Fibrinogenkonzentration [g/l]
Abbildung 8-4: Kalibrationskurve zur Fibrinogenbestimmung. Diese wurden für jedes
Versuchsvorhaben im Rahmen der Methodenetablierung ermittelt und anhand eines humanen
Kontrollstandards und eines porzinen Poolplasmas überprüft. Erstellt wurde eine
Standardverdünnungreihe mit 1,5, 3, 6, 9 und 12 mg/ml Fibrinogen in NaCl. Die aus der
linearisierten Standardkurve errechnete Funktion wurde der Berechnung der
Fibrinogenkonzentrationen zugrunde gelegt.
ADP-induzierte Thrombozytenaggregation
80
70
]
60
[% 50
n
o 40
ti
a
g
30
re
g
g 20
A
Gruppe I
Gruppe II
10
0
t
er
w
ll
u
N
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
Tage pi
Abbildung 8-5: Verlauf der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation im Infektionsverlauf.
Gruppe I erhielt täglich Clopidogrel und ASS p.o., Gruppe II diente der unbehandelten Kontrolle.
Dargestellt sind die mittels APACT ermittelten Aggregationsmaxima. Es wurden 50 µl des
gebrauchsfertigen ADP-Reagenz eingesetzt.
8 Anhänge
172
Tabelle 8-6: Nachweis der KSPV-Infektion. Ergebnisse der RT-PCR an Tag neun p.i. für die Tiere
248 bis 254 und 256 bis 258 unter Angabe der Gruppenzugehörigkeit im Versuch zum Einfluss einer
Clopidogrel- und ASS-Behandlung auf das Krankheitsgeschehen.
TiernummerGruppenzugehörigkeit RT-PCR
Tier 248
Gruppe 1
positiv
Tier 249
Gruppe 1
positiv
Tier 250
Gruppe 1
positiv
Tier 251
Gruppe 1
positiv
Tier 252
Gruppe 1
positiv
Tier 253
Gruppe 1
positiv
Tier 254
Gruppe 2
positiv
Tier 256
Gruppe 2
positiv
Tier 257
Gruppe 2
positiv
Tier 258
Gruppe 2
positiv
Verdünnungsreihe für aPTT mit Actin FS
45
40
35
]
[s
t
ei
sz
g
n
u
n
in
er
G
30
25
20
15
10
0
20
40
60
80
100
Konzentration in % des Poolplasmas
Abbildung 8-6: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
®
Messung der aPTT mit ActinFS im Versuch zur Beeinflussung der Thrombozyteninterkationen.
Die orange Linie zeigt den Bereich der gewünschten aPTT für Poolplasma an. Die Ergebnisse
wurden für die Auswahl des Verdünnungsverhältnisses verwendet.
8 Anhänge
8.2
173
Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien
8.2.1 Zellkulturmedien
EMEM (Eagle´s minimum essential medium)
Pulvermedium
9,60 g
Fa. Invitrogen, Karlsruhe
NaHCO
2,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
Phenolrot
0,016 g
Fa. Merck, Darmstadt
Aqua bidest.
ad 1000,00 ml
Der pH-Wert wurde durch2-Begasung
CO
auf 6,9 eingestellt.
EMEM wurde als Erhaltungsmedium für die PK(15)A-Zelllinie unter Zugabe von 50 ml
Fetalem Kälberserum (Fa. Biochrom, Hamburg) eingesetzt.
Für zellkulturbasierte Nachweissysteme in Mikro- und Makrotiterplatten wurden dem EMEM
folgende Inhaltsstoffe zugefügt:
Penicillin G
50 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
Streptomycinsulfat
60 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum
100 ml
Fa. Biochrom, Hamburg
EDulb (EMEM, modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN [1959])
EDulb-Pulvermedium
13,53 g
Fa. Serva, Heidelberg
NaHCO2
2,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
Penicillin G
60 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
Streptomycin Sulfat
50 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum
100 ml
Fa. Biochrom, Hamburg
Aqua bidest.
ad 1000,00 ml
Der pH-Wert wurde durch2-Begasung
CO
auf 6,9 eingestellt.
