1 Краткий курс лекций по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии Часть первая. Общая микробиология (для студентов 2 курса отделения «лабораторная диагностика» ) Санкт-Петербург 2017 2 В учебном пособии представлены краткие материалы в виде лекций по основным направлениям общей микробиологии в соответствии с Программой профессионального модуля: Теория и практика лабораторных микробиологических исследований по специальностям среднего профессионального образования 060604 Лабораторная диагностика Пособие предназначено для обучения медицинских лабораторных техников и технологов на 2 курсе в третьем семестре. Организация-разработчик: ГБПОУ СПб медицинский колледж 3 Разработчики: Иванова И.Ф. К.м.н., Преподаватель микробиологии высшей квалификационной категории Лаппо О. диагностики П. врач- ЦАРРиТ ФГУ лаборант, 442 мед. окружного лаборатории военного экспресс - клинического госпиталя МО РФ Саенко Т. П. врач, преподаватель микробиологии первой квалификационной категории Учебное пособие может быть полезным для студентов, изучающих микробиологию, вирусологию, иммунологию и смежные дисциплины Рецензенты : Рекомендуется к изданию 3 Содержание Пояснительная записка Лекция №1. Введение. Предмет и задачи 4 стр. 7 стр. микробиологии. История развития. Лекция № 2. Основные принципы классификации 22 стр. микроорганизмов. Лекция №3. Морфология и ультраструктура бактерий Лекция № 4 Морфология грибов, спирохет, 28 стр. 43 стр. простейших, риккетсий, микоплазм, вирусов. Лекция 5. Морфология вирусов. Вирусы бактерий - 53 стр. бактериофаги Лекция 6. Микроэкология. Роль микроорганизмов в 65 стр круговороте веществ. Нормальная микрофлора организма человека. Лекция 7 Действие физических и химических 75 стр. факторов на микроорганизмы. Лекция 8 Антибиотики. Использованная и рекомендуемая литература 80 стр. 92 стр. 4 Пояснительная записка Основная цель лекционного курса по разделу «Общая микробиология» формирование у будущего лаборанта - микробиолога научного мировоззрения о многообразии микроорганизмов и их роли в общебиологических процессах. В задачи курса входит изучение студентами: - принципов систематики, морфологии и физиологии, широты распространения микроорганизмов в природе - особенностей биологии и экологии микроорганизмов; - роли микробов в превращении веществ в природе и эффекты действия факторов внешней среды на прокариотические клетки, - методов индикации и идентификации патогенных бактерий, - основ учения об инфекции и иммунитете - микроскопических, бактериологических, серологических, иммунологических, биологических методов исследования, используемых при диагностике инфекционных болезней. В результате изучения курса студенты должны знать: - теоретические основы жизнедеятельности микроорганизмов, их взаимодействия друг с другом и с организмом человека и животных - основные биологические свойства патогенных микробов, - принципы и способы диагностики и специфической профилактики инфекционных болезней. Освоение программы, в соответствии с профессиональным модулем «Теория и практика лабораторных микробиологических исследований», рассчитано на 6 семестров. Раздел «Общая микробиология » предусматривает 46 лекционных часов, распределенных на первые 3 семестра. В 4, 5, 6 семестрах предусмотрено изучение частной микробиологии и вирусологии. 5 План лекций по дисциплине: Теория и практика лабораторных микробиологических исследований (раздел «Общая микробиология», 3 семестр). Наименование тем лекций в соответствии с профессиональным модулем (ПМ.04) 1 Содержание учебного материала, объем часов 2 2 курс 3 семестр . Задачи медицинской микробиологии Основные этапы Введение: Предмет исторического развития микробиологии. Роль отечественных ученых в микробиология, история развития. развитии микробиологии (Е.П. Павловский, П.Ф. ЗдрАдовский, М.И. Чумаков, А.А. Смородинцев, Л.А. Зильбер, З.В. Ермолаева, Р.В. Петров Задачи микробиологии Лекция 1. Современная международная классификация Берджи. Эукариоты (простейшие грибы), прокариоты (бактерии, риккетсии, хламидии, Основные принципы микоплазмы).. классификации микроорганизмов. Основные формы, величина и полиморфизм бактерий. Строение Лекция 3 Морфология и микробной клетки. Строение и назначение органелл микробной клетки ультраструктура бактерий Краткая характеристика и морфологические свойства грибов, Лекция 4. Морфология грибов, спирохет, простейших, риккетсий, микоплазм спирохет, простейших, риккетсий, микоплазм. Лекция 2 2 Строение вирусов; строение Т- четного бактериофага Классификация б.ф. Этапы взаимодействия б.ф. с чувствительной Морфология вирусов. Вирусы бактерий - клеткой. Понятие о фаготипировании и фагодиагностике бактериофаги. Понятия «популяция», «биотоп», «микробиоценоз», «экосистема». Лекция 6. Микроэкология. Роль Экологические среды микробов. Значение нормальной микрофлоры. Нарушения в составе микроорганизмов в круговороте веществ. нормальной микрофлоры. Понятие дисбактериоза Нормальная микрофлора организма человека. Лекция 3 18 5. 2 2 6 1 Лекция 2 7 Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Лекция 8 Антибиотики. Химиотерапия. Осложнения при антибиотикотерапии Механизмы губительного действия. Антимикробные мероприятия. Микробная деконтаминация объектов внешней среды. Дезинфекция, виды, цели. Группы химических веществ с антимикробным действием. Стерилизация, цели, способы, аппаратура. Методы контроля стерилизации и дезинфекции. Микробная деконтаминация живых организмов. Антисептика. Асептика. Химиотерапевтические средства, основные группы. Механизмы антимикробного действия. Антагонизм бактерий. Классификация по происхождению, химической структуре, спектру и механизму действия. Требования, предъявляемые к антибиотикам. Основные механизмы ингибирующего действия на бактерии. Осложнения антибиотикотерапии. Микробиологические основы Антибиотикоуст рациональной антибиотикотерапии. Методы определения чувствительности микроорганизмов к ойчивость и механизмы ее антибиотикам. Метод серийных разведений. Определение МПК и МБК антибиотиков. Метод бумажных дисков. Ускоренные и формирования. автоматизированные методы определения чувствительности бактерий к Способы преодоления антибиотикам. Принцип определения концентрации антибиотиков в лекарственной биологических жидкостях организма. устойчивости. Лекция 9 3 2 7 Лекция №1. Введение. Предмет и задачи микробиологии. История развития. Микробиология (от micros — малый, bios — жизнь, logos — учение) — наука, изучающая закономерности жизни и развития мельчайших организмов — микроорганизмов в их единстве со средой обитания, их биологические признаки, систематика, экология, взаимоотношения с другими организмами. Микроорганизмы – наиболее древняя форма организации жизни на Земле. По количеству они представляют собой самую значительную и самую разнообразную часть организмов, населяющих биосферу, включают многочисленные виды как полезных, так и вредных для человека микроорганизмов. Одни из них являются участниками круговорота веществ и энергии в природе и, следовательно, определяют возможность существования жизни на Земле. Другие, наоборот, причиняют ущерб. Отдельные виды в процессе эволюции адаптировались к существованию в живых организмах и приобретали свойства возбудителей инфекционных заболеваний людей, животных и растений. К микроорганизмам относят: 1) бактерии; 2) вирусы; 3) грибы; 4) простейшие; 5) микроводоросли. Общий признак микроорганизмов – микроскопические размеры; отличаются они строением, происхождением, физиологией. Бактерии – одноклеточные микроорганизмы растительного происхождения, лишенные хлорофилла и не имеющие ядра. Грибы – одноклеточные и многоклеточные микроорганизмы растительного происхождения, лишенные хлорофилла, но имеющие черты животной клетки, эукариоты. Вирусы – это уникальные микроорганизмы, не имеющие клеточной структурной организации. В зависимости от экологии микробов и практических потребностей человека паука о микробах дифференцировалась на общую, 8 медицинскую, ветеринарную, сельскохозяйственную, пищевую и промышленную микробиологию. В XX веке появилась морская и космическая микробиология. Общая микробиология изучает наиболее общие закономерности, свойственные каждой группе перечисленных микроорганизмов: структуру, метаболизм, генетику, экологию и т. д. Основной задачей технической микробиологии является разработка биотехнологии синтеза микроорганизмами биологически активных веществ: белков, ферментов, витаминов, спиртов, органических веществ, антибиотиков и др. Ветеринарная микробиология изучает возбудителей заболеваний животных, разрабатывает методы их биологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения, направленного на уничтожение микробов-возбудителей в организме больного животного. Предметом изучения медицинской микробиологии являются болезнетворные (патогенные – возбудители инфекционных заболеваний) и условно-патогенные ( вызывают заболевания при определённых условиях) для человека микроорганизмы и те взаимоотношения, которые возникают между ними и организмом в определенных условиях внешней и социальной среды, а также разработка методов микробиологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения вызываемых ими инфекционных заболеваний. Разделом медицинской микробиологии является и иммунология, которая занимается изучением специфических механизмов защиты организмов людей и животных от болезнетворных микроорганизмов. Таким образом, курс медицинской микробиологии состоит из общей части, включающей изучение морфологии и физиологии микроорганизмов, учение об инфекции и иммунитете, и специальной части (частная микробиология), посвященной изучению свойств возбудителей основных инфекционных заболеваний человека, методов микробиологической диагностики, вопросов патогенеза, иммунитета, специфической профилактики и терапии. Предметом изучения санитарной микробиологии являются санитарно- микробиологическое состояние объектов окружающей среды и пищевых продуктов, разработка санитарных нормативов. Развитие микробиологии. За относительно короткий срок развития микробиология обогатила 9 медицину блестящими необходимым в достижениями разнообразных и областях ее применение медицинской стало теории и практики. Практически нет ни одной отрасли медицины, не связанной с микробиологией, в которую, помимо бактериологии, сейчас входят вирусология, иммунология, микология, протозоология и паразитология. Донаучный этап. Задолго до открытия микроорганизмов человек сталкивался с процессами их жизнедеятельности. Люди использовали брожение теста и виноградного сока, сквашивание молока, получение пива, уксуса, при силосовании кормов, мочке льна. Издавна знакомы человечеству и повальные заболевания, уносившие население целых городов. Однако люди не знали вызывающих их истинных причин. Это не мешало делать наблюдения и использовать ряд этих процессов в быту. Ряд философов и естествоиспытателей делали умозрительные заключения о причинах тех или иных явлений. Уже в трудах Гиппократа (460 - 377 д.н.э.) появляются предположения о связи заразных болезней и особых болезнетворных испарений, названных им «миазмами». В трудах Лукреция (95-55 д. н.э.) и Галена (131-211 д.н.э.) была высказана гипотеза о живой природе возбудителей заразных заболеваний. Народы Азии имели определённые представления о заразности лепры (проказы) и проводили изоляцию больных. Авиценна считал, что причиной заразных болезней являются невидимые существа, передающиеся через воду и воздух. Имея подобную гипотезу, наиболее близко к открытию микромира подошел итальянский врач Джироламо Фракасторо (1478—1553), предположивший, что инфекции вызывают маленькие тельца, передающиеся при контакте и сохраняющиеся на вещах больного. Он создал учение о живом «контагии» - о мельчайших и недоступных нашим чувствам частицах, которые, проникая, вызывают болезнь. Гипотезу о том, что эти частицы живые существа, высказал в начале 17 века немецкий учёный, иезуит Афанасий (Анасиус) Кирхер (1602 -1680). Однако в то время невозможно было удостовериться в правильности идей Фракасторо и распространение получили совершенно иные гипотезы. Бактериальную природу инфекционных 10 заболеваний многие революционных Петтенкофер, учёные открытий уверенный продолжали Пастера в том и что отвергать Коха холеру так, в и после 1892 Макс вызывают миазмы, выделяемые окружающей средой, и пытаясь доказать свою правоту, проглотил при свидетелях-медиках культуру холерных вибрионов. Рис. 1 Джироо́ ламо Фракастоо́ ро (1478 1553) — венецианский врач и писатель. Рис. 2 Атанасиус Кирхер (1602 – 1680) - немецкий учёный, иезуит, занимавшийся физикой, естественными науками, лингвистикой, древностями, теологией, математикой. Морфологический (описательный) этап. Возможность изучения микроорганизмов возникла лишь с развитием оптических приборов. Первый микроскоп был создан ещё в 11 1610 году Галилео Галилеем. В 1665 Роберт Гук впервые увидел растительные клетки. Однако 30 кратного увеличения его микроскопа не хватило, чтобы увидеть простейших и тем более бактерии. По мнению В. Л. Омельянского «первым исследователем, перед изумлённым взором которого открылся ... мир микроорганизмов, был учёный иезуит астрологического микромира Афанасий Кирхер, автор характера», однако обычно называют Антони ван ряда сочинений первооткрывателем Левенгука. В своём письме Лондонскому Королевскому обществу он сообщает, как 24 апреля 1676 года микроскопировал каплю воды, и даёт описание увиденных там существ, в том числе бактерий. Левенгук считал обнаруженных им микроскопических существ «очень маленькими животными» и приписывал им те же особенности строения и поведения, что и обычным животным. Повсеместное распространение этих «животных» стало сенсацией не только в научном мире. Левенгук демонстрировал свои опыты всем желающим, в 1698 году его даже посетил Пётр I. Между тем, наука в целом ещё не была готова к пониманию роли микроорганизмов в природе. Система теорий возникла тогда лишь в физике. Во времена Левенгука отсутствовали представления о ключевых процессах живой природы. Поэтому неудивительно что «живым зверькам» Левенгука не нашлось место нигде, кроме как в коллекции курьёзов. В течение следующих 100–150 лет развитие микробиологии проходило лишь с описанием новых видов. Видную роль в изучении многообразия микроорганизмов сыграл Отто Фридрих Мюллер, который к 1789 описал и назвал по линнеевской биномиальной номенклатуре Христиана 379 различных Готтфрида видов. Также Эренберга, следует описавшего отметить множество пигментированных бактерий, первые железобактерии, а также скелеты простейших и диатомовых водорослей в морских и лиманных отложениях, чем положил начало микропалеонтологии. Именно он впервые объяснил окраску воды Красного моря развитием в ней цианобактерий Trichodesmium erythraeum. Он, однако, причислял бактерий к простейшим и рассматривал их вслед за Левенгуком как 12 полноценных животных с желудком, кишечником и конечностями. В России одним из первых микробиологов был Лев Семенович Ценковский (1822-1887), описавший большое число простейших, водорослей и грибов и сделавший вывод об отсутствии резкой границы между растениями и животными, отнёс бактерии к растительным организмам. Позже им также была организована одна из первых Пастеровских станций и предложена вакцина против сибирской язвы. Однако, открытые Левенгуком микроскопические существа не связывали с возникновением заразных заболеваний. Высказывались в это время смелые гипотезы, например военный врач-эпидемиолог Д. С. Самойлович (1744–1801) был убеждён в том, что болезни вызываются именно микроорганизмами, однако тщетно пытался увидеть в микроскоп возбудитель чумы – возможности оптики тогда ещё не позволяли это сделать. Во время чумы в Москве (1771-1772 гг.) именно Данила Самойлович впервые проводит дезинфекцию одежды и других вещей больных чумой, предписывает часто мыть руки и делает «прививку заразного ослабленного начала чумы» здоровым людям, прикасавшимся к больным. В 1796 году английским врачом Эдуардом Дженнером была проведена первая прививка против оспы, на создание метода оспропрививания у него ушло 10 лет. Дженнер заметил, что многие люди, которые не болели оспой при контакте с больными не заражаются. Особенно часто это явление наблюдали у доярок, заражавшихся при доении животных, больных коровьей оспой. Первая прививка была проведена здоровому мальчику, которому ввели содержимое гнойного пузырька коровы, больной оспой, а через полтора месяца он привил этому же мальчику материал от человека, больного оспой. Мальчик не заболел. Таким образом, человечество избавилось от этой страшной болезни, уносившей миллионы человек. ( В Париже за 1723 г. умерло от оспы 20 тыс. человек, в Неаполе в 1768 г. умерло 16 тыс. человек за несколько недель). В 1827 итальянец А. Басси обнаружил передачу болезни шелковичного червя при переносе микроскопического гриба. Ж. Л. Л. Бюффон и А. Л. Лавуазье связывали брожение с дрожжами, однако общепринятой оставалась чисто химическая теория этого процесса, 13 сформулированная в 1697 Г. Э. Шталем. Для спиртового брожения, как для любой реакции, Лавуазье и Жозефом ЛуиГей-Люссаком были посчитаны стехиометрические соотношения. В 1830-х Ш. Каньяр де Латур, Ф. Кютцинг и Т. Шванн независимо друг от друга наблюдали обилие микроорганизмов в осадке и плёнке на поверхности бродящей жидкости и связали брожение с их развитием. Эти представление наткнулись, однако, на резкую критику со стороны таких видных химиков как Фридрих Вёлер, Йёнс Якоб Берцелиус и Юстус Либих. Последний даже написал анонимную статью «О разгаданной тайне спиртового брожения» (1839) – саркастическую пародию на микробиологические исследования тех лет. Тем не менее, вопрос о причинах брожения, тесно связанный с вопросом о спонтанном самозарождении жизни, стал первым успешно решённым вопросом о роли микроорганизмов в природе. Рис. 3 Антони ван Лео́ венгук (1632 1723) — голландский натуралист, конструктор микроскопов, основоположник научной микроскопии, член Лондонского королевского общества (с 1680 года). 