МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И.ПИРОГОВА» (ФГБОУ ВО РНИМУ ИМ. Н.И.ПИРОГОВА МИНЗДРАВА РОССИИ) КАФЕДРА БИОХИМИИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ЛЕЧЕБНОГО ФАКУЛЬТЕТА В.В. Давыдов, О.С. Комаров Биохимия нервной ткани Учебно-методическое пособие Под общей редакцией проф. А.В. Шестопалова Москва, 2018 1 УДК 577.1 (075.8) ББК 28.67я73 Д 13 Составители: д.м.н., профессор Давыдов В.В., д.б.н., профессор Комаров О.С. Рецензенты: С.А.Мошковский – зав. кафедрой биохимии МБФ ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России, д.б.н., профессор РАН; Т.П.Вавилова – зав. кафедрой биохимии Московского государственного медикостоматологического университета имени А.И.Евдокимова, д.м.н., профессор; Рекомендовано к печати ЦКМС ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России Давыдов В.В., Комаров О.С. Биохимия нервной ткани. Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы студентов по специальности «Лечебное дело» // ФГБОУ ВО РНИМУ имени Н.И.Пирогова Минздрава России. – М.: Издательство «Белый Ветер». – 2018. – 56 С. : илл. ISBN978-5-88458-370-2 Пособие «Биохимия нервной ткани» предназначено для студентов медицинских вузов, обучающихся по специальности «Лечебное дело». Задача пособия помочь студентам овладеть сложным материалом курса биохимии, в части биохимии нервной ткани. В пособии рассмотрены особенности метаболизма головного мозга и механизмов передачи нервных импульсов между окончаниями нервных клеток. В пособии представлены вопросы для проверки уровня знаний, описаны лабораторные работы по данному разделу биохимии для выполнения на практических занятиях, даны ситуационные задачи по данному разделу биохимии и тестовые задания. В конце пособия представлен список литературы, который может быть использован для углубленного изучения вопросов темы. Пособие составлено в соответствии с действующим ФГОС по специальности «Лечебное дело». Под общей редакцией д.м.н. проф. А.В. Шестопалова, заведующего кафедрой Биохимии и молекулярной биологии лечебного факультета. ISBN978-5-88458-370-2 УДК 557.1 (075.8) ББК28.67я73 © Давыдов В.В., Комаров О.С., 2018 2 Содержание: Введение ……………………………………………………………….. 4 1. Особенности химического состава нервной ткани………………. 5 1.1. Белки, пептиды и аминокислоты нервной ткани……………….. 5 1.2. Липиды нервной ткани…………………………………………… 15 1.3. Углеводы нервной ткани ………………………………………… 20 2. Структура миелина……………………………………………….... 20 3. Особенности метаболизма головного мозга……………………… 24 4. Механизм передачи нервного импульса между окончаниями нервных леток…………………………..……………………………… 27 5. Нарушение метаболизма нейромедиаторов при психических заболеваниях…………………………………………………………… 34 6. Биохимические аспекты памяти…………………………………… 35 Вопросы для проверки знаний…………………………………..…… 39 Лабораторные работы…………………………………………………..41 1. Определение уровня суточной экскреции катехоламинов (адреналина, норадреналина)……………………………….….41 2. Определение концентрации серотонина в крови……………. 44 Ситуационные задачи…………………………………………………. 48 Тесты………………………………………………………………….….50 Список литературы……………………………………………………...56 3 ВВЕДЕНИЕ По химическому составу нервная ткань сильно отличается от других тканей организма человека. Это связано с существованием гематоэнцефалического барьера – особого образования, которое обеспечивает избирательный транспорт веществ к мозгу из крови и в обратном направлении. Для головного мозга характерно высокое содержание воды. Причем оно значительно выше в сером веществе (до 80%), чем в белом (до 70%). В нервной ткани в достаточно высоком количестве присутствуют различные органические (аминокислоты, пептиды, белки, углеводы, липиды, органические кислоты) и минеральные вещества. 4 1. Особенности химического состава нервной ткани 1.1. Белки, пептиды и аминокислоты нервной ткани Для нервной ткани характерно высокое содержание белков. Однако содержание белков в ней меньше, чем в других тканях (т.н. в мышечной или в печени). В значительно большем количестве они присутствуют в сером, чем в белом веществе. Среди белков нервной ткани выделяются простые и сложные белки. К простым относятся: • нейроальбумины (простые, растворимые белки. В небольшом количестве встречаются в свободном виде, широко используются для образования сложных белков, соединяясь с углеводами, липидами и пр.); • нейроглобулины (составляют основную массу растворимых белков нервной ткани. Значительная их часть входит в состав сложных белков); • основные (катионные) белки – гистоны и некоторые негистоновые белки; • нейросклеропротеины (нерастворимые белки, которые локализуются преимущественно в белом веществе и выполняют опорную функцию. Представлены нейроколлагенами, нейростроминами и нейроэластинами); Особенностью белкового состава нервной ткани является то, что в ней в значительном количестве присутствуют сложные белки (липопротеины, гликолипиды, фосфопротеины и др.). К наиболее распространенным сложным белкам нервной ткани относятся гликопротеины и протеолипиды. Белки нервной ткани выполняют многочисленные функции: • каталитическую (белок 13-4-2, креатинкиназа ВВ); • структурную (опорную) – нейроколлагены; • транспортную – нейрофизины; • регуляторную (гормоны, нейротрофины); • сократительную – нейротубулин, нейростенин; • выступают в роли факторов адгезии нервных клеток (NCAM); 5 др. • обеспечивают генерацию и проведение нервного импульса и Для нервной ткани характерно присутствие особых тканеспецифических белков, не характерных для других тканей. Нейроспецифические белки играют важную роль в синаптической передаче, хранении и переработке поступающей в мозг информации, клеточном узнавании, рецепции, катализе и т.д. За счет этого они участвуют в формировании высших функций головного мозга, таких как память и обучение. В настоящее время известно около 60 представителей нейроспецифических белков. Среди них белок S-100, белок 14-3-2 и ряд других. Нейроспецифические белки встречаются в нейронах и глиальных клетках, где присутствуют в различных субклеточных структурах (цитоплазме, митохондриях и др.). Белок S-100 представляет собой сравнительно небольшой кислый растворимый белок с молекулярной массой около 20 КDа, состоящий из двух полипептидных цепей(рис. 1). В состав его полипептидной цепи входит большое количество моноаминодикарбоновых кислот (глутамат, аспартат). Белок S-100 присутствует в белом и сером веществе коры мозга, подкорковых образований и спинном мозге. В большом количестве он содержатся в глиальных клетках (астроцитах и олигодендроцитах). Молекула этого белка связана с мембранами синаптосом и обладает способностью связывать катионы кальция. При присоединении Са2+ белок изменяет конформацию полипептидной цепи. При этом открываются ионные каналы, через которые осуществляется трансмембранный перенос К+ и Na+. Рис. 1. Структура молекулы белка S-100 6 В исследованиях на экспериментальных животных показано, что содержание этого белка возрастает в отдельных подкорковых образованиях (т.н. гиппокампе) в процессе их обучения. Белок 14-3-2 имеет сравнительно небольшую молекулярную массу (46 – 50 КDа), состоит из 2 полипептидных цепей и находится только в нейронах. Является растворимым белком, содержащимся в цитоплазме нервных клеток. Встречается преимущественно в сером веществе больших полушарий. Белок 14-3-2 представляет собой нейроспецифический изофермент енолазы. Этот изофермент состоит из 2 одинаковых субъединиц –γ,γ. В других тканях молекула енолазы отличается по ее субъединичному составу и имеет структуру – α,α и α,γ. В настоящее время установлен факт изменения уровня нейроспецифических белков при развитии нервно-психических заболеваний. Показано, что их появление в крови и спинно-мозговой жидкости является своеобразным индикатором повреждения центральной нервной ткани. В настоящее время получены данные о том, что белок S-100 является онкомаркером. Его продукция и, как следствие того, концентрация в крови, значительно возрастают при меланоме. Особыми представителями нейроспецифических белков являются нейрофизины. Они обеспечивают транспорт и защиту от разрушения ряда биологически активных пептидов в ЦНС. Нейрофизины представляют собой семейство белков с небольшой молекулярной массой, полипептидная цепь которых включает в состав до 100 аминокислотных остатков. В состав миелиновых оболочек нервных проводников входит особый белок – протеолипид Фолча. Более 80% массы его молекулы представлено липидами. Этот белок даже экстрагируется из нервной ткани при помощи органических растворителей. В его состав входит до 60% аминокислот с неполярными радикалами. В качестве липидных компонентов он содержит цереброзиды, холестерол, сульфатиды и фосфолипиды. Протеолипид Фолча устойчив к действию протеолитических ферментов, за счет чего обладает высокой продолжительностью жизни. 