НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ БЕЛОРУССКОЕ ОБЩЕСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ МИКРОБИОЛОГОВ МИКРОБНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Сборник научных трудов Основан в 2007 году Том 1 МИНСК, Изд. И.П. Логвинов, 2007 УДК 579(082) Печатается по решению Ученого совета Института микробиологии НАН Беларуси Редакционная коллегия: Ответственные редакторы: Коломиец Э.И., член-кор. Лобанок А.Г., акад. члены коллегии: Алещенкова З.М., д-р биол. наук Бабицкая В.Г., д-р биол. наук Зинченко А.И., член-кор., д-р биол. наук Михайлова Р.В., д-р биол. наук Романова Л.В., канд. биол. наук. Самсонова А.С., д-р биол. наук Стефанович Л.И., канд. биол. наук (секретарь) Рецензенты: академик, доктор биологических наук, профессор Картель Н.А. доктор биологических наук, профессор Трепашко Л.И. В сборнике обобщены литературные и экспериментальные данные по микробному синтезу биологически активных соединений, генноинженерному конструированию микроорганизмов. Рассмотрены вопросы создания микробных технологий для сельского хозяйства, медицины и промышленности, контроля окружающей среды. Сборник представляет интерес для микробиологов, биохимиков, инженерно-технических работников микробиологической, пищевой и легкой промышленности. © ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», 2007 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………....... 7 МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИМОВ…………………...... 10 Биоинформатика и микробные биотехнологии – Лобанок А.Г. ……………………………………………………………. 10 Биокаталитический синтез цитидин-5'-дифосфатхолина – Титович О.И., Зинченко А.И. ………………………………………. 21 Влияние компонентов питательной среды и условий культивирования на продуцирование комплекса (3'-5')специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea БМ-105Д – Ерошевская Л.А., Кухарская Т.А., Кулак Т.И., Калиниченко Е.Н., Зинченко А.И. …………………….. 29 Влияние условий культивирования на продуцирование фосфолипазы D при глубинном культивировании Streptomyces Netropics БИМ В-235 – Биричевская Л.Л., Зинченко А.И. ………………………………………………………….. 38 Интенсификация биосинтеза каталазы Penicillium Piceum – Мороз И.В., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. …………… 48 Морфолого-физиологическая характеристика Phellinus Robustus K – продуцента пероксидазы – Осока О.М., Михайлова Р.В., Лобанок А. Г. ……………………………………… 56 Протеолитические ферменты пробиотических микроорганизмов – Самарцев А.А. ……………………………... 65 Белки клеточной поверхности грамположительных бактерий, их функциональное значение в условиях стресса – Головнева Н.А., Рябая Н.Е., Денисенко В.В. ………… 78 Липиды базидиальных грибов – Гвоздкова Т.С., Щерба В.В., Черноок Т.В., Филимонова Т.В., Рожкова З.А., Осадчая О.В., Смирнов Д.А., Бабицкая В.Г. ......... 88 Подбор протекторных сред для криоконсервации мицелиальных грибов – Важинская И.С., Новик Г.И., Кантерова А.В. …………………………………………………………. 103 3 Применение генно-инженерной лизил-тРНК-синтетазы Escherichia coli в реакции синтеза диаденозин-5′, 5′′′-P1,P4тетрафосфата – Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И. …………. 109 Суперпродукция пуриннуклеозидфосфорилазы Escherichia coli в pET/Bl21 системе – Квач С.В., Шахбазов А.В., Зинченко А.И., Картель Н.А. ………………………………………… 117 Создание штамма Escherichia coli – суперпродуцента аденозиндезаминазы – Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И. ………………………………………………………...... 125 Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей многокопийные CpG-мотивы – Квач С.В., Казачкова Я.А., Зинченко А.И. ………………………………………. 130 Молекулярные векторы для клонирования генов в грамположительных прокариотах – Сапунова Л.И., Шляхотко Е.А. ………………………………………………………….. 138 МИКРОБНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА……………………………………………………………. 148 Управление биотехнологическими процессами и их коммерциализация – Романова Л.В., Кузьмина О.Н., Орлова Л.А., Михеева Л.Д., Гладкий Н.Ф., Ерош А.Ю. …………. 148 Средства биологического контроля патогенов растений и животных: подходы к повышению эффективности и конкурентоспособности – Коломиец Э.И., Романовская Т.В., Молчан О.В., Жук Г.В., Евсегнеева Н.В. …… 155 Бактерии-антагонисты как агенты биологического контроля кагатной гнили сахарной свеклы – Коломиец Э.И., Кильчевская О.С., Купцов В.Н., Романовская Т.В., Гирилович Н.И., Свиридов А.В. …………………………………….. 170 Биологический дезинфектант «Энатин» – Сверчкова Н.В., Ладутько Е.И., Коломиец Э.И. ………………………………………. 176 Новые подходы к созданию биопестицидов для защиты зернобобовых культур от болезней – Мандрик М.Н., Купцов В.Н., Гирилович Н.И., Дэй Э., Коломиец Э.И. …………… 185 4 Взаимодействие арбускулярных микоризных грибов с сельскохозяйственными культурами – Алещенкова З.М. Картыжова Л.Е., Шестакова Е.А.,, Ланцевич А.А. ……………………. 196 Влияние искусственной микоризации на развитие Pisum sativum L. в условиях модельного опыта – Алещенкова З.М., Сафронова Г.В., Суховицкая Л.А., Короленок Н.В. ……………… 212 Выделение и количественная оценка спонтанных эндомикоризных структур в корнях ячменя и льна-долгунца, первичная оценка способов микоризации в условиях лабораторной модели – Суховицкая Л.А., Алещенкова З.М., Мохова С.В., Мельникова Н.В. …………………………………………..222 Молочнокислые бактерии – основа препаратов пробиотического действия – Денисенко В.В., Найденко И.А. …. 233 Рост и стабильность молочнокислых бактерий в зависимости от состава питательной среды – Романова Л.В., Кузьмина О.Н., Орлова Л.А., Михеева Л.Д., Гладкий Н.Ф., Ерош А.Ю. ………………………………………………………………. 242 Бактериоцины грамположительных бактерий и перспективы их практического использования – Головнева Н.А., Щетко В.А., Грель М.В. ……………………………………………….. 247 Криоконсервация пробиотических микроорганизмов: научные основы практического использования – Рахуба Д.В., Новик Г.И. ………………………………………………. 268 БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И ПРОМЫШЛЕННОСТИ………………………………………………... 276 Комбинированные лечебно-профилактические препараты многофункционального назначения на основе лекарственных грибов – Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Пленина Л.В., Гвоздкова Т.С., Пучкова Т.А., Смирнов Д.А., Лопатенто Ю.С., Осадчая О.В. ……………………………………… 276 Лечебно-профилактический препарат иммуностимулирующего действия на основе липокаротиноидного комплекса гриба Laetiporus sulphureus – Гвоздкова Т.С., Бирман Б.Я., Щерба В.В., Насонов И.В., Черноок Т.В., Бабицкая В.Г. ……………………….. 284 5 Новый продукт функционального назначения с грибами рода вешенка – Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Паромчик И.И., Осадчая О.В., Филимонова Т.В., Рожкова З.А. …………………... 292 Биохимический состав гриба Cordyceps militaris – нового объекта биотехнологии – Пучкова Т.А., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Гвоздкова Т.С., Рожкова З.А., Черноок Т.В. ………. 299 Критерии отбора штаммов бифидобактерий, перспективных для использования в пищевых и медицинских биотехнологиях – Новик Г.И., Сидоренко А.В. …………………… 305 Использование ультра- и микрофильтрации для получения препарата Пектиназа Г20х – Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Кудряшов В.Л., Сапунова Л.И., Павловская Ж.И., СемашкоТ.В., Жуковская Л.А., Казакевич И.О., Мороз И.В., Осока О.М., Чихаева О.В., Шляхотко Е.А. ………………………………………………………….. 313 БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ…………………………………………………………………... 325 Диметиловый эфир фталевой кислоты: свойства, применение, биодоступность – Волкова К.В., Самсонова А.С. .. 325 Микроорганизмы – деструкторы хлорированных фенолов – Глушень Е.М., Самсонова А.С., Сёмочкина Н.Ф., Петрова Г.М...341 Сурфактантобразующая микрофлора: свойства и практическое использование – Кононова В.В., Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф. …………………………………... 350 Микроорганизмы – деструкторы триэтилмина для очистки сточных вод – Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф., Алещенкова З.М., Петрова Г.М. ……………………………………. 366 Связывание ионов тяжелых металлов структурными биополимерами клеточных стенок базидиальных грибов – Ровбель Н.М. …………………………………………………………… 374 Видовой состав микромицетов – деструкторов биоцидсодержащих материалов – Ровбель Н.М., Мицкевич А.Г., Гончарова И.А., Грек Д.С. ………………………… 383 Действие сульфата меди на рост микромицета Aspergillus Niger – Гончарова И.А., Ровбель Н.М., Грек Д.С. ………………... 391 6 ВВЕДЕНИЕ Перемены, произошедшие в биологии за последние десятилетия, открыли принципиально новые перспективы в развитии биотехнологии и расширили границы применения биологических процессов в производстве. Сегодня инновационные биотехнологии не только предлагают эффективные пути решения экологических, энергетических и продовольственных проблем, но и определяют успех медицинской и микробиологической промышленности. Так, с молекулярной биотехнологией человечество связывает большие надежды на возможность точной диагностики, профилактики и лечения множества инфекционных и генетических заболеваний; создание микроорганизмов, продуцирующих различные химические соединения (антибиотики, полимеры, аминокислоты, ферменты) и обеспечивающих переработку отходов, загрязняющих окружающую среду. Во всех промышленно развитых странах научное обеспечение биотехнологии происходит в рамках государственных исследовательских программ с последующей коммерциализацией результатов частным сектором. В результате такой политики сформировалась система государственно-частного инновационного партнерства, при котором государственная власть и бизнес выступают как равноправные партнеры, взаимно дополняя друг друга. Государство, поддерживая проведение научноисследовательских работ и систему образования, являющихся источниками инноваций, создает благоприятные условия и среду стимулирования предпринимательства, а бизнес берет на себя весь коммерческий риск работы на рынке инновационной продукции. В нашей республике биотехнология определена одним из приоритетов научно-технической деятельности и поддерживается государственными программами различного уровня, обеспечивающими полный инновационный цикл новых разработок от идеи до внедрения, а также предусматривающих реформу образования в области биологии, реорганизацию действующих и организацию новых биотехнологических производств. С самого начала организации Института микробиологии исследования фундаментального характера обеспечивали основу для разработки биотехнологий, наиболее востребованных народным хозяйством республики. Благодаря государственной поддержке в последние 5–7 лет разработаны, зарегистрированы и разрешены для использования в РБ биоконсерванты для силосования растительного сырья, пробиотические препараты, биологические удобрения с азотфик- 7 сирующей и фосфатмобилизующей активностями, биопестициды, биологически активные добавки на основе глубинного мицелия высших грибов, кормовые добавки, повышающие продуктивность животных и птицы на 15–28%, препараты для биодеструкции химических токсикантов. Совместными усилиями химиков и микробиологов в рамках фундаментальных программ и ГНТП «Лекарственные препараты» созданы оригинальные химикоферментативные технологии получения субстанций противоопухолевых препаратов Лейкладин и Флударабел. Эти исследования, удостоенные Государственной премии РБ в области науки и техники в 2004 г., в настоящее время успешно развиваются при создании новых противовирусных и противоопухолевых лекарственных средств, таких как Рибавирин, Гуаран и Лейковир. Однако регистрация новых видов отечественной биотехнологической продукции – это только один из промежуточных этапов на пути к рынку. Решение проблем, связанных с организацией промышленного производства разработанных биопрепаратов и их реализацией, требует от ученых не меньших усилий, чем разработка технологий. Серьезными сдерживающими факторами разработки и коммерциализации биотехнологий служат низкий уровень материально-технической базы микробиологических предприятий; слабо развитая инфраструктура маркетинга и сбыта готовых препаратов; отсутствие законодательства по стимулированию в республике экологического земледелия; незащищенность отечественных производителей от демпинговой политики зарубежных фирм; отсутствие у сельскохозяйственного производителя широкого опыта применения биотехнологических препаратов, давно и прочно вошедших в практику развитых стран. Опыт сотрудничества Института микробиологии НАН Беларуси с ООО «АктивБиоТех» по организации отечественного промышленного производства биоконсерванта Лаксил для силосования растительного сырья, дает все основания полагать, что указанные трудности могут быть успешно решены совместными усилиями научной организации и частной структуры. Благодаря четкому разделению функций (подготовка производства и сбыт продукции – частная структура, научное обеспечение производства – Институт микробиологии) удалось в 2006–2007 гг. произвести и реализовать хозяйствам АПК свыше 500 т отечественного биоконсерванта, по качеству не уступающего лучшим зарубежным аналогом, а по цене в 2–10 раз ниже. За счет импортозамещения сэкономлено около 1,5 млн. долларов США. Мощности, задействованные в производстве препарата Лаксил, позволяют нарабатывать его в количестве свыше 1500 тонн, что полностью закрывает потребность республики в биоконсервантах и исключает за- 8 купку импортных препаратов, доля которых в настоящее время составляет примерно 75%. Весьма своевременным шагом в коммерциализации научных разработок в области биотехнологии является создание на базе Института микробиологии НАН Беларуси Биотехнологического центра, основными задачами которых являются не только освоение оригинальных отечественных биотехнологий в производстве и организация малотоннажного выпуска биопрепаратов, но и проведение маркетинговых и рекламных мероприятий, а также работ по лицензированию, стандартизации, сертификации научно-технической продукции с целью ее продвижения на отечественный и зарубежные рынки. Перспективы деятельности Института микробиологии связаны с созданием научнопроизводственного объединения «Химический синтез и биотехнологии», в состав которого войдут научно-исследовательские организации, частные структуры, имеющие опыт промышленного освоения инноваций и продвижения их на рынок, а также предприятия-изготовители. Создание НПО обеспечит с одной стороны, производственную базу для освоения новых научных разработок, а с другой, позволит рационально использовать мощности предприятия, расширить номенклатуру выпускаемой продукции, повысить рентабельность. Опыт Института микробиологии НАН Беларуси в области разработки новых биотехнологий и их коммерциализации обобщен в настоящем сборнике. 9 МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ УДК 579.2+601.4:577.21+602.6+604.4+604.6 БИОИНФОРМАТИКА И МИКРОБНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ Лобанок А.Г. лаборатория ферментов Статья представляет собой мини-обзор литературы, касающейся взаимодействия биоинформатики и микробиологии и их интегрального вклада в создание и развитие микробных биотехнологий. «До практического применения должно быть познание» Макс Планк (1919) Биотехнология – это технологическое применение биологических систем, живых организмов или их компонентов с целью получения полезных продуктов или процессов для специфического использования. Современная биотехнология манипулирует организмами на молекулярном и генетическом уровне и часто ассоциируется с такими генетически модифицированными, или рекомбинантными, микроорганизмами, как бактерии, дрожжи и грибы, которые продуцируют инсулин, антибиотики, ферменты и др. Это касается также трансгенных животных и растений. Информация в области общей микробиологии и микробной биотехнологии в настоящее время растет экспоненциально благодаря успехам по расшифровке геномов сотен микроорганизмов и возможности использования новых технологий, развитию таких направлений как геномика, транскриптомика, протеомика. Результаты геномных исследований находят множество применений в различных областях, начиная от медицины, сельского хозяйства, органической химии и заканчивая конверсией биомассы и добычей полезных ископаемых. Микроорганизмы, появившись около 4 миллиардов лет назад, составляют основную часть земной биомассы и существуют буквально при любых условиях окружающей среды: экстремально высоких и низких температурах, радиации, давлении, концентрации солей, кислотности и темноте. В этих условиях среды источником питания являются только неорганические вещества, и, кроме микроорганизмов, других форм жизни нет. Разнообразие и 10 размах микробной адаптации показывает, что микробы давно решили проблемы, над которыми все еще бьются ученые. Размеры микробных геномов варьируют от 600 тысяч пар оснований до 10 миллионов. После полного установления нуклеотидных последовательностей микробного генома эти данные анализируются для идентификации генов и их потенциальных функций. Все это открывает новую область сравнительной геномики, что в итоге позволяет открывать новые гены и метаболические пути. Невероятный рост скорости действия вычислительной техники и объемов памяти компьютеров революционизировали возможности хранения и анализа биологических данных. Возникла новая наука биоинформатика, которая рассматривает молекулярную биологию как информационную науку. Биоинформатика использует вычислительную технику не только для лучшего понимания биологических процессов, но и, в конечном итоге, для манипулирования молекулами жизни. Сотни бактериальных и много геномов мицелиальных грибов были секвенированы, создавая предпосылки для более эффективного использования биосинтетического потенциала микроорганизмов. Биоинформатика позволяет сохранять, анализировать и сопоставлять огромное количество данных, полученных геномикой. Оказалось, что микробная геномика дает возможность выяснить, в какой части генома закодированы желаемые свойства, понять функционирование генома не только микроорганизмов, но и человека и животных. Используя методы биоинформатики и генетической инженерии, можно перенести определенный ген или гены из одного или нескольких организмов в другой с целью получения того или иного полезного продукта или осуществления цепи превращений. Важнейшими целями такого подхода могут быть: создание рациональных лекарств и новых антимикробных препаратов; решение проблем лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов; конструирование эффективных бактериальных штаммов для биоремедиации и контроля загрязнения окружающей среды; создание протеиновых биомаркеров для диагностики различных заболеваний, вызываемых бактериями, и лучшего понимания взаимодействия бактерий с организмом-хозяином для предотвращения бактериальных инфекций; создание новых биопродуктов и интенсификация биосинтеза уже известных и многое другое. Биоинформатика не заменяет эксперимент, но значительно упрощает и ускоряет процесс поиска нового и достижения цели. Компьютер предоставил биологу множество новых возможностей. Так, результаты исследований, выполненных с помощью 11 компьютера (in silico), затем проверяют в эксперименте на лабораторном столе биолога. Исследования в области биоинформатики обычно очень машиноемки. В последнее десятилетие развитие биоинформатики привело к созданию интегрированной базы данных, что способствовало решению многих вопросов биологии фундаментального и прикладного характера. Биоинформатика использовалась по нескольким направлениям, включая компьютерный анализ результатов лабораторных исследований, секвенирование генома, идентификацию кодирующих белок сегментов, сравнение геномов для идентификации функции генов, развитие геномной и протеомной базы данных, выведение свойств фенотипа из генотипа, автоматическую реконструкцию и сравнение метаболических путей и ряд других. Так, выяснение механизмов взаимодействия между белками и определенными химическими соединениями ускорило создание лекарственных препаратов. Сравнение новых геномов с набором известных генов для установления их функции во вновь секвенированных геномах дополнялось использованием математического моделирования для идентификации общих характеристик и функций более высокого уровня. В настоящее время исследования в области биоинформатики связаны в основном с геномикой – секвенированием и сравнительным изучением геномов для идентификации гена и функции генома, протеомикой – идентификацией, характеристикой белков, реконструкцией путей метаболизма и их регуляцией,техникой клеточной визуализации, абстрактными геномными моделями и симуляцией метаболических реакций in silico для изучения поведения модели клетки, а также с созданием новых лекарственных соединений, антимикробных препаратов и др. Огромное влияние на биоинформатику оказывает развитие автоматизированных и статистических методов исследования, математического моделирования и интегральный подход. Широкомасштабное использование миниатюризированной биохимической техники позволило получить огромное количество новых результатов, привело к резкому подъему геномного и протеомного анализа, ведущего ко многим новым открытиям и подходам, ранее невозможным в обычных классических лабораторных экспериментах. В тоже время надо отметить, что биоинформатика, в свою очередь, критически зависит от лабораторного эксперимента. Можно сказать, что успехи биоинформатики в основном стали возможными в результате интенсивного применения вычислительной техники, высокоэффективных автоматизированных методов исследования и математического моделирования. Сегодня можно уже утверждать, что, используя новые зна- 12 ния и подходы, наука приближается к пониманию функционирования клеточных механизмов на системном уровне. Геномные исследования и биоинформатика в целом ведут к прорыву в таких областях, как производство вакцин и лучшая диагностика заболеваний, совершенствование микробных препаратов для контроля вредителей и возбудителей заболеваний растений и животных, модификации патогенов растений и животных, создание новых промышленных катализаторов и микроорганизмов – суперпродуцентов биологически активных соединений и многое другое. После первого полного секвенирования генома бактерии Hemophilus influenzae в 1995 году в последующем были секвенированы геномы сотен микроорганизмов. Расшифровка генома человека и ряда других эукариотических геномов создали предпосылки для выяснения взаимодействия патогенов с организмом хозяина с целью создания более эффективных вакцин и рациональных лекарств контроля патогенеза на генетическом уровне. Биоинформационный анализ улучшил понимание структуры генома, процессов реструктурирования микроорганизмов, создание вакцин, противомикробных препаратов и лекарств. Биоинформатика, будучи молодой областью исследований, позволяет осуществлять системный анализ клеточных процессов, рассматривать и контролировать микроорганизмы как клеточные фабрики. Биоинформатика, хотя и молодая область исследований, оказала воздействие на развитие фундаментальной микробиологии и биотехнологии через создание алгоритмов, инструментария и открытий, делающих более понятной абстрактную модель функционирования микробной клетки. В будущем все больше и больше будут использоваться методы, позволяющее интегрированным образом манипулировать микробными клетками на системном уровне. Полагают, что в следующем десятилетии произойдет интеграция лабораторных исследований, техники симуляции клеток и биоинформатики. Геномные исследования играют решающую роль в открытии новых антимикробных препаратов. Быстрый рост числа секвенированных геномов про- и эукариот создает новые и инновационные пути обнаружения мишеней для антимикробных протеинов. Так, например, в одном случае был использован широкомасштабный компьютерный анализ геномных последовательностей с целью идентификации консервативных генов, важных для выживания бактериальных патогенов. Была выдвинута гипотеза о существовании 350 таких индивидуальных значимых генов. Проведенные лабораторные исследования подтвердили наличие в сообществе патогенных бактерий около 200 высокоспецифичных 13 генов-мишеней. Затем в результате структурного и клеточного анализа ключевых мишеней была показана возможность создания низкомолекулярных не только ингибиторов против широкого спектра бактериальных патогенов, но и препаратов для лечения туберкулеза и малярии. В другом случае было показано, что белковые кристаллы поверхностной структуры бактерий имеют тенденцию к самоорганизации в кристаллические порядки в суспензии или на различных внутренних поверхностях. Фундаментальные исследования структуры, генетики, химии, морфогенеза и функции этих структур привели к широкому применению таких белков в нанотехнологиях и биомиметике. Возможность изменять свойства этих белков методами генетической инженерии открывает новые возможности изменения их функциональных и структурных особенностей. Такие функциолизированные протеины, сохранившие способность к самоагрегации, привели к созданию новых аффинных матриц, диагностикумов, вакцин или биосовместимых поверхностей, а также биологических шаблонов или возможностей для специфической биоминерализации на поверхностях. Как известно, более 99% микроорганизмов, обитающих в окружающей среде, плохо культивируются в искусственных условиях. Это так называемые некультивируемые микроорганизмы. Биоинформатика и метагеномные технологии позволяют решить эту проблему. Были получены ДНК-последовательности геномов некультивируемых микроорганизмов, которые нашли применение в различных новых биотехнологиях и фармацевтике, а также для получения новой информации по экологии и физиологии этих микробов. Выяснилось, что в природных условиях микроорганизмы живут в сообществах. Сегодня реально стало возможным подойти к ответу на вопрос, какие микроорганизмы обитают в данной среде, что они делают и каковы их филогенетические отношения. Геномика успешно используется для прослеживания путей микробной эволюции, она выявила многие, ранее неизвестные функции микроорганизмов, что позволило уточнить их положение на древе жизни. Использование метагеномных последовательностей для более полного понимания функционирования микробных сообществ и их взаимодействия в пределах экологических ниш является чрезвычайно актуальным. Биоинформатика во все большей степени помогает постигать удивительную хореографию молекул жизни. Методами генетической инженерии сконструированы штаммы бактерий, которые в качестве биосенсоров используются для мониторинга динамических систем и регистрации в режиме реального времени попадания в окружающую среду различных 14 токсикантов. Исследования в области метагеномики некультивируемых и неохарактеризованных бактерий позволили выявить феноменальный потенциал значимых для окружающей среды микроорганизмов и выявить новые функциональные гены, связанные с катаболизмом ксенобиотиков. Изучение генетики и физики подвижности бактерий, с одной стороны, привело к пониманию движения бактерий и выявило разнообразие механизмов его реориентации, связанных с особенностями физики жгутиков, а, с другой, привело к использованию бактерий в качестве экспериментальных и модельных систем в физике. Микробные технологии используют при получении пищевых продуктов, в фармацевтике и косметике, при получении химикалий, энергии, а также производстве новых материалов. Подходы, выработанные биоинформатикой, позволили вывести на рынок ряд ферментов с повышенной термостабильностью и субстратной специфичностью, процессы ферментации способны существенно снизить зависимость от ископаемых видов топлива. Микробные биотехнологии играют все возрастающую роль в промышленном производстве лекарственных и множества биологически активных соединений. По сравнению с обычными технологиями по целому ряду причин промышленное применение микробных биотехнологий обладает многими преимуществами. Химический синтез более сложен, чем биологический, и сопровождается образованием многих побочных продуктов. На протяжении последних десятилетий молекулярная биология, генетическая инженерия, а позднее и биоинформатика внесли существенный вклад в понимание механизмов и создание процессов промышленной микробиологии. Впервые стало возможным избирательно и эффективно улучшить природные способности микробиологических машин или даже сконструировать новые. За последние 20 лет были созданы новые эффективные микробные технологии производства более чистых и менее дорогих продуктов или веществ, получение которых невозможно химическими методами. В качестве примера можно упомянуть синтез в процессе ферментации ранее неизвестных молекул или получение с помощью ферментов хиральных молекул. Мицелиальные грибы и дрожжи используются во многих промышленных процессах, таких как производство хлеба, вина, пива, сыра, а также антибиотиков, ферментов, витаминов, полимеров, спиртов, пигментов, липидов, гликолипидов и других важных соединений. Вторичные метаболиты грибов имеют огромное значение для медицины, пищевой промышленности и, таким об- 15 разом, являются важным экономическим фактором. Наряду с использованием в обычных процессах ферментации грибы очень эффективно применяются для биотрансформации ряда соединений и особенно незаменимы в производстве химикалий при получении моноизомерных соединений. Технологии рекомбинантных ДНК, в которых дрожжи и другие грибы используются в качестве организма-хозяина, позволили значительно расширить потенциал промышленного использования мицелиальных грибов, в частности, для расширения рынка микробных ферментов. Развитие методов молекулярной биологии открывает новые возможности использования грибов и дрожжей для производства как гомологичных, так и гетерологичных белков, особенно белков млекопитающих. Необходимо особо отметить, что для производства рекомбинантных продуктов в качестве клеточных фабрик используют традиционные штаммы грибов и дрожжей, ранее проверенных на безопасность. Спектр продуктов промышленной микробиологии весьма обширен и, в том числе, включает: - фармацевтические протеины (человеческий интерферон, эпидермальный фактор роста и гемоглобин, антигены вируса гепатита В, стабилизаторы эритропоэтина и человеческий хорионический гонадотропин), получаемые с помощью таких микроорганизмов как Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Agrobacterium tumefaciens. Использование рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris позволило получить выход внеклеточного ингибитора тромбина – гирудина пиявки – в количестве 1,5 г на литр; - рекомбинантные ферменты немедицинского назначения, которые широко используют для производства пищевых продуктов, текстиля, кожи, детергентов, пульпы, в бумажной промышленности. Основной источник получения таких ферментов – мицелиальные грибы. Число гетерологичных грибных ферментов, используемых в пищевой промышленности, постоянно увеличивается. Так, можно отметить производство бычьего белка химотрипсина, используемого в производстве сыров, с помощью рекомбинантного штамма гриба Aspergillus niger, а также производство для сыроделия с помощью Aspergillus oryzae рекомбинантной аспарагиновой протеиназы из гриба другого вида. Большой интерес представляют микробные липазы, стабильные в органических жидкостях, не требующие кофакторов, обладающие широкой специфичностью и высокой энантиоселективностью. Первая рекомбинантная липаза была получена в 1994 году путем клонирования гена липазы Thermomyces lanuginosus в клетках Aspergillus oryzae. Липазы широко используют в моющих средствах и в 16 ряде производственных процессов, часто в сочетании с протеазами, оксидазами и пероксидазами. В настоящее время в пищевой промышленности используют три рекомбинантные липазы; - антибиотики, включая биосинтетический пенициллин V и природный пенициллин G. Из 12000 известных к 1995 году антибиотиков более 20% производились с помощью мицелиальных грибов. Рынок биосинтетических и полусинтетических пенициллинов, а также цефалоспоринов превышает 15,4 миллиарда долларов США; - иммунодепрессанты, в том числе циклоспорин А из Tolypocladium nivenum и мофетилмикофенолат из нескольких видов грибов Penicillium привели к значительному успеху в области трансплантации органов; - гипохолестеролемические агенты, включая ловастатин из Aspergillus terreus и правастатин из Penicillium citrium с объемом рынка до 15 миллиардов долларов США; - противоопухолевые агенты, такие как таксол, эффективный при лечении рака груди и яичников, который первоначально был обнаружен в растениях, но позднее ген, контролирующий синтез таксола перенесен в гриб Taxomices andreanae. Объем реализации продуктов этой группы составляет около 1 миллиарда долларов США; - микотоксины, в том числе эрготические алкалоиды, также продуцируются мицелиальными грибами и широко используются в медицине для лечения многих патологий, таких как мигрени, нарушения кровообращения. Одни алкалоиды являются ингибиторами действия адреналина, норадреналина и серотонина, другие используются как эстрогены и анаболические агенты в животноводстве для скота и овец. Гиббереллины применяют в пивоварении, для увеличения урожайности овощей, вдвое сокращают сроки получения семян салата и сахарной свеклы, являются регуляторами цветения, прорастания семян, удлинения стебля растений. Некоторые эрготические алкалоиды обладают антибиотической активностью; - полиненасыщенные жирные кислоты, включая гаммалиноленовую кислоту, продуцирует Mucor circinelloides, а арахидоновую кислоту получают с помощью Mortierella isabellina; - пигменты, в том числе каратиноид астаксантин Phaffia rhodozyma и бета-каротин Blakeslea trispora, широко используются в пищевой и текстильной промышленности. Биоинформатика и геномика вторгается даже в такие традиционные биотехнологии как выращивание грибов. Как известно, грибы являются важнейшим компонентом и элементом технологии приготовления пищевых продуктов в Юго-Восточной Азии. 17 В течение последних нескольких лет был достигнут большой прогресс в использовании микроорганизмов в качестве «клеточных фабрик». В первую очередь это касается создания рекомбинантных микроорганизмов на базе тех, которые уже разрешены для использования. Так, например, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые разрешены для использования в пищевой промышленности, считаются безопасными для продукции фармацевтических белков. Во-вторых, это развитие молекулярной техники улучшения экспрессии и секреции гетерологичных белков у мицелиальных грибов, а также метаболической инженерии определенных биосинтетических путей. И, наконец, на передний план выдвигается биоинформатика, которая обеспечивает целостный анализ экспрессии генов, включая геномику, протеомику и метаболомику. На повестке дня направленная эволюция ферментов с целью увеличения их активности, специфичности и стабильности. Производство грибных метаболитов с использованием технологий рекомбинантных ДНК представляет большой интерес. Непрерывный прогресс в области метаболической инженерии способствует резкому увеличению выхода конечных продуктов. В качестве примера можно привести создание рекомбинантных штаммов пивных и винных дрожжей, позволившее не только повысить эффективность производства, но заметно повысить качество продукта. Генетическая инженерия пивных дрожжей сделала возможным преодоление целого ряда технологических проблем. Так, клонирование гена грибной эндоглюканазы в дрожжах, ранее не расщеплявших бета-глюкан ячменя, улучшило фильтрацию пива. Сходная технология была использована при конструировании усваивающих крахмал штаммов Saccharomyces cerevisiae, образующих меньше кислоты и больше ароматических соединений. Амилоглюкозидаза рекомбинантного штамма Aspergillus niger способна расщеплять неферментируемые декстрины при производстве светлого пива. Рекомбинантные пивные дрожжи продуцируют ацетолактатдекарбоксилазу из Enterobacter aerogenes и Acetobacter aceti. Использование фермента улучшает качество и аромат пива при созревании после ферментации. Аналогичным образом с помощью рекомбинантных винных дрожжей было достигнуто понижение кислотности и повышение аромата вина. С помощью технологии ДНК-чипов были выяснены и преодолены многие проблемы виноделия. У рекомбинантного продуцента пенициллина эффективность биосинтеза увеличилась в десятки раз. Растительный белок тауматин, который в 3000 раз слаще обычного сахара, был недавно разрешен для использования в 18 пищевой промышленности. В настоящее время ген тауматина клонирован в мицелиальных грибах и, таким образом, такой важный продукт, как и ксилоза, может эффективно производиться путем микробного синтеза. Разрабатываются процессы производства молочной кислоты и бета-каротина на основе использования штаммов обычных пищевых дрожжей. Комбинированная экспрессия гена одного растительного и восьми животных белков у рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae сделала возможным производство гидрокортизона – важнейшего промежуточного продукта синтеза стероидных гормонов. Синтез вторичных метаболитов у грибов может быть усилен путем направленной эволюции самой клетки. Благодаря геномике и биоинформатике уже были выявлены функции ранее неизвестных белков и созданы предпосылки для получения новых продуктов. Новые вторичные метаболиты мицелиальных грибов будут создаваться с помощью комбинаторного биосинтеза. Учитывая, что многие микроорганизмы являются фотосинтезирующими, в перспективе биосинтез биологически важных молекул и соединений может быть осуществлен более эффективным и менее дорогостоящим путем на основе использования углекислого газа как источника углерода, воды как акцептора электронов и солнечной энергии. Вода. Отходы. Энергия. Это трио проблем сегодня является большим вызовом человечеству, его экологическому здоровью. Даже чистая вода становится все большей проблемой из-за возрастающей зависимости водоснабжения от роста стоимости очистки воды, поступающей из загрязненных рек, озер и подземных источников. Выход из сложившейся ситуации и рецепт для оздоровления окружающей среды может предложить микробная экология в союзе с биотехнологией окружающей среды. Почти 6 миллиардов лет истории нашей планеты микроорганизмы правили бал и распространились от геотермальных отверстий на дне океана до зон вечной мерзлоты в Арктике. Пришло время использования богатейшего микробного биоразнообразия для решения проблем человечества, в том числе посредством биотехнологии окружающей среды. Мы должны всегда помнить, что наша планета и пассажиры на ней в возрастающей степени зависят от деятельности микроорганизмов. Благодаря новейшим достижениям биологии, вычислительной техники, новым материалам и технике биотехнологии мы теперь в состоянии заставить микробные сообщества работать на нужды общества. Получение энергии из отходов и возобновляемого сырья может стать крупным прорывом в использовании ее 19 возобновляемых источников и постепенное уменьшение зависимости от ископаемого сырья. Замена последнего биоэтанолом будет означать революцию в энергообеспечении, будет способствовать оздоровлению окружающей среды и, по-видимому, существенно повлияет на сложившиеся международные коммерческие отношения. Микробный этанол как биотопливо – это только первый шаг на пути энергетической революции, конечная цель которой состоит в создании водородных батарей. В этих проектах биоинформатика как инструмент мобилизации микробного потенциала и микробные биотехнологии, без сомнения, будут эффективно использованы и сыграют решающую роль. Следует всегда иметь в виду, что значимые практические успехи в конечном итоге зависят от уровня фундаментальных исследований. На примере анализа взаимодействия биоинформатики и биотехнологии становится очевидным, что микробиология превращается во все более интегрированную науку, которая комбинирует и связывает различные элементы в одно биологическое целое. Стало более понятным глобальное влияние микроорганизмов на окружающую среду, прояснилась роль микроорганизмов в возникновении заболеваний, микроорганизмы находят применение в нанотехнологиях. Микробиология стала играть важную роль в самых разных научных дисциплинах, в том числе даже в таких как океанография, физика, психология, компьютерные и инженерные науки, химия, фармакология, биология и многих других. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 Fungal biotechnology / J.L. Adrio [et al] // Int. Microbiol. – 2003. – Vol. 6. – P. 191–199. Bansal, A.K. Bioinformatics in microbial biotechnology – a mini review / A.K. Bansal // Microbial Cell Factories. – 2005. – Vol. 4. – P. 19–29. Biochemical evidence for the proteolytic degradation of infectious prion protein sc PrP in hamster brain homogenates by foodborne bacteria / S. Muller-Hellwig [et al] // Syst. Appl. Microbiol. – 2006. – Vol. 29. – P. 165–171. Search and discovery strategies for Biotechnology: the paradigm shift / A.T. Bull [et al] // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2000. – Vol. 64, № 3. – P. 573–606. New antibiotics from bacterial natural products / J. Clardy [et al] // Nature Biotechnol. – 2006. – Vol. 24, № 12. – P. 1541–1545. Environmental genomics: exploring the unmined richness of microbes to degrade xenobiotics / L. Eyers [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – Vol. 66. – P. 123–130. Herrera, S. Industrial biotechnology could boost fortunes and help heal the planet. But there’s a giant gulf between here and there / S. Herrera // Nature Biotechnol. – 2004. – Vol. 22. – P. 671–675. The era of microbiology: a Golden Phoenix / S. Maloy [et al] // Int. Microbiol. – 2006. – Vol. 9. – P. 1–7. 20 9 10 11 12 13 14 15 16 Mir, J. Industrial microbiology. A new chellenge / J. Mir // Int. Microbiol. – 2004. – Vol. 7. – P. 81–82. Bacterial mobility: links to the environment and a driving force for microbial physics / J.G. Mitchell [et al] // FEMS Microbiol. Ecol. – 2006. – Vol. 55, № 1. – P. 3–16. Schaechter, M. Integrative microbiology – the third Golden Age / M. Schaechter // J. Biosci. – 2003. – Vol. 28, № 2. – P. 149–154. Microbial diversity: No limits? / Y.S. Schouche [et al]// Curr. Science. – 2005. – Vol. 88, № 9. – P. 1370–1371. S-layers as patterning elements for application in nanobiotechnology / M. Sara [et al] // Curr. Opin. Microbiol. – 2004. – Vol. 7, № 5. – P. 492–498. Metagenomics – the key to the uncultured microbes / W.R. Streit [et al]// Curr. Opin. Microbiol. – 2004. – Vol. 7, № 5. – P. 492–498. Bioinformatic and the discovery of novel anti-microbial targets / C. Volker [et al] // Cur. Drug Targets – Infectious Disorders. – 2002. – Vol. 2, № 4. – P. 279–290. Stress responsive bacteria: Biosensors as environmental monitors / A.C. Vollmer [et al] // Adv. Microb. Physiol. – 2004. – Vol. 49. – P. 131–174. BIOINFORMATICS AND MICROBIAL BIOTECHNOLOGIES LOBANOK A.G. Laboratory of enzymes The article is the mini review concerning interactions of bioinformatics and microbiology and their integrated impact on development of microbial biotechnology. УДК 579.6:577.113:577.15 БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ЦИТИДИН-5'ДИФОСФАТХОЛИНА Титович О.И., Зинченко А.И. лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы Предложен метод получения цитидин-5'-дифосфатхолина с помощью клеток пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в качестве биокатализатора. Метод заключается в последовательной трансформации смеси цитидин-5′монофосфата и холина в цитидин-5'-дифосфатхолин под действием ферментов пекарских дрожжей. Оптимизированы условия проведения синтеза цитидин-5'дифосфатхолина, в результате чего его максимальный выход достиг 80–85%. Предложенный метод отличается простотой, использованием дешевых реагентов (цитидин-5′-монофосфат, холин) и биокатализатора (коммерческие пекарские дрожжи). Введение. Цитидин-5'-дифосфатхолин (ЦДФ-холин) – коньюгат нуклеотида с холином, который абсолютно необходим в процессе биосинтеза фосфолипидов, составляющих клеточные 21 мембраны [1]. Это соединение участвует в различных метаболических процессах мозга, влияет на действие нейротрансмиттеров (поднимая, например, уровень допамина и норадреналина). Изучение метаболизма ЦДФ-холина привело к открытию значительного фармакологического потенциала этого соединения [2–4]. Так установлено, что экзогенный ЦДФ-холин (субстанция препаратов «Citicoline», «Cognizin», «Сомазина») проявляет выраженный нейропротекторый эффект, связанный с активизацией биосинтеза структурных фосфолипидов в мембранах нейронов, увеличением мозгового метаболизма и воздействием на уровнях различных нейромедиаторов, в первую очередь ацетилхолина [5, 6]. ЦДФхолин способствует выведению жидкости, скапливающейся в мозге при травмах головы и кровоизлияниях в мозг. Фармакологическое действие ЦДФ-холина предотвращает вред, наносимый клеткам при недостатке кислорода в легких и в крови (гипоксия) и недостаточном притоке крови к тканям и органам (ишемия). Прием ЦДФ-холина в ряде стран в качестве пищевой добавки [7] благоприятно действует на функции мозга, замедляя развитие болезни Альцгеймера, а также нарушение мозговой деятельности, нередко свойственной старости. В ряде исследований показано, что применение препаратов на основе ЦДФ-холина эффективно при лечении глаукомы [8], которую сегодня рассматривают как нейродегенеративную патологию, сопровождающуюся отмиранием ганглиозных клеток сетчатки согласно апоптозоподомному механизму. Для синтеза ЦДФ-холина предложены многостадийные и довольно трудоемкие химические процессы [9], которые к тому же отличаются достаточно низким выходом целевого продукта (46%). Ферментативные методы, основанные на использовании ферментов печени животных [10, 11] позволяют достичь 70%-ного выхода ЦДФ-холина, однако требуют сложной процедуры очистки ферментов. С другой стороны известно, что синтез этого соединения может осуществляться in vitro с помощью клеток различных микроорганизмов [12]. Цель исследования – разработка метода получения ЦДФхолина с помощью клеток пекарских дрожжей. В настоящее время известно, что ЦДФ-холин образуется из цитидин-5′-трифосфата (ЦТФ) и холинфосфата в результате обратимой реакции (рисунок 1). Данная реакция катализируется ферментом холинфосфатцитидилтрансферазой (син. ЦДФ-холин-пирофосфорилаза) (КФ 2.7.7.15), который широко распространен среди про- и эукариот [13]. 22 Объекты и методы исследования. В работе использовали цитидин-5′-монофосфат (ЦМФ), цитидин-5′-трифосфат (ЦТФ), а также ЦДФ-холин, холин-хлорид и фосфохолин-хлорид фирмы «Sigma» (США). Цитидин-5′-дифосфат (ЦДФ) синтезировали как описано нами ранее в работе [14]. NH2 N O O O N O O P O OH O OH P O OH + HO O OH + CH2 N CH3 CH3 Холинфосфат Холинфосфатцитидилтрансфераза NH2 N O O P CH3 CH2 OH ЦТФ OH OH P O N O O P OH OH O O P OH CH3 CH2 O + CH2 N CH3 CH3 O + HO P OH O O P OH OH Неорганический пирофосфат (РРi) OH Рисунок 1 – Схема реакции синтеза ЦДФ-холина, катализируемой ферментом холинфосфат-цитидилтрансферазой Ход всех реакций контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), которую проводили на пластинах SilufolUV254 фирмы Serva (Германия) в системе растворителей: диоксан–вода–25%-ный водный аммиак (6:6:1). Для идентификации продуктов, содержащих холин, пластины обрабатывали 1%-ным раствором фосфомолибденовой кислоты в смеси этанолхлороформ (1:1), затем окрашивали 1%-ным раствором хлорида олова в 3 М соляной кислоте. Местоположение темно-синих пятен веществ, содержащих холин, на окрашенных пластинах сравнивали с положением УФ-поглощающих пятен на необработанных пластинах, а также с положением веществ-свидетелей. Для количественного определения выхода реакции пятна, содержащие ЦДФ-холин, элюировали 5 мл 0,05 М К-фосфатного буфера (рН=7,0) и замеряли оптическую плотность элюата на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия) при 271 нм. Выход 23 ЦДФ-холина рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции 9,1х103 М-1см-1. Клетки коммерческих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Минский дрожжевой комбинат) высушивали при 28 °С в течение 24 час либо получали т.н. «ацетоновый порошок» путем обработки их 2 объемами ацетона. Реакцию синтеза ЦДФ-холина проводили (до достижения его максимального выхода) при 30 °С в среде, содержащей 20 мМ ЦМФ, ЦДФ или ЦТФ, 50 мМ холин-хлорид или фосфохолинхлорид, 0–2 мМ АТФ, 2–15%-ную глюкозу, 0,2 М К-фосфатный буфер (рН 7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% (по сухой массе) клетки пекарских дрожжей. Результаты и их обсуждение. Выбор объекта исследований был обусловлен тем, что как мы ранее показали [15], клетки пекарских дрожжей способны трансформировать природные и модифицированные нуклеозид-5′-монофосфаты (в том числе и ЦМФ) в нуклеозид-5′-трифосфаты в условиях, благоприятствующих протеканию в клетках процессов гликолиза. Также известно, что пекарские дрожжи содержат ферментные системы, необходимые для синтеза ЦДФ-холина [16]. Ранее в ряде работ, в том числе и нами [14], было установлено, что интактные клетки дрожжей не проявляют киназной активности при биокаталитическом фосфорилировании нуклеозидов и нуклеотидов и приобретают такую способность только после перфорации клеточной стенки тем или иным способом. В связи с этим, на первом этапе разработки метода получения ЦДФхолина нами было изучено влияние способа обработки клеток пекарских дрожжей на выход ЦДФ-холина (таблица 1). Таблица 1 – Влияние способа обработки клеток пекарских дрожжей на выход ЦДФ-холина Ферментный препарат Сырые клетки Клетки, высушенные при 28 °С в течение 1 сут. «Ацетоновый порошок» Выход ЦДФ-холина, % 0 40–45 Время реакции, ч 20–25 4,5–5 5 3–4 Примечание. Состав реакционной смеси: 20 мМ ЦТФ, 50 мМ фосфохолин-хлорид, 2%-ная глюкоза, 0,2 М К-фосфатный буфер (рН=7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% клетки дрожжей. Из таблицы 1 видно, что способ обработки клеток пекарских дрожжей довольно существенно влияет на выход ЦДФ-холина. 24 Однако даже в случае использования сухих клеток выход ЦДФхолина не превышает 40–45%. Далее нами было исследовано влияние различных исходных субстратов (ЦМФ, ЦДФ, ЦТФ) и доноров холина (холинхлорид, фосфохолин-хлорид) на выход реакции синтеза ЦДФхолина, катализируемой ферментами сухих пекарских дрожжей (таблицы 2 и 3). Таблица 2 – Синтез ЦДФ-холина из различных нуклеотидных субстратов Исходный субстрат ЦМФ ЦДФ ЦТФ Выход ЦДФ-холина, % 42–43 41–44 44–45 Время реакции, ч 3,5–4 3–3,5 3 Примечание. Состав реакционной среды: 20 мМ ЦМФ, ЦДФ или ЦТФ, 50 мМ фосфохолин-хлорид, 2%-ная глюкоза, 0,2 М К-фосфатный буфер (рН=7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% (по сухой массе) клетки дрожжей. Из таблицы 2 видно, что присутствие в реакционной среде ЦМФ, ЦДФ или ЦТФ практически не влияет на выход реакции синтеза ЦДФ-холина, поскольку в условия гликолитического расщепления глюкозы ферменты дрожжей способны быстро трансформировать ЦМФ и ЦДФ в необходимый ЦТФ. Однако следует отметить, что с экономической точки зрения целесообразно использовать именно ЦМФ как наиболее дешевый субстрат из исследованных нуклеотидов. Таблица 3 – Влияние различных холинсодержащих субстратов на выход ЦДФ-холина Исходный субстрат Фосфохолин-хлорид Холин-хлорид Холин-хлорид + АТФ Выход ЦДФ-холина, % 44–46 10–15 60–65 Время реакции, ч 3–4 5–6 3–4 Примечание. Состав реакционной среды: 20 мМ ЦМФ, 50 мМ холинхлорид или фосфохолин-хлорид, 2%-ная глюкоза, 0,2 М К-фосфатный буфер (рН=7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% (по сухой массе) клетки дрожжей. Из таблицы 3 видно, что в случае присутствия в реакционной среде фосфохолин-хлорида выход целевого вещества значительно выше, чем в присутствии холин-хлорида. Однако дополнительное внесение в реакционную смесь АТФ приводит к повышению выхода ЦДФ-холина. По-видимому, это связано с нехваткой 25 внутриклеточного АТФ для действия содержащегося в дрожжах АТФ-зависимого фермента – холинкиназы. Отметим также, что холин-хлорид является намного более дешевым субстратом, чем фосфохолин-хлорид. В ходе дальнейшей оптимизации условий синтеза ЦДФхолина нами было изучено влияние концентрации глюкозы в реакционной смеси на выход целевого продукта (таблица 4). В результате проведенных исследований нам удалось добиться значительного повышения выхода целевого продукта, достигшего 80–85%. Таблица 4 – Влияние концентрации глюкозы на выход ЦДФ-холина Концентрация глюкозы,% 2 5 10 15 Выход ЦДФ-холина, % Время реакции, ч 44–46 60–65 80–85 75–78 3–4 3 2,5–3 4–5 Примечание. Состав реакционной среды: 20 мМ ЦМФ, 50 мМ холинхлорид, 2 мМ АТФ, 2–5%-ная глюкоза, 0,2 М К-фосфатный буфер (рН=7,0), 15 мМ MgCl2 и 10% (по сухой массе) клетки дрожжей. Заключение. Таким образом, в результате оптимизации условий проведения синтеза ЦДФ-холина выход целевого продукта увеличился с 40–45% до 80–85%. Разработанный метод предусматривает использование в качестве биокатализатора сухих пекарских дрожжей, ферментные системы которых в условиях гликолитического расщепления глюкозы способны в результате нескольких последовательных реакций трансформировать смесь ЦМФ и холина в ЦДФ-холин (рисунок 2). Следует отметить, что ранее были описаны методы получения ЦДФ-холина с использованием сухих пекарских дрожжей [17, 18], однако трансформация исходных веществ (оротовая кислота, ЦМФ) в ЦДФ-холин в указанных работах не превышала 40–60%. Таким образом, предложенный нами ферментативный метод синтеза ЦДФ-холина не уступает лучшим методам, описанным в литературе, и открывает перспективу создания технологии получения субстанции для лекарственных препаратов, которые укорачивают период выздоровления после инсультов, улучшают зрение при глаукоме, стабилизируют состояние больных болезнями Паркинсона и Альцгеймера. 26 Работа выполнена в рамках ГПФОИ «Физиологически активные вещества». ЦМФ Холин АТФ ЦМФкиназа АДФ Холинкиназа ЦДФ Нуклеозиддифосфаткиназа АТФ АТФ АДФ АДФ Фосфохолин ЦТФ Фосфохолин цитидилтрансфераза ЦДФ-холин + РРi Рисунок 2 – Схема последовательного превращения ЦМФ и холина в ЦДФ-холин под действием ферментов пекарских дрожжей Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 Secades, J.J. CDP-choline: pharmacological and clinical review / J.J. Secades, G. Frontera // Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. – 1995. – Vol. 17, Suppl. B. – P. 1–54. Citicoline improves verbal memory in aging / P.A. Spiers [et al] // Arch. Neurol. – 1996. – Vol. 53, № 5. – P. 441–448. Oral citicoline in acute ischemic stroke: an individual patient data pooling analysis of clinical trials / A. Dávalos [et al] // Stroke. – 2002. – Vol. 33, № 12. – P. 2850–2857. Conant, R. Therapeutic applications of citicoline for stroke and cognitive dysfunction in the elderly: a review of the literature / R. Conant, A.G. Schauss // Altern. Med. Rev. – 2004. – Vol. 9, № 1. – P. 17–31. A paralysed thumb / K. Sudo [et al] // Lancet. – 2004. – Vol. 363, № 9418. – P. 1364. Fioravanti, M. Citicoline (Cognizin) in the treatment of cognitive impairment / M. Fioravanti, A.E. Buckley // Clin. Interv. Aging. – 2006. – Vol. 1, № 3. – P. 247–251. Kahn, S. 10 Ways to recharge your brain / S. Kahn // Better Nutrition. – 2007. Vol. 69, № 3. P. 24–25. Grieb, P. Pharmacodynamics of citicoline relevant to the treatment of glaucoma / P. Grieb, R. Redjak // J. Neurosci. Res. – 2002. – Vol. 67, № 2. – P. 143–148. 27 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Kennedy, E.P. The synthesis of cytidine diphosphate choline, cytidine diphosphate ethanolamine, and related compounds / E.P. Kennedy // J. Biol. Chem. – 1956. – Vol. 222, № 1. – P. 185–191. Kennedy, E.P. The function of cytidine coenzymes in the biosynthesis of phospholipides / E.P. Kennedy, S.B. Weiss // J. Biol. Chem. – 1956. – Vol. 222, № 1. – P. 193–214. Borkenhagen, L.F. The enzymatic synthesis of cytidine diphosphate choline / L.F. Borkenhagen, E.P. Kennedy // J. Biol. Chem. – 1957. – Vol. 227. № 2. – P. 951–962. Poxton, I.R. The biosynthesis of a choline nucleotides by a cell-free extract from Streptococcus pneumoniae / I.R. Poxton, D.J. Leak // J. Gen. Microbiol. – 1977. – Vol. 100, № 1. – P. 23–29. Kent, C. CTP:phosphocholine cytidylyltransferase / C. Kent // Biochim. Biophys. Acta. – 1997. – Vol. 1348, № 1–2. – P. 79–90. Application of microbial cells for transformation of nucleosides into nucleoside-5’diphosphates / O.I. Titovich [et al] // Biocatalytic Technology and Nanotechnology / Nova Science Publishers, Inc.; ed. by G.E. Zaikov. – New York, 2004. – P. 83–91. Enzymatic synthesis of nucleoside 5′-0-mono-and-triphosphates / A.I. Zinchenko [et al] // FEBS Lett. – 1990. – Vol. 260, № 2. – P. 254–256. Purification and kinetic characterization of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase from Saccharomyces cerevisiae / J.A. Friesen [et al] // Protein Expr. Purif. – 2001. – Vol. 21, № 1. – P. 141–148. Process for producing cytidine diphosphate choline: пат. 6387667 США, МПК7 C 12 N 15/52, С 12 Р 17/12 / A. Maruyama, T. Fujio, S. Teshiba; заявитель Kyowa Hakko Kogyo, Co., Ltd., Tokyo (JP) – № 08/014012; заявл. 28.01.1993; опубл. 14.05.2002. Phosphorylation of mononucleotides and formation of cytidine 5'-diphosphatecholine and sugar nucleotides by respiration-deficient mutants of yeasts / A. Kimura [et al] // J. Bacteriol. – 1976. – Vol. 125, № 2. – P. 744–746. BIOCATALYTIC SYNTHESIS OF CYTIDINE 5'-DIPHOSPHOCHOLINE TITOVICH O.I., ZINCHENKO A.I. Laboratory of nucleic compounds biotechnology A method for the synthesis of cytidine 5'-diphosphocholine employing baker’s yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) as a biocatalyst is proposed. The method consists in a consecutive transformation of mixture of cytidine 5'-monophosphate and choline into the cytidine 5'-diphosphocholine under the action of enzyme systems of baker‘s yeast. Conditions of carrying out of cytidine 5'-diphosphocholine synthesis have been optimized therefore its maximal yield has reached 80–85%. The method suggested differs simplicity, use of cheap reagents (cytidine 5'-monophosphate, choline) and the biocatalyst (commercial baker’s yeast). 28 УДК 579.66:577.113.6+615.281 ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПРОДУЦИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСА (3'-5')-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА/ ФОСФАТАЗА ГРИБОМ SPICARIA VIOLACEA БМ-105Д Ерошевская Л.А., Кухарская Т.А., Кулак Т.И.1, Калиниченко Е.Н.1, Зинченко А.И. лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы 1 лаборатория химии нуклеотидов и полинуклеотидов Института биоорганической химии НАН Беларуси Оптимизированы состав питательной среды и условия культивирования гриба Spicaria violacea БМ-105Д – продуцента комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза, что позволило повысить выход комплекса ферментов в 3 раза по сравнению с исходным уровнем. Полученные результаты открывают перспективу создания в будущем новых препаратов для защиты растений от вирусных заболеваний. Введение. (2'-5')-Олигоаденилаты общей формулы А(2'р5'А)n-1 [далее (2'-5')Аn] представляют собой олигонуклеотиды, состоящие из нескольких аденозиновых фрагментов, связанных между собой (2'-5')-фосфодиэфирной связью (рисунок). NH2 N HO O N N NH2 N N O HO O P O O N O _ N NH2 N N O HO O P O O O _ HO N OH Рисунок – Структурная формула тримера (2'-5')А3 29 N N Эти соединения обладают активностью против вирусов растений [1–4] и животных [5], а также цитокининподобным [6, 7] и антипролиферативным [8] действием. При этом наибольшую биологическую активность проявляют три- и тетрамеры. (2'-5')А3 и его аналоги находят применение в растениеводческой практике [9–11], так как, являясь медиаторами фитогормонов [12, 13], обладают разнообразной биологической активностью, в том числе фиторострегуляторным (адаптогенным) действием [14]. Один из лучших химических способов получения (2'-5')А3 [15] заключается в конденсации N6,2'-0,3'-O-три-бензоиладенозина с N6,3'-О-дибензоил-5'-0-монометокситритиладенозин2-[(п-нитрофенил)этил]-фосфатом в присутствии хинолин-8сульфохлорида и 3-нитро-1,2,4-триазола в абсолютном пиридине, деблокировании 5'-ОН группы образующегося динуклеозидмонофосфата, конденсации полученного димера с фосфодиэфиром и удалении защитных групп синтезированного таким образом триаденозиндифосфата. При этом тример (2'-5')А3 получают с выходом 49% в расчете на исходный трибензоат аденозина. Главными недостатками указанного, а также других химических способов получения (2'-5')Аn является их нетехнологичность, обусловленная многостадийностью и применением таких исходных веществ, получение которых требует, в свою очередь, проведения сложных синтезов с применением дорогостоящих реагентов. Современный этап исследований в области синтеза и изучения биологического действия (2'-5')An характеризуется поиском возможностей для удешевления способов получения этих соединений, разработкой методов их практического применения, а также накоплением материала о взаимосвязи между структурой соединений и их активностью. Карпейский и соавт. [16] описали химико-ферментативный способ получения (2'-5')Аn, предусматривающий полимеризацию три-н-октиловой соли 2'(3')-АМФ в диоксане в присутствии дифенилхлорфосфата, приводящую к полимеру, содержащему как (2'-5')-, так и (3'-5')-межнуклеотидные связи, с последующей обработкой его двумя высокоочищенными ферментами – РНКазой Penicillium brevicompactum, гидролизующей только (3'-5')межнуклеотидные связи, и щелочной фосфатазой Еscherichia coli, отщепляющей концевые фосфатные остатки нуклеотидов и олигонуклеотидов. Процедура выделения целевых продуктов из реакционной среды включает гель-фильтрацию через колонку с Сефадексом и анионообменную хроматографию. Выход целевых продуктов составляет: А(2'р5'А)2 – 7,5 и А(2'р5'А)3 – 2,6%. 30 Недостатками описанного способа являются трудоемкость, обусловленная необходимостью выделения и очистки двух микробных ферментов, и длительность ферментативных стадий процесса, составляющая 36 ч (18 ч при гидролизе смешанного полимера РНКазой и 18 ч – при обработке продуктов фосфатазой). Ранее в лаборатории биотехнологии соединений нуклеиновой природы Института микробиологии НАН Беларуси селектирован гриб Spicaria violacea БМ-105Д, мицелий и бесклеточный фильтрат культуральной жидкости (КЖ) которого содержит фосфатазу и специфическую нуклеазу, способную гидролизовать (3'-5')-, но не (2'-5')- фосфодиэфирные связи [17, 18]. Указанные свойства грибного мицелия могут позволить использовать его в качестве биокатализатора для химико-ферментативного получения (2'-5')Аn, основанного на избирательном гидролизе химически синтезированного полиаденилата, содержащего (3'-5')- и (2'-5')межнуклеотидные фосфодиэфирные связи. Однако к настоящему времени не были подобраны условия выращивания гриба, обеспечивающие максимально эффективную продукцию рассматриваемого комплекса ферментов. Цель исследования – изучение влияния некоторых компонентов питательной среды и условий культивирования на образование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea БМ-105Д. Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм гриба Spicaria violacea БМ-105Д (далее Spicaria violacea). Для культивирования гриба в качестве исходной использовали среду Чапека. Для поддержания кислых значений рН среды в процессе роста гриба в нее вносили молочную кислоту до конечной концентрации 0,4%, после чего показатель рН среды доводили 25% аммиаком до значения 4,5. Культивирование гриба проводили глубинным способом в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащих по 100 мл питательной среды, на термостатированной биологической качалке (частота колебаний платфоро мы 180–190 об /мин) в течение 5 сут. при температуре 25 С. Посевным материалом служила трехсуточная культура продуцента (3%, об/об), выращенная на той же среде. После окончания процесса культивирования гриба его биомассу определяли весовым методом после отделения мицелия фильтрованием и высушивания до постоянной массы. Фильтрат КЖ использовали в экспериментах. Препарат хранился в холодильнике (4–8 оС) без потери активности в течение 2–3 мес. Смешанный (2'-5')/(3'-5')-полиаденилат (далее смешанный полиаденилат) синтезировали полимеризацией 2′(3′)-АМФ в диоксане под действием дифенилхлорфосфата и Bu3N [16]. 31 Активность изучаемого комплекса ферментов определяли по скорости накопления аденозина – конечного продукта реакции гидролиза смешанного полиаденилата. Для этого смесь (0,5 мл), содержащую 5 мг/мл смешанного полиаденилата в 0,1 М натрийацетатном буфере (рН=6,0), 10 мМ MgCl2 и 250 мкл фильтрата КЖ Spicaria violacea, инкубировали при 60 oС в течение 2 ч. В процессе реакции отбирали аликвоты (по 5 мкл), которые подвергали тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках SilufolUV254 (Serva, Германия) в системе растворителей изопропанол – 25%-ный водный аммиак – вода (7:1:2). Активность ферментативного комплекса определяли на начальной стадии реакции. Для расчета концентрации аденозина использовали коэффициент молярной экстинкции при 260 нм (рН=7,0), составляющий 15100. За единицу активности ферментативного комплекса принимали такое его количество, которое обеспечивало образование продукта в количестве 1 нмоль за 1 ч в соответствующих условиях реакции. Все цифровые данные, представленные в работе, являются усредненными величинами 3–4 определений. Результаты и обсуждение. Одним из наиболее важных факторов, влияющих на биосинтез ферментов микроорганизмами, является углеродное питание. При изучении влияния источников углерода на способность гриба Spicaria violacea продуцировать комплекс (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза нами были исследованы гексозы, дисахариды, крахмал и многоатомные спирты. Результаты экспериментов по подбору источников углерода представлены в таблице 1. Таблица 1 – Влияние источников углерода на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Источник углерода, 2% Глицерин Глюкоза Крахмал Лактоза Сахароза Сорбит Фруктоза Мальтоза Арабиноза Ксилоза Биомасса, мг/мл 8,5 9,2 9,4 3,6 8,9 5,4 8,6 10,2 6,4 2,1 Ферментативная активность комплекса, ед/мл 845 1010 730 250 935 240 869 845 670 206 32 Как видно из данных, представленных в таблице 1, гриб хорошо рос на всех изученных источниках углерода, за исключением лактозы и ксилозы. Ферментативную активностью проявляли все фильтраты КЖ вне зависимости от использованных источников углерода, но максимальная биосинтетическая активность – 1010 ед/мл наблюдалась при росте на среде с глюкозой. На следующем этапе работ нами были проведены эксперименты по оптимизации концентрации глюкозы в питательной среде. Как видно из данных, представленных в таблице 2, повышение концентрации глюкозы от 1% до 6% приводит к увеличению выхода биомассы гриба и уровня ферментативной активности, но превышение 5% концентрации снижает активность ферментного комплекса. Для дальнейших экспериментов по оптимизации условий культивирования гриба была выбрана глюкоза в 5% концентрации. Таблица 2 – Влияние концентрации глюкозы на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Концентрация глюкозы, % 1,0 2,0 4,0 5,0 6,0 7,0 Биомасса, мг/мл 7,1 9,2 10,5 10,9 11,1 11,0 Ферментативная активность комплекса, ед/мл 505 1000 1290 1395 1330 1315 Из литературы известно, что добавление к синтетическим питательным средам органических источников азота стимулирует синтез микроорганизмами фосфогидролаз [19]. Результаты опытов по исследованию влияния таких добавок на продуцирование ферментного комплекса приведены в таблице 3. Таблица 3 – Влияние органических источников азота на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Источник азота, 0,1% Гидролизат казеина Дрожжевой экстракт Пептон Кукурузный экстракт Биомасса, мг/мл 8,4 5,0 10,7 8,6 33 Ферментативная активность комплекса, ед/мл 1240 635 1 360 1 090 Как видно из данных, представленных в таблице 3, хуже всего гриб растет на среде с добавкой дрожжевого экстракта, а лучше всего на среде с пептоном, где также наблюдается и максимальный уровень ферментативной активности. Поэтому на следующем этапе работ проводились эксперименты по определению оптимальной концентрации пептона в среде культивирования, результаты которых представлены в таблице 4. Таблица 4 – Влияние концентрации пептона на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Концентрация пептона, % 0,1 Биомасса, мг/мл 10,6 Ферментативная активность комплекса, ед/мл 1 370 0,2 0,3 0,40 0,5 0,6 0,7 12,.0 13,1 13,9 14,2 14,0 13,8 1 900 2 360 2 650 2 840 2 830 2 800 Из данных таблицы 4 следует, что увеличение концентрации пептона в питательной среде положительно влияет как на рост гриба, так и на выход ферментативной активности. Наиболее высокий выход ферментативной активности наблюдался при 0,5%-ной концентрации пептона. На следующем этапе исследований была проведена оптимизация концентрации фосфата в питательной среде, поскольку ортофосфат, являясь одним из конечных продуктов ферментативного расщепления полинуклеотидов, способен репрессировать биосинтез ферментов, участвующих в этом расщеплении. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 5. Таблица 5 – Влияние концентрации фосфата на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Концентрация фосфата, % 0,010 0,015 0,030 0,060 Биомасса, мг/мл 14,0 14,2 14,5 15,1 Ферментативная активность комплекса, ед/мл 2 750 2 940 1 500 560 34 Как следует из данных таблицы 5, увеличение концентрации фосфата в среде свыше 0,015% приводит лишь к незначительному увеличению роста культуры, но резко снижает уровень ферментативной активности фильтрата КЖ. Оптимальной концентрацией является 0,015% фосфата в питательной среде. Важным фактором, влияющим на рост и метаболизм грибов при их глубинном культивировании, является степень аэрации среды. Для изучения влияния этого параметра на рост культуры и продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза гриб выращивали в колбах с различной степенью заполнения средой. Как видно из таблицы 6, наиболее активно изучаемый ферментный комплекс накапливается в КЖ при величине отношения объема питательной среды к объему колбы, равной 0,3–0,4. Как увеличение, так и уменьшение этого параметра приводит к снижению уровня активности ферментного комплекса. Следует отметить, что неблагоприятное влияние избыточной аэрации на биосинтез фосфогидролаз отмечали и другие авторы [19, 20]. Таблица 6 – Влияние аэрации на продуцирование комплекса (3'-5')специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Степень заполнения колбы питательной средой, % 60 50 40 30 20 10 Биомасса, Мг/мл Ферментативная активность комплекса, ед/мл 9,9 13,0 14,2 14,4 14,7 15,3 1 310 2 480 2 930 2 800 2 370 1 930 Другим существенным фактором, влияющим на синтез ферментов микроорганизмами, является начальное значение рН среды культивирования. Результаты экспериментов по влиянию рН питательной среды на продуцирование комплекса (3'-5')специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea суммированы в таблице 7. Гриб Spicaria violacea растет в достаточно широких пределах рН, но максимальное накопление ферментативной активности комплекса в КЖ достигается при культивировании в среде с узким диапазоном рН, равном 4,5–5,0. Увеличение начального рН выше этих значений ведет к значительному снижению активности, не оказывая заметного влияния на выход биомассы продуцента. 35 Таблица 7 – Влияние начального рН питательной среды на продуцирование комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea Начальный рН питательной среды 4,5 5,0 5,5 6,0 Биомасса, мг/мл 14,1 14,2 14,5 14,8 Ферментативная активность комплекса, ед/мл 2 910 3 110 2 230 1 850 Заключение. Таким образом, в результате проведенных исследований подобраны состав питательной среды, содержащей (%): глюкозу – 5,0; пептон – 0,5; молочную кислоту – 0,2; КН2РО4 – 0,015; NaNO3 – 0,5; KCl – 0,025; MgSO4.7H2O – 0,025; FeSO4.7H2O – 0,00125, и условия культивирования (pH среды 4,5; степень заполнения колбы питательной средой 30–40%) гриба Spicaria violacea БМ-105Д, обеспечивающие накопление около 3 тыс. единиц активности комплекса (3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза в 1 мл фильтрата КЖ, что в 3 раза выше по сравнению с исходным уровнем. Работа выполнена при финансовой поддержке ГПОФИ «Биорациональные пестициды». Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 Devash, Y. Maltiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf disks is inhibited by (2′-5′) oligoadenylate / Y. Devash, S. Biggs, I. Sela // Science. – 1982. – Vol. 216, № 4553. – P. 1415–1416. 5'-dephosphorylated 2′,5′-adenylate trimer and its analogs. Inhibition of tobacco mosaic virus replication in tobacco mosaic virus-infected leaf discs, protoplasts, and intact tobacco plants / Y. Devash [et al] // J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259, № 6. – P. 3482–3486. Кaнавалава, Г.I. Выкарыстанне iнгiбiтарау вiрусау пры аздарауленнi бульбы метадам культуры тканкi / Г.I. Кaнавалава // Весцi АН Беларусi, cер. бiял. навук. – 1990, № 6. – С. 70–72. Коновалова, Г.И. Результаты использования аналогов тримера 2′,5′-олигоадениловой кислоты при оздоровлении картофеля от вирусов / Г.И. Коновалова // Молекулярная генетика и биотехнология: материалы Междунар. конф., Минск, 6–8 апреля 1998 г. / Минск, 1998. – С. 206. Kara, J. Изучение антивирусного и антиклеточного действия синтетического (2’-5’)-олигоаденилата (A2′p5′A2′p5′A) на мышах с лейкемией Раушера / J. Kara, O. Mach, J. Smrt // Acta Virol. – 1983. – Vol. 27, № 6. – P. 477–483. Индукция цитокониновой активности у растений Amaranthus caudatus, обработанных интерфероном человека и 2′-5′-олигоаденилатами / М.Э. Тальский [и др.] // Докл. АН СССР. – 1987. – Т. 293, № 1. – С. 253–256. Литвяк, В.В. Влияние 2′-5′-олигоаденилатов на обмен кетосахаров прорастающей пшеницы / В.В. Литвяк // Весцi АН Беларусi, cер. бiял. навук. – 2001, № 4. – С. 108–111. 36 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Kimichi, A. Regulation of lymphocyte mitogenesis by (2′-5′) oligoisoadenylate / A. Kimichi, H. Shure, M. Revel // Nature. – 1979. – Vol. 282, № 5741. – P. 849–851. Регулятор роста картофеля: а.с. 1794432 СССР, МКИ5 A 01 N 43/08 / Е.И. Квасюк, Т.И. Кулак, О.В. Ткаченко, И.А. Михайлопуло, Т.И. Боткина, С.Л. Быховец, А.И. Быховец; Ин-т биоорганической химии АН БССР. – № 4848198/15; заявл. 04.06.90; опубл. 15.02.93. Ткачук, З.Ю. Ингибирование вирусной инфекции 2′,5′-олигоаденилатом при регенерации меристем картофеля / З.Ю. Ткачук, В.С. Артеменко, Л.И. Семерникова // Биополимеры и клетка. – 1993. – Т. 9, № 2. – С. 9–18. Аналоги тримера 2′,5′-олигоадениловой кислоты, обладающие активностью против вирусов, поражающих картофель: пат. 1565 Респ. Беларусь, МПК7 С 07 Н 19/20 / Е.И. Квасюк, И.А. Михайлопуло, Т.И. Кулак, С.Л. Сентюрева, О.В. Ткаченко, А.И. Зинченко, В.Н. Барай, Г.И. Коновалова, Н.П. Ященко; заявитель Квасюк Е.И., Михайлопуло И.А. – №1993; заявл. 22.06.94; опубл. 30.03.97. Иткес, А.В. Регуляция биологической активности клеток системой вторичных мессенджеров: сАМР, 2′-5′-олигоаденилата и кальция / А.В. Иткес, В.Л. Туницкая, Е.С. Северин // Успехи биол. химии. –1985. – Т. 26. – С. 125–152. Иткес, А.В. Механизмы регуляции биологической активности клетки с участием 2′,5′-олигоаденилата / А.В. Иткес, В.Л. Туницкая, Е.С. Северин // Биохимия. – 1985. – Т. 50, № 4. – С. 531–542. Влияние 2′,5′-олигоаденилатов на продуктивность и биохимический состав клубней картофеля / С.Л. Быховец [и др.] // Доклады АН Беларуси. – 1995. – Т. 39, № 6. – С. 79–82. Nucleotides. XXIV. Preparative synthesis of trimeric (2’-5’) oligoadenylic acid / E.I. Kvasyuk [et al] // Synthesis. – 1987. – № 6. – P. 535–541. Применение нуклеаз для синтеза 2’-5’-олигоаденилатов и их аналогов / М.Я. Карпейский [и др.] // Биоорган. химия. – 1983. – Т. 9, № 4. – С. 496–504. Гидролиз ДНК до 2′-дезоксинуклеозидов ферментами интактного мицелия Spicaria violacea БМ-105Д / А.И. Зинченко [и др.] // Ферменты микроорганизмов: сб. ст. Ч. 2. / ВНИИСЭНТИ. – М., 1989. – С. 283–289. Присутствие нуклеазы, специфичной к (3'–5')-межнуклеотидным фосфодиэфирным связям, в культуральной жидкости мицелиального гриба Spicaria violacea / Т.А. Кухарская [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. конф., Минск– Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси, отдел. биол. наук, Ин-т микробиологии, Белорус. общественное объединение микробиологов; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 171–173. Кислые фосфатазы грибов / Л.В. Югова [и др.] // Микробиологическое производство. – 1991. – Вып. 8. – С. 1–18. Ежов, В.А. Влияние температуры и рН культивирования на биосинтез внеклеточных фосфогидролаз культурой Penicillium brevicompactum // Прикл. биохим. микробиол. – 1978. – Т. 14, № 3. – С. 354–359. EFFECT OF MEDIUM COMPONENTS AND CULTIVATION CONDITIONS ON THE PRODUCTION OF (3'-5')-SPECIFIC NUCLEASE/PHOSPHATASE BY THE CULTURE SPICARIA VIOLACEA BM 105D 1 EROSHEVSKAYA L.A., KUCHARSKAYA T.A., KULAK T.I. , KALINICHENKO E.N.1, ZINCHENKO A.I. Laboratory of nucleic compounds biotechnology 1 Laboratory of nucleotides and polynucleotides, Institute of bioorganic chemistry, National academy of sciences of Belarus 37 Nutrients and growth conditions for the production of (3'-5')-specific nuclease/phosphatase enzymic complex by the Spicaria violacea BM-105D culture were optimized, that allowed to raise the enzymic complex activity in culture liquid filtrate threefold regarding the initial level. The results obtained may be used for creation of new effective antiviral chemicals for agricultural crops. УДК 579.6:579.873.71+577.152.311 ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПРОДУЦИРОВАНИЕ ФОСФОЛИПАЗЫ D ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ STREPTOMYCES NETROPSIS БИМ В-235 Биричевская Л.Л., Зинченко А.И. лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы Изучено влияние некоторых компонентов питательной среды и условий культивирования на образование фосфолипазы D (ФЛД) культурой Streptomyces netropsis. Среди исследованных источников углерода, добавление глюкозы обеспечивало максимальное накопление активности целевого фермента в культуральной жидкости (КЖ). При культивировании на средах с минеральными источниками азота и аспарагином наблюдался плохой рост актиномицета, при этом активности ФЛД в КЖ обнаружено не было. Оптимальным источником азота оказался дрожжевой экстракт в концентрации 2%. Оптимизация питательной среды и условий культивирования продуцента позволили увеличить активность фермента в КЖ до 3 тыс. единиц в 1 мл, что в 3 раза превышает исходный уровень. Установлено, что процессы роста исследуемого штамма и образования им ФЛД совпадают по времени, причем продукция ФЛД связана с экспоненциальной фазой роста культуры. Введение. Фосфолипаза D (ФЛД) – фермент, осуществляющий специфический гидролиз различных фосфолипидов, а также способный переносить фосфатидильный остаток с молекулы лецитина (син. фосфатидилхолин) на первичную ОН-группу некоторых соединений. В связи с этим ФЛД применяется для получения фосфатидилсерина, фосфатидильных производных нуклеозидов и других хозяйственно важных соединений. Особый интерес вызывают ФЛД стрептомицетов, обладающие высокой трансфосфатидилирующей активностью и нетипичной для ферментов широкой субстратной специфичностью. Указанные свойства позволяют использовать ФЛД в качестве инструмента для ферментативной модификации фосфолипидов. В частности, ФЛД микроорганизмов рода Streptomyces способна синтезировать фосфолипиды, имеющие в своем составе природ- 38 ные и модифицированные нуклеозиды. Данный ферментативный способ предлагается в качестве альтернативы химическому синтезу этих соединений [1–3]. Нужно отметить, что фосфолипидные производные нуклеозидов рассматривают как основу для перспективных лекарственных препаратов нового поколения [4–8]. В целях развития химико-ферментативного подхода к синтезу новых фармацевтически важных соединений нуклеиновой природы, химический синтез которых затруднен, мы отобрали штамм Streptomyces netropsis БИМ В-235, клетки которого секретируют в культуральную среду ФЛД, способную катализировать перенос фосфатидильных групп с лецитина на ОН-группу первичных спиртов, в т.ч. на 5'-гидроксил нуклеозидов [9]. Цель исследования − установить влияние некоторых компонентов питательной среды и условий культивирования на образование ФЛД культурой Str. netropsis БИМ В-235. Такие данные необходимы для создания рациональной питательной среды и подбора условий выращивания продуцента, обеспечивающих максимально эффективный биосинтез им ФЛД. Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм Str. netropsis БИМ В-235 (далее Str. netropsis) из коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси. Культивирование стрептомицета проводили на орбитальной биологической качалке при частоте оборотов 170–190 об/мин о и температуре 28–30 С в течение 1–7 суток в 250 мл колбах Эрленмейера, содержащих 50 мл питательной среды. Посевным материалом служила 18-часовая культура в количестве 10% (об.). В качестве исходной питательной среды (среда I) использовали мясопептонный бульон (МПБ), в который вносили растворимый крахмал до концентрации 1% и соли – NaCl и MgSO4x7H2O до концентрации 0,3 и 0,1% соответственно. Величина рН среды составляла 7,2. Cреда подобного состава использовалась ранее Yamaguchi и соавт. [10] для скрининга ФЛД-продуцирующих стрептомицетов. В процессе подбора оптимальной питательной среды для синтеза ФЛД штаммом Str. netropsis использовались также стандартные среды, рекомендованные Международным протоколом для культивирования и изучения характеристик стрептомицетов: овсяная среда (ISP № 3), синтетические крахмало-аммиачная (ISP № 4), глицерин-аспарагиновая (ISP № 5) [11] и глюкозоаммиачная (ISP № 9) [12] (среды II, III, IV и V соответственно). Среды VI, VII и VIII в качестве источника азота вместо (NH4)2SO4 содержали соответственно NaNO3, NH4NO3 и мочевину в концентрации 0,5%. Остальные компоненты те же, что и в составе среды 39 ISP № 9 (V). На первом этапе исследований в качестве посевного материала для сред I – VIII использовалась суспензия спор и мицелия, получаемая путем смыва их 10-ю мл стерильной среды с поверхности 7-ми суточной культуры Str. netropsis БИМ В-235, выросшей при 28 ºС в пробирках объемом 50 мл на поверхности скошенного овсяного агара (15 мл). Полученный смыв вносили в питательную среду в количестве 10% (об.). По окончании культивирования биомассу стрептомицета отделяли фильтрованием через бязь. Выход биомассы определяли весовым методом после высушивания ее до постоянного значения при 105 ºС. Фильтрат КЖ использовали в качестве источника ФЛД. Активность ФЛД определяли в реакции переноса фосфатидного остатка с молекулы лецитина на 5′-гидроксильную группу о тимидина путем инкубирования при 37 С в течение 45 мин реакционной смеси (1 мл), состоящей из 67% хлороформа и 33% водной фазы и содержащей 10 мМ тимидин, 30 мМ лецитин, 0,1 М Na-ацетатный буфер (рН=6,0), 0,25 М CaCl2 и 0,2 мл фильтрата КЖ. За ходом реакции следили, используя тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинах Silufol-UV254 («Serva», Германия) в системе растворителей хлороформ-этанол (4:1). Вещества обнаруживали в УФ-свете и элюировали: нуклеозиды дистиллированной водой, а фосфолипидные производные – этанолом. Активность ФЛД определяли за время, при котором выход продуктов не превышал 15–20%. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало трансформацию субстрата или образование продукта в количестве 1 нмоль за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Для характеристики продуцирующей способности микробных клеток в отношении ФЛД её активность выражали в ед/мг сухой биомассы, а для характеристики биосинтетической активности культуры в целом (которая зависит не только от продуцирующей способности клеток, но и от урожая биомассы) активность фермента приводили в ед/мл фильтрата КЖ. Для описания и анализа процессов роста культуры и биосинтеза фермента удельную скорость роста (μ) и удельную скорость синтеза фермента (ε) вычисляли по формулам: μ = dX⋅dt-1X-1 и ε = dE⋅dt-1⋅X-1 , где X – биомасса, dX – прирост биомассы, dE – прирост активности фермента за промежуток времени dt [13]. Результаты и их обсуждение. Общеизвестно, что уровень биосинтеза ферментов культурами микроорганизмов зависит не только от генетических особенностей штаммов-продуцентов, но, в 40 немалой степени, и от условий (в том числе питательной среды), в которых эти штаммы культивируются. На первом этапе при подборе питательной среды для оптимального синтеза ФЛД мы сравнили уровень продукции фермента культурой Str. netropsis при выращивании на исходной среде и некоторых средах, рекомендованных Международным проектом по стрептомицетам (ISP) для культивирования и изучения характеристик микроорганизмов рода Streptomyces. На всех исследованных синтетических средах наблюдался слабый рост культуры и отсутствие активности ФЛД в фильтрате КЖ через 7 дней культивирования (таблица 1), тогда как на средах I и II обильный урожай биомассы достигался на 2–3-и сутки выращивания. Однако при этом на овсяной среде, в отличие от среды, использовавшейся для отбора культуры, обнаружились лишь следовые количества ФЛД-активности. Таблица 1 − Накопление активности ФЛД в КЖ в процессе роста культуры Str. netropsis на различных средах Среда Биомасса, мг/мл Активность ФЛД, ед/мл I II III IV V VI VII VIII 3,3 3,7 ±* ± ± ± ± ± 995 15 −** − − − − − Примечания. * измерение биомассы не проводилось в связи с незначительным ее количеством. ** в данных условиях реакции активность не обнаружена. Представленные данные согласуются с результатами, полученными Yamaguchi и соавт. [10]. В этой работе авторы также отмечают отсутствие продукции ФЛД при выращивании культуры Str. hachijoensis на синтетических средах с минеральными источниками азота, мочевиной, аспарагином. Таким образом, в качестве исходной среды для оптимизации была выбрана среда I (МПБ c водорастворимым крахмалом), использовавшаяся ранее для отбора штамма-продуцента. Изучение характера роста Str. netropsis на данной среде и образования ФЛД в динамике показало (рисунок 1), что накопление биомассы 41 и изучаемого фермента происходит параллельно, начиная с 5 ч, и достигает максимальных значений к 14–15 ч роста культуры. Это указывает на то, что продукция ФЛД связана с экспоненциальной фазой роста культуры. Анализ кинетических параметров роста Str. netropsis и синтеза ФЛД показал (рисунок 2), что максимальная удельная скорость роста наблюдается на 10 ч культивирования и составляет в данных условиях эксперимента 0,25 ч-1. Х, мг/мл Е, ед/мл 5 1000 2 1 4 800 3 600 2 400 1 0 200 0 5 10 15 20 25 0 Время, ч Рисунок 1 − Динамика накопления в среде биомассы (1) и ФЛД (2) при культивировании Str. netropsis Максимум удельной скорости синтеза фермента также приходится на 10 ч роста культуры и составляет 75 ед.⋅ч-1мг-1. Это свидетельствует о том, что процессы роста исследуемого штамма и образования им ФЛД совпадают по времени. Важнейшими составляющими культуральной среды для микроорганизмов являются источники углерода и азота. При изучении взаимосвязи между источниками углерода в среде и биосинтезом ФЛД нами было испытано 6 соединений (рисунок 3). При этом моно-, дисахариды и многоатомные спирты вносили в исходную питательную среду вместо крахмала. Установлено, что все источники углерода, кроме глюкозы и глицерина, обеспечивают примерно одинаковый выход биомассы (в пределах 3,1–3,6 мг/мл). Урожай биомассы на средах с глицерином или глюкозой был почти вдвое выше. 42 μ, ч-1 ε, ед⋅ч-1⋅мг-1 0,4 80 0,3 60 0,2 40 2 0,1 20 1 0 0 10 5 15 20 0 Время, ч 2070 Рисунок 2 − Кинетика роста Str. netropsis (1) и синтеза им ФЛД (2). По осям ординат: μ − удельная скорость роста (ч-1); ε −удельная ско-1 -1 рость синтеза фермента (ед⋅ч ⋅мг ) 2200 2000 глицерин 1800 глюкоза 1360 крахмал сахароза сорбит 300 285 340 238 600 395 800 400 1000 1000 манноза 840 1200 930 1030 1400 270 Активность ФЛД 1600 200 0 1 2 Рисунок 3 – Влияние источников углерода на синтез ФЛД культурой tr. Netropsis: 1 – активность ФЛД, ед/мг биомассы; 2 – активность ФЛД ед/мл фильтрата КЖ 43 2410 3000 2050 2500 1000 пептон гидролизат казеина ферментолизат БВК 330 320 225 МПБ (контроль) 330 500 1250 1150 1220 1500 190 Активность ФЛД 2000 дрожжевой экстракт 0 1 2 Рисунок 4 – Влияние органических источников азота на синтез ФЛД культурой Str. netropsis Что касается биосинтетической активности культуры в отношении ФЛД, вариант среды с глюкозой значительно превзошел все другие, причем не только из-за более высокого выхода биомассы, но и по причине более высокой продуцирующей активности мицелия. Следует отметить, что по данным Yamaguchi и соавт. [10], глюкоза и сахароза являются неподходящими источниками углерода для продукции ФЛД. Однако другие исследователи часто используют глюкозу в составе сред для культивирования штаммов-продуцентов ФЛД [14–18]. Помимо источников углерода, важную роль в синтезе ферментов играют источники азота. В следующем эксперименте мы сравнили активность ФЛД в фильтрате КЖ при выращивании продуцента на средах с различными органическими источниками азота и 1% глюкозы в качестве источника углерода. Как видно из данных, приведенных на рисунке 4, все органические источники азота (в отличие от минеральных) обеспечивали накопление достаточно высокого уровня ФЛД-активности в КЖ. Оптимальные результаты получены при использовании дрожжевого экстракта. Проверка влияния различных концентраций глюкозы на биосинтез ФЛД позволила установить (таблица 2), что максимальное накопление фермента в КЖ происходит при культивиро- 44 вании продуцента на среде с концентрацией глюкозы, равной 0,5–1%. Таблица 2 − Влияние концентрации глюкозы на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis Концентрация глюкозы, % 0 0,5 1,0 2,0 4,0 Активность ФЛД ед/мг ед/мл 425 1920 395 2340 335 2340 290 2030 250 1785 Биомасса, мг/мл 4,5 5,9 7,0 7,0 7,2 Примечание. Все среды содержали 1% дрожжевой экстракт в качестве источника азота. Результаты экспериментов по подбору концентрации дрожжевого экстракта в питательной среде отражены в таблице 3. Представленные данные показали, что с увеличением содержания дрожжевого экстракта в среде показатели активности изучаемого фермента растут, однако, с точки зрения экономии субстрата, рационально его вносить в среду в количестве 1–2%. Еще одним важным фактором, влияющим на рост и метаболизм микроорганизмов при их глубинном культивировании, является концентрация кислорода в среде. Таблица 3 − Влияние концентрации дрожжевого экстракта на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis Дрожжевой экстракт, % 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 Биомасса, мг/мл 2,4 3,6 5,7 5,8 6,5 ед/мг 235 400 425 510 450 Активность ФЛД ед/мл 560 1450 2420 2950 3050 Примечание. Среда содержала 0,5% глюкозы в качестве источника углерода. Для изучения влияния аэрации на развитие культуры изучаемого актиномицета и ее биосинтетическую активность в отношении ФЛД его выращивали в колбах (250 мл) с различным объемом питательной среды. Из данных, представленных в таблице 4, видно, что максимальная продуцирующая активность мицелия 45 (685 ед/мг) выявляется в варианте, когда объем питательной среды составляет 40% от объема колбы; при этом накапливается 2940 ед. активности ФЛД в 1 мл фильтрата КЖ. Увеличение степени аэрации среды (которое достигалось путем уменьшения количества среды в колбе), способствует накоплению большего количества биомассы, однако из-за снижения биосинтеза фермента клетками в этих условиях, активность ФЛД в единице объема фильтрата КЖ при этом существенно не меняется. Отсюда представляется целесообразным заполнять колбу средой на 40%, поскольку этот вариант позволяет получить наибольший выход фермента с колбы. Таблица 4 − Влияние аэрации на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis № п/п 1 2 3 4 5 V/V* 0,1 0,2** 0,4 0,5 0,6 Биомасса, мг/мл 6,5 5,8 4,3 3,8 2,9 Активность ФЛД ед/мг ед/мл 435 2825 510 2950 685 2940 580 2210 535 1555 Суммарный выход ФЛД с колбы, ед 70625 147500 294000 276250 233250 Примечания. Питательная среда содержала 0,5% глюкозы и 2% дрожжевого экстракта. * V/V – отношение объема питательной среды к объему колбы (250 мл). ** стандартные условия аэрации. В дополнительных экспериментах нами было отмечено, что отсутствие солей MgSO4⋅7H2O и NaCl не сказывается на продукции изучаемого фермента культурой стрептомицета в подобранных условиях культивирования. Заключение. Таким образом, подобраны питательная среда, содержащая (%): глюкозу – 0,5; дрожжевой экстракт – 2,0; (pH=7,2), и степень аэрации среды, обеспечивающие при культивировании Str. netropsis БИМ В-235 накопление около 3 тыс. ед. активности ФЛД в 1 мл КЖ. Оптимизация питательной среды и условий культивирования продуцента позволили в 3 раза увеличить активность фермента в КЖ по сравнению с исходным уровнем. Установлены некоторые закономерности роста культуры стрептомицета и продуцирования ею внеклеточной ФЛД, рассчитаны кинетические характеристики этих процессов. 46 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Nucleosides and nucleotides – CXXXVII. Antitumor phospholipids with 5-fluorouridine as a cytotoxic polar-head: synthesis of 5'-phosphatidyl5-fluorouridines by phospholipase D-catalyzed transphosphatidylation / S. Shuto [et al] // Bioorg. Med. Chem. – 1995. – Vol. 3, № 3. – P. 235–243. A facile enzymatic synthesis of 5'-(3-sn-phosphatidyl) nucleosides and their antileukemic activities / S. Shuto [et al] // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). – 1988. – Vol. 36, № 1. – P. 209–217. Antitumor activity of a novel nucleotide, 5’-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho)5-fluorouridine (TJ14026) on murine tumors / M. Hayashi [et al] // Biol. Pharm. Bull. – 1993. – Vol. 16, № 8. – P. 778–781. Alexander, R.L. nucleoside conjugates for the treatment of cancer / R.L. Alexander, G.L. Kucera // Curr. Pharm. Design. – 2005. – Vol. 11, № 9. – P. 1079–1089. Morris-Natschke, S.L. Phospholipid analogs against HIV-1 infection and disease / S.L. Morris-Natschke, K.S. Ishaq, L.S. Kucera // Curr. Pharm. Des. – 2003. – Vol. 9, № 18. – P. 1441–1451. Ether phospholipids-AZT conjugates possessing anti-HIV and antitumor cell activity. Synthesis, conformational analysis, and study of their thermal effects on membrane bilayers / T. Mavromoustakos [et al] // J. Med. Chem. – 2001. – Vol. 44, № 11. – Р. 1702–1709. Synthesis and antiproliferative potency of 9-beta-D-arabinofuranosyl-2fluoroadenine phospholipid adducts / H. Brachwitz [et al] // Bioorg. Med. Chem. – 1999. – Vol. 7, № 6. – P. 1195–1200. Новые фосфолипиды – ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность / Е.Л. Водовозова [и др.] // Биоорган. химия. – 1996. – Т. 22, № 6. – С. 451–457. Первичный отбор продуцентов микробной фосфолипазы D / Л.Л. Фещенко [и др.] // Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия: матер. Междунар. конф., Минск, 1–3 июня 2000 г. / Институт микробиологии НАН Беларуси. – Минск, 2000. – C. 135–136. Screening and identification of the phospholipase D-producing Streptomyces / T. Yаmaguchi [et al] // Agr. Biol. Chem. – 1973. – Vol. 37, № 7. – P. 1667–1672. Shirling, E. B. Methods for characterization of Streptomyces species / E.B. Shirling, D. Gottlieb // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1966. – Vol. 16, – Р. 313–340. Atlas, R.M. Handbook of Microbiological Media / R.M. Atlas. – Boca Raton: CRS Press, Inc., 1993. – 666 p. Terui, G. Kinetics of hydrolase production by microorganisms / G. Terui // Pure Appl. Chem. – 1973. – Vol. 36, № 3. – P. 377–395. Study on thermostability of phospholipase D from Streptomyces sp. / T. Hatanaka [et al] // Biochim. Biophys. Acta. – 2002. – Vol. 1598, № 1–2. – P. 156–164. Hagishita, T. Isolation of phospholipase D producing microorganisms with high transphosphatidilatin activity / T. Hagishita, M. Nishikawa, T. Hatanaka // Biotech. Lett. – 2000. – Vol. 22, № 20. – P. 1587–1590. Purification, characterization, and sequence determination of phospholipase D secreted by Streptoverticillium cinnamoneum / C. Ogino [et al] // J. Biochem. – 1999. – Vol. 125, № 2. – P. 263–269. Purification and applications of a phospholipase D from a new strain of Streptomyces / G. Carrea [et al] // Biotech. Lett. – 1997. – Vol. 19, № 11. – P. 1083–1085. Iwasaki, Y. Phospholipase D from Streptomyces antibioticus: cloning, sequencing, expression, and relationship to other phospholipases / Y. Iwasaki, H. Nakano, T. Yamane // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1994. – Vol. 42, № 2/3. – P. 290–299. 47 EFFECT OF CULTIVATION CONDITIONS ON THE PHOSPHOLIPASE D PRODUCTION IN A SUBMERGED CULTURE OF STREPTOMYCES NETROPSIS БИМ B–235 BIRICHEVSKAYA L.L., ZINCHENKO A.I. Laboratory of nucleic compounds biotechnology Effects of various nutrition components and cultivation conditions on the PLD biosynthesis by Streptomyces netropsis culture were studied. With respect to the yield of the enzyme, glucose was found to be the best carbon source and yeast extract the best organic nitrogen source. In the presence of mineral sources of nitrogen or asparagine, the growth of microorganisms was stunted and poor and a lack of PLD activity in the culture liquid were detected. At the optimized conditions the 3000 U of PLD activity in 1 ml of culture liquid were achieved with exceeding the initial value 3 times. There was established that the growth and the enzyme production processes coincided in time and PLD biosynthesis interlinked with exponential period of culture growth. УДК 579.22+577.152.1 ИНТЕНСИФИКАЦИЯ БИОСИНТЕЗА КАТАЛАЗЫ P E N IC IL L IU M P IC EU M Мороз И.В., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. лаборатория ферментов Изучено действие гемсодержащих веществ (гемоглобина, гемина), главного предшественника синтеза порфирина (глицина), метаболических ингибиторов (этидий бромида, актиномицина Д, натрия малоновокислого, теофиллина, селената натрия, холин хлорида, азида натрия, 2,4-динитрофенола, гидроксиламин гидрохлорида) и соединений, вызывающих нарушение структуры и функций мембран (нистатина, додецилсульфата натрия, поливинилового спирта, метанола и этанола) на образование каталазы мицелиальным грибом Penicillium piceum. Показано, что гемоглобин, нистатин и этанол повышают уровень синтеза фермента грибом в 1,3–4,5 раза. Максимальный эффект обеспечивался добавлением в питательную среду 750 мМ этанола. Введение. Каталаза (КФ 1.11.1.6) – фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий реакцию разложения пероксида водорода до молекулярного кислорода и воды. Фермент применяется в текстильной, пищевой промышленности и медицине для детоксикации остаточных количеств пероксида водорода после процессов отбеливания и стерилизации [1–3]. В медицине каталаза также используется в составе полиферментных антиоксидантных препаратов для терапевтических целей [4–6]. Практическая значимость каталазы обуславливает необходимость разработки технологии производства отечественного 48 ферментного препарата. Одним из методов, способствующих реализации биосинтетического потенциала микроорганизмовпродуцентов, является интенсификация биосинтеза ферментов с помощью неспециализированных регуляторов – кофакторов ферментов, метаболических ингибиторов, субстратов, продуктов реакций и т.д. Большинство каталаз являются тетрамерными гемопротеидами и состоят из четырех идентичных субъединиц, содержащих в качестве кофактора железопорфириновый комплекс [7]. В литературе представлены данные о стимулирующем действии гемсодержащих веществ на синтез фермента микроорганизмами. Так, с повышением содержания ионов железа в питательной среде увеличивалось содержание внутриклеточной каталазы Penicillium funiculosum КМ МГУ 433 [8]. Установлено увеличение уровней образования внутриклеточной и внеклеточной каталаз Aspergillus niger G-IV-10 (в 1,2–1,7 раза) при добавлении гематина [9]. Внесение гемина в питательную среду приводило к стимуляции образования каталазы (в 2–100 раз) у многих анаэробных микроорганизмов – Clostridium acetobutylicum 6, Acetobacterium woodii, A. poludosum, Thermohydrogenium lactoethylicum 149, Methanobrevibacter arboriphilus DH1 и AZ [10]. Отмечен также стимулирующий эффект на биосинтез каталазы грибами метаболических ингибиторов и мембрандеполяризующих агентов. Так, холин и ортованадат натрия повышали (в 1,2–1,5 раза) уровень образования внеклеточной каталазы A. niger G-IV-10 [9]. Аналогичное действие оказывали ПАВ (тритон Х-100 и твин 80). Тритон Х-100, бридж 35 и 58 способствовали накоплению внеклеточной каталазы и у Aspergillus terreus [11]. Известно положительное влияние спиртов на синтез ферментов антиоксидантной системы защиты клетки, в том числе и каталазы [12]. Так, этанол увеличивал на 23% продукцию каталазы Thermoascus aurantiacus, а метанол – почти в 2 раза образование фермента A. niger G-IV-10 [13, 9]. Ранее нами оптимизирован состав питательной среды и определены некоторые параметры культивирования высокоактивного продуцента внеклеточной каталазы – гриба Penicillium piceum F-648 [14, 15]. Методом адаптационной селекции к Н2О2 получен P. piceum F-648 А3, каталаза которого отличается от фермента исходной культуры повышенной операционной и термической стабильностью [16]. Цель исследования – изучение влияния гемсодержащих веществ, метаболических ингибиторов и веществ, влияющих на структуру и функции биологических мембран, образование каталазы P. piceum F-648 А3. 49 Объекты и методы исследования. В качестве объекта исследования использовали мицелиальный гриб Penicillium piceum F-648 А3. Культуру поддерживали на агаризованной среде Чапека, содержащей 2,9 мМ пероксида водорода, при 26 оС. Глубинное культивирование гриба проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл питательной среды на качалке (180 об/мин) в течение 96 ч при 25–27 оС. Питательная среда содержала (%): глюкозу – 6,0, KNO3 – 0,8, MgSO4·7H2O – 0,05, KCl – 0,05, KH2PO4 – 0,1, FeSO4·7H2O – 0,001, экстракт солодовых ростков – 2,0; рН питательной среды – 5,0. Экстракт солодовых ростков получали по методу Фертман и Гирс [17]. В качестве посевного материала использовали споровую суспензию в количестве (9,0–9,7)·106 спор на 1 мл питательной среды. Влияние гемсодержащих веществ, глицина, метаболических ингибиторов и мембрандеполяризующих веществ на образование каталазы P. piceum изучали при добавлении их к основной среде в начале культивирования. Активность каталазы определяли титрометрическим методом [18]. За единицу активности принимали количество фермента, расщепляющее за 1 минуту 1 мкмоль пероксида водорода (0,034 мкг) и выражали в ед/мл культуральной жидкости, а также в ед/мг биомассы (продуцирующая способность мицелия гриба). Приведенные результаты представляют собой усредненные величины 3−5 опытов, выполненных в трех повторностях. Результаты и их обсуждение. Результаты изучения влияния гемоглобина, гемина и главного предшественника порфирина – глицина на синтез внеклеточной каталазы грибом представлены на рисунках 1−3. Показано, что гемоглобин влияет на рост гриба и образование фермента. Оптимальной концентрацией данного соединения, обеспечивающей повышение уровня накопления внеклеточной каталазы P. piceum в 1,3 раза, является 0,4–0,6% (рисунок 1). Внесение в питательную среду 0,02–0,11 мМ гемина практически не оказывает влияние на рост продуцента и синтез каталазы (рисунок 2). Увеличение концентрации гемина приводит к снижению накопления биомассы грибом (28,7%) и уровня синтеза фермента (33,9%). Незначительное снижение уровня образования каталазы P. piceum отмечено при наличии в среде 0,01 мМ глицина, дальнейшее увеличение концентрации приводит к подавлению как роста гриба, так и синтеза фермента (рисунок 3). 50 1, 2 70 1 60 2 50 40 30 20 10 0 0 0,1 0,2 0,4 0,6 1,0 Гемоглобин, % Рисунок 1 – Влияние концентрации гемоглобина на рост P.piceum и образование каталазы: 1 – биомасса, мг/мл; 2 – каталаза, ед/мл 1, 2 50 1 40 2 30 20 10 0 0 0,02 0,06 0,11 0,14 0,20 0,50 1,00 Гемин, мМ Рисунок 2 – Влияние концентрации гемина на рост P. piceum и образование каталазы: 1 – биомасса, мг/мл; 2 – каталаза, ед/мл Результаты изучения влияния метаболических ингибиторов (таблица 1) свидетельствуют о том, что ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот – этидий бромид и актиномицин Д подавляют как рост, так и биосинтетическую способность P. piceum. Аналогичное действие оказывают специфический ингибитор сукцинатдегидрогеназного комплекса дыхательной цепи – малонат натрия, и такие ингибиторы ферментов, как теофиллин и селенат натрия. Холин хлорид также ингибирует образование каталазы P. piceum, но не влияет на накопление биомассы грибом. 51 1, 2 50 1 40 2 30 20 10 0 0 0,01 0,10 1,00 2,00 Глицин, мМ Рисунок 3 – Влияние концентрации глицина на рост P. piceum и образование каталазы: 1 – биомасса, мг/мл; 2 – каталаза, ед/мл Анализ чувствительности биосинтетической способности P. piceum к ингибиторам функций митохондрий и хлоропластов показал, что 2,4-динитрофенол в концентрациях 0,001–0,002 мМ способствует повышению на 22–57% продуцирования каталазы грибом. Наибольший стимулирующий эффект обнаружен при добавлении в питательную среду 0,002 мМ исследуемого ингибитора. Следует отметить, что 2,4-динитрофенол не подавляет рост культуры. Ингибиторы каталазы азид натрия (0,1 мМ) и гидроксиламин гидрохлорид (1 мМ) ингибируют синтез фермента грибом. Что касается влияния нистатина, то полученные данные свидетельствуют о том, что данный полиеновый антибиотик (0,05–0,15 мкМ) способствует повышению накопления каталазы P. piceum в культуральной жидкости на 28–35% (таблица 1). Максимальный эффект получен при внесении 0,1 мкМ нистатина в состав питательной среды. Ранее нами было показано, что неионные ПАВ – твин 80, тритон X-100 и тритон X-305 способствуют повышению накопления внеклеточной каталазы P. piceum [19]. Установлено, что данные детергенты влияют на секрецию фермента. При исследовании действия анионного ПАВ – додецилсульфата натрия и высокомолекулярного ПАВ – поливинилового спирта выявлено (таблица 1) снижение продуцирования каталазы P.piceum на 13–32%. Указанные ПАВ практически не оказывают влияние на рост гриба. В отличие от представителей анионных и высокомолекулярных соединений, неионогенный ПАВ – этанол (175–750 мМ) увеличивает биосинтетическую способность P. piceum в 1,2–4,5 раза (таблица 1). 52 Таблица 1 – Влияние метаболических ингибиторов и мембран-деполяризующих веществ на рост P. piceum и образование каталазы Соединение Этидий бромид Актиномицин Д Натрий малоновокислый Теофиллин Селенат натрия Холин хлорид Азид натрия Динитрофенол Гидроксиламин гидрохлорид Нистатин* Додецилсульфат натрия Поливиниловый спирт** Метиловый спирт Этиловый спирт Контроль Концентрация соединения, мМ 0,005 0,01 0,1 0,001 0,005 0,01 0,1 1 10 1 2 0,1 0.5 1 20 40 0,05 0,1 0,001 0,002 0,01 0,1 1 0,05 0,10 0,15 0,001 0,01 0,05 0,01 0,05 50 250 175 350 750 1050 0 Каталаза Биомасса, мг/мл ед/мл ед/мг 9,69 9,21 3,26 10,10 9,23 9,16 9,41 8,18 7,57 9,90 9,35 9,55 4,03 10,27 10,22 10,18 10,10 10,05 10,28 10,26 10,22 9,54 7,47 10,13 10,08 10,01 10,02 10,05 10,10 10,12 10,11 9,29 8,31 8,98 7,25 6,18 3,47 10,29 96,20 88,36 22,91 100,46 76,64 65,88 98,82 82,55 73,01 96,05 84,30 94,54 32,16 100,2 80,33 65,03 101,91 65,32 128,32 164,73 108,68 100,60 89,56 134,40 141,36 139,47 99,90 84,05 65,64 96,76 79,11 86,16 62,33 123,23 204,00 465,96 112,20 104,70 9,92 9,59 7,02 9,94 8,30 6,70 10,50 10,09 9,64 9,70 9,02 9,90 7,98 9,76 7,86 6,39 10,09 6,50 12,48 16,05 10,63 13,60 11,87 13,26 14,02 13,33 9,97 8,36 6,50 9,50 7,82 9,27 7,50 13,72 28,14 75,40 32,33 10,21 Примечание. * – концентрация нистатина в мкМ; ** – концентрация поливинилового спирта, выражена в %. 53 Максимальное количество фермента в культуральной жидкости обнаружено при использовании 750 мМ этанола. С увеличением концентрации этилового спирта снижается накопление биомассы грибом. Установлена специфичность действия этанола, так как другой одноатомный спирт – метанол ингибирует как рост, так и биосинтез каталазы P. piceum даже в низких концентрациях (таблица 1). Заключение. В результате выполненных исследований установлено, что гемсодержащие вещества, метаболические ингибиторы и соединения, нарушающие структуру и функции мембран, в зависимости от их химической природы и концентрации могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на биосинтез каталазы P. piceum. Показано, что интенсификация образования фермента грибом обеспечивается введением в питательную среду гемоглобина, классического разобщителя окислительного фосфорилирования – 2,4-динитрофенола, полиенового антибиотика – нистатина, неионогенного ПАВ – этанола. Данные вещества позволяют увеличить уровень образования внеклеточной каталазы P. piceum в 1,3–4,5 раза. Полученные результаты могут быть использованы при оптимизации состава питательной среды для культивирования продуцента каталазы P. piceum. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 The application of catalase for the elimination of Hydrogen peroxide residues after bleaching of cotton fabrics / A.M. Amorim [et al] // Annals of the Brasilian Academy of Sciens. – 2002. – Vol. 74, № 3. – P. 433–436. Characteristics of immobilized catalase and their application in pasterization of milk with H2O2 / D. Akertek [et al] // Appl. Biochem. Biotechnol. – 1995. – Vol. 50, № 3. – P. 291–303. Способ разложения перекиси водорода (варианты), способ дезинфекции контактных линз (варианты), способ дезинфекции контактной линзы, состав таблетки для разложения перекиси водорода, композиция (варианты): пат. 2126273 С1 Россия, МПК6 А 61 L 2/18 / Д.Н. Кук, Д.Л. Уорсли; заявитель Аллерган, Инк (US). – № 95118443/13; заявл. 09.02.1994; опубл. 20.02.1999. Максименко, А.В. Модифицированные препараты супероксиддисмутазы и каталазы для защиты сердечно-сосудистой системы и легких / А.В. Максименко // Успехи совр. биол. – 1993. – Т. 113, № 3. – С. 351–365. Антитромботическое действие производных каталазы и хондроитинсульфата при артериальном поражении у крыс / А.В. Максименко [и др.] // Вопросы медицинской химии. – 1998. – Т. 44, вып. 4. – C. 362–368. Витилиго: современное состояние проблемы. Новые этиологически обоснованные подходы к терапии / К. Диел [и др.] // Украінський журнал дерматологии, венерологіі, косметологіі. – 2005. – № 3. – С. 25–32. Ультраструктура Penicillium vitale Pidopl. Et. Bilai – продуцента каталази та глюкозооксидази / О.А. Хомутовський [и др.] // Мiкробiол. журн. – 1977. – Т. 39, № 6. – С. 696–701. 54 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ферменты углеводного метаболизма и условия синтеза глюкозооксидазы у Penicillium funiculosum КМ МГУ 433 / М.Б. Куплетская [и др.] // Биотехнология. – 2003. – № 1. – С. 16–21. Optimization of catalase biosyntesis in submerged cultures of Aspergillus niger mutant / A. Gromada [et al] // J. Basic Microbiol. – 1997. – Vol. 37, № 2. – Р. 85–91. Каталаза и супероксиддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов / А.Л. Брюханов [и др.] // Микробиология. – 2002. – Т. 71, № 3. – С. 330– 335. Effect of Triton Х-100 on catalase production by Aspergillus terreus IFO61123 / Y. Nishikawa [et al] // J. Ferment. Bioeng. – 1993. – Vol. 76, № 3. – P. 235–236. Роль каталаз у захистi бiлкiв вiд окислення у дрiжджiв Saccharomyces cerevisiae за використання ними етанолу як джерела вуглецю / Д.В. Господарьов [et al] // Укр. бiохiм. журн. – 2005. – Т. 77, № 2. – С.162–165. Thermo-alkali-stable catalase from Thermoascus aurantiacus and its potential use in textile bleaching process / F. Fang [et al] // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. – 2004. – Vol. 3. – P. 423–428. Влияние компонентов питательной среды на образование внеклеточной каталазы Penicillium piceum F-648 / Ж.И. Павловская [и др.] // Биотехнология. – 2001. – № 3. – С. 18–24. Влияние условий культивирования на образование каталазы и глюкозооксидазы Penicillium piceum F-648 / Ж.И. Павловская [и др.] // Микол. и фитопатол. – 2004. –Т. 38, вып. 1. – С. 77–82. Кинетическая характеристика внеклеточных каталаз грибов Penicillium piceum F-648 и их вариантов, адаптированных к пероксиду водорода / А.Н. Еремин [и др.] // Прикл. биохим. и микробиол. – 2002. – Т. 38, № 4. – С. 374–380. Аминокислотный и углеводный состав экстрактов из солодовых ростков / Г.Н. Фертман [и др.] // Прикл. биохим. и микробиол. – 1969. – Т. 5, № 5. – С. 563–566. Борисова, В.И. Ферменты – активаторы кислорода (терминальные оксидазы) / В.И. Борисова // Методы экспериментальной микологии: сб. науч. ст. / Наук. Думка; под общ. ред. В.И. Билай. – Киев, 1973. – Гл. 4. – С. 95–102. Мороз, И.В. Влияние поверхностно-активных веществ на образование глюкозооксидазы и каталазы Penicillium piceum F-648 / И.В. Мороз, Ж.И. Павловская, Р.В. Михайлова // Микробиология и биотехнология ХХI столетия: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения С.А. Самцевича, Минск, 22–24 мая 2002 г. / НАН Беларуси, отдел. биол. наук, науч. совет по пробл. биотехнол., Ин-т микробиол., концерн «Белбиофарм»; редкол.: А.Г. Лобанок [и др.]. – Минск, 2002. – С. 188–189. INTENSIFICATION OF CATALASE BIOSYNTHESIS BY P E N I C I L L I U M P I C E U M MOROZ I.V., MIKHAILOVA R.V., LOBANOK A.G. Laboratory of enzymes Effect of heme-containing compaunds (haemoglobin, hemin), main precursor of porphyrin synthesis (glycine), metabolic inhibitors (ethidium bromide, actinomycin D, sodium malonate, teophylline, sodium selenate, choline chloride, sodium azide, 2,4-dinitrophenol, hydroxylamine hydrochloride) and substances affecting structure and function of membranes (nistatin, sodium dodecylsulphate, polyvinyl alcohol, methanol and ethanol) on catalase production by mycelial fungi Penicillium piceum was studied. It was shown that haemoglobin, nistatin, ethanol increase the level of enzyme synthesis 1,3−4,5 times. Maximal effect was reached by supplementing 750 mM ethanol into the nutrient medium. 55 УДК 582.284.237+577.152.193 МОРФОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PHELLINUS ROBUSTUS К – ПРОДУЦЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ Осока О.М. , Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. лаборатория ферментов Установлены морфолого-физиологические свойства лигнинразрушающего базидиомицета Phellinus robustus К – продуцента внеклеточной пероксидазы (КФ 1.11.1.7). Показано, что оптимальной для роста Ph. robustus К является температура 26 ˚С; гриб не растет при 4 ˚С, при 35 ˚С скорость роста снижается в 12 раз. Ph. robustus К характеризуется более высокой скоростью роста по сравнению с описанными в литературе штаммами. Синтез пероксидазы Ph. robustus К происходит только при культивировании базидиомицета при 26 ˚С и 30 ˚С. Выявлены отличия в морфологии колоний гриба, выращенных на агаризованных питательных средах различного состава. Введение. Гриб Phellinus robustus (P. Karst.) Bourdot & Galzin 1928 (ложный дубовый трутовик) – представитель семейства Hymenochaetaceae, порядка Hymenochaetales, принадлежит к типу Basidiomycota, классу Hymenomycetes, подклассу Homobasidiomycetes [1]. Способность Ph. robustus к паразитизму на деревьях (более 60 родов) лиственных и хвойных пород, обширный ареал распространения, включающий различные географические регионы (Западная Европа, Европейская часть России, Средиземноморье, Скандинавия, Сибирь, Кавказ, Южная Африка, Северная Америка, Австралия, Новая Зеландия, Китай, Тайвань, Япония, Гавайи), обуславливают наличие фенотипической изменчивости штаммов гриба [1–4]. Из литературных данных известно, что Ph. robustus синтезирует внутри- [5, 6] и внеклеточные [7–9] пероксидазы (КФ 1.11.1.7). Однако, это свойство характерно не для всех штаммов гриба [2]. Для представителей рода Phellinus отмечена зависимость образования пероксидазы от морфологии грибных колоний. Высокий уровень синтеза пероксидазы установлен у Phellinus tremulae, колонии которого характеризуются пушистым мицелием белого или светло-коричневого цвета; отсутствие синтеза фермента выявлено у гриба, образующего колонии темно-коричневого цвета с плотным войлочным мицелием [10]. Различия штаммов Ph. tremulae в зависимости от морфологии колоний выявлены не только по способности синтезировать пероксидазу, а также по 56 скорости роста, секреции тирозиназы, пигмента, летучих ароматических соединений. Поэтому морфологические особенности культур грибов необходимо учитывать при оценке их биосинтетической способности [10]. Ранее нами в результате скрининга наиболее активного продуцента внеклеточной пероксидазы среди 144 видов мицелиальных грибов был отобран Ph. robustus К. Цель исследования – охарактеризовать морфологофизиологические особенности Ph. robustus К в зависимости от состава питательной среды и температуры культивирования. Объекты и методы исследования. В работе использованы: пивное сусло (ОАО «Оливария», Беларусь), L-аспарагин·H2O («ICN Biomedicals, Inc.», США), агар-агар, глюкоза·H2O, KH2PO4, Na2HPO4·12H2O, Zn(NO3)2·6H2O MgSO4·7H2O, FeCl3·6H2O, (ЗАО «5 Океанов», Беларусь), Ca(NO3)2, Mn(CH3COO)2·4H2O, CuSO4·5H2O (ООО «АО Реахим», Россия), тиамин·HCl, пирогаллол («Sigma», США), кора дуба (НПК «Биотест», Беларусь), экстракт солодовых ростков («Difco», США). Кора и древесина бука (Fagus silvatica) получены из Центрального ботанического сада НАН Беларуси. Объектом исследования служил базидиомицет Ph. robustus К. Культура предоставлена заведующей лаборатории экспериментальной микологии ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», д.б.н. В.Г. Бабицкой. Гриб поддерживали методом периодических (1,5–2 мес.) пересевов на скошенном сусло-агаре с 25 об.% содержанием пивного сусла и хранили при 4 ºС. Температурный оптимум роста Ph. robustus К определяли на основании сравнительного анализа скорости роста гриба, выращиваемого на сусло-агаре с 25 об.