14 Рис. 4 Лев Семёнович Ценкоо́ вский (1822 - 1887) — русский ботаник, протозоолог и бактериолог, член- корреспондент Петербургской АН (1881). Рис. 5 Даниил Самойлович Самойлович (настоящая фамилия — Сущинский;1744 - 1805) — украинский медик, основатель эпидемиологии в Российской империи, фундатор первого на Украине научного медицинского товарищества. Первым доказал возможность противочумной прививки. Рис. 6 Эдвард Дженнер (1749 - 1823) — английский врач, разработал первую вакцину — против оспы. Первый 15 руководитель общества оспопрививания в Лондоне с 1803 года (ныне Дженнеровский институт). Физиологический этап. Последующее развитие микробиологии и становление ее как науки связаны с именем французского ученого Л. Пастера (1822—1895). Первые работы Пастер (химик по образованию) посвятил изучению асимметрии виннокислых солей и уже в этой области приобрел известность, открыв явление изомерии. Но во всем мире он получил признание благодаря изучению микробиологии, сделав ряд открытий. Именно его труды микроорганизмов в дали научные возникновении доказательства заразных значения заболеваний и обоснование для развития методов борьбы с ними. Основные этапы деятельности Л. Пастера. 1. Описал процессы брожения и гниения, показал, что они вызываются микроорганизмами, 1857. 2. Впервые выявил новую форму жизни микроорганизмов – анаэробную, не требующую кислорода, а иногда даже гибнущей под его воздействием. 3. Доказал, что самопроизвольного зарождения жизни не существует, в 1860-х показал что стерилизация делает брожение невозможным. Опыты Пастера показали, что микроорганизмы попадают в питательную среду из воздуха. Этот вопрос волновал учёных на протяжении долгого времени. ( Хотя ещё в 1775 г. русский исследователь М.М. Тереховский высказал мнение, что микроскопические существа не возникают путём самозарождения, но вопрос возникновения живого из неживого оставался спорным.) Так принцип omne vivum ex vivo (всё живое из живого) окончательно победил в биологии. 4. Занимался болезнями вина и пива, 1865. 5. Изучил болезни шелковичных червей, которые наносили огромный урон экономике Франции, нашёл причину поражения червей – их заболевания также были вызваны микробами, нашёл средство борьбы с ними, 1868. 6. Разработал метод уничтожения микроорганизмов, при воздействии на них высокой температурой. Этот метод обеспложивания называют стерилизацией. Для пищевых продуктов, которые при кипячении изменяют свои свойства, он предложил более «мягкую» обработку, которую назвали пастеризацией. 7. Доказал, что заразные болезни человека являются результатом жизнедеятельности микроорганизмов, это дало начало новой науке медицинской микробиологии. 16 8. Создал вакцину (vacca – лат. корова) этим термином Пастер назвал ослабленную культуру микроорганизмов, введение которой не вызывает заболевание, но делает людей и животных невосприимчивыми к заболеванию. Пастер является основоположником профилактических прививок. В 1885г. предложил прививку против бешенства. Для создания этой вакцины он использовал материал от бешенной собаки, так как в чистом виде возбудителя бешенства не удавалось увидеть под микроскопом или вырастить на питательной среде. Первым от бешенства был вакцинирован ребенок, искусанный бешенной собакой, что спасло его от смерти. Следующим шагом была вакцинация русских крестьян, пришедших пешком в Париж, после укусов бешенного волка. На основе этого были созданы вакцины против сибирской язвы и холеры животных. 9. Кроме того, в 1877 г. разработал метод получения чистых культур бактерий вне организма или той естественной природной среды, где микробы находятся, открыл новую эпоху в микробиологии и обеспечил ее развитие в ближайшие годы. Пастеру принадлежит честь открытия возбудителя куриной холеры, родильной горячки, септицемии, остеомиелита, одного из возбудителей газовой гангрены. На основании открытий Пастера английский учёный Д. Листер в 1867 г. создал методы антисептики и септики – промывания ран и перевязочных материалов раствором карболовой кислоты, чтобы предотвратить микробное заражение. 1880-е и 1890-е ( «Золотой век» микробиологии) ознаменовались для микробиологии всплеском числа открытий. Во многом это было связано с подробной разработкой методологии. Прежде всего, здесь следует отметить вклад Роберта Коха (1843-1910), создавшем в конце 1870-х – начале 1880-х ряд новых методов и общих принципов ведения исследовательской работы. Впервые ввел в практику плотные питательные среды ( до этого использовались только жидкие питательные среды), позволившие получить отдельные колонии и чистую культуру. В 1887 году введены в практику чашки Петри. Кох впервые предложил использовать анилиновые красители для окраски бактерий (ранее использованные в ботанике), применил иммерсионную систему и микрофотографию, вел освещение при микроскопировании, используя конденсор Аббе. Он открыл возбудителя туберкулёза, названного в честь учёного полочкой Коха (1882) и возбудителя холеры (1883) 17 Коху принадлежат также знаменитые постулаты: возбудитель заболевания должен регулярно обнаруживаться у пациента он должен быть выделен в чистую культуру выделенный организм должен вызывать у подопытных животных те же симптомы, что и у больного человека Эти принципы были приняты не только в медицине, но и в экологии для определения вызывающих те или иные процессы организмов. Методы выращивания и выделения микроорганизмов, которые разработал Кох, привели к целому ряду других открытий и обогащению методологии: так в 1884 Ганс Кристиан Грам использовал метод дифференцирующего окрашивания бактерий (Метод Грама), Сергей Николаевич Виноградский в 1891 применил первую элективную среду. За следующие годы было описано больше видов чем за все предыдущее время, выделены возбудители опаснейших заболеваний, обнаружены новые процессы, производимые бактериями и неизвестные в других царствах природы. Были описаны возбудители дифтерии (Э. Клебс и Ф. Леффлер), брюшного тифа (К. Эберт и Г. Гаффки), столбняка (А. Николайер и С. Китазато), дизентерии (А.В. Григорьев и К. Шига) и другие. Открытие некоторых возбудителей инфекций, связаны и с драматическими страницами в истории медицины, так в1874 году профессор Казанского университета Г.Н. Минх заразил себя кровью больного возвратным тифом, доказав этим, что возбудитель данного заболевания находится в крови, он так же высказал предположение, что передаётся это заболевание через кровососущих насекомых. Через два года врач О.О. Мочутковский, повторив опыт Минха заразил себя кровью больных сыпным и возвратным тифом и подтвердил, что возбудители этих инфекционных заболеваний находятся в крови. 18 Рис. 7 Луии Пастеи р (1822 - 1895) — французский микробиолог и химик, член Французской академии (1881). Рис. 8 Геи нрих Геи рман Рои берт Кох (1843 - 1910) — немецкий микробиолог. За исследования туберкулёза награждён Нобелевской премией по физиологии и медицине в 1905 году. Рис. 9 Сергеи й Николаи евич Винограи дский (1856 -1953) — выдающийся русский микробиолог, основатель экологии микроорганизмов и почвенной микробиологии. 19 Рис. 10 Ганс Кристиан Йоахим Грам (1853 - 1938) — датский бактериолог. Иммунологический этап. К началу данного периода учёными были разработаны научные основы, а их классические работы привели к созданию учения о фагоцитозе. Теория фагоцитоза была предложена И. И. Мечниковым в 1883 г. на VII съезде русских естествоиспытателей и врачей в Одессе. В противовес односторонней этиологической направленности мнения Коха и его учеников И. И. Мечников впервые научно аргументировал роль и активность самого организма в инфекционном процессе, объединив бактериологию с патологией, создав новое направление в медицине. В 1886 г. И. И. Мечников организовал и возглавил первую в России бактериологическую станцию в Одессе. Общественная деятельность И. И. Мечникова навлекла на него преследования царского правительства, и в 1888 г. ученый вынужден был покинуть родину. Последние 20 лет жизни он работал в Париже в Институте Пастера, но, оставаясь русским подданным, ученый - патриот часто приезжал в Россию, содействовал развитию отечественной медицинской науки. Совместно с французским микробиологом Эмилем Ру в 1903 г. И. И. Мечников разработал метод воспроизведения экспериментального сифилиса. Учение о фагоцитозе явилось основой для понимания сущности воспаления как активной реакции организма против микробов, в которой фагоцитарная активность клеток организма обеспечивает устойчивость, сформировавшуюся в процессе эволюционного развития человека. Одновременно с И. И. Мечниковым невосприимчивость к инфекционным болезням исследовал Пауль Эрлих (1854—1915), создавший гуморальную теорию иммунитета (от humor — жидкость). Эта теория основывалась на накапливающихся фактах, свидетельствующих о защитной роли сыворотки крови, которая содержит особые вещества — антитела. Были получены антитоксические сыворотки против ядов дифтерийной, столбнячной палочки, возбудителя ботулизма и др., примененные в лечении соответствующих заболеваний. Длительная и 20 упорная борьба мнений между сторонниками клеточной и гуморальной теорий иммунитета стимулировала проведение большого числа исследований, результатом которых явились создание более совершенных лабораторных методов диагностики инфекционных болезней, получение вакцин для профилактики и другие полезные для практики предложения, а главное — установление общепризнанного теперь факта, что невосприимчивость к инфекционным заболеваниям зависит как от клеточного (фагоцитарного), так и от гуморального факторов. За разработку учения об иммунитете И. И. Мечников и П. Эр лих в 1908 г. были удостоены Нобелевской премии. Современная иммунология родилась как учение о невосприимчивости к инфекционным заболеваниям. Многочисленные исследования в области иммунологии на протяжении нескольких десятилетий показали, что иммунитет является функцией не только фагоцитов. Главное значение иммунитета состоит в распознавании «своего» и «чужого». Эта идея, сыгравшая огромную роль в расширении границ иммунологии, принадлежит Ф. Бернету — известному австралийскому ученому, одному из крупнейших иммунологов современности. Русскому ученому Д. И. Ивановскому принадлежит честь открытия фильтрующихся вирусов (1892). Опыты Д. И. Ивановского по методу выполнения были простыми: сок, выжатый из листьев табака, пораженных мозаичной болезнью, фильтровался через специальные каолиновые фильтры и фильтратом заражались свежие листья, в результате чего у растения развивалось заболевание. Год описания этих опытов (1892) считают годом открытия вирусов, а Д. И. Ивановского — первооткрывателем их и основоположником вирусологии, которая сейчас сформировалась в самостоятельную науку. Вслед за установленнием Д. И. Ивановским вирусной природы болезней растений были открыты вирусы, патогенные для животных и человека. Большим успехом отечественной вирусологии является история борьбы с трансмиссивными энцефалитами. Используя достижения науки, в 1937 г. группа ученых под руководством Л. А. Зильбера па Дальнем Востоке выделила вирус клещевого энцефалита, изучила основные закономерности патогенеза, патоморфологии и иммунологии этого заболевания и доказала роль клещей в передаче инфекции. Уже в 1940 г. были созданы высокоэффективные средства профилактики (инактивированная мозговая формолвакцина) и терапии (препараты специфического лошадиного гаммаглобулина, а также гаммаглобулина, приготовленного из сыворотки людей, проживающих в эпидемических очагах). Изучение очагов клещевого и японского энцефалита в природе привело к созданию теории природной очаговости инфекционных болезней. В 1955 г. американский ученый Дж. Солк получил инактивированную вакцину против полиомелита, а затем А. Сэбин селекционировал 21 живую вакцину. Исключительно важное место в работах отечественных вирусологов занимает изучение гриппа — наиболее распространенной и сейчас инфекционной болезни человека. Изучение гриппа было начато в 1933—1934 гг. Вирусолог В. М. Жданов посвятил свои работы, разрешению проблем гриппа, созданию классификации вирусов, изучению эволюции инфекционных вирусных болезней. Вирусологи внесли много нового в изучение онкогенных вирусов. Ими были разработаны вопросы иммунологии рака, вирусной трансформации клетки и многие другие. Л. А. Зильбером была сформулирована первая вирусогенетическая теория возникновения опухолей. Основы современной химиотерапии были заложены П. Эрлихом, который показал, что растворимые свинцовые соли, введенные в организм, не распределяются в нем равномерно, а способны концентрироваться в определенных органах и клетках. Он сделал очень важное заключение, что некоторые химические вещества имеют химическое сродство к определенным тканям и клеткам. Этот подход к лечению инфекционных заболеваний Эрлих называл химиотерапией и считал, что химия поможет найти «волшебную пулю», которая способна убить микробы, не повреждая клетки организма человека. Наблюдая антагонизм микробов, некоторые исследователи пытались выделять вещества, продуцируемые микробами - антагонистами в окружающую среду, в частности зеленой плесенью, лечебные свойства которой были известны еще в XIX веке. Но практического выхода эти работы не получили и вскоре были забыты. Английский ученый Александр Флеминг в 1928 г. наблюдал зоны лизиса стафилококка в чашках, случайно проросших зеленой плесенью. Выделенный штамм плесени губительно действовал и на другие микробы. Однако выделить активное начало зеленой плесени — пенициллин — удалось только в 1940 г. В чистом виде пенициллин был получен группой английских химиков во главе с Г. Флори и Э. Чейном. Организация производства и широкое внедрение пенициллина в медицинскую практику потребовали согласованных усилий ученых разных специальностей. В Советском Союзе активные штаммы, продуцирующие пенициллин, были изучены 3. В. Ермольевой в 1942 г. Открытие пенициллина и широкое внедрение его в практику положило начало новой эры в развитии медицины — эры антибиотиков. В 1943 г. С. Ваксмаи из почвенного микроба Actinomyces globisporus получил новый антибиотик стрептомицин, который оказался эффективным средством в лечении туберкулеза. 1945 г. был ознаменован открытием хлорамфеникола и хлортетрациклина— антибиотиков, эффективных в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Затем были получены так называемые антибиотики широкого спектра действия. 22 Рис. 11 Ильяи Иль ии ч Меи чников (1845 - 1916) российский и французский биолог (зоолог, эмбриолог, иммунолог, физиолог и патолог). Лауреат Нобелевской премии в области физиологии и медицины (1908). Рис. 12 Пауль Эрлих (1854 - 1915) — немецкий врач, иммунолог, бактериолог, химик, основоположник химиотерапии. Лауреат Нобелевской премии (1908). Рис.13 Дмитрий Иосифович Ивановский (1864 - 1920) — русский физиолог растений и микробиолог, основоположник вирусологии. 23 Рис.14 Алексаи ндр Флеи минг (1881 - 1955) — британский бактериолог. Открыл лизоцим и впервые выделил исторически первый антибиотик. В 1945 Флеминг, Флори и Чейн были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Начиная с 40—50-х годов XX в. микробиология и иммунология вступили в молекулярно-генетический этап развития. За последние три десятилетия в результате развития нового этапа в микробиологии — генетики микроорганизмов — возникла молекулярная биология как новая отрасль знаний, в задачу которой входит изучение структуры белка, нуклеиновых кислот и пр. Создание электронного микроскопа сделало видимым мир вирусов и макромолекулярных соединений. Генетика бактерий пролила свет на когда-то запутанные проблемы их изменчивости, внесла поистине революционизирующий вклад в генетику в целом, «вскормила» целую область биохимии, что в значительной степени обусловило рождение молекулярной биологии и биотехнологии. возможными Расшифровка искусственное генома кишечной конструирование палочки генов и сделала пересадку отдельных генов из одних клеток в другие. К настоящему времени генная инженерия внесла принципиально новые идеи и методы в производство широкого спектра биологически активных веществ. Основными технологическими принципами, используемыми в биотехнологии, являются: а) брожение (ферментация); б) биоконверсия (превращение одного вещества в другое); в) культивирование бактерий, вирусов, растительных и животных клеток; г) генетическая инженерия, к ней относится и процесс искусственного создания микробов с необходимыми свойствами. 24 Лекция № 2. Основные принципы классификации микроорганизмов. Построение классификации на основе рибосомной РНК отображает родство организмов, но зато зачастую не отражает сходство в образе их жизни. Почему выбрана именно рибосомная РНК? Потому что это самая консервативная, т.е. наиболее медленно меняющаяся, часть генома. Ниже на рисунке представлено дерево родства разных организмов. На нем выделяются группы бактерий, архей и эукариот. Эти группы, более высокого ранга, чем царства. Их называют надцарства или домены. Термин домен используется в разных науках. В данном случае, в систематике, «домен» обозначает группу (рангом выше царства), объединяющую разные организмы, обладающие определенным набором общих черт. 25 Что же общего у бактерий и архей, что отличает их от эукариот? Итак, живые организмы разделили на царства Растений, Грибов, Животных и Простейших (одноклеточных), и царство бактерий, в которое входили все прокариоты. Но когда изучали бактерий, оказалось, что они также делятся на две сильно отличающиеся группы. Соответственно, их пришлось разделить на два царства: Эубактерии (собственно бактерии) и Архебактерии (другое название – Археи). Последние также не имеют ядра, но по структуре сильно отличаются от бактерий. Систематика и номенклатура микроорганизмов. Основной таксономической единицей систематики бактерий является вид. Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками. Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты (разновидности) микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками. Так, различают: 1) серовары (по антигенной структуре); 2) хемовары (по чувствительности к химическим веществам); 26 3) фаговары (по чувствительности к фагам); 4) ферментовары; 5) бактериоциновары; Бактериоцины – вещества, продуцируемые бактериями и губительно действующие на другие бактерии. По типу продуцируемого бактериоцина различают бактериоциновары, а по чувствительности – бактериоциногеновары. 6) бактериоциногеновары. Для видовой идентификации бактерий необходимо знать следующие их свойства: 1) морфологические (форму и структуру бактериальной клетки); 2) тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями); 3) культуральные (характер роста на питательной среде); 4) биохимические (способность утилизировать различные субстраты); 5) антигенные. Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки. Более высокими таксономическими категориями являются классы, отделы, подцарства и царства. Согласно современной систематике патогенные микроорганизмы относятся к царству прокариот, патогенные простейшие и грибы – к царству эукариот, вирусы объединяются в отдельное царство – Vira. Все прокариоты, имеющие единый тип организации клеток, объединены в один отдел – Bacteria. Однако отдельные их группы отличаются структурными и физиологическими особенностями. На этом основании выделяют: 1) собственно бактерии; 2) актиномицеты; 3) спирохеты; 4) риккетсии; 5) хламидии; 6) микоплазмы. Наибольшую известность получила фенотипическая классификация бактерий, основанная на строении их клеточной стенки, включённая, в частности, в IX издание Определителя 27 бактерий Берги (1984—1987). Крупнейшими таксономическими группами в ней стали 4 отдела: Gracilicutes (грамотрицательные), Firmicutes (грамположительные), Tenericutes (микоплазмы; отдел с единственным классом Mollicutes) и Mendosicutes (археи). В последнее время всё большее развитие получает филогенетическая классификация бактерий, основанная на данных молекулярной биологии. Филогенетическая классификация отчасти повторяет фенотипическую, так, группа Gracilicutes присутствует и в той и в другой. В то же время систематика грамотрицательных бактерий была полностью пересмотрена, архебактерии и вовсе выделены в самостоятельный таксон высшего ранга, часть таксономических групп разбита на части и перегруппирована, в одни группы объединены организмы с совершенно разными экологическими функциями, что вызывает ряд неудобств и недовольство части научного сообщества. Объектом нареканий становится и то, что проводится фактически классификация молекул, а не организмов. В настоящее время для систематики микроорганизмов используется ряд таксономических систем. 1. Нумерическая таксономия. Признает равноценность всех признаков. Для ее применения необходимо иметь информацию о многих десятках признаков. Видовая принадлежность устанавливается по числу совпадающих признаков. 2. Серотаксономия. Изучает антигены бактерий с помощью реакций с иммунными сыворотками. Наиболее часто применяется в медицинской бактериологии. Недостаток – бактерии не всегда cодержат видоспецифический антиген. 3. Хемотакcономия. Применяются физико-химические методы, с помощью которых исследуется липидный, аминокислотный состав микробной клетки и определенных ее компонентов. 4. Генная систематика. Основана на способности бактерий с гомологичными ДНК к трансформации, трансдукции и конъюгации, на анализе внехромосомных факторов наследственности – плазмид, транспозонов, фагов. При изучении, идентификации и классификации микроорганизмов чаще всего изучают следующие (гено- и фенотипические) характеристики: 1. Морфологические - форма, величина, особенности взаиморасположения, структура. 2. Тинкториальные- отношение к различным красителям (характер окрашивания), прежде всего к окраске по Граму. По этому признаку все микроорганизмы делят на 28 грамположительные и грамотрицательные. Морфологические свойства и отношение к окраску по Граму позволяют как правило отнести изучаемый микроорганизм к крупным таксонам- семейству, роду. 3. Культуральные - характер роста микроорганизма на питательных средах. 4. Биохимические - способность ферментировать различные субстраты (углеводы, белки и аминокислоты и др.), образовывать в процессе жизнедеятельности различные биохимические продукты за счет активности различных ферментных систем и особенностей обмена веществ. 5.Антигенные- зависят преимущественно от химического состава и строения клеточной стенки, наличия жгутиков, капсулы, распознаются по способности макроорганизма (хозяина) вырабатывать антитела и другие формы иммунного ответа, выявляются в иммунологических реакциях. 6.Физиологические- способы углеводного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) и других видов питания, тип дыхания (аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы). 7.Подвижность и типы движения. 8.Способность к спорообразованию, характер спор. 9.Чувствительность к бактериофагам, фаготипирование. 10.Химический состав клеточных стенок- основные сахара и аминокислоты, липидный и жинокислотный состав. 11.Белковый спектр (полипептидный профиль). 12.Чувствительность к антибиотикам и другим лекарственным препаратам. 13.Генотипические (использование методов геносистематики). В последние десятилетия для классификации микроорганизмов, помимо их фенотипических характеристик (см. пп.1- 12), все более широко и эффективно используются различные генетические методы (изучение генотипа- генотипических свойств). Используются все более совершенные методы- рестрикционный анализ, ДНКДНК гибридизация, ПЦР, сиквенс и др. В основе большинства методов лежит принцип определения степени гомологии генетического материала (ДНК, РНК). При этом чаще исходят из условного допущения, что степень гомологии более 60% ( для некоторых групп микроорганизмов- 80%) свидетельствует о принадлежности микроорганизмов к одному виду (различные генотипы - один геновид), 40- 60%- к одному роду. Идентификация. Основные фено- и генотипические характеристики, используемые для классификации микроорганизмов, используются и для идентификации, т.е. установления 29 их таксономического положения и прежде всего видовой принадлежности- наиболее важного аспекта микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Идентификация осуществляется на основе изучения фено- и генотипических характеристик изучаемого инфекционного агента и сравнения их с характеристиками известных видов. При этой работе часто применяют эталонные штаммы микроорганизмов, стандартные антигены и иммунные сыворотки к известным прототипным микроорганизмам. У патогенных микроорганизмов чаще изучают морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Номенклатура- название микроорганизмов в соответствии с международными правилами. Для обозначения видов бактерий используют бинарную латинскую номенклатуру род/вид, состоящую из названия рода (пишется с заглавной буквы) и вида (со строчной буквы). Примеры- Shigella flexneri, Rickettsia sibirica. Специализированные термины. Совокупность основных биологических свойств бактерий можно определить только у чистой культуры – это бактерии одного вида, выращенные на питательной среде. Культура – скопление микробных клеток, может быть чистой и смешанной (бактерии разного вида, выращенные на питательной среде). Колония (клон) – потомство одной микробной клетки. Штамм – вид микроорганизмов, выделенный из разных источников. Вопросы для контроля знаний: 1. Назвать основные таксономические единицы классификации бактерий 2. Что такое вид ? 3. Что такое штамм? 4. Понятие о вариантах, примеры 5. Что такое идентификация микроорганизмов 30 6. Понятие о морфологических свойствах 7. Понятие о бинарной номенклатуре 8. Что такое культура ? 9. Что такое чистая культура? 10. Что такое колония? Лекция №3. Морфология и ультраструктура бактерий. Особенности строения бактериальной клетки. Основные органеллы и их функции Отличия бактерий от других клеток: 1. Бактерии относятся к прокариотам, т. е. не имеют обособленного ядра. 31 2. В клеточной стенке бактерий содержится особый пептидогликан – муреин. 3. В бактериальной клетке отсутствуют аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, митохондрии. 4. Роль митохондрий выполняют мезосомы – инвагинации цитоплазматической мембраны. 5. В бактериальной клетке много рибосом. 6. У бактерий могут быть специальные органеллы движения – жгутики. 7. Размеры бактерий колеблются от 0,3–0,5 до 5—10 мкм. Микроорганизмы измеряются в микрометрах и нанометрах. Форма и размер - важный диагностический признак. Способность бактерий изменять свою форму и величину называется полиморфизм. Подавляющее большинство бактерий одноклеточны. Одноклеточные формы способны осуществлять все функции, присущие организму, независимо от соседних клеток. Многие одноклеточные прокариоты склонны к образованию клеточных агрегатов, часто скреплённых выделяемой ими слизью. Чаще всего это лишь случайное объединение По форме клеток они могут быть округлыми (кокки), палочковидными (бациллы, клостридии, псевдомонады), извитыми (вибрионы, спириллы, спирохеты), реже — звёздчатыми, тетраэдрическими, кубическими, C- или O-образными. Формой определяются такие способности бактерий, как прикрепление к поверхности, подвижность, поглощение питательных веществ. Отмечено, например, что олиготрофы, то есть бактерии, живущие при низком содержании питательных веществ в среде, стремятся увеличить отношение поверхности к объёму, например, с помощью выростов. 32 Формы бактерий Шаровидные бактерии. Шаровидные бактерии, или кокки. Форма шаровидная или овальная. По характеру расположения клеток в мазках выделяют: Микрококки – отдельно расположенные клетки. Диплококки – располагаются парами. Стрептококки – клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку. Сарцины – располагаются в виде «пакетов» из 8 и более кокков. Стафилококки – кокки, расположенные в виде грозди винограда в результате деления в разных плоскостях. 33 Палочковидные бактерии (кишечная палочка). Палочковидные бактерии Форма палочковидная, концы клетки могут быть заостренными, закругленными, обрубленными, расщепленными, расширенными. Палочки могут быть правильной и неправильной формы, в том числе ветвящиеся, например у актиномицетов. По характеру расположения клеток в мазках выделяют: Монобактерии – расположены отдельными клетками. Диплобактерии – расположены по две клетки. Стрептобактериии – после деления образуют цепочки клеток. Палочковидные бактерии могут образовывать споры: бациллы (аэробные бактерии) и клостридии (анаэробные бактерии). Извитые бактерии (холерный вибрион). Извитые бактерии Форма - изогнутое тело в один или несколько оборотов. Вибрионы – изогнутость тела не превышает одного оборота. Спирохеты – изгибы тела в один или несколько оборотов. Строение. Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и так называемым нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры. 34 Строение бактериальной клетки Клеточная стенка важный структурный элемент бактериальной клетки, однако не обязательный. Искусственным путём были получены формы с частично или полностью отсутствующей клеточной стенкой (L-формы), которые могли существовать в благоприятных условиях, однако иногда утрачивали способность к делению. Известна также группа природных не содержащих клеточной стенки бактерий — микоплазмов. Клеточная стенка выполняет следующие функции: 1) защитную - осуществление фагоцитоза; 2) регуляцию осмотического давления; 3) рецепторную; 4) принимает участие в процессах питания деления клетки; 5) антигенную (определяется продукцией эндотоксина – основного соматического антигена бактерий); 6) стабилизирует форму и размер бактерий; 7) обеспечивает систему коммуникаций с внешней средой; 8) косвенно участвует в регуляции роста и деления клетки. У бактерий существует два основных типа строения клеточной стенки, свойственных грамположительным и грамотрицательным видам. Такое название они получили после того, как в конце XIX века датский врач Ханс Кристиан Грам обнаружил, что если бактерии обработать сначала красителем кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, то 35 бесцветные в обычных условиях клетки окрашиваются. Но у одних бактерий образуется прочная фиолетовая окраска (их назвали грамположительными), а у других (грамотрицательных) краситель смывается этиловым спиртом, поэтому их докрашивают фуксином Циля и они приобретают розовую окраску. Строение клеточной стенки. А - грамположительные бактерии, Б - грамотрицательные бактерии Клеточная стенка имеет два слоя: 1) наружный – пластичный; 2) внутренний – ригидный, состоящий из муреина. Клеточная стенка грамположительных бактерий представляет собой гомогенный слой толщиной 20—80 нм, построенный в основном из пептидогликана (муреина), с меньшим количеством тейхоевых кислот и небольшим количеством полисахаридов, белков и липидов (так называемый липополисахарид). В клеточной стенке имеются поры диаметром 1—6 нм, которые делают её проницаемой для ряда молекул. У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой неплотно прилегает к ЦПМ и имеет толщину лишь 2—3 нм. Он окружён наружной мембраной, имеющей, как правило, неровную, искривлённую форму. Между ЦПМ, слоем пептидогликана и внешней 36 мембраной имеется пространство, называемое периплазматическим, и заполненное раствором, включающим в себя транспортные белки и ферменты. Клеточная стенка проницаема: через нее питательные вещества свободно проходят в клетку, а продукты обмена выходят в окружающую среду. Крупные молекулы с большим молекулярным весом не проходят через оболочку. Капсула. Клеточная стенка многих бактерий сверху окружена слоем слизистого материала — капсулой. Толщина капсулы может во много раз превосходить диаметр самой клетки, а иногда она настолько тонкая, что ее можно увидеть лишь через электронный микроскоп — микрокапсула. Капсула не является обязательной частью клетки, она образуется в зависимости от условий, в которые попадают бактерии. Она служит защитным покровом клетки и участвует в водном обмене, предохраняя клетку от высыхания. Среди бактерий различают: 1) истиннокапсульные бактерии (род Klebsiella) – сохраняют капсулообразование и при росте на питательных средах, а не только в макроорганизме; 2) ложнокапсульные – образуют капсулу только при попадании в макроорганизм . Капсулы вокруг клеток Clostridium. Увел. X 2200. Капсула играет роль антигена, может быть фактором вирулентности (патогенности). По химическому составу капсулы чаще всего представляют собой полисахариды. Иногда они состоят из гликопротеидов (сложные комплексы сахаров и белков) и полипептидов (род Bacillus), в редких 37 случаях — из клетчатки (род Acetobacter). Цитоплазма и ЦПМ. Все содержимое клетки, за исключением ядра и клеточной стенки, называется цитоплазмой. В жидкой, бесструктурной фазе цитоплазмы (матриксе) находятся рибосомы, мембранные системы, митохондрии, пластиды и другие структуры, а также запасные питательные вещества. Цитоплазма обладает чрезвычайно сложной, тонкой структурой (слоистая, гранулярная). Внешний липопротеидный слой протопласта бактерий, обладающий особыми физическими цитоплазматической и химическими мембраной свойствами, (ЦПМ). Она называется имеет обычное строение: два слоя фосфолипидов (25–40 %) и белки. ЦПМ выполняет очень важную роль — регулирует поступление веществ в клетку и выделение наружу продуктов обмена. Между плазматической мембраной и клеточной стенкой имеется связь в виде десмозов — мостиков. Через мембрану питательные вещества могут биохимического поступать процесса с в клетку участием в результате ферментов. активного Кроме того, в мембране происходит синтез некоторых составных частей клетки, в основном компонентов клеточной стенки и капсулы. Наконец, в ЦПМ находятся важнейшие ферменты (биологические катализаторы). Упорядоченное расположение ферментов на мембранах позволяет регулировать их активность и предотвращать разрушение одних ферментов другими. С мембраной связаны рибосомы — структурные частицы, на которых синтезируется белок. Мембрана состоит из липопротеидов. Она достаточно прочна и может обеспечить временное существование клетки без оболочки. ЦПМ составляет до 20% сухой массы клетки. ЦПМ и цитоплазму объединяют вместе в понятие протопласт. ЦПМ - это жидкокристаллическая структура, состоящая из билипидного слоя и белковых молекул. 38 Назначение: • Механическая защита клетки от внешней среды • Не дает цитоплазме растечься • Химическая регуляция процессов внутри кл. • Принимает активное участие в питании, дыхании, выделении • Антигенная функция Гомогенная фракция цитоплазмы, содержащая набор растворимых РНК, белков, продуктов и субстратов метаболических реакций, названа цитозолем. Другая часть цитоплазмы представлена различными структурными элементами. Одним из основных отличий клетки бактерий от клетки эукариот является отсутствие ядерной мембраны и, строго говоря, отсутствие вообще внутрицитоплазматических мембран, не являющихся производными ЦПМ. Однако у разных групп прокариот (особенно часто у грамположительных впячивания ЦПМ — бактерий) мезосомы, имеются выполняющие локальные в клетке разнообразные функции и разделяющие её на функционально различные части. 39 Одни из этих структур — аналоги митохондрий. Другие выполняют функции эндоплазматической сети или аппарата Гольджи. Путем инвагинации цитоплазматической мембраны образуется также фотосинтезирующий аппарат бактерий. Рибосомы являются центрами синтеза белка в клетке. При этом они часто соединяются между собой, образуя агрегаты, называемые полирибосомами или полисомами. Рибосомы представляют собой рибонуклеопротеиновые частицы размером 20 нм, состоящие из двух субъединиц – 30 S и 50 S. Перед началом синтеза белка происходит агрегация -объединение этих субъединиц в одну – 70 S. В отличие от клеток эукариотов рибосомы бактерий не объединены в эндоплазматическую сеть. 40 Включения. В цитоплазме клеток бактерий часто содержатся гранулы различной формы и размеров. Однако их присутствие нельзя рассматривать как какой-то постоянный признак микроорганизма, обычно оно в значительной степени связано с физическими и химическими условиями среды. Многие цитоплазматические включения состоят из углерода. соединений, Эти снабжается запасные достаточным которые служат вещества источником образуются, количеством энергии когда питательных и организм веществ, и, наоборот, используются, когда организм попадает в условия, менее благоприятные в отношении питания. У многих бактерий гранулы состоят из крахмала или других полисахаридов — гликогена и гранулезы. У некоторых бактерий при выращивании на богатой сахарами среде внутри клетки встречаются капельки жира. Другим широко распространенным типом гранулярных включений является волютин (метахроматиновые гранулы).. 