7 Для белков нервной ткани характерен интенсивный метаболизм. Скорость их превращений зависит от функционального состояния нервной системы. По интенсивности обмена белки нервной ткани значительно превосходят белки других тканей. Помимо белков в структуру нервной ткани входят многочисленные олигопептиды – нейропептиды. В их состав входит от 2 до 60 аминокислотных остатков. С-концевые остатки нейропептидов часто амидированы. Пептиды нервной ткани проявляют высокую биологическую активность. Они способны изменять поведенческие реакции, принимать участие в формировании памяти и др. Подобные эффекты нейропептидов связаны с тем, что они выступают в роли нейромедиаторов и гормонов. К нейропептидам относятся сотни различных представителей, которые объединяются в 40 семейств. Среди них либерины и статины гипоталамуса, опиоидные пептиды, меланокортины, вазопрессин, окситоцин, панкреатические пептиды (нейропептид Y) и многие другие. Отдельные пептидные нейрогормоны (вазопрессин и окситоцин), синтезируются в форме крупных молекул белков – предшественников. В аксональном токе, в процессе их транспорта в 8 заднюю долю гипофиза из гипоталамуса, эти белки подвергаются ограниченному протеолизу и распадаются с образованием активных гормонов и нейрофизинов. Гормоны депонируются в задней доле гипофиза в комплексе с нейрофизинами и далее вместе с ними секретируются в кровь. До настоящего времени функция этих нейрофизинов окончательно не ясна. Среди представителей нейропептидов заслуживают особого внимания пептиды, взаимодействующие с опиоидными рецепторами и пептиды-антиоксиданты (энкефалины, эндорфины, карнозин, ансерин, глутатион и др.). Они часто содержат в своем составе необычные аминокислоты, которые не входят в состав белков (βаланин и др.). COOH COOH H2N CH2 CH2 CO HC NH CH CH2 NH CH2 CO N N CH3 CH2 N CH2 N NH2 карнозин H2N CH COOH (CH2) 2 CO NH CH CO CH2 NH CH2 ансерин COOH глутатион SH К опиоидным пептидам относятся энкефалины и эндорфины, которые образуются из общего предшественника – белка проопиомеланокортина, путем его ограниченного протеолиза эндопептидазами (рис. 2). Проопиомеланокортин представляет собой полипептид, состоящий из 241 аминокислотного остатка. Вместе с тем существуют и специальные гены, кодирующие энкефалины. 9 Рис. 2. Биологически активные продукты частичного протеолиза проопиомеланокортина (МСГ – меланоцитстимулирующий гормон; ЛПГ – липотропный гормон; КППГ – кортикотропинподобный пептид) На рисунке 3 представлена структура опиоидных пептидов. лейцин-энкефалин H2N-Tир-Гли-Гли-Фен-Лей-COOH метионин-энкефалин H2N-Тир-Гли-Гли-Фен-Мет-COOH β-эндорфинNH2-Тир-Гли-Гли-Фен-Мет-Три-Сер-Гли-Лиз-Сер-ГлнТри-Про-Лей-Вал-Три-Лей-Фен-Лиз-Асн-Ала-Иле-Иле-Лиз-Асн-АлаГис-Лиз-Лиз-Гли-Глн-COOH Рис. 3. Структура некоторых опиоидных пептидов мозга Все эти пептиды обладают морфиноподобным эффектом. В результате их взаимодействия с опиоидными рецепторами возникает чувство эйфории, аналгезия, изменяется тонус гладкой мускулатуры и понижается температура тела. Подобные пептиды являются важными компонентами антистрессорной защиты организма. В этой связи их секреция возрастает в условиях воздействия различных стрессоров. Помимо опиоидных пептидов при ограниченном протеолизе проопиомеланокортина в мозге образуется целый ряд пептидных гормонов – АКТГ, меланотропные гормоны и липотропины (рис. 2). В большом количестве в нервной ткани присутствуют и свободные аминокислоты. Причем их содержание значительно выше 10 такового в крови и спинномозговой жидкости. Это связано с особой ролью аминокислот в нервной ткани: • участием в синтезе нейропептидов и белков, • осуществлении межнейрональных связей, в качестве нейромедиаторов и нейромодуляторов, • энергетическом обеспечении нервных клеток и т.д. Для мозга характерно очень высокое содержание глутамата, глутамина, аспарагиновой кислоты и ГАМК. На их долю приходится 1/3 пула всех свободных аминокислот мозга. Особое положение среди свободных аминокислот нервной ткани занимает глутаминовая кислота. Здесь она принимает участие в обезвреживании аммиака, синтезе тормозного медиатора ГАМК, глутатиона и др. Глутаминовая кислота используется в качестве нейромедиатора и играет важную роль в энергетическом обмене мозга, в процессе трансаминирования превращаясь в промежуточный продукт цикла трикарбоновых кислот α-кетоглутаровую кислоту. Глутаминовая кислота образуется в мозге из α-кетоглутаровой в процессе ее восстановительного аминирования в реакции, катализируемой глутаматдегидрогеназой: Важное значение в реализации роли глутаминовой кислоты, как энергетического субстрата в нервных клетках играет ее окислительное дезаминирование в глутаматдегидрогеназной реакции. Процесс окислительного дезаминирования глутаминовой кислоты сопровождается образованием аммиака – токсического конечного продукта азотистого обмена. Высокую чувствительность к 11 нему проявляют именно нервные клетки. Повышение концентрации аммиака уже до 0,6 мМ сопровождается поражением мозга. Характерными проявлениями его поражения являются повышение внутричерепного давления, отек мозга и развитие коматозного состояния. COOH CHNH2 COOH CO CH2 + NH + НАДН+Н CH2 + НАД + H O 3 2 CH2 глутаматдегидрогеназа CH2 COOH COOH + альфа-кетоглутаровая к-та Одной из причин поражения мозга при увеличении в нем уровня аммиака, является стимуляция его использования для восстановительного аминирования α-кетоглутаровой кислоты с образованием амидов аминокислот в астроцитах. Следствием этого является уменьшение содержания в них глутаминовой кислоты и, наоборот – увеличение содержание глютамина в астроцитах. В результате возникновения подобных сдвигов в цитоплазме астроцитов резко повышается осмотическое давление. Это приводит к угнетению их функции. В результате нарушается трофика нейронов, а также развивается отек мозга и повышение внутричерепного давления. Важный вклад в повреждение мозга при интоксикации аммиаком вносит уменьшение содержания в нем глутаминовой кислоты. Эта аминокислота сама выступает в роли нейромедиатора, а также используется в качестве предшественника синтеза γаминомасляной кислоты – медиатора тормозных синапсов ЦНС. Понижение уровня этих нейромедиаторов предопределяет нарушение нейрофизиологических процессов в мозге. Помимо этого, глутаминовая кислота играет важную роль в энергетическом обеспечении нервных клеток. Поэтому уменьшение ее содержания способствует понижению уровня энергетического 12 обеспечения нейронов и, соответственно, торможению их специфический функций. Вместе с тем, вовлечение глутаминовой кислоты в реакцию амидирования, катализируемую глутаминсинтетазой, играет ключевую роль в детоксикации аммиака в мозге: Большая часть глутаминсинтетазы находится в глиальных клетках. Глутамин способен свободно проникать через клеточные мембраны. Поэтому далее он транспортируется в печень, где амидная группа отщепляется в форме свободного аммиака в глутаминазной реакции. Освободившийся при этом аммиак далее подвергается детоксикации в цикле мочевины. COOH COOH CHNH2 CHNH2 CH2 CH2 + H2O CH2 глутаминаза + NH3 CH2 CONH2 COOH глутамин глутамат Образовавшийся в глиальных клетках глутамин далее может транспортироваться в нейроны. Здесь он в глутаминазной реакции дезаминируется в глутамат, который может использоваться в качестве энергетического субстрата или для синтеза ГАМК. Таким образом, в нервной ткани глутамин выступает в качестве транспортной формы глутаминовой кислоты. С метаболизмом глутаминовой кислоты в нервной ткани связано существование особого метаболического процесса – ГАМК-шунта (рис. 4). 