Методы определения микробной биомассы в почве И.В. Евдокимов Задачи почвенной микробиологии в широком контексте междисциплинарных проблем современной науки Определение запасов и потоков биофильных элементов через микробную биомассу Определение дыхательной и ферментативной активности микробного сообщества Определение структуры микробного сообщества Роль микробиоты в регуляции потоков парниковых газов и, таким образом, в глобальных изменениях климата Функционирование ризосферы и дриллосферы как гологеномов Определение взаимосвязей между структурой и функциями микробного сообщества Методы определения микробной биомассы– классификация по принципу получения аналитического сигнала I. Методы, основанные на анализе биомаркеров : PLFA-PLEL (ЖК фосфолипидов), LPS, гликолипидов, эргостерола, хинонов и др. Анализ ATФ, ДНК и РНК - неспецифических биомаркеров. II. Биоцидные методы - фумигационный (FI, FE), регидратационный (RI, RE). III. Методы, основанные на дыхательном отклике микробного сообщества – субстрат-индуцированного дыхания (СИД, SIR), кинетический ( KSIR). I. Методы, основанные на анализе биомаркеров Метод жирных кислот фосфолипидов (ЖКФ) phospholipid fatty acids (PLFA) profiling Принцип метода: Метод PLFA основан на анализе жирных кислот фосфолипидов (ЖКФ), входящих в состав мембран. ЖКФ не входят в состав запасных веществ клетки, а после смерти клетки подвергаются быстрому биохимическому разложению под действием внеклеточных ферментов. Это делает PLFA (ЖКФ) отличными маркерными веществами, а полученные по результатам анализов PLFA (ЖКФ) микробные профили могут быть использованы для качественного и количественного анализа микробного сообщества почвы. Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) Структура микробного сообщества (выделение больших групп): Мембранные липиды Микоризные грибы Прочие грибы Грам - бактерии Грам + бактерии «Неспецифическая» информация: общее кол-во липидов (биомасса) Актиминоцеты Архебактерии Простейшие Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) Маркеры для групп организмов: Среди наиболее часто используемых кислот (список – НЕ исчерпывающий) выделяют следующие классы: SATFA (saturated fatty acids, насыщенные жирные кислоты) Как правило, являются маркерами Г+ бактерий. Исключения: циклические PLFA (c префиксом Cy)– являются маркерами Г- бактерий; n14:0, n15:0 - неспецифические (встречаются и у Г+, и у Г-); Длинноцепочечные (длиннее С20) – маркеры эукариот (простейшие, растения). Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) Маркеры для групп микроорганизмов: MUFA (mono-unsaturated fatty acids,мононенасыщенные жирные кислоты) Как правило, являются маркерами Г- бактерий. Исключения: 16:1w5 – маркер для арбускулярных микоризых грибов; 18:1w9 – маркер для сапротрофных грибов. Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) Маркеры для групп микроорганизмов: PUFA (poly-unsaturated fatty acids, полиненасыщенные жирные кислоты) Как правило, являются маркерами для сапротрофных грибов. Наиболее распространенный в почве маркер для сапротрофных грибов - 18:2w6,9. Прочие маркеры: 18:1w7 – маркер для метанотрофов; 10Me18:0, 10Me17:0, 10Me16:0 – маркеры для актиномицетов. Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) – – – Преимущества: Позволяет «напрямую» применить метод стабильных изотопов (stable isotope probing, SIP) с целью выявления групп микроорганизмов, ответственных за определенные процессы/последовательности реакций цикла углерода. Может быть использован не только для качественного, но и количественного анализа микробной биомассы в почве. Соотношения между группами PLFA являются хорошими индикаторами стресса в почве. Недостатки: Не дает возможности определять микроорганизмы до вида или рода (за исключением актиномицетов). Необходимость сложных экстракций с токсическими растворителями – по сути дела, это сложный метод органической химии с газохроматографическим окончанием. Сложность с идентификацией пиков и однозначной привязкой их к стандартам-ЖКФ. Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) – «отцыоснователи» Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) – «отцыоснователи» Индикаторы стресса по результатам анализа ЖКФ (stress indicators as determined by PLFA analyses) Основные индикаторы Соотношение «грамположительные бактерии/ грамотрицательные бактерии» (Gram-positive-to-Gram-negative ratio). Соотношение «насыщенные ЖКФ/мононенасыщенные ЖКФ» как аналог данного индекса (SATFA/MUFA ratio as an analogue of that index). Соотношение trans/cis изомеров (напр., 16:1w7t/16:1w7). Соотношение «циклические ЖКФ/их моноеновые предшественники» (cyclopropyl PLFA to monoenoic precursors ratio) – напр., в парах cy17:0/16:1w7 и cy19:0/18:1w7. Вспомогательные индикаторы: Относительное обилие тех или иных специфических ЖКФ – маркеров микромицетов, бактерий, простейших и т.д. (abundance of specific PLFA – markers of fungi, bacteria, protozoa etc). Соотношение «грибы/бактерии» (fungi/bacteria ratio). Метод PLFA (жирных кислот) Как это выглядит (стадии экстракции): Университет г. Гёттинген, Германия Метод PLFA (жирных кислот) Как это выглядит (стадии дериватизации): Университет г. Гёттинген, Германия Метод PLFA (жирных кислот) Как это выглядит (оборудование): Выделение ДНК из почвы Как это выглядит (I), стадии 1 – 4 : Выделение ДНК из почвы Как это выглядит - стадии 5 - 8 (II) : Выделение ДНК из почвы Как это выглядит - стадия 8 с дальнейшим определением концентрации ДНК (III) : Полимеразная цепная реакция, ПЦР (PCR) II. Биоцидные методы Фумигационный метод Принцип метода Почва подвергается воздействию паров фумиганта в течение 24 ч (чаще всего, хлороформа CHCl3 ), а биомасса микроорганизмов, убитых этой биоцидной обработкой, определяется по приросту (flush) в выделении СО2 при последующей инкубации почвы - метод фумигации инкубации, fumigation-incubation (FI) (Jenkinson & Powlson, 1976), либо по приросту (flush) растворимых соединений углерода (в других вариантах - азота, фосфора или серы) – метод фумигации-экстракции, fumigation-extraction (FE) (Brookes et al., 1985). Фумигационный метод Этапы определения методом фумигации (I) Открытые чашки/стаканчики/сосуды с почвой (навески 20 – 40 г в пересчете на абс.сух.) помещают в эксикатор, дно которого выстелено фильтровальной бумагой, смоченной в воде. В эксикатор ставят стаканчик с хлороформом, на дно стакана кладут стеклянные бусы для предотвращения образования слишком больших пузырьков хлороформа. Закрывают эксикатор крышкой, подсоединяют вакуумный насос и вакуумируют до появления пузырьков хлороформа в стаканчике. Желательно, чтобы кипение продолжалось не менее 2 мин. Отсоединяют насос, изолируют атмосферу внутри эксикатора от внешней атмосферы, оставляют эксикатор в темноте при комнатной температуре на 24 часа. Открывают эксикатор, удаляют стаканчик с остатками хлороформа. Затем подсоединяют насос и вакуумируют систему в течение нескольких минут, затем открывают краны, заполняя эксикатор обычным воздухом. Повторяют процедуру 4 – 5 раз с целью удаления остатков фумиганта в почве. Вынимают емкости с почвой из эксикатора. Фумигационный метод Этапы определения методом фумигации (II) Делают солевые экстракты (в 0,25 – 0,5 М растворе K2SO4) из почвы, подвергшейся фумигации, анализируют содержание растворимого С (N, P или S). Из полученных величин С (N, P или S) в растворе (FE) или выделившемся СО2 (FI) вычитают соответствующие величины, определенные в контрольной почве. Контролем служит свежая почва, не подвергшаяся фумигации. Рассчитывают величину биомассы по формуле Cbio = (Fc-Ufc) / kc = flushC / kc (или по аналогичным формулам для других биофильных элементов), где Fc – С в фумигированной почве, Ufc – С в контроле, kc – пересчетный коэффициент (conversion factor), flush C – прирост («флаш») растворимого или минерализуемого углерода. Фумигационный метод Как это выглядит: Институт почвенной экологии, Научн.-иссл. Центр Гельмгольцевского общества, Нойерберг/Мюнхен, Германия Университет г. Гёттинген, Германия Фумигационный метод: «прямая экстракция» (Setia et al., 2012) Принципиальное отличие от фумигации-экстракции и фумигации-инкубации: Замена процедуры экспозиции в парах хлороформа на экстракцию с эмульсией хлороформа в растворе K2SO4. Длительность экспозиции 1 ч. Дозировка хлороформа – 1мл/10 г почвы (возд.