Einfriermedium
EMEM
700 ml
DMSO
100 ml
Fa. Sigma, Deisenhofen
Fetales Kälberserum
200 ml
Fa. Biochrom, Hamburg
8 Anhänge
174
8.2.2 Lösungen und Reagenzien
ATV (adjusted trypsin-versen)-Lösung
NaCl
8,00 g
Fa. Merck, Darmstadt
KCl
0,40 g
Fa. Merck, Darmstadt
NaHCO3
0,58 g
Fa. Merck, Darmstadt
Dextrose
1,00 g
Fa. Sigma, Deisenhofen
EDTA (Versen)
0,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
Trypsin(3U/mg)
0,50 g
Fa. Serva, Heidelberg
Aqua bidest.
ad 1000,00 ml
Versen-Trypsin-Lösung (0,125%)
NaCl
8,0 g
Fa. Merck, Darmstadt
KCl
0,2 g
Fa. Merck, Darmstadt
KH2PO4
0,2 g
Fa. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 x 12 H2O
2,37 g
Fa. Merck, Darmstadt
CaCl2 x 2 H2O
0,132 g
Fa. Merck, Darmstadt
Trypsin (3 U/mg)
1,25 g
Fa. Serva, Heidelberg
EDTA (Versen)
1,25 g
Fa. Merck, Darmstadt
Penicillin G
50 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
Streptomycinsulfat
60 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
MgCl2 x 6 H2O
0,1 g
Fa. Sigma, Deisenhofen
Aqua bidest.
ad 1000,00 ml
Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 mit 1 N NaOH
AEC-Lösung
3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC)20,00 mg
Fa. Sigma, Deisenhofen
Dimethylformamid
3,00 ml
Fa. Merck, Darmstadt
(0,05 M, pH 5,0)
ad 50,00 ml
Fa. Merck, Darmstadt
H2O2 (3 %)
0,40 ml
Fa. Merck, Darmstadt
Natriumazetat-Puffer
8 Anhänge
175
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
NaCl
8,00 g
Fa. Merck, Darmstadt
KCl
0,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 x 12 H2O
2,37 g
Fa. Merck, Darmstadt
KH2PO4
0,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
CaCl2 x 2 H2O
0,132 g
Fa. Merck, Darmstadt
MgCl2 x 6 H2O
0,10 g
Fa. Sigma, Deisenhofen
Aqua bidest.
ad 1000,00 ml
PBSM (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium)
NaCl
8,00 g
Fa. Merck, Darmstadt
KCl
0,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 x 12 H2O
2,37 g
Fa. Merck, Darmstadt
KH2PO4
0,20 g
Fa. Merck, Darmstadt
Aqua bidest.
ad 1000,00 ml
PBS/Tween
PBSM
1000,00 ml
Tween® 20
100,00µl
Fa. Serva, Heidelberg
(C4H4KnaO6 x 4 H2O)
45,0 g
Fa. Merck, Darmstadt
NaOH (0,2 mol/l)
ad 400 ml
Fa. Roth, Karlsruhe
Kupfer-II-Sulfat
ad 15,0 g
Fa. Merck, Darmstadt
Kaliumjodid
ad 5,0 g
Fa. Merck, Darmstadt
NaOH (0,2 mol/l)
ad 1000 ml
Fa. Roth, Karlsruhe
Biuret-Stammlösung
Kaliumnatriumtartrat
Filtrierung der Lösung durch einen Faltenfilter und lichtgeschützte Aufbewahrung.
Kaliumjodidlösung
Kaliumjodid
5,0 g
Fa. Merck, Darmstadt
NaOH (0,2 mol/l)
ad 1000 ml
Fa. Merck, Darmstadt
8 Anhänge
176
Biuret-Gebrauchslösung
Biuret-Stammlösung
100 ml
Kaliumjodidlösung
ad 500 ml
Ecarin-Reagenz
Ecarin-Lösung (10 U/ml)
in 0,9 %iger NaCl-Lösung)
100 µl
Tris mit 3 % BSA
(0,05 M, pH 7,5 in 0,1 M NaCl)800 µl
CaCl2-Lösung (0,1 M)
100 µl
Hämalaunlösung nach MAYER
Hämatoxylin
1g
Aqua bidest.
ad 1000 ml
Natriumjodad
ad 0,2 g
Kaliumaluminiumsulfat x 12
2OH ad 50 g
Lösung erwärmen, weitere Bestandteile nach Erkalten lösen.