13 COOH COOH CO COOH + CH2 CHNH2 CHNH2 CH2 CH3 COOH аланин CH2 аланинаминотрансфераза альфа-кетоглутарат COOH CO + CH2 CH3 COOH пируват глутамат COOH CHNH2 CHNH2 CH2 CH2 глутаматдекарбоксилаза CH2 COOH COOH глутамат ГАМК O CHNH2 COOH CH2 CO + COOH C H + CH2 CH2 CH2 ГАМКтрансаминаза CH2 COOH COOH я нтарный альфа-кетополуальдегид глутарат CH2 COOH ГАМК + CO2 CH2 CHNH2 CH2 CH2 COOH глутамат O C CH2 CH2 H НАД + НАДН+Н CH2 + H2O COOH я нтарный полуальдегид COOH дегидрогеназа янтарного полуальдегида CH2 COOH сукцинат Рис. 4. Реакции ГАМК-шунта Как видно из представленного рисунка, α-кетоглутаровая кислота, которая образуется в качестве промежуточного продукта в цикле трикарбоновых кислот, может подвергаться 14 трансаминированию с образованием глутаминовой кислоты. Далее она подвергается декарбоксилированию с образованием тормозного медиатора – γ-аминомасляной кислоты (ГАМК). ГАМК окисляется в янтарный полуальдегид, который в дальнейшем используется для образования янтарной кислоты – одного из промежуточных продуктов цикла Кребса (рис. 5). Рис. 5. Схема ГАМК-шунта в нервных клетках (1– аланинаминотрансфераза, 2 – глутаматдекарбоксилаза, глутаматдекарбоксилаза 3 – ГАМК-трансаминаза, 4 – дегидрогеназа янтарной кислоты) Скорость превращений в ГАМК шунте возрастает при экстремальных состояниях (гипоксии, психическом перенапряжении и др.). 1.2. Липиды нервной ткани Характерной особенностью строения нервной ткани является присутствие в ней большого количества липидов. Их содержание в белом веществе мозга может достигать 50 %, а в сером – 25 % от их сухой массы. Высокое содержание липидов в нервной ткани связано с выполняемыми ими функциями: • структурной (образуют нейрональные мембраны мембраны); • диэлектрической (обеспечивают электрическую изоляцию нервных проводников); 15 • регуляторной (предшественники синтеза биологически активных веществ). К наиболее распространенным липидам нервной ткани относятся фосфолипиды, гликолипиды и холестерол. В мозге присутствует значительное количество фосфолипидов, к числу которых относятся глицерофосфатиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин) и сфингофосфатиды (сфингомиелин) (Рис. 6). CH2 O CO R CH2 O R OC O CH O CH2 O P O OH CH3 O + CH2 O P O CH2 CH2 N CH3 OH CH CH2 CH2 NH2 фосфатидилэтаноламин CH2 O R OC O CH CO R R OC O CH фосфатидилхолин 3 CO R CH2 O O CH2 O P O OH R OC O CH CH2 CH NH2 COOH CO R O CH2 O P OH OH фосфатидилсерин фосфатидная кислота OH HC CH CH NH CH CO (CH2)12 R CH3 O CH2 O P OH O CH2 CH2 N(CH3)3 сфингомиелин Рис.6. Наиболее распространенные липиды нервной ткани На долю фосфолипидов в сером веществе приходится до 70%, а в белом – до 50% от суммарной массы липидов. Все они участвуют в формировании липидного бислоя нейрональных мембран. Помимо фосфолипидов для нервной ткани характерно присутствие плазмалогенов – производных фосфолипидов, в состав которых 16 вместо одного остатка высшей жирной кислоты входит остаток высшего альдегида. CH2 O R CO R CH CH O CH CH3 O + CH2 O P O CH2 CH2 N CH3 OH CH3 плазмалоген В нервной ткани практически не встречаются триацилглицеролы и свободные жирные кислоты, а эфиры холестерола содержатся только в участках миелинизации нервных волокон. CH3 CH3 HC CH2 CH2 CH2 CH CH3 холестерол HO CH3 CH3 HC CH2 CH2 CH2 CH CH3 эфир холестерола O R CO Из гликолипидов в мозге широко присутствуют цереброзиды, сульфатиды и ганглиозиды. Все они включают в свой состав церамидную часть, которая состоит из сфингозина и связанного с ним остатка высшей жирной кислоты. 17 церамид В цереброзидах церамид связан с остатками моносахаридов – галактозы или глюкозы. К другим представителям гликолипидов относятся сульфатиды. Они представляют собой производные цереброзидов, в состав углеводного компонента которых входят остатки серной кислоты. OH H HC C CH2 O OH H HC C CH2 O CH2 CH CO CH CO OH OH OH R (CH2)12 OH CH3 цереброзид O CH NH O CH NH CH2 OSO3 OH OH R (CH2)12 OH CH3 cульфатид Цереброзиды и сульфатиды локализуются преимущественно в миелиновых оболочках, а ганглиозиды входят в состав нейрональных мембран. Ганглиозиды являются высокомолекулярными веществами. Их углеводный компонент представлен ветвистым полисахаридом. Церамидная часть молекулы ганглиозида жестко встроена в липидный бислой мембраны нервных клеток (рис. 7). 18 Рис. 7. Топография ганглиозида в нейрональной мембране Ганглиозиды обладают многочисленными свойствами. Они участвуют в регуляции уровня поляризации нейрональных мембран (проявляя способность связывать катионы кальция и регулировать обладают способностью активность Na+-K+-АТФазы), иммунохимического узнавания, способствуют связыванию отдельных нейронов в своеобразные ансамбли, что имеет отношение к хранению и передаче информации, обеспечивают межклеточные взаимодействия и др. Большое количество ганглиозидов находится в синаптических мембранах. Для нервной ткани характерен более широкий спектр жирных кислот чем для других тканей организма. Более того, их содержание в нервной ткани выше, чем в других тканях. В ней встречается более 50 их представителей, относящихся к насыщенным и ненасыщенным жирным кислотам, в состав которых входит от 12 до 26 углеродных атомов. В молекулу ненасыщенных жирных кислот может входить от 1 до 6 двойных связей. Для нервной ткани характерно сравнительно высокое содержание полиеновых длинноцепочечных жирных кислот (20:4; 22:5; 22:6 и др.).Важной особенностью жирнокислотного состава мозга является присутствие в нем большого количества их гидроксипроизводных. Последние могут входить в структуру цереброзидов и сульфатидов. Жирнокислотный состав нейрональных мембран подвержен высокой лабильности. Он изменяется под влиянием различных 19 внешних и внутренних факторов. Это, в свою очередь, предопределяет высокую лабильность нейрональных мембран и их способность к адаптации в меняющихся условиях. 1.3. Углеводы нервной ткани Наиболее распространенным углеводом нервной ткани является глюкоза. Мозг активно потребляет глюкозу из крови. Известно, что ткань головного мозга потребляет до 70% эндогенной глюкозы, которая образуется в организме в процессе глюконеогенеза. Все это определяется тем, что глюкоза представляет собой основной энергетический субстрат, используемый нервными клетками. Содержание гликогена в нем невелико, всего около 0,1% от общей массы углеводов. Однако интенсивность его обмена в мозге очень высока. В мозге новорожденных уровень этого полисахарида втрое выше такового у взрослых. 2. Структура миелина Нервные клетки (нейроны) относятся к возбудимым клеткам. Они способны генерировать электрический потенциал на клеточной мембране и передавать его на соседние клетки. Именно с этими процессами связаны высшие функции головного мозга. Нейроны имеют многочисленные отростки (рис. 8). Каждый нейрон коры больших полушарий головного мозга контактирует с 10000 других нейронов. Все они получают электрические импульсы через дендриты и передают их на соседние клетки через аксоны. Длина аксона может достигать 1 метра. Снаружи он часто покрыт Шванновскими клетками, которые формируют на них миелиновую оболочку, многократно «наматываясь» на нервный проводник (рис. 9). Последняя включает в свой состав большое количество липидов, обеспечивающих эффективную электрическую изоляцию нервного проводника и проведение нервного импульса. 20 Рис. 8. Строение нейрона (по J. Koolman et al., 2005) Миелиновая оболочка не покрывает полностью поверхность всего аксона. На нем формируются сегменты миелиновых оболочек, между которыми остаются непокрытые миелином участки – перехваты Ранвье. Миелин представляет собой особую структуру, которая образована плотно упакованными мембранами глиальных (Шванновских) клеток, между которыми практически отсутствует цитоплазма. Учитывая мембранное происхождение миелина становится понятно, что основными его липидными компонентами являются фосфолипиды, гликолипиды и холестерол. Миелин является доминирующим компонентом белого вещества и составляет до 50% его массы. Около 75% компонентов миелина представлено липидами и лишь около 25% – белками. Среди белков следует выделить специфический для миелина протеолипид Фолча, на долю которого приходится до 1/3 всех белков миелина. Помимо этого белка, к специфическим белкам миелина относится кислый белок Вальгрема и основной белок. Основной белок появляется в нервной ткани перед началом миелинизации и принимает участие в инициации этого процесса. К белкам миелина относятся и некоторые ферменты – гидролаза эфиров холестерола, карбоангидраза, пептидазы, β-галактозидазы и др. Белки миелина очень медленно обмениваются. Период их полураспада составляет около 14 дней. 21 Рис. 9. Строение миелиновой оболочки (а – схема строения, б – миелиновая оболочка на электронной микрофотографии) в В качестве липидных компонентов миелина в нем значительных количествах присутствуют цереброзиды, сульфатиды и плазмалогены. В их состав входит большое количество оксипроизводных жирных кислот. Структура миелина в центральной и периферической нервной системе различается. Процесс образования миелина (миелинизация) происходит в разных образованиях мозга не в одно и тоже время. С максимальной скоростью он идет до рождения ребенка. Заканчивается миелинизация ко второму году жизни, хотя существуют данные о том, что этот процесс продолжается почти до 20 лет. Миелиновые нервные волокна проводят нервный импульс со значительно большей скоростью, чем немиелиновые. Нарушение процесса образования миелина приводит к тяжелому поражению ЦНС. Подобное состояние (демиелинизация) возникает при аутоиммунных заболеваниях и генетических дефектах. Одним из факторов, предрасполагающих к демиелинизации, относится дефицит витамина В12. 