-сух вес). Применяется для анализа С,N и P микробной биомассы в почве. Фумигационный метод: «прямая экстракция» (Setia et al., 2012) Преимущества «метода прямой экстракции» по сравнению с другими вариантами фумигационного метода: Отсутствие довольно утомительной и опасной процедуры вакуумирования эксикатора. Не нужен специальный вакуумный насос, стойкий к органическим растворителям (экономия средств). Экономия времени при проведении анализов: не нужно тратить сутки на экспозицию; не нужно многократно вакуумировать эксикатор по окончании экспозиции с целью избавления от остаточных концентраций хлороформа в растворе. Регидратационный метод Принцип метода Биоцидная обработка фумигантом (как это делается в фумигационном методе) заменяется на высушивание почвы при 65 – 70оС в течение 24 ч. По окончании высушивания прирост (flush) в С и N, вызванный поступлением в почву убитой биомассы микроорганизмов, определяется аналогично методу фумигации-экстракции (FE), или после добавления воды – как в методе фумигации-инкубации (FI) (Благодатский и др., 1987). Регидратационный метод Преимущества метода по сравнению с фумигационным: Не нужно использовать токсические вещества (фумиганты). Меньшая трудоемкость, отсутствие манипуляций с вакуумным эксикатором. Возможность хранить высушенные пробы длительное время, «накапливая» их для экстракции и анализа на С и N. Недостатки метода по сравнению с фумигационным: – Большее количество растворенных органических веществ в экстракте, имеющих немикробное происхождение (собственно ПОВ становится более растворимым в результате высушивания). – Нет взаимозаменяемости экстрактов K2SO4 и CaCl2, которая бывает у образцов многих сельскохозяйственных почв при использовании метода FE. – Отсутствие апробации метода на широком ряде почв и экологических условий – этот метод не является «стандартным», общепризнанным методом. Фумигационный и регидратационный методы Способы определения пересчетных коэффициентов (I): Сравнение с результатами прямого микроскопирования (Jenkinson & Powlson, 1976). По результатам определения С или N в биомассе микроорганизмов, выращенных на искусственных средах (Van Veen et al., 1987) - «непрямой метод». Для kEN – расчет по усредненному значению С:N во “flush” после фумигации (Joergensen & Mueller, 1996) - «непрямой метод». Фумигационный и регидратационный методы Способы определения пересчетных коэффициентов (II): «Прямая калибровка» с внесением 13C или 14C меченого С субстрата (при определении kEC) или 15N меченого источника N (при определении kEN) (Brookes et al., 1985; Jenkinson, 1988; Blagodatsky & Yevdokimov, 1998). Большинство исследователей выбирает простой путь – берут наиболее часто встречающиеся в литературе величины kEC = 0,45 и kEN = 0,54 и считают величины пересчетных коэффициентов постоянными. Это – главный источник ошибок при применении биоцидных методов!!! Фумигационный и регидратационный методы Способы определения пересчетных коэффициентов (III): • «Прямая калибровка» с изотопами с широким интервалом величин C:N во вносимом субстрате, либо с широком интервалом величин других факторов (рН, почвенная влажность и т.д.) При этом появляется возможность получить эмпирические уравнения зависимости k от вышеперечисленных экофизиологических факторов. Фумигационный и регидратационный методы Способы определения пересчетных коэффициентов (IV): • Примеры таких эмпирических уравнений: kEC = 0,2(C/N)0,3 C:N в калибровочном эксперименте колебалось от 3,4 до 36,2, при этом kEC варьировали от 0.18 (при максимальной величине C:N) до 0,62 (при минимальной) (Yevdokimov et al., 2006). kEN = (4,7 (1 – kEC) + (C/N) kEC) kEC/(C/N) (Blagodatsky & Yevdokimov, 1998). Общая закономерность: чем выше соотношение C:N, тем ниже пересчетный коэффициент. Фумигационный метод Трудности при определении фосфора микробной биомассы в почве: Необходимо количественно определить сорбцию Рсодержащих соединений. Необходимо количественно определить изотопный обмен при определении пересчетного коэффициента в опытах с радиоактивной меткой азота (32Р и 33Р). В связи с этим перспективным представляется использование анионно-обменных смол (anionexchange membranes, AEM). Экспериментальное определение Мечение изотопом 33P коэффициента сорбции Rsorp Ионообменные мембраны показали гораздо более высокое сродство к фосфатам, чем поверхность почвенных частиц, поэтому… Экспериментальное Для всех типов почв можно использовать 0.9 для Rsorp и определение коэффициента Rexch изотопного обмена Rexch kP следует Экспериментальное определение пересчетного коэффициента kP на основе Rsorp