41 Эти гранулы состоят из полиметафосфата (запасное вещество, включающее остатки фосфорной кислоты). Полиметафосфат служит источником фосфатных групп и энергии для организма Бактерии чаще накапливают волютин в необычных условиях питания. Ядерный аппарат. В центральной части клетки локализовано ядерное вещество — дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). У бактерий нет такого ядра, как у высших организмов (эукариотов), а есть его аналог — «ядерный эквивалент» — нуклеоид, который является эволюционно более примитивной формой организации ядерного вещества. Нуклеоид – ядерное вещество, распыленное в цитоплазме клетки. Не имеет ядерной мембраны, ядрышек. В нем локализуется ДНК, представленная двухцепочечной спиралью. Обычно, замкнута в кольцо и прикреплена к цитоплазматической мембране. Содержит около 60 млн. пар оснований. Это чистая ДНК, она не cодержит белков гистонов. Их защитную функцию выполняют метилированные азотистые основания. В нуклеоиде закодирована основная генетическая информация, т. е. геном клетки. Наряду с нуклеоидом в цитоплазме могут находиться автономные кольцевые молекулы ДНК с меньшей молекулярной массой – плазмиды. В них также закодирована наследственная информация, но она не является жизненно необходимой для бактериальной клетки. Жгутики. На поверхности некоторых бактерий имеются придаточные структуры; наиболее широко распространенными из них являются жгутики — органы движения бактерий. Есть у подвижных бактерий. Это особые белковые выросты на поверхности бактериальной клетки, содержащие белок – флагелин. Жгутики связаны с бактериальным телом при помощи двух дисков: наружный находится в клеточной стенке, а внутренний – ЦПМ. В результате их энергичного движения, напоминающего штопор или греблю, жидкость движется вдоль жгутиков и бактерий, развивается скорость до 50 мкм/с. 42 Строение бактериального жгутика на примере бактерии Esherichia Coli Количество и расположение жгутиков может быть различным. Различают: 1) монотрихи (имеют один жгутик); А 2) лофотрихи (имеют пучок жгутиков на одном конце клетки); В 3) амфитрихи (имеют по одному жгутику на каждом конце); С 4) перитрихи (имеют несколько жгутиков, расположенных по периметру). Д Типы расположения жгутиков: A- Монотрихи; B-Лофотрихи; C-Амфитрихи; D-Перитрихи. Помимо жгутиков, поверхность многих бактерий покрыта цитоплазматическими выростами — микроворсинками. Обычно это волоски (числом от 10 до нескольких тысяч) толщиной 3-25 нм и длиной до 12 мкм. Микроворсинки встречают как у подвижных, так и у неподвижных бактерий. Эти выросты способствуют увеличению площади поверхности бактериальной клетки, что дает ей дополнительные преимущества в утилизации питательных веществ из окружающей среды. Известны специализированные микроворсинки — фимбрии и пили. 43 Фимбрии бактерий [от лат. fimbria, бахрома]. Многие грамотрицательные бактерии имеют длинные и тонкие микроворсинки, пронизывающие клеточную стенку. Образующие их белки формируют спиралевидную нить. Основная функция фимбрии — прикрепление бактерий к субстратам (например, к поверхности слизистых оболочек), что делает их важным фактором колонизации и патогенности. F-пили бактерий [от англ. fertility, плодовитость, + лат. pilus, волосок], или «секс-пили», — жёсткие цилиндрические образования, участвующие в конъюгации бактерий. Пили впервые обнаружены у Escherichia coli K12, то есть у штаммов, содержащих F-фактор Обычно клетка снабжена 1-2 пилями, имеющими вид полых белковых трубочек длиной 0,5-10 мкм; нередко они имеют шаровидное утолщение на конце. Большинство Fпилей образует специфический белок — пилин. Образование пилей кодируют плазмиды. Их идентифицируют с помощью донорспецифических бактериофагов, адсорбирующихся на пилях и лизирующих клетки. 44 F-пили обеспечивают контакт между бактериальными клетками в процессе конъюгации. Через них идет обмен генетической информацией от донора к реципиенту. Донор– обладает F-пили. Реципиент – не имеет F-пили. Электронномикроско пическое изображение конъюгации у кишечной палочки; удлинённая клетка — донор, круглая — реципиент. Споры и спорообразование. Споры – это особые формы существования некоторых бактерий при неблагоприятных условиях внешней среды. Споры бактерий - своеобразная форма покоящихся бактерий, форма сохранения наследственной информации в неблагоприятных условиях внешней среды и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразование присуще грамположительным бактериям. В отличие от вегетативных форм 45 споры более устойчивы к действию химических, термических факторов. Чаще всего споры образуют бактерии рода Bacillus и Clostridium. Бациллы являются аэробами или факультативными анаэробами. Крупные и среднего размера прямые или слабоизогнутые палочки, способные к образованию устойчивых к неблагоприятным воздействиям эндоспор (экстремальным температурам, высушиванию, ионизирующим излучениям, химическим агентам). Диаметр споры, как правило, не превышают поперечник палочки. Не надо путать с термином, характеризующим форму микроорганизма - бации лла (палочка) (лат. bacilli, ед. ч. bacillum илиbacillus — «палочка») — палочковидная бактерия. Клостридии (лат. Clostridium) — род грамположительных, облигатно анаэробных бактерий, способных продуцировать эндоспоры. Отдельные клетки — удлинённые палочки, название рода происходит от греческого κλοςτεδ (веретено). Многие виды, которые были отнесены к клостридиям по этому морфологическому признаку, позже были реклассифицированы. Эндоспоры могут располагаться центрально, эксцентрально и терминально. Диаметр эндоспор часто превышают диаметр клетки. У грамотрицательных бактерий также обнаружена способность 46 сохраняться в неблагоприятных условиях в виде некультивируемых форм. При этом нет типичного спорообразования, но в таких клетках замедлены метаболические процессы, невозможно сразу получить рост на питательной среде. Но при попадании в макроорганизм они превращаются в исходные формы. Рис. 23 Расположение спор. Процесс спорообразования заключается в утолщении всех оболочек клетки. Они становятся плотными, клетка теряет воду, замедляются все образования споры: прекращением ее пластические процессы. Подготовительная деления и увеличением Выделяют стадия стадии сопровождается количества липидных включений. Стадия предспоры обычно начинается бурно. В клетке появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с изменёнными плотностью и тинкториальными свойствами. Подобное образование обозначают терминами «предспора, проспора». Третья стадия включает появление оболочки (обычно в течение 10 мин после образования предспоры) и ещё большее увеличение коэффициента светопреломления. Стадия созревания споры сопровождается её уплотнением и снижением метаболической Образуются споры в течение 18-20 часов. активности клетки. При попадании споры в благоприятные условия она прорастает в вегетативную форму. В благоприятных условиях споры прорастают за 4-5 часов. 47 Рис. 24. Цикл развития спорообразующих бактерий: в— деление вегетативных клеток; 1-7 стадии спорообразования: 1 — образование осевого хроматинового тяжа; 2— образование споровой перегородки (септы); 3— «поглощение» протопластом материнской клетки септированного участка цитоплазмы с ядром; 4 — формирование кортекса; 5 — начало формирования оболочки споры; 6 — завершение образования оболочки и созревание споры; 7— лизис материнской клетки и освобождение спор; с — свободная зрелая спора; п — прорастание споры. Темные извитые нити — ДНК, красным цветом обозначены мембраны вегетативной клетки и споры, голубым — цитоплазма, желтым — клеточная стенка, синим — оболочка споры. Вопросы для контроля знаний: 1. Строение прокариотической клетки 2. Основные отличия эукариот и прокариот 3. Строение клеточной стенки; отличие в строении клеточной стенки (кл.ст.) Гр+ и Гр- м.о. Понятие о тинкториальных свойствах. Назначение кл. ст. 4. Цитоплазматическая мембрана: строение, назначение. Мезосомы 5. Нуклеоид; особенности строения, назначение. 48 6. Рибосомы; назначение 7. Реснички; виды ресничек, понятие о фимбриях и пилях. Что такое адгезия? Что такое конъюгация? 8. Жгутики; назначение, классификация м.о. по расположению жгутиков. 9. Капсула: классификация, назначение 10. Споры: назначение, классификация. Понятие о бациллах и клостридиях; отличия Лекция № 4 Морфология грибов, спирохет, простейших, риккетсий, микоплазм, вирусов. Спирохеты Форма Спирохеты (spira - виток, chaite - волосы) представляют собой тонкие спирально извитые нити, изогнутые вокруг центральной оси, которая, по-видимому, является пучком слившихся фибрилл. Они относятся к порядку Spirochaetales. Спирохеты имеют штопорообразную извитую форму. Они отличаются друг от друга характером и числом завитков, длиной клеток, а также другими морфологическими и физиологическими признаками. Спирохеты чрезвычайно полиморфны. 49 Структура Бледная трепонема. Электронная микроскопия. Ультратонкий срез. Увеличение 131000. ч - чехол; б блефаропласт; ф - фибрилы; Патогенные виды относятся к трем родам: Treponema, Borrelia, Leptospira, отличающимся друг от друга структурными особенностями, количеством завитков, типом движения и другими признаками. В структурном отношении клетки спирохет представляют собой цитоплазматические цилиндры, отграниченные цитоплазматической мембраной (ЦМ) от тонкой и эластичной клеточной стенки (КС), которая состоит из наружной мембраны и пептидогликанового слоя. Между ЦМ и цитоплазматическим цилиндром спирохет расположены фибриллы, состоящие, так же как и жгутики бактерий, из белка флагеллина. У трепонем и боррелий имеется два пучка фибрилл, прикрепленных к дисковидным образованиям - блефаропластам, расположенным на обоих концах цилиндра и направленных навстречу друг другу. У лептоспир единичные фибриллы прикреплены на концах клетки к блефаропластам. Фибриллы обеспечивают разные типы движения спирохет: поступательное, вращательное и сгибательное. В процессе движения спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые получили название вторичных завитков. Окраска Спирохеты, особенно трепонемы, в отличие от других бактерий плохо воспринимают анилиновые красители. Их, так же как простейших, окрашивают краской Романовского – Гимза или серебрением. Все спирохеты - грамотрицательные микроорганизмы. Однако лучше всего наблюдать спирохеты в живом виде при фазовоконтрастной микроскопии или в темном поле. 50 Патогенность Патогенными для людей являются немногие. Различные виды - анаэробы, факультативные анаэробы и аэробы. Большая часть спирохет - свободно живущие микроорганизмы, обитают как сапрофиты и в организме человека. Патогенные для человека спирохеты являются представителями трех родов семейства Spirochaetaceae: В род Treponema входят мелкие тонкие спирохеты с неглубокими завитками (в количестве 8—12). Эти спирохеты очень подвижны (возбудитель сифилиса Т. pallidum, возбудитель фрамбезии - Т. раllidum subsp. tenue, возбудитель пинты-Т. carateum); Borrelia (возбудитель эпидемического возвратного тифа - В. recurrentis, возбудители клещевого возвратного тифа - В. persica, В. hispanisa и др.) Спирохеты этого рода длиннее, имеют 3—8 крупных завитков с большей амплитудой. Среди спирохет рода Leptospira (от leptos — малый, spiera — завиток) около 40 патогенных видов и большое количество сапрофитических форм, живущих в пресных водоемах. Лептоспиры имеют длину до 4—8 мкм и своеобразную структуру: завитки очень неглубокие и частые (напоминают под микроскопом веревку), концы изогнуты в виде крючков и имеют пуговчатые утолщения. Образуя вторичные завитки при движении, лептоспиры приобретают вид букв S или С. L. interrogans вызывают у человека инфекционную желтуху. Род Leptospira семейства Leptospiraceae (возбудитель лептоспироза - L. interrogans). Морфология риккетсий. Риккетсии находятся в составе класса Rickеttsias и относятся к прокариотам. Они являются облигатными внутриклеточными паразитами, поражая членистоногих, птиц, животных, человека. Их не удается культивировать па искусственных питательных средах. Риккетсии размножаются в живых клетках, лучше всего в желточном мешке куриного эмбриона (метод Кокса). Риккетсии названы в честь американского исследователя Г. Риккетса, описавшего первого возбудителя заболевания, известного под названием пятнистой лихорадки Скалистых гор. Это своеобразные микроорганизмы, имеющие черты сходства с бактериями: задерживаются на бактериальных фильтрах, имеют клеточную стенку, 51 содержащую мурамовую кислоту, нуклеотид, рибосомы, окрашиваются по Граму, Романовскому — Гимзе, Здродовскому или серебрением (по Морозову), размножаются так же, как бактерии, — поперечным делением, но этот процесс может происходить только внутри клеток. Жизненный цикл риккетсий зависит от жизнедеятельности клеткихозяина и складывается из двух стадий: вегетативной и покоящейся (элементарные тельца). Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии (рис. 4) активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной жгутиковыми подвижностью, структурами. по-видимому, Риккетсии обусловленной покоящейся стадии (элементарные тельца) имеют сферическую форму и они не активны. Порядок Rickettsiales включает виды патогенные для теплокровных животных и человека, переносчиками служат вши, блохи, клещи. Заболевания называются риккетсиозами. Большинство болезнетворных для человека видов риккетсий входит в состав семейства Rickettsiaceae , роды Rickettsia , Rochalimaea , Coxiella , вызывая эпидемический сыпной тиф ( Rickettsia prowazekii ), Ку-лихорадку ( Coxiella burnetti ), волынскую лихорадку ( Rochalimaea guintana ), лихорадку цуцугамуши ( Rickettsia tsutsugamushi ) и другие. Паразитирующие виды ассоциированы с ретикулоэндотелиальными клетками и клетками эндотелия сосудов или эритроцитами. Морфология грибов. Грибы – многоклеточные или одноклеточные гетеротрофные 52 эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой. Рост и строение грибов. Выделяют два типа роста грибов – дрожжевой и мицелиальный (гифальный). Дрожжевые грибы (дрожжи) имеют вид овальных клеток. Дрожжеподобный гриб рода Candida образует псевдомицелий (фиолетовые клетки). У большинства клеток грибов имеется клеточная стенка, отсутствует она лишь у зооспор и вегетативных клеток некоторых примитивных грибов. На 80—90 % она состоит из азотистых и безазотистых полисахаридов, у большинства основным полисахаридом является хитин, только у оомицетов — целлюлоза. Вегетативное тело подавляющего большинства видов грибов (гифальные (плесневые) грибы) — это мицелий, или грибница, состоящая из тонких бесцветных (иногда слегка окрашенных) нитей, или гиф, с неограниченным ростом и боковым ветвлением. Гифы низших грибов клеточных перегородок не имеют. Гифы высших грибов перегородки имеют. Гифы растут апикально и обильно ветвятся. Грибница обычно имеет большую общую поверхность, так как через неё осмотическим путём всасывается пища.. Мицелий обычно дифференцируется на две функционально различные части: субстратный, служащий для прикрепления к субстрату, поглощения и транспортировки воды и растворенных в ней веществ, и воздушный, поднимающийся над субстратом и образующий органы размножения. В процессе приспособления к различным условиям 53 обитания у грибов возникают многочисленные видоизменения мицелия, одно из них гаустории, характерные для грибов-паразитов, представляют собой специальные выросты мицелия, проникающие в клетки хозяина и поглощающие из них питательные вещества. Строение гриба рода а) Aspergillus, б) Penicillium (рисунок). Высшие грибы рода Penicillium (фото). Питание грибов. Все грибы являются гетеротрофными организмами. Минеральные вещества гриб способен усваивать из окружающей среды, однако органические он должен получать в готовом виде Грибы не способны усваивать крупные частички пищи, поэтому всасывают исключительно жидкие вещества через всю поверхность тела, при этом огромная площадь поверхности мицелия оказывается весьма выгодной. 54 Высшие грибы рода Aspergillus (фото). По способу питания различают две основные группы грибов: сапротрофы и симбионты. Для последних характерен паразитизм и мутуализм. К сапротрофам относится большинство шляпочных и плесневых грибов, а также дрожжи. Обширная система ветвящихся гиф позволяет им тесно контактировать с субстратом. Почти все клетки мицелия отделены от субстрата лишь тонкой клеточной стенкой. Пищеварительные ферменты, выделяемые грибами в окружающую среду, очень быстро воздействуют на материал субстрата и способствуют его частичному перевариванию вне грибной клетки. Такой полупереваренный материал затем всасывается всей поверхностью клетки. Это называется внешнее пищеварение. Размножение грибов. У большинства грибов выделяют половой и бесполый типы размножения. Совершенные грибы – размножаются половым и бесполым путем. Несовершенные грибы – размножаются только бесполым путем. В отличие от довольно однообразного вегетативного строения формы полового размножения очень разнообразны (на них основана классификация царства). Характерен плеоморфизм — наличие одновременно нескольких видов спороношений, например, бесполого и полового. 