22 Витамин В12 Этот витамин в форме 5'-дезоксиаденозилкобаламина выступает в роли кофермента метилмалонил-КоА-мутазы, которая катализирует реакцию превращения метилмалонил-КоА в сукцинил– КоА (рис. 10). CH3 H C L - метилмалонил- КоА CO-SKoA COOH метилмалонил-КоА мутаза H2C CH2 CO-SKoA сукцинил-КоА COOH Рис. 10. Метилмалонил-КоА мутазная реакция 23 Характерным проявлением недостаточности витамина В12 служит появление неврологической симптоматики. Причиной ее возникновения служит нарушение миелинизации нервных волокон. В основе нарушения процесса миелинизации лежит накопление в нервных клетках метилмалонил-КоА. Этот метаболит тормозит синтез высших жирных кислот, необходимых для образования миелиновой оболочки нервных проводников. Включение в синтез жирных кислот метилмалонил-КоА приводит к образованию разветвленных жирных кислот, следствием чего становится нарушение структуры миелина. Возникновение очагов демиелинизации в мозге характерно для рассеянного склероза. 3. Особенности метаболизма головного мозга Функционирование головного мозга сопряжено с использованием значительного количества энергии. Наиболее высокую потребность в ней испытывают АТФ-зависимые процессы, связанные с функционированием транспортных АТФаз на нейрональных мембранах. Они используют до 70% всей образующейся в нервных клетках АТФ. Энергетическое обеспечение клеток головного мозга сопряжено с аэробными процессами. Мозг нуждается в поступлении большого количества кислорода. Хотя его масса составляет всего лишь 2% от массы тела, он потребляет около 20% всего поступающего в организм кислорода. Повышение функциональной активности мозга сопровождается увеличением скорости потребления им кислорода. С другой стороны угнетение функции мозга при наркозе приводит к снижению уровня потребления кислорода. Основным субстратом окисления головного мозга является глюкоза. Мозг потребляет до 60 % всей глюкозы организма. Причем потребление глюкозы серым веществом почти наполовину выше, чем белым. В нервных клетках глюкоза подвергается распаду в процессе аэробного гликолиза с вовлечением пирувата в процесс 24 окислительного декарбоксилирования с образованием ацетил КоА и распадом последнего в цикле трикарбоновых кислот (рис. (рис 11). Рис. 11. Стадии процесса аэробного распада глюкозы (ЦТК – цикл трикарбоновых кислот, ПВК – пировиноградная кислота) С реакциями цикла трикарбоновых кислот и окислительного декарбоксилирования пирувата тесно связан процесс терминального окисления (тканевого дыхания), как основной источник синтеза АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. В нейронах содержится крайне незначительное количество гликогена. Поэтому функционирование головного мозга сильно зависит от поступления в него глюкозы из крови крови. В условиях гипогликемии (голодание, тяжелая физическая работа работа, передозировка инсулина), содержание АТФ в нервных клетках быстро понижается. Следствием того может быть возникновение коматозного состояния (гипогликемическая кома). К аналогичным последствиям приводит нарушение поступления в мозг и кислорода. кислорода Кратковременные прекращение поступления кислорода к мозгу приводит к обратимым 25 нарушениям со стороны его функционирования. Однако при длительной кислородной недостаточности эти изменения становятся необратимыми и приводят к смерти. В качестве еще одного энергетического субстрата в мозге используется глутаминовая кислота. Это связано с тем, что она легко подвергается трансаминированию с образованием α-кетоглутаровой кислоты, которая далее вовлекается в цикл трикарбоновых кислот. При голодании нервные клетки могут использовать кетоновые тела в качестве дополнительного субстрата окисления. Особенно велико значение этого субстрата окисления на ранних этапах онтогенеза. Небольшая часть глюкозы в мозге (до 5%) используется в процессе пентозофосфатного окисления. Скорость этого процесса в нервной ткани сравнительно не высока, по сравнению с таковой в печени и жировой ткани. Однако пентозофосфатный путь распада глюкозы играет в ней важную роль. Она связана с поддержанием в нервных клетках пула восстановленного НАДФ, который необходим для процессов липогенеза. Его скорость в нервной ткани определяется соотношением окисленного и восстановленного НАДФ. Интенсивность пентозофосфатного пути окисления глюкозы более высока в сером, чем в белом веществе мозга. Высокая интенсивность аэробных процессов в мозге обусловливает в нем интенсивный синтез АТФ. При этом содержание данного макроэргического фосфата находится на его уровне в других тканях. В тоже время скорость обмена АТФ в мозге значительно выше. Другим макроэргическим фосфатом нервной ткани является креатинфосфат. Его концентрация вдвое выше, чем АТФ. Считается, что креатинфосфат и его метаболит креатин формируют своеобразный энергетический буфер в нервных клетках, который позволяет в некоторых ситуациях стабилизировать уровень АТФ. Это связано с тем, что креатинфосфат может переносить свою макроэргическую фосфатную группу на АДФ в креатинкиназной реакции: креатинфосфат + АДФ креатин + АТФ креатинкиназа 26 OH O H2N C NH COOH N C NH OH N CH3 CH2 P N CH3 CH2 + АТФ креатинкиназа креатин + АДФ COOH креатинфосфат В нервных клетках существует несколько изоферментов креатинкиназы. Все они принимают участие в переносе АТФ от места его синтеза (в митохондриях) к месту активного использования (нейрональной мембране). Эта система транспорта энергии напоминает таковую в мышечных клетках. Ее существование позволяет с большей эффективностью использовать АТФ в нейронах для обеспечения электрофизиологических процессов на нейрональных мембранах, сопряженных с функционированием мембранотранспортных АТФаз. В нервной ткани присутствует тканеспецифический изофермент креатинкиназы – ВВ-креатинкиназа. При поражениях мозга (геморрагических инсультах и травмах мозга) его содержание в крови и спинно-мозговой жидкости существенно возрастает. В нервной ткани выявляются и некоторые особенности обмена липидов. Для нее характерна высокая скорость биосинтеза высших жирных кислот. Причем в митохондриях клеток головного мозга практически не происходит распада высших жирных кислот в процессе β-окисления. В тоже время для нервной ткани характерен процесс α-окисления жирных кислот, с которым связан процесс распада в мозге жирных кислот с разветвленным радикалом. Для мозга характерна высокая скорость синтеза холестерола, особенно в период его формирования. С возрастом она существенно снижается. Механизм передачи нервного импульса между окончаниями нервных клеток Перенос электрического импульса между нервными клетками происходит через нервные окончания – синапсы (рис. 19). 4. 27 В ЦНС встречаются разные типы синапсов. Однако все они построены по одному принципу. В структуру синапса входят пре- и постсинаптические мембраны, а между ними находится синаптическая щель. В пресинаптическом нервном окончании содержатся специальные мембранные пузырьки, содержащие нейромедиатор. Рис. 19. Строение синапса Нейромедиаторы представляют собой вещества, которые обеспечивают передачу нервного импульса через синапс. Все они подразделяются на: • возбуждаюшие медиаторы (адреналин, норадреналин, ацетилхолин и др.); • тормозные медиаторы (глицин, ГАМК и др.). Нейромедиаторы могут быть представлены: • аминокислотами (глутамат, глицин, ГАМК и др.); • биогенными аминами (катехоламины, серотонин); • пептидами (энкефалины). В различных синапсах используются различные медиаторы. По этому признаку синапсы подразделяются на адренэргические, дофаминэргические, серотонинэргические и холинэргические: 1. В адренергических синапсах в качестве медиатора используется норадреналин. Предшественником синтеза норадреналина и других катехоламинов (ДОФамина и адреналина) является тирозин. Как видно из рисунка 20, тирозин первоначально подвергается окислению в реакции катализируемой тирозинмонооксигеназой с образованием диоксифенилаланина. Данный энзим представляет собой монооксигеназу со смешанной функцией, использующую 28 тетрагидробиоптерин в качестве кофермента. Реакция, катализируемая этим ферментом, лимитирует скорость всего процесса синтеза катехоламинов. NH2 CH2 CH COOH тирозин HO O2 тирозин гидроксилаза тетрагидробиоптерин дигидробиоптерин NH2 HO CH2 CH COOH HO диоксифенилаланин ДОФАдекарбоксилаза CO2 HO NH2 CH2 CH2 HO ДОФамин ДОФаминоксидаза O2 S-аденозил метионин HO HO CH S-аденозил гомоцистеин CH2 NH2 OH норадреналин HO HO N-метил трансфераза CH OH CH2 NH CH3 адреналин Рис. 20. Образование катехоламинов из тирозина в нервной ткани Функционирование ДОФаминоксидазы (ДОФамингидроксилазы) требует присутствия аскорбиновой кислоты, которая необходима для поддержания в восстановленном состоянии атома меди, входящего в структуру его активного центра. 