% содержанием пивного сусла в диапазоне температур 4–35 ºС. В качестве посевного материала использовали агаровые диски (диаметром 0,7 см) краевой части колонии, полученной на сусло-агаре. Для характеристики колоний Ph. robustus К гриб выращивали при 26 ºС на агаризованных средах различного состава (таблицы 1, 2). В качестве посевного материала служил мицелий гриба, полученный на скошенном сусло-агаре. Для определения температурного оптимума биосинтеза внеклеточной пероксидазы Ph. robustus K выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды Линденберга [11], содержащей (г/л): глюкоза·H2O – 5,0; L-аспарагин H2O – 1,14; MgSO4·7H2O – 0,5; KH2PO4 – 0,47; Na2HPO4·12H2O – 0,48; Ca(NO3)2 – 0,05; FeCl3·6H2O – 0,0032; Mn(CH3COO)2·4H2O – 0,0015; Zn(NO3)2·6H2O – 0,002; CuSO4·5H2O – 0,0025; тиамин·HCl 57 – 0,00005 поверхностным способом в диапазоне температур 4–35 ºС в течение 12 сут. В качестве посевного материала на 50 мл питательной среды использовали 40 цилиндрических агаровых дисков (диаметр 0,7 см) краевой части колонии гриба с сусло-агара, содержащего 25 об.% пивного сусла. По окончании культивирования биомассу гриба отделяли фильтрованием, промывали, высушивали при 105 °С до постоянного веса и ее количество определяли весовым методом, а фильтрат культуральной жидкости использовали для анализов. Активность внеклеточной пероксидазы определяли по методу [12]. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует реакцию окисления 1 мкM пирогаллола с максимальной скоростью за 1 сек. Полученные в работе данные являются результатом 3-6-ти кратной повторности опытов и измерений. Все значения приведены в виде средней арифметической ± среднее абсолютное отклонение. Результаты и их обсуждение. В результате исследований установлено, что по отношению к температуре Ph. robustus К принадлежит к мезофильным грибам. Базидиомицет не растет при 4 ºС, при 35 ºС скорость роста снижается до 0,45 мм/сут. Оптимальной для роста гриба является температура 26 ºС: линейная скорость роста на 12 сут достигает 5,43 мм/сут (рисунок 1). Следует отметить, что, согласно данным литературы, штаммы Ph. robustus отличаются как по оптимальным температурным условиям роста, так и по скорости роста. Так, линейная скорость роста штамма Ph. robustus 129 на сусло-агаре при оптимальной температуре (22 ºС) достигает 3,38 мм/сут [2], Ph. robustus М-10 и Ph. robustus К-1551, К-1695, К-1730 на глюкозопептонной агаризованной среде – 3,1 мм/сут (24 ºС) и 2,0–2,8 мм/сут (28 ºС), соответственно [13]. Аналогичные термооптимум (26,5–29,5 ºС) и скорость роста (1,07–3,0 мм/сут) характерны и для других штаммов гриба, выделенных из различных географических регионов [4, 7, 14].Таким образом, Ph. robustus К принадлежит к группе медленнорастущих грибов, но характеризуется более высокой скоростью роста по сравнению с описанными в литературе штаммами Ph. robustus. Установлено, что синтез пероксидазы Ph. robustus K происходит только при выращивании гриба при 26 ºС и 30 ºС (рисунок 2). При этом максимальный уровень образования фермента и накопления биомассы грибом установлен при росте культуры при 26 ºС, при 30 ºС отмечено снижение этих показателей в 10,2 и 1,2 раза, соответственно. Следует отметить, что в интервале рН 5,3– 5,8 питательной среды происходит активный синтез фермента. 58 7 6 5 4 3 2 1 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Длительность культивирования, сут 0 4С 0 15 С 0 20 С 0 26 С 0 30 С 0 35 С Рисунок 1 – Зависимость скорости роста Ph. robustus K от температуры Сравнительное исследование морфологии колоний Ph. robustus К показало (таблица 1), что при выращивании гриба на агаризованных средах с недостаточным количеством источника углерода и витаминов (агаризованные синтетическая среда Линденберга и 0,5% экстракт солодовых ростков) гриб рос слабо, мицелий был рыхлым, белым, паутинистым. Скорость роста гриба (таблица 2) на этих средах в 1,26–1,42 раза ниже, чем на 25% сусло-агаре. На средах с повышенным содержанием питательных веществ скорость роста увеличивается, мицелий становится более плотным, на 11-е сутки роста наблюдается образование пигмента желтого или светло-коричневого цвета. Кольцеобразное распределение пигмента в агаризованной среде свидетельствует о том, что пигментообразование может происходить периодически, и, возможно, зависит от морфологических, возрастных изменений мицелия в процессе роста и концентрации источника углерода. Следует отметить, что, согласно литературным данным, Ph. robustus образует меланины пирокатехинового типа [13, 15–18]. 59 14 Биомасса, мг/мл Пероксидаза, ед/мл конечный рН 12 10 8 6 4 2 0 0 4С 0 15 С 0 20 С 0 26 С 0 30 С 0 35 С Рисунок 2 – Зависимость роста Ph. robustus K и синтеза пероксидазы от температуры культивирования. Вес посевного материала (40 агаровых дисков с мицелием гриба) – 2,0 мг/мл. При выращивании Ph. robustus К на 25% и 50% сусло-агаре наблюдается изменение окраски мицелия от белого до охрянокоричневого, а также образование четкой зоны апикального мицелия белого цвета (рисунок 3). Образование коричневого пигмента отмечено только в центре колоний, в зоне наиболее старого мицелия. Рисунок 3 – Морфология колонии Ph. robustus K на сусло агаре, содержащем 25% пивного сусла 60 Таблица 1 – Особенности морфологии колоний Ph. robustus K на агаризованных средах различного состава Агаризован- Тип коная среда лоний 1 2 50% сус- Колонии ло бархатистовойлочные, 25% сус- гладкие или конло центрические, гифы очень короткие, мицелий плотный, кожи25% сус- стый, ло + 1% край ровный, четэкстракт коры дуба кая зона белого или светложелтого 25% сус- апикальло + 2% ного мицелия. измельченной коры дуба 25% сусло + 2% измельченной коры бука 25% сусло + 2% измельченной древесины бука Цвет, край и пигментация колоний 3 Цвет мицелия изменяется от светло-желтого (6 сут) до охряно-коричневого (11 сут). На 8 сут появляется четкая зона белого апикального мицелия. Наличие коричневого пигмента в центре колонии отмечено к 8 сут. Цвет мицелия изменяется от светло-желтого (6 сут) до желтого (9 сут) и охрянокоричневого (11 сут). На 8 сут появляется четкая зона белого апикального мицелия. Светло-коричневый пигмент в центре колонии определяется на 6 сут, цвет пигментированной зоны изменяется до коричневого на 9 сут роста. На 18 сут пигментирован центр колонии или отмечено кольцеобразное ее пигментирование. Цвет мицелия изменяется от светло-желтого (6 сут) до желтого (8 сут). На 8 сут появляется четкая зона белого апикального мицелия. Коричневый пигмент в центре колонии отмечается на 6 сут, цвет пигментированной зоны изменяется до темно-коричневого на 11 сут роста, пигментация распределяется почти по всему диаметру колонии. Мицелий желтый, зона светло-желтого апикального мицелия узкая. Темно-коричневый пигмент, почти черный, появляется на 6 сут, выходит в агаризованную среду за пределы краев колоний. Цвет мицелия изменяется от темно-желтого (6 сут) до светло-коричневого (8 сут) и охряно-коричневого (11 сут). Светло-коричневый пигмент появляется на 6 сут и распределен по всему диаметру колонии. Цвет мицелия изменяется от светлокоричневого (6 сут) до охряно-коричневого (11 сут). Пигментация колонии отсутствует. 61 1 0,5% экстракт солодовых ростков 3% экстракт солодовых ростков Среда Линденберга с 0,5% глюкозы Среда Линденберга с 3% глюкозы 2 Колонии паутинистые, пушистые, воздушный мицелий высокий, рыхлый, край ровный, зона апикального мицелия не видна. Продолжение таблицы 1 3 Мицелий белый, рыхлый. Пигментация колонии отсутствует. Мицелий белый, рыхлый. На 11 сут середина колонии – войлочная, светло-коричневая, затем изменяется до темно-коричневой к 18 сут роста. Пигмент светло-коричневый (11 сут), изменяется до темно-коричневого (18 сут), распределен кольцеобразно. Мицелий белый, рыхлый. Пигментация колонии отсутствует. Мицелий белый, рыхлый. Светло-желтый пигмент отмечен в центре колонии на 11 сут, цвет пигментированной зоны изменяется до желтого на 18 сут роста. Таблица 2 – Скорость роста Ph. robustus K на агаризованных средах различного состава Среда 50% сусло 25% сусло 25% сусло + 1% экстракт коры дуба 25% сусло + 2% измельченной коры дуба 25% сусло + 2% измельченной коры бука 25% сусло + 2% измельченной древесины бука 0,5% экстракт солодовых ростков 3% экстракт солодовых ростков Среда Линденберга с 0,5% глюкозы Среда Линденберга с 3% глюкозы Максимальная линейная скорость роста, мм/сут 5,66±0,84 (8 сут) 6,53±0,64 (6 сут) 6,43±0,90 (6 сут) 4,94±0,81 (8 сут) 6,50±1,0 (6 сут) 6,75±0,63 (8 сут) 5,17±0,17 (9 сут) 6,14±0,36 (9 сут) 4,59±0,81 (9 сут) 4,78±0,33 (9 сут) Однако избыток питательных веществ в среде (50% сусло-агар) приводит к ингибированию роста гриба: максимальная линейная скорость роста Ph. robustus K в 1,15 раз ниже по сравнению с указанным показателем, полученным при выращивании гриба на 25% сусло-агаре (таблица 2). 62 Наличие компонентов древесных субстратов в агаризованной питательной среде влияет на скорость роста гриба и пигментообразование. При добавлении в среду водного экстракта и измельченной коры дуба отмечено снижение скорости роста Ph. robustus K в 1,02 и 1,32 раза, соответственно, использование измельченной коры бука не оказывало влияния на этот показатель, при выращивании на среде с измельченной древесиной бука скорость роста культуры увеличивалась в 1,03 раза. Повышение содержания дубильных веществ в питательных средах, содержащих кору дуба, приводило к усилению распространения пигментов в среду за пределы края колоний уже на 6 сут. роста гриба, что, по-видимому, является реакцией на присутствие в питательной среде токсических соединений. Следует отметить и различия цвета пигментированной зоны колоний: на среде с измельченной корой дуба Ph. robustus К секретировал пигмент черного цвета, на среде с корой бука пигментация колонии светло-коричневая. При выращивании базидиомицета на среде с древесиной бука пигмент отсутствовал. Эти результаты дают основание предположить стимуляцию пигментообразования гриба фенольными соединениями. Нами установлено, что при выращивании Ph. robustus К на сусло-агаре с 0,001М пирогаллола – электронодонорного субстрата пероксидазы – максимальная радиальная скорость роста гриба снижалась в 1,25 раз, а на среде с 0,01 М пирогаллола рост Ph. robustus К полностью подавлялся. Одновременно увеличилась секреция пигмента в агаризованную среду: на среде с 0,001 М пирогаллола темно-коричневая пигментированная зона распределена по всей поверхности колонии, с 0,01 М пирогаллола – максимальная радиальная скорость зоны диффузии пигмента в сусло-агар вокруг нерастущего мицелия, служащего в качестве посевного материала, – 1,68 мм/сут. Таким образом, содержание в питательной среде достаточного количества источника углерода, а также различных дополнительных факторов роста, отражается на морфологии культуры Ph. robustus K, в частности, на плотности и окраске мицелия. Следует отметить, что способность синтезировать внеклеточную пероксидазу зависит от морфологических особенностей колоний Ph. robustus K: синтез фермента наблюдали только при использовании в качестве посевного материала бархатистовойлочных колоний с плотным светло-желтым или охрянокоричневым мицелием (таблица 1). Такой тип колоний характеризуется также секрецией метилового эфира бензойной кислоты [19]. 63 Заключение. Таким образом, в результате выполненных исследований определены морфолого-физиологические особенности колоний Ph. robustus K при росте на агаризованных питательных средах различного состава. Установлено, что Ph. robustus K характеризуется более высокой скоростью роста (в 1,93– 6,10 раз) по сравнению с описанными в литературе штаммами гриба, максимальная скорость роста базидиомицета и уровень биосинтеза внеклеточной пероксидазы наблюдается при температуре 26 ºС. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Бондарцев, А.С. Трутовые грибы Европейской части СССР и Кавказа / А.С. Бондарцев. – Москва–Ленинград: Из-во АН СССР, 1953. – С. 361–365. Гандбаров, Х.Г. Эколого-физиологические особенности дереворазрушающих высших базидиальных грибов / Х.Г. Гандбаров. – Баку: ЭЛМ, 1989. – 200 с. Fungal databases // Systematic Botany and Mycology Laboratory [Electronic resource]. – 2007. – Mode of access: http://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases. – Date of access: 15.05.2007. Centraalbureau voor Schimmelcultures // Fungal Biodiversity Center [Electronic resource]. – 2006. – Mode of access: http://www.cbs.knaw.nl/scripts/ Aphyllophorales.dll. – Date of access: 23.04.2007. Iзоферменти пероксидази вищих базидiальних грибiв / Г.Г. Мельничук [и др.] // Укр. бiохим. журнал. – 1976. – Т. 33, № 3. – С. 252–256. Isozyme analysis on some wood decay fungi / T. Annesi [et al.] // J. of plant pathology. – 2003. – Vol. 85, № 2. – P. 87–90. Lyr, H. Untersuchungen über die Peroxydasen höherer Pilze / H. Lyr // Planta. – 1956. – Vol. 48. – P. 239–265. Lyr, H. Über den Nachweis von Oxydasen und Peroxydasen bei höheren Pilzen und die bedentung dieser Enzyme für die Bavendamm-reaction / H. Lyr // Planta. – 1958. – Vol. 50. – P. 359–370. Решетникова, И.А. Поиск грибов – продуцентов пероксидазы / И.А. Решетникова [и др.] // Микология и фитопатология. – 1992. – Т. 26, № 5. – С. 383–387. Кочаловский, С.Б. Сердцевидная гниль осины / С.Б. Кочаловский. – Минск: Ураджай, 1976. – 208 с. Łobarzewski, J. Stimulation of peroxidase activity in Inonotus radiatus and Phellinus pini fungi / J. Łobarzewski // Ann. Univ. Mariae Curie-Skłodowska: Sec. C, Biologia. – 1970. – Vol. 25, № 3. – P. 15–21. Gramss, G. Activity of oxidative enzymes in fungal mycelia from grassland and forest soils / G. Gramss // J. basic microbiol. – 1997. – Vol. 37, № 6. – P. 407–423. Влияние температуры на синтез меланина грибами Phellinus robustus и Inonotus obliquus в поверхностной культуре / Н.В. Иконникова [и др.] // Успехи медицинской микологии: материалы 4 Всеросс. конгр. по медицинской микологии, Москва, 29–31 марта 2006 г.: в 7 т. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – Москва, 2006. – Т. 7. – С. 238–240. Stalpers, J.A. Identification of wood-inhabiting Aphyllophorales in pure culture / J.A. Stalpers // Studies in Micology. – 1978. – № 16. – 248 с. Природа меланиновых пигментов некоторых микро- и макромицетов / В.Г. Бабицкая [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. – 2002. – Т. 38, № 3. – С. 286–291. 64 16 17 18 19 Меланиновые пигменты макромицетов / В.Г. Бабицкая [и др.] // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1998. – № 3. – С. 83–88. Меланиновые пигменты некоторых мицелиальных грибов / А.А. Малама [и др.] // Весцi АН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1996. – № 4. – С. 68–73. Иконникова, И.В. Высшие грибы – перспективные продуценты меланиновых пигментов / И.В. Иконникова // Микология и альгология – 2004: материалы юбилейной конф., посвящ. 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 2 фев. 2004 г. / Моск. гос. ун-т, редкол.: Ю.Т. Дьяков [и др.]. – Москва, 2004. – С. 65–66. Осока, О.М. Образование метилбензоата базидиомицетом Phellinus robustus K / О.М. Осока [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы междунар. науч. конф., Минск– Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси, Ин-т микробиологии; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск–Раков, 2006. – С. 198–200. MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PHELLINUS ROBUSTUS K – PRODUCER OF PEROXIDASE OSOKA O.M., MIKHAILOVA R.V., LOBANOK A.G. Laboratory of enzymes Morphological and physiological properties of lignin-destructing basidiomycete Phellinus robustus K – producer of extracellular peroxidase (EC 1.11.1.7) were established. It was shown that temperature optimum for Ph. robustus K growth is 26 °C; the fungus does not grow at 4 °C, at 35 °C growth rate is decreased in 12 times. Ph. robustus K is characterized by higher rate of growth in contrast to strains described in the literature. Synthesis of peroxidase of Ph. robustus K occurs only during basidiomycete cultivation at 26 and 30 °С Morphological distinctions of fungal colonies at its growth on agar mediums with different composition were revealed. УДК 579.222.3 ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Самарцев А.А. лаборатория молочнокислых и бифидобактерий Приводятся сведения о протеазах пробиотических микроорганизмов. Отмечается, что большинство этих ферментов представлено сериновыми и металлопротеиназами. Дается информация о субстратной специфичности протеаз пробиотиков. Протеолитические ферменты играют ключевую роль в осуществлении многих нормальных и патологических процессов микробной клетки. Это клеточный рост и морфогенез, активация 65 зимогенов, транспорт секреторных белков и пептидов и др. Внеклеточные протеазы микроорганизмов принимают участие, главным образом, в гидролизе крупных белковых молекул до небольших пептидных остатков, впоследствии транспортируемых внутрь клетки, в то время как внутриклеточные – регулируют клеточный метаболизм. Гидролиз молекул белков и полипептидов внеклеточными протеиназами является важнейшей функцией в обеспечении клетки азотным питанием. Протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многочисленны и сильно различаются по своим физикохимическим характеристикам, спектрам, оптимумам и особенностям действия на гидролизуемый субстрат. Для многих бактерий характерно образование протеиназ серинового типа. Представители мицелиальных грибов образуют более разнообразные по своему составу и свойствам протеиназы. Их ферменты активны в широком диапазоне pH и обладают широкой субстратной специфичностью [1–3]. Протеазы микроорганизмов наиболее удобны для применения в биотехнологических процессах промышленного производства. Протеолитические ферменты, образуемые некоторыми микроорганизмами, представляют огромный коммерческий интерес и производятся в промышленных масштабах. Препараты таких ферментов получают с использованием генетически модифицированных микроорганизмов, которые содержат гены, кодирующие необходимые протеолитические ферменты [4–5]. Пробиотические микроорганизмы в настоящее время чрезвычайно широко используются в производстве разнообразных продуктов и препаратов, которые, при их приеме, позволяют изменять в лучшую сторону нарушенный баланс полезной микрофлоры макроорганизма. Пробиотические микроорганизмы снижают количество «вредных» микроорганизмов, минимизируют отрицательное действие неблагоприятных факторов различной природы, улучшают пищеварение, усиливают неспецифический иммунитет и, в целом, оказывают позитивное действие на макроорганизм. Пробиотические микроорганизмы, часто их называют пробиотики, включают в себя представителей, главным образом, родов Lactobacillus и Bifidobacterium, а также отдельных представителей бактерий родов Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Bacillus, дрожжей Saccharomyces и некоторых других [6–13]. Представители пробиотических микроорганизмов, за исключением, вероятно, бифидобактерий, характеризуются достаточно высоким уровнем протеолитической активности. Образование таких ферментов характерно для лактобацилл, стреп- 66 то- и лактококков, которые отличаются сложными пищевыми потребностями. В частности, они нуждаются в свободных аминокислотах. Высокая протеолитическая активность в данном случае – очень важное свойство, поскольку позволяет молочнокислым микроорганизмам быстро развиваться на молоке, в котором слишком мало свободных аминокислот, необходимых для их нормального роста. При гидролизе казеина микробные клетки получают необходимые аминокислоты и пептиды. Способность пробиотических микроорганизмов эффективно сквашивать молоко широко используется в производстве ферментированных молочных продуктов [14–16]. Протеолитические ферменты молочнокислых микроорганизмов достаточно вариабельны по молекулярной массе (от 40 до 200 кДа), среди них встречаются, главным образом, сериновые и металлопротеиназы, большинство их имеют оптимум рН поряд0 ка 7,0±0,5 и температурный оптимум действия порядка 40±10 С. Хорошо изучены биохимические и генетические особенности протеолитических систем ассоциированных с клеточной стенкой лактококков. В составе протеолитической системы лактококков присутствуют протеолитические ферменты с различной субстратной специфичностью и оптимумом действия, что позволяет им эффективно расщеплять молочный белок. Их протеиназы исследователями разделены на две основные группы: предпочтительно гидролизующие β-казеин и протеиназы, которые, помимо β-казеина, гидролизуют также его α- и κ-формы. Установлено, что протеиназы лактококков относятся к сериновому типу, имеют высокую молекулярную массу, pH оптимум между 6 и 7. У всех изученных штаммов лактококков гены, кодирующие протеиназы, локализованы на плазмидах различного размера. Образуют лактококки и различные пептидазы, завершающие расщепление пептидов [17]. Установлено, что штамм Lactococcus lactis subsp. cremoris NCDO 1201 образует внелеточную и ассоциированную с клеточной стенкой протеиназы. Наивысший уровень протеолитической активности в культуральной жидкости при росте данного штамма авторы наблюдали в конце экспоненциальной и начале стационарной фазы, в то время как та же активность, ассоциированная с клетками наблюдалась в конце экспоненциальной фазы. Причем уровни активности свободной и ассоциированной с клеточной стенкой протеиназы были сопоставимы. Обе формы протеиназы имели pH оптимум между 4,6 и 5,8 и этапы очистки подтвердили, что они имеют родственную природу. Проведение электрофореза показало, что это два основных вида белковых молекул названных pro150 и 67 pro115, обладающих протеиназной активностью и с молекулярной массой 150 кДа и 115 кДа. При гель-фильтрации масса pro150 оказалась 300 кДа, а pro115 – 125 кДа, т.о. pro150 оказался димером, а pro115 – мономером. Дальнейшие исследования показали, что pro115 является продуктом автодеградации pro150 [18]. Наличие протеиназ различной локализации (внеклеточные, клеточносвязанные, внутриклеточные) установлено у бактерий р. Lactobacillus. Эти ферменты выделены и охарактеризованы. В основном они отвечают за гидролиз белков молока. Дополняют протеолитическую систему лактобацилл многочисленные внутриклеточные пептидазы. Исследование протеолитических ферментов, которые образуют различные штаммы вида Lactobacillus casei, показало, что они имеют много общего с аналогичными ферментами, образуемыми лактококками. Характеристики протеиназ, образуемых Lactobacillus plantarum, близки к таковым Lacrtobacillus casei, хотя имеются противоречивые данные о специфичности действия тех и других. Штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus отличаются образованием в процессе роста множественных форм белков, обладающих протеолитической активностью. Эти микроорганизмы широко используются в производстве ферментированных молочных продуктов [19–23]. Так, например, исследование способности штамма Lactobacillus bulgaricus ACA DC235 гидролизовать казеин показало, что в этом процессе участвуют две ассоциированные с клеточной стенкой протеиназы. Подтверждением этого было значительное высвобождение протеолитической активности у данного микроорганизма при обработке клеток лизоцимом. Причем уровень протеолитической активности Lactobacillus bulgaricus при росте на молоке был значительно выше, чем на синтетической питательной среде, содержащей пептиды. Дальнейшее выделение, очистка и характеристика протеиназ показали, что одна из них инактивируется ЭДТА, восстанавливает актив2+ ность в присутствии Zn и является Zn-зависимой термостабильной металлопротеиназой. Другой фермент ингибировался фенилметилсуфонилфторидом (ФМСФ), был нечувствителен к N-этилмалеимиду, активировался Ca 2+ и являлся термолабильной сериновой протеазой [24]. Ассоциированные с клеточной стенкой протеиназы отвечают за деградацию казеина штаммами L. delbrueckii subsp. lactis. Ассоциированная с клеточной стенкой протеиназа штамма L. Delbrueckii subsp. lactis ACA-DC 178 преимущественно гидролизует β-казеин и, в значительно меньшей степе- 68 ни, его α- и κ-формы. Фермент является сериновой протеиназой с оптимумом pH 6,0 и оптимумом температуры 40 0C. По своим биохимическим особенностям фермент близок к протеиназам, образуемым другими молочнокислыми микроорганизмами. Ген, кодирующий этот фермент, находится в хромосомальной ДНК [25]. Штаммы Lactobacillus helveticus способны гидролизовать α- и β-формы казеина. Штамм L. helveticus СЗ790 образует сериновую протеиназу с молекулярной массой 45 кДа, pH оптимумом 7,0, температурным оптимумом 40 0С [26]. Молочнокислые бактерии, помимо применения в производстве различных кисломолочных продуктов, также широко используются в качестве стартерной закваски в производстве отдельных изделий из теста. Так, L. sanfrancisco находится в симбиотических отношениях с дрожжами Saccharomyces exiguus и принимает участие в ферментативном сбраживании теста. Этот микроорганизм обладает наиболее мощной протеолитической системой из обнаруженных в сквашенном тесте других молочнокислых бактерий [27]. Протеолитическая система L. sanfrancisco содержит ферменты с протеолитической, дипептидазной и аминопептидазной активностями. У штамма L. sanfrancisco CB1 были проведены очистка и получена характеристика протеолитических ферментов. Протеиназа штамма имела молекулярную массу 57 кДа, рН оптимум 0 действия 7,0, температурный оптимум – 40 С. Очищенные дипептидаза и аминопептидаза имели массу 65 и 75 кДа, pH оптимум действия 7,5, температурный оптимум действия 35 и 30 0С, соответственно. Исследование влияния ингибиторов на очищенные ферменты показало, что протеиназа относится к сериновому типу, дипептидаза и аминопептидаза подавляются металлохелатирующими агентами и являются металлзависимыми [28]. Сериновой протеиназой является фермент клеточной стенки штамма Streptococcus thermophilus CNRZ 385. Оптимальный рН для его действия 7,5, оптимум температуры – 37 0С. Исследования специфичности действия протеиназы на субстрат позволили установить, что фермент занимает промежуточное положение между типами PI и PIII протеиназ лактококков [29]. Крайне ограничена в доступной литературе, по сравнению с другими представителями пробиотических микроорганизмов, информация о протеолитических ферментах бифидобактерий. Объяснением этого может быть и низкий уровень продукции, 69 и сложность выделения и характеристики данного класса гидролаз у этих микроорганизмов. Известно, что не многие бифидобактерии могут использовать белки как источник аминного азота в процессе роста. Однако, некоторые из них образуют внеклеточные протеазы, гидролизующие казеин, в частности его α- и β-формы, альбумин, некоторые иммуноглобулины. Образование протеаз отдельными штаммами B. longum и B. infantis установлено при их росте на молоке. Выявлена прямая корреляция между активностью роста бифидобактерий на молоке и их протеолитической активностью. При исследовании гидролиза белков молока представителями четырех различных видов бифидобактерий было установлено, что наибольшим уровнем активности протеолитических ферментов обладают B. longum и B. angulatum в сравнении с B. breve и B. bifidum. Методом селекции по уровню протеолитической активности был получен штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis БИМ В-87Д. Установлено, что продуцируемые данным штаммом протеиназы активны в широком диапазоне рН и способны гидролизовать различные белковые субстраты, в том числе и казеин [30–33]. После расщепления протеиназами пробиотических микроорганизмов молекул белка, в частности казеина, на пептиды различного размера их последующая деградация осуществляется различными пептидазами. Помимо образования внеклеточных протеиназ, штаммы S. cremoris (аналог Lactococcus сremoris по некоторым источникам) образуют различные пептидазы, локализованные на поверхности клеточной мембраны. Это такие ферменты как аланиламинопептидаза, пролиламинопептидаза, пирролидонкарбоксилатпептидаза, лейцил-, лизил- и глутаматаминопептидаза. Три последних фермента обнаруживаются только в растворимой фракции после ультразвуковой обработки клеток. Интересным является факт, что, хотя все пептидазы находятся внутри клеточной мембраны, однако уровень пептидазной активности целых клеток оказывается выше, чем разрушенных [34]. У штаммов Lactobacillus lactis и Streptococcus thermophilus показано наличие внутриклеточных аргининаминопептидазы, лейцин-аминопептидазы, глицил-пролиндипептидазы и лейцил-лейцин-дипептидазы. Ферменты, отвечающие за расщепление белков у этих штаммов, ассоциированы с клеточной стенкой, а также в мембранной и цитоплазматической фракциях. Установлено отличие протеазы кле- 70 точной стенки от внутриклеточных протеолитических ферментов [35]. Гидролиз пептидов у термофильных вариантов Lactobacillus delbrueckii обеспечивают пролилдипептидиламинопептидаза (образование этого фермента характерно для большинства лактобацилл), а также аргинин-, лизин-, лейцин- и пролин-аминопептидаза. Большинство из обнаруженных пептидаз находились в цитоплазматической фракции [36]. В процессе своего роста штаммы L. helveticus образуют высокие уровни аминопептидазы широкого спектра действия и пролин-пролил-аминопептидазу, которые способны отщеплять как одиночные аминокислоты, так и ди- и трипептиды от более крупных полипептидов. У штамма L. helveticus ITGL1 это обеспечивают две клеточносвязанные аминопептидазы. Одна из них катализирует гидролиз L-лизин-p-нитроанилида. Фермент является мономером с молекулярной массой 97 кДа, 0 0 оптимумом pH 6,5, оптимумом температуры 50 С. При 60 С активность теряется. Протеиназа полностью ингибируется бестатином, ЭДТА, фенантролином и двухвалентными ионами Zn и Cu. Восстановление активности фермента, обработанного ЭДТА, возможно в присутствии ионов Co 2+, Ca 2+ или Mn 2+ . Фермент является металлопротеиназой [37–39]. Экзопептидазы различного типа образуют бифидобактерии. Из B. breve была выделена пролинаминопептидаза и получена ее характеристика. Молекулярная масса фермента составляет 67 кДа, оптимум рН 6,8, оптимум температурного действия – 37 0С. Фермент способен гидролизовать пептиды с остатком Lпролина на N-конце молекулы. Образование пептидаз исследовано у B. infantis, B. longum и B. adolescentis. Установлено, что все три вида продуцируют ферменты, обладающие аминопептидазной, дипептидазной, трипептидазной и карбоксипептидазной активностями. Была исследована протеолитическая система штамма B. animalis subsp. lactis. Установлено образование этим микроорганизмом различных внутриклеточных аминопептидаз. Была выделена и охарактеризована внутриклеточная эндопептидаза О [40, 41]. Исследования по регуляции уровня протеолитической активности факторами среды показали, что он находится в строгой зависимости от концентрации пептидов в составе питательной среды. Исследования, проведенные со штаммами L. lactis и L. cremoris показали, что наивысший уровень протеиназной активности клеток наблюдался на молочной среде с низким уровнем свободных аминокислот и пептидов. Была установлена важная роль дипептидов и, в частности, пролил- 71 лейцина, в зависимой от фактора роста регуляции протеолитической активности. В присутствии этого дипептида происходила репрессия образования клеточносвязанной протеиназы и внутриклеточных протеиназ. Наличие гидролизата казеина в питательной среде также приводит к подавлению продукции протеиназ лактококками. И только в конце стационарной фазы роста, когда содержание свободных аминокислот и пептидов в среде значительно снижается, наблюдается максимальный уровень протеолитической активности. К двух- или пятикратному снижению уровня продукции протеиназ на сывороточной среде приводило использование в ее составе в качестве источника аминокислот 0,5 или 2,0% казитона, соответственно [42, 43]. Было исследовано влияние на продукцию протеиназы штаммами L. helveticus таких источников азота, как аминокислоты, дипептиды, казитон и казеин. Установлено, что пептиды молекулярной массой до 3 кДа из казитона и дипептид лейцилпролин играют важную роль в регуляции протеиназной активности. Добавление лейцилпролина в концентрации 5 мМ к питательной среде приводило к падению протеиназной активности до уровня 25% от исходного [44]. При исследовании роста на молоке Streptococcus thermophilus установлено две различных экспоненциальных фазы роста культуры, на протяжении которых происходит инициация синтеза протеиназ. Утилизация казеина на второй экспоненциальной фазе связана со снижением ростовой активности, которая вызывается, вероятно, снижением уровня свободных пептидов в среде и, соответственно, их транспортом в клетку. Концентрация в молоке аминокислот, необходимых для роста S. thermophilus, очень низкая. Но, благодаря наличию протеиназы, ассоциированной с клеточной стенкой, транспортной системы для пептидов и широкого спектра внутриклеточных пептидаз, S. thermophilus способен эффективно утилизировать молочный казеин подобно тому механизму, который описан для стрептококков. Для объяснения особенностей роста S. thermophilus были использованы нормальные штаммы, а также мутантные, не образующие протеиназу. Было установлено, что при внесении в молоко глутамина и метионина, существенных для развития S. thermophilus, наблюдали только одну экспоненциальную фазу роста. Дальнейшие исследования показали, что в молоке развитие S. thermophilus в первоначальной стадии характеризуется резким снижением некоторых свободных аминокислот. Было высказано предположение, что не происходит экспрессии 72 протеиназы S. thermophilus на начальных стадиях роста. Вторая экспоненциальная фаза характеризуется снижением уровня роста бактерий, несмотря на образование протеиназы, что может быть связано с ослаблением процесса утилизации казеина. Однако, некоторые аминокислоты и пептиды накапливаются в молоке на протяжении этой фазы. С использованием дефектных по уровню протеиназы штаммов была показана возможность их роста на молоке, после выращивания в нем «нормальной» культуры S. thermophilum. Полученные авторами результаты свидетельствуют, что «нормальный» штамм на протяжении своего роста обогащает молоко аминокислотами и пептидами, которые могут использовать для своего роста мутантные штаммы [45]. С использованием методов иммунологического анализа исследованы протеолитические системы штаммов Streptococcus cremoris, используемые в производстве сыра. В результате было обнаружено четыре различных белка, ассоциированных с поверхностью клеточной стенки и обладающих протеолитической активностью. Установлено, что для каждого штамма характерна своя особая комбинация белков, обладающих протеолитической активностью. Один из этих белков образуют в процессе роста все исследованные штаммы. На основе анализа полученных результатов авторы разделили штаммы Streptococcus cremoris на четыре различных группы. При росте штаммов S. сremoris на полноценной питательной 2+ среде MRS содержащей 8 мM Са протеолитические ферменты не удавалось обнаружить с помощью иммуноэлектрофореза, однако, протеолитическая активность присутствовала, когда те же штаммы росли на искусственной среде определенного состава с казеином или на молоке. В результате экспериментов было установлено, что продукция протеиназ штаммов S. сremoris подвержена метаболической регуляции [46]. Анализ научных работ о протеолитических системах пробиотических микроорганизмов свидетельствует о достаточно глубоком исследовании протеолитических систем молочнокислых бактерий. Доступны многочисленные публикации, посвященные изучению особенностей продукции, свойствам, выделению и очистке протеаз лактобацилл, лакто- и стрептококков, использовании штаммов лактококков с целью получения сверхпродукции определенных протеиназ. Несомненный интерес представляют исследования, направленные на выяснение особенностей функционирования протеолитических систем пробиотических микроорганизмов р. Bifido- 73 bacterium, которые занимают особое место среди представителей нормальной кишечной микрофлоры, имеют важное значение для развития высокой резистентности организма по отношению к патогенной микрофлоре, обладают иммуномодулирующим, противоопухолевым и др. эффектами, являются основой ряда пробиотических препаратов, компонентами кисломолочных продуктов. Ряд доказанных положительных эффектов пробиотических микроорганизмов на организм человека и животных является веским основанием их использования в лечении и профилактике различных дисбактериозов и сопутствующих инфекций. Способность отдельных представителей пробиотиков к достаточно активной продукции протеолитических ферментов является дополнительным ценным свойством, т.к. позволяет получать с использованием этих микроорганизмов кисломолочные продукты, которые обладают приятным для потребителей вкусом и консистенцией и содержат в достаточ6 но высоких концентрациях (не менее 10 КОЕ/мл на конец срока годности) живые пробиотические бактерии. По-прежнему высок коммерческий интерес к бифидобактериям, поскольку рынок пробиотических продуктов продолжает активно развиваться. Однако, в сравнении с другими пробиотическими микроорганизмами, имеющиеся данные о протеолитических системах бифидобактерий весьма немногочисленны и не дают исчерпывающей информации о протеазах бифидобактерий. Вместе с тем, без ясных знаний о физиолого-биохимических особенностях конкретного штамма сегодня представляется достаточно проблематичным создание новых высокоэффективных пробиотических препаратов. Исследование протеолитических систем бифидобактерий важно и в связи с большой популярностью среди потребителей именно кисломолочных пробиотических продуктов, обладающих комплексным позитивным действием на макроорганизм. Создание новых продуктов с использованием чистых культур бифидобактерий предполагает наличие у них такого производственно ценного признака как высокий уровень протеолитической активности (помимо образования некоторых других ферментов), необходимый для активного роста на молоке и сквашивания его. Важно также сохранение этого признака при длительной работе с культурой. Крайне мало в литературе сведений о физиологических путях повышения протеолитической активности, о влиянии различных факторов среды на биосинтез протеиназ у бифидобактерий. Работа в данном направлении, несомненно, представляет как сугубо практиче- 74 ский, так и теоретический интерес в плане расширения представлений о биологии микроорганизмов. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Barrett, A. Classification of peptidases / A. Barett // Methods Enzymol. – 1994. – Vol. 244, № 1. – P. 1–15. Phadatare, S. High activity alkaline protease from from Conidiobolus coronatus (NCL 86.8.120): enzyme production and compatibility with commercial detergents / S. Phadatare, M. Scrinivasan, V. Desphande // Enzyme Microb. Technol. – 1993. – Vol. 15, № 1. – P. 72–76. Cloning and disruption of the gene encoding an extracellular metalloproteinase of Aspergillus fumigatus / K. Jaton-Ogay [et al] // Mol. Microbiol. – 1994. – Vol. 14. – P. 917–928. Cloning of the gene encoding streptococcal immunoglobulin A protease and its expression in Escherichia coli / J. Gilbert [et al] // Infect. Immun. – 1988. – Vol. 56, № 8. – P. 1961–1966. Hodgson, J. The changing bulk catalysis market recombinant DNA techniques have changed bulk enzyme production dramatically / J. Hodgson // Biotechnology. – 1994. – Vol. 12. – P. 789–790. Guidelines for the evaluation of probiotics in food // Report of a Joint FAO/WHO group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food [Electronic resource]. – 2002. – Mode of access: ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf. – Date of access: 22.09.2006. Overview of gut flora and probiotics / W. Holzarfel [et al] // Int. J. Food. Microbiol. – 1998. – Vol. 41, №1. – P. 85–101. Saccharomyces boulardii protease inhibits the effects of Clostridium difficile toxins A and B in human colonic mucosa / I. Castagliuolu [et al] // Infect. Immun. – 1999. – Vol. 67, № 1. – P. 302–307. Lactococci as probiotic strains: adhesion to human enterocyte-like Caco-2 cells and tolerance to low pH and bile / H. Kimoto [et al] // Let. Appl. Microbial. – 1999. – Vol. 29, № 5. – P. 313–316. Arunachalam, K. Role of bifidobacteria in nutrition, medicine and technology / K. Arunachalam // Nutr Res. – 1999. – Vol. 19. – P. 1559–1597. Bacteria used for the production of yogurt inactivate carcinogens and prevent DNA damage in the colon of rats. / I. Wollowski [et al] // J. Nutr. – 1999. – Vol. 129, № 1. – P. 77–82. Szajewska, H. Mets-analysis non-pathogenic yeast Saccharomyces boulardii in the prevention of antibiotics-associated diarrhea / H. Szajewska, J. Mirukowicz // Aliment. Pharmacol. Ther. – 2005. – Vol. 22, № 5. – P. 365–372. Chermesh, I. Probiotics in the gastrointestinal tract: where are we in 2005 / I. Chermesh, R. Eliakim // World J. Gastroenterol. – 2006. – Vol. 12, № 6. – P. 853–857. Tamime, A. Fermented milks: a historical food with modern applications – a review / A. Tamime // Eur. J. Clin. Nutr. – 2002. – Vol. 56, № 4. – P .2–15. Effect of milk base and starter culture on acidification, texture, and probiotic cell counts in fermented milk processing / I. Sodini [et al] // J. Dairy Sci. – 2002. – Vol. 85, № 10. – P. 2479–2488. Fermented milks, probiotics cultures, and colon cancer / J. Saikali [et al] // Nutr. Cancer. – 2004. – Vol. 49, № 1. – P. 14–24. Comparative study of action of cell wall proteinases from various strains of Streptococcus cremoris on bovine αs1-, β- and κ-casein / S. Visser [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1986. – Vol. 52, № 5. – P. 1162–1166. 75 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Purification and characterization of the free form of the lactococcal extracellular proteinase and its autoproteolytic cleavage products / J. Nissen-Meyer [et al] // J. General Microbiol. – 1991. – Vol. 137. – P. 1611–1618. The cell bound preoteinase system of Lactobacillus casei – purification and characterization / N. Ezzat [et al] // Int. J. Food Microbiol. – 1988. – Vol. 6. – P. 327–332. Characterization of the cell-wall bound proteinase of Lactobacillus casei HN14 / M. Kojic [et al] // Appl.Environ. Microbiol. – 1991. – Vol. 51, № 1. –P. 1753–1757. Holck, A. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding the cellenvelope associated proteinase from Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NCDO151 / A. Holck, H. Naes // J. Gen. Microbiol. – 1992. – Vol. 138. – P. 1353–1364. Cell wall associated proteinase of Lactobacillus delbrueckii subsb. bulgaricus CNRZ 397: differential extraction, purification and properties of the enzyme / P. Laloi [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1991. – Vol. 36. – P. 680–685. Pritchard, G. The physiology and biochemistry of the proteolytic system in lactic acid bacteria / G. Pritchard, T. Coolbear // FEMS Microbiol. Rev. – 1993. – Vol. 12. – P. 179–206. The presence of two proteinases associated with the cell wall of Lactobacillus bulgaricus / D. Stefanitsi [et al] // FEMS Microbiol. Let. – 1995. – Vol. 128, № 1. – P. 53–58. Cell-wall-bound proteinase of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ACADC 178: characterization and Specificity for β-casein / E. Tsakalidou [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65, № 5. – P. 2035–2040. Yamamoto, N. Purification and specificity of a cell-wall-associated proteinase from Lactobacillus helveticus CP790 / N. Yamamoto, A. Akino, T. Takano // J. Biochem. – 1993. – Vol. 5. – P. 740–745. Free D- and L-amino acid evolution during sourdough fermentation and baking / M. Gobetti [et al] // J.Food Sci. – 1994. – Vol. 59. – P. 881–884. The proteolytic system of Lactobacillus sanfrancisco CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and a aminopeptidase / M. Gobetti, [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – Vol. 62. – P. 3220–3226. Fernandez-Espla, M. Streptococcus thermophilus cell wall-anchored proteinase: release, purification, and Biochemical and genetic characterization / M. FernandezEspla [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 11. – P. 4772–4778. Гудков А.В. Биологическая активность бифидобактерий в молоке / А.В. Гудков [и др.] // Молочная промышленность. – 1984. – № 1. – С. 21–23. Yoshikide, F. A novel IgA protease from Clostridium sp. capable of cleaving IgA1 and IgA2 A2(m1)-allotype but not IgA2 A2(m2)-allotype paraproteins / F. Yoshikide [et al] // J. Immunol. – 1985. – Vol. 134, № 1. – P. 573–576. Growth, viability, and proteolytic activity of bifidobacteria in whole camel milk / H. Abu-Taraboush [et al] // J. Dairy Sci. – 1998. – Vol. 81, № 2. – P. 354–361. Самарцев, А.А. Особенности роста и образования внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentis 94-БИМ / А.А.Самарцев, Н.И. Астапович, Г.И Новик // Микробиология. – 1997. – Т. 66, № 5. – С. 635–639. Exterkate, F. Location if peptidases outside and inside the membrane of Strreptococcus cremoris / F. Exterkate // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – Vol. 7, № 1. – P. 177–183. Location of proteolytic enzymes in Lactobacillus lactis and Streptococcus thermophilus and their influence on cheese ripening / J. Meyer [et al] // Milchwissenschaft. – 1989. – Vol. 44, № 11. – P. 678–681. Peptidase activity IV various species of dairy thermophilic lactobacilli / M. Gatti [et al] // J. Appl. Microbiol. – 2004. – Vol. 96, № 2. – P. 223–229. 76 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Blanc, B. Two cell-wall-associated aminopeptidases from Lactobacillus helveticus and the purification and characterization of APII from strain ITGL1 / B. Blanc // J. Gen. Microbiol. – 1993. – Vol. 139. – P. 1441–1448. Khalid, N. Purification and partial characterization of a plrolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus helveticus CNRZ 32 / N. Khalid, E. Marth // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – Vol. 55. – P. 381–388. Purification and characterization of an aminopeptidase from Lactobacillus helveticus LHE-511 / H. Miyakawa [et al] // J. Dairy Sci. – 1992. – Vol. 75, № 1. – P. 27–35. Exopeptidase profiles of bifidobacteria / E. Minagawa [et al] // J. Nutr. Sci. Vitaminol. – 1985. – Vol. 31, № 6. – P. 599–606. Enzymatic ability oa Bifidobacterium animalis subsp. Lactis to hydrolyze milk proteins: identification and characterization of endopeptidase O / C. Janer [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – Vol. 71, № 12. – P. 8460–8465. Medium dependent regulation of proteinase gene expression in Lactococcus lactis:control of transcription initiation by specific dipeptides / J. Marugg [et al] // J. Bacteriol. – 1995. – Vol. 177, № 1. – P. 2982–2989. Meijer, W. Regulation of proteolytic enzyme activity in Lactococcus lactis / W. Meijer, J. Marugg, J. Hugenholtz // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – Vol. 62, № 1.– P. 156–161. Hebert, E. Nutritional Requirements and Nitrogen-Dependent Regulation of Proteinase Activity of Lactobacillus helveticus CRL 1062 / E. Hebert [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 12. – P. 5316–5321. Casein utilization by Streptococcus thermophilus results in a diauxic growth in milk / C. Letort [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – Vol. 66, № 6. – P. 3162–3165. Hugenholtz, J. The proteolytic Systems of Streptococcus cremoris: an Immunological Analysis / J. Hugenholtz, F. Exterkate, W. Konings // Appl. Environ. Microbiology. – 1984. – Vol. 48, № 6. – P. 1105–1110. PROTEOLYTIC ENZYMES OF PROBIOTIC MICROORGANISMS SAMARTSEV A.A. Laboratory of lactic acid and bifidobacteria Data are presented on proteases of probiotic microorganisms. It was found that majority of the enzymes is represented by serine- and metal- proteinases. Information is provided on substrate specificity of probiotic proteases. 77 УДК 579.22.+577.151.6 БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ, ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА Головнева Н.А., Рябая Н.Е., Найденко И.А., Денисенко В.В., Сафонова М.Е. лаборатория молочнокислых и бифидобактерий Белки, локализованные на клеточной поверхности грамположительных бактерий, осуществляют ряд жизненно важных функций и имеют определяющее значение в установлении и поддержании взаимодействия между микроорганизмом и окружающей средой. Бактерии постоянно подвергаются стрессовым воздействиям, которые индуцируют в клетке процессы, способствующие выживанию в неблагоприятных условиях – изменяется уровень транскрипции определенных генов, усиливается синтез специфических стрессовых белков. Исследование секреторных белков бифидо- и молочнокислых бактерий в условиях стресса помимо фундаментального, имеет и практическую значимость – позволяет определить оптимальные условия сохранения жизнеспособности и биологической активности культур в составе высокоэффективных препаратов-пробиотиков. В процессе промышленной ферментации, при использовании в составе многокомпонентных препаратов и при длительном хранении бактерии постоянно подвергаются стрессовым воздействиям, включающим экстремальные температуры, высокую кислотность среды, повышенную концентрацию солей, воздействие кислорода и других факторов. Такие технологические приемы, как охлаждение, замораживание, лиофилизация, распылительная сушка и термообработка, могут вызвать структурные и физиологические повреждения бактериальных клеток и привести к существенной потере жизнеспособности и биологической активности культур. Однако, несмотря на интенсивное использование молочнокислых и бифидобактерий в составе пищевых и диетических продуктов, различных пробиотических препаратов, в настоящее время мало изучены механизмы выживания этих микроорганизмов в стрессовых условиях. Изучение адаптационных возможностей бактерий позволит сохранить биологические свойства культур в составе различных бактериальных препаратов. Выяснение механизмов, обеспечивающих колонизационную устойчивость нормальной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте, также крайне важно при использовании бифидо- и молочнокислых бактерий в качестве пробиотиков или компонентов пищи. 78 Клеточная поверхность бактерий является первым барьером, защищающим микроорганизмы от антимикробных веществ и стрессов, вызванных изменениями в окружающей среде. Особую актуальность имеет изучение белков, локализованных на клеточной поверхности бифидо- и молочнокислых бактерий, выполняющих такие важные функции, как адгезия к кишечному эпителию, снабжение клеток питательными веществами, модуляция иммунной системы, а также ингибирование роста патогенных микроорганизмов и др. Грамположительные бактерии обладают уникальными механизмами для иммобилизации белков на поверхности клетки, включающими как ковалентное связывание белков с пептидогликаном, так и нековалентное взаимодействие с полимерами клеточной стенки. По способу прикрепления к клетке белки клеточной поверхности грамположительных бактерий подразделяются на несколько групп [1]. Первую группу составляют белки, ковалентно связанные с пептидогликаном через специфическую С-концевую аминокислотную последовательность [2, 3]. Присоединение белков происходит под действием специфического фермента – сортазы при наличии у секреторного белка соответствующей концевой аминокислотной последовательности (LPXTG). К этой группе относится достаточно хорошо изученный белок А стрептококков, а также ряд протеиназ грамположительных бактерий. Белки, ковалентно связанные с клеточной стенкой, эффективно экстрагируются с поверхности при помощи литических ферментов, разрушающих пептидогликан. Известна также сортаза, осуществляющая связывание белков, содержащих аминокислотную последовательность QVPTGV [4]. Для таких белков характерно также наличие гидрофобного положительно заряженного участка. Вторая группа включает белки клеточной поверхности, интегрированные в мембрану посредством образования ковалентной связи между мембранными липидами и цистеиновым остатком N-концевой последовательности белковой молекулы [5]. Следующую группу составляют белки, удерживаемые силами электростатического притяжения между белковой молекулой и полимерами клеточной поверхности (пептидогликаном или тейхоевыми кислотами), имеющими противоположный заряд. К этой группе относятся белки кристаллического S-слоя, которые участвуют в образовании фимбрий или пилей на поверхности бактерий. Такие полипептиды могут быть экстрагированы с клеточной поверхности соединениями, нейтрализующими заряд (например, концентрированными растворами солей гуанидина). Кроме белков S-слоя на поверхности клеток бактерий 79 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus обнаружены также нековалентно связанные протеиназы [6]. Предполагается, что протеиназы электростатически взаимодействуют С-концевой последовательностью, имеющей положительный заряд, с тейхоевыми кислотами клеточной поверхности [7]. На поверхности молочнокислых бактерий обнаружены также нековалентно связанные белки, участвующие в системе энергозависимого поглощения питательных веществ [8], и белки, обеспечивающие адгезию. Наличие периплазматического пространства у грамположительных бактерий по аналогии с грамотрицательными микроорганизмами является предметом дискуссии [9]. Морфологические исследования показали существование у некоторых бактерий узкого пространства между цитоплазматической мембраной и пептидогликаном клеточной стенки. Было обнаружено, что многие белки-гомологи, локализованные у грамотрицательных бактерий в периплазме, у грамположительных бактерий модифицированы липидами. Функцией таких липопротеинов является захват специфических субстратов, например, углеводов, и доставка их к транспортным системам, встроенным в цитоплазматическую мембрану. Предполагается, что липидная часть может быть средством связывания полипептидов на поверхности мембраны грамположительных бактерий [10–12]. Так, β-лактамаза грамотрицательных бактерий, фермент обеспечивающий резистентность к β-лактамным антибиотикам, локализована в периплазматическом пространстве, ограниченном внутренней и внешней мембранами, в то время как β-лактамазы грамположительных Staphylococcus aureus и Bacillus licheniformis являются липопротеинами [13, 14]. Предшественник цитоплазматической β-лактамазы (Bla) грамположительных бактерий служит субстратом сигнальных пептидаз типа I и II, их продуктом является смесь секреторной, растворимой Bla I и интегрированной в мембрану, связанной с липидами Bla II. Мутант Bla, обладающий сигнальной пептидазой только типа I, секретирует β-лактамазу во внеклеточную среду, но при этом утрачивает способность защищать стафилококки от антибиотиков [15]. На этом примере видно, что интегрирование ферментов в структуры клеточной поверхности может быть важным фактором в защите клеток от антибиотиков, а также в снабжении микроорганизмов необходимыми источниками питания. Многие ковалентно связанные белки патогенных бактерий важны для развития инфекционного процесса [16]. Клеточная стенка также является местом локализации ферментов, контролирующих синтез и распад пептидогликана в процессе клеточного роста и деления [17]. Среди ферментов клеточной поверхности 80 обнаружены различные гидролазы – декстраназы, фруктозидазы, пептидазы, а также ферменты, осуществляющие модификацию секреторных пептидов. Идентифицированы белки клеточной поверхности грамположительных бактерий, отвечающие за агрегацию и конъюгацию бактериальных клеток [18, 19]. Так, основной полипептид клеточной поверхности Streptococcus gordonii придает клеточной поверхности гидрофобность, является компонентом поверхностных структур, обеспечивающих адгезию бактерий и агрегацию клеток [20]. На поверхности L. johnsonii и L. gasseri также идентифицированы белки-промоторы агрегации, принадлежащие к семейству S-белков [21]. У многих грамположительных бактерий на клеточной поверхности локализованы белкиадгезины, участвующие в процессе адгезии бактериальных клеток на поверхностных рецепторах клеток организма-хозяина. Установлено, что адгезины играют ключевую роль в процессе колонизации желудочно-кишечного тракта пробиотическими бактериями [22, 23]. Особый интерес привлекают иммунологические аспекты взаимодействия поверхностных белков грамположительных бактерий с белками эукариотов. Функция связывания иммуноглобулинов показана для белка А стафилококков, белков М и G стрептококков. Для белков этого типа показана способность связывать IgG, а также Ig A [1]. В окружающей среде бактерии постоянно подвергаются стрессовым воздействиям: низким или высоким температурам, недостатку питательных веществ, низким рН, различных токсических соединений и т.