Chloralhydrat
ad 50 g
Citronensäure (kristallin)
ad 1 g
8 Anhänge
8.3
177
Sonstige Chemikalien
Aceton
Fa. Applichem, Darmstadt
A 0993
AEC
Fa. Sigma, Deisenhofen
A 5754
Bovines Serumalbumin
Fa. Serva, Darmstadt
11930
Calciumchlorid Dihydrat
Fa. Merck, Darmstadt
1.02382
Citronensäure
Fa. Merck, Darmstadt
1.00247
Dimethylformamid
Fa. Merck, Darmstadt
1.02952
Essigsäure
Fa. Roth, Darmstadt
3738.2
Ethanol
Fa. Merck, Darmstadt
1.00983
Glycerin
Fa. Gibco BRL
15514-011
Kaliumchlorid
Fa. Merck, Darmstadt
1.04936
Kaliumdihydrogenphoshat
Fa. Merck, Darmstadt
1.04877
Kalium-EDTA
Fa. Merck, Darmstadt
1.04819
Kaliumhydrogencarbonat
Fa. Merck, Darmstadt
1.04854
Magnesiumchlorid
Fa. Merck, Darmstadt
0059097
Natriumacetat-Trihydrat
Natrium-Carbonat, wasserfrei
Fa. Merck, Darmstadt
Fa. Merck, Darmstadt
1.06267
1.06392
Natriumchlorid
Fa. Roth, Karlsruhe
9265.2
Natriumhydrogencarbonat
Fa. Merck, Darmstadt
1.06329
Phenolrot
Fa. Merck, Darmstadt
7241.0005
Salzsäure
Fa. Roth, Karlsruhe
6331.2
TRIS
Fa. Roth, Karlsruhe
5429.2
Tween 20
Fa. Serva, Heidelberg
37470
Wasserstoffperoxid
Fa. Merck, Darmstadt
1.07209
Paraplast (Paraffin)
Fa. Shandon, Frankfurt
Corbitbalsam
Fa. Hecht, Kiel
8 Anhänge
8.4
178
Pharmakologisch wirksame Substanzen
®
Abciximab (ReoPro
)
Centocor B.V., Leiden, NL
®
Acetylsalicylsäure (Aspisol
)
Bayer, Leverkusen
®
Acetylsalicylsäure (ASS ratiopharm
)
®
Ratiopharm, Ulm
Clopidogrel (Iscover
)
Bristol-Myers Squibb Pharma, Hounslow, GB
PEG-Hirudin
zur Verfügung gestellt von Prof. Nowak, Jena
®
Pentobarbital (Narcoren
)
Merial, Halbergmoos
®
Tirofibanhydrochlorid (Aggrastat
)
MSD Sharp und Dohme, Haar
8 Anhänge
8.5
179
Kommerzielle Reagenzien und Kits
®
Actin FS
Fa. DADE Behring, Schwalbach B4218-100
AMAX ADP Reagent
Fa. Trinity Biotech, Darmstadt
885-3
AMAX Collagen Reagent
Fa. Trinity Biotech, Darmstadt
885-1
AMAX Platelet Aggregation Fa. Trinity Biotech, Darmstadt
885-A
Screening Test
Antithrombin III
Fa. Roche Diagnostics, Mannheim
CaCl2-Lösung, 0,025 mol/l
Fa. DADE Behring, Schwalbach ORHO 37
CELLaTOXIK
Fa. Mölab, Hilden
0200050
Cello-clean Enzym
Fa. Mölab, Hilden
0200020
Cello-ton VerdünnungslösungFa. Mölab, Hilden
0200003
Chekit-CSF-Sero
Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, CST113-
CSFV Anitgen Test Kit,
Schweiz
413
IDEXX Laboratories, Wörrstadt
ESF113-
HerdChek
556
CSFV Antibody Test Kit,
IDEXX Laboratories, Wörrstadt
HerdChek
432203492
Diäthylbarbiturat-AcetatPufferlösung
Fa. DADE Behring, Schwalbach ORHW 61
Fibrinogen (human)
Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen F-4883
Fibrinogen, plasminogenfrei Fa. Haemochrom Diagnostica, Essen
FIB1
Gerinnungsfaktor IIMangelplasma
Fa. DADE Behring, Schwalbach OSGR 13
Gerinnungsfaktor VMangelplasma
DADE Behring, Schwalbach
Kontrol-Plasma N
Fa. DADE Behring, Schwalbach ORKE 41
mö-lyse Hämolaysemittel
Fa. Mölab, Hilden
®
Pathromtin
ORSM 19
0200012
Fa. DADE Behring, Schwalbach OTXA 31
QIAamp Blood Mini Kit
®
QuantiTECT SYBR Green
Fa. Qiagen GmbH, Hilden
51106
Fa. Qiagen GmbH, Hilden
204243
RT-PCR
Mastermix
Test-Thrombin-Reagenz
Fa. DADE Behring, Schwalbach OWHM 13
Thrombin (bovin)
Fa. Sigma-Aldrich, Deisenhofen T-4648
®
ThromborelS
Fa. DADE Behring, Schwalbach OUHP 49
8 Anhänge
8.6
180
Geräte und Gebrauchsgegenstände
Autoklav
Autoklav 17
Melag, Berlin
Einbettungsautomat
Hypercenter II
Shandon, Frankfurt
ELISA-Reader
Spectra II
Tecan, Crailsheim
Färbeautomat
Varistain 24-3
Shandon, Frankfurt
Fieberthermometer
®
Gerathermplus
Geratherm Medical AG, Geschwenda
Geräte zur Blutuntersuchung
Sysmex F-800 System
Sysmex Deutschland, Norderstedt
Mölab Hämatologie System 8702/6