2. В дофаминэргических синапсах в качестве медиатора используется дофамин: 29 HO NH2 HO CH2 CH2 ДОФамин 3. В серотонинергических синапсах в качестве медиатора используется серотонин: CH2 CH2 NH2 HO NH серотонин Предшественником серотонина является аминокислота триптофан. На рисунке 21 показана последовательность реакций в которых она превращается в серотонин. COOH CH2 CH NH2 NH триптофангидроксилаза триптофан O2 тетрагидробиоптерин дигидробиоптерин H2O НАДФН+Н + дигидробиоптерин редуктаза НАДФ COOH CH2 CH NH2 HO NH 5-гидрокситриптофан 5-гидрокситриптофандекарбоксилаза CH2 CH2 NH2 HO NH серотонин +CO2 Рис. 21. Образование серотонина из триптофана в нервной ткани 30 Следует заметить, что фермент триптофангидроксилаза катализирует процесс гидроксилирования триптофана по механизму, аналогичному гидроксилированию фенилаланина ферментом фенилаланин-4-гидроксилазой. Образовавшийся при этом 5гидрокситриптофан далее подвергается декарбоксилированию при помощи 5-гидрокситриптофан-декарбоксилазы. В состав этого фермента в качестве простетической группы входит пиридоксальфосфат. В шишковидной железе мозга серотонин подвергается дальнейшим превращениям, связанным с его последовательным метилированием и ацетилированием, в результате которых образуется гормон мелатонин: CH3 CO CH2 CH2 NH H3C O NH мелатонин Этот гормон принимает участие в регуляции циркадных ритмов в организме и обладает выраженными антиоксидантными свойствами. В процессе онтогенеза его продукция значительно снижается, что выступает в качестве одной из причин понижения адаптационных свойств организма при старении. 4. В холинэргических синапсах в качестве медиатора используется ацетилхолин: CH3 + C O CH2 CH2 N CH3 CH3 O H3C Синтез ацетилхолина происходит из ацетил-КоА и холина в реакции которая катализируется холинацетилтрансферазой (рис. 22): 31 Рис. 22. Синтез ацетилхолина Важным источником ацетил-КоА для синтеза этого медиатора является глюкоза. В аэробных условиях она распадается с образованием пировиноградной кислоты, которая далее подвергается окислительному декарбоксилированию в пируватдегидрогеназной реакции с образованием ацетил-КоА. Помимо указанных выше, существует еще целый ряд других синапсов, в которых в качестве медиаторов используются аминокислоты и их производные (глицин, глутамат, ГАМК, гистамин и др.), энкефалины и др. На постсинаптической мембране находятся рецепторы к нейромедиатору. В том случае, когда электрический импульс достигает пресинаптической мембраны, в ней открываются вольтажзависимые Са-каналы. При этом возникают условия для выделения медиатора в синаптическую щель путем экзоцитоза. Диффундируя через синаптическую щель, молекулы медиатора специфически связываются с рецепторами на постсинаптической мембране. Рецепторы к нейромедиаторам представляют собой интегральные мембранные белки. В их структуре выделяется особый 32 участок – участок связывания медиатора, который обращен в синаптическую щель. Существуют различные типы рецепторов постсинаптической мембране (рис. 23). Среди них выделяются ионотропные и метаболические. Ионотропные рецепторы связаны с мембранными ионными каналами. При образовании комплекса медиатора с этим типом рецепторов происходит открытие канала. В результате через него начинается ток ионов, в соответствие с характером их градиента на мембране. Это, в свою очередь приводит к деполяризации постсинаптической мембраны и возникновению потенциала действия. Подобный механизм обеспечивает передачу нервного импульса через синапсы, в которых в качестве медиатора используются ацетилхолин, глутамат и др. Рис. 23. Механизм переноса электрического импульса через синапс с ионотропными и метаболическими рецепторами Другой тип рецепторов – метаболические рецепторы. рецепторы Они связывают катехоламины (адреналин, норадреналин норадреналин, дофамин), серотонин и др. После образования комплекса нейромедиатора с 33 рецептором, происходит активация G-белка, расположенного на внутренней поверхности постсинаптической мембраны. Следствием этой активации становится образование и накопление в цитоплазме нервного окончания вторичных посредников (цАМФ, инозитолтрифосфата и др.). Под их влиянием происходит активация внутриклеточных протеинкиназ и, как следствие того, фосфорилирование целого ряда внутриклеточных белков, в результате чего происходит возникновение ответа со стороны постсинаптической нервной клетки. Его проявлением служит возникновение потенциала действии на постсинаптической мембране. После переноса нервного импульса через синапс, медиатор диссоциирует из комплекса с рецептором. Далее медиатор может подвергаться обратному захвату пресинаптическим нервным окончанием и депонироваться в мембранных пузырьках в аксоплазме. Часть освободившегося медиатора подвергается распаду в синаптической щели с помощью специальных ферментов: - ацетилхолин гидролизуется холинэстеразой, - адреналин – метилируется катехол-О-метилтрансферазой (КОМТ) или дезаминируется моноаминооксидазой. 5. Нарушение метаболизма нейромедиаторов при психических заболеваниях С нарушениями метаболизма нейромедиаторов связано возникновение различных психических заболеваний. Так, например, имеются сведения о том, что при болезни Альцгеймера имеет место торможение синтеза ацетилхолина и как следствие этого уменьшение его содержания в синапсах. При болезни Паркинсона возникает нарушение баланса между уровнем ацетилхолина и дофамина в определенных подкорковых образованиях головного мозга (черная субстанция и полосатое тело), что приводит к повышению их биоэлектрической активности и возникновению характерной клиники заболевания. В процессе развития шизофрении в мозге повышается уровень дофамина. Одновременно с этим в его подкорковых структурах 34 изменяется содержание других нейромедиаторов (серотонина, глутамата и ГАМК). В последнее время установлена роль изменений со стороны нейромедиаторных систем мозга в развитии депрессивных состояний и неврозов. Показано, что возникновение депрессий и расстройства сна могут быть связаны со снижением уровня серотонина в мозге. Одной из причин того становится дефицит синтеза фермента 5окситриптофан декарбоксилазы, участвующего в образовании этого нейромедиатора. Для лечения депрессивных расстройств в настоящее время широко используются антидепрессанты – лекарственные вещества, которые тормозят обратный захват серотонина в синаптической щели (флуокситин) или ингибируют их распад в процессе окислительного дезаминирования. Помимо серотонина в формировании депрессивных состояний важную роль играет понижение с уровня норадреналина в мозге. Лечение подобных форм депрессий связано с использованием особой группы антидепрессантов, к которой относятся лекарственные препараты, тормозящие обратный захват этих медиаторов в синаптической щели (мапротилин), а также ингибиторы моноаминооксидазы – фермента, принимающего участие в распаде адреналина и норадреналина (ипрониазид, ниаламид). В последние годы появились убедительные данные в пользу того, что нарушение баланса нейромедиаторов в мозге является одной из причин возникновения алкоголизма и наркоманий. 