д. Стрессовые воздействия индуцируют в клетке процессы, способствующие выживанию в неблагоприятных условиях – изменяется уровень транскрипции определенных генов, усиливается синтез специфических стрессовых белков [24, 25]. Для бактерий рода Lactococcus показано, что низкие температуры индуцируют синтез белков гликолитического цикла [26, 27]. В клетках L. lactis в ответ на воздействие высоких температур индуцируется синтез ряда белков теплового шока и некоторых гликолитических ферментов: пируваткиназы, глицеральдегид-3фосфатдегидро-геназы, фосфоглицераткиназы [28]. Для L. lactis показано также, что в ответ на снижение рН среды в клетках запускается синтез белков цитрат-лиазного оперона. Предполагается, что таким образом в клетке включается механизм устойчивости к ингибирующему эффекту продукта брожения – молочной кислоте [29]. У грамположительных неспорообразующих бактерий Enterococcus faecalis идентифицированы 42 белка, экспрессируемые при голодании по глюкозе [30–32]. Синтез одного из белков – Gls-24 – индуцируется также в ответ на стрессовое воздействие, 81 вызванное желчными кислотами. Этот белок относится к так называемым белкам неспецифического стресса. Белки, подобные Gls-24, обнаружены также у L.lactis иS. aureus [33]. У Streptococcus mutans также обнаружено 6 белков неспецифического стресса. Все эти белки синтезируются в ответ на любой из видов стресса – воздействие температуры, соли, кислоты, кислорода или голодания. Помимо этих белков в ответ на каждый вид стрессового воздействия усиливается также и синтез ряда специфических белков [34]. Повышенное содержание соли в среде вызывает избирательную репрессию и индукцию синтеза порядка 40 белков бактерий Listeria monocytogenes – патогенного микроорганизма, вызывающего порчу пищевых продуктов [35]. Показано, что воздействие низких температур у Listeria monocytogenes также индуцирует синтез белков, названными белками холодового шока [36] – 0 при 5 С наблюдалось индукция 12 белков с молекулярными массами от 14,4 до 48,6 Да. Стрессовые воздействия индуцируют синтез белков транспортных систем, а также основных белков клеточного метаболизма: аланиндегидрогеназы и глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназы – ключевого фермента гликолиза. Высказано предположение, что солевой стресс вызывает усиленный синтез ацетил-коэнзима А, ключевого компонента цикла Кребса. Таким образом, гликолиз является одним из процессов в клетке, наиболее чувствительных к стрессу. Среди стресс-индуцируемых белков теплового шока различают так называемые быстро индуцируемые белки, синтез которых резко увеличивается в течение первых 10–15 мин. стрессового воздействия, а затем возвращается к исходному уровню, и белки, продукция которых увеличивается постепенно, в течение более длительного времени. Примечательно, что в ответ как на воздействие высоких температур, так и высоких концентраций соли, в клетках Lactococcus lactis индуцируется синтез одних и тех же шоковых белков. Кроме того, для бактерий рода Lactococcus установлено, что синтез белков гликолитического цикла также индуцируется и низкими температурами [26, 27]. У L. helveticus тепловой шок вызывает синтез поверхностного белка, гомологичного белкам семейства сериновых протеиназ, локализованного на внешней поверхности плазматической мембраны [37]. В ответ на стресс, вызванный присутствием в среде 0,1% желчи, изменяется морфология клеток молочнокислых бактерий L. plantarum. В присутствие желчных кислот поверхность клеток становится шероховатой, некоторые клетки сморщиваются, в них появляются пустоты. Присутствие желчных кислот в среде индуцирует экспрессию 31 гена у L. рlantarum, что сопровождается 82 изменением окислительно-восстановительные реакций клетки, связанных с функционированием белков клеточной стенкой и цитоплазматической мембраны [38]. Воздействие 0,3% желчи на L. acidophilus приводит к изменению проницаемости клеток, что сопровождается увеличением β-галактозидазной активности клеток [39]. Выполненные нами исследования показали возможность регуляции факторами среды продукции гидролаз у бифидо- и молочнокислых бактерий, выявили различия в спектре ферментов микроорганизмов, находящихся в условиях анабиоза и физиологической активности [40–45]. Для сохранения жизнеспособности бактериальных клеток в условиях адаптации к стрессовым воздействиям особенно важна роль ферментных белков клеточной поверхности. Проведен сравнительный анализ белков клеточной поверхности бифидо- и молочнокислых бактерий, развивающихся в полноценной питательной среде, и клеток, помещенных в минеральную среду, не содержащую факторов роста и источников углерода. Показано, что в условиях голода у бифидобактерий уменьшается количество белковых фракций, экстрагированных с клеточной поверхности, в то время как у лактобактерий обнаружены стрессиндуцируемые белки [46]. Установлено, что протеолитическая активность лактобактерий значительно снижается после инкубации клеток в среде без источника углеродного и азотного питания. У штаммов L.plantarum, независимо от стадии роста культуры, в условиях голодания казеинолитическая активность клеток уменьшается в 2,5–4 раза или полностью исчезает (рисунок 1). Исследование электрофоретического спектра и протеолитической активности белков клеточной поверхности молочнокислых бактерий в условиях температурного стресса показало, что активность локализованных на клеточной поверхности протеиназ с повышением температуры культивирования увеличивалась у обоих штаммов L.plantarum. В условиях высокотемпературного 0 стресса (37–42 С) протеолитическая активность повышалась в 1,5 и 2 раза по сравнению с оптимальными условиями и в 3,5–5 раз по сравнению с низкотемпературными условиями культивирования (рисунок 2). Таким образом, анализ научной литературы свидетельствует об актуальности физиолого-биохимических исследований белков клеточной поверхности грамположительных бактерий. Интенсивные исследования в этой области проводились, в основном, на модели грамположительных бактерий родов Streptococcus, Lactococcus. 83 усл. ед/г биомассы 30 25 20 15 10 5 0 1 L. plantarum 1 2 L. plantarum 2 логарифмическая фаза. голодание стационарная фаза, голодание логарифмическая фаза , контроль стационарная фаза, контроль усл. ед/мг белка Рисунок 1 – Изменение протеолитической активности клеток L. plantarum при голодании 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 L. plantarum 1 20 С L. plantarum 2 28 С 37-42 С Рисунок 2 – Протеолитическая активность белков (ед/мг белка), солюбилизированных с клеточной поверхности L. plantarum, в зависимости от температуры культивирования 84 В связи с непатогенностью и способностью заселять желудочно-кишечный тракт, бифидо- и молочнокислые бактерии в последнее время рассматриваются в качестве перспективных векторов для продукции различных рекомбинантных белков (вакцин, лекарств, иммуностимуляторов) [47–49]. Такие «живые вакцины» – клетки нормальной непатогенной микрофлоры кишечника человека и животных – экпрессируют определённые антигены, способные стимулировать синтез специфических иммуноглобулинов [50]. Выяснение механизмов, обеспечивающих колонизационную устойчивость нормальной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте, крайне важно при использовании микроорганизмов в качестве пробиотиков или компонентов пищи. Исследование клеточносвязанных белков бифидо- и молочнокислых бактерий позволит также установить их роль в адаптации этих микроорганизмов к стрессовым воздействиям, определить оптимальные условия сохранения жизнеспособности и биологической активности бифидо- и молочнокислых бактерий в составе высокоэффективных препаратов-пробиотиков. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope / W.W. Navarre [et al] // Microbiol. and Mol. Biol. Rev. – 1999. – Vol. 63, № 1. – P. 174–229. Cell wall sorting signals in surface proteins of Gram-positive bacteria / O. Schneewind [et al] // EMBO J. – 1993. – Vol. 12. – P. 4803–4811. Proteolytic cleavage and cell wall anchoring at the LPXTG motif of surface proteins in Gram-positive bacteria / W. W. Navarre [et al] // Mol. Microbiol. – 1994. – Vol. 14. – P. 115–121. A novel sortase, SrtC2, from Streptococcus pyogenes anchors a surface protein containing a QVPTGV motif to the cell wall / T.C. Barnett [et al] // J. of Bacteriology. – 2004. – Vol. 186, № 17. – P. 5865–5875. A maturation protein is essential for production of active forms of Lactococcus lactis SK11 serine proteinase located in or secreted from the cell envelope / P. Vos [et al] // J. Bacteriol. – 1989. – Vol. 171, № 5. – P. 2795–2802. Streptococcus thermophilus cell wall-anchored proteinase: release, purification, and biochemical and genetic characterization / M.D. Fernandez-Espla [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 11. – P. 4772–4778. Determination of the domain of the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cell surface proteinase PrtB involved in attachment to the cell wall after heterologous expression of the prtB gene in Lactococcus lactis / J.-E. Germo [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2003. – Vol. 69, № 6. – P. 3377–3384. Identification and characterization of basic cell surface-located protein from Lactobacillus fermentum BR11 / M.T. Turner [et al] // J. Bacreriol. – 1997. – Vol. 179, № 10. – P. 3310–3316. Graham, L.L. Periplasmic space and the concept of the periplasm / L.L Graham [et al] // Trends Biochem Sci. – 1991. – Vol. 16. – P. 328–329. 85 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Evidence for high affinity binding-protein dependent transport systems in Grampositive bacteria and in Mycoplasma / E. Gilson [et al] // EMBO J. – 1988. – Vol. 7. – P. 3971–3974. Lipoproteins of gram-positive bacteria / I.C. Sutcliffe [et al] // J.of Bacretiol. – 1995. – Vol. 177. – P. 1123–1128. MsmE a lipoprotein involved in sugar transport in Streptococcus mutans / I.C. Sutcliffe [et al] // J.of Bacteriol. – 1993. – Vol. 175. – P. 1853–1855. Lipoprotein nature of Bacillus licheniformis membrane penicillinase / J.B. Nielsen [et al] // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1981. – Vol. 78. – P. 3511–3515. Glyceride-cysteine lipoproteins and secretion by gram-positive bacteria / J.B. Nielsen [et al] // J. Bacteriol. – 1982. – Vol. 152. – P. 315–322. Wall sorting of lipoproteins in Staphylococcus aureus / W.W. Navarre [et al] // J. Bacteriol. – 1996. – Vol. 178. – P. 441–446. Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus / O. Schneewind [et al] // Science. – 1995. – Vol. 268. – P. 103–106. Holtje, J.-V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli / J.-V. Holtje // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1998. – Vol. 62. – P. 181–203. Douglas, C.W. Bacterial-protein interactions in the oral cavity / C.W. Douglas // Adv. Dent. Res. – 1994. – Vol. 8. – P. 254–262. Comparative analysis of Enterococcus faecalis sex pheromone plasmids identifies a single homologous DNA region which codes for aggregation substance / D. Galli [et al] // J. Bacteriol. 1991. – Vol. 173. – P. 3029–3033. Cell wall-anchored CshA polypeptide (259 kilodaltons) in Streptococcus gordonii forms surface fibrils that confer hydrophobic and adhesive properties / R. McNab [et al] // J. of Bacteriology. – 1999. – Vol. 181, № 10. – P. 3087–3095. Identification and characterization of novel surface proteins in Lactobacillus johnsonii and Lactobacillus gasseri / M. Ventura [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2002. – Vol. 68, № 12. – P. 6172–6181. Purification and characterization of a suface protein from Lactobacillus fermentum 104R that binds to porcine small intestinal mucus and gastric mucin / M. Rojas [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 68, № 5. – P. 2330–2336. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components / S. Roos [et al] // Microbiology. – 2002. – Vol. 148. – P. 433–442. Linquist, S. The heat-shock response / S. Linquist // Ann. Rev. Biochem. – 1986. – Vol. 55. – P. 1151–1191. Inactivation of the stress- and starvation-inducible gls24 operon has a pleiotrophic effect on cell morphology, stress sensitivity, and gene expression in Enterococcus faecalis / J.-C. Giard [et al] // J. Bacteriol. – 2000. – Vol. 182, № 1. – P. 4512–4520. Environmental stress response in Lactococcus lactis / J.-W. Sanders [et al] // FEMS Microbiol. Rev. – 1999. – Vol. 23. – P. 483–501. Changes in glycolytic activity of Lactococcus lactis induced by low temperature / J.A. Wouters [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 9. – P. 3686– 3691. Relationship between stress response towards bile salts, acid and heat treatment in Enterococcus faecalis / S. Flahaut [et al] // FEMS Microbiol. Lett. – 1996. – Vol. 138. – P. 49–54. Acid-inducible transcription of the operon encoding the citrate lyase complex of Lactococcus lactis biovar diacetylactis CRL264 / M.G. Martín [et al] // J. of Bacteriology. – 2004. – Vol. 186, № 17. – P. 5649–5660. Glucose starvation response in Enterococcus faecalis JH2-2: survival and protein analysis / J.-C. Giard [et al] // Res. Microbiol. – 1997. – Vol. 148. – P. 27–35. 86 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Defense against lethal treatments and de novo protein synthesis induced by NaCl in Enterococcus faecalis ATCC19433 / S. Flahaut [et al] // Arch. Microbiol. – 1996. – Vol. 165. – P. 317–324. Salt stress proteins induced in Listeria monocytogenes / O. Duche [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2002. – Vol. 68, № 4. – P. 1491–1498. Inactivation of the stress- and starvation-inducible gls24 operon has a pleiotrophic effect on cell morphology, stress sensitivity, and gene expression in Enterococcus faecalis / J.-C. Giard A. [et al] // J. of Bacteriology. – 2000. – Vol. 182, № 16. – P. 4512–4520. Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stress-specific proteins / G. Svensäter [et al] // Microbiology. – 2000. – Vol. 146. – P. 107–117. Cold stress proteins induced in Listeria monocytogenes in response to temperature downshock and growth at low temperatures / D.O. Bayles [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 1996. – Vol. 62. – P. 1116–1119. Induction of heat shock proteins DnaK, GroEL, and GroES by salt stress in Lactococcus lactis / M. Kilstrup [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – Vol. 63. – P. 1826–1837. Molecular characterization of a stress-inducible gene from Lactobacillus helveticus / A. Smeds [et al] // J. of Bacteriology. – 1998. – Vol. 180, № 23. – P. 6148–6153. Genetic characterization of the bile salt response in Lactobacillus plantarum and analysis of responsive promoters in vitro and in situ in the gastrointestinal tract / P.A. Bron [et al] // J. of Bacteriology. – 2004. – Vol. 186, № 23. – P. 7829–7835. Influence of bile on cellular integrity and ß-galactosidase activity of Lactobacillus acidophilus / D.O. Noh [et al] // J. Dajry Sience. – 1993. – Vol. 76. – P. 1253–1259. Биологически активные соединения бифидобактерий: продукция и свойства / Н.И. Астапович [и др.] // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы ІІІ Московского междунар. конгресса, Москва, 14–18 марта 2005 г. / ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.Менделеева. – Москва, 2005. – Ч. 2, С. 82–83. Влияние источника углерода на рост и продукцию гликозидаз молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum / В.В. Денисенко [и др.] // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в реальных условиях единого экономического пространства стран содружества: материалы Междунар. науч.-практ. конф., Минск–Нарочь, 25–28 мая 2005 г. / Бел. гос. ун-т.; сост. и общ. ред. А.Н. Евтушенкова. – Минск, 2005. – С. 57–58. Особенности роста и образования β-галактозидаз бифидобактериями / Н.И. Астапович, [и др.] // Микробиология, 2006. – Т. 75, № 3. – С. 329–333. Щетко В.А. Сравнительная характеристика активности роста некоторых представителей рода Bifidobacterium / В.А. Щетко, Н.А. Головнева, Н.И. Астапович // Вес. Нац. акад. Беларусi Сер. бiял. Навук. – 2002. – № 3. – С.57–61. Ферментативная активность бифидобактерий в условиях температурного стресса / Н.А. Головнева [и др.] // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы IV Московского междунар. конгресса, Москва, 12–16 марта 2007 г. / ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.Менделеева. – Москва, 2007 – С. 102. Характеристика осмотолерантности бифидобактерий в зависимости от физиологического состояния и стадии развития культур микроорганизмов / Н.А. Головнева [и др.] // Клиническое питание. – 2007. – № 1–2. – С. А-33. Ферментативная активность белков клеточной поверхности бифидобактерий при адаптации к стрессовым воздействиям / Астапович Н.И. [и др] // Молекулярная и прикладная генетика: материалы Междунар. науч. конф., Минск, 17–18 ноября 2005 г / Ред. колл.: А.В.Кильчевский и др. – Минск, 2005. – С. 210. 87 47 48 49 50 Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis / S. Nouaille [et al] // Genet. Mol. Res. – 2003. – Vol. 2, № 1. – P. 102–111. Progress in the development of Lactococcus lactis as a recombinant mucosal vaccine delivery system / P.M. Norton [et al] // Folia Microbiol. – 1995. – Vol. 40. – P. 225–230. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis / Y. Le Loir [et al] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2001. – Vol. 67. – P. 4119–4127. Cross, M.L. Microbes versus microbes: immune signals generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens / M.L. Cross // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2002. – Vol. 34, № 4. – P .245–253. PROTEINS FROM CELL SURFACE OF GRAM-POSITIVE BACTERIA, THEIR FUNCTIONAL SINIFICANCE UNDER STRESS CONDITIONS GOLOVNEVA N.A., RYABAYA N.E., DENISENKO V.V. Laboratory of lactic acid bacteria and bifidobacteria Proteins localized on cell surface of gram-positive bacteria carry out a number of vital functions and play a key role in establishing and maintaining stable interactions between microorganisms and environmental media. Bacteria are constantly subjected to stress factors inducing intracellular processes promoting survival in adverse conditions – change in transcription level of specific genes, increased synthesis of stress proteins. Investigation of proteins secreted by bifido- and lactic acid bacteria under stress is of both fundamental and practical value to define optimal conditions for preservation of viability and biological activity of cultures-components of highly active probiotics. УДК 579.22:582.28:66.08 ЛИПИДЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Гвоздкова Т.С., Щерба В.В., Черноок Т.В., Филимонова Т.В., Рожкова З.А., Осадчая О.В., Смирнов Д.А., Бабицкая В.Г. лаборатория экспериментальной микологии Исследовано образование липидов ксилотрофными базидиальными грибами разных таксономических групп. Установлено, что около 50% проверенных культур (в основном порядка Polyporales) при глубинном культивировании образует 7–10% липидов, остальные грибы – не более 3–5%. Наиболее высокая липидсинтезирующая способность выявлена у штаммов гриба Laetiporus sulphureus (20– 30% в пересчете на сухой мицелий). Удельный вес фосфолипидов в составе общих липидов варьировал в пределах от 13 до 60% или 0,7–5,4% в сухом мицелии. Наиболее высоким содержанием фосфолипидов в мицелии грибов (свыше 3–5%) с одновременно активным ростом и повышенным синтезом липидов характеризовались отдельные представителя порядка Polyporales родов Ganoderma, Lentinus, Trametes и Laetiporus. Исследование жирнокислотного состава липидов грибов выявило общую закономерность – сумма ненасыщенных жирных кислот в составе липидов грибов в 2–4 раза превышает сумму насыщенных за счет существенного преобладания эссенциальной линолевой (С18:2) кислоты – более 60–70% от суммы 88 кислот, что позволяет в целом рассматривать эту группу грибов в качестве перспективных источников биоактивных соединений липидной природы. Введение. Перспективы промышленного получения и использования биоактивных липидов давно привлекают внимание исследователей. Особая роль при этом отводится растительным маслам, жирам животных и некоторых видов промысловых рыб, что обусловлено высокой биологической активностью и пищевой ценностью содержащегося в них комплекса эссенциальных жирных кислот, фосфолипидов, различных жирорастворимых витаминов, стеринов и др. Потенциальными продуцентами биоактивных соединений липидной природы могут служить и микроорганизмы, в частности, мицелиальные грибы, способные синтезировать их в достаточно больших количествах. Возрастающий интерес к грибным липидам и актуальность проблемы обусловлены рядом причин. Для мицелиальных грибов характерен тип липидов, близкий по составу жирных кислот, в том числе незаменимых, а также по содержанию отдельных классов липидов (фосфолипидов, цереброзидов и др.) к растительным маслам и липидам некоторых животных тканей. Это открыло перспективу их производства и создание нового поколения фармацевтических препаратов на основе ряда микробных продуцентов [1–3]. В то же время, несмотря на значительные успехи, достигнутые в этом отношении, использование некоторых микромицетов в биотехнологии имеет и ряд недостатков. Одним из них является потенциально опасный посевной материал в виде спор. Кроме того, они в определенных условиях культивирования могут продуцировать микотоксины, являющиеся мутагенами и канцерогенами [4]. Острая же потребность современной фармакологии в высокоактивных и нетоксичных липидсодержащих препаратах диктует необходимость продолжения поиска и изучение новых источников для их получения. Перспективным объектом современной биотехнологии среди мицелиальных грибов становятся ксилотрофные базидиомицеты, у которых отсутствуют указанные выше недостатки, к тому же многие из них являются съедобными, издавна применяются в народной медицине и признаны лекарственными [5]. Кроме того, отдельные представители этой группы грибов по способности образовывать некоторые биологически активные соединения липидной природы превосходят традиционно используемые микромицеты. В большинстве работ, начатых еще в 60-ые годы и посвященных изучению липидов базидиомицетов, исследовались, в основном, плодовые тела грибов. Количество липидов у них, как было установлено, сравнительно невелико и, в зависимости от 89 видовой принадлежности, колеблется от 2 до 5%, за редким исключением – до 10% от сухих веществ [6–8]. Имеющиеся сведения о количественном и качественном составе липидов глубинного мицелия ксилотрофных базидиомицетов немногочисленны и противоречивы, что может быть связано с применением различных условий культивирования, питательных сред, использованием разных штаммов грибов и др. [9, 10]. Большинство исследователей отмечают невысокий уровень липидов в глубинном мицелии этих грибов – 5–12% [7, 8, 11– 14]. Однако, судя по научно-информационной литературе, некоторые представители базидиальных грибов способны накапливать в мицелии до 20–50% липидов, что позволяет отнести их к истинным липидным продуцентам. При этом качественный состав липидов глубинного мицелия по наличию важнейших биоактивных липидов (фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот и др.) мало отличался от таковых плодовых тел [15–17]. Для липидов некоторых базидиальных грибов характерно высокое (более 40%) содержание фосфолипидов как в плодовом теле, так и в глубинном мицелии [18–23]. В составе липидов базидиальных грибов обнаружены те же жирные кислоты, которые встречаются и у других эукариотных организмов. Отличительной особенностью жирнокислотного состава липидов некоторых ксилотрофных грибов является сверхвысокое (свыше 50–60 %) удельное содержание эссенциальной линолевой кислоты [8, 16, 18, 24]. Таким образом, анализ имеющихся работ по содержанию и составу липидов глубинного мицелия некоторых базидиальных грибов свидетельствует о высоком их потенциале в качестве источников биологически активных соединений липидной природы. Учитывая высокую их значимость в жизнедеятельности организма человека и животных, целесообразность проведения исследований по выявлению среди базидиальных грибов наиболее активных их продуцентов очевидна и представляется весьма актуальной. Цель исследования – скрининг штаммов ксилотрофных базидиомицетов и выявление среди них перспективных продуцентов комплекса биоактивных липидных соединений. Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования в работе было использовано 47 культур грибов, относящихся к классу Basidiomycetes и порядкам Polyporales (35 штаммов, 12 видов), Agaricales (9 штаммов, 3 видов), Russulales (3 штамма, 3 видов) из коллекции лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии НАН Беларуси. Базидиальные грибы выращивали в 0,5 л колбах Эрленмейера на качалке со 150 мл стандартной глюкозо-пептонной 90 среды следующего состава (г/л): глюкоза – 30,0; КН2РО4–1,0; К2НРО4 –1,0; МgSO4×7Н2О– 0,25; пептон – 3,0; кукурузный экстракт – 2,0 мл; температура культивирования – 25–27 0С. Для приготовления инокулята 150 мл пивного сусла (70 по Баллингу) в 0,5 л колбах засевали мицелием, выращенным в пробирках на скошенном сусло-агаре. В качестве посевного материала использовали 10–14 суточную культуру базидиальных грибов. Инокулюм вносили в опытные колбы в количестве 15% от объема среды. В зависимости от видовой принадлежности длительность культивирования составляла от 6 до 10 суток. Выращенный грибной мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через плотную нейлоновую ткань, промывали дистиллированной водой и использовали для проведения соответствующих анализов. Липиды из влажного мицелия экстрагировали методом Фолча в модификации Блайя и Дайэра [25, 26]. Содержание фосфолипидов в составе общих липидов определяли согласно методу [28]. Качественный и количественный состав жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе «Хром-5» c пламенно-ионизационным детектором, используя колонку из нержавеющей стали длиной 2,8 м, заполненную хроматоном N-AW-HMDS (0,16–0,20 мм) с 15% полиэтиленгликольсукцинатом в качестве жидкой фазы, при программировании 0 0 температуры колонки – 160 С, испарителя – 210 С. В качестве газа носителя использовали гелий (30 мл/мин). Смесь метиловых эфиров очищали методом препаративной хроматографии на колонках с силикагелем L 40/100 (Чехия) в системе гексан : диэтиловый эфир (19:1 по объему). Идентификацию эфиров жирных кислот проводили по относительным объемам удерживания, а также в сопоставлении с показателями контрольных метиловых эфиров чистых жирных кислот. Результаты и их обсуждение. Проверенные культуры грибов порядков Polyporales, Agaricales и Russulales показали довольно широкую амплитуду колебаний по выходу биомассы (от 2,0 до 16,0 г/л) и содержанию общих липидов (от 3,0 до 30,0% от АСБ). Однако способность к активному росту и накоплению липидов в мицелии различна у представителей одного и того же рода и даже у штаммов одного вида (рисунки 1 и 2). Так, уровень биомассы и содержание общих липидов в мицелии грибов наиболее представительных родов, в частности, Ganoderma порядка Polyporales колебался в пределах 6,4– 9,5 г/л и 4,7–8,2% соответственно, рода Lentinus – 4,5-11,5 г/л и 3,9–9,7%, рода Trametes – 6,9–13,0 г/л и 3,8–8,7%, рода Laetiporus 91 – 5,7–10,2 г/л и 9,3–30,0%, рода Pleurotus порядка Agaricales – в пределах 12–14 г/л и не более 3,0–4,5%. Pleurotus Laetiporus T rametes Lentinus Ganoderma 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 АСБ, г/л Рисунок 1 – Выход биомассы у различных родов базидиальных грибов Pleurotus Laetiporus T rametes Lentinus Ganoderma 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Общие липиды, % от АСБ Рисунок 2 – Содержание липидов у разных родов базидиальных грибов На основании сравнительного анализа полученных результатов установлено, что наибольшей липогенной активностью, по сравнению с другими представителями класса Basidiomycetes, характеризовались отдельные штаммы гриба Laetiporus sulphureus. Несмотря на значительную вариабельность по выходу биомассы и синтезу липидов, именно среди них были выявлены штаммы, способные к наиболее активному образованию липидов 92 (свыше 25,0%), что отмечено и другими исследователями [9, 15]. Повышенная способность к синтезу липидов (более 8–10%) и активный рост были отмечены у отдельных представителей порядка Polyporales – G. lucidum, L. lepideus, Phanerochaetа chrysosporium. В то же время у большинства грибов родов Pleurotus, Shizophyllum и Crinipellis порядка Agaricales, характеризующихся, в основном, активным ростом в глубинной культуре (выход биомассы – 12–14 г/л), в составе образуемой биомассы обнаружено не более 3,0–4,5% липидов (таблица 1). Поскольку биологическая ценность липидов определяется их составом, скрининг продуцентов велся также с учетом содержания в них наиболее ценных в биологическом отношении компонентов – фосфолипидов и полиненасыщенных жирных кислот. Исследование состава общих липидов мицелия грибов показало, что в зависимости от родовой, а также внутривидовой принадлежности грибов, содержание вышеуказанных соединений в липидах отличалось значительной вариабельностью. Распределение грибов по способности к синтезу фосфолипидов представлено на рисунке 3. Удельный вес фосфолипидов в составе общих липидов разных таксономических групп грибов колебался от 13 до 60% и выше. Содержание же фосфолипидов в самом мицелии исследованных грибов находилось в пределах 0,7–5,4%. Pleurotus Laetiporus Trametes Lentinus Ganoderma 0 10 20 30 40 50 60 70 Фосфолипиды, % от общих липидов Рисунок 3 – Содержание фосфолипидов в составе общих липидов базидиальных грибов Среди проверенных культур порядка Polyporales наиболее активным синтезом фосфолипидов характеризовались представители рода Ganoderma (35–66%). 93 Таблица 1 – Рост и липидообразующая способность базидиальных грибов Культуры грибов 1 Ganoderma lucidum 171 G. lucidum 362 G. lucidum 357 G. lucidum 333 G. lucidum 354 Lentinus edodes 182 L. edodes 198 L. edodes 364 L. edodes 509 L. edodes 199 L. lepideus L. tigrinus Coriolus hirsutus РБ C. hirsutus УК Trametes versicolor РБ T. versicolor УК T. zonatus РБ T. zonatus УК T.pubescens РБ T. pubescens УК T. pulverulentum Laetiporus sulphureus 131 L. sulphureus 132 L. sulphureus 133 L. sulphureus 134 L. sulphureus 115 L. sulphureus 122 L. sulphureus 1772 L. sulphureus 1773 Fomes fomentarius Abortiporus biennis Daedaleopsis confragosa Время культивирования, сутки АСБ г/л Общие липиды, % от АСБ порядок Polyporales 2 3 Фосфолипиды, % от % общих от липидов АСБ 4 5 6 8 8,1 8,2 66,1 5,4 7 7 7 7 7,4 9,5 8,3 6,4 7,7 5,8 7,1 4,7 58,14 35,2 43,17 59,9 4,4 2,0 3,1 2,8 8 8,3 7,0 12,8 0,9 10 10 10 10 8 8 7 7 5,5 4,5 10,4 5,8 8,3 11,5 9,2 8,3 4,8 4,7 5,3 3,9 9,7 3,9 4,3 4,5 41,8 32,0 34,8 48,2 38,4 16,8 35,6 37,8 2,0 1,5 1,8 1,9 3,7 0,6 1,5 1,7 7 13,0 6,1 31,0 1,9 7 7 7 6 7 9 11,2 8,1 7,8 7,4 8,0 6,9 3,8 6,2 5,9 6,9 8,0 8,7 30,3 35,2 30,9 28,0 19,4 38,3 1,2 2,2 1,8 1,9 1,6 3,3 6 5,9 30,2 17,2 5,2 6 6 6 6 6 6 6 7 9 7,8 10,2 7,8 8,5 5,7 9,3 6,9 2,7 8,1 10,3 22,0 27,6 9,3 18,4 18,2 14,8 7,3 4,9 29,7 21,9 14,1 28,1 22,6 27,2 19,7 42,9 45,3 5,4 4,8 3,9 2,6 4,2 5,0 2,9 3,1 2,2 6 11,6 7,7 34,4 2,7 94 1 Climacodon septentrionalis Tyromyces lacteus Bjerkandera adusta Phanerochaetа chrysosporium Pleurotus osvantus P.ostreatus 10 P.ostreatus 42 P.ostreatus 35 (186) P.ostreatus 205 P.ostreatus ИБР P.zummer Shizophyllum commune Crinipellis schevczenkovi Hericium erinaceus Stereum hirsutum Окончание таблицы 1 5 6 2 3 4 6 8,2 8,1 22,2 1,8 11 6 2,2 7,4 5,7 4,8 18,8 22,7 1,1 1,1 7 15,7 10,6 13,1 1,4 4,5 4,1 3,6 3,0 3,5 3,7 3,8 21,5 38,9 29,2 27,3 28,7 27,8 29,5 1,0 1,6 1,0 0,8 1,0 1,0 1,1 порядок Agaricales 5 5,2 7 14,2 7 12,8 7 12,4 7 12,4 7 11,6 7 11,0 7 8,0 4,4 28,9 1,3 7 7,4 3,8 23,6 0,9 порядок Russulales 10 6,0 6,0 28,2 1,7 26,7 1,4 6 8,7 5,3 Наибольшее количество фосфолипидов в составе липидов и мицелии было отмечено у G. lucidum 171 (66% от общих липидов или 5,4% от АСБ) и G. lucidum 362 (58% от общих липидов или 4,5% от АСБ), которые к тому же сравнительно активно накапливали биомассу (8,1 и 7,4 г/л) и общие липиды (8,2 и 7,7% от АСБ). Повышенное содержание фосфолипидов отмечено также и в липидах грибов родов Lentinus и Trametes (свыше 30–40%). Среди представителей рода Lentinus можно выделить штаммы L. edodes 198 и L. edodes 199, отличающиеся наиболее высоким содержанием в липидах фосфолипидной фракции – 41,8 и 48,2% соответственно. Однако выход биомассы (5,5 и 5,8 г/л) и общих липидов у этих культур были низкими (4,8 и 3,9% от АСБ). В то же время у штамма L. edodes 182 содержание фосфолипидов не превышало 13% от суммы общих липидов. Среди других представителей этого рода можно отметить гриб L.lepideus, который отличался высоким содержанием в липидах фосфолипидной фракции (38% или 3,7% от АСБ), активным накоплением биомассы (9,5 г/л) и общих липидов – 9,7% от АСБ (см. таблица 1). 95 Среди исследованных представителей рода Trametes наиболее высокое содержание фосфолипидов отмечено у гриба T. pulverulentum (38,3% или 3,3% от АСБ). Несмотря на сравнительно невысокий уровень фосфолипидов в составе общих липидов у штаммов гриба Laetiporus sulphureus (14–29 %), содержание их в биомассе достигало 5% от АСБ и выше, что сравнимо с наиболее эффективными продуцентами фосфолипидов, а именно, G. lucidum 171. Большинство грибов рода Pleurotus, Shizophyllum и Crinipellis порядка Agaricales, несмотря на высокий выход биомассы (7–14 г/л), характеризовались низкой продуктивностью, как по общим липидам, так и по фосфолипидам, что согласуется с данными литературы [9]. Содержание фосфолипидов в мицелии грибов Hericium erinaceus и Stereum hirsutum составляло не более 1,4–1,7%. На основании проведенных исследований можно заключить, что наиболее высоким содержанием фосфолипидов в мицелии базидиальных грибов (свыше 3–5% от АСБ) с одновременно активным ростом и повышенным синтезом липидов характеризуются грибы родов Ganoderma, Lentinus, Trametes и Laetiporus. Пищевая и фармакологическая ценность липидов определяется также содержанием и сбалансированностью в них незаменимых полиненасыщенных жирных кислот. Исследование состава жирных кислот липидов у проверяемых грибов показало, что они практически не содержат соединений с нечетным числом атомов углерода, а также разветвленных жирных кислот. Эти свойства выгодно отличают липиды базидиальных грибов от бактериальных, дрожжевых и некоторых продуцентов липидов микромицетов. Установлено, что качественный состав жирных кислот общих липидов исследованных грибов сходен: в липидах проверенных культур присутствовали в основном жирные кислоты с длиной цепи от 14 до 18 атомов углерода, 60–80% от суммы жирных кислот составляли ненасыщенные жирные кислоты. Характерной особенностью состава жирных кислот липидов практически всех исследованных грибов явилось сверхвысокое содержание линолевой кислоты (С18:2) – 55–70% и выше. Повышенной способностью к синтезу линолевой кислоты (свыше 70%) отличались штаммы грибов р.р. Ganoderma, Lentinus, Laetiporus, Abortiporus. 96 Таблица 2 – Жирнокислотный состав липидов мицелия базидиальных грибов различных таксономических групп Культуры грибов Жирнокислотный состав липидов * С 16:1 С 17:0 С 18:0 С18:1 С18:2 порядок Polyporales СН ∑ненас / ∑нас 1,52 1,54 1,46 4,09 4,26 3,03 С 14:0 С 15:0 С 16:0 G. lucidum 362 G. lucidum 357 0,01 0,01 0,01 0,83 0,60 0,08 14,17 17,52 24,59 1,48 0,90 1,64 2,99 Сл. 0,05 1,41 0,87 0,07 7,75 7,42 2,84 71,12 72,67 70,71 G. lucidum 354 0,05 1,55 16,48 1,58 1,71 0,71 6,71 71,60 сл 1,52 3,83 Lentinus edodes 182 0,23 0,23 20,51 0,45 сл сл 5,02 72,66 0,90 1,54 3,77 L. edodes 198 0,54 1,35 19,13 0,80 1,32 2,85 6,69 67,12 0,20 1,42 2,97 L. edodes 199 0,83 2,16 21,98 0,85 0,92 4,07 5,68 62,83 0,59 1,34 2,33 L. edodes 364 0,91 1,58 21,45 1,33 0,78 2,65 5,35 65,20 0,75 1,39 2,65 L. edodes 509 сл 0,32 16,5 сл сл 0,78 28,68 53,72 - 1,36 4,68 L. tigrinus 0,8 1,20 25,03 0,47 1,20 1,43 7,38 62,39 0,10 1,33 2,37 - 2,62 22,59 сл сл 4,13 13,06 57,60 - 1,28 2,41 4,72 13,67 56,59 - 1,27 2,36 Ganoderma lucidum 171 Coriolus hirsutus (РБ) С. hirsutus (УК) С18:3 сл сл сл 3,14 1,12 20,76 сл сл Trametes versicolor (РБ) 8,23 3,03 16,20 2,96 0,23 2,36 11,02 55,97 - 1,26 2,33 T. versicolor (УК) 7,68 2,79 18,30 3,91 сл 2,78 10,34 54,20 - 1,23 2,17 T. zonatus (РБ) 2,11 3,05 18,20 3,08 0,07 2,23 10,35 60,89 - 1,35 2,89 T. zonatus (УК) 1,92 3,45 19,42 3,78 0,38 2,54 9,87 58,63 - 1,31 2,48 T.pubescens (РБ) 0,01 3,57 27,11 - 0,40 5,02 7,49 61,30 - 1,30 2,20 97 Продолжение таблицы 2 Культуры грибов СН ∑ненас / ∑нас - 1,26 1,43 1,99 2,76 72,29 - 1,55 4,63 8,53 68,55 - 1,47 3,63 2,36 9,63 73,04 - 1,57 5,13 1,73 11,96 67,37 - 1,52 5,49 14,19 60,42 - 1,37 3,19 15,62 59,01 - 1,34 2,94 10,21 63,22 - 1,38 2,90 2,20 9,64 64,23 - 1,38 2,83 0,49 1,00 9,32 68,06 - 1,46 3,60 0,06 2,90 5,02 73,00 - 1,56 3,50 - 3,91 0,74 11,00 64,39 - 1,40 3,06 20,32 - 1,19 2,32 10,20 64,47 - 1,39 2,95 0,02 26,30 - - 0,04 7,13 66,51 - 1,40 2,79 - 0,49 22,42 - 2,55 0,23 10,01 64,30 - 1,39 2,89 - 0,02 20,37 0,01 - - 25,23 54,37 - 1,34 3,90 С 14:0 С 15:0 С 16:0 С 16:1 С 17:0 С 18:0 T. pubescens (УК) T. pulverulentum Laetiporus sulphureus 131 L. sulphureus 132 0,02 сл 3,70 0,02 24,91 24,42 сл - 0,42 0,09 4,32 2,05 6,85 3,32 59,76 70,10 сл 3,13 11,21 2.65 0,79 2,60 7,30 0,01 2,02 16,95 1,32 0,05 2,58 L. sulphureus 133 0,02 1,25 10,65 1,02 0,03 L. sulphureus 134 0,10 4,14 9,43 5,27 - L. sulphureus 115 - 4,20 16,94 1,50 0,50 2,25 L. sulphureus 122 - 3,33 19,35 - сл. 2,89 L.sulphureus 1772 0,01 0,17 23,74 0,93 0,04 1,68 L.sulphureus 1773 - 0,18 23,40 сл. 0,35 Fomes fomentarius - 0,12 20,10 0,94 Abortiporus biennis 0,07 0,15 18,80 - - 0,37 19,50 0,01 1,48 - Daedaleopsis confragosa Climacodon septentrionalis Tyromyces lacteus Bjerkandera adusta Phanerochaete сhrysosporium 98 С18:1 С18:2 С18:3 Окончание таблицы 2 Культуры грибов С 14:0 С 15:0 С 16:0 С 16:1 С 17:0 С 18:0 С18:1 С18:2 С18:3 СН ∑ненас / ∑нас порядок Agaricales Pleurotus osvantus 2,02 2,38 10,43 5,64 4,45 6,29 9,03 57,94 1,80 1,36 2,90 P. ostreatus 10 3,04 2,76 10,00 3,02 6,53 3,50 10,66 58,62 1,87 1,37 2,87 P. ostreatus 42 1,30 1,17 8,10 4,97 4,82 2,79 9,92 65,03 1,90 1,51 4,50 P.ostreatus 35(186) сл 1,49 10,58 2,80 4,25 3,73 6,05 66,20 4,72 1,55 3,9 P. ostreatus 205 1,39 2,04 10,22 2,06 5,96 3,24 6,77 64,66 3,66 1,49 3,38 P.ostreatus (ИБР) 3,12 2,32 7,60 5,91 5,02 P. zummer Shizophyllum commune Crinipellis schevczenkoi 1,21 0,75 1,52 1,50 0,54 9,27 22,84 22,02 Hericium erinaceus 3,14 Stereum hirsutum 0,02 2,95 10,00 59,31 3,77 1,46 3,75 9,82 13,11 6,32 64,26 60,16 64,45 1,67 1,63 сл 1,48 1,39 1,37 4,02 2,91 2,66 1,12 4,43 5,60 2,32 1,05 0,36 1,35 1,90 1,63 2,38 порядок Russulales 20,76 сл сл. 4,72 3,67 66,59 - 1,41 2,36 0,39 11,64 9,89 59,84 - 1,39 2,30 сл 16,46 1,23 Примечание. 1 – *С12:0 – не более 0,2% или следы (сл); 2 – СН – степень ненасыщенности липидов. 99 Доля олеиновой (С18:1) кислоты в составе липидов у большинства проверенных грибов колебалась в незначительных пределах и, в зависимости от родовой и видовой принадлежности гриба, не превышала 8–15%. Практически у всех штаммов грибов рода Lentinus и Pleurotus была обнаружена линоленовая кислота (С18:3), удельное содержание которой в жирнокислотном составе липидов составило 0,1–0,9% и 1,6–4,7% соответственно (таблица 2). Среди насыщенных жирных кислот липидов наибольший удельный вес приходился на пальмитиновую кислоту (С16:0), составляющую 7,6–26,3% от суммы всех кислот. Что касается других жирных кислот в составе общих липидов (С12:0, С14:0 и С15:0), то они содержались в незначительном количестве, и их доля не превышала 1–3% от суммы всех кислот. Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что в зависимости от родовой и видовой принадлежности исследованных грибов общая сумма ненасыщенных жирных кислот в составе общих липидов в 2–4 раза превышает сумму насыщенных. Синтез ненасыщенных жирных кислот у исследованных базидиальных грибов идет по пути преимущественного образования эссенциальной линолевой кислоты. Заключение. По количеству синтезируемых липидов исследованные базидиальные грибы несколько уступают микромицетам. Вместе с тем отдельные представители базидиальных грибов, особенно лекарственные, представляют определенный интерес для получения биомассы, обогащенной биоактивными липидными соединениями – фосфолипидами и эссенциальными жирными кислотами. Кроме того, некоторые грибы могут использоваться как продуценты фармацевтически важных липидных компонентов (фосфолипиды, полиеновые жирные кислоты, жирорастворимые витамины, стероидные соединения гормоноподобного действия и др.), которые могут найти самостоятельное применение в различных отраслях народного хозяйства: пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и др. Список литературы 1 2 3 Штамм гриба Fusarium sambucinum – продуцент биологически активных веществ: пат. 2004105836 RU, МПК7 С12N1/14 / Е.Т. Зуев, Л.М. Брагинцева, Г.И. Воробьева, Л.А. Неминущая, Э.Ф. Токарик. Н.К. Еремец; – № 2004105836/13; заявл. 01.12.2006; опубл. 27.12.2006. Способы получения вододиспергируемых антиоксидантов липидной природы на основе компонентов биомассы гриба Blakeslea trispora / С.В. Деев [и др.] // Биотехнология. – 2004. – № 1. – С.58–69. Фунтикова, Н.С. Синтез биологически активных липидов грибом Mucor lusitanicus 306 Д на средах разного состава / Н.С. Фунтикова, И.С. Мысякина, 100 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 И.В. Конова // Прикладная биохимия и микробиология. – 2002. – Т.38. – №6. – С. 644–648. Weete, J.D. Lipid Biochemistry of fungi and other organisms / J.D. Weete. – L.: Plenum Press, 1980. – 388 p. Лекарственные препараты и пищевые добавки из макромицетов / А.С. Бухало [и др.] // Успехи медицинской микологии: материалы третьего всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, 24–25 марта 2005 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – Москва, 2005. – Т.5. – С. 254–256. Ratledge, C. In: Microbial oils and fats: an assessment of their commercial potential / C. Ratledge // Progr. Ind. Microbial. – 1982. – Vol. 16. – P. 119–206. Изменение в липидном и углеводном составе клеток грибов в процессе онтогенеза и использование этих данных в хемотаксономии / Е.П. Феофилова [и др.] // Микология и фитопатология. – 1991. – № 4. – С. 348–358. Михайлова, Н.В. Липиды высших грибов и их жирнокислотный состав при различных экологических условиях: автореф. дис… канд. биол. наук / Н.В. Михайлова; Днепропетровский гос. университет. – Днепропетровск, 1990. – 16 с. Капич, А.Н. Содержание и жирнокислотный состав липидов дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич, Е.С. Романовец, С.П. Войт // Микол. и фитопатол. – 1990. – Т. 24, № 1. – С. 51–56. Липидный состав плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). / Е.П. Феофилова [и др.] // Микробиол. – 1998. – Т. 97, № 5. – С. 655–659. Гарибова, Л.В. Методологические подходы к изучению макромицетов используемых в биотехнологиях / Л.В. Гарибова, Л.А. Завьялова, И.Д. Инсарова // Грибы в природных и антропогенных системах: материалы Междунар. конф., С-Петербург, 24–28 апреля 2005 г. / С-Петербург, 2005. – Т. 1. – С.145–149. Ефименко, О.М. О химическом составе плодового тела и искусственных культур трутового гриба Fomitopsis officinalis (Vill.) Bond. Et Sing. / О.М. Ефименко, Л.В. Агеенкова // Кормовые белки и физиологические вещества для животноводства. – М.–Л.: Наука. – 1965. – С. 92–97. Шиврина, А.Н. Биологически активные вещества высших грибов / А.Н. Шиврина.– М.-Л.: Наука. – 1965. – 194 с. Jennison, M.W. Physiology of the wood–rotting Basidiomycetes. II. Nutritive composition of mycelium grown in submerged culture / M.W. Jennison, M.D. Newcomb, R. Henderson // Appl. Microbiol. – 1957. – Vol. 5, № 2.– P. 87–95. Nour el Dein, M.S. Biosynthesis of fat in submerged culture of Polyporus sulphureus / M.S. Nour el Dein, N.M. Abdallah // L. Allgem Mikrobiol. – 1967. – Vol. 7, № 1. – P. 29–32. Изменения в составе липидов в процессе дифференцировки грибов порядка Agaricales / Н.В. Михайлова [и др.] // Прикл. биохимия и микробиол. – 1993. – Т. 39, № 2. – С. 315–319. For higher basidiomycetes mushrooms grown as biomass in submerged culture: пат. 6372964 США, МКИ7 А 01 Н 015/00 / S.P. Wasser [et al]; Assignee Med Myco Ltd. – № 432653; заявл. 02.11.1999; опубл.16.04.2002. Елинов, Н.П. Химическая микробиология / Н.П. Елинов.− М.: В.Ш. Л.: Наука. − 1989. − 448 с. Капич, А.Н. Фосфолипиды мицелия дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич, Л.Н. Шишкина // Микол. и фитопатол. – 1993. – Т. 27, № 3. – С. 32–37. 101 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Капич, А.Н. АОА экстрактов мицелия ксилотрофных базидиомицетов / А.Н. Капич // Микол. и фитопатол. – 1995. – Т. 29, № 5. – С. 35–40. Капич, А.Н. Перекисное окисление липидов и его регуляция в мицелии ксилотрофных базидиомицетов / А.Н. Капич, Л.Н. Шишкина // Микробиология. − 1995.− Т. 64, № 3.− С. 320−326. Гвоздкова, Т.С. АОА липидов грибов различных таксономических групп / Т.С. Гвоздкова, Т.В. Черноок, А.Н. Капич // Весцi НАН Беларусi. – 2000. – № 4. – С. 50–53. Рrooxidant activity in cultures of wood-decaying fungi / A.N. Kapich [et al] // Biotechnology in the Pulp and Paper Industry. – 2004. – P. 33–34. Yokokawa, H. Fatty acid and sterol composition in mushrooms of ten species of Polyporaceae / H. Yokokawa // Phytochemistry. – 1980. – Vol. 19, № 12. – P. 2615–2618. Folch, I. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues / I. Folch, M. Lees, G.H.S. Sloan-Staulet // J. Biol. Chem. − 1957. − Vol. 226, № 1.− P. 491−509. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс.− М.: Мир, 1975.− 322 с. О липидах Pythium debarianum / Н.Л. Соловьева [и др.] // Микробиология. – 1997. – Т.66, № 4. – С. 475–480. Молочкина, Е.М. Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии / Е.М. Молочкина // Исследование синтетических и природных фосфолипидов in vitro и in vivo: сб. ст. / М.: «Наука», 1992. – С. 100–109. LIPIDS OF BASIDIOMYCETES GVOZDKOVA T.S., SHCHERBA V.V., CHERNOOK T.V., FILIMONOVA T.V, ROZHKOVA Z.A., OSADCHAYA O.V, SMIRNOV D.A., BABITSKAYA V.G. Laboratory of experimental mycology Lipids synthesis by basidiomycetes belonging to different taxons was studied. It was established that approximately 50% of studied cultures (basically belonging to order Polyporales) during submerged cultivation synthesize 7–10% of lipids, other fungi synthesize not more then 3–5%. The highest capability of lipids synthesis showed Laetiporus sulphureus strains (20–30% of dry mycelium). Ratio of phospholipids in total lipids ranged between 13 and 60% and in dry mycelium between 0.7 and 5.4%. The highest content of phospholipids in mycelium (more then 3–5%) with active growth and increased lipids synthesis exhibited individual representatives of order Polyporales gender Ganoderma, Lentinus, Trametes and Laetiporus. Study of composition of lipids’ fatty asides revealed common regularity: sum of unsaturated fatty acids in total lipids is 2–4 times higher than the sum of saturated fatty acids at the expense of substantial predominance of essential linoleic acid (С18:2) that comprises more then 60–70% of the sum of acids. The performed study allows considering the above mentioned group of fungi as a promising source of biologically active lipids. 102 УДК 579.2+579.6;573.6 ПОДБОР ПРОТЕКТОРНЫХ СРЕД ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Важинская И.С., Новик Г.И., Кантерова А.В. лаборатория «Коллекция микроорганизмов» Для мицелиальных грибов, представителей родов Fusarium, Pleurotus, Ganoderma, подобраны протекторные среды, способствующие сохранению их жизнеспособности в процессе длительной консервации при -70оС. Лучшими протекторными средами для F. solani БИМ F-347 и F. oxysporum БИМ F-346 являются ДМСО и глицерол, для P. ostreatus БИМ F-306 Д - лактоза и ДМСО, для G. lucidum БИМ F-325 Д - обезжиренное молоко. Введение. Одним из надежных способов сохранения микробных культур в жизнеспособном состоянии является их консервация в условиях низких и сверхнизких температур. В Международном микологическом Институте (Великобритания) этот способ успешно применяется для хранения грибов [1]. Используя криогенный световой микроскоп, ряд исследователей [2] изучали влияние замораживания на мицелий. В зависимости от реакции культур на низкую температуру, авторы разделили их на несколько групп. К первой отнесли грибы, у которых мицелий полностью терял жизнеспособность при замораживании со всеми проверенными скоростями охлаждения. Происходило нарушение целостности поверхности клеток без образования кристаллов льда внутри мицелия (например, Phytophthora nicotianae, Lentinus edodes). Во вторую группу включили культуры, у которых наблюдалась внутриклеточная кристаллизация воды с потерей жизнеспособности (Sordaria fimicola, Schizophyllum commune). При этом представители Hyphomycetes выживали даже без использования криопротекторов. У грибов, включенных в третью группу (например, Serpula lacrymans), не наблюдалось образование кристаллов льда в клетках, не происходило деформации мицелия и гибели клеток, в результате у них был самый высокий процент выживаемости. Сложность низкотемпературного консервирования мицелиальных грибов заключается в том, что необходимо подбирать условия не только для каждого вида, но часто и для разных штаммов одного и того же вида, поскольку их индивидуальная устойчивость к холоду различна. Перед замораживанием культуры должны быть выращены на оптимальной питательной среде до зрелой стадии разви- 103 тия, поскольку плохо развитый мицелий не выдерживает воздействия низких температур. Необходимо знать наиболее подходящие скорости замораживания и оттаивания, правильно выбрать температуру хранения, использовать эффективные криопротекторы, поскольку ни одна защитная среда не может быть универсальной. В результате такой оптимизации факторов, культуры мицелиальных грибов могут сохраняться длительное время без морфологических, физиологических и генетических изменений. В Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии хранятся около 300 штаммов грибов, 14 из которых являются объектами правовой защиты. Для поддержания фонда культур в жизнеспособном состоянии используются несколько методов. Для спорообразующих дейтеромицетов применяется консервация в лиофильно-высушенном состоянии [3]. Грибы, растущие в культуре только в мицелиальной форме (в основном, базидиомицеты) поддерживаются постоянными пересевами на плотную питательную среду и хранятся при о температуре +4 С под слоем минерального масла или без него. Гифы у грибов этой группы либо совсем не выдерживают лиофильное высушивание, либо имеют очень низкий процент выживаемости. Лучшим способом хранения для них считается криоконсервация. Опыты по хранению грибов в условиях низкотемпературных режимов были начаты в лаборатории «Коллекция микроорганизмов» ИНМИ НАНБ в 2006 г. [4, 5]. Цель настоящего исследования – подбор криопротекторов для грибов различных таксономических групп, обеспечивающих их жизнеспособность при длительном хранении в состоянии «холодового» анабиоза при температуре -70 оС. Объекты и методы исследования. Для хранения в замороженном состоянии были отобраны штаммы из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов – анаморфные аскомицеты Fusarium solani БИМ F-347 и F. oxysporum БИМ F-346, используемые в качестве тест-культур для отбора агентов биоконтроля патогенных микроорганизмов, а также представители базидиомицетов – агариковый гриб Pleurotus ostreatus БИМ F-306 Д, продуцент пищевой биомассы [6], и трутовик Ganoderma lucidum БИМ F-325 Д, продуцент полисахаридов, обладающих антиоксидантной активностью [7]. Все отобранные штаммы представляют интерес для биотехнологии, что предполагает поиск способов их длительного гарантированного хранения без потери полезных свойств. На основании анализа данных литературы [8, 9] и результатов собственных исследований [5] в качестве криопротекторов 104 были использованы следующие химические соединения: диметилсульфоксид (ДМСО), 5% об., (CH3)2SO, Мм=78,13 – в криобиологии широко используется как эффективный, быстро проникающий в клетки криопротекторный агент [10, 11]; глицерол, 10% об., (CH2)2CH(OH)3, Мм=92,09 – часто используется в качестве криопротектора для мицелиальных грибов [12], скорость его проникновения в клетки несколько ниже, чем у ДМСО; лактоза, 10%, C12H22O11·H2O, Мм=360,31 – дисахарид с низкой скоростью проникновения в клетки, широко применяемый в криобиологии [13]. Из комплексных протекторов, также обладающих низкой скоростью проникновения в клетки, нами использовалось 10% обезжиренное молоко [14]. Грибы перед замораживанием выращивали 14 суток на плотных питательных средах оптимального состава [15]. Образцы воздушного и субстратного мицелия помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и добавляли протекторы. Контролем служили образцы нативного мицелия. Пробирки выдерживали 2 ч при +4 оС, затем помещали в низкотемпературную морозильную камеру на хранение при -70 оС. Для определения жизнеспособности культур и эффекта действия протекторов, образцы отбирали через 1 сутки, 1 и 3 месяца, 6, 9, и 12 месяцев. Размораживали мицелий в два этапа – при -20 оС в течение 3 ч, далее при +4 оС до полного оттаивания. Извлеченный из пробирок мицелий выращивали на плотной питательной среде, через 2, 7 и 14 суток определяли жизнеспособность культур, изучали макро- и микроморфологию мицелия. В экспериментах рассчитывали ростовой коэффициент (РК) – показатель, учитывающий диаметр колоний грибов через 2–3 суток роста, плотность и высоту воздушного мицелия [16]. Результаты и обсуждение. Установлено, что без использования криопротекторов клетки мицелия G. lucidum БИМ F-325 Д утрачивали жизнеспособность уже через 6 месяцев хранения при -70оС. Для F. solani БИМ F-347, F. oxysporum БИМ F-346 и P. ostreatus БИМ F-306 Д возможна консервация при -70 оС в течение 12 месяцев без потери жизнеспособности (таблица). Необходимо отметить, что РК культур рода Fusarium после восстановления и выращивания на плотной питательной среде через 2 суток варьировали в пределах 80–100, плотность мицелия даже через 7 суток была низкой. Микроскопический контроль показал, что после репарации у грибов рода Fusarium слабо развивались конидиеносцы – монофиалиды, макро- и микроконидии были малочисленные. Лигнотрофный вид Pleurotus ostreatus относится к быстрорастущим базидиомицетам, однако, после замораживания мицелия без протекторов и хранения в течение 105 года, скорость роста гриба значительно снизилась, РК равнялся всего 60, основу мицелия составляли, в основном, генеративные гифы с малочисленными пряжками. Таблица – Рост и морфологические свойства аско- и базидиомицетов при криоконсервации и субкультивировании * Культура Условия хранения -70 0С +4 0С 0 -70 С +4 0С F. oxysporum F-346 P. ostreatus F-306 Д G. lucidum F-325 Д РК через 2 суток С протекторами** Без протекторов 150 150 200 100 100 60 150 С протекторами Без протекторов С протекторами -70 0С Без протекторов +4 0С F. solani F-347 - 150 200 Цвет мицелия через 7 суток белый лиловый белый 30 0 150 белый Бледнобелый розовый белый лиловый белый белый Микроскопический контроль через 14 суток Многочисл. Многочисл. МногоМаломикро- и микро- и макроконимакроконичисл. числ. пряжки пряжки дии, хладии, хламидоспоры мидоспоры Малочисл. Малочисл. Маломикро- и микро- и числ. макроконимакроконипряжки дии дии Многочисл. Многочисл. микро- и микро- и МногоМногочисл. числ. макроконимакроконидии, хладии, хлапряжки пряжки мидоспоры мидоспоры белый Примечание. * – Срок хранения 12 месяцев, периодичность пересевов культур, хранившихся при +4 оС – 3 месяца; ** – усредненные данные, полученные при хранении с ДМСО, глицеролом, лактозой. При замораживании и хранении с использованием протекторов мицелий грибов полностью сохранил жизнеспособность. Для F. solani БИМ F-347 и F. oxysporum БИМ F-346 через год хранения с ДМСО и глицеролом отмечены хорошие показатели 106 РК ~ 150. Мицелий был плотный, хлопьевидный, белого (F. solani) и лилового (F. oxysporum) цвета с многочисленными макро- и микроконидиями и хламидоспорами. Защитный эффект лактозы и обезжиренного молока для фузариев проявился значительно слабее. Для P. ostreatus БИМ F-306 Д лучшими протекторами служили лактоза и ДМСО. Величина РК равнялась 200, воздушный мицелий имел третью степень плотности и высоту ~ 10 мм, на генеративных гифах с большим количеством ответвлений сформировалось множество пряжек. Культура G. lucidum БИМ F-325 Д сохранила жизнеспособность при хранении с обезжиренным молоком. Но РК через 2 суток не превышал показатель 30, генеративные, скелетные и связывающие гифы мицелия были четко дифференцированы после второго пассажа на свежую питательную среду. Одновременно контролировали скорость роста и особенности строения мицелия культур, поддерживаемых методом пео риодических пересевов и хранящихся при +4 С. У аскомицетов Fusarium solani БИМ F-347 и F. oxysporum БИМ F-346 величина РК равнялась 150, мицелий был плотный, войлочный, характерно окрашенный, макро- и микроконидии, а также хламидоспоры были многочисленные. Достоверных различий в скорости роста и строении мицелия с аналогичными показателями культур, хранившихся в замороженном состоянии, не установлено. Представители базидиомицетов P. ostreatus БИМ F-306 Д и G. lucidum БИМ F-325 по скоростям роста (РК через 2 суток равнялся 200 и 150, соответственно), и по характеру роста мицелия (хорошо развитые генеративные, скелетные и связывающие гифы, большое количество пряжек) также не отличались от культур, хранившихся при низкой температуре. Таким образом, опыты по криоконсервации представителей аско- и базидиомицетов показали, что при использовании защитных сред, грибы устойчивы к воздействию низкой температуры, полностью сохраняют жизнеспособность и морфологические свойства. Данный способ хранения может успешно применяться в коллекции наряду с традиционно используемым методом периодических пересевов, поскольку значительно экономит время, исключается возможность диссоциации и контаминации культур. Заключение. Наряду с субкультивированием целесообразно проводить криоконсервацию для длительного гарантийного сохранения коллекции мицелиальных грибов. Для увеличения срока хранения грибов в замороженном состоянии необходимо использовать защитные среды, подобранные для каждой культуры. Для аскомицетов F. solani БИМ F-347 и F. oxysporum БИМ 107 F-346 в качестве криопротекторов рекомендуется использовать ДМСО и глицерол, для базидиомицетов P. ostreatus БИМ F-306 Д-лактозу и ДМСО, G. lucidum БИМ F-325 Д – обезжиренное молоко. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Onions, A.N.S. Preservation of fungi. / A.N.S. Onions // In: Methods in Microbiology (ed. by C. Booth), London and New-York: Academic Press. – 1971. – Vol. 4. – Р. 113–151. A comparative study of the changes in the morphology of hyphae during freezing and viability upon thawing for twenty species of fungi. / G.J Morris [et al] // J. of General Microbiology. – 1988. – Vol. 134. – P. 2897–2906. Важинская, И.С. Лиофилизация – эффективный метод длительного хранения дейтеромицетов. / И.С.Важинская, А.В.Кантерова // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы междунар. науч. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006 / НАН Беларуси. Ин-т микробиол.; редкол.: Алещенкова З.М. [и др.]. – Минск, 2006. – C. 26–27. Важинская, И.С. Теоретические и практические аспекты криоконсервации микроорганизмов. / И.С. Важинская, Г.И. Новик, Д.В. Рахуба // Инновационные технологии в производстве пищевых продуктов: материалы V-ой междунар. науч.-практ. конф., Минск, 5–6 октября 2006 / НАН Беларуси; редкол.: Алещенкова З.М. [и др.]. – Минск, 2006. – С. 36–38. Важинская, И.С. Криоконсервация мицелиальных грибов в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов / И.С. Важинская, Г.И. Новик, Д.В. Рахуба // Инновационные технологии в производстве пищевых продуктов: матер. V-ой междунар. науч.-практ. конф., Минск, 5–6 октября 2006 / НАН Беларуси; редкол.: Алещенкова З.М. [и др.]. – Минск, 2006. – С. 34–35. Способ получения пищевой биомассы гриба: пат. 7614 Респ. Беларусь, С 12Р 21/00,С12N 1/14 / В.Г. Бабицкая, В.В. Щерба, Т.А. Пучкова, Н.М. Ровбель, Т.В. Филимонова, О.В. Осадчая, З.А. Рожкова; заявитель ГНУ «Институт микробиологии НАНБ». – N а 20030773; заявл. 28.07.03; опубл. 30.06.04. Штамм Ganoderma lucidum БИМ F-325 Д – продуцент полисахаридов, обладающий антиоксидантной активностью: пат. 8374 Респ. Беларусь МПК 7 С12 В 1/14, С 12 Р 19/10 / В.Г. Бабицкая, В.В. Щерба, О.В. Осадчая, Т.А. Пучкова, Д.А. Смирнов; заявитель ГНУ «Институт микробиологии НАНБ». – № а 20040220; заявл. 18.03.04; опубл. 12.05.2006 // Афiцыйны бюл. / Нац. цэнтр iнтэлектуал. уласнасцi. – 2006, – № 4. – C. 83. Use of Commercially Available Cryogenic Vials for Long-Term Preservation of Dermatophyte Fungi / M. Baker [et al] // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44, № 2. – P. 617–618. Hubalek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms / Z. Hubalek // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46. – P. 205–229. Hwang, S.-W. Investigation of ultralow temperature for fungal cultures I / S.-W. Hwang // Mycologia. – 1968. – Vol. 60. – P. 613–621. Hwang, S.-W. Investigation of ultralow temperature for fungal cultures II / S.-W. Hwang // Mycologia. – 1968. – Vol. 60. – P. 622–626. Hwang, S.-W. Effects of ultralow temperature on the viability of selected fungus strains / S.-W. Hwang // Mycologia. – 1960. – Vol. 52. – P. 527–529. Cryopreservation of entrapped monoxenically produced spores of an arbuscular mycorrhizal fungus / S. Declerck [et al] // New Phytol. – 2000. – Vol. 148. – P. 169–176. 108 14 15 16 Technique for longterm preservation of phytopathogenic fungi in liquid nitrogen / H. Dahmen [et al] // Phytopathology. – 1983. – Vol. 73. – P. 241–246. Важинская, И.С. Выделение и идентификация микромицетов из торфяных и дерново-подзолистых почв в различных регионах Беларуси / И.