Mölab, Hilden
Glaspipetten und –gefäße
Jürgens, Hannover
Inkubator
CO2-Inkubator Typ B 5060 EK/CO
2
Heraeus, Hanau
Kugelkoagulometer
Amelung Coagulometer KC 4A
Amelung, Lemgo
Mikroskop
Inverses Mikroskop (715075)
Leitz, Wetzlar
Axiostar plus Lichtmikroskop
Zeiss, Oberkochen
Mikrotom
Schlittenmikrotom
Mikrom, Heidelberg
8 Anhänge
181
PCR-Maschine
MX 4000 PCR Maschine
Strategene, La Jolla, California, USA
pH-Meter
Jürgens, Hannover
Photometer
Ultraspec 2000
Amersham, Freiburg
Pipetten und Pipettierhilfen
Pipetman, P20, P100, P200, P1000
Abimed Analysen Technik
Blutmischpipetten für Leukozyten
Landgraf Laborgeräte, Langenhagen
®
pipettus-standard
®
Hirschmann Laborgeräte
Pipetboy plus
Tecnomara AG, Wallisellen, Schweiz
12-Kanal-Pipette
Brand
®
Multipette4780
Eppendorf, Hamburg
Micro-Pipettierhelfer BRAND
Heiland Vet, Hamburg
Sicherheitswerkbänke
NUAIRE™ Klasse II Typ A/B3
NUAIRE, Plymouth, Minnesota, USA
Nunc Mikroflow adv. biosafety cabinet
Schnakenberg, Bremen
Thermocycler
T personal Cycler
Biometra, Göttingen
Thrombozytenaggregationsmessung
APACT System
LABiTec, Ahrensburg
Trockenschrank (80°C)
Ehret, Emmerdingen
Vakuumpumpe
Vacusafe
Integra Biosciences, Chur, Schweiz
Vortex
Reax 2000
Heidolph, Schwabach
8 Anhänge
182
Waagen
1213 MP
Sartorius GmbH, Göttingen
Analysenwaage, 1712 MP 8
Sartorius, Göttingen
Wärmeschrank
Fa. Medite, Burgdorf
Wasserbad
Type 1003
Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel
Zählkammer
Thomakammer
Heiland Vet GmbH, Hamburg
Neubauer, improved
Landgraf Laborgeräte, Langenhagen
Zentrifugen
Labofuge 400R
Heraeus-Christ, Osterode/Harz
Multifuge 3 S-R
Heraeus- Christ, Osterode/Harz
Mikroliter-Kühlzentrifuge 5417R
Eppendorf, Hamburg
8 Anhänge
183
8.7
Verbrauchsmittel
Blutentnahme
®
Kabe, Nürmbrecht
102325
®
Kabe, Nürmbrecht
102200
®
Kabe, Nürmbrecht
102100
®
Kabe, Nürmbrecht
102125
®
Kabe, Nürmbrecht
102600
Kabavette G EDTA 3,5
Kabavette G EDTA 7,5
Kabavette G Gerinnung 5,5
Kabavette G Gerinnung 4
Kabavette G Serum 7,5
Adapter zur Mehrfachentnahme
mit Luer-Konus
Kabe, Nürmbrecht
104300
®
Heiland Vet, Hamburg
370-690
®
Heiland Vet, Hamburg
370-692
®
Heiland Vet, Hamburg
370-218
Terumo Einmalkanülen 18 G
Terumo Einmalkanülen 20 G
Terumo Einmalkanülen 22 G
Gewebeschnitte
Objektträger, Mattrand
®
Engelbrecht, Edermünde
SuperFrostObjektträger
Roth, Karlsruhe
Deckgläschen
Roth, Karlsruhe
Pipettenspitzen
Combitips 1,25 ml
Eppendorf, Hamburg
0030 048.083
Volumen bis 1000 µl
Ratiolab, Dreieich
2100611
Volumen bis 200 µl
Ratiolab, Dreieich
2100601
Mikrotiterplatten
Greiner, Nürtingen
653190
Makrotiterplatten
Greiner, Nürtingen
662160
Polystyrol- Reagenzröhrchen
Heiland Vet, Hamburg
370-470
Reagenzröhrchen
Heiland Vet, Hamburg
370-495
Makro-Küvetten, Polystyrol
Reaktionsgefäße
Polyethylen-Stopfen für
Heiland Vet, Hamburg
370-485
Küvetten und Kugeln für KC 4ATrinity Biotech, Lemgo
Z 05100
mölab-cups, klein
Mölab, Hilden
0300002
Mikro-Küvetten inkl. Mixer
Greiner BioChemica, Flacht 6130005
8 Anhänge
184
Sonstiges
Schachlik-Stäbchen
Fackelmann, Hersbruck
Kryo-Vials, 2 ml
Greiner, Nürtingen
Latex Handschuhe
Zentralbestand TiHo
®
Rotilabo-Spritzenfilter, 0,22 µmRoth, Karlsruhe
®
Parafilm „M“
Heiland Vet, Hamburg
126263
P666.1
371-053
Spritzen
®
Terumo Einwegspritzen, 5 ml Heiland Vet, Hamburg
710-2096
® Einwegspritzen, 10 ml Heiland Vet, Hamburg
Terumo
®
Terumo Einwegspritzen, 20 ml Heiland Vet, Hamburg
710-2094
710-2092
Transcoject Einmalspritzen, 30 ml Tierärztebedarf Hannover
60.530
Zellkultur
Gewebekulturflaschen, 50 ml Greiner, Nürtingen
690160
Gewebekulturflaschen, 250 ml Greiner, Nürtingen
658170
185
8.8