6. Биохимические аспекты памяти О биохимических механизмах памяти к настоящему времени известно совсем немного, несмотря на огромный научный и практический интерес к этому вопросу. По-видимому, первоначально поступающая информация обрабатывается в афферентных системах коры. Далее она перекодируется с помощью системы готовых сенсорных, образных и семантических кодов. Наконец, непосредственно за кодированием следует формирование и консолидация следа, вследствие чего информация организуется в 35 устойчивую физиологическую систему, доступную для последующего воспроизведения. Определенную роль в консолидации памяти играют нейропептиды – белки, образующиеся в центральной или периферической нервной системе и регулирующие физиологические функции организма человека и животных. Нейропептиды содержат от 2 до 50-60 аминокислотных остатков. Показано, что пептиды могут находиться в вакуолях синаптических бляшек в качестве сопутствующего медиатора. Например, вместе с норадреналином часто выделяется нейропептид У, опиоидные пептиды, соматостатин. Дофамин часто выделяется окончаниями аксонов вместе с холецистокинином, энкефалином; ацетилхолин - с вазоактивным интестинальным пептитодом (ВИП), энкефалином, люлиберином; серотонин - с веществом Р, тиреолиберином, холецистокинином. Избыточное выделение пептида-спутника всегда наблюдается при усилении активности нейронов, которое наблюдается во время активной обработки информации. Как влияют пептиды на клеткумишень? Пептид-спутник может значительно повысить сродство рецептора постсинаптической мембраны к основному медиатору. Например, ВИП усиливает сродство к ацетилхолину более чем в 10 000 раз. Несомненный интерес в вопросе о роли пептидов в процессах памяти представляют опыты с АКТГ, меланостимулирующим гормоном, вазопрессином. Как выяснилось, они обладают способностью стимулировать запоминание при введении извне. Заметно влияют на обучение и память эндогенные опиатные пептиды - эндорфины и энкефалины. После открытия способа кодирования генетической информации в ДНК (генетической памяти) и успешного изучения иммунологической памяти были предприняты попытки отыскать молекулярные основы нейронной памяти. Согласно одной из гипотез биохимические процессы, протекающие на уровне протоплазмы, вызывают динамические изменения генома нейрона, и перестройку кода РНК, следствием чего является синтез адекватных для данной ситуации новых молекул белка - хранителей полученной 36 информации. Однако идея существования биохимических факторов, способных к сохранению и переносу информации, большинством исследователей воспринимается критически. В настоящее время считается, что гипотеза молекулярного кодирования индивидуального опыта не имеет прямых фактических доказательств. Несмотря на то, что установлена существенная роль нуклеиновых кислот и белков в механизмах обучения и памяти, предполагается, что принимающие участие в формировании новой ассоциативной связи РНК и белки специфичны лишь по отношению к функциональному изменению участвующих в процессе синапсов и неспецифичны по отношению к самой информации. Медиаторам — химическим посредникам в синаптической передаче информации — придается большое значение в обеспечении механизмов долговременной памяти. Основные медиаторные системы головного мозга принимают самое непосредственное участие в обучении и формировании энграмм памяти. Так, экспериментально установлено, что уменьшение количества норадреналина замедляет обучение, вызывает амнезию и нарушает извлечение следов из памяти. Различные медиаторы могут оказывать разные эффекты в процессах усвоения и хранения информации. Серотонин, например, ускоряет обучение и удлиняет сохранение навыков при положительном эмоциональном подкреплении (например, пищевом) Норадреналин ускоряет обучение в условиях применения отрицательного подкрепления (электрокожного). К веществам, которые могут временно ухудшать память, относятся: алкоголь, успокоительные и снотворные препараты, соединения брома, антидепрессанты, обезболивающие средства, лекарства от гипертонии, инсулин, лекарства от морской болезни, антигистаминные и антипсихотические препараты. Попытки найти анатомические, морфологические или биохимические корреляты памяти ещё раз показывают, что память нельзя рассматривать как нечто статичное, находящееся строго в одном месте или в небольшой группе клеток. Память существует в динамичной и относительно распределенной форме. При этом мозг 37 действует как функциональная система, насыщенная разнообразными связями, которые лежат в основе регуляции процессов памяти. 38 Вопросы для проверки знаний 1. Какие особенности химического состава нервной ткани вам известны? 2. Что такое нейроспецифические белки? Какова их функция? Какие нейроспецифические белки вам известны? Как нейроспецифические белки используются в медицине? 3. Что характерно для пептидов мозга? Какие функции они выполняют (поясните примерами)? 4. Что такое опиоидные пептиды? Как они образуются и какие функции выполняют? 5. Какова роль ГАМК в регуляции физиологических функций мозга? Как образуется ГАМК в нервной ткани? 6. Какая аминокислота занимает центральное положение среди других аминокислот в нервной ткани? 7. Что вам известно о липидах нервной ткани и их значении? 8. Что такое миелин и какую он имеет структуру? Какие заболевания сопровождаются демиелинизацией? 9. Почему при недостатке витамина В12 возникают условия для демиелинизации? 10. Какое значение имеет высокая скорость аэробных процессов для нервной ткани? Как можно объяснить факт высокой зависимости головного мозга от его обеспечения кислородом и глюкозой? 11. Какие процессы обеспечивают энергией клетки головного мозга? Что является основным энергетическим субстратом в нервных клетках? 12. В чем заключается роль креатинкиназной системы в нервной ткани? 13. Что такое синапс? Что вам известно о строении синапсов? Какие бывают синапсы? 14. Что такое нейромедиаторы? Классификация нейромедиаторов? 15. Какие заболевания сопровождаются нарушением обмена нейромедиаторов? Приведите примеры. 39 16. Почему в качестве антидепрессантов могут использоваться ингибиторы моноаминооксидазы и вещества, которые замедляют обратное всасывание медиаторов в пресинаптическое волокно? 40 ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ 1. Определение уровня суточной экскреции катехоламинов (адреналина, норадреналина) В основу метода положено количественное определение содержания флюоресцирующих продуктов окисления (адренолютина и норадренолютина) катехоламинов (адреналина и норадреналина) йодом. Реактивы: 1. Этилендиаминтетрауксусная кислота кристаллическая (ЭДТА). 2. Насыщенный раствор сульфата аммония. 3. Гидроксид алюминия Al(OH)3. Для его приготовления 50 г алюмоаммиачных квасцов растворяются при нагревании в 400 мл воды. После охлаждения добавляется по каплям при постоянном интенсивном встряхивании 40 мл 25% раствора едкого натрия. Через 15-20 минут полученная суспензия фильтруется через бумажный фильтр. Осадок промывается 1,5 – 2,0 л дистиллированной воды, снимается с фильтра и суспензируется в бидистиллированной воде. Объем суспензии доводится до 250 мл. 4. 1% спиртовый раствор фенолфталеина. 5. 4% раствор едкого натрия (4 г NaOH растворяется в 96 мл дистиллированной воды). 6. 25% раствор едкого натрия (25 г NaOH растворяется в 75 мл дистиллированной воды). 7. 30% раствор едкого натрия (30 г NaOH растворяется в 70 мл дистиллированной воды). 8. Раствор для промывания проб: перед исследованием к 250 мл бидистиллированной воды добавляется 5,0 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Полученный раствор подщелачивается под контролем индикатора (по фенолфталеину или индикаторной бумаге) до pH 8,0. 9. 1 н раствор серной кислоты (1 фиксанал доводится до 100 мл дистиллированной водой). 41 10. 1 н раствор соляной кислоты (1 фиксанал доводится до 100 мл дистиллированной водой). 11. 0,1 н раствор Na2S2O3 (79 г Na2S2O3 растворяется в 1 л дистиллированной воды). 12. 0,1 н раствор йода, из которого перед исследованием готовится 0,01 н раствор. 13. Ацетатный буфер pH 4,6 (к 52 мл 1 н уксусной кислоты добавляется 48 мл 1 н уксуснокислого натрия). Раствор хранится в холодильнике. 14. 50% раствор уксуснокислого натрия. 15. 1% раствор аскорбиновой кислоты (готовится непосредственно перед использованием). 16. Водный раствор эозина (1 мкг/мл). Готовится непосредственно перед использованием, разводится в 4 раза (0,25 мкг/мл). 