и Rexch определять kP показал сильную специфичность для каждой почвы, вероятно, из-за колебаний соотн. «грибы:бактерии», поэтому… отдельно для каждой почвы, используя мечение с 33P Результаты. Извлекаемость 33P после сорбции и изотопного обмена во время ионообменной процедуры (%); пересчетные коэффициенты для расчета микробного P (+ SE) Извлекаемость с учетом Почва сорбции, % Извлекаемость с учетом изотопного обмена, % Пересчетный коэффициент Rsorp Rexch kp Phaeozem 87+1 a 87+1 a 0.30+0.02 б Kastanozem 85+1 a 89+1 a 0.38+0.02 в Chernozem 92+2 б 88+1 a 0.19+0.01 a Podzol 91+2 б 98+2 б 0.32+0.01 б Буквами показаны существенные различия между почвами при P < 0.05, Yevdokimov et al., 2016 определенные по тесту Тьюки (n=3). Фумигационный метод: «прямая экстракция» при определении микробного Р Фумигационный метод: «прямая экстракция» при определении микробного Р Использование концентрации ДНК, выделенной из почвы, в качестве индекса общей микробной биомассы Joergensen (2006) : Cмик (мкг/г почвы) = FPLFA × PLFA (нмоль/г почвы), где FDNA – пересчетный коэффициент. Величины пересчетного коэффициента составили: FPLFA = 5,8 – при калибровке по методу фумигации-экстракции (FE) FDNA = 6,0 – “ – “ - Semenov et al. (2017) : Cмик (мкг/г почвы) = FDNA × dsDNA (мкг/г почвы), где FDNA – пересчетный коэффициент. Величины пересчетного коэффициента составили: FDNA = 4,4 – при калибровке по методу фумигации-экстракции (FE) FDNA = 5,1 – при калибровке по методу СИД (SIR) III. Методы, основанные на определении дыхательного отклика микробного сообщества Метод субстрат-индуцированного дыхания (СИД) – Substrate induced respiration (SIR) Принцип метода В почву вносят глюкозу и определяют дыхательный отклик микробного сообщества на внесение легкодоступного субстрата, продолжающийся в течение первых 3 - 4 ч (Anderson & Domsch, 1978). Углерод микробной биомассы рассчитывается с использованием пересчетного коэффициента. Метод СИД (SIR) Этапы определения методом СИД (SIR) В навеску почвы 10 – 40 г вносят раствор глюкозы или сухую глюкозу, перемешанную с тальком, прокаленным песком или др. инертным веществом. Почву, обогащенную углеродным субстратом, помещают в сосуд/ пластиковую трубку, герметично изолированную от окружающей атмосферы эластичной крышкой или мембраной, и инкубируют в течение нескольких часов в термостатических условиях. Производят периодическое (каждые 0,5 – 1 ч) определение скорости выделения СО2 из почвы (почвенного дыхания). Рассчитывают углерод микробной биомассы y (мкг С/ г) по следующей формуле: y = 40,04x + 0,37 , где x – интенсивность дыхания (мкл СO2/( г * ч)) – Anderson & Domsch (1978). Метод СИД (SIR) Определение скорости выделения СО2: Газохроматографическое – анализ производится на газовом хроматографе - gas chromatograph, GC (вручную или с автоматизированной системой пробоотбора и измерений). Методом инфракрасной спектроскопии –анализ производится на инфракрасном газовом анализаторе – infrared gas analyzer (IRGA) (вручную или с автоматизированной системой пробоотбора и измерений). . Адсорбционным методом - почва помещается в пластиковые стаканчики, стаканчики герметически изолируют в микрокосме с емкостью, содержащей раствор КОН. Измерения проводимости раствора щелочи производятся автоматически через заранее установленные интервалы времени. Уменьшение проводимости пропорционально поглощению СО2 из атмосферы микрокосма. Метод СИД (SIR) Преимущества СИД по сравнению с биоцидными методами Не нужно использовать токсические вещества (фумиганты), не нужно производить измерения растворимых соединений С и N. Меньшая трудоемкость при использовании автоматической установки с IRGA или RESPICOND, возможность использовать большее число повторностей. Возможность определять микробную биомассу параллельно с базальным дыханием на той же установке. Недостатки СИД по сравнению с биоцидными методами – Нельзя определить N, P и S в микробной биомассе. – Нельзя определить изотопный состав микробной биомассы. Метод СИД (SIR) Пересчетный коэффициент: Распространенной ошибкой является использование коэффициента 30 для расчетов, в которых величина х уже приведена к размерности мкг СО2-С/(г * ч). В этом случае происходит занижение расчетной величины микробной биомассы почти вдвое: фактически нужно подставлять пересчетный коэффициент 