55 Несовершенные грибы рода Microsporum. Несовершенные грибы рода Trichophyton. Инфекционными агентами грибов считаются споры и конидии. Заболевания, вызванные грибами, обозначают термином микозы. Классификация грибов. Грибы отнесены к царству Fungi (Mycota), подразделяемому на отделы Myxomycota (грибы-слизевики) и Eumycota (истинные грибы), которые включают 7 классов: Хитридиомицеты (Chytridiomycetes) Гифохитридиомицеты (Hyphochytridiomycetes) Оомицеты (Oomycetes) Зигомицеты (Zygomycetes) Аскомицеты (Ascomycetes) Базидиомицеты (Basidiomycetes) Дейтеромицеты (Deuteromycetes) Один из основных методов выявления возбудителей микозов - 56 микроскопия позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах. Идентификацию возбудителя проводят по морфологическим и биохимическим признакам. Плесневые грибы развиваются сапротрофно в почве, на увлажненных продуктах, плодах и овощах, на животных и растительных остатках, образуя пушистые или паутинистые налеты (плесень) серого, зеленого, черного, сизого цвета. Плесневые грибы встречаются среди зигомицетов (например, мукор), сумчатых и несовершенных грибов. Среди плесневых грибов бывают и паразитические виды, которые вызывают болезни человека и животных (аспергиллез, бластомикоз, пневмомикоз) и растений (альтернариоз, фузариоз и др.). Известным представителем плесневых грибов является пеницилл. Его мицелий состоит из разветвленных нитей, разделенных перегородками на клетки, а спороношение напоминает кисть, отсюда и его название «кистевик». На концах разветвленных конидиеносцев образуются цепочки конидий, с помощью которых пеницилл размножается. Этот гриб встречается в виде плесени (зеленого, сизого, голубого цвета) на почве и продуктах растительного происхождения (на плодах, овощах, варенье, томатной пасте и др.). Некоторые виды пеницилла используются для приготовления пенициллина— одного из наиболее известных антибиотиков. Плесневые грибы: 1 — мукор; 2 — пеницилл; 3 — аспергилл. Дрожжи не имеют мицелия и представляют собой неподвижные клетки овальной формы размером 2—10 мкм. Размножаются дрожжи почкованием или делением. У них наблюдается и половой процесс, протекающий в виде копуляции двух клеток. Образовавшаяся при этом зигота превращается в сумку с 4-8 спорами. Предполагают, что дрожжи произошли от многоклеточных предков. Упрощение их организации произошло в связи с обитанием в жидких сахаристых средах. Наибольшее практическое значение имеют пекарские дрожжи, представленные несколькими сотнями рас — винными, пивными, хлебопекарными и др. Они применяются в пивоварении, хлебопечении, производстве спирта. Винные дрожжи встречаются в природе на поверхности плодов 57 (например, винограда), в нектаре цветков, в истечениях деревьев и используются в виноделии. Лекция 5. Морфология вирусов. Вирусы бактерий - бактериофаги Вирусы человека, животных, растений, насекомых и бактерий (фаги) выделены в царство Vira. Они отличаются от других микроорганизмов своей ультраструктурной организацией и наличием только одного типа нуклеиновой кислоты—РНК или ДНК. Вирусы не воспроизводятся самостоятельно, они — облигатные внутриклеточные паразиты, репродуцирующиеся только в живых клетках. Все вирусы существуют в двух формах. Внеклеточная форма — вирион — включает в себя все составные элементы (капсид, нуклеиновую кислоту, структурные белки, ферменты и др.). Внутриклеточная форма — вирус — может быть представлена лишь одной молекулой нуклеиновой кислоты, так как, попадая в клетку, вирион распадается на составные элементы. Размеры вирионов колеблются от 15—20 до 300—500 нм. Они имеют палочковидную или цилиндрическую форму (вирус табачной мозаики), нитевидную форму в виде изгибающихся тонких нитей шириной около 10 нм и длиной до 500 нм и более (вирусы растений и некоторые фаги), сферическую форму, напоминающую многогранники (пикорнавирусы, аденовирусы), форму параллелепипеда (поксвирусы) и булавовидную или сперматозоидную форму (вирусы бактерий—фаги). При всём разнообразии конфигураций, размеров и функциональных характеристик вирусам присущи некоторые общие признаки. В общем виде зрелая вирусная частица (вирион) состоит из нуклеиновой кислоты, белков и липидов, либо в его состав входят только нуклеиновые кислоты и белки. Простейшие вирионы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки—капсида, который плотно ее окружает. В морфологическом отношении их характеризуют как нуклеокапсиды, а в химическом — как 58 нуклеопротеиды. Основные функции капсида — зашита вирусного генома от внешних воздействий, обеспечение адсорбции вириона к клетке, проникновение его в клетку путём взаимодействия клеточными рецепторами. Нуклеиновые кислоты вирусов Вирусы содержат только один тип нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, но не оба типа одновременно. Например, вирусы оспы, простого герпеса, Эпстайна-Барр — ДНК-содержащие, а тогавирусы, пикорнавирусы — РНКсодержащие. Геном вирусной частицы гаплоидный. Наиболее простой вирусный геном кодирует 3-4 белка, наиболее сложный — более 50 полипептидов. ДНК может быть: 1) двухцепочечной; 2) одноцепочечной; 3) кольцевой; 4) двухцепочечной, но с одной более короткой цепью; 5) двухцепочечной, но с одной непрерывной, а с другой фрагментированной цепями. РНК может быть: 1) однонитевой; 2) линейной двухнитевой; 3) линейной фрагментированной; 4) кольцевой; 5) содержащей две одинаковые однонитевые РНК. Капсид представлен белковой оболочкой, состоящей из повторяющихся субъединиц капсомеров, организованных в один или два слоя по двум типам симметрии — кубическому или спиральному. Некоторые бактериофаги (вирусы бактерий) имеют двойную симметрию: головка организована по принципу кубической симметрии, отросток — по принципу спиральной симметрии. Отсутствие постоянной симметрии. Для вирусов больших размеров (например, для поксвирусов) характерно отсутствие постоянной симметрии. Симметричность капсида связана с тем, что для упаковки генома требуется большое количество капсомеров, а компактное их соединение возможно лишь при условии симметричного расположения субъединиц. Формирование капсида напоминает процесс кристаллизации и протекает по принципу самосборки. Число с 59 капсомеров строго специфично для каждого вида и зависит от размеров и морфологии вирионов. Капсомеры (морфологические единицы вирусов) образуют молекулы белка— протомеры (структурные единицы). Протомеры могут быть мономерными (содержать один полипептид) либо полимерными (включать несколько полипептидов). Комплекс капсида и вирусного генома называют нуклеокапсидом. Он повторяет симметрию капсида, то есть обладает спиральной либо кубической симметрией соответственно. Сложно устроенные вирионы могут содержать поверх капсида особую оболочку — суперкапсид, организованный двойным слоем липидов и специфичными вирусными белками, наиболее часто образующими выросты-шипы, пронизывающие липидный бислой. Такие вирусы называют «одетыми». Вирусы не имеющие капсида называют «голыми». Образование суперкапсида происходит на поздних этапах репродуктивного цикла, обычно при отпочковывании дочерних популяций. Основные типы симметрии вирусов. А — «голый», кубическая симметрия. Б— «одетый», кубическая симметрия. В — «голый», спиральная симметрия. Г — «одетый», спиральная симметрия. 60 Репродукция вирусов. Вирусы не способны к самостоятельному размножению. Синтез вирусных белков и воспроизведение копий вирусного генома — необходимые условия для появления дочерней популяции — обеспечивают биосинтетические процессы клеткихозяина. При этом белковые макромолекулы и нуклеиновые кислоты образуются отдельно, после чего происходит сборка дочерних популяций. Другими словами, для вирусов характерен дизъюнктивный (разобщённый) тип репродукции, осуществляемый при взаимодействии вируса с инфицируемой клеткой. Реализация репродуктивного цикла в существенной степени зависит от типа инфицирования клетки и характера взаимодействия вируса с чувствительной (могущей быть инфицированной) клеткой. Существует четыре типа взаимодействия вирусов с клеткой хозяина: 1) продуктивная вирусная инфекция (происходит репродукция вируса, а клетки погибают); 2) абортивная вирусная инфекция (репродукции вируса не происходит, а клетка восстанавливает нарушенную функцию); 3) латентная вирусная инфекция (идет репродукция вируса, а клетка сохраняет свою функциональную активность); 4) вирус-индуцированная трансформация (клетка, инфицированная вирусом, приобретает новые, свойства). Основные этапы взаимодействие). репродукции вирусов ( продуктивное 61 Первая стадия репродуктивного цикла — адсорбция вириона на поверхности инфицируемой клетки. Адсорбция происходит путём взаимодействия вириона со специфическими клеточными рецепторами. За распознавание рецепторов ответственны белки, входящие в состав капсида либо суперкапсида. Таким образом, понятие «тропизм вирусов» объясняется специфическим взаимодействием вирусных белков с поверхностными рецепторами инфицируемой клетки. Процесс адсорбции не зависит от температуры (то есть не требует энергетических затрат) и протекает в две фазы; фаза ионного притяжения обусловлена неспецифическим взаимодействием, фаза прикрепления происходит благодаря структурной гомологии либо комплементарности взаимодействующих молекул. Вторая стадия. «Голые» вирусы проникают в клетку путём эндоцитоза — погружения участка клеточной мембраны в месте их адсорбции. Иначе этот процесс известен как виропексис . «Одетые» вирусы проникают в клетку путём слияния суперкапсида с клеточной мембраной при участии специфических F-белков (белков слияния). При проникновении «голых» вирусов в клетку образуются вакуоли (эндосомы). После проникновения «одетых» вирусов в цитоплазму происходит частичная депротеинизация вирионов и модификация их нуклеопротеида (раздевание). Третья фаза. После депротеинизации вирусы невозможно выделить из культуры клеток. Этот этап репродукции известен как теневая фаза, или фаза эклипса. Она включает репликацию нуклеиновых кислот вируса и синтез вирусных белков. Теневая фаза заканчивается после образования составных компонентов вируса, необходимых для сборки дочерних популяций. Четвёртая фаза. Образование дочерних вирусных частиц в заражённой клетке подразумевает необходимость трёх процессов: 1) экспрессия генетического материала в виде его транскрипции и последующей трансляции, что приводит к появлению вирусных белков; 2) синтез генетического материала вируса (репликация); 3) сборка из генетического материала и вирусных белков дочерних популяций. Пятая фаза. Высвобождение дочерних вирионов — конечная стадия репродуктивного цикла. Вирусы, лишённые суперкапсида, и поксвирусы обычно высвобождаются быстро; выход дочерних популяций сопровождается разрушением цитоплазматической мембраны 62 (ЦПМ) и лизисом клетки. Вирусы, содержащие суперкапсид, высвобождаются медленнее. Модифицированные участки мембраны с заключёнными в них вирионами выпячиваются наружу и затем отпочковываются. При высвобождении почкованием изменённая клетка иногда может сохранять жизнеспособность. Вирусы бактерий. Бактериофаги. Бактериофаги [от бактерии, + греч. phagein, поедать] — группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. История открытия и изучения фагов. В 1898 г. Н.Ф. Гамалея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов. 1915 г. Ф. Туорт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исчезали и что агент лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность растворять свежие культуры этих микроорганизмов. Явление лизиса было описано, но природа не изучена. В 1917 г. канадский учёный д,Эрелль, изучая фильтраты испражнений больного дизентерией, которые он вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя, заметил что при последовательных посевах после инкубации их в термостате лизирующая способность фильтрата возрастает до полного растворения дизентерий ной культуры ( это совпало с началом выздоровления больного). Из этого учёный сделал вывод, что растворяет её живой агент, проходящий через бактериальный фильтр, т.е. вирус. Открытый вирус д,Эрелль назвал бакрериофагом, а явление – бактериофагией. Вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Размножение и выход дочерних популяций вируса из бактерии сопровождается её гибелью и разрушением (лизисом). Бактериофаги устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Большинство из них без вреда переносит высокие температуры (50-70 °С), действие дезинфектантов (за исключением кислот и формалина), прямой солнечный свет и УФоблучение в низких дозах. Бактериофаги проявляют иммуногенные свойства, вызывая синтез специфических антител. Бактериофаги широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще. В основу классификации положены антигенная структура, морфология фагов, 63 спектр действия, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНКсодержащим вирусам с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. Именуют фаги обычно по названию клкетки-хозяина (дизентерийный, стрептококковый и т.д.), по группе хозяина фаги могут и классифицироваться. Фаги обладают строгой специфичностью. По спектру действия (по специфичности) выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные (видовая специфичность) фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки. Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании которых выделяют пять основных типов бактериофагов. • К типу I бактериофагов относят ДНК-содержащие нитевидные фаги, лизирующие бактерии, содержащие F-плазмиды. • Фаги типа II представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК. • Бактериофаги типа III имеют короткий хвост. • К типу IV относят фаги с несокращающимся хвостом и двухнитевой ДНК . • Фаги типа V имеют ДНК-геном, сокращающийся чехол хвоста, который заканчивается базальной пластиной. 64 Рис.5 Строение бактериофага. 1 - Головка, 2 - хвостик, 3 - ДНК, 4 - капсид, 5 - воротник, 6 - чехол, 7 - хвостовые фибриллы, 8 - шипы, 9 - базальная пластинка. Головка Т-фагов ( бактериофагов ) образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин). Хвост Т-фагов ( бактериофагов ) может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает поль - стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120-140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са2+. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами, шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов окончания фибрилл опущены вниз, а у нечётных — загнуты вверх. У некоторых Т-фагов ( бактериофагов ) в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин). Взаимодействие бактериофагов с клеткой специфично, так как они, как правило, инфицируют бактерии только определённого вида. Подобно вирусам животных, репродуктивный цикл литических бактериофагов включает адсорбцию свободного фага на клетке, инъекцию ДНК, репродукцию фага, выход дочерних 65 популяций. Прикрепление фага к бактерии (адсорбция) происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов (в липополисахаридном слое, в наружной мембране). На бактериях без клеточной стенки (протопласты, L-формы) бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений. При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200-300 вирусных частиц. После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са2+, активизирующие 66 АТФазу, что вызывает сокращение чехла и вталкивание стержня хвоста через ЦПМ в клетку. Затем вирусная ДНК впрыскивается в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). Поскольку диаметр канала лишь немного превышает диаметр молекулы ДНК (около 20 нм), то ДНК способна попадать в цитоплазму только в форме нити. Проникнув в клетку, ДНК фага «исчезает»; уже через несколько минут обнаружить вирус не удаётся. В этот, так называемый скрытый период (эклипс) вирус берёт на себя генетическое управление клеткой, осуществляя полный цикл репродукции фага. К его окончанию составляющие фага соединяются в зрелый вирион. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНК-полимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилат синтетаза. Они появляются в клетке через 5-7 мин после её заражения. Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНК-полимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНК-полимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения. Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот. 67 Репликация нуклеиновых кислот реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК-полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот. Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Другой пул содержит ДНК потомства. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНКсодержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает около 40 мин. После образования потомства клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Такой лизис бактериальной клетки называется лизисом изнутри (внутренний), но может быть и лизис извне (наружный) – происходит, когда на клетку адсорбируется сразу очень много бактериофагов, они проделывают многочисленные отверстия в клеточной стенке, через которые содержимое бактериальной клетки вытекает и она гибнет. В этом случае бактериофаг не размножается. Если фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в окружающую среду большого количества фаговых частиц, спрособных поражать новые клетки, то такие фаги называют вирулентными. В некоторых случаях вирулентных свойств фага оказывается недостаточно для разрушения бактерии. Подобные вирусы — умеренные фаги — претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. При этом процессе ДНК вируса не вызывает образования вирусспецифических белков и нуклеиновых кислот, но включается в бактериальную хромосому. С практической точки зрения бактерия приобретает новый набор генов (встроенного вируса), а также становится «иммунной» к повторному заражению (интерференция вирусов). Подобный феномен известен как лизогения, а популяции бактерий — как лизогенные культуры. ДНК умеренного вируса реплицирует синхронно с размножением лизогенной бактерии, а иногда фаг начинает спонтанно размножаться, а клетка подвергается лизису. Некоторые умеренные фаги не способны образовывать дочерние популяции, то есть являются дефектными вирусами. Дефектные фаги используют как векторы в генной инженерии. Вирусная ДНК может длительно сохраняться в бактериальном потомстве. Такие латентные бактериофаги известны как провирусы, или профаги. 