17. Стандартные растворы адреналина (А) и норадреналина (НА) с концентрацией 1 мкг/мл. Для этого навески гормонов растворяются в нескольких каплях 1 н раствора соляной кислоты, после чего объемы доводятся бидистиллированной водой. Оборудование: • центрифуга; • облучатель ультрафиолетовый; • флюориметр. Ход определения: В центрифужные пробирки емкостью 45 – 50 мл, добавляется 30 мл мочи и 250 мг ЭДТА. Пробы интенсивно перемешиваются стеклянной палочкой до получения гомогенного раствора. Параллельно ставится контроль на реактивы. Для этой цели в пробирке смешивается 30 мл воды и 100 мг ЭДТА. В дальнейшем контрольные пробы обрабатываются аналогично опытным. Через 20 мин к пробам добавляется 0,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония, 3 мл предварительно взмученной гидроокиси алюминия и 2-3 капли фенолфталеина. При постоянном перемешивании пробы осторожно подщелачиваются 4% едкого 42 натрия до появления слабой розовой окраски. После этого добавляется еще 2 капли фенолфталеина и подщелачивание продолжается до появления стойкой розовой окраски (pH 8,5). Рекомендуется дополнительно контролировать реакцию среды по универсальной индикаторной бумаге, т.к. в отдельных случаях изменение окраски фенолфталеина в моче оказывается недостаточно четким. Определение рН при помощи индикаторной бумаги проводится, при исследовании интенсивно пигментированной мочи. После подщелачивания пробы центрифугируются в течение 5 минут при 2000 об/мин. Центрифугат удаляется, а к осадку добавляется 25 мл раствора для промывки (раствор №6). Пробы перемешиваются и повторно центрифугируются при тех же условиях. Процедура промывания осадка проводится дважды (на этом этапе работы пробы вместе с надосадочной жидкостью могут быть оставлены до следующего дня в холодильнике). После второго промывания осадка центрифугат тщательно сливается. В пробирку добавляется 7 мл бидистиллированной воды и после перемешивания еще 0,5 мл 1н серной кислоты. После этого пробы интенсивно перемешиваются и центрифугируются в течение 7 мин при 3000 об/мин. Полученный супернатант переливается в пробирки. Его количество обычно равняется 8,0 мл. В некоторых случаях надосадочная жидкость может опалесцировать, что не мешает дальнейшему ходу определения. Супернатант (элюат) разливается по 2 мл в три пробирки. Обработка проб начинается со второй и третьей пробирок. Во вторую пробирку добавляется 1 мл ацетатного буфера, а в третью – 0,5 мл 50% раствора ацетата натрия. Пробирки интенсивно встряхиваются, после чего в них добавляется по 5 капель 0,01н йода. Через 30 секунд в пробирки добавляется по 2 капли 0,1н Na2S2O3. Аналогичным образом обрабатываются вторая и третья пробирки. (В третьей пробирке может появляться муть, которая исчезает на следующем этапе и не мешает определению). Через 5 мин после начала обработки супернатантов, поочередно в каждую пробирку, начиная с первой, добавляется по 6 капель 1% раствора аскорбиновой кислоты. Пробы перемешиваются и 43 в них добавляется по 3 капли 30% раствора едкого натрия. Пробы вновь интенсивно перемешиваются и их объем доводится дистиллированной водой до 10 мл. Через 15 минут проводится определение интенсивности флюоресценции проб при длине волны возбуждения 360 нм, и длине волны эмиссии 510 нм. Расчет суточной экскреции катехоламинов: Расчет проводится по формуле: A = (a· 4 ·V / v1) ·K Где: А– содержание адреналина (А) или норадреналина (НА) (мкмоль/сутки); а – количество А или НА (мкг), рассчитанное по калибровочной кривой (мкг); V– объем суточной мочи (мл); v1– объем мочи, взятой для исследования (обычно 30 мл); K– коэффициент пересчета мкг в мкмоль (для А соответствует 5,5, а для НА - 5,9) Калибровочные кривые для А и НА строятся по их стандартным растворам, проведенным через все этапы исследования (объем стандартных растворов доводится водой до 30 мл, добавляется 100 мг ЭДТА и далее согласно описанной методике). 2. Определение концентрации серотонина в крови В основу количественного определения серотонина положено его свойство, вступать в реакцию с нингидрином с образованием продукта, обладающего характерной флюоресценцией. 44 Реактивы: 1. 1 н раствор хлорной кислоты (42,5 мл концентрированной хлорной кислоты доводится дистиллированной водой до объема 250 мл), в которой перед опытом растворяется аскорбиновая кислота (7 мг/мл). 2. 0,5 М боратный буфер (pH 10). 31,4 г борной кислоты растворяется в 1 л бидистиллированной воды и рН доводится до требуемого значения путем прибавления 67 мл 30% раствора едкого натрия. 3. 0,1% раствор тимолового синего в 20% этаноле. 4. 10% и 0,4% водные растворы едкого натрия. 5. Кристаллический хлористый натрий. 6. н-Бутиловый спирт, промытый 1 н раствором едкого натрия, 1 н раствором соляной кислоты и три раза дистиллированной водой. 7. 0,1 М боратный буфер (pH 10), насыщенный хлористым натрием и н-бутанолом (из расчета 50 мл н-бутанола на 500 мл буфера). Готовится путем разведения 0,5 М боратного буфера (реактив №2) из расчета 100 мл 0,5 М буфера и 400 мл бидистиллированной воды. 8. 0,05 М фосфатный буфер pH 7,0. 6,8 г KH2PO4 растворяется в 1 л бидистиллированной воды (0,05 М раствор KH2PO4). 8,90 г Na2HPO4·2Н2О растворяется в 1 л бидистиллированной воды (0,05 М раствор Na2HPO4). Буфер готовится путем смешивания приготовленных растворов до рН соответствующего 7,0. 9. Гептан, промытый 1н раствором едкого натрия, 1 н соляной кислотой и три раза дистиллированной водой. 10. 0,1 М раствор нингидрина (1,78 г нингидрина растворяется в 100 мл дистиллированной воды). 11. Серотонин-креатинин сульфат кристаллический (содержащий 43,6% серотонина основания). Маточный (100 мкг/мл) и рабочий (0,5 мкг/мл) растворы готовятся на 0,01 н растворе соляной кислоты. Устойчивы при хранении в холодильнике в течение 2-х месяцев. 12. Бидистиллированная вода. Оборудование: • центрифуга лабораторная; 45 • шуттель-аппарат; • флюориметр. Ход определения: Кровь смешивается с равным объемом 1 н хлорной кислоты и в течение 15 минут подвергается встряхиванию на шуттель-аппарате. После этого пробы центрифугируются в течение 30 минут при 3000 об/мин. Прозрачный супернатант, содержащий 0,1 – 0,9 мкг серотонина, помещается в стеклянные баночки с притертыми пробками объемом 50 мл. При небольшом объеме супернатанта сюда же добавляется 0,5 н раствор хлорной кислоты (суммарный объем должен быть в пределах от 1 до 8 мл), аскорбиновая кислота (в количестве около 14 мг в пробу), а затем еще 0,5 мл 0,5 М боратного буфера и 2 капли тимолового синего. После этого производится подщелачивание с помощью 10% и 0,4% растворов едкого натрия до рН 9,5 – 10,5. Окончательный контроль рН проводится при помощи универсальной индикаторной бумаги или pH–метра. К пробам с подведенным рН добавляется порошок хлористого натрия из расчета 1 г на мл супернатанта (безбелкового экстракта) и 15 мл н-бутанола. Пробы интенсивно встряхиваются в течение 15 минут на шуттель-аппарате. После разделения фаз, верхняя органическая фаза количественно переносится в другую баночку, содержащую 2,6 мл фосфатного буфера и 15 мл гептана. Пробы вновь интенсивно встряхиваются в течение 10 минут. Содержимое переливается в стеклянную центрифужную пробирку и центрифугируется в течение 10 минут при 1000 об/мин. Отбирается 2,4 мл водной фазы, и переносится в чистую сухую пробирку. Сюда же добавляется 0,1 мл раствора нингидрина. Пробы перемешиваются и на 30 минут помещаются в термостат с температурой 75оС. Через час после этого проводится измерение интенсивности их флюоресценции при длине волны возбуждения 360 нм и длине волны эмиссии 510 нм. 46 Параллельно ставятся контрольные пробы, для приготовления которых вместо безбелкового экстракта (супернатанта) используется соответствующий объем хлорной кислоты. Расчет уровня серотонина проводится по калибровочной кривой. Для ее построения готовится ряд разведений серотонина с концентрацией 0,5; 1 и 2 мкг/мл. Приготовленные стандартные растворы обрабатываются так же, как и опытные пробы. По результатам измерения оптической плотности стандартных проб строится калибровочная кривая. Расчет концентрации серотонина в крови (мкмоль/л) Концентрация серотонина рассчитывается по формуле: (2 ·0,62·X / 0,62 ·k·v) · 5,23 = (2 ·X / k·v) ·5,23 Где: 2 – разведение крови хлорной кислотой; X – интенсивность флюоресценции пробы; к – флюоресценция стандартного раствора, содержащего 1 мкг серотонина; v – объем хлорного экстракта крови, взятого на исследование; 0,62 – поправка на объемы бутанола и фосфатного буфера, используемые на последующих этапах метода (10/15 ·2,4/2,6 = 0,62); 5,23 – коэффициент пересчета мкг серотонина в мкмоли. 