С. Важинская, Н.В. Образцова // Микробиология и биотехнология ХХ1 столетия: материалы междунар. конф., Минск, 22–24 мая 2002 г. / НАН Беларуси; редкол.: Астапович Н.И. [и др.]. – Минск, 2002. – С. 17–18. Бухало, А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / А.С. Бухало // Киев. Наукова думка. – 1988. – 144 с. SELECTION OF PROTECTANTS FOR CRYOPRESERVATION OF FILAMENTOUS FUNGI VAZHYNSKAYA I.S., NOVIK G.I., KANTEROVA A.V. Laboratory “Microbial collection” Dimethylsulfoxide, glycerol, lactose and skimmed milk have been successfully applied for cryopreservation of filamentous fungi from genera Fusarium, Pleurotus, Ganoderma. УДК 579.6+577.15:577.113.3:579.842.11 ПРИМЕНЕНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ ЛИЗИЛ-тРНКСИНТЕТАЗЫ ESCHERICHIA COLI В РЕАКЦИИ СИНТЕЗА ДИАДЕНОЗИН-5′,5′′′-P1,P4-ТЕТРАФОСФАТА Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И. лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы В настоящей работе показано, что лизил-тРНК-синтетаза, продуцируемая генно-инженерным штаммом Escherichia coli, способна служить биокатализатором реакции синтеза фармакологически важного соединения – диаденозин-5′,5′′′-Р1,Р4тетрафосфата (Ар4А). Ген lysU, кодирующий стресс-индуцибельную лизил-тРНКсинтетазу (LysU), выделен методом ПЦР и лигирован в вектор рЕТ24b+, предназначенный для экспрессии белков. Лигазная смесь использовалась для трансформации клеток E. coli BL21(DE3). В результате получен штамм, сверхпродуцирующий LysU. Уровень экспрессируемой LysU в сконструированном штамме достигал 80% от суммарного клеточного белка. Предложен также эффективный метод очистки генно-инженерной LysU, который позволил получить препарат гомогенного фермента с выходом 79%. Очищенный фермент эффективно катализировал синтез Ар4А из АТР. Выход целевого продукта спустя 1 час после начала реакции составил 95 мол.%. Введение. Диаденозин-5′,5′′′-P1,P4-тетрафосфат (Ар4А) представляет собой молекулу, состоящую из двух аденозиновых остатков, соединенных тетрафосфатным мостиком (рисунок 1). 109 NH 2 NH2 N N N N N O O P HO OH O O- O P O- O P O- N O O O -O P O N N O OOH OH Рисунок 1 – Химическая формула диаденозин-5′,5′′′-P1,P4тетрафосфата Ар4А присутствует в цитоплазме клеток как прокариот, так и эукариот [1]. Сравнительно недавно обнаружено, что этот динуклеотид способен действовать как внеклеточная сигнальная молекула в различных тканях, участвует в передаче синаптического сигнала, ингибирует агрегацию тромбоцитов [2], а также способен изменять тонус сосудов [3, 4]. В связи с таким широким спектром активностей, проявляемых Ар4А, открываются перспективы использования этого соединения и его аналогов в качестве химикотерапевтических средств. По литературным данным Ар4А синтезировать можно, используя химические [5] и ферментативные [6,7] методы. Химические способы синтеза представляют собой многостадийные процессы с низкими (не превышающими 25%) выходами Ар4А. Кроме того, эти процессы сопровождаются образованием побочных соединений, трудно отделяемых от целевого продукта. К тому же химический синтез Ар4А проводится с использованием токсичных органических растворителей и требует создания трудно реализуемых условий. Однако, в 1966 году P. Zamecnik впервые обнаружил, что Ар4А можно синтезировать при помощи ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) в присутствии молекул АТР, ионов магния и аминокислот [8]. Данная реакция протекает in vivo в две стадии: aaRS + аминокислота + ATP → aaRS·аминоацил-AMP + PPi (1 стадия) aaRS·аминоацил-AMP + ATP → Ap4A + аминокислота + + aaRS (2 стадия) На первой стадии реакции к аминокислоте присоединяется AMP, образуя комплекс фермента с аминоацил-аденилатом. Также на этой стадии образуется побочный продукт – пирофосфат. На второй стадии реакции aaRS-комплекс c аминоациладенилатом атакуется еще одной молекулой АТР, в результате 110 чего образуется Ар4А и освобождаются исходная аминокислота и фермент. В данной работе для синтеза Ар4А in vitro была использована бактериальная рекомбинантная лизил-тРНК-синтетаза (LysU). LysU – стресс-индуцибельный фермент, который является изоферментом конститутивно экспрессируемой лизил-тРНКсинтетазы (LysS) Escherichia coli. Гены, кодирующие LysU и LysS (lysU и lysS, соответственно), располагаются раздельно на хромосоме E. сoli и регулируются особым образом. Так, ген lysS экспрессируется при нормальных условиях роста, а ген lysU эскпрессируется только при особых физиологических условиях, таких как тепловой шок, окислительный стресс, анаэробные условия роста, переход в стационарную фазу роста, метаболический стресс и т.д. В норме LysS катализирует реакцию присоединения Lys лизина к тРНК , в то время как LysU способна эффективно катализировать реакцию синтеза Ар4А, что, по-видимому, является ее основной функцией. Цель исследования – изучить возможность применения очищенного генно-инженерного фермента LysU для синтеза Ар4А. Объекты исследований. В работе использовали бактерии E. coli BL21(DE3) из коллекции лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси. Конструирование генно-инженерного штамма E. coli lysU2. Ген lysU был выделен методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы геномной ДНК штамма E. coli DH5α, а также праймеров L-F (5′TACGACCATATGTCTGAACAAGAAACACGG-GGAGCC-3’) и L-R (5′-CGGGTCGACTTATTTCTGTGGGCGCATCG-3’). Для проведения реакции амплификации использовали 1,25 ед. активности GoTaq-полимеразы (Promega, США). Полученный в результате ПЦР продукт выделяли из геля с помощью набора реактивов «Wizard SV gel and PCR clean-up system» согласно методике фирмыизготовителя, обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и SalI, и затем вставку с геном lysU лигировали в вектор pET24b+, содержащий T7-промотор (Novagen, США). В результате была получена плазмида pETlysU2, несущая ген lysU. Этот вектор использован для трансформации клеток E. coli BL21(DE3). Таким образом получен новый штамм бактерий E. coli lysU2, являющийся суперпродуцентом LysU. Выделение и очистка LysU. Клетки E. coli lysU2, несущие плазмиду с геном lysU, выращивали до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм) на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл канамицина; затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения изопро- 111 пил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 5-ти часов. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 × g. Осадок суспендировали в 10 мМ Naфосфатном буфере (pH = 7,5) до концентрации клеток 0,06 г/мл (в расчете на сухую биомассу). Для разрушения клеток их суспензию обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10 (Techpan, Польша) при мощности 0,5 кВт в течение 5 мин при 4 оС. После центрифугирования образца в течение 30 мин при 20000 × g супернатант подвергали сульфатаммонийному фракционированию. Для этого концентрацию сульфата аммония доводили до 50% насыщения и центрифугировали пробу 10 мин при 10 000 × g. Полученный осадок белка растворяли в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН=7,5) и проводили диализ против 1000-кратного объема того же буфера. Затем раствор белка наносили на хроматографическую колонку (l=10 см, d=2 см) с кальций-тартратным гелем (CTG), уравновешенную 10 мМ К-фосфатным буфером (рН=7,0). CTG получали при помощи метода, описанного в статье [9]. После промывания колонки 100 мл К-фосфатного буфера белок элюировали при скорости 1 мл/мин с использованием линейного градиента К-фосфатного буфера (100 мл, от 10 до 300 мМ). Фракции, содержащие LysU, собирали и подвергали сульфат-аммонийному фракционированию путем внесения сульфата аммония до 80% насыщения. Суспензию центрифугировали в течение 20 мин при 10000 × g, осадок белка растворяли в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН = 7,5), содержащем 60%-ный глицерин. Образец объемом 2 мл наносили на колонку (l=75 см, d=1,4 см) с гелем Toyopearl HW-55 (ToyoSoda, Япония), уравновешенную 10 мМ К-фосфатным буфером (рН=7,0), содержащем 10%-ный глицерин и 0,2 М хлорид натрия. Полученные после гель-хроматографии фракции анализировали с помощью SDS-полиакриламидного гель-электрофореза [10], и затем объединяли фракции, содержащие LysU. Определение ферментативной активности LysU. Ферментативную активность LysU анализировали по скорости реакции превращения ATP в Ар4А. Стандартная реакционная смесь (1 мл) содержала 20 мМ Na-фосфатный буфер (рН = 7,5), 4 мМ хлорид магния, 150 мМ хлорид натрия, 160 мкМ сульфат цинка, 4,3 мМ АТР, 2,4 мМ L-лизин (Serva, Германия) и 0,5 ед. пирофосфатазы (Serva, Германия). Смесь инкубировали при 37 оС при перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии в системе: диоксан – вода – 25% водный аммиак (6:4:1, об/об). Соединения детектировались в УФ-свете и сравнивались с маркерами. Пятна, 112 соответствующие ATP и Ap4A, экстрагировали 3 мл 10 мМ Naфосфатного буфера, и их концентрации определяли спектрофотометрически с использованием известных коэффициентов молярной экстинкции (λ=260 нм, ε=15400 и ε=30800 для ATP и Ap4A, соответственно). За единицу активности LysU принимали такое количество фермента, которое обеспечивало образование продукта в количестве 1 нмоль за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури [11]. Результаты и их обсуждение. Клонирование lysU и экспрессия генно-инженерного белка. На первой стадии был создан штамм-суперпродуцент LysU. Для этого использовалась pET-система экспрессии, состоящая из плазмиды pET24b+ и штамма бактерий E. coli BL21(DE3). Как известно, система pET является наиболее эффективной системой, разработанной для клонирования и экспрессии рекомбинантных белков в клетках E. coli. Целевые гены встраиваются в рЕТ-плазмиды, где они находятся под контролем промотора, полностью зависящего от наличия в клетке Т7-РНКполимеразы. С помощью бактериофага ген Т7-РНК-полимеразы был внесен в геном некоторых штаммов E. coli, одним из которых является E. coli BL21(DE3). Данный ген в своей структуре имеет сильный индуцибельный промотор, репрессор которого также внедрен в геном бактерии. Синтез Т7-РНК-полимеразы можно индуцировать с помощью широко распространенного индуктора – изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG). Таким образом, добавлением в растущую культуру бактерий индуктора можно управлять экспрессией нужного гена в составе целевой плазмиды и нарабатывать целевой белок. Применение выше описанной pET-системы экспрессии позволило нам получить новый бактериальный штамм E. coli lysU2. Уровень экспрессируемой LysU в полученном штамме достигал 80% от суммарного клеточного белка. Обычно такой высокий уровень экспрессии сопровождается формированием нерастворимых тел включения, чего не наблюдалось в нашем случае. Более того, высокое содержание LysU в клетках не приводило к сколь нибудь заметному лизису клеток-продуцентов белка. Очистка LysU. На следующей стадии мы выделили генноинженерный фермент. Схема очистки белка включала стадии: сульфат-аммонийное фракционирование, CTG-хроматографию и гель-фильтрацию на смоле Toyopearl HW-55. CTG-хроматография имеет ряд преимуществ перед хроматографией на гидроксиаппатите, который обычно используется 113 для выделения лизил-тРНК-синтетаз. По своим характеристикам CTG похож на гидроксиаппатит, но имеет ряд существенных преимуществ, таких как более высокая скорость протекания и высокая белок-адсорбирующая емкость. Использование CTGхроматографии позволило очистить белок в 1,13 раза. Полученный после хроматографии белок был свободен от ДНК и РНК. Для получения гомогенного препарата LysU фермент, собранный после CTG-хроматографии и сконцентрированный с помощью сульфата аммония (80% насыщения), подвергли дополнительной очистке на колонке с гелем Toyopearl HW-55. На этой стадии мы получили гомогенный белок, о чем свидетельствуют результаты SDS-полиакриламидного гель-электрофореза (рисунок 2). кДа M 1 2 3 200 120 70 60 50 40 30 25 15 Рисунок 2 – Электрофоретический анализ белковых фракций, полученных на различных этапах очистки генно-инженерного фермента LysU. М – положение и молекулярные массы (кДа) стандартных белков; 1 –лизат клеток E. coli lysU2; 2 – объединенные фракции белка LysU после CTG-хроматографии; 3 – объединенные фракции белка LysU после гель-фильтрации на смоле Toyopearl HW-55. 114 С помощью данной методики было получено 21,8 мг LysU из 57,6 мг суммарного клеточного белка (таблица 1). Препарат гомогенного фермента использовали в реакции синтеза Ap4A. На рисунке 3 показаны кривые зависимости выхода синтезированного Ap4A от времени реакции. Как видно, после 60 мин реакции выход Ap4A достигает максимума 95% и после этого резко снижается. Таблица 1 – Выделение и очистка LysU Стадии очистки УЗ-лизат клеток CTGхроматография Гельфильтрация на смоле Toyopearl Общий белок (мг) Общая активность (ед) Удельная активность (ед/мг) Степень очистки Выход (%) 57,6 6371 110,6 1 100 41,4 5187 125,3 1,13 81 21,8 5053 231,8 2,08 79 120 Выход Ap4A, % 100 80 2 60 1 40 20 0 0 50 100 150 200 250 Время реакции, мин Рисунок 3 – Синтез Ар4А с использованием очищенной LysU в стандартной реакционной смеси (1) и в смеси с АТР-регенерирующей системой (2) Согласно данных статьи [12] синтез Ap4A с помощью лейцил-тРНК-синтетазы сопровождается образованием нескольких 115 побочных продуктов из-за гидролиза ATP до ADP и AMP. Для снижения образования побочных продуктов авторы предлагают вводить в реакционную смесь систему, регенерирующую ATP и состоящую из ацетаткиназы, аденилаткиназы, а также ацетилфосфата в качестве донора фосфата. В наших экспериментах использование этого подхода привело к небольшому снижению скорости деградации AP4A (кривая 2, рисунок 3) В настоящее время проводится дальнейшая оптимизация реакции синтеза AP4A. Заключение. Таким образом, нами сконструирован бактериальный штамм-суперпродуцент лизил-тРНК-синтетазы, содержащий в составе плазмиды рЕТ24b+ ген, кодирующий этот фермент. Разработан метод выделения гомогенной генноинженерной LysU с 79% выходом и продемонстрирована возможность применения этого фермента для биокаталитического синтеза Ар4А. Работа выполнена в рамках ГПOФИ «Физиологически активные вещества». Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Baxi, M.D. Diadenosine polyphosphates: Their biological and pharmacological significance / M. D. Baxi, J.K. Vishwanatha // J. Pharmacol. Toxicol. Meth. – 1995. – Vol. 33, № 1 . – P . 1 2 1 – 1 2 8 . Analogues of diadenosine 5',5'''-P1,P4-tetraphosphate (Ap4A) as potential antiplatelet-aggregation agents / P. C. Zamecnik [et al] // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 1992. – V o l. 8 9 , № 6 . – P . 2370– 2 3 7 3 . Hilderman, R.H. P1,P4-diadenosine 5' tetraphosphate induces nitric oxide release from bovine aortic endothelial cells / R.H. Hilderman, E.F. Christensen // FEBS Lett. – 1998. – Vo l. 427, № 3 . – P . 320– 3 2 4 . Mesenteric and renal vascular effects of diadenosine polyphosphates (APnA) / G. Gabriels [et al] // Cardiovasc. Res. –2002. –Vo l. 56, № 1 . – P . 2 2 – 3 2 . Reiss, J. Dismutation reactions of nucleoside polyphosphates. 3. The synthesis of alpha, omega-dinucleoside 5'-polyphosphates / J. Reiss, J. Moffat // J. Org. Chem. – 1965. – V o l . 3 0 . – P . 3 3 8 1 – 3 3 8 7 . 1 4 / Synthesis of P ,P -di(adenosine 5 -) tetraphasphate by leucyl-tRNA synthetase, coupled with ATP regeneration / K. Seji [et al] // Biochemical and biophysical research communications. – 1987.– Vol. 146, № 1.– Р. 173–178. Characterization of stress protein Lys U. Enzymic synthesis of diadenosine 5′,5′′′P1, P4 – tetraphosphate (Ap4A) analogues by Lys U / M. Theoclitou [e t a l] / / J. Chem. Soc. – 1996.– Vol. 1. – Р. 2009– 2019. Enzymatic synthesis of diadenosine tetraphosphate and diadenosine triphosphate with a purified lysyl-sRNA synthetase / P.C. Zamecnik [et al] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1966. – Vol. 24. – Р. 91–97. Akhrem, A.A. Calcium tartrate gel / A.A. Akhrem, A.P. Drozhdenyuk // Anal. Biochem. – 1989. – Vol. 179, № 1. – Р. 86–89. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 259. – P. 680–685. 116 11 12 Peterson, G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable / G.L. Peterson // Anal. Biochem. – 1997. – Vol. 83, №2 . – Р. 436–356. Synthesis of P1, P4-di(adenosine 5'-) tetraphosphate by leucyl-tRNA synthetase, coupled with ATP regeneration / S. Kitabatake [et al] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1987. – Vol. 146, № 1 . – Р. 173–178. APPLICATION OF ESCHERICHIA COLI RECOMBINANT LYSYL-tRNA SYNTHETASE FOR THE SYNTHESIS OF DIADENOSINE 5′,5′′′-P1,P4TETRAPHOSPHATE BURKO D.V., KVACH S.V., ZINCHENKO A.I. Laboratory of nucleic compounds biotechnology A considerable potential of lysyl-tRNA synthetase produced by a new recombinant strain of Escherichia coli as biocatalyst for manufacturing of pharmacologically 1 4 valuable diadenosine 5′,5′′′-P ,P -tetraphosphate (Ap4A) was demonstrated. The gene of E. coli encoding the heat-inducible form of lysyl-tRNA synthetase (LysU) was isolated by the PCR method and ligated into the expression vector pET24b+. The ligation mixture was used to transform E. coli BL21(DE3). Typically, the expressed LysU in transformed cells was at least 80% of the total soluble cell proteins. A method for isolation of recombinant LysU with 79% yield of the homogeneous enzyme has been proposed. Max. degree of the recombinant LysU catalyzed ATP conversion into Ap4A reached 95 mol.% within 1 h. УДК 579.6:577.15:579.842.11 СУПЕРПРОДУКЦИЯ ПУРИННУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ ESCHERICHIA COLI В pET/BL21 СИСТЕМЕ Квач С.В., Шахбазов А.В.1, Зинченко А.И., Картель Н.А.1 лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы 1 лаборатория молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси Проведено выделение гена, отвечающего за синтез пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФазы) Escherichia coli методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Осуществлено молекулярное клонирование данного гена в вектор pET24b+ и отбор конструкций, содержащих ген ПНФазы под индуцибельным промотором Т7 в правильной ориентации. Создан генно-инженерный штамм-суперпродуцент ПНФазы на основе штамма E. coli BL21(DE3). Показано, что полученный генноинженерный штамм, названный E. coli:pD10 экспрессирует целевой белок в растворимой форме и уровень экспрессии ПНФазы достигает 80% от суммарного растворимого клеточного белка. Продемонстрирована возможность проведения индукции синтеза ПНФазы не только с помощью дорогостоящего изопропил-βтиогалактопиранозида (IPTG), обычно используемого для индукции экспрессии белков в pET-системах, но и с помощью более дешевой лактозы. Установлено, 117 что по уровню индуцируемой экспрессии белка лактоза не уступает IPTG и может с успехом использоваться для наработок генно-инженерной ПНФазы. Введение. Реакция гликозилирования, состоящая в присоединении гетероциклического основания к активированному сахарному (пентозному) остатку, является ключевым этапом в получении нуклеозидных аналогов, широко применяемых в качестве субстанций противовирусных и противоопухолевых лекарственных препаратов. Для проведения указанной выше реакции трасгликозилирования предложены химические и ферментативные методы. Химические методы гликозилирования приводят к образованию смеси трудно разделяемых изомеров. В отличие от химических ферментативные методы синтеза модифицированных нуклеозидов характеризуются высокой специфичностью и повышенным выходом целевых продуктов. В качестве биокатализаторов при получении модифицированных нуклеозидов чаще всего применяют группу ферментов – нуклеозидфосфорилаз (EC 2.4.2.3). Нуклеозидфосфорилазы E. coli представлены тремя внутриклеточными ферментами: уридинфосфорилазой и тимидинфосфорилазой, использующими в качестве субстратов пиримидиновые нуклеозиды, и ПНФазой, субстратами которой служат пуриновые нуклеозиды [1–3]. Как известно, методические подходы генетической инженерии позволяют значительно повысить эффективность микробиологического синтеза различных продуктов. В частности, одной из наиболее привлекательных альтернатив традиционной селекции микроорганизмов по целевому признаку является клонирование гена, непосредственно отвечающего за искомый признак, в вектор, обеспечивающий суперэкспрессию данного гена в соответствующем штамме [4]. Цель исследования – повышение уровня экспрессии ПНФазы E. сoli, фермента, катализирующего фосфоролиз широкого ряда природных и модифицированных нуклеозидов. Данный фермент, нарабатываемый в клетках E. coli, полученных с использованием традиционных методов селекции, с успехом применяется для биотехнологического получения таких субстанций лекарственных препаратов как 2-хлор-2′-дезоксиаденозин (субстанция препарата «Лейкладин») и 9-β-D-арабинофуранозил-2фтораденин (ключевое соединение для синтеза препарата «Флударабел») [5, 6]. Объекты и методы исследования. Объектом исследований служил коллекционный штамм E. coli БМТ-4Д/1а – донор гена, кодирующего ПНФазу, штамм E. coli BL21(DE3), использующийся 118 для получения генно-инженерного суперпродуцента ПНФазы и штамм E. coli DH5α, служащий промежуточным хозяином для наработки и анализа рекомбинантного вектора. Культивирование всех штаммов проводилось при температуре 37 oС на стандартной среде LB, содержащей: 10 г/л триптона, 10 г/л хлорида натрия и 5 г/л дрожжевого экстракта (рН=7,2). Штаммы, содержащие плазмиды и векторы на их основе, культивировались с добавлением канамицина в концентрации 50 мкг/мл. Клетки E. coli BL21(DE3), несущие плазмиду с геном ПНФазы, выращивали на LB-среде до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения IPTG до концентрации 1 мМ либо лактозы (0,1–0,8%) и продолжали культивирование в течение 3-х час. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием при 7000 g в течение 10 мин, дважды отмывали от питательной среды 0,15 М NaCl и ресуспендировали в этом же растворе. Выделение геномной ДНК проводили с помощью фенолхлороформенного метода с дополнительной очисткой при помощи цетавлона [7]. В качестве исходного материала использовали клетки E. coli БМТ-4Д/1а, выращенные в течение 24 ч на LB-среде. Подбор праймеров для ПЦР проводили, используя данные о первичной структуре гена ПНФазы. На 5′-концах праймеров были встроены сайты рестрикции NdeI и EcoRI, дополненные 4-мя произвольными нуклеотидами. Реакцию ПЦР проводили в буфере, содержащем 67 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 17 мМ (NH4)2SO4, 3 мМ MgCl2, 0,1% Твин-20, 0,12 мг/мл БСА, 8% глицерин, с добавлением 0,02 мM каждого из четырех природных дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0,2 мкМ каждого из праймеров (GGAATTCATATGGCTACCCCACACATTAA и CGGAATTCTATTACTCTTTATCGCCCAGCA), 150–200 нг тотальной ДНК E. coli БМT4Д/1а и 1 ед. активности Taq- или Pfu-полимеразы. Амплификация выполнялась по программе: 5 мин 94,0оС, (30 с 94,0 оС; 30 с 61,0 оС; 1 мин 72,0 оС) – 30 циклов; 7 мин 72,0 оС. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену ПНФазы, выделяли и лигировали в вектор pET24b+, также рестрицированный по NdeI и EcoRI и обработанный щелочной фосфатазой. Вставка и ориентация гена в векторе проводилась рестрикцией эндонуклеазами EcoRV, PstI, BamHI, HindIII, EcoRI. Электрофорез белков в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН), проводили в по методу 119 Лэммли [8] с использованием 3%-ого концентрирующего и 10%ого разделяющего гелей. Белковые препараты солюбилизировали добавлением буфера (в соотношении 1:1) следующего состава: 0,125 М Трис-НCl (рН 6,8); 4% ДСН; 20% глицерин; 0,2 М дитиотреитол. Для денатурации белков пробы кипятили в течение 5 мин. По окончании электрофореза белки окрашивали при помощи красителя Кумасси G-250. Активность ПНФазы определяли по скорости синтеза аденозина из аденина при использовании в качестве донора рибозы инозина. Реакционную смесь, содержащую 50 мМ аденин, 100 мМ инозин, 10 мМ К-фосфатный буфер (рН=7,0) и ферментный прео парат, инкубировали при 60 С в течение 20 мин. Из анализируемых образцов при помощи микрокапилляра отбирали аликвоты (5 мкл), которые наносили на хроматографические пластины для тонкослойной хроматографии Silufol-UV254. Хроматографию проводили в системе растворителей изопропанол–хлороформ–25%аммиак (10:10:1; об/об). Расположение пятен субстратов и продуктов реакции определяли в УФ-свете. Вещества элюировали 5 мл воды. УФ-светопоглощение элюатов измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны λ=260 нм. Активность фермента определяли на начальной стадии реакции, когда выход продукта не превышал 10–15% от максимального. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало образование 1 нмоль продукта за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мл культуральной жидкости и в ед/мг сухой биомассы клеток. Результаты и их обсуждение. Ген deoD, кодирующий ПНФазу E. сoli, был изолирован из геномной ДНК с использованием ПЦР с применением высокоточной Pfu-полимеразы (Promega, США) и встроен в плазмиду pET24b+ (Novagen, США) под контролем Т7-промотора (сильного промотора одного из белков фага Т7). Система pET, использованная в настоящей работе, является наиболее мощной из систем, разработанных для клонирования и экспрессии рекомбинантных белков в E. coli. Согласно этой системе гены клонируются в рЕТ-плазмиду, где они находятся под контролем промотора, полностью зависящего от наличия Т7-РНК-полимеразы в клетке. С помощью бактериофага ген Т7РНК-полимеразы был внесен в геном некоторых штаммов E. coli, одним из которых является E. coli BL21(DE3). Данный ген в своей структуре имеет индуцибельный промотор, репрессор которого также внедрен в геном бактерии. Синтез Т7-РНК-полимеразы можно индуцировать с помощью широко распространенного индуктора – IPTG. 120 Две конструкции (pD6 и pD10), несущие ген ПНФазы в правильной ориентации, были введены в штамм E. coli BL21(DE3), оптимизированный для индуцибельной экспрессии рекомбинантных белков в системе pET. Для проверки экспрессии целевого белка проводили индукцию синтеза ПНФазы в двух полученных штаммах с помощью 1 мМ IPTG в течение 3 ч, после чего измеряли активность ПНФазы. Результаты измерения приведены в таблице 1. Таблица 1 – ПНФазная активность генно-инженерных штаммов E. coli Штамм E. coli Активность ПНФазы, ед/мг клеток BL21:pD6 BL21:pD10 БМТ-4Д/1а (исходный) 207 000 221 000 10 000 Как видно из данных таблицы 1, продуцирование ПНФазы двумя генно-инженерными штаммами находится в одинаковых пределах. Для дальнейшей работы нами был выбран штамм E. coli BL21:pD10. Активность ПНФазы в полученных клеткахсверхпродуцентах в среднем в 20 раз превышает таковую мутантных клеток E. coli БМT-4Д/1а, полученных методами классической селекции, которые в настоящее время используются при синтезе субстанций лекарственных препаратов «Лейкладин» и «Флударабел», и, как минимум, в 2000 раз превышают активность диких штаммов E. coli. На следующем этапе была изучена возможность экспрессии ПНФазы с использованием в качестве индуктора не только обычно применяемого в таких случаях известного аналога лактозы – IPTG, но также и самой лактозы, которая является более дешевым соединением, что играет немаловажную роль при препаративных получениях белка. Применение лактозы для экспрессии белков, имеющих lacзависимые промоторы, до настоящего времени ограничено единичными сообщениями. Так, в некоторых исследованиях было показано, что внесение лактозы в концентрации 0,2–0,4% приводит к экспрессии ряда рекомбинантных белков на уровне, сопоставимом с экспрессией под действием IPTG [9, 10]. В настоящем исследовании для проверки возможности использования лактозы в качестве индуктора экспрессии ПНФазы ее вносили в концентрациях 0,1–0,8%; параллельно часть контрольных клеток была индуцирована с помощью 1 мМ IPTG. Ре- 121 зультаты этого эксперимента представлены в таблице 2. Из этих данных видно, что степень индукции ПНФазы практически не зависит от концентрации лактозы и результирующая активность фермента изменяется в пределах 213 000–259 000 ед/мг клеток. Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что для препаративной наработки ПНФазы можно использовать лактозу в концентрации 0,1%. Таблица 2 – Активность ПНФазы в зависимости от вида и концентрации индуктора Индуктор (концентрация) Контроль (без индуктора) Лактоза (0,1 %) Лактоза (0,2 %) Лактоза (0,4 %) Лактоза (0,8 %) IPTG (1 мМ) ПНФаза ед/мг 51 500 ед/мл 70 040 Биомасса клеток, мг/мл 1,36 224 000 213 000 233 000 259 000 328 000 336 000 323 760 330 860 370 370 252 560 1,50 1,52 1,42 1,43 0,77 Из таблицы 2 также видно, что при индукции клеток с помощью IPTG рост клеток сильно замедляется (в результате того, что T7-РНК-полимераза способна транскрибировать гены только с T7-промотора, при этом продуцирование других белков, необходимых для роста клетки, останавливается). В этом варианте опыта наблюдается максимальная активность ПНФазы в расчете на единицу клеточной биомассы. В случае с лактозой продукция биомассы в два раза выше, чем при индукции IPTG, в то же время максимальная активность ПНФазы, выраженная в ед/мг клеток, оказалась в 1,26 раза меньше. Что касается активности, выраженной в ед/мл культуральной жидкости, то она максимальна при экспрессии ПНФазы c помощью лактозы. В результате анализа полученных данных можно отметить, что применение в качестве индуктора именно лактозы (в любой использованной нами концентрации) не приводит к выраженному ингибированию роста клеток, но при этом индукция экспрессии гена ПНФазы идет не столь интенсивно по сравнению с использованием в качестве индуктора IPTG (разница в активности фермента достигает 115 000 ед/мг). Однако, при использовании IPTG урожай клеточной биомассы в два раза меньше, чем при использовании лактозы. Особо стоит отметить высокую активность ПНФазы в культуре, не подвергавшейся действию индуктора. Этот факт может свидетельствовать о том, что lac-оператор, кон- 122 тролирующий как экспрессию T7-РНК-полимеразы в клетках E. coli BL21:pD10, так и экспрессию самой ПНФазы не обеспечивает должную репрессию в отсутствие индуктора. Поскольку в нашем случае ПНФаза не является токсичной для клеток, то так называемая «фоновая экспрессия» не приводит к ингибированию роста культуры и гибели клеток. Мы предполагаем, что этот факт может быть использован в будущем для разработки метода экспрессии ПНФазы клетками-суперпродуцентами без использования дорогостоящего индуктора. Для качественного анализа белкового состава клеток, подвергшихся индукции синтеза ПНФазы с помощью лактозы и IPTG, лизаты клеток были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидному геле, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН). Результаты эксперимента изображены на рисунке 1. Из рисунка 1 видно, что при индукции экспрессии ПНФазы с помощью IPTG относительная доля целевого белка к остальным белкам гораздо выше, чем при индукции с помощью любых концентраций лактозы. По нашему мнению, это связано с высоким уровнем синтеза T7 РНК-полимеразы, которая не способна вести экспрессию клеточных белков. С этим же связан и более низкий рост клеточной биомассы после внесения IPTG. M 1 2 3 4 5 6 97,4 кДа 66 кДа 45 кДа 29 кДа Рисунок 1 – Анализ белкового состава клеток E. coli BL21:pD10 с плазмидой pET24b+, несущей вставку с геном ПНФазы при индукции экспрессии при помощи IPTG и лактозы М – маркерные белки с известными молекулярными массами, 1 – контрольный образец, в который не вводился индуктор; 2 – индукция 0,1% лактозой; 3 – индукция 0,2% лактозой; 4 – индукция 0,4% лактозой; 5 – индукция 0,8% лактозой. 123 Заключение. Таким образом, с использованием высокоточной Pfu-полимеразы проведена амплификация гена ПНФазы из геномной ДНК E. coli. Выделенный ген клонирован в плазмиду pET24b+. Получен новый генно-инженерный штамм E. coli BL21:PD10 – суперпродуцент ПНФазы. Показано, что продуцируемая штаммом E. coli BL21:PD10 ПНФаза представлена активным, водорастворимым белком. Продемонстрировано, что активность ПНФазы в 20 раз превышает таковую исходного штамма БМТ-4Д/1а, полученного ранее традиционными методами селекции. Показана возможность использования лактозы (вместо дорогостоящего IPTG) в качестве индуктора синтеза генно-инженерной ПНФазы. Работа выполнена в рамках ГППИ «Новые биотехнологии». Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Jensen, K.F. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Purifiсation and some properties / K.F Jensen, P. Nygaard // Eur. J. Biochem. – 1975. – Vol. 51. – P. 253–265. An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides / T.A. Krenitsky [et al] // Carbohydrate Res. – 1981. – Vol. 97. – P. 139–146. Utagawa, T. Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics / T. Utagawa // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. –1999. –Vol. 6, № 3. – P. 215–222. Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the pET/BL21(DES) system yields active recombinant enzymes / R.S. Esipov [et al] // Protein Expression and Purification. –2002. –Vol. 24. – P. 56–60. Synthesis of 2-chloro-2’-deoxyadenosine by microbiological transglycosylation / I.A. Mikhailopulo [et al.] // Nucleosides, Nucleotides. –1993. –Vol. 12, № 3–4. – P. 417–422. Барай, В.Н. Синтез модифицированных нуклеозидов нуклеозидфосфорилазами бактерий / В.Н. Барай // Весцi НАН Беларусi, сер. бiял. навук. – 2002. – № 2. – С. 112–118. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. Frittsch, T. Maniatis. – 2-nd ed.– New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 2222 p. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 259. – P. 680–685. Hoffman, B.J. Lactose fed-batch overexpression of recombinant metalloproteins in Escherichia coli BL21(DE3): process control yielding high levels of metal incorporated, soluble protein / B.J. Hoffman,. J.A. Broadwater, P. Johnson // Protein Expression and Purification. – 1995. – Vol. 6. – P. 646–654. Stationary phase protein overproduction is a fundamental capability of Escherichia coli / J. Ou [et al] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2004. – Vol. 314, № 1. – P. 174–180. 124 SUPERPRODUCTION OF ESCHERICHIA COLI PURINE NUCLEOSIDE PHOSPHORYLASE IN THE pET/BL21 SYSTEM KVACH S.V., SHAKHBAZAU A.V.1, ZINCHENKO A.I., KARTEL N.A.1 Laboratory of nucleic compounds biotechnology 1 Laboratory of molecular genetics, Institute of genetics and cytology, National academy of sciences of Belarus The gene encoded purine nucleoside phosphorylase (PNPase) has been isolated from Escherichia coli DNA by the polymerase chain reaction (PCR) method. The gene has been cloned in pET24b+ vector. A new strain named E. coli BL21:pD10 superproducing bacterial PNPase has been created. It was demonstrated that this recombinant strain produces PNPase in soluble form and in a high yield (the expressed PNPase was approximately 80% of the total cell proteins). The ability to induce the expression of recombinant E. coli PNPase using inexpensive lactose instead commonly used IPTG has been demonstrated. УДК 579.6: 579.842.11:577.15 СОЗДАНИЕ ШТАММА ESCHERICHIA COLI – СУПЕРПРОДУЦЕНТА АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗЫ Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И. лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы Выделен ген, отвечающий за синтез аденозиндезаминазы Escherichia coli. Амплифицированный с помощью ПЦР ген аденозиндезаминазы клонирован в составе вектора pET24b+. Создан генно-инженерный штамм, осуществляющий суперпродукцию целевого белка. Показано, что полученный генно-инженерный штамм, названный E. coli:pADD3 экспрессирует аденозиндезаминазу в растворимой форме. Изучена динамика накопления фермента в зависимости от времени индукции при использовании в качестве индуктора изопропил-βтиогалактопиранозида (IPTG). Показано, что максимальная аденозиндезаминазная активность клеток, суперпродуцирующих данный белок, наблюдается на 7-й час культивирования после индукции с помощью 1 мМ IPTG. Введение. Аденозиндезаминаза (ЕС 3.5.4.4) – фермент, играющий важную роль в метаболизме пуриновых нуклеозидов. Этот фермент осуществляет необратимую реакцию превращения аденозина в инозин путем отщепления NH2-группы от гетероциклического основания нуклеозида. Помимо своего основного субстрата – аденозина, аденозиндезаминаза E. coli может использовать ряд других природных и модифицированных нуклеозидов – 2′-дезоксиаденозин, 3′-дезоксиаденозин, 2′,3′-дидезоксиаденозин, 6-метил-2-аминопуринрибозид, 2,6-диаминопуринрибозид, аде- 125 нинарабинозид [1,2]. Способность фермента осуществлять дезаминирование модифицированных пуриновых нуклеозидов делает его привлекательным для использования в химикоферментативных схемах получения различных субстанций с потенциальной фармакологической активностью. Цель исследования – повышение уровня экспрессии аденозиндезаминазы E. сoli, катализирующей дезаминирование широкого ряда природных и модифицированных пуриновых нуклеозидов. Объекты и методы исследования. Объектом исследований служил коллекционный штамм E. coli БМТ-4Д/1а – донор гена, кодирующего аденозиндезаминазу, штамм E. coli BL21(DE3), использующийся для получения генно-инженерного суперпродуцента аденозиндезаминазы и штамм E. coli DH5α, служащий промежуточным хозяином для наработки и анализа рекомбинантного вектора. Культивирование всех штаммов проводилось при темпераo туре 37 С на стандартной среде LB (рН 7,2), содержащей: 10 г/л триптона, 10 г/л хлорида натрия и 5 г/л дрожжевого экстракта. Штаммы, содержащие плазмиды и векторы на их основе, культивировались на среде с добавлением канамицина в концентрации 50 мкг/мл. Клетки E. coli BL21(DE3), несущие плазмиду с геном аденозиндезаминазы, выращивали на LB-среде до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения IPTG до концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 24 часов. После добавления индуктора через равные промежутки времени отбирали по 1 мл культуры и определяли выход биомассы и аденозиндезаминазную активность клеток. Выделение геномной ДНК проводили с помощью фенолхлороформенного метода с дополнительной очисткой при помощи цетавлона [3]. В качестве исходного материала использовали клетки E. coli БМТ-4Д/1а, выращенные в течение 24 ч на LBсреде. Подбор праймеров для ПЦР проводили, используя данные о первичной структуре гена аденозиндезаминазы. На 5′-концах праймеров были встроены сайты рестрикции NdeI и BamHI, дополненные 6-ю и 2-мя произвольными нуклеотидами. Реакцию ПЦР проводили в буфере, содержащем 67 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 17 мМ (NH4)2SO4, 3 мМ MgCl2, 0,1% Твин-20, 0,12 мг/мл БСА, 8% глицерин с добавлением 0,02 мM каждого из четырех природных дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0,2 мкМ каждого из праймеров (GCCCGACATATGATTGATACCACCCTGCCA и CGGGATCCCG- 126 TTACTTCGCGGCGACTTTTTC), 150–200 нг тотальной ДНК E. coli БМT-4Д/1а и 1 ед. Taq-полимеразы. Амплификация выполнялась по программе: начальная денатурация (5 мин 94 оС), 25 циклов амплификации (30 с 94 оС + 30 с 61 оС + 1 мин 72 оС), заключительная элонгация (7 мин 72 оС). Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену аденозиндезаминазы, выделяли и лигировали в вектор pET24b+, также рестрицированный по NdeI и BamHI и обработанный щелочной фосфатазой. Электрофорез белков в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН), проводили по методу Лэммли [4] с использованием 3%-ого концентрирующего и 10%-го разделяющего гелей. Белковые препараты солюбилизировали добавлением буфера (в соотношении 1:1) следующего состава: 0,125 М Трис-НCl (рН=6,8); 4% ДСН; 20% глицерин; 0,2 М дитиотреитол. Для денатурации белков пробы кипятили в течение 5 мин. По окончании электрофореза белки окрашивали при помощи красителя Кумасси G-250. Активность аденозиндезаминазы определяли по скорости дезаминирования аденозина. Реакционную смесь, содержащую 50 мМ аденозин, 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0) и 0,004% клетки о (из расчета на сухую биомассу), инкубировали при 37 С в течение 15 мин. Из анализируемых образцов при помощи микрокапилляра отбирали аликвоты (5 мкл), которые наносили на хроматографические пластины для тонкослойной хроматографии Silufol-UV254. Хроматографию проводили в системе растворителей изопропанол–хлороформ–25%-аммиак (10:10:1; об/об). Расположение пятен субстратов и продуктов реакции определяли в УФ-свете. Вещества элюировали 5 мл воды. УФ-светопоглощение элюатов измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны λ=250 нм. Активность фермента определяли на начальной стадии реакции, когда выход продукта не превышал 10–15% от максимального. За единицу активности фермента принимали такое количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мл культуральной жидкости и ед/мг сухой биомассы клеток. Результаты и их обсуждение. Ген add, кодирующий аденозиндезаминазу E. сoli, был изолирован из геномной ДНК с использованием ПЦР и встроен в плазмиду pET24b+ (Novagen, США) под контролем Т7-промотора (сильного промотора 10-го гена капсида фага Т7). Полученной плазмидой трансформировали клетки E. coli BL21(DE3), предназначенные для экспрессии белка, находящегося под контролем T7-промотора. Полученный штамм 127 был назван E. coli:pADD3. На первом этапе провели выращивание штамма E. coli:pADD3 и индукцию синтеза аденозиндезаминазы согласно рекомендациям фирмы производителя. Клетки выращивали до оптической плотности 0,6, затем в среду вносили индуктор IPTG в концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 3-х часов. Для визуального контроля синтеза целевого белка проводили ДСН-полиакриламидный электрофорез белков, результаты которого представлены на рисунке 1. Из электрофореграммы видно, что через 3 ч индукции нарабатывается белок, составляющий большую часть общего растворимого клеточного белка. На следующем этапе работы изучена динамика накопления фермента от длительности индукции. Результаты представлены на рисунке 2. A М 50 кДа 40 кДа 30 кДа Рисунок 1 – Электрофореграмма белков клеток E. coli:pADD3 при индукции экспрессии при помощи IPTG. А – клетки, индуцированные 1 мМ IPTG в течение 3 ч; М – маркерные белки с известными молекулярными массами. Изучение характера роста клеток E. coli:pADD3 и накопления ими аденозиндезаминазы при индукции 1 мМ IPTG в динамике показало, что максимальный уровень накопления индуцируемого фермента (47,3 ед/мг) достигается через 7 ч после начала индукции (10 ч после начала культивирования). 128 X, мг/мл Е, ед/мг 2,5 50 2,0 40 1 2 1,5 30 1,0 20 0,5 10 0,0 0 0 5 10 15 20 25 30 Время, ч Рисунок 2 − Динамика накопления в среде биомассы (1;Х) и аденозиндезаминазы (2;Е) при индукции экспрессии белка в штамме E. coli:pADD3 При дальнейшем культивировании активность падает и к 24 ч составляет 40% от максимальной. Это, по нашему мнению, может быть связано с потерей клетками целевой плазмиды при истощении в среде антибиотика при длительном культивировании и, как следствие, размножение безплазмидных клеток, неспособных экспрессировать целевой белок. Таким образом, показано, что для достижения максимального выхода генно-инженерной аденозиндезаминазы индукцию целесообразно проводить с помощью 1 мМ IPTG в течение 7 ч. Заключение. Проведена амплификация гена аденозиндезаминазы из геномной ДНК E. coli. Выделенный ген клонирован в плазмиду pET24b+. Получен новый генно-инженерный штамм E. coli:pADD3 – суперпродуцент аденозиндезаминазы. Продуцируемая штаммом E. coli:pADD3 аденозиндезаминаза представлена активным водорастворимым белком. Изучена динамика накопления фермента при индукции экспрессии с помощью 1 мМ IPTG. Показано, что максимальный уровень продукции фермента (47,3 ед/мг) достигается к 7 ч индукции. Работа выполнена в рамках ГППИ «Новые биотехнологии». 129 Список литературы 1 2 3 4 Nygaard, P. Adenosine deaminase from Escherichia coli / P. Nygaard // Methods Enzymol. – 1978. – Vol. 51. – P. 508–512. Okuyama, K. Enzymatic Synthesis of 2`-deoxyguanosine with nucleoside deoxyribosyltransferase-II / K. Okuyama, S. Shibuya, T. Hamamoto, T. Noguchi // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2003. – Vol. 67, № 5. – P. 989–995. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. Frittsch, T. Maniatis. – 2-nd ed.– New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 2222 p. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 259. – P. 680–685. CREATION OF ESHERICHIA COLI STRAIN SUPERPRODUCING ADENOSINE DEAMINASE KVACH S.V., EROSHEVSKAYA L.A., ZINCHENKO A.I. Laboratory of nucleic compounds biotechnology The gene encoded adenosine deaminase has been isolated from Escherichia coli DNA by the polymerase chain reaction (PCR) method. The gene has been cloned in pET24b+ vector. A new strain named E. coli:pADD3 superproducing bacterial adenosine deaminase has been created. The strain obtained produces protein in a soluble form. The dynamic of adenosine deaminase accumulation during the induction with IPTG has been investigated. It was shown that the maximal level of adenosine deaminase production is obtained on 7-th hour after induction with 1 mM IPTG. УДК 579.6+577.15:577.113.3:579.842.11 КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ МНОГОКОПИЙНЫЕ CpG-МОТИВЫ Квач С.В., Казачкова Я.А.1, Зинченко А.И. лаборатория биотехнологии соединений нуклеиновой природы 1 УО «Международный государственный экологический университет им. А.Д. Сахарова» С целью конструирования плазмиды, содержащей иммуностимулирующие последовательности нуклеотидов, химически синтезированный CpG-мотив GTCGTT клонирован в клетках Escherichia coli DH5α в составе мультикопийной плазмиды pBluescript SK. Рестрикционный анализ показал наличие в составе полученной рекомбинантной плазмиды pBS:CpG2 восьми повторов клонированного CpG-мотива. Предполагается, что полученная плазмида может использоваться как адьювант для белковых и ДНК-вакцин, а также для терапии онкологических, инфекционных и аллергических заболеваний. 130 Введение. Сравнительно недавно раскрыт механизм, который используют человек и позвоночные животные для распознавания патогенов бактериальной и вирусной природы и защиты от них. Установлено, что ДНК прокариот (в отличие от ДНК высших организмов) содержит значительное количество не метилированных динуклеотидов CpG, которые распознаются специальными рецепторами на поверхности иммунных клеток и служат сигналом опасности [1–3]. К настоящему времени среди исследователей многих стран уже сложилось мнение, что природные и синтетические олигодезоксинуклеотиды, содержащие CpG-последовательности нуклеотидов (CpG-ОДН), обладают весьма значительным терапевтическим потенциалом [4–6]. Действительно, при введении CpG-ОДН в организм человека и животных они быстро мобилизуют все защитные факторы врожденного (неспецифического) иммунитета. Кроме того, они ускоряют формирование и повышают силу защитного ответа со стороны адаптивного раздела иммунитета, демонстрируя беспрецедентно мощную адьювантную активность. Имеются многочисленные экспериментальные данные, позволяющие рассматривать CpG-ОДН в качестве многообещающих средств для лечения аллергических заболеваний и астмы [7, 8]. В ведущих научных центрах Запада отмеченный феномен изучается чрезвычайно интенсивно, и ряд препаратов, созданных на основе CpG-ОДН, уже проходит клинические испытания [4, 9– 13]. В этой связи мы сочли целесообразным приступить к аналогичным исследованиям по созданию технологий получения иммуностимулирующих препаратов на основе CpG-ОДН для терапии и профилактики онкологических, инфекционных и аллергических заболеваний человека и животных. Одним из наиболее перспективных стратегических подходов к практическому использованию CpG-мотивов в иммунологии является встраивание этих нуклеотидных последовательностей в плазмиды с последующим введением таких векторных конструкций в организм человека или животных [14, 15]. Цель исследования – конструирование плазмиды, содержащей несколько копий CpG-мотива и пригодной для клонирования этой нуклеотидной последовательности в клетках Escherichia coli. Предполагается, что эта конструкция может использоваться как адьювант, а также для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекционных, онкологических и аллергических заболеваний. Объекты и методы исследования. Использованный в работе штамм бактерии E. coli DH5α получен из коллекции лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси. 131 Использованные реагенты. В работе использовали: набор реагентов для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля, набор для выделения плазмид из бактериальных клеток, рестрикционные эндонуклеазы, Т4-ДНК-лигазу, Т4-полинуклеотидкиназу, щелочную фосфатазу, агарозу, ацетилированный бычий сывороточный альбумин, буферные растворы для ДНК-лигазы и рестриктаз (“Promega”, США), плазмиду pBluescript KS (“Invitrogen”, США), ЭДТА, АТФ, полиэтиленгликоль марки “PEG6000”, бромистый этидий (“Serva”, Германия), β-меркаптоэтанол (“Sigma”, США), олигодезоксинуклеотиды («Синтол», Россия), маркеры размера молекул ДНК (“Fermentas” Литва). Агарозный и полиакриламидный гель-электрофорезы ДНК. Агарозный гель-электрофорез нуклеиновых кислот проводили в 0,7–2%-ном геле агарозы по методу, описанному в работе [16]. В случае электрофореза ДНК в полиакриламидном геле, использовали 8%-ный гель, приготовленный на TBE-буфере [16]. Предварительно пробы разводили (1:5) буфером следующего состава: 50% глицерин + 50 мМ ЭДТА (pH 8,0) + 0,125% бромфеноловый синий. Визуальное обнаружение нуклеиновых кислот осуществляли при помощи бромистого этидия в проходящем ультрафиолетовом свете. Получение двухцепочечного ОДН. Смесь одноцепочечных ОДН, содержащих прямые и обратные последовательности CpG-мотивов (по 0,5 нмоль в 125 мкл 20 мМ Трис-HCl-буфера, рН 7,5 + 10 мМ MgCl2 + 50 мМ NaCl), подвергли процедуре отжига, поместив ее на ночь в нагретый до 95 оС термос, а затем медленно охладив до 4 оС. Для фосфорилирования образовавшегося дуплекса в полученную смесь внесли АТФ до концентрации 10 мМ и 10 ед. Т4-полинуклеотидкиназы, после чего ее инкубировали 30 мин при 37 оС. Лигирование дуплекса провели по липким концам, соответствующим сайтам рестрикции HindIII. Реакционную смесь (30 мкл), состоящую из раствора фосфорилированного дуплекса (15 мкл) и 10 ед. ДНК-лигазы инкубировали 2 ч при 18 оC. После окончания реакции продукты лигирования осадили 13% полиэтиленгликолем и растворили в 30 мкл 10 мМ Трис-HCl-буфера (Рн=8,0). Рестрикция и дефосфорилирование плазмиды. Плазмиду pBlueskript SK (5 мкг) внесли в рестрикционную смесь (20 мкл), состоящую из ацетилированного бычьего альбумина (0,01 мг/мл) и 10 ед. рестриктазы HindIII. Реакционную смесь инкубировали при 37 оС. Спустя 1,5 ч добавляли щелочную фосфатазу (0,5 ед.) и продолжили инкубацию в течение 30 мин, после чего ферменты инактивировали прогреванием (20 мин, 65 оС). 132 Полученную плазмиду очистили с помощью электрофореза в 0,7%-ом агарозном геле, выделив ее из геля при помощи набора реагентов, согласно методике фирмы-изготовителя. Лигирование дуплекса в плазмиду проводили в реакционной смеси, содержащей раствор самолигированного дуплекса (0,5 мкл), раствор плазмиды pBlueskript KS в лигазном буфере (7 мкл) и 2,5 ед. T4-ДНК-лигазы. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 18 оС, после чего инактивировали лигазу нагреванием (15 мин при 65 оС). Полученную смесь использовали для трансформации E. coli DH5α. Клонирование ОДН с CpG-мотивами. Приготовление компетентных клеток Е. coli DH5α и их трансформацию проводили, согласно методике, описанной в работе [16]. Отобранные рекомбинантные клоны (9 колоний) выращивали в течение 24 ч на LB-среде следующего состава (г/л): бактотриптон – 10, дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 5. Для селекции клеток, несущих плазмиду, в среду вносили ампициллин до концентрации 100 мкг/мл. Культивирование проводили 24 ч при температуре 37 °С в колбе Эрленмейера, объемом 250 мл на биологической качалке с частотой колебания платформы 250 об/мин. Выделение и анализ плазмидной ДНК. Выделение плазмиды из бактериальных клеток проводили с помощью набора реактивов, согласно методике фирмы-изготовителя. Для проверки плазмиды на наличие вставки, содержащей CpG-мотивы, ее обрабатывали рестриктазами XhoI, XbaI и HindIII. Полученную в результате рестрикции смесь анализировали с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Определение первичной структуры ДНК проводили на генетическом анализаторе ABI Prism 310 (“Applied Biosystems”, США) с использованием набора реактивов для секвенирования «ABI PRISM BiqDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencin Kit» согласно рекомендациям фирмы-производителя. Результаты и их обсуждение. Известно, что CpG-мотивы, оптимальные для активации иммунитета человека и различных животных отличаются по своей первичной структуре. Для клонирования нами был выбран CpG-мотив № 2006, который, судя по литературным данным, вызывает отчетливый иммунный ответ в организме как человека, так и ряда млекопитающих [17, 18]. В качестве вектора была использована мультикопийная плазмида pBluescript KS, способная реплицироваться в E. coli в количестве 200–1000 копий на клетку. В работе были использованы химически синтезированные олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие четыре CpG-мотива, комплементарные друг другу. 133 Для облегчения процедуры клонирования в последовательности каждого ОДН на 5′-конце были добавлены нуклеотиды таким образом, чтобы при их отжиге образовались 5′-липкие концы, соответствующие рестриктазе HindIII (рисунок 1). Прямая последовательность 5'-AGCTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTA-3' + Обратная 3'-AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAAAACAGCAATTCGA-5' последовательность Отжиг HindIII AGCTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTA AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAAAACAGCAATTCGA HindIII Рисунок 1 – Схема процедуры получения двухцепочечного дуплекса, содержащего CpG-мотивы. Жирным шрифтом выделены CpGмотивы, подчеркнуты их комплементарные последовательности. Наклонным шрифтом обозначены сайты рестриктазы HindIII Таким образом, на первом этапе работы был получен ДНКдуплекс, размером 37 пар нуклеотидов (п.н.). На следующем этапе было проведено фосфорилирование 5′-концов дуплекса с использованием T4-полинуклеотидкиназы и лигирование его с HindIII-линеаризованной плазмидой pBluescript KS. В работе [14] показано, что эффективность иммунного ответа на введенную плазмиду зависит от количества содержащихся в плазмиде CpG-мотивов. Максимальный иммунный ответ был получен на плазмиду, содержащую 20 повторов CpG-мотива. Для увеличения числа CpG-мотивов в конструируемой плазмиде нами было проведено лигирование дуплексов друг с другом. Для этого в раствор полученного дуплекса добавляли ДНК-лигазу и смесь инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Результаты лигирования представлены на рисунке 2. Как видно из рисунка 2, уже через 30 мин после начала реакции лигирования образуется смесь продуктов, которая на электрофореграмме выявляется в виде своеобразной «лесенки» из нуклеиновых фрагментов разного размера. Для удаления мелких фрагментов и смены буфера смесь обработали полиэтиленгликолем “PEG-6000”, который, предпочтительно осаждает ДНК размером более 300 п.н. 134 1 2 3 4 5 300 п.н. 100 п.н. Рисунок 2 – Электрофореграмма лигирования дуплексов друг с другом в зависимости от времени инкубирования. 1 – маркеры размера молекул ДНК, 2 – исходный ДНК-дуплекс, 3–5 – дуплекс после лигирования в течение 0,5 ч, 1 ч и 2 ч, соответственно. Далее, осажденную полиэтиленгликолем смесь ОДН лигировали с линеаризованной плазмидой pBluescript KS и полученной лигазной смесью трансформировали клетки E. coli DH5α. Клетки-трансформанты, содержащие плазмиду, изолировали на агаризованной среде, содержащей ампициллин. Отобранные колонии (клоны) культивировали в LВ-среде с ампициллином, и из полученных клеточных биомасс выделяли плазмиды. В результате проведенной работы была отобрана плазмида pBS:CpG2. Для верификации структуры плазмиды ее обработали рестриктазами XhoI, XbaI и HindIII. Смесь рестриктов подвергли электрофорезу в полиакриламидном геле. На рисунке 3 представлена электрофореграмма рестрикционного анализа полученной и исходной плазмид. 135 1 2 3 4 200 п.н. 100 п.н. 80 п.н. Рисунок 3 – Электрофореграмма рестрикционного анализа плазмиды pBS:CpG2 1 – маркеры размера молекул ДНК; 2 – плазмидa pBS:CpG2, обработанная смесью рестриктаз XbaI и XhoI; 3 – плазмидa pBS:CpG2, обработанная смесью рестриктаз XbaI, XhoI и HindIII, 4 – плазмида pBluescript SK, обработанная смесью рестриктаз XbaI и XhoI. Видно, что при обработке контрольной плазмиды вырезается фрагмент меньше 80 п.н. Теоретически из этой плазмиды должен вырезаться фрагмент длинной 63 п.н. В результате рестрикции плазмиды pBS:CpG2 мы получили фрагмент величиной порядка 140 п.н. Этот фрагмент состоит из фрагмента контрольной плазмиды плюс лигированная вставка. Таким образом, размер полученной нами вставки составляет 140–63=77 п.н. Если учесть, что вставка, состоящий из двух лигированных друг с другом дуплексов, имеет размер ~ 70 п.н., то можно сделать вывод о том, что полученная нами плазмида несет вставку, содержащую двойной повтор полученного дуплекса и соответственно 8 повторов CpG-мотива. Это предположение подтвердилось при секвенировании вставки, которое выявило следующую ее первичную структуру: 5′-AAGCTTAACGACAAAACGACAAAACGACAAAACGACTAAGCTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTAAGCTT-3′. 136 В представленной последовательности жирным шрифтом выделены CpG-мотивы (GTCGTT) и их комплементарные участки (AACGAC). Подчеркнуты сайты узнавания рестриктазы HindIII. Из анализа этого участка следует, что четыре повтора CpG-мотива находятся в прямой цепи ДНК (GTCGTT), а 4 – в комплементарной (TTGCTG). Заключение. На основе мультикопийной плазмиды pBluescript SK сконструирован вектор для клонировании в клетках E. coli ОДН, содержащего 8 повторов иммуностимулирующего CpG-мотива GTCGTT. Судя по литературным данным, полученная плазмида может использоваться как адьювант для повышения эффективности белковых и ДНК-вакцин, а также для терапии и профилактики инфекционных, онкологических и аллергических заболеваний. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cells activation // A.M. Krieg [et al] Nature. – 1995. – Vol. 374. – P. 546–549. Krieg, A.M. CpG otifs in bacterial DNA and their immune effects / A.M. Krieg // Annu Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 20. – P. 709–760. Direct evidence that toll-like receptor 9 (TLR9) functionally binds plasmid DNA by specific cytosine-phosphate-guanine motif recognition / S. Cornelie [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 278. – P. 15124–15129. Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides / D.M. Klinman // Nat. Rev. Immunol. – 2004. – Vol. 4, № 4. – P. 249–258. Иммуностимулирующая CpG-ДНК: акпспективы клинического применения в онкологии / С.