68 Пути развития умеренного фага. • Сохранение способности к инфицированию у умеренного фага зависит от низкомолекулярного белкового репрессора, кодируемого вирусной ДНК и «выключающего» все вирулентны функции бактериофага. • Переход умеренного фага на литический цикл развития происходит при нарушениях синтеза белкового репрессора. При этом встроенный в геном бактерии вирус проявляет все свои вирулентные свойства, репродуцируется и лизирует клетки, а также может инфицировать другие бактерии. Переход умеренного бактериофага в литический цикл можно вызвать воздействием на бактерии ряда факторов. Например, если лизогенные культуры подвергнуть УФ-облученик действию или создать в среде избыток некоторых питательных веществ и витаминов, так происходит немедленная стимуляция вирулентных свойств фага — индукция фага. Ассоциация фаговой ДНК с геномом бактерии способна качественно изменять свойства бактериальной клетки. Иными словами лизогенная бактерия будет вирулентной, тогда как её нелизогенный двойник останется безвредным. У других бактерий присутствие профага вызывает изменение морфологии или антигенных свойств. Такое изменение генетических свойств, вызванное вирусной ДНК, обозначают терми нами «инфекционная наследственность» или «лизогенная (фаговая) конверсия». При лизогении происходит изменение наследственных свойств не только бактериальной клетки, но и фага; размножаясь в клетке, он способен захватывать некоторые гены бактерии и, инфицируя другую клетку, передаёт приобретённые гены новому хозяину. Подобная передача (трансдукция) во многом аналогична генетической рекомбинации у высших растений и животных. 69 Практическое применение фагов. 1. Фаготерапия – лечение с помощью препаратов содержащих фаги возбудителя заболевания. 2. Фагодиагностика – постановка диагноза осуществляется с помощью выделения от больного фага и определение его вида. 3. Фаготипирование – определение вида микроорганизмов по известному бактериофагу. Вопросы для контроля знаний: 1. Системное положение вирусов. Классификация вирусов по их геному. 2. Строение вирусов. Типы симметрии. Назначение капсида. Понятие о сперкапсиде. 3. Бактериофаг (б.ф.); строение 4. Взаимодействие б.ф с чувствительной микробной клеткой 5. Понятие о вирулентном и умеренном б.ф 6. Специфичность б.ф. 7. Понятие о фаготипировании, фагодиагностике и фаготерапии 70 Лекция 6. Микроэкология. Роль микроорганизмов в круговороте веществ. Нормальная микрофлора организма человека. Распространение в природе. Микрофлора воды. Вода также является естественной средой обитания микроорганизмов. Микрофлора воды чаще всего отражает микробный пейзаж почвы около водоема, постоянно меняется и обновляется, что связано с попаданием различных бактерий с ливневыми, сточными, талыми водами, с пылью, из организма живущих в водоеме рыб, гниющих растений. Микрофлора в пресных и соленых водоемах различна. В пресных водоемах (озерах, реках) обнаруживаются кокки (Micrococcus roseus и др.) и палочковидные бактерии (Pseudomonas fluorescens). Анаэробов в воде мало; в основном они размножаются в иле на дне рек, участвуя в биохимических процессах очищения. Сапрофитные микроорганизмы выполняют роль мусорщиков, расщепляя органические отходы, делая их пригодными для метаболических процессов других живых существ. Микрофлора морей и океанов не так богата и представлена галофильпыми (солелюбивыми) микроорганизмами. Вода артезианских скважин почти не содержит микроорганизмов, что объясняется фильтрующей способностью почвы. 71 Pseudomonas fluorescens — (фото с сайта www.scienceclarified.com The bacterium Micrococcus roseus С ливневыми, талыми и сточными водами в реки и озера попадают микроорганизмы — представители нормальной флоры кишечника человека и животных, например, кишечная палочка, энтерококки, различные клостридии. Вместе с ними могут попасть и патогенные микроорганизмы — брюшнотифозные, дизентерийные бактерии, холерные вибрионы, вирусы полиомиелита, гепатита, которые сохраняются от нескольких дней до недель. Именно поэтому водный путь передачи является одним из возможных факторов распространения кишечных инфекций. Возбудитель холеры Возбудитель брюшного тифа 72 Микрофлора воздуха. Микрофлору воздуха можно условно разделить на постоянную, часто встречающуюся, и переменную, представители которой, попадая в воздух из свойственных им мест обитания, недолго сохраняют жизнеспособность. Постоянно в воздухе обнаруживаются пигментообразующие кокки, палочки, дрожжи, грибы, актиномицеты, спороносные бациллы и клостридии и др., т. е. микроорганизмы, устойчивые к свету, высыханию. Стафилококки Стрептококки (на 2-ой картинке - зеленые) В воздухе крупных городов количество микроорганизмов больше, чем в сельской местности. Над лесами, морями воздух содержит мало микробов. Дождь и снег способствуют очищению воздуха от микробов. В воздухе закрытых помещений микробов значительно больше, чем в открытых воздушных бассейнах, особенно зимой, при недостаточном проветривании. Состав микрофлоры и количество микроорганизмов, обнаруживаемых в 1 м3 воздуха (микробное число воздуха), зависят от санитарно-гигиенического режима, числа находящихся в помещении людей, состояния их здоровья и других условий. 73 В воздух могут попадать и патогенные микроорганизмы от животных, людей (больных и носителей) при разговоре, кашле, чиханье — возбудители дифтерии, коклюша, скарлатины, туберкулеза, гриппа, кори и других инфекций. Возбудитель дифтерии Вирус гриппа При высыхании в капельках слизи и мокроты, которые образуют защитную белковую пленку, жизнеспособность попавших в воздух микробов увеличивается. Микрофлора почвы. Почва является средой обитания огромного числа мельчайших живых существ: множества видов бактерий, актиномицетов, грибов, простейших, водорослей, вирусов и др. В 1 г почвы содержится 1—10 млрд. микроорганизмов; взаимоотношения между ними носят характер как симбиотических, так и антагонистических. Почвенные микробы антагонисты широко применяются в медицинской промышленности при получении антибиотиков. Качественный состав, количество особей и соотношения между различными группами микроорганизмов изменяются в зависимости от вида почвы, способов ее обработки. Распределение микробов в почве неравномерно. На глубине 10—50 см микрофлора наиболее обильна. Здесь идет процесс разложения органических веществ с активным 74 участием таких почвенных бактерий, как гнилостные, аммонифицирующие, нитрифицирующие, азотфиксирующие и др. Небольшой верхний слой почвы (1—2 см) содержит немного микробов, что объясняется постоянным действием различных физических и химических факторов, вызывающих их гибель. В глубоких слоях почвы микробов мало, на глубине 4— 5 м — ничтожное количество. С выделениями больных животных и человека в почву попадают также патогенные микроорганизмы; часть из них погибает, но многие могут сохраняться длительное время. Поэтому почву рассматривают как путь передачи возбудителей инфекционных заболеваний. В ней обнаруживаются возбудители грибковых заболеваний, возбудители ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, способные образовывать споры и благодаря этому свойству длительно, иногда десятками лет, сохраняющиеся в почве. Непродолжительное время в почве могут существовать брюшнотифозные бактерии, возбудители туляремии, туберкулеза. Возбудитель сибирской язвы Возбудитель ботулизма 75 Возбудитель газовой гангрены и пищевых токсикоинфекций Микрофлора человека. Микрофлора - это набор микроорганизмов, свойственных данному (конкретному) организму. Организм взрослого человека населен огромным количеством разнообразных видов микроорганизмов, живущих на поверхности тела и в полостях, имеющих естественные сообщения с окружающей средой. Изучая микробный пейзаж тела здорового человека, можно условно разделить обнаруживаемые микроорганизмы на три группы: 1) случайные, транзиторные, неспособные к длительному существованию в организме человека, быстро отмирающие; 2) постоянно живущие, полезные для человека микробы — обитатели его тела (способные расщеплять и усваивать питательные вещества, продуцировать витамины, выступающие как антагонисты патогенных, например, бифидобактерии); 3) постоянно живущие, но потенциально опасные для человека, способные проявить свои болезнетворные свойства при снижении резистентности организма, изменении состава нормальной микрофлоры и других условиях, — так называемые условно-патогенные микроорганизмы. Макроорганизм и его микробное население в нормальных условиях находятся в состоянии динамического равновесия. Симбиотические взаимоотношения между ними сложились и закрепились в процессе длительного эволюционного развития, поэтому для микрофлоры каждой области тела человека характерно относительное постоянство. Изменения в 76 состоянии макроорганизма находят отражение в изменении микробного пейзажа всех участков тела. Заселение микробами организма новорожденного начинается в процессе родов: микробы попадают па кожу, в полости; возможно заражение и патогенными микробами (например, гонококками от больной гонореей матери, которые вызывают у ребенка конъюнктивит— бленнорею). Затем микрофлора формируется под влиянием окружающей среды, в зависимости от питания и других действующих на растущий организм факторов. Микрофлора кожи человека включает постоянных обитателей на поверхности (сарцины, стафилококки, дифтероиды, некоторые виды стрептококков, грибов) и в глубоких слоях — в волосяных мешочках, просветах сальных и потовых желез (эпидермальные стафилококки). Кроме характерной для кожи аутомикрофлоры, могут быть обнаружены транзиторные микроорганизмы, быстро исчезающие под влиянием бактерицидных, стерилизующих свойств кожи. Большей способностью к самоочищению обладает чисто вымытая кожа. Бактерицидность кожи отражает общую резистентность организма. В дыхательные пути вместе с воздухом попадают пылевые частички и носоглотке. микроорганизмы, Здесь чаще Треть всего которых задерживаются обнаруживаются в анаэробные бактероиды, стафилококки, стрептококки, пневмококки, нейссерии. Трахеи и бронхи, как правило, стерильны. Микрофлора желудочно-кишечного тракта наиболее обильна и разнообразна по видовому составу. В полости рта обнаруживаются микроорганизмы более 100 видов, что объясняется наиболее благоприятными условиями существования: достаточная влажность, щелочная реакция среды, наличие остатков пищи, постоянная стрептококки, температура. стафилококки, В полости рта лактобактерии, человека живут клебсиеллы, коринебактерии, спириллы и спирохеты, простейшие, грибы. Микрофлора желудка очень скудна. Желудочный сок вызывает гибель микроорганизмов, попадающих в него с пищей, водой. Бедна также микрофлора тонкой кишки. Высокие отделы по характеру микрофлоры приближаются к желудку; в нижних отделах, постепенно обогащаясь, микрофлора сближается с флорой толстой кишки. 77 Микрофлора толстой кишки наиболее обильна и многообразна. По современным представлениям, в составе микрофлоры толстого отдела кишечника здорового человека превалируют анаэробные бактерии, составляющие 96% всех видов кишечной аутофлоры. Основные представители: неспоровые грамположительные (бифидум-бактерии, лактобактерии, пептококки,' катенобактерии) и грамотрицательные палочки, среди которых основное место занимают бактероиды. Значительная роль в микрофлоре кишечника принадлежит кишечной палочке Е. coli — грамотрицатсльной, подвижной бактерии, обладающей энергичной ферментативной деятельностью. Кишечная палочка имеет патогенных выраженные представителей стафилококков и грибов микрофлоры кишечника стрептококк, образующий кишечнике живут антагонистические семейства Candida. К относится цепочки свойства против Enterobacteriaceae, против представителям энтерококк, из дрожжеподобные или диплококков. грибы, нормальной фекальный Постоянно споровые в анаэробы, спирохеты, простейшие, вирусы, включая фаги. Нормальная микрофлора здорового человека играет важную роль в поддержании здоровья, обеспечивает отлаженную работу всего организма. большинство микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры, выделяют кислоты, спирты, лизоцим (антибактериальное вещество). Благодаря этому тормозится развитие гнилостных бактерий в кишечнике. Кроме того, нормальные микроорганизмы препятствуют выделению токсинов патогенными (вызывающими заболевание) микроорганизмами. нормальная микрофлора кишечника способствует пищеварению: расщепляет трудноперевариваемые сложные органические вещества (клетчатка, целлюлоза, пектины). С дейтельностью микроорганизмов связаны обмен липидов, разложение желчных кислот, разложение белков до конечных продуктов, процессы всасывания веществ. микроорганизмы участвуют в процессах обезвреживания токсинов, поступающих с пищей. 78 нормальная микробиота способствует усилению всасывания из кишечника ионов железа и кальция, витамина Д, участвует в образовании витамина К (при недостатке - хрупкость сосудов), группы В, фолиевой, никотиновой, пантотеновой кислот (витаминные вещества) Нормальная микрофлора обеспечивает образование иммуноглобулина А, поддерживая этим иммунитет. Не позволяет возбудителям проникнуть в ткани. У взрослого здорового человека, по весу в толстом кишечнике (в сушеном виде) находится до 1,5 килограмм полезных микробов. Функция, которых приравнивается к функции двух органов печени и почек вместе взятых. Есть сведения, что нарушения состава микрофлоры являются одной из причин преждевременного старения организма. Т.к. токсины, выделяемые гнилостными бактериями, которые в норме уничтожаются нормальной микрофлорой кишечника, отравляют организм, вызывая различного рода нарушения. Дисбактериоз Часто можно слышать о нормальной микрофлоре и о нарушениях, связанных с отклонением от нормы. Термин нормальная микрофлора объединяет виды микроорганизмов, часто выделяемые из организма здорового человека. Нарушение качественного и количественного состава микрофлоры и перемещение ее в другие, не свойственные микроорганизмам, части тела называют дисбактериозами. Развитию дисбактериоза способствует: Длительное применение антибиотиков и антисептиков. Антимикробная терапия сопровождается дисбактериозом в 90% случаев. Поэтому настоятельно рекомендуется использовать антибиотики только в острых и тяжелых случаях. Чрезмерная чистоплотность, использование средств гигиены с антибактериальными веществами (например, триклозан) также может приводить к дисбактериозу. Используя антибактериальные средства, человек убивает не только патогенные микроорганизмы, но и нормальные. Последние являются защитным барьером для человека. Здесь уместна аналогия со стражниками, защищающими ворота. Стражники - нормальная микрофлора, ворота - кожа человека. Нет стражи, ворота легко атакуемы. Снижение местного и общего иммунитета в результате гормонотерапии , лучевой терапии, инфекционных заболеваний, воспалительных процессов, аллергий. 79 Нарушения в гормональной системе организма. Чаще всего нарушение в гормональной системе вызваны употреблением продуктов, содержащих активные гормоны (мясо, молоко крупномасштабных производителей) Стресс. Группу риска составляют люди, находящиеся в состоянии постоянного напряжения: летчики, бизнесмены, моряки, спортсмены, врачи, а также жители экологически неблагоприятных территорий и пожилые люди. Нарушение работы нервной системы. Нарушения в нервной системе могут быть вызваны недосыпанием, чрезмерным употреблением кофе, энергетических напитков, использованием снотворных средств. Общее ухудшение экологической обстановки, низкое качество воды, неполноценное и несбалансированное питание также могут стать причиной дисбактериоза. Наиболее распостранен дисбактериоз кишечника, симптомы которого следующие: Нарушение работы кишечника (диарея, запор, урчание, повышенный метеоризм) Общее недомогание, сопровождающееся болями в области живота Постоянная усталость, депрессивность Вопросы для контроля знаний: 1. Что такое микрофлора и ее отличие от культуры?. 2. Какие м.о. являются наиболее частыми обитателями водоемов, почвы и воздуха? Какой природный объект наиболее обсеменен? 3. Понятие о нормальной микрофлоре (н.м.ф.) человека. 4. Какие биотопы организма обсеменены? 5. Назначение н.м.ф. в организме человека 6. Понятие о дисбактериозе; симптомы Лекция 7 Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Основные понятия: Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов и вирусов в 80 объектах, подвергшихся обработке. Дезинфекция — процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии. Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители. Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса. Методы воздействия на микроорганизмы по виду использованного фактора можно разделить на физические и химические, по характеру воздействия- на неизбирательные (обеззараживание- дезинфекция, стерилизация) и избирательные (химиотерапевтические). Физические методы. 1.Термическая обработка- прокаливание, кипячение, пастеризация, автоклавирование. 2.Облучение- ультрафиолетовое, гамма- и рентгеновское, микроволновое. 3.Фильтрование (оптимально- бактериологические фильтры с диаметром пор около 200 нм). Химические методы. 1.Неспецифического действия- дезинфектанты (обработка помещений и др., антисектики- обработка живых тканей). К ним относятся: препараты йода и хлора, спирты, альдегиды, кислоты и щелочи, соли тяжелых металлов, катионные детергенты, фенолы, окислители, природные препараты- деготь, ихтиол, хлорофиллипт. 2.Избирательно подавляющие жизнедеятельность микроорганизмов - антибиотики и химиотерапевтические препараты. Влияние физических факторов. Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при высокой — термофилами. 81 К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий. Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С. При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250—300 °С и давлении 262 атм. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы. Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С). Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты. Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств. Действие излучения. Неионизирующее излучение — ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. 82 С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм. Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcusradiodurans была выделена из ядерного реактора. Методы, основанные на термической обработке стерилизуемых объектов Губительное действие высокой температуры обусловливается повреждением коллоидного состояния плазмы, денатурацией белка с последующей коагуляцией его, а также нарушением ферментных систем микроорганизмов. Различают влажные и сухие способы тепловой стерилизации. Влажные способы используются, главным образом, для стерилизации питательных сред. К таким способам относятся стерилизация паром под давлением, стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) и тиндализация. Стерилизация паром под давлением – самый эффективный в бактериологической практике способ стерилизации питательных сред и посуды, так как с его помощью быстро достигается полное и надежное обеспложивание. Этот способ стерилизации основан на том, что образующийся при кипячении воды пар не выходит наружу, а, скапливаясь в замкнутом пространстве, повышает давление. При создании избыточного давления возрастает температура кипения воды и температура пара. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в паровых стерилизаторах, принцип работы и устройство которого описаны в разделе 1.1.3. Стерилизация текучим паром используется для сред, которые нельзя нагревать выше температуры 100 0 С. Стерилизация проводится при 100 0 С (температура парообразования) по 30…60 минут в течение 3 дней с промежутками в 18-20 часов, во время которых материал выдерживается в термостате или при комнатной температуре. Поэтому этот способ называют еще дробной стерилизацией. В основу способа дробной стерилизации положен следующий принцип: при нагревании до 100 0С в течение 30…60 минут погибают все вегетативные клетки, а споры остаются жизнеспособными. В промежутке между стерилизацией споры прорастают в вегетативные клетки. Через сутки проводят повторную стерилизацию. Обычно после третьей стерилизации достигается полное обеспложивание объекта. Стерилизацию текучим паром осуществляют в аппаратах Коха или текучепаровых аппаратах (кипятильниках Коха). Тиндализация – это дробная стерилизация при низкой температуре – 56…58 0С. Применяют этот способ при стерилизации сред, которые нельзя нагревать до 100 0С. Такие 83 среды подвергают нагреванию в течение 5…6 дней подряд по 1 часу ежедневно (в 1-й день – в течение 2 часов). В промежутках между прогреванием стерилизуемая жидкость хранится в термостате. При этом оставшиеся в живых споры прорастают в вегетативные клетки, которые погибают при последующем нагревании. Тиндализацию проводят в специальных приборах с терморегулятором или на водяных банях. Сухие способы. При работе в микробиологической лаборатории из сухих способов термической стерилизации используются следующие: Прокаливание на огне (фламбирование) очень быстрый и надежный способ стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл перед посевами. Этим способом можно стерилизовать также мелкие металлические предметы (пинцеты, скальпели) и предметные стекла. Осуществляют прокаливание над пламенем горелки. Стерилизация сухим жаром (сухим нагретым воздухом) используется для стерилизации микробиологической посуды (пипеток, чашек Петри), песка. Осуществляют стерилизацию сухим жаром при температуре 1650-180 0С в течение 1…1,5 часов в печах Пастера или в сушильных шкафах. Методы холодной стерилизации Механическая стерилизация (фильтрование). Этот способ применяется для стерилизации сред в тех случаях, когда их нельзя подвергать нагреванию. При механической стерилизации стерилизуемые жидкости фильтруют через специальные фильтровальные приборы, которые имеют настолько мелкие поры, что на своей поверхности задерживают взвешенные в жидкости частицы, в том числе и микробы. Для фильтрации в микробиологической практике применяют различные фильтровальные приборы (фильтры Зейтца, свечи Шамберлана, Мандлера, Беркефельда и др.). Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д. Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям. Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли). 84 Вопросы для контроля знаний: 1. Что такое стерилизация? 2. Что такое дезинфекция? 3. Что такое асептика ? 4. Что такое антисептика? 5. Стерилизация посуды 6. Стерилизация питательных сред; тиндализация, стрилизация текучим паром 7. Обеспложивание (убивка м.о.) 8. Механическая стерилизация 9. Виды дезинфекции Лекция 8 Антибиотики. Антибиои тики (от др.-греч. ἀντί — против + βίος — жизнь) — вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших. 85 По ГОСТ 21507-81 (СТ СЭВ 1740-79) Антибиотик — вещество микробного, животного или растительного происхождения, способное подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель. Исторический очерк. В народной медицине для обработки ран и лечения туберкулеза издавна применяли экстракты лишайников. Позднее в состав мазей для обработки поверхностных ран стали включать экстракты бактерий Pseudomonas aeruginosa, хотя почему они помогают, никто не знал, и феномен антибиоза был неизвестен. Однако некоторые из первых ученых-микробиологов сумели обнаружить и описать антибиоз (угнетение одними организмами роста других). Дело в том, что антагонистические отношения между разными микроорганизмами проявляются при их росте в смешанной культуре. До разработки методов чистого культивирования разные бактерии и плесени выращивались вместе, т.е. в оптимальных для проявления антибиоза условиях. Луи Пастер еще в 1877 описал антибиоз между бактериями почвы и патогенными бактериями – возбудителями сибирской язвы. Он даже предположил, что антибиоз может стать основой методов лечения. Первые антибиотики были выделены еще до того, как стала известной их способность угнетать рост микроорганизмов. Так, в 1860 был получен в кристаллической форме синий пигмент пиоцианин, вырабатываемый небольшими подвижными палочковидными бактериями рода Pseudomonas, но его антибиотические свойства были обнаружены лишь через много лет. В 1896 Б. Гозио из жидкости, содержащей культуру грибка из рода Penicillium (Penicillium brevicompactum), выделил кристаллическое соединение — микофеноловую кислоту, подавляющую рост бактерий сибирской язвы. В 1899 году Р. Эммерих и О. Лоу сообщили об антибиотическом соединении, образуемом бактериями Pseudomonas pyocyanea, и назвали его пиоцианазой; препарат использовался как местный антисептик. Постепенно выяснилось, что антибиоз имеет химическую природу и обусловлен выработкой специфических химических соединений. В 1929 Александр Флеминг, наблюдая антагонизм Penicillium notatum и стафилококка предположил в смешанной возможность культуре, его открыл применения в пенициллин лечебных и целях. Антагонистические отношения между болезнетворными для растений микробами и непатогенными микроорганизмами почвы, выявленные в смешанных культурах, заинтересовали фитопатологов, и они попытались использовать этот феномен для борьбы с болезнями растений. Было известно, что в почве присутствует определенный грибок, который уменьшает выпревание ростков; в 1936 из культуры 86 этого грибка был выделен антибиотик, получивший название глиотоксин. Это открытие подтвердило значение антибиотиков как средства профилактики заболеваний. Годом ранее в 1935 –м Герхард Домагк опубликовал статью о терапевтическом действии пронтозила в Deutsche Medizinische Wochenschrift, данная статья была первым руководством по лечению антибиотиком, а в 1939-м году он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине за «за открытие антибактериального эффекта пронтозила». В 1937-м М. Вельш описал первый антибиотик стрептомицетного происхождения — актиномицетин. Среди первых исследователей, занявшихся целенаправленным поиском антибиотиков, был Р.Дюбо. Проведенные им и его сотрудниками эксперименты привели к открытию антибиотиков, вырабатываемых некоторыми почвенными бактериями, их выделению в чистом виде и использованию в клинической практике. В 1939 Дюбо получил тиротрицин – комплекс антибиотиков, состоящий из грамицидина и тироцидина; это явилось стимулом для других ученых, которые обнаружили еще более важные для клиники антибиотики. В этом же году Н. А. Красильников и А. И. Кореняко получили мицетин, а на химикофармацевтическом заводе «АКРИХИН» начали производство стрептоцида. В 1940 году — Э. Чейн выделил пенициллин в кристаллическом виде. В 1942 год —Х.Флори со своими коллегами по Оксфордскому университету повторно исследовал пенициллин и доказал возможность его клинического использования в качестве нетоксичного средства лечения многих острых инфекций. Зельман Ваксман впервые ввел термин «антибиотик». З.Ваксман со своими студентами в Университете Ратджерса, США, занимался актиномицетами (такими, как Streptomyces) и в 1944 открыл стрептомицин, эффективное средство лечения туберкулеза и других заболеваний. После 1940 было получено множество клинически важных антибиотиков, в их числе бацитрацин, хлорамфеникол (левомицетин), хлортетрациклин, окситетрациклин, амфотерицин В, циклосерин, эритромицин, гризеофульвин, канамицин, неомицин, нистатин, полимиксин, ванкомицин, виомицин, цефалоспорины, ампициллин, карбенициллин, аминогликозиды, стрептомицин, гентамицин. В настоящее время открывают все новые и новые антибиотики. В середине 1980-х годов в США антибиотики прописывались чаще, чем любые другие лекарства, за исключением седативных средств и транквилизаторов. Классификация антибиотиков. Современная классификация антибиотиков разработана в Государственном центре по антибиотикам (С.М.Навашин, 1994), в соответствии с которой, они характеризуются по происхождению, способу получения, механизму действия, химической структуре, противомикробному спектру, типу действия на клетку. 87 Продуцентами большинства антибиотиков являются ( классификация по происхождению): - актиномицеты (стрептомицин, тетрациклин), - плесневые грибы (весь пенициллиновый ряд); но их можно получить и из: - бактерий (полимиксины), - высших растений (фитонциды) - тканей высших животных, человека и рыб (эритрин, эктерицид, лизоцим, интерферон). По способу получения их делят на: - природные (штаммы-продуценты антибиотиков выращивают на искусственных питательных средах, а за тем антибиотик извлекают из питательной среды химическими методами); - синтетические (химические аналоги природных антибиотиков и синтезированные антибиотики, не имеющие природного аналога); - полусинтетические (на начальном этапе получают естественным путем, затем синтез ведут искусственно, то есть изменяют химическую структуру природного антибиотика). С учетом механизма действия антибиотики разделяют на три основные группы: - ингибиторы синтеза клеточной стенки микроорганизма (пенициллины, цефалоспорины, ванкомицин, тейкопланин и др.); - антибиотики, функции клеточных нарушающие мембран молекулярную (полимиксин, организацию, нистатин, леворин, амфотерицин и др.); - антибиотики, подавляющие синтез белка и нуклеиновых кислот, в частности, ингибиторы синтеза белка на уровне рибосом (хлорамфеникол, тетрациклины, макролиды, линкомицин, аминогликозиды) и ингибиторы РНК-полимеразы (рифампицин) и др. 88 В зависимости от типа воздействия на микробную клетку антибиотики классифицируют на две группы: - бактерицидные – вызывают гибель микробной клетки (пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, рифампицин, полимиксины и др.); - бактериостатические – задерживают рост микробной клетки (макролиды, тетрациклины, линкомицин, хлорамфеникол и др.). По химическому строению антибиотики делятся на: 1. Бета-лактамные антибиотики - основу из молекулы составляет бета-лактамное кольцо. К ним относятся: - пенициллины - это группа природных и полусинтетических антибиотиков, молекула которых содержит 6-аминопенициллановую кислоту, состоящую из двух колец - тиазолидонового и бета-лактамного. Среди них выделяют: - биосинтетические (пенициллин G - бензилпенициллин), - аминопенициллины (амоксициллин, ампициллин, бекампициллин), - полусинтетические "антистафилококковые" пенициллины (оксациллин, метициллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин), основное преимущество которых - устойчивость к микробным бета-лактамазам, в первую очередь, стафилококковым; 2. цефалоспорины - это природные и полусинтетические антибиотики, полученные на 89 основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты и содержащие цефемовое (также беталактамное) кольцо, т.е. по структуре они близки к пенициллинам. Они делятся на цефалоспорины: - 1-го поколения: цепорин, цефалотин, цефалексин; - 2-го поколения:- цефазолин (кефзол), цефамезин, цефамандол (мандол); - 3-го поколения:- цефуроксим (кетоцеф), цефотаксим (клафоран), цефуроксим аксетил (зиннат), цефтриаксон (лонгацеф), цефтазидим (фортум); - 4-го поколения:- цефепим, цефпиром (цефром, кейтен) и другие. - монобактамы - азтреонам (азактам, небактам); - карбопенемы - меропенем (меронем) и имипинем. Причем имипинем применяют только в комбинации со специфическим ингибитором почечной дегидропептидазы циластатином - имипинем/циластатин (тиенам); 3 Аминогликозиды - они содержат аминосахара, соединенные гликозидной связью с остальной частью (агликоновым фрагментом) молекулы. К ним относятся: стрептомицин, гентамицин (гарамицин), канамицин, неомицин, мономицин, сизомицин, тобрамицин (тобра) и полусинтетические аминогликозиды спектиномицин, амикацин (амикин), нетилмицин (нетиллин); 4. Тетрациклины - основу молекулы составляет полифункциональное гидронафтаценовое соединение с родовым название тетрациклин. Среди них имеются природные тетрациклины - тетрациклин, окситетрациклин (клинимицин) и полусинтетические тетрациклины - метациклин, хлортетрин, доксициклин (вибрамицин), миноциклин, ролитетрациклин; 5. Макролиды - препараты этой группы содержат в своей молекуле макроциклическое лактоновое кольцо, связанное с одним или несколькими углеводными остатками. К ним относятся: эритромицин, олеандомицин, рокситромицин (рулид) азитромицин (сумамед), кларитромицин (клацид), спирамицин, диритромицин; 6. Линкозамиды - к ним относятся: линкомицин и клиндамицин. Фармакологические и биологические свойства этих антибиотиков очень близки к макролидам, и, хотя в химическом отношении это совершенно иные препараты, некоторые медицинские источники и фармацевтические фирмы - производители химиопрепаратов, например, делацина С, относят линкозамины к группе макролидов; 7. Гликопептиды - препараты этой группы в своей молекуле содержат замещенные пептидные соединения. К ним относятся: ванкомицин (ванкацин, диатрацин), тейкопланин (таргоцид), даптомицин; 8. Полипептиды - препараты этой группы в своей молекуле содержат остатки полипептидных соединений, к ним относятся: грамицидин, полимиксины М и В, бацитрацин, колистин; 9. Полиены - препараты этой группы в своей молекуле содержат несколько сопряженных двойных связей. К ним относятся: амфотерицин В, нистатин, леворин, 90 натамицин; 10. Антрациклинновые антибиотики - к ним относятся противоопухолевые антибиотики - доксорубицин, карминомицин, рубомицин, акларубицин. Есть еще несколько достаточно широко используемых в настоящее время в практике антибиотиков, не относящихся ни к одной из перечисленных групп - фосфомицин, фузидиевая кислота (фузидин) рифампицин. По спектру противомикробного действия антибиотики разделяют на следующиие группы: - антибиотики широкого спектра действия, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных палочек: хлорамфеникол, тетрациклины, аминогликозиды, полусинтетические пенициллины широкого спектра действия (ампициллин, азлоциллин и др.) и цефалоспорины 2-го поколения. - антибиотики узкого спектра действия - препараты, действующие преимущественно на грамположительные и грамотрицательные кокки (стафилококки, стрептококки, менингококки, гонококки), некоторые грамположительные микробы (коринебактерии, клостридии). К этим препаратам относятся бензилпенициллин, бициллины, феноксиметилпенициллин, пенициллиназоустойчивые пенициллины (оксациллин, метициллин), цефалоспорины 1-го поколения, макролиды, ванкомицин, линкомицин. Антибиотики с преимущественной активностью в отношении грамотрицательных палочек (полимиксины, цефалоспорины 3-го поколения). Противотуберкулезные антибиотики (стрептомицин, рифампицин, флоримицин). Противогрибковые антибиотики (нистатин, леворин, гризеофульвин, амфотерицин В, кетоконазол, анкотил, дифлюкан и др.). По направленности действия : - антибактериальные; - противогрибковые; - противоопухолевые; - противовирусные. Вышеперечисленные свойства в основном и диктуют выбор антибиотика для лечения инфекционного больного. При этом обязательно учитываются фармакодинамика и фармакокинетика препарата, индивидуальные особенности больного (возраст, состояние иммунитета, сопутствующие заболевания и др.). Устойчивость и степень чувствительности бактерий к антибиотикам. Антибиоо́ тикорезистео́ нтность чувствительности (устойчивость, – отсутствие или снижение невосприимчивость) культуры микроорганизмов к действию антибактериального вещества. 