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2-1: Genomorganisation von Pestiviren................................................................... 3
Abbildung 2-2: Schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der
plasmatischen Blutgerinnung ........................................................................................... 29
Abbildung 2-3: Stark schematisierte Darstellung der Fibrinbildung. ...................................... 29
Abbildung 2-4: Schematische Darstellung des Fibrinolysesystems ........................................ 30
Abbildung 4-1: Hämorrhagische Symptome in der Finalphase der KSPV-Infektion.............. 74
Abbildung 4-2: Klinischer Symptome im Verlauf der KSPV-Infektion.................................. 75
Abbildung 4-3: Charakteristische pathologisch-anatomische Befunde ................................... 77
Abbildung 4-4: Leukozytenzahlen der Tiere 153 - 159 im Versuchsverlauf........................... 82
Abbildung 4-5: Leukozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf .......................... 82
Abbildung 4-7: Thrombozytenzahlen der Tiere 175 – 181 im Versuchsverlauf ..................... 83
Abbildung 4-8: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere 175 bis 181 im
Versuchsverlauf................................................................................................................ 84
Abbildung 4-9: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Die aPTT im Verlauf der KSPVInfektion. .......................................................................................................................... 87
Abbildung 4-10: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Thrombinzeit im Verlauf der
KSPV-Infektion................................................................................................................ 87
Abbildung 4-11: Ergebnisse der Globaltests der Gerinnung. Prothrombinzeit im Verlauf der
KSPV-Infektion................................................................................................................ 87
Abbildung 4-12: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der aPTT-Bestimmung................... 88
Abbildung 4-13: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Thrombinzeitbestimmung ........ 88
Abbildung 4-14: Globaltests der Gerinnung. Ergebnisse der Prothrombinzeitbestimmung.... 88
Abbildung 4-15: Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere 153 bis 159 .................................. 90
Abbildung 4-16: Fibrinogenkonzentrationen für die Tiere 175 bis 181 .................................. 90
Abbildung 4-17: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-II-Aktivität. .......................................... 92
Abbildung 4-18: Einzelfaktorenbestimmung. Faktor-V-Aktivität........................................... 92
Abbildung 4-19: Einzelfaktorenbestimmung. Antithrombin-III-Aktivität. ............................. 92
Abbildung 4-20: Temperaturkurven für die Gruppen I und II. ................................................ 94
Abbildungsverzeichnis
186
Abbildung 4-21: Gruppenmittelwerte für den CS beider Tiergruppen .................................... 95
Abbildung 4-22: Pathologisch-anatomische Veränderungen der Tiere beider Gruppen ......... 97
Abbildung 4-23: Gruppenmittelwerte für die Leukozytenzahlen beider Gruppen .................. 98
Abbildung 4-24: Thrombozytenmittelwerte für die Tiere beider Gruppen.............................. 99
Abbildung 4-25: Mittleres Thrombozytenvolumen für die Tiere beider Gruppen ............... 100