В. Олишевский [и др.] // Онкология. – 2006. –Т. 8. – С. 209–217. Encapsulation in liposomal nanoparticles enchances the immunostimulatory, adjuvant and anti-tumor activity of subcutaneously administered CpG ODN / S. de Jong [et al] // Cancer Immunol. Immunother. – 2007. – Vol. 56. – P. 1251–1264. Horner, A.A. Immunostimulatory sequence oligodeoxynucleotide-based vaccination and immunomodulation: two unique but complementary strategies for the treatment of allergic diseases / A.A. Horner, E. Raz // J. Allergy. Clin. Immunol. –2002. – Vol. 110. – P. 706–712. Hayashi, T. TLR9-based immunotherapy for allergic disease / T. Hayashi, E. Raz // Am. J. Med. – 2006. – Vol. 119, № 10. – Р. 897.e1–897.e7. A phase I study of the safety and immunogenicity of recombinant hepatitis B surface antigen co-administered with an immunostimulatory phosphorothioate oligonucleotide adjuvant / S.A. Halperin [et al] Vaccine. – 2003. – Vol. 21. – P. 2461–2467. Safety and immunogenicity of CpG 7909 injection as an adjuvant to Fluarix influenza vaccine / C.L. Cooper [et al.] // Vaccine. – 2004. – Vol. 22. – P. 3136–3143. Superior activity of the type C class of ISS in vitro and in vivo across multiple species / J.D. Marshall [et al.] // DNA Cell. Biol. – 2005. – Vol. 24, № 1. – P. 63–72. Combination immunotherapy with a CpG oligonucleotide (1018 ISS) and rituximab in patients with non-Hodgkin lymphoma: increased interferon-/ -inducible gene expression, without significant toxicity / J.W. Friedberg [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 105, № 2. – P. 489–495. 137 13 14 15 16 17 18 Phase II trial of a Toll-like receptor 9-activating oligonucleotide in patients with metastatic melanoma / M. Pashenkov [et al] // J. Clin. Oncol. – 2006. – Vol. 24, № 36. – Р. 5716-5724. Adjuvant effect of multi-CpG motifs on an HIV-1 DNA vaccine / Y. Kojima [et al] // Vaccine. – 2002. – Vol. 20. – P. 2857–2865. CpG-Modified plasmid DNA encoding flagellin improves immunogenicity and provides protection against Burkhoderia pseudomallei infection in BALB/c mice / Y.S. Chen [et al] // Infect. Immun. – 2006. – Vol. 74, № 3. – P. 1699–1705. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual.– 2-nd ed. / J. Sambrook, E. Frittsch, T. Maniatis – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.– 2222 p. Krieg, A.M. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts / A.M. Krieg // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 831–835. Krieg, A.M. Antitumor applications of stimulating Toll-like receptor 9 with CpG oligodeoxynucleotides / A.M. Krieg // Curr. Oncol. Rep. – 2004. – Vol. 6, № 2. – P. 88–95. CONSTRUCTION OF A RECOMBINANT PLASMID CONTAINING MULTICOPY CPG MOTIFS KVACH S.V., KAZACHKOVA Ya.A.1, ZINCHENKO A.I. Laboratory of nucleic compounds biotechnology 1 International Sakharov environmental university Bacterial DNA and synthetic olygodeoxynucleotides containing unmethylated CpG dinucleotides (CpG motifs) have been shown to induce potential immune responses. In this study chemically synthesized CpG motif GTCGTT was cloned in Escherichia coli DH5α into a Bluescript SK-derived plasmid. According to restriction enzyme digestion the plasmid contains 8 copies of CpG motif. It is suggested that plasmid obtained may be used to improve protein and DNA vaccines and treat cancer, infectious and allergic diseases. УДК 579.2+601.4:577.21 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ В ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ПРОКАРИОТАХ Сапунова Л.И., Шляхотко Е.А. лаборатория ферментов Приводится обзор данных литературы, касающихся конструирования молекулярных векторов для клонирования в грамположительных бактериях генов, ответственных за синтез микробных метаболитов. Анализируются методы введения генетического материала в клетки указанной группы микроорганизмов, стабильность наследования гибридных генетических элементов и эффективность их экспрессии в гомо- и гетерокариотических микроорганизмах. Рассматривается возможность использования челночных векторов, сконструированных для манипуляций со штаммами Corynebacterium glutamicum, Streptomyces lividans, Brevibacterium linens, Brevibacterium lactofermentum, для трансформации актинобактерий 138 рода Arthrobacter. Обсуждаются перспективы использования векторов, предназначенных для клонирования в клетках грамположительных эукариот, при генноинженерном конструировании новых высокопродуктивных штаммов – продуцентов коммерчески востребованных продуктов. Введение. Технология рекомбинантных ДНК, или генная инженерия – направление исследований в молекулярной биологии и генетике, целью которой является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит возможность целенаправленного манипулирования фрагментами нуклеиновых кислот, которая обусловлена последними достижениями в области молекулярной биологии и генетики. Это касается, прежде всего, установления универсальности генетического кода и успехов генетической энзимологии. Первое подразумевает, что включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу всех живых организмов кодируется одними и теми же последовательностями нуклеотидов. Второе предоставляет в распоряжение исследователей набор ферментов (рестриктаз, ДНК-полимераз, ревертаз, лигаз), позволяющих изолировать отдельные гены или фрагменты нуклеиновых кислот, реализовать in vitro их синтез и объединение в различных комбинациях. В результате изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введению его в реципиентный организм, а также созданию условий для стабильного функционирования и наследования генетических конструкций. Несомненно, что на современном этапе развития науки именно технологии рекомбинантных ДНК будут способствовать разработке наукоемких высокорентабельных биотехнологических процессов получения различных веществ, остро востребованных в медицине, промышленности и сельском хозяйстве [1]. В настоящее время большинство векторов для клонирования и экспрессии генов, а также методик введения чужеродного генетического материала разработано для манипуляций с грамотрицательными микроорганизмами, в частности, с различными штаммами бактерий Escherichia coli и не предназначено для трансформации грамположительных организмов. Поэтому очевидно, что создание универсальных векторов и методик их клонирования в клетках грамположительных прокариот обеспечит необходимую методическую базу для генно-инженерного конструирования новых высокоэффективных штаммов-продуцентов 139 социально значимых продуктов на основе представителей указанной группы микроорганизмов. Целью проведенной работы явился анализ опубликованных в литературе данных, касающихся конструирования молекулярных векторов и методов их введения в компетентные клетки, а также стабильности наследования гибридных генетических элементов и эффективности их экспрессии в гомо- и гетерокариотических грамположительных микроорганизмах. Основная часть. В природе грамположительные бактерии, благодаря высокой метаболической активности, занимают разнообразные экологические ниши. Среди них встречаются патогены растений и животных, а также почвенные сапрофиты, которые широко эксплуатируются в микробиологических производствах. Для улучшения промышленных культур и создания новых штаммов-суперпродуцентов необходимы эффективные конструкции для клонирования генов и их экспрессии, а также методики манипулирования генетическим материалом. В настоящее время таких векторов для грамположительных бактерий существует ограниченное количество, что связано с недостаточной изученностью представителей этой систематической группы микроорганизмов. Одним из объектов интенсивных генетических исследований являются представители рода Streptomyces. Проанализировав морфологические и физиолого-биохимические особенности различных видов рода Streptomyces, Hopwood D. с сотрудниками (1983) пришли к выводу, что штамм Streptomyces lividans 66 является наиболее подходящим для генно-инженерных манипуляций [2]. При создании конструкции для клонирования генов были использованы плазмиды SLP2 и SLP3 из природного штамма Streptomyces lividans 66 и плазмиды группы SLP1.1 из Streptomyces coelicolor A3(2). Для клонирования генов в Streptomyces lividans 66 были сконструированы также векторы pIJ702-pIJ705, несущие ген тирозина в различных ориентациях [3]. Вектор pIJ702 содержит селективный маркер устойчивости к антибиотику тиострептону, а также ген тирозина, по которому ведут селекцию. Экспрессия этого гена приводит к продукции тирозина, который является предшественником меланина. Колонии клеток, которые содержат активный ген тирозина, имеют темно-коричневую или черную окраску. Ген содержит три сайта рестрикции – BglII, SphI, SstI, по которым встраивают чужеродную ДНК. Отбор трансформантов осуществляют по устойчивости к антибиотику тиострептону и по цвету образовавшихся колоний – белые колонии содержат вставочный фрагмент чужеродной ДНК в составе вектора pIJ702, в отличие от колоний клеток, имеющих коричневый и черный цвет. 140 Использование указанных, а также других генетических конструкций для клонирования генетического материала в штаммах различных видов рода Streptomyces стало возможным благодаря межродовой экспрессии генов у актиномицетов [4–12]. Детальный анализ достижений в области генетики и генной инженерии названной группы микроорганизмов представлен в обзоре английского ученого D.Hopwood [13]. Поиск плазмид и конструирование векторов для клонирования в бактериях рода Corynebacterium осуществил M.Yoshihama с сотрудниками [14]. Было обнаружено, что только 7 из 14 исследованных штаммов Corynebacterium содержат по четыре криптические плазмиды, размер которых составлял 3,0; 5,2; 15 и 25 т.п.н. Для конструирования челночного вектора, реплицирующегося в Bacillus subtilis и Corynebacterium glutamicum, исследователи использовали выделенную из Corynebacterium glutamicum ATCC 19223 плазмиду pSP1 массой 3,0 т.п.н. и вектор pWS101 размером 4,4 т.п.н., изолированный из Bacillus lactofermentum ATCC 13869. После рестрикции обеих плазмид ферментом BclI, их совместного лигирования и трансформации бактерий Bacillus subtilis 1A46 были отобраны два рекомбинантных штамма, несущих гибридную плазмиду pHY416 молекулярной массой 9,3 т.п.н. Кроме того, авторами была разработана эффективная методика трансформации векторными молекулами протопластов Corynebacterium glutamicum. С целью расширения спектра утилизируемых субстратов, включая ксилозу, проведена трансформация штамма Corynebacterium glutamicum R с использованием мультикопийного челночного вектора pCRA1, полученного из pHSG298 и pBL1 и предназначенного для клонирования в бактериях Escherichia coli и Corynebacterium sp. [15]. Сконструированы три рекомбинантных штамма, которые содержали в различных комбинациях гены ксилозоизомеразы и ксилулокиназы из Escherichia coli и ген ксилулокиназы из Corynebacterium glutamicum R. Благодаря высокой эффективности выражения генов под контролем конститутивного trcпромотора плазмиды pTrc99A рекомбинантный штамм Corynebacterium glutamicum CRX2 оказался способным утилизировать ксилозу и при этом преимущественно продуцировать молочную и янтарную кислоты. Более того, клетки указанного трансформанта утилизировали смесь ксилозы и глюкозы, не обнаруживая обычной в таких случаях диауксии роста. В 1987 году вектор pIJ702 был использован A.Roberts с сотрудниками для трансформации бактерий рода Arthrobacter [16]. В результате было получено семь колоний трансформантов Arthrobacter sp. NRRLB3381, которые характеризовались устойчи- 141 востью к тиострептону в концентрации 25 мкг/мл и автономно наследовали плазмиду pIJ702. При отсутствии селективных условий плазмида pIJ702 стабильно наследовалась клетками бактерий в течение семи генераций. Таким образом, авторы разработки доказали возможность использования вектора pIJ702, первоначально предназначенного для трансформации актиномицетов рода Streptomyces, также для модификации бактерий рода Arthrobacter и экспрессии в них клонированных генов. Для клонирования генов в составе вектора pIJ702 в актиномицетах рода Streptomyces исследователям, однако, пришлось модифицировать методику, разработанную D.Hopwood с коллегами [2]. Так, были использованы более высокие концентрации лизоцима и полиэтиленгликоля 1000, а также была увеличена продолжительность инкубации микробных клеток, что позволило повысить выход осмотически чувствительных протопластов и увеличить частоту трансформации [16]. Эффективность трансформации продуцирующих антибиотики нанаомицин и калафунгин актиномицетов Streptomyces rosa subsp. notoensis KA301 и Streptomyces tanashiensis Kala однокопийной плазмидой, предназначенной для репликации в Streptomyces lividans TK24, также существенно повышалась в случае 0 прогревания протопластов при 42 С в течение 15 мин [9]. В литературе имеются данные об эффективной экспрессии в клетках Arthrobacter sp. челночных векторов, созданных на основе криптических плазмид, наследуемых бактериями рода Brevibacterium. В 1988 году P.Shaw и B.Hartley разработали действенную систему клонирования генов в бактериях Arthrobacter sp. [17]. В качестве модельного объекта они использовали штамм Arthrobacter sp. NRRL B3728, являющийся промышленным продуцентом ксилозоизомеразы. Авторы сконструировали три гибридных вектора – pBL2100, pCG1100, pCG100, состоящих из плазмиды pBR322, наследуемой Escherichia coli, гена устойчивости к канамицину из плазмиды pNCAT4, а также криптических плазмид из Brevibacterium lactofermentum NCIB 9567 или Corynebacterium glu5 tamicum NCIP 10026. Частота трансформации достигала 10 – 6 10 клеток/мкг ДНК, число копий плазмид pBL2100 на клетку – 5, плазмид pCG1100 и pCG100 – 33. Сконструированные векторы были структурно стабильны в клетках Arthrobacter sp. NRRL B3728, однако в неселективных условиях скорость сегрегации плазмид варьировала в пределах 2,2–12,2%. Впоследствии T.Loviny-Anderton с сотрудниками использовали вектор pCG2100 для клонирования гена xylA в клетках Arthrobacter sp. (xyl-), что обусловило появление у рекомбинант- 142 ного штамма способности к росту на минимальной среде с ксилозой в качестве единственного источника углерода [18]. Для клонирования генов в клетках Arthrobacter sp. также сконструирован челночный вектор pULRS8, содержащий ген устойчивости к канамицину. Введение этого вектора, включающего репликоны бактерий Brevibacterium lactofermentum и Escherichia coli, в компетентные клетки осуществляли путем электропорации. В составе сконструированного вектора ген липазы был клонирован в бактериях Arthrobacter sp. MIS38 [19]. Для экспрессии в клетках грамотрицательных бактерий Escherichia coli и грамположительных бактерий Brevibacterium linens был создан челночный вектор на основе криптической плазмиды pBLA8, выделенной из Brevibacterium linens [20]. Указанная плазмида кодировала последовательности двух белков – RepA и RepB, необходимых для репликации, и, как было установлено на основании структурного сходства, принадлежала к новому подсемейству семейства СolE2, реплицирующегося по θ-типу. Сконструированный челночный вектор pA2203 включал в себя репликон плазмиды pBLA8, вектор pBluescript II SK+ из Escherichia coli и фенотипический маркер устойчивости к канамицину. Методом электропорации гибридной плазмидой были трансформированы штаммы Corynebacterium glutamicum и штаммы некоторых видов рода Arthrobacter. В результате проведенных исследований канамицинустойчивые трансформанты Corynebacterium glutamicum получить не удалось. Рекомбинантные же бактерии рода Arthrobacter стабильно наследовали плазмиду pA2203 [20]. Возможность экспрессии генетических элементов в гетерологичных микроорганизмах подтверждает межродовая экспрессия генов под контролем собственных промоторов. Так, A.Roberts с коллегами показали, что ген ermA Arthrobacter sp. успешно экспрессировался в Streptomyces lividans под контролем собственного промотора. Об этом свидетельствовали устойчивость к эритромицину и тиострептону рекомбинантного штамма, трансформированного вектором pIJ702ermA, а также приобретенная им способность к синтезу меланина [16]. S. Kubo с сотрудниками получил доказательство того, что ген декстраназы бактерий Arthrobacter sp. в составе челночного вектора pMNK-4 экспрессировался в Streptococcus gordonii. Созданный ими рекомбинантный штамм продуцировал не свойственный ему белок, проявляющий декстраназную активность [21]. Актиномицет Streptomyces lividans продуцировал 3-кетостероид-дельта-1-дегидрогеназу, кодируемую геном ksdD, локализованным на челночном векторе Arthrobacter simplex [22]. Гибридная плазмида состояла из векторов pIJ702 (Streptomyces lividans) 143 и pUC19 (Escherichia coli), а также гена ksdD, клонированного под контролем собственного промотора. Уровень продукции рекомбинантным штаммом фермента, до 55% которого секретировалось в среду культивирования, в 100 раз превышал уровень продукции ферментного белка исходным штаммом Arthrobacter simplex. Получение рекомбинантных штаммов микроорганизмов осуществляют различными методами, включая трансформацию протопластов чужеродной ДНК, электропорацию, конъюгативный перенос вектора между различными бактериями. Наиболее трудоемким является метод трансформации протопластов, что обусловлено длительностью периода их реактивации, занимающего, как правило, семь суток. Метод электропорации компетентных клеток эффективен так же, как и метод трансформации протопластов, однако более прост и удобен в исполнении. Конъюгативный перенос является естественным путем передачи генетического материала между клетками бактерий. В лабораторных условиях его обычно осуществляют между близкородственными видами и родами микроорганизмов [12, 23], однако известны случаи конъюгативной передачи генетических конструкций между штаммами грамотрицательных бактерий Escherichia coli и различными видами грамположительных микроорганизмов. Для реализации такого переноса плазмида должна содержать репликоны Escherichia coli и грамположительных микроорганизмов и, кроме того, нуклеотидную последовательность oriT и traгенов. Известны примеры конъюгативного переноса плазмидной ДНК между клетками прокариотических и эукариотических организмов. Например, плазмидная ДНК из бактерий Agrobacterium sp. передавалась в клетки растений табака [24]. Наблюдали также перенос челночного вектора из Escherichia coli в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae [25, 26]. В 1991 году E.Gormley и J.Davies опубликовали результаты исследований по конъюгативному переносу плазмиды широкого круга хозяев pRSF1010 из Escherichia coli в штаммы Streptomyces lividans и Mycobacterium smegmatis [27]. Конъюгаты возникали с разной частотой, причем частота их образования у бактерий Mycobacterium smegmatis, устойчивых к стрептомицину и сульфонамиду, была на четыре порядка выше, чем у Streptomyces lividans, -2 и составляла 10 . Методом конъюгативного переноса плазмидных ДНК были получены рекомбинантные штаммы различных видов актиномицетов. Так, плазмиды pTO1, pPM803, pVGTB24 из штамма-донора Escherichia coli S 17-1 передавались в клетки различных представителей систематического порядка Actinomycetales [28]. Перенос интегративной плазмиды pTO1 был осуществлен в штаммы бак- 144 терий, принадлежащих различным видам родов Actinomadura, Arthrobacter, Kitasatoa, Micromonospora, Nocardia, Rhodococcus и Saccharopolyspora, а также в 16 штаммов, представленных видами рода Streptomyces. Частота образования содержащих плазмиду конъюгатов составляла 10-3–10-7. С помощью метода гибридизации было показано, что у реципиентных штаммов плазмида pTO1 находится в интегрированном в хромосому состоянии. Автономные плазмиды pPM803 и pVGTB24 наследуются с низкой частотой даже в селективных условиях, тогда как эффективность наследования интегративной плазмиды достигала 80–100%. Заключение. Анализ представленных в литературе немногочисленных данных показал, что из грамположительных прокариот наиболее часто в качестве реципиентов при клонировании генов используются представители родов Corynebacterium и Streptomyces. Созданные для работ с этими организмами векторы и методики генетических манипуляций иногда шаблонно применяются для трансформации других грамположительных прокариот. Однако эффективность применения таких векторных молекул, содержащих клонированные гены, как правило, невысока вследствие их элиминации в реципиентных клетках. Широкие возможности для создания универсальных молекулярных векторов ожидаются от результатов исследования закономерностей межродового конъюгативного переноса генетического материала. Создание универсальных векторов, обеспечивающих перенос генов и их высокоэффективную экспрессию в гомо- и гетерокариотических организмах, а также методик клонирования обеспечит необходимую методическую базу для конструирования оригинальных естественных биореакторов по производству коммерчески востребованных продуктов. По прогнозам, в XXI в. продукты, полученные с использованием рекомбинантных организмов, составят не менее 20% всех товаров, поступающих на мировой рынок. В целом же индустриальная биотехнология, использующая самые современные достижения технологий рекомбинантных ДНК и других методов генной инженерии, призвана решать такие встающие перед человечеством в третьем тысячелетии глобальные проблемы как сохранение окружающей среды, охрана здоровья, преодоление энергетического кризиса и дефицита пищевого и кормового белка, получение новых продуктов питания. 145 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-organisms / A. Kern [et al] // J. Biotechnol. – 2007. – Vol. 129. – P. 6–29. Plasmids, recombination and chromosome mapping in Streptomyces lividans 66 / D. Hopwood [et al] // J. Gen. Microbiol. – 1983. – Vol. 129. – P. 2257–2269. Cloning and expression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans / E. Katz [et al] // J. Gen. Microbiol. – 1983. – Vol. 129. – P. 2703–2714. Molecular cloning and expression of the phenoxazinone synthase gene from Streptomyces antibioticus / G.H. Jones [et al] // J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259, № 22. – P. 1415–14157. Activation of phenoxazinone synthase expression in Streptomyces lividans by cloned DNA sequences from Streptomyces antibioticus / G.H. Jones [et al] // J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259, № 22. – P. 14158–14164. Clonong and expression of the genetically unstable tyrosinase structural gene from Streptomyces glaucescens / G. Hintermann [et al] // Mol. Gen. Genet. – 1985. – Vol. 200, № 3. – P. 422–432. Properties of in vitro recombinant derivatives of pJV1, a multi-copy plasmid from Streptomyces phaeochromogenes / C.R. Bailey [еt al] // J. Gen. Microbiol. – 1986. – Vol. 132, № 8. – P. 2071–2078. Plasmid pIJ699, a multi-copy positive-selection vector for Streptomyces / T. Kieser [et al] // Gene. – 1988. – Vol. 65, № 1. – P. 83-91. Isolation of restriction-reduced mutants from Streptomyces / S. Kakinuma [еt al] // Agric. Biol. Chem. – 1990. –Vol. 54, № 10. – P. 2611–2617. Cloning and expression of a lignin peroxidase gene from Streptomyces viridosporus in Streptomyces lividans / Z.M. Wang [еt al] // J. Biotechnol. – 1990. – Vol. 13, № 2–3. – P. 131–144. Activation of phenoxazinone synthase expression in Streptomyces lividans: characrerization of the activator fragment from Streptomyces antibioticus / F.S. Fawaz [et al] // Microbiol. – 1994. – Vol. 140, № 5. – P. 1051–1058. Hu, Z. Directed transfer of large DNA fragments between Streptomyces species / Z. Hu, D.A. Hopwood, C. Khosla // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 5. – P. 2274–2277. Hopwood, D.A. Forty years of genetics with Streptomyces: from in vivo through in vitro to in silico / D.A. Hopwood // Microbiol. – 1999. – Vol. 145. – P. 2183–2202. Cloning vector system for Corynebacterium glutamicum / M. Yoshihama [еt al] // J. Bacteriol. – 1985. – Vol. 163, № 2. – P. 591–597. Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum / H. Kawaguchi [еt al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – Vol. 72, № 5. – P. 3418–3428. Transformation of Arthrobacter and studies on the transcription of the Arthrobacter ermA gene in Streptomyces lividans and Escherichia coli / A.N. Roberts [et al] // Biochem. J. – 1987. – Vol. 243. – P. 431–436. A host-vector system for an Arthrobacter species / P.C. Shaw [et al] // J. Gen. Microbiol. – 1988. – Vol. 134, № 4. – P. 903–911. D-xylose (D-glucose) isomerase from Arthrobacter strain N.R.R.L. B3728 / T. Loviny-Anderton [еt al] // Biochem J. – 1991. – Vol. 277. – P. 263–271. Construction of new host-vector system in Arthrobacter sp. and cloning of the lipase gene / M. Morikawa [еt al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1994. – Vol. 42. – P. 300–303. pBLA8 from Brevibacterium linens belongs to a gram-positive subfamily of ColE2related plasmids / V. Leret [еt al] // Microbiol. – 1998. – Vol. 144. – P. 2827–2836. 146 21 22 23 24 25 26 27 28 Expression and secretion of an Arthrobacter dextranase in the oral bacterium Streptococcus gordonii / S. Kubo [еt al] // Infect. Immunity. – 1993. – Vol. 61, № 10. – P. 4375–4381. Secretory overproduction of Arthrobacter simplex 3-ketosteroid delta 1-dehydrogenase by Streptomyces lividans with a multicopy shuttle vector / K.P. Choi [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1995. – Vol. 46. – P. 1044 –1049. High-frequency homologous plasmid-plasmid recombination coupled with conjugation of plasmid SCP2* in Streptomyces / J. Xiao [et al] // Mol. Microbiol. – 1994. – Vol. 14, № 3. – P. 547-555. Plasmid transfer by conjugation from Escherichia coli to gram positive bacteria / P. Trieu-Cuot [еt al] // FEMS Microbiol. Lett. – 1987. – Vol. 48. – P. 289–294. The mob and oriT mobilization functions of bacterial plasmid promote its transfer to plants / V. Buchanan-Wollaston [et al] // Nature. – 1987. – Vol. 328. – P. 172–175. Bacterial conjugative plasmids mobilize DNA transfer between bacteria and yeast / J. Heinemann [et al] // Nature. – 1989. – Vol. 340. – P. 205–209. Gormley, E.P. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium stegmatis / E.P. Gormley, J. Devies // J. Bacteriol.– 1991. – Vol. 173, № 21. – P. 6705–6708. Воейкова, Т.А. Конъюгативный перенос плазмид из Escherichia coli в различные штаммы порядка Actinomycetales / Т.А. Воейкова // Генетика. – 1999. – T. 35, № 12. – C. 1626–1633. MOLECULAR VECTORS FOR GENE CLONING IN GRAM-POSITIVE PROKARYOTES SAPUNOVA L.I., SHLYAKHOTKA E.A. Laboratory of enzymes Literature review of data related to engineering of molecular vectors for cloning of genes responsible for synthesis of microbial metabolites in gram-positive bacteria is presented. Methods of inserting genetic material into competent cells of aforementioned microbial group, stability of inheritance of hybrid genetic elements and efficiency of their expression in homo- and heterocaryotic microorganisms are analyzed. Possibility of using shuttle vectors initially designed for manipulations with strains Corynebacterium glutamicum, Streptomyces lividans, Brevibacterium linens, Brevibacterium lactofermentum in transformation of actinobacteria of Arthrobacter genus is considered. Prospects of applying vectors intended for cloning in cells of gram-positive eukaryotes during gene engineering of novel highly efficient strains-producers of commercially valuable products are discussed. 147 МИКРОБНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УДК 579.6:663.1 УПРАВЛЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ ПРОЦЕССАМИ И ИХ КОММЕРЦИАЛИЗАЦИЯ Романова Л.В., Кузьмина О.Н., Орлова Л.А., Михеева Л.Д., Гладкий Н.Ф., Ерош А.Ю. Биотехнологический центр Исследования, проводимые в биотехнологическом центре, охватывают широкий круг проблем, координированное решение которых в дальнейшем позволит создать надежную систему коммерциализации объектов интеллектуальной собственности Института микробиологии НАН Беларуси. Основной задачей биотехнологии является разработка новых и усовершенствование известных биотехнологических процессов на основе управляемого культивирования микроорганизмов. Управление микробным синтезом позволяет снизить издержки и уменьшить экономические риски микробиологического производства. Это возможно за счет сокращения длительности технологических процессов, оптимизации состава питательных сред и условий культивирования, увеличения выхода целевых продуктов, обеспечения стабильности получаемых биопрепаратов, что облегчает стандартизацию конечного продукта. Разработка биотехнологий включает ряд важных этапов: скрининг штаммов-продуцентов с заданными свойствами, изучение закономерностей их роста и биосинтетической активности в зависимости от температурного режима, условий аэрации, динамики изменения рН, соотношения компонентов питательной среды, количество вносимого посевного материала и т.д. Оптимально подобранные физико-химические условия культивирования позволяют достигнуть высокого уровня жизнеспособности и биологической активности клеток микроорганизмов, входящих в состав препаратов, и получать конечный продукт заданного свойства. Критерии управления технологическим процессом различны и зависят от физиолого-биохимических особенностей штаммов микроорганизмов. Новизна разрабатываемых и усовершенствование известных технологий заключается в использовании специально отобранных штаммов-продуцентов биологически ак- 148 тивных веществ и оригинальности предлагаемых технологических решений, обеспечивающих безотходность и рентабельность микробиологического производства, а также высокое качество препаратов, что является условием повышения эффективности научно-технической и инновационной деятельности Института микробиологии НАН Беларуси и коммерциализации разработок, имеющих приоритетное народнохозяйственное значение. Эти задачи решаются Биотехнологическим центром – промежуточным звеном между исследовательскими лабораториями и производством. Основным направлением деятельности центра является разработка и освоение новых биотехнологий, организация малотоннажного производства микробных препаратов различного назначения (биоудобрений, биологических средств защиты растений, дезинфектантов, биоконсервантов, пробиотиков, ферментных препаратов, биологически активных добавок и др.), маркетинговая и рекламно-коммерческая деятельность по производству и реализации микробных препаратов, научно-консультативное обеспечение работ при организации промышленного производства микробных препаратов [1]. В качестве объектов исследований используются микроорганизмы различных таксономических групп (высшие грибы, мицелиальные грибы, бактерии, дрожжи) – продуценты биологически активных веществ и технологии их получения. Известно, что активным началом микробиологических препаратов могут быть как живые клетки штаммов-продуцентов, так и отдельные их метаболиты. Примером последних являются ферменты. Глубинный способ культивирования продуцентов ферментов имеет ряд преимуществ перед поверхностным, однако требует более высокой культуры производства. Контроль процесса приготовления питательной среды, её стерилизации, очистки воздуха, подаваемого на аэрацию, процесса культивирования и т.д. должен проводиться более тщательно и чаще, чем при поверхностном культивировании. Одним из практически значимых ферментов является глюкозооксидаза, которая используется в химической, пищевой промышленности, медицине [4, 5]. В медицине глюкозооксидаза применяется в клинической диагностике для определения уровня глюкозы в крови и в других физиологических жидкостях. Биотехнологическим центром совместно с лабораторией ферментов изучалось влияние условий глубинного культивирования, качества и количества посевного материала на биосинтетическую активность мицелиального гриба Penicillium adametzii – продуцента глюкозооксидазы. Культивирование проводилось в 149 глубинных условиях (в ферментерах АК-3) с использованием синтетической питательной среды. Наряду с оптимизацией физикохимических условий ферментации, особое внимание уделялось выделению и очистке фермента. В ряду перспективных продуцентов для создания микробных препаратов различного назначения особое место занимают представители рода Bacillus. Спорообразующие бактерии отличаются широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных агентов человека, животных и растений, так как обладают способностью продуцировать низкомолекулярные антибиотики, ферменты, бактериоцины и другие метаболиты, обладающие антагонистическим и энтомопатогенным действием [6–10]. Бактерии рода Bacillus также технологичны, так как характеризуются высокой скоростью роста в достаточно широком диапазоне физико-химических факторов (температура, аэрация, состав питательных сред, рН и др.). Биотехнологическим центром совместно с лабораторией средств биологического контроля изучались особенности развития спорообразующих бактерий – агентов биологического контроля широкого спектра возбудителей болезней и вредителей сельскохозяйственных растений в глубинных условиях, обеспечивающих высокую антагонистическую и энтомоцидную активность, а также интенсивное спорообразование. Спорообразование зависит от продолжительности, других условий культивирования и состава питательных сред. При разработке технологий изготовления новых биопрепаратов на основе спорообразующих бактерий основными технологическими параметрами, требующими оптимизации, являлись интенсивность аэрации, температура и состав питательной среды [11–16]. Лабораторией взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений и Биотехнологическим центром ведутся многоплановые исследования в области направленного культивирования азотфиксирующих и фосфатмобилизующих почвенных микроорганизмов, изучаются условия совместного выращивания клубеньковых и фосфатмобилизующих бактерий. Благодаря проведенным исследованиям установлена возможность выращивания в аппаратах промышленного типа двухкомпонентной смеси композитов и установлено их оптимальное соотношение. Это позволило оптимизировать технологию получения комплексных микробных удобрений. Биопрепараты могут частично заменить минеральные удобрения, увеличить урожай, улучшить качество продукции и при этом сохранить плодородие почвы. Главным требованием, предъявляемым к микробным удобрениям, должна быть: без- 150 вредность, дешевизна, простота применения и высокая эффективность. Оценить потребность в таких препаратах и требования к их качественным показателям позволяет постоянная работа с потребителями, по заявкам которых нарабатываются микробные препараты. Отмечено, что согласно проведенным производственным испытаниям отечественные препараты по эффективности не уступают зарубежным аналогам, способствуют снижению антропогенной нагрузки, удешевлению и повышению качества сельскохозяйственной продукции [17–27]. Наработка опытных образцов новых продуктов микробного синтеза дает возможность решить ряд важных вопросов, таких как ориентировочная экономическая оценка в целом, определение возможных областей применения биопрепаратов, их токсикологическая проверка; рынки сбыта и др. Большой научно-практический интерес представляет изучение молочнокислых бактерий, которые традиционно являются компонентом пробиотиков, кормовых и пищевых добавок. Молочнокислые бактерии обладают уникальными пробиотическими, иммуностимулирующими и адгезивными свойствами. В процессе своей жизнедеятельности они продуцируют биологически активные соединения, оказывающие положительное влияние на микробоценоз, работу желудочно-кишечного тракта, обмен веществ и иммунную систему макроорганизма. Эти свойства лактобактерий используют при изготовлении продуктов и препаратов различного назначения, содержащих жизнеспособные клетки и их метаболиты. Немаловажным является и тот факт, что технологии получения таких препаратов отличаются низкой энергоемкостью, отсутствием твердых, жидких и газообразных отходов, экологической безопасностью. Нами был проведен комплекс исследований по разработке молочнокислой кормовой добавки, включающий направленный скрининг продуцентов с учетом физиолого-биохимических, технологических, медико-биологических свойств исследуемых бактерий, по результатам которого отобран штамм Lactobacillus acidophilus, отличающийся высокой метаболической активностью и биосинтетическим потенциалом. Подобран состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие получение максимально высоких титров жизнеспособных клеток в предельно короткие сроки – 6 часов. Определены основные качественные показатели, условия и сроки хранения нового жидкого продукта, технология получения добавки. При научно-технологическом сопровождении Биотехнологического центра технология освоена на 151 производственных площадях РУП «Энзим» (г.Пинск) и РУП «Гродненский завод медицинских препаратов» (г.Скидель). Применительно ко всем биотехнологиям проведен комплекс исследований по сокращению технологических стадий в производстве за счет использования готовых форм инокулятов. В результате проведенных экспериментов была установлена возможность сокращения производственных стадий при получении готового продукта стабильно высокого качества. Важным итогом проведенных работ явилось доведение до промышленного выпуска препарата биологического Лаксил для силосования растительного сырья. Разработка состава производственной питательной среды, оптимизация условий культивирования, использование готового инокулята со стабильными качественными характеристиками, маркетинговые исследования при определении фасовки, взаимовыгодные правовые отношения с покупателем технологии в комплексе позволили успешно наладить многотоннажное производство конкурентоспособного препарата на двух предприятиях (РУП «Энзим» и РУП «Гродненский завод медпрепаратов») и стабильно получать сертифицированный продукт. Проблемы реализации созданной микробиологической продукции, включающие анализ рынка, разработку рекламных материалов, работу с потребителями и др., решаются сотрудниками Биотехнологического центра совместно со специалистами ООО «АктивБиоТех», имеющими опыт продвижения на рынок новых биопрепаратов. Такая совместная координационная деятельность в дальнейшем позволит наладить получение конкурентоспособных микробных препаратов и освоение их промышленного выпуска. В многоплановые исследования по характеристике разрабатываемых биопрепаратов, оптимизации технологий, наряду со специализированными лабораториями и Биотехнологическим центром органично интегрирована группа патентно-лицензионной работы и маркетинга. В настоящее время для успешной коммерциализации НИР, помимо маркетинговых исследований, не менее значимыми являются вопросы правовых отношений между разработчиками и производителями биотехнологической продукции с одной стороны, и потребителем с другой. Защита интеллектуальной собственности путем своевременного оформления заявок на получение патентов и свидетельств на товарные знаки, реклама биопрепаратов, проведение консультаций с потребителями и производителями биологических препаратов, выявление рыночных преимуществ наших технологий, поиск потенциальных инвесторов для доведения разработок 152 до стадии промышленного освоения, определение стоимости объектов промышленной собственности, подготовка и заключение лицензионных соглашений, которые являются лучшим способом передачи технологий – вот круг вопросов, решаемых совместно Биотехнологическим центром и патентно-лицензионной группой для успешной коммерциализации научных разработок института. Заключение. На основании проведенных исследований можно полагать, что создание эффективной системы коммерциализации научных разработок института базируется на взаимодополняющей интеграции всех ее этапов: от разработки новых технологий и препаратов до их промышленного освоения, использования и защиты. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Романова, Л.В. Перспективы производства и внедрение микробных препаратов / Л.В. Романова, Л.Д. Михеева, Л.А. Орлова, О.Н. Кузьмина // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 397–398. Орлова, Л.А. Лабораторный ферментационный стенд – первая ступень от теории к практике / Л.А. Орлова, Л.Д. Михеева, О.Н. Кузьмина // Итоги научной деятельности Института микробиологии Национальной академии наук Беларуси, 1975–2005: сб. ст. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2005. – С. 193–202. Грачева, И.М.Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева // Москва: Пищевая промышленность, 1975. – 160 с. Turner, A.P.F. Biosensors Instrumentation and Processing / A.P.F. Turner, S.P. Hendry, M.F. Cardosy // The World Biotech. Report. Online. London. – 1987. – Vol. 1. – P. 125–137. Crueger, A. Microbial Enzymes and Biotechnology / A. Crueger, W. Crueger // Elsevier Applied Science, London and New. York. – 1990. – P. 177–226. Paul, B. Biological control of Botrytis cinrera causing grej monid disease of elicitation of stiebene phytoalexin by a soil bacterium / B. Paul, I. Masih, A. Benoit // FEMS Microbiology Letters. – 1998. – Vol. 165. – P. 67–70. Chuang, T.V. Biological control of mango anthracnose / T.V. Chuang, P.I. Ann // Plant protection Bulletin Faipci. – 1997. – Vol. 39, № 3. – P. 227–240. Korsten, L. Status of research on biological control of avocado pre- and post harvest diseases an overview / L. Korsten // Yearbook South African Avocado Growers Association. – 1995. – Vol. 18. – P. 114–118. Дорожкин, Н. Антагонистические бактерии, перспективные для защиты картофеля от болезней / Н. Дорожкин, Л. Новикова, С. Бельская // Доклады АН РБ. – 1991. – Т. 35, № 11. – C. 1037–1038. Прищепа, Л.И. 30-летний опыт изучения бактериальных препаратов для защиты сельскохозяйственных культур от вредителей / Л.И. Прищепа // Защита растений. – 2001. – № 2. – C. 36–38. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации / В.В. Смирнов [и др.] // Микробиол. журн. – 1993. – Т. 55, № 3. – С. 38–44. 153 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Романовская, Т.В. Динамика роста и спорообразования глубинной культуры Bacillus subtilis – антагониста фитопатогенной микрофлоры / Т.В. Романовская, О.В. Молчан., Э.И. Коломиец и др. // Микробиология и биотехнология на рубеже ХХI столетия: материалы Междунар. конф., Минск, 22–24 мая 2002 г. // НАН Беларуси; редкол.: Астапович Н.И. [и др.] – Минск, 2002. – С. 73–74. Оптимизация технологических параметров глубинного культивирования Bacillus thuringiensis 24 – основы биопестицида «Бацитурин» / Э.И. Коломиец, [и др.] // Микробиология и биотехнология на рубеже ХХI столетия: материалы Междунар. конф., Минск, 22–24 мая 2002 г. / НАН Беларуси; редкол.: Астапович Н.И. [и др.]. – Минск, 2002. – С. 230–231. Оптимизация технологических параметров глубинного культивирования Bacillus subtilis – антагониста фитопатогенной микрофлоры в лабораторных и опытно-промышленном ферментерах / Э.И. Коломиец [и др.] // Микробиология и биотехнология на рубеже ХХI столетия: материалы Междунар. конф., Минск, 22–24 мая 2002 г. / НАН Беларуси; редкол.: Астапович Н.И. [и др.]. – Минск, 2002. – С. 232–233. Динамика роста и спорообразования бактерий Bacillus subtilis 12A – антагониста фитопатогенной микрофлоры в глубинной культуре / А.Е. Чикилева [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: матер. Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 121–123. Чикилева, А.Е. Оптимизация параметров глубинного культивирования бактерий Bacillus subtilis 12A. / А.Е. Чикилева, Л.А. Орлова, Л.Д. Михеева // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С.123–124. Использование препарата на основе молочнокислых бактерий для приготовления кормов с высокой протеиновой и энергетической ценностью / С.В. Абраскова [и др.] // материалы Междунар. конф., Минск, 22–24 мая 2002 г. / НАН Беларуси; редкол.: Астапович Н.И. [и др.]. – Минск, 2002. – С. 198–199. Спектр биологического действия биоинсектицида «Бацитурин» / Н.В. Евсегнеева [и др.] // материалы Междунар. конф., Минск, 22–24 мая 2002 г. / НАН Беларуси; редкол.: Астапович Н.И. [и др.]. – Минск, 2002. – С. 217–218. Вильдфлуш, И.Р. Влияние биопрепаратов на урожайность и качество озимой ржи / И.Р. Вильдфлуш, Л.А. Суховицкая, А.А. Цыганова // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 276–278. Бактериальный препарат Ризобактерин-С: подбор и оптимизация питательных сред для глубинного культивирования штамма-продуцента, эффективность применения / С.В. Мохова [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 318–320. Биологическая эффективность биопестицида «Фрутин» / Р.И. Плескацевич [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 323–325. Влияние препаратов на основе молочнокислых бактерий на аэробную стабильность силосованных кормов / С.В. Абраскова [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 356–357. Зенькова, Н.Н. Формирование бобово-ризобиального комплекса в зависимости от вида инокулянта при возделывании галеги восточной / Н.Н. Зенькова, 154 24 25 26 27 Л.Е. Картыжова, Т.В. Изюмова // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 362–364. Попов, Ф.А. Фитозащитное и ростстимулирующее действие бактерий Bacillus subtilis 12A в условиях лабораторно-полевых опытов / Ф.А. Попов, А.Е. Чикилева, Э.И. Коломиец // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 387–388. Абраскова, С.В. Силосование кормовых культур с использованием добавок / С.В. Абраскова, И.А. Найденко // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 395–397. Изюмова, Т.В. Формирование урожая семян сераделлы сорта «Новозыбковская 50» за счет инокуляции семян биопрепаратом «Сапронит» / Т.В. Изюмова // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 401–402. Коломиец, Э.И. Эффективность бактерий рода Bacillus против кагатной гнили корнеплодов сахарной свеклы / Э.И. Коломиец, А.В. Свиридов, Т.В. Романовская, А.Е. Воронкова, О.В. Молчан, В.В. Просвиряков // Современное состояние и перспективы развития микробиол. и биотехнол.: материалы Междунар. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 338–341. ROMANOVА L.V., KUZMINA O.N., ORLOVA L.A., MIHEEVA L.D., GLADKI N.F., YEROSH A.Y. Biotechnological center Investigations carried out at biotechnological center encompass a broad range of problems and coordinated solution thereof will further enable to set up a sustainable system of marketing network for objects of intellectual property generated at the Institute of Microbiology, of the National Academy of Sciences. УДК 579.663+606.63 СРЕДСТВА БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПАТОГЕНОВ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ: ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ И КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ Коломиец Э.И., Романовская Т.В., Молчан О.В., Сверчкова Н.В., Жук Г.В., Евсегнеева Н.В. лаборатория средств биологического контроля Предложены способы получения препаратов для защиты растений и животных на основе штаммов, проявляющих комплексное антибактериальное, ан- 155 тифунгальное и/или энтомоцидное действие. Селектированы фагоустойчивые варианты бактерий-антагонистов и энтомопатогенов. Проведены работы по усовершенствованию препаративной формы биопестицидов. Введение. Разработка и внедрение биотехнологий в агропромышленном секторе является приоритетом государственной политики многих стран. В настоящее время мировой рынок биотехнологий для сельского хозяйства и пищевой промышленности оценивается в 95 млрд. долларов и ежегодный рост его достигает 10%. В странах с высокой пестицидной нагрузкой созданы государственные программы, предусматривающие сокращение уровня применения химических пестицидов в 2 раза за счет внедрения биопрепаратов. В России объем рынка биотехнологий находится на уровне 1,6 млрд. долларов, из них препараты для сельского хозяйства составляют 23,6%. Производится более тысячи тонн средств защиты растений от болезней и вредителей, причем 74% выпуска продукции контролируют Станции Защиты Растений (58 предприятий), имеющие единую структуру в рамках Министерства сельского хозяйства РФ. Выпускается около 30 наименований препаратов (11 фунгицидов и 17 инсектицидов), которыми по данным аналитической группы компании Abercade Consulting обрабатывается около 8 млн. га, что составляет 9% от всех пахотных земель. В нашей республике средства защиты растений преимущественно закупаются за рубежом, при этом финансовые затраты достигают 120 млн.долларов в год. Доля биологических препаратов в общем объеме закупаемых и применяемых пестицидов незначительна – по данным Минсельхозпрода, в 2006 г. было применено 20,9 т биологических препаратов на площади 28,8 тыс. га, что составляет всего лишь 0,2% от объема использованных химических препаратов и 0,45% от общего количества обработанных химическими средствами площадей. Отечественное промышленное производство биопестицидов находится в зачаточном состоянии. Между тем, экологическая и фитосанитарная ситуация в республике требует более широкого использования для борьбы с патогенами и вредителями биотехнологической продукции, поскольку увеличение пестицидной нагрузки (2,32 кг/га в 2006 г., что на 25% выше уровня предыдущего года) приводит к загрязнению почв агрохимикатами и появлению резистентных форм возбудителей болезней и вредителей. Настоящая работа направлена на решение указанных проблем и предусматривает разработку подходов к повышению эф- 156 фективности и конкурентоспособности микробных пестицидов и усовершенствование технологий их получения как основы биологизации защитных мероприятий. Создание микробных пестицидов включает в себя обязательное решение целого ряда ключевых вопросов - от получения штаммов микроорганизмов с высокой антагонистической или энтомоцидной активностью до государственной регистрации препаратов. Эта работа выполняется с привлечением микробиологов, биотехнологов, медиков, специалистов по защите растений. Результатом ее явилось создание и организация опытнопромышленного производства первых отечественных биопрепаратов для защиты растений от вредителей и болезней, в том числе, разработанных в лаборатории средств биологического контроля: - Бацитурина – биоинсектицида на основе Bacillus thuringiensis, предназначенного для борьбы с паутинным клещом, репной белянкой, капустной молью, колорадским жуком в открытом и защищенном грунте; - Фрутина – высокоэффективного препарата на основе бактерий Bacillus subtilis для защиты плодовых культур от парши и рака; - Фитопротектина – биопестицида на основе бактерий Bacillus subtilis для защиты овощных культур от болезней грибной и бактериальной этиологии. В настоящее время проводятся работы по повышению эффективности и расширению ассортимента средств биологического контроля патогенов и вредителей с целью внедрения их в практику растениеводства и животноводства. Основные направления исследований: - создание полифункциональных биопрепаратов на основе высокоэффективных бактерий-антагонистов и энтомопатогенов с широким спектром действия; - получение фагоустойчивых вариантов бактерий с целью повышения их технологичности; - совершенствование препаративной формы биопестицидов. Поставленные задачи реализуются в рамках заданий государственных программ – ГППИ «Новые биотехнологии», ГППИ «Животноводство и ветеринария», ГНТП «Промышленные биотехнологии». Целями программ являются повышения потенциала биотехнологических агентов; создание на их основе новых технологий; научное обеспечение развития отечественной биотехнологии в интересах народного хозяйства. Наличие в республике нескольких биотехнологических программ различного статуса спо- 157 собствует объединению достижений фундаментальной и отраслевой науки с имеющимся производственным потенциалом предприятий микробиологического профиля. Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследований использованы бактерии рода Bacillus и Pseudomonas, а также их фагоустойчивые варианты, представляющие интерес в качестве агентов биоконтроля патогенов и вредителей. Отбор бактерий-антагонистов проводили методами точечного тестирования и лунок [1]. Тест-культурами для определения антагонистической активности выделенных изолятов служили фитопатогенные бактерии родов Pseudomonas, Xanthomonas и грибы родов Fusarium, Botrytis, а также представители патогенной и условно-патогенной микрофлоры родов Esherichia, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, Klebsiella, Salmonella, Pasterella. Инсектицидную активность оценивали по гибели гусениц вощинной моли (Galleria mellanella L.) и личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say.) 2-го возраста. Глубинное культивирование бактерий-антагонистов и энтомопатогенов осуществляли в колбах Эрленмейера на качалке (200 об/мин) и/или в лабораторном ферментере АНКУМ-2М, а также в опытно-промышленных ферментерах емкостью 100 и 300 л (аэрация 0,5–2,0 л воздуха/л среды⋅мин, скорость вращения мешалки 200 об/мин) на оптимизированной среде с мелассой в качестве источника углерода. При определении титра бактерий применяли метод предельных разведений [2]. Для выделения бактериофагов почвенные суспензии освобождали от сопутствующей микрофлоры 2–3 ч экспозицией с хлороформом и после центрифугирования инкубировали в присутствии индикаторных культур – исследуемых штаммов бактерий-антагонистов и энтомопатогенов. Чистые линии фагов получали путем последовательных пассажей из морфологически однородных негативных колоний. Выделение фагоустойчивых вариантов проводили из культуральной жидкости бактерий, выращенных в присутствии фагов. При определении титра бактерий и бактериофагов применяли соответственно методы предельных разведений [2] и агаровых слоев [3]. При статистической обработке результатов экспериментов проводили определение средних арифметических и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95% с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2003, наименьшую существенную разность (НСР) определяли с использованием дисперсионного анализа [4, 5]. 158 Результаты и их обсуждение. Из природных и техногенных источников выделены новые штаммы бактерий рода Bacillus, характеризующиеся антимикробной активностью в отношении патогенов растений, из погибших насекомых с характерными признаками бактериоза – энтомопатогенные бактерии. Исследован спектр их антагонистического и энтомоцидного действия, в ходе сравнительного анализа отобраны штаммы с высокой биологической активностью (таблица 1). В соответствии с полученными данными практически все исследуемые культуры характеризуются антагонистической активностью в отношении возбудителей болезней растений бактериальной и грибной этиологии, изолят Bacillus sp. Е3 проявляет только энтомоцидное действие, культуры Bacillus sp. Е2, B. thuringiensis Е4-Ф и B. thuringiеnsis 24 эффективны как в отношении фитопатогенов, так и вредителей растений. Таблица 1 – Оценка биологической активности выделенных штаммов антагонистов и энтомопатогенов Гибель Гибель личинок гусениц колорадвощинной Ps. syского жумоли, % ringae ка, % Диаметр зоны задержки роста тесткультур, мм Штаммы B. subtilis 9/6 B. subtilis 21 B. subtilis 8/12 B. subtilis 19 B. pumilus В-263 Ps. aurantiaca 9 Bacillus sp. Е2 Bacillus sp. Е3 B. thuringiеnsis Е4-Ф B. thuringiеnsis 24 F. oxysporum B. cinerea X. campestris 27,0±1,0 45,0±1,5 22,5±1,0 26,0±0,5 0 15 27,0±1,0 42,0±1,0 23,5±0,5 27,5±1,0 0 6 26,0±0,5 37,0±1,0 25,0±0,5 25,0±0,5 0 10 24,5±1,0 38,0±0,5 26,0±1,0 24,0±0,5 0 0 25,0±1,0 35,0±0,5 28,0±1,0 31,0±0,5 0 0 29,5±0,5 28,0±0,5 23,0±0,5 26,0±0,5 0 0 27,0±1,0 26,0±1,0 32,0±0,5 29,5±1,0 40 20 80 13 24,0±0,5 37,0±0,5 26,0±1,0 32,5±0,5 100 90 22,0±0,5 37,0±0,5 22,5±1,0 23,5±0,5 86 92 0 0 0 159 0 Для выявления наиболее технологичных штаммов проведены исследования по оценке их фагоустойчивости. В связи с отсутствием типовых бактериофагов к бациллам их выделяли из почвенных суспензий, используя бактерии-антагонисты и энтомопатогены в качестве индикаторных культур. В результате проведенных исследований получены фаги бактерий, отличающиеся между собой по морфологическим признакам. При длительном культивировании исследуемых бактерий в присутствии вирулентных фагов установлено, что в первые часы совместного инкубирования (2–2,5 ч) наблюдается интенсивный лизис культур, о чем свидетельствует снижение титра клеток бактерий и активное размножение фагов, сопровождающиеся уменьшением оптической плотности суспензии. Однако в дальнейшем происходит замещение чувствительной к фагу бактериальной популяции устойчивыми бактериями и к 48 ч доля фагоустойчивых клеток увеличивается до 72–80% в зависимости от исследуемого штамма бактерий. Выделенные фагоустойчивые варианты бактерий B. pumilus и P. аurantiacа, Bacillus subtilis 9/6 и Bacillus sp. Е-2 тестировали на сохранность антагонистических свойств и инсектицидной активности, а также на стабильность приобретенного признака фагоустойчивости. Установлено, что некоторые штаммы при пересевах оказываются чувствительными к фаговым лизатам, однако большинство полученных мутантов сохраняют приобретенные свойства (таблица 2). Таблица 2 – Стабильность признака фагоустойчивости выделенных бактерий Варианты B. pumilus 203-4.1 B. pumilus 203-4.2 B. pumilus 203-4.3 B. pumilus 203-4.4 P. aurantiaca 9Б-1 P. aurantiaca 9Б-2 P. aurantiaca 9Б-3 P. aurantiaca 9Б-4 P. aurantiaca 9Б-5 P. aurantiaca 9Б-6 Оптическая плотность культуры перед допри инкубации в присутбавлением ствии фага, ч фага 1 1,5 2–2,5 0,45 0,44 0,52 0,75 0,37 0,35 0,28 0,15 0,41 0,51 0,55 0,7 0,44 0,43 0,5 0,64 0,37 0,41 0,55 0,9 0,42 0,4 0,32 0,15 0,42 0,42 0,4 0,21 0,37 0,36 0,31 0,18 0,4 0,51 0,67 1,1 0,35 0,62 0,85 1,5 160 Наличие лизиса – + – – – + + + – – Таким образом, в результате проведенных исследований выделены штаммы, характеризующиеся комплексным (антагонистическим и энтомоцидным) действием, фагоустойчивостью, перспективные в качестве основы полифункциональных препаратов, Положено начало созданию коллекции фагов бактерийантагонистов и энтомопатогенов рода Bacillus, что обеспечивает возможность контроля производственных штаммов спорообразующих бактерий на фагоустойчивость. Наряду с исследованиями по получению высокоактивных штаммов – основы биопестицидов, проведена работа по усовершенствованию товарных форм разрабатываемых препаратов. В последние годы заметна тенденция к замене пылевидных форм (сухие порошки) на увлажненные. Такой подход способствует меньшему загрязнению окружающей среды, сохранению естественных комплексов полезной фауны и флоры, а также экономии средств, поскольку производство сухих форм весьма энергоемкий процесс [6, 7]. Нами разработана и внедрена на РУП «Новополоцкий завод БВК» технология получения биопестицидов Фрутин и Фитопротектин в жидкой форме и в виде текучей пасты с добавлением веществ, способствующих улучшению адгезионных свойств и стабильности препаратов, что позволяет гарантировать их качество в течение 3-х (для жидких) и 6-ти (текучей пасты) месяцев и эффективность их применения. В качестве потенциальных носителей проверены различные типы сапропелей, низинный, верховой торф, а также их смеси, взятые в различных соотношениях, оптимизированы нормы внесения инокулята и питательных веществ, обеспечивающие высокую приживаемость спорообразующих бактерий на субстрате и поддержание их жизнеспособности. Установлено, что оптимальные условия для роста и синтеза антимикробных метаболитов культурой Bacillus subtilus БИМ В-334 Д достигаются при использовании сапропелей и смеси сапропеля с низинным торфом (таблица 3). Для обогащения указанных субстратов требуется внесение дополнительного источника углеродного питания (мелассы) в количестве 1% от веса носителя. Оптимальная концентрация вегетативного посевного материала составляет – 30% от веса носителя. Испытания эффективности действия опытных партий Фитопротектина на основе сапропеля и смеси сапропеля с низинным торфом против возбудителя слизистого бактериоза капусты Xantomonas campestris pv. сampestris показали, что при внесении в грунт носители обеспечивают высокую приживаемость проростков 161 и формирование у растений мощной корневой системы, а также снижение заболеваемости проростков на 16–20% по сравнению с контролем (таблица 4). Таблица 3 – Влияние типа твердого носителя на рост и споруляцию бактерий B. subtilis БИМ B-334 Д – основы биопестицида Фитопротектин 1 Тип носителя Верховой торф Низинный торф Сапропель (кремниевый) Сапропель (карбонатный и органический 1:3) Смесь (1:1) низинного торфа и сапропеля (карбонатный и органический 1:3) Титр клеток и спор2 B. subtilis, n/г исходный на 4-е сут. клетки споры клетки споры 8 7,5·10 8 3,7·10 8 8 НСР0.05 клетки споры 8 0,6·108 9,0·10 3,2·10 1,0·10 1,1·109 9,0·108 1,5·108 1,1·108 3,1·108 1,0·109 8,5·108 1,8·108 1,4·108 8,0·108 3,5·108 1,2·109 1,1·109 1,0·108 0,5·108 9,2·108 3,6·108 1,3·109 1,0·109 1,2·108 0,7·108 8,5·108 3,2·108 8 7,5·10 Примечания. 