56. Важнейшее следствие недоразумений с пересчетными коэффициентами в FE, FI и SIR: В ряде публикаций величины микробной биомассы, полученные методом СИД (SIR), оказывались ниже таковых, полученных фумигационным или регидратационным методами. Это – следствие несовершенства методик определения пересчетных коэффициентов! На этом основании, а также в связи с тем, что в методе СИД (SIR) определяется дыхательная активность микробного сообщества, некоторые авторы до сих пор утверждают, что метод СИД (SIR) определяет «активную микробную биомассу». Это – ошибка!!! И биоцидные методы, и СИД (SIR) предназначены и откалиброваны для определения одного и того же пула – общей микробной биомассы. Главная проблема при использовании любых методов определения микробной биомассы в почве : Определение пересчетного коэффициента !!! Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR) Принцип метода: В почву вносят глюкозу и определяют динамику выделения СО2 в течение 16 – 24 ч после внесения легкодоступного субстрата (Panikov & Sizova, 1996). Общая и активная микробная биомасса, а также удельная скорость роста рассчитываются с использованием уравнений экспоненциального роста. Определения скорости выделения СО2 производятся в динамике (оптимально – не реже 1 раза в час) аналогично тому, как это делается в методе СИД (SIR). Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR) Определяемые параметры: Уравнения: vC – скорость продуктивного дыхания; vU – скорость ) непродуктивного дыхания; µmax – максимальная удельная скорость роста v(t) = vu + vc ×exp(µmax×t) (1), где v(t) – скорость продукции CO2; t - время r0 – фракция «активной» микробной биомассы r0= (vC ×0.1)/( vU + vC ×0.1) (2) x0=(vC × 0.9 × Yx/p)/(r0 × µmax) (3), x0 - общая микробная биомасса x’ – «активная» микробная биомасса где Yx/p– экономический коэффициент x’ = x0 × r0 (Panikov & Sizova, 1996) (4) Typical curve of CO2 emission - KSIR method 200 VCO2, mkgCg-1h-1 150 100 50 0 0 5 10 hours 15 20 25 Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR) Преимущества KSIR перед другими методами определения микробной биомассы + Определение не только общей, но и активной микробной биомассы. + Определение параметров микробной кинетики, что особенно важно при моделировании микробного роста в почве. + Большая чувствительность по сравнению с СИД при определении быстрой динамики микробной биомассы в почве и ризосфере. + Не требуется дополнительных лабораторных манипуляций по сравнению с СИД – кинетику выделения СО2 можно изучать в тех же пробах. Недостатки KSIR по сравнению с другими методами определения микробной биомассы – Привлечение довольно сложного математического аппарата, высокая трудоемкость расчетов. – Параметры µmax и vc часто бывают скоррелированными между собой – результаты расчетов микробной биомассы поэтому получаются не свободными от субъективизма исследователя. – Использование фиксированных значений коэффициента CNрезистентного дыхания и экономического коэффициента Y. – Отсутствие апробации на широком ряде почв и экосистем. Методы СИД (SIR) и кинетический (KSIR) Как это выглядит (определение на установке с IRGA): Технический Университет г. Инсбрук, Австрия Методы СИД (SIR) и кинетический (KSIR) Как это выглядит (определение на установке RESPICOND): Институт почвенной экологии, Научн.-иссл. центр Гельмгольцевского общества, Нойерберг/Мюнхен, Германия Название метода Принцип получения аналитического сигнала Фумигационный БИОЦИДНЫЕ БИОЦИДНЫЕ МЕТОДЫ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОГО ОТКЛИКА метод Регидратационный метод Метод СИДСИД Кинетический СИД метод АТФ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАРКЕРОВ ЖКФ ДНК и РНК Возможности метода Пригодность для измерений внутрисуточной динамики Низкая трудоемкость определений Высокая степень автоматизации измерений Ненужность сложного оборудования для «мокрой химии» Совместимость с изотопными методами Определение таксономической структуры микробного сообщества Евдокимов И.В. Методы определения биомассы почвенных микроорганизмов // Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2018. Т. 3. № 3. С. 1-20. DOI: 10.21685/2500-0578-2018-3-5, Q4. Илья Витальевич Евдокимов Контакты: ilyaevd@rambler.ru ilyaevd@yahoo.com БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!