Abbildung 4-26: Large Platelets für die Tiere beider Gruppen. ............................................ 101
Abbildung 4-27: aPTT für die Tiere der Gruppen I und II .................................................... 103
Abbildung 4-28: Thrombinzeit für die Tiere der Gruppe II................................................... 103
Abbildung 4-29: Prothrombinzeit für die Tiere der Gruppen I und II ................................... 104
Abbildung 4-30: Fibrinogenkonzentration für die Tiere der Gruppen I und II...................... 105
Abbildung 4-31: Körpertemperatur im Versuchsverlauf für die Gruppen I und II................ 108
Abbildung 4-32: Clinical Score für die Gruppen I und II ...................................................... 109
Abbildung 4-33: Leukozytenzahlen für die Gruppen I und II................................................ 111
Abbildung 4-34: Thrombozytenzahlen für die Gruppen I und II im Versuchsverlauf .......... 112
Abbildung 4-35: aPTT für die Gruppen I und II .................................................................... 114
Abbildung 4-36: Thrombinzeit für die Gruppen I und II ....................................................... 114
Abbildung 4-37: Prothrombinzeit für die Gruppen I und II................................................... 114
Abbildung 4-38: Fibrinogenkonzentration für die Gruppen I und II. .................................... 115
Abbildung 8-1: Eichkurve aus einer PEG-Hirudin-Standardverdünnungsreihe .................... 169
Abbildung 8-2: Ecarin Clotting Time für die Tiere 182 bis 186 (Gruppe 1) ......................... 169
Abbildung 8-3: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
®
Messung der aPTT mit Actin
FS .................................................................................. 170
Abbildung 8-4: Kalibrationskurve zur Fibrinogenbestimmung ............................................. 171
Abbildung 8-5: Verlauf der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation ............................ 171
Abbildung 8-6: Verdünnungsreihe zur Ermittlung der optimalen Plasmavorverdünnung für die
®
Messung der aPTT mit Actin
FS .................................................................................. 172
187
8.9
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2-1: Rezeptoren und weitere relevante Komponenten der Thrombozyten.................. 25
Tabelle 2-2: Substanzen des Endothels und Subendothels ...................................................... 26
Tabelle 3-1: Thrombozytenparameter, die mittels Sysmex F-800 untersucht wurden ............ 58
Tabelle 3-2: Fibrinogenverdünnungsreihe (Standardkurve). ................................................... 62
Tabelle 3-3: Gerinnungsansätze für die Fibrinogenbestimmung aus Plasma. ......................... 63
Tabelle 4-1: Wirkstoffe, Monitoringmethoden, Dosierungen und Ergebnisse der
pharmakokinetischen Vorversuche ................................................................................ 106
Tabelle 8-1: Ergebnisse der Virusisolierung aus der Leukozytenfraktion und des AntigenELISAs für die Tiere 153 bis 159 .................................................................................. 167
Tabelle 8-2: Ergebnisse der Virusisolierung für die Tiere 175 bis 181 ................................. 167
Tabelle 8-3: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 153 bis 159.
........................................................................................................................................ 168
Tabelle 8-4: Antikörpernachweis in VNT und Antikörper-ELISA für die Tiere 175 bis 191.