1 – влажность носителя 60–80 %; 2 – в пересчете на сухой вес Оценена стабильность основных качественных показателей биопестицида Фитопротектин на твердых носителях в процессе хранения (таблица 5). По данным 6-месячных наблюдений установлено, что новая товарная форма препарата обеспечивает высокую сохранность культуры B. subtilis и стабильность антагонистической активности по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям. Результаты исследования свидетельствуют об эффективности использования твердых носителей в качестве основы Фитопротектина и перспективности проведения работ по внедрению новой препаративной формы биопестицида в производство. В последние годы в лаборатории развивается новое направление по созданию средств биологического контроля патогенов животных. 162 Таблица 4 – Эффективность образцов биопрепарата Фитопротектин на твердых носителях 5-й день Твердые носители Низинный торфа и сапропель (1:1) Сапропель Контроль 11 Контроль 22 10-й день число зараколичест- женных расво проротений стков, шт. шт. % число зараженных растений количество проростков, шт. шт. % 25,0 3,0 12,0 25,0 4,0 16,0 25,0 25,0 25,0 2,0 7,0 1,0 8,0 28,0 4,0 25,0 25,0 25,0 4,0 9,0 3,0 16,0 36,0 12,0 Примечания. 1 – грунт без биопрепарата + инокуляция корешков суспензией фитопатогена; 2 – естественный фон Таблица 5 – Оценка стабильности биопестицида Фитопротектин на твердом носителе в процессе хранения Фитопротектин на основе сапропеля Титр клеток, n/г АСВ субстрата Титр спор, n/г АСВ субстрата Диаметр зон нарастания и задержки роста тест-культур, мм Х.campestris B.cinerea Длительность хранения препарата, сут. исх. 40 60 90 180 1,2·109 5,6·109 9,0·109 8,6·109 4,3·109 1,1·10 9 2,1·109 3,0·109 5,3·109 3,8·109 171/362 291 18 /38 301 1 2 1 2 18 /38 301 1 2 16 /34 291 1 2 13 /32 271 Примечания: 1 – зона нарастания антагониста на тест-культуру; 2 – зона задержки роста тест-культур Для современного мясного и молочного скотоводства характерна высокая концентрация поголовья на ограниченных площадях, комплектование животноводческих ферм и комплексов одновозрастными и одновидовыми животными, что способствует быстрому распространению инфекционных заболеваний. Безвыгульное и безвыпасное содержание животных, нарушение микроклимата, теснота, малый фронт кормления, интенсивная эксплуатация, присущие современной промышленной технологии, оказывают стрессовые воздействия на организм животных, иммунная система под воздействием отрицательных факторов не в состоянии противостоять возбудителям болезней даже с невысокой патоген- 163 ностью. На этом фоне условно-патогенная микрофлора активизируется и у животных развиваются пневмоэнтериты, приводящие к значительному снижению их продуктивности и отходу. Желудочнокишечные болезни крупного рогатого скота наносят огромный экономический ущерб животноводству. При тяжелом течении заболеваний телят наступает угнетение клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Лечение антибиотиками приводит к сдвигу количественного и качественного состава условно-патогенной и нормальной кишечной флоры, обозначенному как дисбактериоз, который является одним из основных факторов развития заболеваний с диарейным синдромом. Кроме того, в результате постоянного применения антибиотиков у возбудителей вырабатывается резистентность, в результате чего препараты теряют эффективность. Таким образом, негативные последствия фармакологического и антигенного прессинга, усиленного в условиях промышленного содержания антропогенной и техногенной нагрузкой на организм животных, способствуют нарушению процессов саморегуляции между основными представителями кишечного биоценоза, усилению изменчивости бактерий и вирусов, развитию множественной лекарственной резистентности и усилению факторов патогенности ряда условно-патогенных микроорганизмов [9–12]. Эти обстоятельства привели к необходимости разработки нового поколения безопасных и эффективных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных. Нами выделен штамм бактерий Bacillus pumilus БИМ В-263 с широким спектром бактерицидного действия, на основе которого разрабатывается технология получения микробного дезинфектанта Энатин [13]. Испытания опытных партий препарата в производственных условиях РУСПП «Свинокомплекс Борисовский», проведенные совместно с сотрудниками Института животноводства НАН Беларуси, показали, что аэрозольная дезинфекция свиноводческих помещений с использованием Энатина позволяет существенно снизить микробную обсемененность воздуха и поверхностей животноводческих станков, пола, стен и стабилизировать концентрацию санитарно-показательной микрофлоры (бактерий групп кишечной палочки и стафилококко-стрептококковой) на экономически незначимом уровне. Проводятся также исследования по разработке пробиотических препаратов, направленных на коррекцию биоценоза кишечника сельскохозяйственных животных. Интерес к пробиотикам обусловлен их биологической безвредностью, способностью усиливать защитную функцию организма, стимулировать его иммунную реактивность, нормализовать пищеварение, не вызывая при 164 этом формирования устойчивости у патогенных микробов. Благодаря вышеперечисленным свойствам спектр применения пробиотиков широк - их используют для стимуляции неспецифического иммунитета, восстановления нормофлоры желудочно-кишечного тракта после лечения антибиотиками и другими антибактериальными химиотерапевтическими средствами, замены антибиотиков в комбикормах для молодняка животных, пушных зверей и птицы, ускорения адаптации животных к высокоэнергетическим рационам и небелковым азотистым веществам, повышения эффективности использования корма и продуктивности животных. Пробиотики широко применяются для борьбы с дисбактериозами различного происхождения, при проведении лечебно-профилактических мероприятий, а также в качестве стимуляторов роста для животных на откорме. Наиболее известны пробиотики на основе представителей нормального кишечного биоценоза, в частности, бифидо- и лактобактерий [14–27]. Однако эти микроорганизмы характеризуются высокой чувствительностью к факторам внешней среды, что приводит к тому, что традиционные пробиотические средства зачастую не способны обеспечить заявленную производителями эффективность применения, так как поступают к потребителю с большими потерями активности. В связи с этим в последнее время в качестве основы пробиотиков используют широко распространенные в природе бактерии рода Bacillus [28–37]. Пробиотики на основе бацилл эффективны, выгодно отличаются от традиционных тем, что сохраняют жизнеспособность при воздействии различных агрессивных факторов и стабильны при хранении. Высокая их выживаемость при неблагоприятных условиях существования, пагубных для других микроорганизмов, обусловлена способностью к спорообразованию [32]. При этом бактерии рода Bacillus характеризуются высокой избирательной антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам и способностью продуцировать разнообразные биологически активные соединения, в частности, липополисахариды, повышающие иммунитет животных. В связи с этим разработка и внедрение нового полифункционального лечебно-профилактического препарата для коррекции микробоценоза желудочно-кишечного тракта и стимуляции иммунной системы при вирусных и бактериальных болезнях молодняка крупного рогатого скота на основе бактерий рода Bacillus является актуальной задачей, направленной на повышение эффективности животноводства в республике. В таблице 6 представлены итоговые результаты исследования антагонистической активности 35 выделенных культур споро- 165 образующих бактерий в отношении возбудителей желудочнокишечных и легочных заболеваний животных. Приведенные данные свидетельствуют, что бациллы особенно эффективны против E. coli 018, P. vulgaris, S. аureus. Так, у 50–70% выделенных культур диаметры зон задержки роста патогенов составляют от 21 до 30 мм. Таблица 6 – Скрининг спорообразующих бактерий – антагонистов патогенных и условно-патогенных тест-культур Диаметр зоны задержки роста тесткультур, мм 0–10 11–20 21–30 31 и более Количество бацилл – антагонистов патогенов животных, % E. coli E. coli Salmo- Proteus PasKleb- StaphyК 9:F41 018 nella vulgaris terella siella lococholerae multapneucus suis cida monia aureus 16/45,7 19/54,3 - 8/22,9 6/17,1 9/25,7 3/8,6 20/57,2 8/22,9 23/65,7 10/28,6 18/51,4 1/2,9 - - 21/60,0 10/28,0 3/8,6 12/34,3 23/65,7 2/5,7 2/5,7 3/8,6 25/71,4 - - 5/14,3 Примечание. в числителе – количество антагонистов, в знаменателе – процент от общего количества (35) исследованных штаммов В таблице 7 обобщены данные по антимикробной активности шести наиболее активных штаммов, свидетельствующие, что выделенные культуры могут представлять интерес в качестве основы пробиотических препаратов. На агаризованных питательных средах проведены эксперименты по изучению влияния метаболитов отобранных бактерий рода Bacillus, характеризующихся высокой антимикробной активностью к патогенным и условно-патогенным бактериям животных, к представителям нормофлоры кишечника. Установлено, что бесклеточная культуральная жидкость (КЖ) бактерий-антагонистов не угнетает развитие лактобактерий и оказывает слабую задержку роста бифидобактерий. Полученные in vitro данные получили подтверждение в опытах in vivo. При скармливании бесклеточной КЖ бактерий-антагонистов здоровым мышам отмечается снижение на 2-3 порядка численности кишечной палочки, протея и полное исчезновение сальмонелл, в то время как концентрация бифидо- и лактобактерий в кишечнике практически не изменяется. Влияние продуктов метаболизма бацилл на животных с признаками поражения желудочно-кишечного тракта выражается в снижении на 3-4 порядка количества кишечной палочки, протея и 166 сальмонелл. При этом концентрация бифидо- и лактобактерий в кишечнике увеличивается на 2-3 порядка по сравнению с контролем. Таблица 7– Сравнительная оценка антагонистического действия отобранных бактерий (метод лунок) Препараты на основе антагонистов B. pumilus 203 B. subtilis 8/12 B. subtilis 10/19 B. subtilis 6/5 B. subtilis 7/1 B. subtilis 9/9 Диаметр зоны подавления роста тест–культур, мм E. coli E. coli P. vulga- K. pne- S. holeSta- P. multa018 099 ris umoraesuis phylоcida niae coccus sp. 28,0± 11,0± 23,0± 17,0± 14,0± 31,0± 11,0± 0,3 0,2 0,3 0,2 0,2 0,3 0,1 17,0± 22,0± 22,0± 22,0± 23,0± 29,0± 22,0± 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 19,0± 20,0± 24,0± 20,0± 17,0± 28,0± 20,0± 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,4 0,2 28,0± 13,0± 22,0± 18,0± 25,0± 30,0± 13,0± 0,3 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,1 20,0± 20,0± 21,0± 23,0± 27,0± 19,0± 20,0± 0,3 0,3 0,2 0,3 0,4 0,2 0,2 17,0± 19,0± 24,0± 20,0± 18,0± 26,0± 19,0± 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2 0,3 0,3 Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют об избирательной антагонистической активности исследуемых бактерий рода Bacillus – продукты метаболизма бацилл угнетают развитие условно-патогенной и патогенной микрофлоры и не оказывают негативного воздействия на нормофлору кишечника. Заключение. Проведенные научные исследования охватывают широкий спектр актуальных для республики проблем по созданию конкурентоспособных отечественных биопрепаратов для повышения эффективности и экологизации сельскохозяйственного производства. Выделены и отселектированы штаммы, характеризующиеся комплексным (антагонистическим и энтомоцидным) действием, фагоустойчивостью, перспективные в качестве основы полифункциональных препаратов для растениеводства и животноводства. В рамках ГНТП «Промышленные биотехнологии» разрабатываются технологии их получения и применения. Положено начало созданию коллекции фагов бактерий-антагонистов и энтомопатогенов рода Bacillus, что в перспективе обеспечит возможность контроля производственных штаммов спорообразующих бактерий на фагоустойчивость. 167 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Сэги, Й. Методы почвенной микробиологии / Й. Сэги.– М.: Колос, 1983. – 253 с. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Отв. ред. Д.Г.Звягинцев. – М.: МГУ, 1980.– 224 с. Практическое пособие по бактериофагии / Под ред И.М. Габриловича. – Минск: Вышэйшая школа, 1968. – 180 с. Рокицкий, П.Ф. Биологическая статистика / П.Ф. Рокицкий. – Минск: Вышэйшая школа, 1973. – 320 с. Дмитриев, Е.А. Математическая статистика в почвоведении / Е.А.Дмитриев. – М.: МГУ, 1995. – 319 с. Штерншис, М.В. Повышение эффективности микробиологической борьбы с вредными насекомым / М.В.Штерншис. – Новосибирск: Новосибирский гос. аграр. ун-т, 1995. – 193 с. Славнова, В.С. Товарные формы микробных инсектицидов / В.С. Славнова., Л.И.Кавызина // М.: ВНИИСЭНТИ, 1986. – 40 с. Страчунский, Л.С. Состояние антибиотикорезистентности в России / Л.С. Страчунский, Т.М. Богданович // Клинич. фармакология и терапия. – 2000. – Т. 9, № 2. – С. 6–9. Сидоренко, С.В. Происхождение, эволюция и клиническое значение антибиотикорезистентности / С.В.Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. – 1999. – Т. 44, № 12. – С. 19–22. Викторов, Д.В. Активный мембранный транспорт и множественная антибиотикорезистентность бактерий / Д.В. Викторов, Н.Н. Пивень // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. – 2001. – № 3. – С. 3–8. Эпидемиология антибиотикорезистентности нозокоминальных штаммов Staphylococcus aureus в России: результаты многоцентрового исследования / А.В. Дехнич [и др.] // Клинич микробиология и антимикроб химиотерапия. – 2002. – Т. 4, № 4. – С. 325–336. O’Sullivan, D.J. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria / D.J. O’Sullivan // J. Agr. and Food Chem. 2001. – 49, № 4. – C. 1751–1760. Штамм бактерий Bacillus pumilus БИМ В-263, обладающий антагонистической активностью к микроорганизмам – возбудителям болезней растений и животных: патент 9685 Респ. Беларусь, МПК А01 N 63/00 / Э.И.Коломиец, Н.В. Сверчкова, Т.В. Романовская, В.И. Беззубов; – № 20050240; заявл. 15.03.05; опубл. 30.08.07. Способ получения гомопробиотического бактерийного препарата, содержащего живые молочнокислые бактерии: патент 2146288 Россия, МПК7 С12 N 1/20, А 01 N 63/00 / Б.А. Шендеров, М.А. Маивелова; – № 99114928/13; заявл. 16.07.99; опубл. 10.03.00. Studies on probiotics properties of two Lactobacillus strains / M.A. Brizuella [et al] // Braz. Arch. Biol. and Technol. – 2001, Vol. 44, № 1. – P. 95–99. Antagonismo in vitro e in vivo de Bifidobacterium sp. diaute de Salmonella entertains var. typhimurium / L.M. Silva [et al] // Agr. bras. med. vet. e zootecn.1998. – Vol. 50, № 5. – C. 499–504. Probiotic formulation: рat. 6468525 USA МПК7 С12 N 1/20 / T.S. Watson, B.F. Watson, L. Reneur. – № 09/37 1335; заявл. 10.08.99; опубл. 22.10.02; НПК 424/93.3. Эффективность пробиотиков в профилактике болезней органов пищеварения и гиповитаминозов / И.М. Карпуть [и др.] // Современное состояние перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы междунар. конф., Минск, 26–28 мая 2004 г. / Нац. акад. наук Беларуси. Отделение биол. наук НАН Беларуси. Ин-т микробиологии. Концерн «Белбиофарм». Белорусский 168 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 республиканский фонд фундаментальных исследований. – Минск, 2004.– С. 234–236. Использование бифидобактерий для борьбы с желудочно-кишечными заболеваниями поросят и цыплят / Т.М. Эрвольдер [и др.] // Молочная промышленность – 1984. – № 8. – С. 18–20. Klaver, F.A. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt-deconjugating activity / F.A.Klaver, R.Meer // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – Vol. 59, № 4. – P. 1120–1124. Proteinaceous factors in culture supernatant fluids of bifidobacteria which prevents the binding of enterotoxigenic Escherichia coli to gangliotetraosylceramide / S. Fujiwara [et al] // Appl.Environ. Microbiol., – 1997. – Vol. 63, № 2. – P. 506–512. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий по отношению к возбудителям кишечных заболеваний домашних птиц // Е.И. Квасников [и др.] // Мікробіологічний журнал. – Т. 45, № 5. – 1983. – С.27–32. Бабина, М.П. Пробиотики в профилактике желудочно-кишечных заболеваний и гиповитаминозов животных и птицы: анал. обзор / М.П. Бабина, И.М. Карпуть. – Мн.: Белнаучцентр информмаркетинга АПК, 2001. – С. 11–16. Малик, Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н.И. Малик А.И. Панин // Ветеринария. – № 1. – 2001. – С. 46–51. Antimicrobial activity of intraurethrally administered probiotic Lactobacillus casei in a murine model of Escherichia coli urinary tract infection / T. Asahara [et al] // Antimicrobial agents and chemotherapy – Vol. 45, № 6. – 2001. – Р. 1751–1760. Получение лечебно-профилактического препарата Энтеробифидин на основе Bifidobacterium adolescentis МС-42 / Г.И. Новик [и др.] // Прикл. биохимия и микробиол. – 2000. – Т. 36, № 1. – С. 104–110. К механизму антимикробной активности бифидобактерий / Н.И. Астапович [и др.] // Доклады НАН Беларуси. – 2004. – Т. 48, № 4. – С. 57–61. Современные представления о механизмах лечебно—профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus / В.В. Смирнов [и др.] // Мікробіологічний журнал. – 1993. – Т. 55. – № 4. – С. 92–112. Сорокулова, И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств биоспорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл / И.Б. Сорокулова // Мікробіологічний журнал. – 1997. – Т. 59. – № 6. – С. 43–49. Пробиотический препарат комплексного действия: пат. 2159625 Россия, МПК7 А 61К 35/66 / В.А. Белявская, Т.А. Кашперова, И.Б. Сорокулова [и др.]; заявитель Гос. науч. центр вирусол. и биотехнол. «Вектор» – № 99111728/14; заявл. 25.05.99; опубл. 27.11.00. Properties of the Bacillus cereus strain used in probiotic CenBiot / C. Gil-Turnes [et al] // Rev. microbial. – 1999. – Vol. 30, № 1. –P. 11–14. Спорообразующие аэробные бактерии-продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов [и др.]. – Киев: Наукова Думка, 1982. – 230 с. Влияние условий культивирования на некоторые свойства бацилл, составляющих основу пробиотиков / Т.М. Фурзикова [и др.] // Мікробіологічний журнал. – 1999. – Т. 61, № 5. – С. 19–27. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина [и др.] // Биотехнология. – 2001. – № 2. – С. 48–56. Крюков, О. Спорообразующий пробиотик при выращивании бройлеров / О. Крюков // Комбикорма. – 2006. – № 1. – С. 75. Коррекция нарушений микробоценоза человека с помощью пробиотиков / М.В. Волков [и др.] // Вопросы питания. – 2006. – № 4. – С. 32–34. Бондаренко, В.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов / В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева // Фарматека. – 2003. – № 7. – С. 56–63. 169 BIOLOGICAL AGENTS TO CONTROL PLANT AND ANIMAL PATHOGENTS: APPROACH TO INCREASE EFFICIENCY AND COMPETITIVE ABILITY KOLOMIETS E.I., ROMANOVSKAYA T.V., MOLCHAN O.V., SVERCHKOVA N.V., ZHUK G.V., EVSEGNEEVA N.V. Laboratory of biological control agents Methods of producing preparations for plant and animal protection based on strains displaying complex antibacterial, antifungal and/or insecticidal action were proposed. Phag-resistant variants of antagonistic bacteria and entomopathogens were selected. Investigations to improve preparation form of biopesticides have been performed. УДК 579.64+606.63 БАКТЕРИИ-АНТАГОНИСТЫ КАК АГЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ КАГАТНОЙ ГНИЛИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ Коломиец Э.И.1, Кильчевская О.С.1, Купцов В.Н.1, Романовская Т.В.1, Гирилович Н.И.1, Свиридов А.В.2 1 лаборатория средств биологического контроля ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», 2 кафедра энтомологии и биологической защиты растений УО «Гродненский государственный аграрный университет» Установлено, что в составе возбудителей кагатной гнили сахарной свеклы преобладают фитопатогенные грибы родов Fusarium, Penicillium, Botrytis, Sclerotinia, Alternaria и Phoma. Выделены культуры бактерий, представляющие интерес в качестве потенциальных агентов биологического контроля указанных фитопатогенов. Выявлено ингибирующее действие метаболитов изученных бактерийантагонистов на прорастание спор и развитие мицелия грибов. По данным лабораторных исследований отобраны культуры бактерий с максимальной антагонистической активностью для наработки опытных образцов препаратов. Отмечено, что хозяйственная эффективность некоторых биопрепаратов, используемых для обработки свеклы в буртах, достигает 45%. На основе проведенных исследований рекомендован штамм бактерий Bacillus subtilis М-22 в качестве основы биопрепарата для защиты сахарной свеклы от кагатной гнили. Введение. Кагатная гниль – болезнь корнеплодов свеклы в период зимнего хранения в кагатах или буртах, вызываемая комплексом различных фитопатогенных грибных и бактериальных микроорганизмов, из которых наиболее часто встречаются грибы родов Botrytis, Phoma, Trichothecium, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Rhizopus [1, 2]. Болезнь проявляется в разложении и отми- 170 рании тканей корнеплодов, которые покрываются плесенью различного цвета или имеют характер мокрой гнили, вследствие чего снижается пищевая и технологическая ценность сахарной свеклы. Как правило, комплекс защитных мероприятий включает обработку свеклы от вредителей и болезней в период вегетации, предохранение от механических повреждений при уборке и транспортировке, тщательную браковку перед укладкой в кагаты. Наряду с этим большое значение имеет подавление жизнедеятельности фитопатогенной микрофлоры при хранении свеклы. Применение различных химических средств защиты приводит к остаточному загрязнению корнеплодов пестицидами и ограничено санитарно-гигиеническими нормами. Широко практикуемая обработка корнеплодов известковыми материалами перед закладкой их на хранение не обеспечивает эффективную защиту свеклы от кагатной гнили. В связи с указанным, возрастает актуальность разработки методов биологического контроля возбудителей кагатной гнили. Исследования в этом направлении ведутся в различных странах мира. Выделены бактерии рода Bacillus, Serratia, Pseudomonas [3], отличающиеся способностью к подавлению роста патогенных грибов при низких температурах, характерных для условий содержания овощной продукции в хранилищах. Показана целесообразность использования бактерий-антагонистов рода Bacillus в качестве основы эффективных биопрепаратов [4, 5]. Так, российский препарат «Фитоспорин-М» (Bacillus subtilis 26Д) рекомендован для снижения развития и распространения гнилостных процессов на различных сортах сахарной свеклы [6]. Проблема защиты сахарной свеклы от кагатной гнили весьма актуальна и для Республики Беларусь. Вместе с тем, видовой состав возбудителей этого заболевания в республике не изучен, не зарегистрированы биопрепараты, способные эффективно подавлять развитие кагатной гнили. Поэтому разработка отечественного микробного препарата для защиты сахарной свеклы от кагатной гнили с учетом особенностей видового состава и патогенных свойств возбудителей, распространенных в Беларуси, обеспечивающего снижение потерь и качество продукции при хранении, является актуальной задачей. В задачи исследования входили скрининг штаммов микроорганизмов – антагонистов возбудителей кагатной гнили и оценка их активности в отношении комплекса грибных патогенов сахарной свеклы, распространенных в Беларуси, с целью создания микробного препарата. Объекты и методы исследования. В работе использовали бактерии рода Bacillus и Pseudomonas, выделенные в лабора- 171 тории средств биологического контроля Института микробиологии НАН Беларуси, а также бактерии рода Serratia и Pantoea из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. Кроме этого, изучали изоляты бактерий Г-1 – Г-13, выделенные сотрудниками УО «Гродненский государственный аграрный университет». Основными тест-объектами для оценки антагонистической активности исследуемых культур бактерий служили фитопатогенные грибы, изолированные из пораженных кагатной гнилью корнеплодов свеклы и идентифицированные сотрудниками УО ГГАУ. Определение видового состава возбудителей кагатной гнили выполняли по общепринятым в фитопатологии методам [7], культивирование выделенных изолятов грибов осуществляли на картофельно-глюкозном бульоне и агаре. Бактерии-антагонисты выращивали на среде Мейнелла с использованием мелассы в качестве источника углерода в колбах Эрленмейера объемом 250–1000 мл на качалке (200 об/мин) при 28 °С в течение 72 ч. Первичный скрининг бактерий-антагонистов проводили методом точечного тестирования и методом лунок [8]. Результаты учитывали после 24–48 ч инкубации при температуре 28 °С по диаметру зон задержки роста тест-культур патогенов. Идентификацию наиболее активных штаммов бактерийантагонистов проводили с использованием элективных питательных сред по общепринятым методикам [9] и определителю бактерий [10]. Титр колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий устанавливали методом предельных разведений [11]. Для определения титра спор проводили термическую обработку разведений бактериальной суспензии при 80 °С в течение 10 мин с последующим высевом на МПА. Для изучения влияния метаболитов бактерий-антагонистов на прорастание спор и развитие мицелия фитопатогенных грибов использовали модифицированный метод агаровых пластинок [12]. При оценке холодостойкости бактериальных культур проводили наблюдения за их развитием на поверхности МПА в чашках Петри при температурах 3 °С, 5 °С и 8 °С. Испытания опытных образцов биопрепаратов против кагатной гнили проводили в 2006–2007 годах в условиях крупногабаритных буртов УО СПК «Путришки» Гродненского района на свекле сортов Сильвано, Казино, Марс и малогабаритных буртов РУП «Несвижская опытная станция по сахарной свекле» на сорте Белорусская односемянная 69. Распространенность заболевания (Р, %) вычисляли по формуле Р=(n/N)×100, где n – количество больных корнеплодов в пробе, N – общее количество корнеплодов [13]. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием метода дисперсионного анализа [14]. 172 Результаты и их обсуждение. Определен видовой состав и патогенность возбудителей кагатной гнили. Из пораженных тканей корнеплодов сахарной свеклы были выделены следующие грибы: Penicillium expansum Link, Fusarium culmorum Sacc., Fusarium redolens Woll., Alternaria tenuis Nees., Botrytis cinerea Pers. et Fr., Sclerotinia sclerotiorum (lib) de Bary, Phoma betae Frank. По данным первичного отбора, проведенного методом точечного тестирования на агаризованных питательных средах, были отобраны бактериальные культуры, проявившие выраженную антагонистическую активность по отношению к испытываемым фитопатогенам. Далее изучаемые бактерии выращивали в глубинной культуре. Наблюдения с использованием светового микроскопа выявили ингибирование прорастания спор и развития мицелия фитопатогенных грибов под действием метаболитов бактерийантагонистов. Установлено, что бесклеточная КЖ большинства исследуемых бактерий вызывает деформацию спор и ростовых трубок грибов P. expansum и B. cinerea, сопровождающуюся вакуолизацией и появлением опухолеобразных вздутий. Антагонистическое действие бактерий, оцененное методом лунок, проявляется как в полном отсутствии роста фитопатогенных грибов, так и в ослаблении их развития, диаметр зон лизиса или задержки роста тест-объектов варьирует в диапазоне от 10 до 66 мм (таблица). Из изученных псевдомонад наибольшая антифунгальная активность отмечается у штамма Ps. aurantiaca 9, отличительной особенностью антагонистического действия которого является подавление роста всех исследуемых фитопатогенных грибов и образование чистой зоны лизиса на газоне тест-объектов. Характерной особенностью бактерий рода Serratia является их способность развиваться при пониженных температурах (3–5 °С), что позволяет прогнозировать их конкурентоспособность in vivo, поскольку оптимальная температура при хранении свеклы в кагатах составляет 1–3 °С. Наиболее перспективными агентами биологического контроля возбудителей кагатной гнили сахарной свеклы в климатических условиях Беларуси являются бактерии Bacillus subtilis. Максимальную антагонистическую активность проявляет штамм B. subtilis 10/19, однако он не отличается высокой холодостойкостью (рост наблюдается лишь при 8 °С и выше). Штаммы B. subtilis М-22, B. subtilis М-19, B. subtilis 12, B. subtilis 14, B. subtilis 7/14 характеризуются не только высокой антимикробной активностью, но и холодостойкостью. Изоляты бактерий Г-3, Г-6, Г-10(4), 173 Г-12(6), идентифицированные как Bacillus subtilis, также сочетают эти важные качества. Таблица – Антифунгальная активность исследуемых культур бактерий Культуры Ps. aurantiaca 3 Ps. aurantiaca 9 Ps. sp. B-136 P.agglomerans 97 S.plymuthica B-162 S.plymuthica B-163 B. subtilis 7/14 B. subtilis 8/12 B. subtilis 9/6 B. subtilis 10/19 B. subtilis 12 B. subtilis 14 B. subtilis M-19 B. subtilis M-22 Изолят Г-1 Изолят Г-2 Изолят Г-3 Изолят Г-4 Изолят Г-5 Изолят Г-6 Изолят Г-7(1) Изолят Г-8(2) Изолят Г-9(3) Изолят Г-10(4) Изолят Г-11(5) Изолят Г-12(6) Диаметр зоны задержки роста тест-культур*, мм 1 2 3 4 5 6 7 22,0 19,0 26,0 33,0 25,0 17,0 24,0 24,0 23,0 29,5 38,0 28,0 20,0 32,0 14,5 17,5 14,5 46,0 23,0 22,5 25,0 13,5 22,0 17,0 42,0 13,0 12,5 14,0 14,0 14,0 20,0 35,0 28,5 22,5 18,5 10,0 15,0 10,0 47,5 11,0 16,0 17,5 22,0 29,5 17,0 46,0 25,0 24,0 29,0 22,5 31,5 19,9 40,0 47,0 19,5 24,0 18,5 30,5 20,5 41,5 44,0 26,0 29,0 30,0 24,0 32,0 46,0 37,0 29,0 47,0 22,0 20,0 30,0 47,0 45,0 22,0 45,0 21,0 19,0 33,0 40,0 33,0 25,0 36,0 22,0 32,5 20,0 40,0 49,0 24,5 25,5 26,0 27,5 27,0 38,0 40,0 24,0 41,0 21,0 22,0 17,0 30,0 29,0 28,5 29,5 15,5 29,5 16,0 38,0 32,0 18,0 25,5 25,0 23,0 21,0 48,0 43,0 21,0 30,0 18,5 28,0 19,0 45,0 43,0 21,5 26,0 13,5 27,0 10,0 25,0 39,0 20,0 21,5 27,0 21,5 28,0 44,0 34,0 21,0 31,0 23,5 22,0 24,0 42,0 40,0 22,0 28,5 30,0 25,0 30,0 52,0 53,0 25,5 43,0 25,5 30,5 30,0 63,0 43,0 25,5 30,5 30,5 30,0 33,0 66,0 56,0 25,5 37,0 26,0 25,5 20,0 48,0 36,0 22,5 27,0 29,0 25,5 29,0 53,0 54,0 26,5 32,0 Примечание. * тест-культуры: 1 – F. redolens, 2 – F. culmorum, 3 – P. expansum, 4 – B. cinerea, 5 – Sc. sclerotiorum, 6 – Al. tenuis, 7 – Ph. betae На основе наиболее активных культур бактерий были наработаны опытные образцы препаратов, титр КОЕ и титр спор которых составил 4,6–5,6·109 и 2,0–4,0·109, соответственно. Оценка их действия (in vivo) на сохранность корнеплодов свеклы в буртах в период зимнего хранения показала, что наиболее эффективными являются препараты на основе штаммов бактерий B. subtilis M-22, B. subtilis 14 и B. subtilis Г-3. Под их влиянием распространенность кагатной гнили на корнеплодах сахарной свеклы значи- 174 тельно снижается. Хозяйственная эффективность препарата на основе бактерий B. subtilis M-22 достигает 45%. Заключение. Видовой состав возбудителей кагатной гнили сахарной свеклы представлен фитопатогенными грибами родов Fusarium, Penicillium, Botrytis, Sclerotinia, Alternaria и Phoma. В лабораторных условиях максимальной активностью в отношении грибных патогенов характеризуются штаммы бактерий B. subtilis 10/19, B. subtilis M-22, B. subtilis Г-3, а в условиях крупно- и малогабаритных буртов в период зимнего хранения – B. subtilis M-22, B. subtilis Г-3 и B. subtilis 14. Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по разработке биотехнологии получения высокоэффективного экологически безопасного препарата для защиты сахарной свеклы от кагатной гнили. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Дементьева, М.И. Фитопатология / М.И. Дементьева. – М.: Агропромиздат. – 1985. – 397 с. Фунгициды против болезней / К.Н. Брояковская [и др.] // Сахарная свекла. – 1991. – №4. – С. 46–47. Штамм бактерий для предотвращения грибкового заболевания фруктов или овощей после сбора урожая и получения антибиотиков для ингибирования возбудителей вышеуказанных заболеваний: пат. 2126210 (РФ) A 01 № 63/00, А 01 F 25/00, С 12 S 3/00; заявитель К. Лейферт, Г. Артур, С. Иптон, Д.Ч. Сайги; опубл. 20.02.99 // Бюл. № 8 / Изобретения. – 1999. – № 8. – С. 112. Эффективность бактерий рода Bacillus против кагатной гнили сахарной свеклы / Э.И. Коломиец [и др.]: материалы Междунар. науч. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006 г. / Минск, 2006. – С. 338–341. Научные и практические основы создания биопрепарата для защиты сахарной свеклы от кагатной гнили / Э.И. Коломиец [и др.] // Инф. бюл. ВПРС МОББ. – 2007. – Т. 38. – С. 145-147. Возбудители кагатных гнилей сахарной свеклы и меры борьбы с ними / А.В. Широков [и др.]: материалы V Всерос. конгр. по медиц. микологии, М., 28–30 марта 2007 г. / M., 2007. – Т. IX. – С. 120–121. Сэги, Й. Методы почвенной микробиологии / Й. Сэги. – М.: Колос. – 1983. – 296 с. Пидопличко, Н.М. Грибы – паразиты культурных растений / Н.М. Пидопличко. Т. 1-3. – Киев: Наукова думка. – 1977. – 300 с. Добровольская, Т.Г. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий / Т.Г. Добровольская, И.Н. Скворцова, Л.В. Лысак. – М.: МГУ. – 1989. – 70 с. Краткий определитель бактерий Берги / под ред. Дж. Хоулта. – М.: Мир. – 1980. – 495 с. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г.Звягинцева. – М.: МГУ. – 1980. – 224 с. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхарда. Т.1. – М.: Мир. – 1983. – 472 с. 175 13 14 Поляков, И.Я. Прогноз развития вредителей и болезней сельскохозяйственных культур (с практикумом) / И.Я. Поляков, М.П. Персов, В.А. Смирнов. – Л.: Колос. – 1984. – 318 с. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований.) / Б.А.Доспехов. – М.: Агропромиздат. – 1985. – 351 с. ANTAGONISTIC BACTERIA AS BIOLOGICAL CONTROL AGENTS AGAINST CLAMP ROT OF SUGAR BEET KOLOMIETS E.I.1, KILCHEVSKAYAO.S.1, KUPTSOV V.N.1, RO1 1 2 MANOVSKAYA T.V. , GIRILOVICH N.I. , SVIRIDOV A.V. 1 Laboratory of biological control agents, Institute of Microbiology, 2 Chair of entomology and biological plant protection, State Agricultural University, Grodno It was revealed that phytopathogenic fungi of genera Fusarium, Penicillium, Botrytis, Sclerotinia, Alternaria and Phoma prevailed among pathological agents causing clamp rot of sugar beet. The cultures of bacteria attractive as potential agents for biological control of these phytopathogens were isolated. Inhibitory action of metabolites produced by tested antagonistic bacteria on spore germination and development of fungal mycelium was demonstrated. According to laboratory results, cultures of bacteria with the maximal antagonistic activity were selected to produce test specimens of microbial preparations. It should be noted, that application of some biopreparations during clamp storage resulted in 45% economic efficiency. After completed investigations Bacillus subtilis М-22 bacterial strain was recommended as a basis of biopreparation against clamp rot of sugar beet. УДК 579.64 БИОЛОГИЧЕСКИЙ ДЕЗИНФЕКТАНТ ЭНАТИН Сверчкова Н.В, Ладутько Е.И., Коломиец Э.И. лаборатория средств биологического контроля Изучено антимикробное действие биопрепарата Энатин, полученного на основе спорообразующих бактерий Bacillus pumilus БИМ В-263, и показана перспективность его использования в качестве биологического дезинфектанта в животноводческих комплексах. Введение. Одним из путей решения проблемы снижения микробной обсемененности помещений животноводческого комплекса, что во многом способствует профилактике инфекционных болезней животных, является проведение комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий [1]. Для дезинфекции широкого круга объектов чаще используют химические методы обеззараживания, основанные на применении дезинфицирующих химических ве- 176 ществ. Однако основной их недостаток в том, что эти методы не являются экологически чистыми, поскольку сопряжены с применением вредных для человека и медленно деградирующих во внешней среде химических агентов. Длительное применение химических дезинфектантов приводит также к возникновению проблемы резистентности микроорганизмов, что делает указанные средства малопригодными для дальнейшего использования. В связи с этим особую актуальность приобретают биологические препараты, обладающие экологической безопасностью, безвредностью для животных и человека и являющиеся эффективным средством, направленным на профилактику болезней в стаде животных и, в первую очередь, инфекций, вызванных бактериями групп кишечной палочки, стафилококко-стрептококковой [1]. Перспективным является создание дезинфицирующих средств на основе бактерий рода Bacillus. Известно, что спорообразующие бактерии находят широкое применение не только в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами [2–5], но и патогенами животных [6–9]. Живые культуры спорообразующих аэробных бактерий рода Bacillus используются в животноводстве с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных заболеваний. Показано, что бактерии В. cereus, B. polymyxa, B. coagulans, B. brevis, B. megaterium, B. pumilus, B. laterosporus, B. licheniformis могут служить эффективным средством при лечении острых и хронических инфекций благодаря своим антагонистическим свойствам [10, 11]. Их применяют также для повышения эффективности использования корма и прироста живой массы животных [10]. Известен способ биологической дезинфекции операционных путем распыления живой культуры B. subtilis [12]. Микробные препараты, созданные на основе бактерии рода Bacillus, наряду с безвредностью для макроорганизма и окружающей среды, обладают селективностью действия, простотой технологии производства, стабильностью при хранении. Использование бактерий рода Bacillus в качестве дезинфицирующих средств для снижения микробной обсемененности является новым направлением биотехнологии и требует глубокого и детального изучения [12, 13]. Нами выделен штамм бактерий Bacillus pumilus БИМ В-263, исследованы его физиолого-биохимические особенности, влияние условий культивирования на проявление антимикробных свойств и на его основе разработана технология получения биопрепарата Энатин с широким спектром антибактериального действия. Настоящее исследование направлено на изучение дезин- 177 фицирующего действия Энатина в отношении бактерий групп кишечной палочки, стафилококко-стрептококковой в лабораторных и производственных условиях. Объекты и методы исследования. В качестве основного объекта исследования использован штамм B. pumilus БИМ В-263, характеризующийся высокой антимикробной активностью к бактериальным патогенам животных. В качестве тест-объектов для определения антагонистической активности исследуемой культуры использовали бактерии родов Esсherichia, Staphylococcus, Streptococcus. Антимикробную активность биопрепарата Энатин определяли методами лунок [14] и реплик [15]. Дезинфицирующее действие Энатина оценивали согласно инструкции № 4718 от 24.12.1998 Министерства здравоохранения РБ, Главного управления гигиены, эпидемиологии и профилактики «Методы испытания противомикробной активности дезинфицирующих средств» [16]. В качестве эталона использовали химические дезинфектанты, рекомендуемые для дезинфекции животноводческих помещений – КДП (комбинированный дезинфектант поверхностей на основе альдегидов, четвертичных аммониевых солей, алкоголей), Лизол (раствор очищенных фенолов), СандимД (раствор, содержащий стабилизированную перекись водорода, надуксусную, уксусную кислоты). Производственные испытания биодезинфектанта Энатин проводили совместно с сотрудниками РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству» в секциях поросят на доращивании в РУСПП «Свинокомплекс Борисовский». Опытные секции обрабатывали аэрозольным методом с использованием пневматических распылителей (струйный аэрозольный генератор САГ–1, САГ-2). Норма расхода микробного 3 3 дезинфектанта – 3 см /м воздуха. Эффективность действия Энатина оценивали по его влиянию на инфекционный фон животноводческих секций после содержания в них животных, включая воздушную среду и поверхности (свиноводческие станки, пол, стены). Анализ микрофлоры воздуха проводили с использованием аппарата Кротова [17]. Микробную обсемененность воздуха и поверхностей до и после обработки оценивали по количеству санитарнопоказательной (бактерии групп кишечной палочки, стафилококкострептококковой) и общей микрофлоры согласно инструкции по контролю качества дезинфекции животноводческих помещений [18]. 178 При статистической обработке результатов экспериментов проводили определение средних арифметических и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95% с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2003 и Statistica 6.0 [19]. Результаты и их обсуждение. На первоначальном этапе исследований была проверена эффективность действия биологического дезинфектанта Энатин в лабораторных условиях. С использованием различных методов оценки антимикробной активности установлено, что дезинфектант подавляет рост исследуемых тест-объектов на 92–98% (метод реплик), а зона ингибирования роста тест-объектов составляет 26,0–31,5 мм (метод лунок) (таблица 1). С использованием качественного и количественного суспензионных методов установлена минимальная бактерицидная концентрация (МБК) Энатина в отношении бактерий E. сoli и S. аureus, составившая 2,5% и 0,1% соответственно. В сравнении с дезинфицирующим действием химических средств МБК биодезинфектанта в отношении E. coli не уступает значению этого показателя для КДП и Лизола, Таблица 1 – Антагонистическая активность биодезинфектанта Энатин в отношении общей и санитарно-показательной микрофлоры (в лабораторных условиях) Тест-объект Escherichia coli Staphylococcus aureus Streptococcus sp. Общая микрофлора Диаметр зоны подавления роста тест-объектов, мм (метод лунок) 26,0±0,5 28,5±0,3 Степень подавления роста тестобъектов, % (метод реплик) 95 98 27,3±0,2 31,5±0,6 96 92 а в отношении S. аureus – превосходит МБК всех проверенных эталонов, что свидетельствует о преимуществе биологического препарата (таблица 2). Эффективность дезинфицирующего действия биопрепарата Энатин подтверждена производственными испытаниями на РУСПП «Свинокомплекс Борисовский» в секциях поросят на доращивании в летний период, когда уровень инфекционного фона в животноводческих помещениях является максимальным. 179 Таблица 2 – Действие Энатина и химических дезинфектантов на тест-культуры санитарно-показательной микрофлоры S. аureus E. coli Тестобъект Экспозиция, ч 0,25 0,5 1 2 3 4 0,25 0,5 1 2 3 4 К 10,0 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ – – – – – – – – – – – – Энатин, % 2,5 1,0 ++ + + – – – – – – – – – +++ +++ ++ + + + – – – – – – 0,1 10,0 +++ +++ +++ +++ +++ +++ + + – – – – – – – – – – – – – – – – КДП, % 2,5 1,0 + + – – – – – – – – – – ++ ++ + – – – ++ ++ + + – – 0,1 10,0 +++ +++ +++ +++ ++ + ++ ++ ++ + + – – – – – – – – – – – – – Лизол, % 2,5 1,0 + + – – – – – – – – – – ++ ++ + – – – ++ ++ + + – – 0,1 10,0 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ + + + – – – – – – – – – – – – – Сандим-Д, % 2,5 1,0 0,1 – – – – – – – – – – – – Примечания. 1 – контроль – нейтрализатор; 2 – «+++» - активный, «++» – средний, «+» – слабый рост, «–» – отсутствие роста на агаризованных средах. 180 – – – – – – – – – – – – +++ +++ +++ +++ ++ + ++ ++ ++ + – – Использование биопрепарата Энатин позволило снизить обсемененность воздуха секции для молодняка свиней бактериями группы кишечной палочки на 100% и 87%, бактериями группы стафилококко-стрептококковой на 84% и 68%, общей микрофлорой на 78% и 58% (через двое и семь суток после обработки соответственно). При этом рост бактерий группы кишечной палочки практически отсутствовал и на 14-е сутки после обработки (таблица 3). Таблица 3 – Санитарно-показательная микрофлора воздуха животноводческой секции после обработки биопрепаратом Энатин Группа кишечной палочки Пробы КОЕ/ чашку тыс/м 3 До обра158±3,8 15,82 ботки После обработки через: 2 суток 3,1±0,9 0,31 7 суток 21,5±1,5 2,15 14 суток 27,5±1,5 2,75 эффектив ность,% Группа стафилококкострептококковая КОЕ/ тыс/м эффек3 чашку тивность,% 261±4,1 98 86,4 82,6 46,9±2,4 91,3±2,7 442±4,3 26,1 3,99 9,75 44,2 82 65 - Под действием Энатина снижается обсемененность поверхностей животноводческих станков, пола, стен бактериями группы кишечной палочки на 100–81%, бактериями группы стафилококко-стрептококковой – 89–69%, общей микрофлорой – 77– 35% (через двое и семь суток после обработки соответственно). Эффективность препарата через 14 суток после обработки в отношении группы кишечной палочки составляет 67–53%, в отношении стафилококко-стрептококковой группы – 34–24% (таблица 4). При сравнении с действием каустической соды на санитарно-показательную микрофлору отмечено, что через двое суток после обработки животноводческой секции каустиком происходит снижение обсемененности поверхностей станков, пола и стен бактериями группы кишечной палочки на 95–82%, бактериями группы стафилококко-стрептококковой – 78–73%, общей микрофлорой – 96–78%. Однако уже к 7-ми суткам эффективность каустической соды в отношении общей и санитарно-показательной микрофлоры снижается более чем в 2 раза, что свидетельствует о необходимости проведения повторных дезинфекционных мероприятий уже через несколько дней после обработки (таблица 5). 181 Таблица 4 – Общая и санитарно-показательная микрофлора поверхностей животноводческой секции после обработки биопрепаратом Энатин Поверхность животноводческого станка, КОЕ/см2 общая группа- группа споромикрокишеч- стафиобразуВариант флора ной па- лококкоющие лочки стрептококковая 3 2 2 2 nх10 nх10 nх10 nх10 До обработки 360±8,4 27±0,3 420±0,8 2,3±0,1 После обработки через: 2 сут 120±7,8 63±0,5 300±1,9 Эффективность обработки, % 77 100 85 7 сут 180±9,5 5,1±0,08 130±0,8 Эффективность обработки, % 50 81 69 14 сут 310±4,2 8,9±0,09 320±0,9 Эффективность обработки, % 14 67 24 2 2 Поверхность пола, КОЕ/см общая микрофлора 4 группакишечной палочки 2 спорогруппа стафи- образулококко- ющие стрептококковая 2 2 nх10 nх10 Поверхность стены, КОЕ/см общая микрофлора 4 nх10 nх10 300±4,0 12±0,7 290±4,1 1,5±0,03 140±9,5 - 41±0,9 250±3,2 250±12,1 группакишечной палочки 2 спорогруппа стафи- образулококко- ющие стрептококковая 2 2 nх10 nх10 nх10 nх10 520±7,0 3,2±0,04 19±1,2 - 2,1±0,05 180±2,7 2,8±0,05 80±1,4 53 100 180±12,9 1,3±0,02 86 78±1,5 52 100 130±1,5 340±13,1 0,5±0,02 89 5,1±0,1 36±1,7 60±1,1 40 89 320±10,5 4,4±0,04 73 190±4,8 35 84 10,0±3,7 460±10,7 1,5±0,02 73 14±1,3 2,7±0,1 34 12 26 - 63 182 53 Таблица 5 – Общая и санитарно-показательная микрофлора поверхностей животноводческой секции после обработки каустической содой Пробы Поверхность животноводческого станка, КОЕ/см2 общая группагруппа споромикрокишечстафи- образуфлора ной па- лококко- ющие лочки стрептококковая 3 2 2 2 nх10 nх10 nх10 nх10 До обработки 430±5,2 54±1,7 340±2,6 37±2,4 2 2 Поверхность пола, КОЕ/см общая микрофлора nх10 nх10 250±3,9 26±1,3 150±2,6 13±1,1 380±4,8 3,2±0,1 15±1,0 25±1,4 2,1±0,2 55±2,5 4,7±0,2 40±1,9 1,5±0,1 42±2,9 0,16±0,1 3,3±0,2 3,2±0,2 60±2,7 78 210±6,5 82 14±1,4 73 96±3,9 17±1,2 89 210±5,4 95 1,7±0,04 78 8,7±0,4 2,7±0,2 16 46 36 45 47 42 80±2,6 340±9,2 31±1,8 250±3,4 23±2,3 310±7,0 3,8±0,1 23±1,7 13±1,4 - - - - - 18 - - - 2 общая микрофлора nх10 nх10 4 группакишечной палочки спорогруппа стафи- образулококко- ющие стрептококковая 2 2 nх10 nх10 группа споростафи- образулококко- ющие стрептококковая 2 2 nх10 nх10 4 группакишечной палочки Поверхность стены, КОЕ/см 2 После обработки через: 2 сут 18±1,3 8,6±0,2 82±2,5 Эффективность обработки, % 96 84 76 7 сут 170±3,4 27±1,5 240±4,4 Эффективность обработки, % 60 50 38 14 390±4,1 58±2,0 410±6,9 сут Эффективность обработки, % 8 - 183 Таким образом, экологически безопасный биологический препарат Энатин характеризуется более высокой эффективностью и продолжительностью действия по сравнению с химическим дезинфектантом. Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования биопрепарата Энатин на основе спорообразующих бактерий B. pumilus БИМ В-263 для санации воздушной среды и поверхностей животноводческих помещений и профилактики инфекционных заболеваний молодняка животных. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ибрагимова, Д.М. Разработка режимов аэрозольной санации воздуха для профилактики инфекционных болезней норок в промышленном звероводстве: автореф. дис. … канд. ветер. наук: 03.00.07 / Д.М. Ибрагимова; Всерос. науч. исслед. ветер. ин-т. – Казань, 2000. – 22 с. Use of Bacillus subtilis as biological control agent / B. Krebs [et al.] // Journal of Plant Disease and protection. – 1998. – № 105. – P. 181–197. Шерстобоева, Е.В. Альтернатива химическим фунгицидам / Е.В. Шерстобоева, Н.К. Шерстобоева // Хранение и переработка зерна. – 2002. – № 3. – С. 16–19. Antibiotic production and biocontrol activity by Bacillus subtilis CL27 and Bacillus pumilus CL45 / C.Li. Leifert [et al] // J. of Appl. Bacteriology. – 1995. – Vol. 78, № 2. – P. 97–108. Biochemical and molecular characterization of Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis and Bacillus pumilus isolated with distinct antagonistic potential against Xanthomonas campestris pv. campestris / E.G. Wulff [et al] // Plant Pathology. – 2002. – Vol. 51, № 5. – P. 574. Пути оптимизации микробоценоза в помещениях животноводческих ферм в условиях Крайнего Севера / Тарабукина Н.П. [и др.] // Наука и образование. – 2002. – № 1. – С. 102–104. Микробная и пылевая загрязненность воздуха коровника / Зубов Н.Д. [и др.] // Ветеринария. – 1995. – № 3. – С. 27–29. Никитенко, В.Н. Вместо лекарств – бактерии / В.Н. Никитенко // Наука в СССР – 1991. – № 4. – С. 117–121. Тарабукина, Н.П. Научное обоснование и разработка системы ветеринарносанитарных мероприятий в животноводстве Крайнего Севера: автореф. дис. … д-ра вет. наук: 16.00.06 / Н.П. Тарабукина; Всерос. науч.-иссл.. ин.-т ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. – Москва, 2000. – 41 с. Тараканов, Б.В. Использование микробных препаратов и продуктов микробиологического синтеза в животноводстве / Б.В.Тараканов. – Москва: Агропромиздат, 1987. – 48 с. Intestinal flora in health and disease / H. Haenal [et al] // Progr. Food and Nutr. Sci. – 1985. – Vol. 21, № 1.– P. 64. Никитенко, В.Н. Вместо лекарств – бактерии / В.Н. Никитенко // Наука в СССР. – 1991. – № 4. – С. 117–121. Медведев, Н.П. Экологически безопасная аэрозольная дезинфекция в промышленных свиноводческих комплексах и на птицефабриках / Н.П. Медведев // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии: сб. науч. тр. / Всерос. НИИ 184 14 15 16 17 18 19 вет. сан. и гигиены; под науч ред. Н.П. Медведева. – Москва, 2001.– Т. 110. – С. 32–41. Возняковская, Ю.М. Микрофлора растений и урожай / Ю.М. Возняковская. – Л.: Колос, 1969.– 240 с. Тирранен, Л.С. Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии / Л.С. Тирранен. – Новосибирск: Наука, 1989. – 104 с. Методы испытания противомикробной активности дезинфицирующих средств / Временная инструкция № 4718: утв. Минздравом РБ, Главн. управл. гигиены, эпидемиологии и профилактики 24.12.98. – Минск, 1998. – 8 с. Ассонов, Н.Р. Практикум по микробиологии / Н.Р. Ассонов. – М: “Колос”, 1975. – 160 с. Поляков, Н.Р. Ветеринарная дезинфекция / А.А. Поляков.- 4-е изд. – Москва: Колос, 1975. – 560 с. Дмитриев, Е.А. Математическая статистика в почвоведении / Е.А. Дмитриев. – М.: МГУ, 1995. – 319 с. BIOLOGICAL DESINFECTANT ENATIN SVERCHKOVA N.V., LADUT'KO E.I., KOLOMIETS E.I. Laboratory of biological control agents Phytoprotective, growth-stimulating, disinfecting action of biopreparation Enatin based on sporulating bacteria Bacillus pumilus BIM B-263 was investigated, biological efficiency of Enatin in control of bacterial pathogens of plants and animals resulting in steady decline of pathogenic microbial population and sanitary-representative microflora of pigsties was demonstrated. УДК 579.64/63 НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ БИОПЕСТИЦИДОВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЗЕРНОБОБОВЫХ КУЛЬТУР ОТ БОЛЕЗНЕЙ Мандрик М.Н.1, Купцов В.Н.1, Гирилович Н.И.1, Дэй Э. 2, Коломиец Э.И. 1 1 лаборатория средств биологического контроля, ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» 2 лаборатория общей и прикладной биохимии, Химический центр, Лундский университет (Швеция) Отобраны микроорганизмы с высокой антагонистической активностью к патогенам зернобобовых культур, оценен их фитозащитный потенциал и проанализирована возможность продукции антимикробных метаболитов при культивировании штаммов на средах с осадком городских сточных вод (ОГСВ). Введение. Площади под зернобобовые культуры в Республике Беларусь с каждым годом увеличиваются и в настоящее 185 время составляют 205 тысяч гектаров – около 4,5 процента от всех возделываемых сельскохозяйственных культур. Однако прогнозируемые урожаи зернобобовых не всегда соответствуют практически полученным, что часто связано с потерями, вызванными различными болезнями, наиболее распространенными и опасными из которых являются антракноз [1], серая гниль [2], бурая пятнистость [3], фузариоз [4], бактериальный ожог [5] и др. Эффективное подавление возбудителей болезней может быть осуществлено путем использования в защите растений экологически безопасных микробных пестицидов, действие которых основано на антагонистических взаимоотношениях между микроорганизмами. Агенты биологического контроля способны полностью или частично ингибировать развитие патогенов, проявляя антибиоз [6], конкуренцию [7] либо паразитизм [8]. Отбор микроорганизмов с высокой антагонистической активностью, оптимизация среды для культивирования микроорганизмов и условий синтеза ими антимикробных метаболитов являются важными этапами на пути создания биопрепаратов. При выборе питательной среды основными критериями поиска являются полноценный компонентный состав, доступность и невысокая стоимость питательного субстрата. Канадскими учеными были проведены исследования по использованию ОГСВ в качестве дешевой среды для культивирования микроорганизмов-антагонистов [9]. Интерес к ОГСВ вызван его богатым составом, включающим органическое вещество (до 60–80%), азот и фосфор (до 3,5–6%), калий (до 0,4–0,7%) и различные микроэлементы. Применение в качестве среды для роста и продукции антимикробных метаболитов ОГСВ может не только снизить затраты на производство биопестицидов, но и способствовать решению экологических проблем, связанных с утилизацией ОГСВ, занимающих большие территории и загрязняющих окружающую среду. В связи с указанным настоящая работа направлена на выделение и скрининг микроорганизмов с высокой антимикробной активностью к патогенам зернобобовых культур и способностью к росту на средах с ОГСВ. Работа выполнена в Институте микробиологии НАН Беларуси и Университете г. Лунда (Швеция) в рамках международной программы «Visby Programme University Cooperation with Central-Eastern Europe». Материалы и методы. Выделение микроорганизмовантагонистов проводили из почвенных образцов методом накопительной культуры на целлюлозо- и лигнинсодержащих отходах и гуматах [10]. В качестве основного объекта исследования был отобран штамм Pseudomonas aurantiaca S-1, выделенный мето- 186 дом накопительной культуры на целлюлозо- и лигнинсодержащих отходах. Идентификацию культур антагонистов проводили по определителю Берджи [11]. Антимикробная активность определялась методом лунок [12]. В качестве тест-обьектов были использованы фитопатогенные грибы Colletotrichum lupini, Botrytis cinerea, Fusarium sp.и бактерии Pseudomonas syringae - возбудители болезней зернобобовых культур. Фитозащитное действие бактерий-антагонистов изучали in vivo на проростках люпина и сои при последовательной обработке семян и растений суспензией фитопатогенного микроорганиз6 ма (1·10 спор/мл) и жидкой культурой антагониста, разведенной в 10 раз. Результаты эксперимента учитывали на 7-е сутки по степени поражения и количеству больных растений. Степень пораженности проростков оценивали по 4-х бальной шкале, где 0 баллов – отсутствие симптомов болезни и 4 балла – полная гибель проростков. Развитие болезни рассчитывали по следующей формуле: Рб = ∑(а b) 100 , где Nk ∑(а·b) – сумма произведений числа растений на соответствующий им балл поражения k – высший балл шкалы учета N – общее количество растений в пробе. В качестве сырья для культивирования бактерий использовали три вида ОГСВ, предоставленные заводом по переработке сточных вод г. Лундтофта: ОГСВ до переработки, после анаэробной мезофильной переработки – метаногенеза, после ферментативно-анаэробной мезофильной переработки (проходит стадию ферментативной обработки с помощью гидролаз – амилазы, протеазы и целлюлазы и мезофильно-анаэробную переработку) и ОГСВ г. Минска. Состав ОГСВ г. Лундтофта: - до переработки: сухие вещества (СВ) – 68 г/л; органические вещества (ОВ) – 49.0 г/л; С-13.5; N – 4.2; P205 -3.97; K- 0.29; Ca – 10.0; Fe – 3.97; белок – 30.0; жиры -14.0; целлюлоза – 12.9 (% от СВ); - после переработки: CB – 40.0 г/л; ОВ – 20.0 г/л; % от СВ: С- 8.0; N – 18.5; P205-2.0; K- 0.2; Ca – 17.0; Fe – 2.0; белок – 15.5; жиры -7.5; целлюлоза – 10.0 (% от СВ); Состав ОГСВ г. Минска: СВ – 276.0 г/л, ОВ -184.6 г/л; С – 4.5; N – 2.8; P205 – 5.9; жиры – 16.4; целлюлоза – 41.2; общие сахара – 16.5; белок – 15.6; лигнин – 43.3 (% от СВ). 