47 Ситуационные задачи 1. У людей, питающихся в основном белым рисом (без оболочки), развивается поражение нервной системы, полиневриты, ухудшение аппетита, сна, раздражительность, снижение психической и физической работоспособности. В современном обществе заболевание встречается редко. С недостатком какого витамина связано это заболевание? Какие виды обмена регулирует кофермент на основе этого витамина? Какой метаболит накапливается при дефиците этого витамина в крови и нервной системе? Какое заболевание имеет эту характерную симптоматику? применение аминокислоты глицин, как 2. Общеизвестно самостоятельного лекарственного средства. В тоже время, нарушения в функционировании нервной ткани сопровождаются повышенной концентрацией глицина в моче. Каково биохимическое обоснование применения глицина как фармацевтического препарата в неврологии? 3. Считается, что своевременное применение фибринолитиков, разрушающих тромб, облегчает клиническую картину инсульта. Но часть нервных клеток, несмотря на это, все-таки погибает. Как объяснить это явление? Какие изменения происходят в нервной ткани при инсульте, в частности, при ишемическом? 4. Симптомами рассеянного склероза являются затруднения при ходьбе, рассеянность, нарушение зрительных функций, избирательная потеря чувствительности. Объясните, с учетом ваших знаний о составе и функциях миелина, его роль в развитии перечисленной симптоматики. 5. Больные, склонные к депрессивным состояниям, раздражительности, перепадам настроения получают от врачейдиетологов и неврологов рекомендации употреблять продукты, богатые триптофаном (шоколад, бананы, мясо, икра). На чем основаны эти рекомендации? 6. Адренергическими называются нейроны, в синапсах которых в качестве медиаторов работают производные катехоламинов. Что 48 это за вещества? Как они функционируют, из чего синтезируются (схема)? 7. Роль глутаминовой кислоты, как многофункционального и активного метаболита, обсуждается давно. Ее используют и как пищевую добавку, и как усилитель вкуса. В нашей стране был создан «Глутамевит» - витаминный антистрессовый препарат. Но есть и противники широкого применения глутамата, так как в ряде случаев возникает неврологическая симптоматика в виде тошноты и головной боли. Опишите возможные метаболические эффекты глутамата и его роль в развитии описанных явлений. 8. Нервная ткань имеет свои структурные и метаболические особенности, в частности в ней в больших концентрациях обнаруживаются некоторые аминокислоты или их прямые производные. О каких аминокислотах и их метаболических продуктах идет речь? Вспомните об их нейромедиаторных функциях. 9. Почему нервная ткань и прежде всего мозг используют именно глюкозу в качестве основного субстрата окисления? В то же время, жирные кислоты – общепризнанный аккумулятор энергии – нервная ткань не использует. Как это объяснить, с учетом того обстоятельства, что нервная ткань характеризуется и очень нуждается в высоком уровне энергетического обмена? 10. АТФ - универсальный энергоемкий продукт. Учитывая, что нервная ткань характеризуется высоким уровнем энергетического обмена, можно было ожидать значительных запасов АТФ в нервной ткани. Однако запаса АТФ там нет. Почему? Каковы возможные пути использования АТФ? 11. Детям раннего и дошкольного возраста категорически не рекомендовано голодание. Какие вам известны особенности углеводного обмена и гормонального статуса у детей? Как голодание может отразиться на развитии мозга у ребенка? 49 Тесты 1. Назовите наиболее значимую причину, по которой нервная ткань по составу сильно отличается от других тканей организма. 1. Превосходит интенсивность белкового обмена в других тканях 2. Протекает медленно 3. Не отличается по интенсивности от белкового обмена в других тканях 4. Не подвергается изменения на протяжении жизни 5. Метаболизируется только при заболеваниях 2. Назовите одну из наиболее характерных особенностей нервной ткани: 1. Высокий процент коллагена 2. Большое количество альбуминов 3. Повышенное содержание термогенина 4. Наличие значительного количества белков 5. Высокое содержание гистонов 3. Какое примерное количество нейроспецифических белков известно к настоящему времени? 1. 2 2. 10 3. Таких белков нет 4. 600 5. 60 4. Как в основном характеризуется белковый обмен нервных тканей? 1. Превосходит интенсивность белкового обмена в других тканях 2. Протекает медленно 50 3. Не отличается по интенсивности от белкового обмена в других тканях 4. Не подвергается изменениям на протяжении жизни 5. Изменяется только при заболеваниях 5. Какие из предложенных пептидов не относятся к группе нейропептидов? 1. Либерины и статины 2. Вазопрессин и окситоцин 3. Энкефалины и эндорфины 4. Грелин и мотилин 5. Проопиомеланокортин и ансерин 6. Для мозга характерно высокое содержание следующих свободных аминокислот: 1. Лизина и пролина 2. Аспартата и глутамата 3. Триптофана и фенилаланина 4. Тирозина и пролина 5. Аргинина и серина 7. Какая из перечисленных аминокислот играет ключевую роль в жизнедеятельности нормальной нервной ткани и чрезвычайно важна при интоксикации аммиаком? 1. Лизин 2. Аргинин 3. Пролин 4. Глутамат 5. Триптофан 8. Какие из перечисленных групп липидов содержатся в нервной ткани в небольших количествах? 51 1. Сфингомиелин и фосфатидилхолин 2. Фосфатидилсерин и плазмалоген 3. Триацилглицеролы и свободные жирные кислоты 4. Фосфатидилэтаноламин и лецитин 5. Кефалин и гликолипиды 9. Какой из углеводов наиболее характерен для нервной ткани? 1.Фруктоза 2. Сахароза 3. Гликоген 4. Глюкоза 5. Лактоза 10. Отсутствие какого из витаминов является основной причиной демиелинизации нервных волокон и проявления неврологической симптоматики? 1. Витамин D 2. Витамин К 3. Витамин В12 4. Витамин U 5. Токоферолы 11. Какой из процессов в норме является основным в обеспечении головного мозга энергией? 1. Аэробное окисление глюкозы 2. Гликогенолиз 3. Глюконеогенез 4. Пентозофосфатный путь 5. β-окисление жирных кислот 12. В качестве дополнительного субстрата окисления нервные клетки при голодании могут использовать: 52 1. Лецитин 2. Рибозу 3. Глутатион 4. Кетоновые тела 5. Крахмал 13. В чем заключается основная функционировании нервной ткани? роль креатинкиназы в 1. Стимулирует гликолиз 2. Тормозит пентозофосфатный путь окисления глюкозы 3. Активирует гликогенолиз 4. Стабилизирует уровень АТФ в нервной клетке 5. Активирует глюконеогенез 14. Какие из перечисленных нейромедиаторам? веществ не относятся к 1. Адреналин и норадреналин 2. Ацетилхолин и ГАМК 3. Серотонин и глицин 4. Энкефалины и катехоламины 5. Карнитин и гастриксин 15. Какой из ферментов не участвует в образовании катехоламинов из тирозина в нервной ткани? 1. Тирозингидроксилаза 2. ДОФА-декарбоксилаза 3. Холинацетилтрансфераза 4. Метилтрансфераза 5. ДОФА-аминоксидаза 16. Предшественником серотонина является аминокислота: 53 1. Фенилаланин 2. Метионин 3. Триптофан 4. Лизин 5. Глутамат 17. Предшественниками для синтеза ацетилхолина являются: 1. Фенилаланин и карнитин 2. Рибоза и АМФ 3. Креатин и ГАМК 4. Глюкоза и серин 5. УДФ и олеиновая кислота 18. С нарушением метаболизма нейромедиаторов связывают все перечисленные заболевания, кроме одного. Укажите это исключение: 1. Болезнь Альцгеймера 2. Болезнь Паркинсона 3. Шизофрения 4. Болезнь Аддисона 5. Депрессии 19. Из какой аминокислоты синтезируется адреналин? 1.Тирозин 2.Триптофан 3. Аланин 4. Гистидин 5. Пролин 20. Какие гормоны депонируются в нейрогипофизе? 1. Липотропины 2. Либерины и статины 54 3. Норадреналин и адреналин 4. Меланотропины 5. Окситоцин и вазопрессин 21. Из какой аминокислоты образуется мелатонин? 1. Глицин 2. Треонин 3. Тирозин 4. Фенилаланин 5. Триптофан 55 Список литературы 1. Биохимия: учебник / Л.В. Авдеева [и др.]; под ред. Е.С. Северина. – 5-е изд., испр. и доп. – М.: Издат. группа «ГЭОТАР-Медиа», 2013. – 768 с. 2. King M.W. The medical biochemistry pages / M.W. King. – 2011. – URL: http://themedicalbiochemistrypage.org/ 3. Principles of medical biochemistry. Tutorial on biochemistry for foreign students of medical department of higher education institutions / V.V. Davydov, E.R. Grabovetskaya; Ryazan State Medical University. – Ryazan; Saint Petersburg: Eco-Vector LLC, 2016. – 552 p. 4. Smith C. Mark's Basic Medical Biochemistry A clinical approach. 4th Edition/ C. Smith, A.D. Marks, M. Lieberman, C. Peet.– 2nd edition. – N.Y., Philadelphia, Baltimor, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokio: Wolters Kluwer Lippincott Williams &Wilkins, 2013. – 1026 p. 56 Учебно-методическое пособие Давыдов Вадим Вячеславович Комаров Олег Самуилович Биохимия нервной ткани Под общей редакцией проф. А. В. Шестопалова Корректор Комаров О.С. Компьютерная верстка Давыдов В.В. Подписано в печать __.___.2018 Формат___ . Уч. изд. л. ___ Тираж 50 экз. Отпечатано в Типографии ООО «Белый Ветер» 115054, Москва, ул. Щипок, д.28, тел. (495)651-84-56 wwprint.ru 57