91 Механизмы резистентности. У микроорганизма может отсутствовать структура на которую действует антибиотик (например бактерии рода микоплазма нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки); Микроорганизм непроницаем для антибиотика (большинство грам-отрицательных бактерий невосприимчивы к пенициллину G, поскольку клеточная стенка защищена дополнительной мембраной); Микроорганизм в состоянии переводить антибиотик в неактивную форму (многие стафилококки содержат фермент β-лактамазу, который разрушает β-лактамовое кольцо большинства пенициллинов); В результате генных мутаций, обмен веществ микроорганизма может быть изменён таким образом, что блокируемые антибиотиком биохимические реакции больше не являются критичными для жизнедеятельности данного микроорганизма. Кроме того, антибиотикорезистентность микроорганизмов может быть создана искусственно методом генетической трансформации. Например, внесением искусственных генов в геном микроорганизма. Таким образом выделяют два типа устойчивости к антибиотикам: - естественная – является видовым признаком. Чаще всего эта устойчивость связана со слабой для данного антибиотика проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны микроорганизма. - приобретённая – возникает у отдельных штаммов в результате изменения генома микроорганизма под действием антибиотика. Существует так же понятие полирезистеи нтность — устойчивость микроорганизмов к двум и более антибактериальным препаратам. По степени чувствительности к основным антибиотикам микробы подразделяются на чувствительные, среднечувствительные, умеренно устойчивые и устойчивые. В группу чувствительных входит большинство штаммов микроорганизмов, рост которых на питательных средах прекращается при использовании концентраций, соответствующих средним терапевтическим дозам антибиотиков. Если он угнетается при применении только максимальных доз препаратов, то такие микроорганизмы среднечувствительны к антибиотику. Если рост бактерий прекращается только при непосредственном воздействии антибиотиком на очаг инфекции, то такие возбудители относят к умеренно устойчивым. 92 Если подавление роста достигается в опыте в лаборатории лишь при очень высоких концентрациях препарата, которые нельзя создать в организме, то такие возбудители инфекции относятся к устойчивым к антибиотику. Определение чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. Циркуляция антибиотикорезистентных микроорганизмов в современный период столь широка, что только точное определение чувствительности к антибиотикам каждого конкретного возбудителя инфекции может обеспечить правильный выбор препарата для химиотерапии. Диффузный метод дисков (метод наложения дисков). Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри. На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37°С 24 часа В зависимости от диаметра зоны задержки роста различают степень чувствительности испытуемого штамма: чувствительные, малочувствительные и устойчивые (отсутствие зоны). Степень чувствительности к антибиотику отмечается по четырёхкрестной системе, в зависимости от диаметра зоны задержки роста. 93 Зона задержки роста культуры вокруг диска, пропитанного антибиотиком. Метод серийных разведений. Биологическую активность антибиотика измеряют в международных единицах ЕД (единица действия) – наименьшее количество препарата, которое оказывает антимикробное действие на тест-культуру. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений. Метод серийного разведения препарата в бульоне основан на определении способности растворенного в питательном бульоне препарата вызывать гибель или ингибировать рост находящихся в нем микробов. Для постановки опыта необходимы основные растворы антибиотиков в дистиллированной воде, питательный бульон (МПБ) и 18-часовая бульонная культура исследуемого штамма с примерной плотностью в 10 м.т./мл. Ход исследования: из основных разведений препаратов готовят ряд в объеме 1 мл двукратных серийных разведений (титруют с1-й по 7-ю пробирки, из последней 1.0 мл сливают в дез. раствор для уравнивания количества жидкости) по схеме , захватывающие все уровни чувствительности-устойчивости. Во все разведения ряда доливают по 0,1 мл исследуемой культуры. Контроли: контроль культуры (К/К) содержит 0,1 мл культуры и 1 мл бульона, а контроль среды ( К\Ср) только 1 мл питательного бульона. Инкубируют посевы при 37°С до следующего дня. Число пробирок Кратные разведения а\б , ЕД МПБ (мл) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 3 1 8 4 2 1 К К 4 2 1 .0 А\б 128 ЕД 6 1 .0 \К 1 .0 1 .0 1 .0 1 1.0 .0 1 .0 1 .0 \Ср _ 1.0 мл в дез.р-р 1 .0 _ 94 Исследуема я культура Результат 0 .1 0 .1 - 0 .1 - 0 .1 - 0 .1 + 0 0.1 + + .1 + 0 _ + - .1 Результат: Сначала смотрят контроли – К\К – мутная пробирка, есть рост культуры (+) – микроорганизмы способны размножаться, а К/Ср – прозрачная пробирка (-) – рост отсутствует, питательная среда стерильна. Определяют МИК (минимальная концентрация препарата, оказывающая антимикробное действие), которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (последняя прозрачная пробирка в ряду с 1-й по7-ю). Затем эту дозу антибиотика пересчитывают на вес больного. Если необходимо установить бактерицидное действие МБК, из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на секторы чашки с МПА. Инкубируют до следующего дня и учитывают рост. За МБК принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста. Метод серийных разведений в плотной питательной среде базируется на способности растворенного в плотной питательной среде препарата ингибировать рост нанесенных на него микробов. По сравнению с методом серийных разведении в жидкой среде более производителен, чувствителен и точен. Ускоренные методы определения чувствительности. Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к химиопрепаратам дают возможность получить ответ спустя 2-6 ч. от начала исследования чистых культур. По принципу и механизму реакций, возникающих в результате действия антибиотиков, можно выделить 5 групп ускоренных методов, которые основаны на: 1) выявлении изменений ферментативной активности бактерий. Сущность методов 1-й группы заключается в следующем: в мясо-пептонный бульон с глюкозой добавляют антибиотик в необходимой концентрации, а затем засевают испытуемый штамм микробов. Устойчивые к данному антибиотику микроорганизмы усваивают глюкозу, что проявляется изменением кислотно-щелочного потенциала (pH) среды. Для определения изменений pH среды предложено использовать индикаторы, которые изменяют свой цвет при снижении pH – феноловый красный, индикатор Андреде и бромтимоловый синий. 2) выявлении изменений окислительно-восстановительного потенциала среды развивающимися микроорганизмами. Методы 2-й группы, получившие наибольшее распространение, основаны на выявлении изменений окислительно-восстановительного потенциала среды (rH2) развивающимися микроорганизмами в присутствии антибиотиков с помощью биологических или химических редокс-индикаторов. Микроорганизмы, которые устойчивы к антибиотику, растут и размножаются в среде и снижают rH2 – потенциал, в результате чего индикатор, добавленный к питательной среде, изменяет свой цвет. Чувствительные микроорганизмы в зоне диффузии антибиотиков не размножаются и не изменяют rH2, вследствие этого цвет среды вокруг дисков не изменяется. 3) цитоморфологической оценке изменений бактериальных клеток и формирования микроколоний. Цитоморфологические ускоренные методы основаны на том принципе, что 95 микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам при 3-4-часовом росте на средах с химиопрепаратами, не увеличивают размеров микробной клетки или не образуют микроколоний на специальных препаратах с питательными средами. 4) определении изменений оптической плотности среды растущей популяцией или включения радиоизотопов в микробные клетки. Предложены ускоренные методы, основанные на выявлении динамики оптической плотности культур в присутствии антибиотика с помощью нефелометра или спектрофотометра. Разработка системы автоматизации процесса регистрации подавления микробного роста антимикробными препаратами позволила создать различные приборы-автоматы (АТВ Expression, MIC-2000, MS-2, Autobac и др.), обеспечивающие стандартность исследования и ускоренное получение антибиотикограмм. 5) использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами. Пятая группа ускоренных методов основана на использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами для достижения быстро регистрируемых изменений в среде. В качестве таких стимуляторов используют экстракт бычьего сердца и глюкозу, кровь и глюкозу, индолилмасляную и индолилуксусную кислоты, гибереллин. Для лечебной и эпидемиологической практики большой интерес представляют экспрессметоды определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, которые позволяют устанавливать антибиотикограмму возбудителя непосредственно в нативном материале или в первичном посеве, то есть без выделения чистой культуры, что сокращает время анализа до нескольких часов. Разработано несколько модификаций экспресс-метода, в основном для определения чувствительности к антибиотикам возбудителей опасных инфекционных заболеваний (ОИЗ) в первичном посеве исследуемого материала с помощью иммунологических реакций-метода флюоресцирующих антител, реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного метода. Основу модификаций эспресс-анализа антибиотикочувствительности составляет регистрация с помощью специфических антител действия препаратов на рост и размножение популяции возбудителя в смешанной культуре, то есть в ассоциации с сопутствующей микрофлорой. Преимущества использования экспресс-методов в микробиологической практике. 1. Экспресс-методы позволяют оценить чувствительность-устойчивость к антибиотикам возбудителей гнойно-септических инфекций непосредственно в патологическом материале – в моче, мокроте и гное. 2. Экспресс-методы оценки чувствительности-устойчивости микроорганизмов к антибиотикам характеризуются достаточной чувствительностью, обеспечивают получение результатов, сопоставимых с таковыми, полученными с помощью классических методов. 3. Применение экспресс-методов в клинических лабораториях позволяет получить результаты в течение 3-4 часов, что обеспечивает раннее назначение этиотропной антибиотикотерапии. 4. Ускоренное определение чувствительности к антибиотикам чистых культур микроорганизмов устанавливает минимальную ингибирующую концентрацию препарата в день получения чистых культур, что способствует назначению эффективного препарата в дозе, необходимой для проведения рациональной антибиотикотерапии. Осложнения антибиотикотерапии. 96 1. Аллергические реакции 2. Прямое токсическое действие 3. Дисбактериозы 4. Развитие антибиотикорезистентных штаммов возбудителя 5. Снижение иммунной резистентности 6. Обострение заболевания Аллергические реакции не связаны с фармакологическими свойствами лекарств и возникают только у людей с повышенной чувствительностью (чаще сенсибилизированных). Антигенные свойства антибиотиков объясняются тем, что они являются неполными антигенами — гаптенами (простые химические соединения). Гаптены приобретают антигенные свойства только после связи с белком в организме. Это осуществляется при связи с растворимыми протеинами в крови или клеточными мембранами. Установлено, что антитела к пенициллину относятся к классам IgG, IgM, IgE. Клинические проявления аллергии на антибиотик могут быть различны от сыпи и до анафилактического шока. Для определения повышенной чувствительности организма к препарату перед назначение антибиотика проводят кожную пробу. Кожная проба заключается в следующем. На сгибательную поверхность предплечья наносят каплю раствора антибиотика, содержащую 100—1000 ЕД препарата и скарифицируют кожу, как это делают при пробе Пирке. Если через 15 минут появляется покраснение более 1 см в диаметре, реакция оценивается как слабоположительная (+), если покраснение и папула — положительная (++), если множественные папулы, везикулы, разлитая гиперемия — резко положительная (+++). В случаях резко повышенной чувствительности возможно появление общей реакции — крапивница, уртикарная сыпь по всему телу т. д. Внутрикожная проба заключается в интрадермальном введении раствора антибиотика (200 —2000 ЕД пенициллина) в 0,2 мл физиологического раствора. Вводится антибиотик на сгибательной поверхности предплечья, на другой руке на симметричном участке вводят 0,2 мл физиологического раствора. Появление гиперемии (размер папулы более 3-х копеечной монеты), отечности, иногда высыпаний на месте инъекций расценивается как положительная проба. Кожные пробы не всегда дают немедленную реакцию: она может проявиться через 24—48 часов. Токсическое действие антибиотиков. Нейротоксические явления возникают после применения антибиотиков ряда групп и проявляются: 1) поражением на слуховые ветви VIII пары черепных нервов (мономицин, канамицин, неомицин, стрептомицин, флоримицин, ристомицин). 2) действием на вестибулярный аппарат (стрептомицин, флоримицин, канамицин, неомицин, гентамицин). 3) поражением зрительного нерва (стрептомицин, левомицетин, цикло-серин, полимиксин). 4) развитием полиневрита (стрептомицин, полимиксин, амфотерицин В, циклосерин). 5) возникновением парестезии, головных болей, головокружений, атаксии (полимиксин, стрептомицин, циклосерин, амфотерицин В). 6) развитием различных поражений центральной нервной системы (циклосерин, полимиксин, гризеофульвин, амфотерицин В, пенициллин, стрептомицин).7) возникновением нервно-мышечной блокады (аминогликозиды, полимиксин). 8) прямым токсическим действием при интралюмбальном введении, проявляющимся в виде галлюцинаций, эпилептиформных 97 припадков, судорог отдельных групп мышц и общей гипертензии мускулатуры (пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, левомицетин и ряд других антибиотиков). Нефротоксические реакции могут сопровождать лечение полимиксином, амфотерицином В, неомицином, мономицином, канамицином, гентамицином, сизомицином, тобрамицином, стрептомицином, цефалоридином, гризеофульвином, ристомицином, сульфонамидами. И гепатотоксические явления. Многие антибиотики накапливаются в больших концентрациях в желчи (тетрациклины, эритромицин, рифампицин) и могут вызывать поражения печени. Так как печень несет детоксицирующую функцию, а почки— выделительную, часто оба эти органа могут являться одновременным объектом побочного действия препаратов. При любых нарушениях функции этих систем надо иметь в виду возможность развития токсических побочных явлений. Токсическое действие на желудочно-кишечный тракт ряда антибиотиков (тетрациклин, эритромицин, гризеофульвин, амфотерицин В, фузидин и др.), связанное с их раздражающим воздействием на слизистые оболочки, проявляется в виде тошноты, рвоты, анорексий, болей в области живота, поноса и др. Обычно эти явления носят не столь выраженный характер, чтобы отменять антибиотики. Однако при часто присоединяющемся дисбактериозе под влиянием антибиотиков широкого спектра действия, а также линкомицина и клиндамицина могут возникать серьезные осложнения вплоть до псевдомембранозного энтероколита. Влияние на кроветворную систему. Угнетение кроветворения в виде гипопластической анемии наблюдается в редких случаях при применении левомицетина и амфотерицина В, гемолитические анемии—при применении левомицетина, стрептомицина, апластические анемии—при использовании левомицетина. Лейкопения с агранулоцитозом описана при лечении левомицетином, ристомицином, гризеофульвином, тромбоцитопения— при применении ристомицина, левомицетина, рифампицина. Как правило, кроветворение восстанавливается после прекращения лечения. Тяжелые поражения костного мозга наблюдаются при лечении левомицетином, особенно при его длительном применении. Эмбриотоксическое действие антибиотиков—побочное действие препаратов на плод, связанное с их проникновением через плацентарный барьер. Описаны случаи поражения слуха у новорожденных при лечении беременных стрептомицином, слуха и почек—при лечении неомицином и канамицином. Под действием тетрациклина при назначении его беременным могут возникать пигментация зубов и повреждение зубной эмали» повышенная склонность к кариесу у детей. Описано влияние на рост костей плода (замедление скелетообразования) при введении беременным больших доз тетрациклинов. В связи с возможностью токсического действия на плод за 3—6 нед. до родов противопоказано применение левомицетина, тетрациклина, стрептомицина, канамицина и других препаратов. Побочные реакции, обусловленные непосредственным фармакодинамическим действием. В эту группу входят обусловленные биологическим действием антибиотиков суперинфекции и внутрибольничные инфекции, а также побочные явления, связанные с нарушением состава так называемой нормальной микрофлоры организма больного (дисбактериоз), реакцией бактериолиза (Яриша -Герксгеймера). 98 Дисбактериозы. Кандидозы. К этой группе относятся заболевания, вызванные дрожжеподобными грибами рода Candida. Антибиотикотерапия (особенно применение препаратов широкого спектра действия) нарушает обычные соотношения между различными представителями нормальной микрофлоры (подавление роста бактерий и усиленное раз-множение дрожжеподобных грибов) и способствует активации Candida и их распространению у ослабленных больных. При длительной антибиотикотерапии для предотвращения кандидоза совместно назначают и противогрибковые препараты. Авитаминозы. При проведении антибиотикотерапии есть основания ожидать развития вторичного авитаминоза группы В и витамина К, которые необходимо профилактировать назначением соответствующих препаратов. Обострение заболевания. Может наступить при улови, что заболевание вызвано Гр(-) возбудителем, а для лечения использовался бактериоцидный антибиотик. В результате массовой гибели возбудителя в организм больного будет поступать большое количество эндотоксина (ЛПС клеточной стенки Гр (–) м.о.). Это приведет к обострению заболевания и даже развитию эндотоксического шока. 1. 99 Использованная литература: 1. Борисов Л.Б. Медицинскапя микробиология, вирусология, иммунология.- М., 2006., 736с. 2. Рудаков Н.В. Краткий курс лекций по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. В 2 частях: Учебное пособие. - Омск, 2002. Интернет ресурсы: 1. 2. 3. 4. 5. 6. nmu-S.net > loag mikrobiologija / 16-1-0-247 www mmbook. ru Северо-запад medstudents. ru > catory / mbio/ mbiotextbookc www. Colibri. ru Евразия images. yandex. Ru > микробиология, учебник