........................................................................................................................................ 168
Tabelle 8-5: Nachweis der KSPV-Infektion .......................................................................... 170
Tabelle 8-6: Nachweis der KSPV-Infektion .......................................................................... 172
Tagungsbeiträge
Teile dieser Arbeit wurden vorab veröfffentlicht:
BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK und V. MOENNIG (2004):
Does disseminated intravascular coagulation (DIC) play a major role in the pathogenesis of
Classical Swine Fever? In: Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie" Joint Meeting
with Società Italiana di Virologia, Tübingen, March 17–20, 2004, 208.
BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK, R. MISCHKE und V. MOENNIG
(2005): Characterisation of Coagulation Disorders occuring in the Course of Classical Swine
Fever using Thrombocyte Aggregation Inhibitors Clopidogrel and Acetyl Salicylic Acid.
In: Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie", Hannover, Germany, March 16-19,
2005, 179.
BLOME, S., A. MEINDL-BÖHMER, G. NOWAK und V. MOENNIG (2005):
Characterisation of coagulation disorders occuring in the course of acute classical swine fever
virus (CSFV) infections using direct thrombine inhibitor Hirudin and thrombozyte
aggregation inhibitors Clopidogrel and acetyl salicylic acid.
In: 6th ESVV Pestivirus Symposium, Thun, Switzerland, 13 - 16 September 2005, 75.
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. V. Moennig für die Überlassung des Themas, die
wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie die freundliche Aufnahme am Institut für
Virologie.
Ich danke Herrn Prof. Dr. G. Nowak und der Arbeitsgruppe „Pharmakologische
Hämostaseologie“ für die freundliche Unterstützung in allen hämostaseologischen Fragen und
Techniken, die geduldige Diskussionsbereitschaft sowie die Bereitstellung diverser
Reagenzien und Protokolle.
Frau Prof. Dr. I. Greiser-Wilke danke ich besonders dafür, dass sie die Zusammenarbeit mit
der AG „Pharmakologische Hämostaseologie“ durch ihr persönliches Engagement möglich
gemacht hat.
Frau Dr. A. Meindl-Böhmer danke ich für ihre stete Diskussionsbereitschaft, die
konstruktiven Vorschläge für die Überarbeitung des Schrifttums und ihre Hilfe und Betreuung
bei der Durchführung der experimentellen Arbeiten.
Dem Evangelischen Studienwerk e. V. Villigst danke ich für die finanzielle Unterstützung im
Rahmen eines Promotionsstipendiums.
Mein Dank gilt Prof. Dr. W. Baumgärtner, Institut für Pathologie TiHo Hannover, für die
Beratung in histopathologischen Fragen und die Erlaubnis, die Geräte des Instituts zu nutzen.
Insbesondere danke ich auch den Mitarbeiterinnen des Instituts Frau P. Grünig und Frau K.
Rohn für die Einarbeitung in die Anfertigung histopathologischer Präparate.
Ich danke Herrn Prof. Dr. R. Mischke und Herrn Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere
TiHo Hannover, für die Beratung während der Ausarbeitung der Vorversuche und Herrn D.
Menzel für die freundliche Einarbeitung in die hämostaseologische Diagnostik.
Für die exzellente Pflege der Versuchstiere und die weit über das übliche Maß hinausgehende
Einsatzbereitschaft danke ich insbesondere Günter Thiem, Helmut Schulz und Monika Berg.
Ich danke Frau Gabriele Müller für die freundliche Einarbeitung in alle virologischen
Techniken und die umfassende und verständnisvolle Unterstützung während des gesamten
Projektes.
Meinen Mitdoktoranden Andreas Gavrilenko und Stefan von Rüden sowie Frau Dr. Stefanie
Bendfeldt danke ich für ihre Diskussionsbereitschaft, die Korrektur der schriftlichen Arbeit
und die moralische Unterstützung.
Ich danke Christina Fuest für die unermüdliche Hilfe bei der Aufarbeitung diverser Proben.
Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Virologie gilt mein herzlicher Dank
für die freundliche Aufnahme und stete Hilfsbereitschaft.
Meinen Freunden und meiner Familie danke ich für ihre Geduld und Unterstützung.
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Zur Pathogenese der Klassischen
Schweinepest: Analyse der Blutgerinnungsstörung“ selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
•
Die automatischen Schritte der Einbettung, Färbung und Eindeckung der
histopathologischen Präparate erfolgte am Institut für Pathologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Ich
habe keine entgeltliche Hilfe
von
Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
•
Institut für Virologie, Europäisches Referenzlabor für Klassische Schweinepest
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
31.05. 2006
Sandra Blome