187 Для определения способности бактерий – антагонистов расти на ОГСВ, их культивировали в жидкой культуре на средах, содержащих в качестве источников азота и углерода 1% ОГСВ г. Лундтофта и ОГСВ г. Минска (из расчета на сухое вещество). В качестве контрольной среды был использован мясо-пептонный бульон (МПБ). Оценку ферментативной активности исследуемых культур проводили спектрофотометрически с использованием хромогенных субстратов Magazymes [13]. Статистическая обработка результатов проводилась при помощи программы Microsoft Excel. Результаты и их обсуждение. Скрининг микроорганизмов, проявляющих антимикробную активность к патогенам зернобобовых культур и способных к росту на трудноразлагаемых субстратах проводился в несколько этапов. Первоначальным критерием отбора была способность микроорганизмов, выделенных из почвы или полученных из накопительной культуры на лигноцеллюлозных отходах и гуматах (трудноразлагаемых компонентов ОГСВ), в опытах in vitro задерживать рост фитопатогенов люпина и сои. Было установлено, что из выделенных 423 микроорганизмов 10 штаммов проявляют различную степень активности к возбудителям антракноза, серой гнили, фузариоза люпина и бактериального ожога сои (таблица 1). Антимикробная активность изучаемых антагонистов проявляется в образовании зон нарастания на патоген и (или) зон отсутствия либо ослабления роста последнего. Подавление патогена за счет нарастания антагониста в большинстве случаев обусловлено гиперпаразитизмом. Зоны отсутствия либо ослабления роста тест-объектов связаны с диффузией в агаризованную среду выделяемых антимикробных метаболитов. Полученные нами результаты сопоставимы с данными, описанными бельгийскими и бразильскими исследователями при изучении антагонистических отношений микроорганизмов B. subtilis, P. fluorescens, Pichia ohmeri и Sporobolomyces sp. с фитопатогенными грибами B. cinerea и C. lupini [14, 15]. Наибольший интерес для дальнейшей работы представляют изоляты М-1, М-22 и S-1, отличающиеся в опытах in vitro высокой антимикробной активностью к B. cinerea и P. syringae, а также бактерии M-46, M-49, M-50, M-19, S-1, эффективные в отношении C. lupini, F. culmorum, F. oxysporum. Отобранные микроорганизмы идентифицированы как Bacillus sp. М-17, Bacillus sp. М-19, Bacillus subtilis M-1, Pseudomonas aurantiaca S-1, Streptomyces anulatus М-46, Streptomyces anulatus М-49, Streptomyces anulatus М-50. 188 Таблица 1 – Антимикробная активность изолятов в отношении патогенов зернобобовых культур Изолят 1 C. lupini 2 3 1 Диаметр зон задержки роста тест-культур, мм F. culmorum B. cinerea F. oxysporum 2 3 1 2 З 1 2 З P. syringae 2 3 1 M-1 19±1,2 11±1,2 0 0 14±0,9 0 16±1,3 8±1,1 22±1,1 6±1,2 0 0 0 19±0,7 0 M-22 18±1,0 10±0,9 0 0 12±0,7 0 14±1,0 6±0,7 34±0,9 5±0,8 0 0 0 17±1,0 0 М-17 25±0,8 0 0 17±1,1 7±1,2 0 16±0,8 0 16±1,1 0 0 26±1,2 0 0 М-19 30±0,9 0 0 20±1,1 0 0 25±0,9 5±0,9 0 21±0,9 0 0 36±1,1 10±1,2 0 M-20 26±1,0 0 0 0 15±1,0 0 19±0,8 0 0 25±1,0 0 0 25±1,2 0 0 0 S-1 0 29±1,1 0 0 27±1,2 0 0 27±1,2 0 0 26±0,9 0 0 32±1,0 0 М-46 0 26±0,7 0 0 18±1,2 0 0 17±0,9 0 0 10±1,1 0 18±0,9 0 0 0 0 35±0,8 0 0 0 0 0 0 0 0 35±1,0 0 0 М-47 30±0,6 М-49 0 24±1,1 0 0 14±0,8 0 0 18±0,6 0 0 14±1,2 0 14±0,6 0 0 М-50 0 23±0,6 0 0 20±0,8 0 0 18±1,1 0 0 11±1,2 0 20±0,8 0 0 Примечание. 1 – зона нарастания, 2 – зона отсутствия роста фитопатогена, 3 – зона слабого роста фитопатогена. 189 При обработке семян и вегетирующих растений (таблицы 2, 3) на всходах люпина и сои было продемонстрировано фитозащитное действие наиболее активных антагонистов. Таблица 2 – Эффективность фитозащитного действия отобранных культур микроорганизмов- антагонистов при предпосевной обработке семян люпина* Антагонисты Развитие болезни, % антракноз фузариоз Контроль (без обработки антагонистами) P. aurantiaca S-1 83 30 45 0 S. anulatus М-46 43 30 S. anulatus М-49 45 30 S. anulatus М-50 50 20 НCР0,05 1,7 1,1 Примечание. Обработку семян люпина проводили путем замачивания в течение 3 -х часов разбавленными в 10 раз жидкими культурами бактерий-антагонистов. Таблица 3 – Эффективность фитозащитного действия отобранных культур микроорганизмов- антагонистов при обработке вегетирующих растений люпина и сои* Антагонисты антракноз Развитие болезни, % серая бактериальгниль ный ожог 100 78 Контроль (без обработки антагонистами) P. aurantiaca S-1 100 48 64 38 B. subtilis M-1 100 8 21 B. subtilis M-22 100 9 25 НСР0,05 2,7 1,6 1,2 Примечание. Обработку всходов проводили путем опрыскивания разбавленными в 10 раз жидкими культурами бактерий-антагонистов в количестве 20 мл на 1 сосуд (15 растений). 190 Штаммы родов Streptomyces и Pseudomonas снижают заболеваемость растений люпина антракнозом в 2–3 раза. Бактерии Bacillus sp. M-1 и M-22 ингибируют развитие серой гнили люпина в 11–12 раз, а бактериального ожоги сои – в 3–4 раза. Штамм P. aurantiaca S-1 эффективен в отношении фузариоза, полностью подавляя развитие болезни на всходах люпина. В качестве сравнения можно отметить, что изученные китайскими исследователями бактерии - антагонисты гриба Colletotrichum уменьшают поверхность некротических пятен антракноза на плодах манго в среднем на 20–45% [16]. По данным бельгийских ученых фитозащитный эффект от обработки яблони бактериями B. subtilis GA 1 против серой гнили сохранялся на уровне 80% на протяжении свыше 10 дней [14]. Таким образом, отобранные микроорганизмы-антагонисты не уступают по своей антимикробной активности зарубежным аналогам и могут быть использованы для защиты зернобобовых культур от болезней грибного и бактериального происхождения. С целью увеличения конкурентоспособности разрабатываемых микробных биопестицидов важным является подбор среды для культивирования бактерий и продукции антимикробных метаболитов. Нами установлено (рисунок 1), что все исследованные микроорганизмы способны в той или иной степени утилизировать ОГСВ. Наиболее активно бактерии растут на необработанном ОГСВ, хотя их титр все же ниже (на 15–20%), чем на контрольной среде (МПБ). Исключение составляет штамм P. aurantiaca S-1, титр которого значительно превышает контроль. На средах с анаэробно и анаэробно-ферментативно переработанным ОГСВ развитие культур замедляется и титр клеток в некоторых случаях почти в 2 раза ниже, чем на МПБ. Различия в росте культур на ОГСВ до и после переработки обусловлены тем, что в процессе метаногенеза уменьшается количество легкоутилизируемых веществ в субстрате и микроорганизмы-антагонисты вынуждены использовать более труднодоступные соединения, такие как целлюлоза, гуматы, лигнин. Анализ антимикробной активности микроорганизмов на различных типах ОГСВ показал, что бактерии Bacillus sp. М-17, М-19, P.aurantiaca S-1, B. subtilis М-1, S. anulatus М-46 проявляют сходную антимикробную активность на средах с необработанными ОГСВ и МПБ (таблица 4). Высокая антимикробная активность при росте на ОГСВ после анаэробной и анаэробноферментативной переработки сохраняется только у штамма P. aurantiaca S-1, несколько ниже данный показатель для S. anulatus М-46 и Bacillus sp. M-19. 191 Рисунок 1 – Оценка способности бактерий-антагонистов к росту на средах с ОГСВ в качестве единственного источника углерода и азота 192 Таблица 4 – Антимикробная активность микроорганизмов-антагонистов, выращенных на средах с ОГСВ в отношении патогенов зернобобовых культур Диаметр зон задержки роста патогена, мм Микроорганизмы F. oxysporum 1 Bacillus sp М-17 НСР0.05 Bacillus sp М-19 НСР0.05 B. subtilis M-1 НСР0.05 P. aurantiaca S-1 НСР0.05 S. anulatus M-46 НСР0.05 S. anulatus M-49 НСР0.05 S. anulatus M-50 НСР0.05 22±0,8 22±0,8 0 25±1,2 23±1,1 16±0,9 15±1,2 2 B. cinerea 3 18±0,9 18±0,8 0,8 20±0,8 21±0,7 0,9 0 0 24±1,0 25±1,0 0,8 20±0,8 21±1,0 0,8 15±1,1 20±0,8 0,7 15±1,0 15±0,9 0,8 4 1 22±0,8 27±0,7 23±0,8 0 25±1,0 23±0,6 23±0,8 23±0,8 2 P. syringae 3 25±1,0 26±0,7 0,9 25±1,1 26±0,8 26±1,0 1 27±0,8 25±0,6 20±0,9 1,1 30±1,1 29±0,9 28±1,0 1,3 26±1,0 24±0,8 22±1,1 0,7 22±0,8 21±0,6 23±1,0 0,9 21±0,7 21±0,9 21±0,7 1 4 1 28±0,9 23±0,8 27±0,8 18±0,9 27±1,1 21±0,6 30±0,8 25±0,8 24±1,0 22±0,9 26±1,0 18±1,0 24±1,118±0,9 2 3 4 21±0,5 18±1,0 24±0,9 1 20±1,0 20±1,1 22±0,9 0,7 20±0,7 20±0,8 25±0,8 0,8 24±1,0 25±0,7 25±0,9 0,9 20±0,8 20±1,0 23±0,8 1 18±1,0 16±0,8 20±1,0 0,9 18±0,8 15±1,0 20±0,8 0,8 Примечание. Питательная среда, содержащая:1 – ОГСВ до переработки; 2 – ОГСВ после ферментативно-анаэробной переработки; 3 – ОГСВ после анаэробной переработки; 4 – МПБ. 193 У остальных микроорганизмов при культивировании на ОГСВ антимикробная активность существенно снижается. Был изучен спектр ферментативной активности штаммов P. aurantiaca S-1, S. anulatus М-46 и Bacillus sp.19, выращенных на ОГСВ и гидролизном лигнине, и установлено, что на трудноутилизируемых средах микроорганизмы образуют комплекс ферментов, отличающийся от продуцируемого на контрольной среде (таблица 5). Стрептомицеты на средах с ОГСВ активно продуцируют целлюлазу, протеазу и пероксидазу, а P. aurantiaca S-1 – целлюлазу, протеазу и лакказу, что объясняет способность культур разлагать трудноутилизируемые компоненты среды. При выращивании бактерий P.aurantiaca S-1 на ОГСВ г. Минска также достигнуты высокие показатели титра КОЕ и антимикробной активности культуры, не уступающие показателям на контрольной среде. Таблица 5 – Ферментативная активность бактерий-антагонистов на различных средах Ферментативная активность, Е/мл Штамм Bacillus sp. M-19 P.aurantiaca S-1 S. anulatus M-46 Среда 1 2 3 1 2 3 1 2 3 целлюлаза 0.03 0 0.02 0 0,05 0.01 0.3 0.03 0.4 протеаза амилаза 0.16 0 0.02 0.01 0 0.3 0.3 0.03 0.52 0.2 0.1 0.1 0.16 0.11 0.11 0.17 0.15 0.03 Ксиланаза 0.01 0 0.01 0 0 0 0 0 0 пероксидаза лакказа 0 0.05 0 0 0.05 0 0 0.08 0.01 0 0 0 0 0.05 0.05 0 0 0 Примечание: 1 – МПБ; 2 – гидролизный лигнин; 3 – ОГСВ после анаэробной переработки. Заключение. Таким образом, отобранные микроорганизмыантагонисты способны утилизировать ОГСВ и снижать развитие антракноза, фузариоза, серой гнили люпина и бактериального ожога сои, что позволяет рекомендовать их в качестве основы новых конкурентоспособных биопрепаратов с выраженным фитозащитным действием в отношении широкого спектра патогенов зернобобовых культур. 194 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Thomas, G.J. Fungicide seed dressings for lupin Anthracnose / G.J. Thomas, M.W. Sweetingham // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium. (Proceedings of the 9th International Lupin Conference 1999), Klink/Muritz, 20–24 June, 1999 / Ed. by E. van. Santen. – Klink/Muritz, 1999. – Р. 43–45. Response of australian sweet lupin to agronomic practices in Southern Chile / H.E. Penaloza [et al] // (Abstracts of the 8th International Lupin Conference 1996). – Asilomar, California, 11–16 May, 1996. – P. 108. Купцов, В.Н. Бурая пятнистость узколистного люпина и создание устойчивого селекционного материала / В.Н. Купцов // Науч. тр. по земледелию и растениеводству Белорус. науч.-исслед. ин-та земледелия и кормов. – Жодино: БелНИИЗиК, 1999. – Вып. 36. – С. 11–18. Дорожкин, Н.А. Болезни люпина / Н.А. Дорожкин, Н.И. Чекалинская. – Минск: Урожай, 1965. – 84 с. Soya (genetics, selection, seed breeding) / А.К. Leshchenko [et al] // Кiev: Naukova dumka. – 1987. – 240 с. Production of the antibiotic phenazine-1-carboxylic acid by fluorescent Pseudomonas species in the rhizosphere of wheat / L.S. Thomashow [et al] // Applied Environmental Microbiology – 1990. – Vol. 56. – P. 908–912. The Relationship between Anthracnose Severity and Population of Bacteria on the Phylloplane of the Tropical pasture Legume Stylosanthes scabra / S.D. Hetherington [et al] // Biological control. – 1995. – № 5. – P. 39–46. Whipps, J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere / J.M. Whipps // J. Exp. Bot. – 2001. – № 52. – P. 487–511. Production of biopesticides as a novel method of wastewater sludge utilization/disposal / V. Sachdeva [et al] // Water Sci. Technol. – 2000. – № 42. – Р. 211– 216. Герхард, Ф. Методы общей бактериологии / Ф. Герхард. – М.: Мир, 1982. – 536 с. Сеги, Й. Методы почвенной микробиологии / Й. Сеги. – М.: Колос,1983. – 296 с. Megazyme II. Soluble Chromogenic Substrates. Wicklow: Megazyme. – 2006. – 14 р. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology / S.T. Williams [et al] // Baltimore: Williams and Wilkins. – 1989. – Vol. 4. – Р. 25–45. Role of lypopeptides produced by Bacillus subtilis GA1 in the reduction of grey mould disease caused by Botrytis cinerea on apple / Y. Toure [et al] // J. Appl. Microb. – 2004. – № 96. – P. 1151–1160. Chitinolytic activity of actinomycetes from a cerrado soil and their potential in biocontrol / R.C. Gomes [et al] // Lett. Appl. Microb. – 2000. – № 30. – P. 146–150. Chuang, T.Y. Biological control of mango anthracnose / T.Y. Chuang, P.J. Ann // Plant Protection Bulletin Taipei. – 1997. – № 39. – Р. 227–240. NEW APPROACHES IN DEVELOPMENT OF BIOPESTICIDES FOR PROTECTION OF LEGUME CROPS AGAINST DISEASES MANDRYK M.N. 1, KUPTSOV V.N. 1, GIRILOVICH N.I. 1, DEY E. 2, KOLOMIETS E.I. 1 1 Laboratory of biological control, Institute of Microbiology, Belarus 2 Pure and Applied Biochemistry, Lund University, Sweden 195 Microorganisms-antagonists against pathogens of legume crops displayed phytoprotective action have been isolated. The possibility of the production of antimicrobial metabolites on the liquid medium containing sludge has been analyzed. УДК 579.64:631.46 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АРБУСКУЛЯРНЫХ МИКОРИЗНЫХ ГРИБОВ С СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫМИ КУЛЬТУРАМИ Алещенкова З.М., Картыжова Л.Е., Шестакова Е.А., Ланцевич А.А. лаборатория взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений В обзоре приведены данные о морфологии, генетическом контроле образования и физиолого-биохимических особенностях развития арбускулярных микоризных грибов (АМГ) в корнях растений, а также роли АМГ в жизнедеятельности сельскохозяйственных культур. Арбускулярная микориза (АМ) является важной и широко распространенной формой растительно-микробного взаимодействия, ее формируют более 80% всех видов наземных растений. Она способствует поглощению растениями минеральных веществ (особенно фосфорных). В свою очередь, растения обеспечивают арбускулярные микоризные грибы углеводами и липидами [23, 31, 73]. Ежегодно 5 биллионов тонн углерода поступает из растений в АМГ [24]. Все арбускулярные микоризные грибы отнесены к порядку Glomales. Систематическое положение Glomales проблематично, так как у АМГ отсутствует половая стадия в цикле развития, а споры содержат множество ядер. Выявление необычного полиморфизма р-РНК показало, что ядра грибной споры генетически не идентичны. Это позволило выдвинуть концепцию о межъядерном полиморфизме и отнести АМГ к гетерокариотическим организмам [33, 56, 64]. Эта точка зрения недавно была подвергнута сомнению [63]. Было выдвинуто предположение, что отдельные споры содержат однотипные ядра, для которых характерен внутриядерный полиморфизм [63, 64]. На основании филогенетического анализа последовательностей 18s pРНК и различных белков выдвинуто предположение, что происхождение Glomales не имеет тесной связи с Zygomycetes, куда их традиционно включали. В настоящее время пред- 196 ложено относить АМГ к отдельному типу Glomeromycota – древнейшей группе грибов. Они появились около 450 миллионов лет назад и способствовали колонизации суши растениями [11, 35, 39, 56, 64]. Арбускулярные микоризные грибы являются облигатными симбионтами, не растущими в культуре in vitro, существующими вне растения лишь в форме покоящихся спор. АМ положительно влияет на рост и развитие растения-хозяина, увеличивая его обеспеченность фосфором и другими элементами минерального питания, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам [2, 3, 8, 42]. Положительное влияние АМ на растения является результатом сложного молекулярного взаимодействия между двумя симбиотическими партнерами. Гены грибов и растений, регуляция их экспрессии, особенности обмена питательными веществами между симбиотическими партнерами активно изучаются в настоящее время и в дальнейшем могут быть использованы для определения экологической роли эндомикоризных грибов [12, 13, 15, 22, 27, 29, 43, 53, 55, 59, 65, 68, 81]. Арбускулярные микоризные грибы, хотя и не растут в чистой культуре, обнаруживают ограниченный рост гифов перед их контактом с корнями растений. Корневые эксудаты растенияхозяина индуцируют переход стадии асимбиоза в состояние пресимбиоза, которое характеризуется интенсивным разветвлением гиф. Во время колонизации корня АМГ проникают через внутреннюю стенку клеток внешнего кортекса и развивают внутриклеточную арбускулу. На этой симбиотической стадии они улучшают минеральное питание растения-хозяина и защищают его от биотических и абиотических стрессов [7, 9, 10, 19, 20, 36]. АМГ колонизируют апопласт и клетки кортекса корней растений. Положительный эффект эндомикоризных грибов может быть связан с активностью кислой и щелочной фосфотаз, которые были обнаружены в корнях растений, инокулированных Glomus mosseae [9]. Клетки кортекса корня высвобождают сахарозу, которая под действием кислой инвертазы превращается в глюкозу и накапливается грибами внутри апопластического отдела. Внеклеточные кислые инвертазы могут определять защитный статус растения [9, 31, 73]. Процесс развития арбускулярной микоризы можно условно разделить на три этапа: преинфекционные взаимодействия, формирование межклеточного мицелия, развитие внутриклеточных симбиотических структур [14, 38]. На первом этапе споры гриба прорастают в почве и образуют специальные структуры прикрепления – апрессории. На втором этапе из апрессорий внутрь корня начинают расти инфицирующие гифы, проникая че- 197 рез ризодермис в кортекс, где образуют разветвленный мицелий, колонизирующий межклеточные пространства. На третьем этапе в местах тесного контакта мицелия с клетками гифы проникают в клетки кортекса, где образуются арбускулы – разветвленные структуры, глубоко вросшие в растительную клетку и окруженные растительной (периарбускулярной) мембраной и редуцированной клеточной стенкой [14, 38]. Арбускулы являются местами наиболее интенсивного обмена метаболитами у партнеров, в частности, передачи в растение фосфатов, поглощаемых грибом из почвы. При образовании арбускул между стенками растительных клеток и гифами образуется матрикс (апопласт), который содержит полисахариды и ферменты, синтезируемые обоими партнерами. Арбускулы существуют в течение нескольких дней, затем лизируются хозяином, а взамен гифы в кортексе корня образуют новые арбускулы [9, 38]. При формировании арбускул в растительных клетках наблюдают ряд ультраструктурных изменений: уменьшается или полностью исчезает вакуоль; пластиды деградируют до состояния пропластид; резко возрастает количество α-тубулина. Ядро растительной клетки, содержащей арбускулу, увеличивается в размере и деформируется, а хроматин переходит в диффузное состояние, что говорит о высокой транскрипционной активности. Значительно возрастает количество телец Гольджи и эндоплазматического ретикулюма, которые участвуют в формировании периарбускулярной мембраны [10]. Везикулы, характерные для АМ, – сферические или овальные пузырчатые вздутия в середине или на концах гиф. Формы и размеры везикул сильно варьируют в пределах 25–60 до 120–150 мкм. Они обычно многоядерны, имеют связь с несущими их гифами [7, 9]. Вокруг корня формируется редкая сеть наружного мицелия с гифами диаметром 20–30 мкм, на концах которых образуются крупные покоящиеся споры. Именно за счет этих внешних гиф, выступающих за пределы корня на несколько сантиметров, резко увеличивается площадь поглощения корневой системы, что особенно важно в случае отсутствия корневых волосков у растений, как, например, у кукурузы [9]. Развитие симбиоза между АМГ и высшими растениями – сложный многоэтапный процесс, включающий в себя узнавание, передачу сигнала и взаимосвязь между грибом и корнями растений. Анализ высших растений с нарушенными функциями по отношению к микоризному взаимодействию может помочь в понимании генетических механизмов развития нормальной микоризы. 198 В последнее десятилетие активно ведется работа по выявлению растительных генов, контролирующих образование арбускулярной микоризы [10, 34, 36, 38, 46, 60, 80]. Отбор мутантов по этим генам проблематичен в связи с тем, что развитие АМ не приводит к новообразованиям и видимым морфологическим изменениям корней. Одним из исключений являются бобовые культуры, у которых нарушения арбускулярной микоризы часто выявляются у мутантов, не способных образовывать клубеньки. Так, у гороха были обнаружены гены sym8, sym9, sym19, sym 30, sym36, мутации по которым обладают двойным эффектом, нарушая образование клубеньков (Nod-) и микоризы (Myc- ) [10]. Были описаны мутанты растений с нарушением функций по отношению к микоризному взаимодействию на разных стадиях развития симбиоза [18]. Эти мутанты были классифицированы относительно определенных стадий развития заражения грибом корня: 1) Pre-Pen (стадия узнавания, ведущая к образованию апрессорий); 2) Pen (стадия проникновения, на которой происходит образование апрессорий, но гриб при этом не проникает через эпидермис); 3) Coi (гриб проникает внутрь клеток корня, но инфицирование останавливается в области кортекса); 4) Arb (мутанты не способны формировать арбускулы) [18]. Изучение мутантов растений по отношению к разным стадиям развития арбускулярной микоризы, также как и мутантов среди грибов, дает возможность лучшего понимания молекулярных механизмов ее развития. Известны две группы растительных мутаций, нарушающих -1 -2 -1 развитие арбускулярной микоризы: Myc и Myc . Фенотип Myc встречается у Нас - мутантов бобовых, неспособных осуществлять самую раннюю стадию развития клубеньков - скручивание корневых волосков. У этих мутантов формируются только апрессории, а в кортексе инфицирующие гифы элиминируются. Фенотип Myc-2 характерен для мутантов гороха, у которых блокировано развитие инфекционной нити в корневом волоске. При симбиозе этих мутантов с АМГ образуются апрессории и межклеточный мицелий, но при этом не происходит образования арбускул. У гороха описаны мутанты с недоразвитыми арбускулами, а у лядвенца – с их преждевренной деградацией [14, 70]. У суперклубенькообразующих (Nod++) мутантов сои число арбускул повышено в 2,5–4,5 раза, интенсивность развития межклеточного мицелия – в 1,5–3 раза [45]. Однако пока не удалось выявить растительные мутации, которые блокируют многие стадии развития арбускулярной микоризы, выявленные при изучении растений «дикого типа». Это может быть связано с тем, что при развитии эндомикоризы наиболее сложный морфогенез претерпевает ми- 199 кобионт, а роль растения-хозяина ограничена регуляцией некоторых стадий онтогенеза гриба [10, 70]. Микоризация стимулирует синтез ряда белков (микоризинов), которые отсутствуют в неинокулированных корнях [7]. Они составляют 4-5% от общего пула белков корней (белки перибактероидной и периарбускулярной мембран, некоторые ранние нодулины), которые в небольшом количестве синтезируется в растительных клетках, содержащих арбускулы. Арбускулярная микориза стимулируется липо-хито-олигосахаридными Nodфакторами. При инокуляции корней бобовых АМГ индуцируется синтез литических ферментов, деградирующих олигомеры хитина [38]. Растение строго контролирует развитие и активность микобионта в процессе формирования арбускулярной микоризы [7, 60]. Мицелий эндомикоризного гриба Glomus индуцирует в тканях корня процессы, сходные с реакциями защиты растения от патогенов: модификацию клеточных стенок, синтез фитоалексинов, каллозы, пероксидаз, литических ферментов и патогенрегулируемых белков [7, 44]. При развитии Glomus интенсивность защитных реакций ниже, чем при патогенезе, они менее продолжительны и более дифференцированы в пространстве и во времени [75]. При развитии АМ активность ферментов фенилпропаноидного пути (фенилаланин-аммоний лиаза, халькон-изомераза, халькон-синтаза, изофлавон-редуктаза), приводящих к синтезу флавоноидных фитоалексинов, ниже, она более локальна и наблюдается лишь на определенных стадиях симбиоза. Литические ферменты (хитиназы, глюканазы) активны только при инфицировании эпидермиса, а при колонизации кортекса и образовании арбускул активность большинства из них падает до уровня, меньшего, чем у неинокулированных растений. По-видимому, защитные реакции растения подавляются сигнальными факторами, выделяемыми грибом [75]. Гены рецепции ризобиальных Nod-факторов, близких к олигомерам хитина-основного компонента клеточных стенок грибов, являются общими как для образования арбускулярной микоризы, так и клубеньков. Показано, что Nod-факторы, активирующие образование клубеньков, стимулируют и микоризацию, а у бобовых синтез хитиназ, расщепляющих Nod-факторы, индуцируется и ризобиями, и АМГ [38, 72]. Получены доказательства, что хитиназы растений являются частью механизма, обеспечивающего проникновение эндомикоризного гриба внутрь корня. На упрощенной модельной системе, состоящей из суспендированной культуры ели Picea abies и одного из ее естественных грибных партнеров-Hebeloma crustulini- 200 forme, показано, что гриб непрерывно выделял связанные с хитином компоненты, которые индуцировали ряд быстрых защитных реакций в клетках ели, включая отток К+ и Cl- , приток Са2+ и Н+, фосфорилирование белков (63 кДа) и синтез Н2 О2 . С другой стороны, клетки растения способны уменьшать собственную защитную реакцию. Выделенные клетками ели хитиназы эффективно инактивировали связанные с хитином компоненты, формируя мономерные единицы N-ацетилглюкозоамина, которые не обладали способностью индуцировать защитную реакцию [57]. У люцерны (Medicago truncatula), микоризованной in vitro Glomus intraradices, обнаружен сложный пример экспрессии гена хитиназы в ответ на воздействие различных патогенных и симбиотических микроорганизмов. Высказано предположение, что только два из восьми генов хитиназы, представленных в M. truncatula, являются важными для образования АМ. Другие хитиназные гены экспрессируются в ответ на воздействие патогенов или инфекцию ризобиями. Особый интерес представляет ген Mtchit III-3. Данные его секвенирования вместе с результатами по гибридизации мРНК in situ подтверждают, что Mtchit III-3 белок становится активным в переарбускулярном пространстве, которое формируется между плазмолеммой клетки растения-хозяина и грибной арбускулой. Остается неясным, вовлечен ли Mtchit III-3 непосредственно в формирование высоко разветвленных структур арбускул путем воздействия на вновь образованные макромолекулы хитина или он расщепляет компоненты хитина и препятствует индукции защитных механизмов в клетке растенияхозяина во время формирования арбускул [28, 52, 72, 76]. В результате анализа профилей экспрессии 2300 генов, представленных в библиотеке микоризы, был идентифицирован новый микоризо-индуцируемый ген у Medicago truncatula, а также новый микоризо-специфичный фосфатный транспортер MtPT4, экспрессия которого осуществляется только в кортикальных клетках, содержащих арбускулы, а белок располагается в переарбускулярной мембране [37]. Установлено, что гены LjsymRK и Ljsym 15 Lotus japonicus ответственны за проникновение грибов в растение-хозяин, а ген Ljsym 15 также необходим для образования арбускул и установления симбиотических метаболических связей [16]. Возрастание уровня жасмонатов сопровождается клеточно-специфичной экспрессией генов, кодирующих ферменты биосинтеза JA и JAиндуцируемого белка, указывающие на то, что жасмонаты образуются и действуют внутри клеток, содержащих арбускулы. Показано, что колонизация корней растений АМ грибами приводит к повышению уровня жасминовой кислоты [31, 78]. 201 Специфические изменения в морфологии корня и уникальной физиологии развития арбускулярной микоризы дают основание для предположения о существовании АМ-специфичных регуляторных путей, приводящих к индукции АМ-специфических генов [10, 56]. Наличие защитной реакции микоризованных растений и анализ мутантов бобовых, дефектных по АМ и симбиотической азотфиксации, указывает на существование общих путей сигнальной трансдукции, регулирующих арбускулярную микоризу, бобово-ризобиальный симбиоз и взаимодействие с патогенами [56]. Роль арбускулярных микоризных грибов в жизнедеятельности растений. Возникновение симбиотических отношений между грибом и корневой системой растения-хозяина – весьма распространенное явление в природе. Многочисленными исследованиями установлено, что при инокуляции растений арбускулярными микоризными грибами происходит значительное усиление поступления в них фосфора [9, 58]. Гифы грибов способствуют лучшему усвоению растением почвенных растворов минеральных и органических веществ за счет увеличения всасывающей поверхности корня. Выявлено, что колонизация корней сельскохозяйственных культур арбускулярными микоризными грибами способствует улучшению использования фосфорных удобрений. Возрастание содержания в растениях фосфора, как усвоенного, так и мобилизованного АМГ, активизирует процесс азотфиксации (азотфиксация – процесс энергоемкий и непосредственно зависит от АТФ), и, как следствие, повышает урожай. Прибавка урожая растений от инокуляции арбускулярными микоризными грибами может превышать 200% [48]. Арбускулярная микориза играет огромную роль в выживании и развитии растений в неблагоприятных условиях окружающей среды. На почвах с пониженным содержанием фосфора растения, колонизованные АМГ, имеют более высокие показатели роста [7, 9]. Поступление фосфора из почвы в корни и стебли у микоризованных растений происходит гораздо быстрее. Это объясняется увеличением площади поглощения (до 7 раз) за счет удлинения грибных гиф [17]. Этот довод вполне уместен и для объяснения участия арбускулярной микоризы в транспорте других микроэлементов, необходимых для роста и развития растений. Фосфор в виде полифосфатов может также накапливаться и храниться в вакуолях арбускулярных микоризных грибов и при необходимости использоваться растениями [9, 17, 58, 71]. Jakoby e.a. изучали эффективность арбускулярной микоризы у различных сортов клевера и галеги восточной на почве с высоким содержанием фосфора (106 мг P/кг). Была показана воз- 202 можность применения эффективных штаммов АМГ (G. intraradices G.st7, G. fasciculatum G.st8) для различных сортов клевера и галеги. Штамм G. fasciculatum G.st8 увеличивал урожайность галеги на 22% в 2001 г., а в следующем засушливом году на 60% по сравнению с контролем (без инокуляции АМГ) [47]. Gouda e.a. изучали влияние АМГ и фосфатмобилизующих бактерий на урожайность зерна кукурузы. В первый год проведения экспериментов авторы не обнаружили заметных различий межу вариантами опыта, включающими инокуляцию растений фосфатмобилизующими бактериями и АМГ (как вместе, так и отдельно), в то время как в последующие годы более высокий урожай зерна кукурузы был связан с инокуляцией [40]. Показана неоднозначность влияния эндомикоризных грибов на продуктивность вики на дерново-подзолистой слабоокультуренной почве. Из 7-ми испытанных эндофитов 3 культуры р. Glomus значительно повышали урожай зеленой массы, содержание в ней фосфора и азота. Наибольший эффект получен при совместном применении их с Rhizobium в отсутствие минеральных удобрений [9]. Было установлено положительное влияние микоризации Zea mays L. штаммами Glomus (G. intraradices, G. geosporum, G. caledonium, G. mosseae) на агрономические и физиологические характеристики зерна в условиях теплицы на фоне различного содержания калия (0, 45, 90, 135 г/га). В первый год исследований влияние содержания К2SO4 не выявлено, в то время как во второй год показатели роста: индекс площади листьев, относительная скорость роста, скорость прироста урожая и др. были наиболее высокими в микоризованных растениях [30]. Проведена оценка влияния минеральных удобрений и мероприятий по защите растений на рост корней и образование АМГ у злаков и кукурузы. Повышение доз удобрений вело к повышенной плотности посевов, интенсивному росту растений и более высоким урожаям. Одновременно наблюдалось улучшение образования корней на площадях с оптимизированным азотным удобрением, отчетливо замедлялась дегенерация корней ко времени созревания. Удобрение не оказывало отрицательного влияния на долю корней, содержащих АМГ, даже при очень высоких дозах азота. Гербициды не оказали достоверного влияния на образование симбиоза. Применение листовых фунгицидов для борьбы с мучнистой росой привело к продолжительному стимулированию роста корней и образованию АМГ. Отмечена положительная корреляция между состоянием корневой системы, образованием структур АМГ и урожаем. Интенсивность образования АМГ после обработки регуляторами роста отчетливо повыша- 203 лась. Показано, что арбускулярная микориза не угнетается при интенсивной агротехнике и обеспечивает улучшение развития корневой системы [26]. В теплице на песке с 20%-ной добавкой стерильной почвы были выращены растения пшеницы и кукурузы, инокулированные различными видами Glomus (G. mosseae, G. fasciculatum). Через три недели вегетации определяли % зараженных растений, длину колонизованных корней на одно растение, количество везикул и арбускул на корнях. Изучено варьирование этих признаков в зависимости от видовой принадлежности растений и грибов, кислотности и состава среды. Наилучшее развитие микоризы наблюдали, когда большая часть внесенного под растения азота находилась в нитратной форме [79]. В корнях растений, культивируемых на пяти видах почв с высоким содержанием кальция, фосфатмобилизующей способностью и pH, установлено содержание структур АМГ и число эндомикоризных спор в исследуемых почвах. Инфекционные уровни корней составляли от 10 до 40%, что свидетельствовало о присутствии арбускулярных микоризных грибов во всех изучаемых образцах. Наиболее значительными факторами, влияющими на микоризные ассоциации в почвах были pH и содержание кальция [62]. Инокуляция Glomus macrocarpum повышает содержание фосфора в корнях, а также массу и содержание фосфора в надземной части ячменя, но не влияет на массу и содержание в растениях азота. При этом активность почвенных микроорганизмов, разлагающих целлюлозу и хитин, повышается, а разлагающих белок - понижается [77]. Растения вигны инокулировали арбускулярным микоризным грибом Glomus fasciculatum и Rhizobium sp. на почве с рН=7,2 и содержанием подвижного P2O5 – 28 кг/га. Вносили на фоне K25 по 50 и 100% от рекомендуемой дозы N75P50 под вигну сорта С-152. Наблюдение за динамикой изменения числа корневых клубеньков и их сухой массы, высоты растений и урожаем зерна показало, что число корневых клубеньков и их сухая масса были наибольшими при 50% дозы NP удобрений. Примерно эти же тенденции отмечены в отношении роста растений и урожая зерна, колонизации корней и споруляции микоризы. Содержание Р и N в растениях было наибольшим при двойной инокуляции, увеличился также вынос Cu, Zn и Fe. Рекомендовано снижение норм внесения азотных и фосфорных удобрений под вигну при двойной инокуляции [49]. Высокий уровень солей, низкий уровень воды часто являются лимитирующими для роста сельскохозяйственных растений. 204 Микориза улучшает адаптацию растений к стрессовым ситуациям (вредному влиянию высокой концентрации Н+, временному дефициту влаги) [7, 67]. Обработка растений АМГ может способствовать увеличению урожайности на засоленных территориях. Для определения параметров растительной солеустойчивости были использованы 4 линии модельного бобового растения Medicago truncatula (Jemalong, DZA315.16, F83OO5.5, DZA45.5). Тестировали следующие параметры: длину стебля, образование клубеньков и продукцию наземной биомассы. При различном содержании азота было выявлено биоразнообразие, проявляемое этими линиями растений. Medicago truncatula F83OO5.5 оказалась чувствительной к соли. При взаимодействии со штаммом T3 Sinorhizobium meliloti, который в свободно живущем состоянии является высокоустойчивым к содержанию соли, образовывались клубеньки различного фенотипа от маленьких белых до продолговатых розовых в зависимости от линии Medicago truncatula и концентрации NaCl. Растения линии F83OO5.5 не образовывали клубеньки при концентрации NaCl 75 мМоль, а DZA315.16 все еще продуцировал примордии клубеньков при 90 мМоль NaCl [54]. Изучение влияния арбускулярной микоризы на урожайность растений проводили на томатах, инокулированных Glomus mossea [41]. У микоризованных растений биомасса корней и стеблей, урожайность, общий уровень поглощения P, Z, Cu и Fe были выше. Влияние АМГ на минеральное питание, рост и продуктивность растений изучали на двух видах кукурузы – устойчивом и чувствительном к засухе. В микоризованных культурах значительно увеличивается содержание Na, K, P, Mg, Mn и Zn [61]. Присутствие АМГ позволяет получить высокий прирост биомассы кукурузы в условиях засухи, этот эффект отмечается как для видов чувствительных к засухе, так и для засухоустойчивых растений. Установлено влияние АМГ на адаптацию растения-хозяина (ячмень) к засухе. Ячмень выращивали в контролируемых условиях окружающей среды с предпосевной микоризацией семян (Glomus mossea, G. Intraradices) и без нее. Засуха влияла на осмотический потенциал и на степень колонизации микоризой. Взаимоотношения скорости колонизации и устойчивости к засушливым условиям были заметны между микоризованными растениями. Установлен, что G. intraradices лучше подходит для микоризации ячменя, чем G. mossea. Содержание хлорофилла в листьях ячменя было на 12% выше при симбиозе с G. intraradices [50]. 205 Арбускулярные микоризы оказывают значительное влияние на поступление и испарение воды растениями. В 70-е годы было выдвинуто предположение, что влияние АМГ на движение воды в растениях может быть связано с улучшенным поступлением фосфора. Позднее было показано влияние арбускулярной микоризы на размер устьиц и водный потенциал у разных видов растений. Было предложено несколько теорий о механизме влияния микоризы на движение воды в растениях: посредством гормональных изменений, за счет улучшенного контакта между почвой и корнями, путем стимуляции более сильного газового обмена, за счет увеличения площади поглощения воды благодаря внешним гифам [7]. Изучали влияние различных почвенных температур на рост хлопка, развитие арбускулярных микоризных грибов и содержание некоторых веществ в растении с целью выявления видов эндосимбионтов, которые могут адаптироваться к температурным колебаниям в почве в широких пределах, оставаясь эффективными в отношении симбиоза с растениями хлопка. Значительная прибавка в сухом весе побегов и длине корней наблюдалась при инокуляции 3-мя видами грибов при температурах 24, 30 и 36 °С, но не при 18 °С. У микоризованных растений в ткани листьев возрастала концентрация минеральных элементов [71]. Арбускулярные микоризы могут ослаблять действие почвенных патогенов на растения. Имеются сведения о взаимодействии микоризы и патогенов: продукции микоризой антибиотиков, влиянии на споруляцию патогенов, конкуренции за места инфекции и субстраты. Микориза увеличивает толерантность растений, но не обеспечивает полного контроля болезней [7]. Механизмы защитного действия АМГ включают в себя анатомические и морфологические изменения корневой системы, индуцируемые эндомикоризными грибами, изменение бактериального состава в ризосферной популяции микоризованных растений, локальное проявление растениями защитного механизма при воздействии АМГ [7]. Было установлено влияние микоризации на численность и состав бактериальной микрофлоры ризосферы просо. Растения крупного просо (Panicum maximum Jacq.) выращивали в сосудах в условиях вегетационного опыта в течение 5 месяцев при температуре 26–30 °С. Предварительно их инокулировали различными видами АМГ: Glomus fasciculatum (1), Gigantospora margarita (2), Sclerocystis dussii (3), Acaulospora laevis (4). В конце периода вегетации проводили подсчет общей численности бактерий в почве и содержание в ней различных физиологических групп бактерий. В почвах с первыми тремя типами микориз наблюдалось увеличение численности азотфиксирую- 206 щих микроорганизмов, бактерий, гидролизующих мочевину, а в почве с 2 и 3 – микроорганизмов, осуществляющих гидролиз крахмала. При инокуляции 1 и 4 увеличивалось количество актиномицетов, обладающих антагонистическими свойствами к фитопатогенам: Fusarium golanum и Pseudomonas solanacearum, а при инокуляции 2 – антагонистов фитопатогенных бактерий Xanthomonas vignicole [21]. Микоризация растений способствует повышению их устойчивости к загрязнению почвы тяжелыми металлами [30]. Арбускулярные микоризные грибы обеспечивают устойчивость растений, растущих на почвах с высоким содержанием Cu, Zn, Cd, Pb [30]. В почвах, загрязненных кадмием, в микоризованных корнях табака (инокуляция Glomus intraradices) обнаруживали Cd в меньшей концентрации, чем в немикоризованных растениях [69]. Инокуляция растений препаратами АМГ может быть эффективным подходом для целей фиторемедиации, так как арбускулярные микоризы модифицируют биологическую доступность радионуклидов, снижают токсичность тяжелых металлов для растений, не наносят вреда окружающей среде и способствуют увеличению продуктивности растений [7, 51]. Была показана целесообразность использования АМГ для фитомелиорации горных пород, в частности, марганцевых отложений г. Никополя. В исследовании использовали озимую пшеницу сорта Альбатрос Одесский и сою сорта Крепыш, которые были микоризованы штаммами G. mosseae. В условиях теплицы было установлено положительное влияние АМГ на продуктивность сухих побегов (10–20%), корней (10–16), количество бобов (7–24%), содержание P2O5 (12–18%), K2O (20–30%) в микоризованной сое. Урожай зерна озимой пшеницы возрос на 8–10 ц/га [25]. Анализ литературных данных показывает, что инокуляция различных сельскохозяйственных культур эффективными арбускулярными микоризными грибами в вегетационных и полевых опытах при строгом учете почвенно-климатических условий приводит к повышению урожая и содержания в нем фосфора. Актуальность проведения подобных исследований подтверждается, тем, что начатые в Великобритании, они приобрели в настоящее время большой размах в разных странах, в том числе, начаты и в Беларуси [1, 4–6, 8, 25, 40, 42, 45, 47, 48, 50]. Список литературы 1 Алещенкова, З.М. Создание эффективных микробо-растительных систем для повышения продуктивности бобовых культур / З.М. Алещенкова // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы четвертого Московско- 207 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 го междунар. Конгресса, Москва, 12–16 марта 2007 / Москва, 2007. – ч. 1. – С. 201. Борисов, А.Ю. Эффективность использования совместной инокуляции гороха посевного (Pisum sativum L.) грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями для повышения продуктивности растений в устойчивом экологически ориентированном земледелии / А.Ю. Борисов [и др.] // Доклады Россельхозакадемии. – 2004. – № 2. – C. 12–14. Влияние инокуляции растений клубеньковыми бактериями и эндомикоризным грибом Glomus intraradices на урожай различных сортов сои и содержание белка и масла в семенах / Н.М. Лабутова [и др.] // Докл. Рос. акад. сельхоз. наук. – 2004. – № 2. – С. 10–12. Влияние двойной инокуляции клубеньковыми бактериями и арбускулярными микоризными грибами на рост и развитие Glicine max / З.М. Алещенкова [и др.] // Проблемы и пути повышения эффективности растениеводства в Беларуси:материалы юбилейной научно-практической конференции, посвящ. 80летию образов. Института земледелия, Жодино, 29 июня 2007 г. / НАН Беларуси, РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию», «ИВЦ Минфина» / Минск, 2007. – С. 306–309. Гусева, Е.Г. Подбор растений, отзывчивых на микоризацию, для получения инокуляционного материала / Е.Г. Гусева // Бюл. ВНИИ с.-х. микробиол., – 1986. – № 43. Зольникова, Н.В. ВАМ-грибы в агрофитоценозах / Н.В. Зольникова // Разработка экологически безопасных методов ведения сельского хозяйства: сб. ст. / ОНЗ Россельхозакадемии. – С.-Пб., 1993. – С. 125–137. Молекулярные и клеточные аспекты развития арбускулярных микоризных симбиозов и их значение в жизнедеятельности растений / А.В. Крипка [и др.] // Цитол. и генетика. – 2002. – Т. 36, № 4. – С. 72–81. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями / Л.М. Якоби [и др.] // Сельскохозяйственная биология. – 2000. – № 3. – C. 94–102. Роль почвенных микроорганизмов в фосфорном питании растений / Г.С. Муромцев [и др.] // Успехи микробиологии. – 1985. – № 20. – С. 174–198. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами / Н.А. Проворов [и др.] // Журнал общей биологии. – 2002. – Т. 63, № 6. – С. 451–472. A new fungal phylum, the Glomeromycota: phylogeny and evolution / A. Schüssler [et al] // Mycol Res. – 2001. – Vol. 105. – P. 1413–1421. A plant receptor-like kinase required for both fungal and bacterial symbiosis / S. Stracke [et al] // Nature. – 2002. – Vol. 417. – P. 959–962. A receptor kinase gene of the LysM type is involved in legume perception of rhizobial signals / E. Madsen [et al] // Nature. – 2003. – Vol. 425. – P. 637–640. Analysis of arbuscular mycorrhizas using symbiosis-defective plant mutants / J.F. Marsh [et al] // New Phytologist. – 2001. – Vol. 150 – P. 517–532. Analysis of gene expression in arbuscular mycorrhizas: new approaches and challenges / P. Franken [et al] // New Phytologist. – 2001. – Vol. 150 – P. 517–523. Analysis of mycorrhizal mutants of Lothus japonicus / K.N. Demchenco [at al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. – St.-Peterburg, 18–26 July 2003. – P. 333. Anatomy and physiology of vesicular-arbuscular and nonmycorrhizal roots / D.E. Carling [et al] // Phytopatiology. – 1982. – № 72 – P. 1108–1114. Arbuscular mycorrhizal fungal colonization. Factors involved in host recognition / V. Gadkar [et al] // Plant Physiol. – 2001. – Vol. 127. – P. 1439–1499. Arbuscular mycorrhizal fungi elicit a novel intracellular apparatus in Medicago truncatula root epidermal cells before infection / A. Genre [et al] // Plant cell. – 2005. – Vol. 17, № 12. – P. 3489–3499. 208 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Arbuscular mycorrhizal fungi, rhizobia, available soil P and nodulation of groundnut (Arachie hypogaea) in Zimbabwe / Y. Lekberg [et al] // Agric. Ecosyst. Environ. – 2005. – Vol. 110, № 3/4. – P. 143–148. Bacteria and actinomycetes associated with pot cultures of vesicular-arbuscular mycorrhizas / J. Secilia [et al] // Can. J. Microbiol. – 1987. – Vol. 33. – № 12. Besser, K. Functional genomics of the mycorrhizal symbiosis using enhancer trapping in Medicago truncatula / K. Besser // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. – St.-Peterburg, 18–26 July 2003. – P. 331. Carbon export from arbuscular mycorrhizal roots involves the translocation of carbohydrate as well as lipid / B. Bago [et al] // Plant Physiol. – 2003. – Vol. 131. – P. 1496-1507. Carbon metabolism and transport in arbuscular mycorrhizas / B. Bago [et al] // Plant Physiol. – 2000. – Vol. 124. – P. 949–958. Chaykovska, L.A. The use of VAM fungi agricultural land recultivation / L.A. Chaykovska // Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on molecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 18–26 July 2003 / St.-Petersburg, 2003 – P. 340. Dehne, H.-W. Zum Einflub von Kulturmaßnahmen auf die VA Mykorrhizabildung und die Wurzelgesundheit in Getreide / H.-W. Dehne. // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. – 1986. – № 232. Development of bioinformatics tools to support EST-sequencing, in silico- and microarray-based transcriptome profiling in mycorrhizal symbioses / H. Kuester [et al] // Phytochemistry. – 2007. – Vol. 68, № 1. – P. 19–32. Differential expression of eight chitinase genes in Medicago truncatula roots during mycorrhiza formation, nodulation and pathogen-infection / P. Salzer [et al] // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2000. – № 13. – P. 763–767. Diffusible factors from arbuscular mycorrhizal fungi alter gene expression in Medicago truncatula / S. Kosuta [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.Peterburg, 2003. – P. 103. Del Val, C. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungus population in heavy metal contaminated soil / C. Del Val, J.M. Barea // Appl. and Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 2 – P. 718–723. Effects of altered levels of carbohydrates on the establishment of arbuscular mycorrhiza /S.Schaarschmidt [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003. / St.Peterburg, 2003. – P. 334. Evaluation the effects of four different mycorrhizae species of Glomus spp. and potassium on morphological and physiological characteristics of corn (Zea mays L.) / M. Barzali [et al] // Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on molecular plantmicrobe interactions, St.-Petersburg, 18–26 July 2003. / St.-Petersburg, 2003 – P. 340. Evidence for the evolution of multiple genomes in arbuscular mycorrhizal fungi / G. Kuhn [et al] // Nature. – 2001. – Vol. 414. – P. 745–748. Four genes of Medicago truncatula controlling components of a Nod factor transduction pathway / R. Catoira [et al] // Plant cell. – 2000. – Vol. 12. – P. 1647–1666. Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae / W. Remy [et al] // Proc Natl Acad Sci USA. – 1994. – Vol. 91. – P. 11841–11843. Franken, P. Molecular analysis of arbuscular mycorrhizal fungal development and function. / P Franken [et al]// Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on mo- 209 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 lecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 18–26 July 2003 / St.Petersburg, 2003 – P. 42. Functional genomics approaches to study the arbuscular mycorrhizal symbiosis / M.J. Harrison [et al] //Abstracts of 11-th International Congress on Molecular PlantMicrobe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.-Peterburg, 2003 – P. 43. Gianinazzi-Pearson, V. Plant cell responses to arbuscular mycorryzal fungi: getting to the roots of the symbiosis / V. Gianinazzi-Pearson // The Plant Cell. – 1996. – Vol. 8 – P. 1871–1883. Glomalean fungi from the Ordovician / D. Redecker [et al] // Science. – 2000. – Vol. 289. – P. 1920–1921. Gouda, A.S.H.A. Influence of phosphate solubilizing bacteria and vesicular mycorrhiza on maize plants / A.S.H.A. Gouda [et al] // Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on molecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 18–26 July 2003 / St.-Petersburg, 2003 – P. 339. Growth of mycorrhizal tomato and mineral acquisition under salt stress / N. Grazi, Al-Karaki // Mycorrhiza. – 2000. – Vol. 10 – P. 51–54. Harikumar, V.S. Influence of arbuscular mycorrhizal fungi Glomus microcarpum on phosphorus acquisition by sweet potato in P fixing soils./ V.S. Harikumar [et al] // Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on molecular plant-microbe interactions. St.-Petersburg, 18–26 July 2003 / St.-Petersburg, 2003 – P. 339. Harrier, L.A. The arbiscular myccorrhizal symbiosis: a molecular review of the fungal dimension // J. of Exper. Bot. – 2001. – Vol. 52, № 90001. – P. 469–468. Identification of a novel genetically controlled step in mycorrhizal colonization: plant resistance to infection by fungal spores but not extra-radical hyphae / R. David-Schwartz [et al] // Plant J. – 2001. – Vol. 27. – P. 561–569. Interaction between supernodulating or nonnodulating mutants of soybean and two arbuscular mycorrhizal fungy / P.C. Shrihari [et al] // Mycorrhiza. – 2000. – Vol. 10 – P. 101–106. Isolation of a premycorrhizal infection (pmi2) mutant of tomato, resistant to arbuscular mycorrhizal fungal colonization / R. David-Schwartz [et al] // Mol Plant Microbe Interact. – 2003. – Vol. 16. – P. 382–388. Jacobi, L. Influence of arbuscular-mycorrhizal fungi on the perennial legume grasses at the high phosphorus level in soil / L. Jacobi. [et al] // Molecular plantmicrobe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on molecular plant-microbe interactions, St.Petersburg, 18–26 July 2003 / St.-Petersburg, 2003 – P. 338. Jeffries, P. Use of mycorrhizae in agriculture / P. Jeffries // CRC Crit. Rev. Biotechnol. – 1987. –Vol. 5. – № 4. –124–132. Jose, M. Propagation of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi on moong (Vigna radiate L.) through nutrient film technique (NFT) / M. Jose, B.N. Johari // Curr. Sci. (India) – 1988. – Vol. 57 – № 3. – P. 217–223. Khalvati, M.A. Influence of two species of VAM fungi on water uptake under drought tolerance in mycorrhizae symbiosis with barley / M.A. Khalvati, W. Ritter // Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress on molecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 18–26 July 2003 / St.-Petersburg, 2003 – P. 338. Mycorrhozoremediation – an enhanced form of phitoremediation / A.G. Khan [et al] // Journal of Zhejiang University Science B. – 2006. № 7. – P. 503–514. Local induction of a mycorrhiza-specific class III chitinase gene in cortical root cells of Medicago truncatula containing developing or mature arbuscules / A. Bonanomi [et al] // Plant Biology. – 2001. – Vol. 3 – P. 194–199. Medicago truncatula DMI1 required for bacterial and fungal symbioses in legumes / J.M. Ane [et al] // Science. – 2004. – Vol. 303. – P. 1364–1367. 210 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 Medicago truncatula lines have different tolerance to salinity stress / O.N. Kurchak [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.-Peterburg, 2003 – P. 304. Molecular analysis of arbuscular mycorrhiza fungal development and function / P. Franken [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular PlantMicrobe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.-Peterburg, 2003 – P. 42. Molecular and cell biology of arbuscular mycorrhizal symbiosis / B. Hause [et al] // Planta. – 2005. – Vol. 221. – P. 184–196. Molecular biology of symbiosis. Recognition and developmental processes in mycorrhizae [Electronic resource] / Botanical Institute section Plant Physiology. – Dirk Redecker, 2006. – Mode of access: http://plantbiology.unibas.ch /molbio/molbio.htm. – Date of access: 14.03.2007. Mycorrhizal fungi can dominate phosphate supply to plants irrespective of growth responses / S.E. Smith [et al] // Plant Physiol. – 2003. – Vol. 133. – P. 16–20. Mycorrhizas: Gene to Function / J.H. Graham [et al] //Plant and Soil. – 2005. – Vol. 274. – № 1–2. – P. 79–100. Nonlegumes, legumes, and root nodules harbor different arbuscular mycorrhizal fungal communities / T. Scheublin [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, № 10. – P. 6240–6246. Nutritional, growth, and reproductive responses of maize (Zea mays L.) to arbuscular mycorrhizal inoculation during and after growth stress at tasseling / K.S. Subramanian [et al] // Mycorrhiza. – 1997. – Vol. 7 – P. 25–32. Occurrence and infectivity of endomycorrhizas in Egyptian soil. S.A.Z. Mahmond [et al] // Egypt. J. Microbiol. – 1985/1986. – Sept. Issue. Organization of genetic variation in individuals of arbuscular mycorrhizal fungi / T. Pawlowska [et al] // Nature. – 2004. – Vol. 427. – P. 733–737. Parniske, M. Molecular geneticsof the arbuscular mycorrhizal symbiosis / M. Parniske // Cur. Opin. in Plant Biol. – 2004. – Vol. 7. – P.414–421. Physiological interactions between symbionts in vesicular-mycorrhizal plants / S.E. Smith [et al] // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1988. – Vol. 39 – P. 221–244. Plant gene expression linked to early recognition stages in mycorrhiza ignition in M. truncatula / Weidmann [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.Peterburg, 2003 – P. 332. Plant growth, nutrient acquisition and mycorrhizal symbiosis of a waterlogging tolerant legume (Lotus glaber Mill.) in a saline-sodic soil / R. Mendoza [et al] // Plant and Soil. – 2005. – Vol. 275, № 1/2. – P. 305–315. Plant recognition of symbiotic bacteria two LysM receptor-like kinases / S. Radutoiu [et al] // Nature. – 2003. – Vol. 425. – P. 585–592. Potential contribution of arbuscular mycorrhizal to cadmium immobilization in soil / M. Janouskova [et al] // Chemosphere. – 2006. – Vol. 65, № 11. – P. 1959–1965. Developmental genetics and evolution of symbiotic structures in nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhizal / N.A. Provorov [et al] // J. Theor. Biol. – 2002. – Vol. 214. – P.215–232. Responses of three vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi at four soil temperatures and their effects on cotton growth / G.S. Smith [et al] // New Phytol. – 1986. – Vol. 104. – № 1. – Р.136–141. Differential expression of eight chitinase genes in Medicago truncatula roots during mycorrhiza formation, nodulation and pathogen infection / P. Salzer [et al] // Mol. Plant-Microbe Interact. – 2000. – Vol. 13. – P. 763–777. Effects of altered levels of carbohydrates on establishment of arbuscular mycorrhiza / S.Schaarschmidt [et al] // Molecular plant-microbe interactions: new bridges between past and future: Volume of abstracts: 11-th international congress 211 74 75 76 77 78 79 80 81 on molecular plant-microbe interactions, St.-Petersburg, 18–26 July 2003 / St.Petersburg, 2003. – P. 334. Schönbeck, F. Mycorrhiza und Pflanzengesundheit / F. Schönbeck // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt, Berlin-Dahlem. – 1986. – № 232. Supression of defence responses in mycorrhizal alfalfa and tobacco roots / Y. Kapulnik [et al] // New Phytologist. –1996. – Vol. 133 – P. 59–64. The chitinase Mtchit 3-3 of Medicago truncatula: a key enzyme in mycorrhiza formation? / M. Elfstrand [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.-Peterburg, 2003 – P. 44 The establishment of microorganisms in vesicular-arbuscular mycorrhizal and control treatments / R.N. Ames [et al] // Biol. Fert. Soils. – 1987. – Vol. 3 – №4. The putative role of jasmonates in mycorrhizal roots/ B. Hause [et al] // Plant Physiol. – 2002. – Vol. 130. – P. 1213–1220. Thompson, J.P. Soilless culture of vesicular-arbuscular mycorrhizae of cereals: effects of nutrient concentration and nitrogen source / J.P. Thompson // Can. J. Boot. – 1986. – Vol. 64 – № 10. – Р. 261–265. Transcriptional regulation processes during AM-development in the model plant Medicago truncatula / A.Wulf [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.Peterburg, 2003. – P. 332. Transcriptome profiling of early stage interactions between mycorrhizal symbionts in Medicago truncatula/ S. Weidmann [et al] // Abstracts of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Peterburg, 18–26 July 2003 / St.-Peterburg, 2003 – P. 331. INTERACTION OF ARBUSCULAR MYCORRHIZAL FUNGI WITH AGRICULTURAL CROPS ALESCHENKOVA Z.M., KARTYZHOVA L.E., SHESTAKOVA E.A., LANTSEVICH A.A. Laboratory of interactions of soil microorganisms and higher plants The review presents data on morphology, genetic control, physiologicalbiochemical aspects of development of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in plant roots, and AMF role in cultivation agricultural crops. УДК 606:63 ВЛИЯНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ МИКОРИЗАЦИИ НА РАЗВИТИЕ PISUM SATIVUM L. В УСЛОВИЯХ МОДЕЛЬНОГО ОПЫТА Алещенкова З.М., Сафронова Г.В., Суховицкая Л.А., Короленок Н.В. лаборатория взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений В модельных условиях установлено, что микоризация растений гороха как почвенно-корневым, так и корневым инокулятом способствует формированию 212 структур эндомикоризного гриба и увеличению биометрических показателей растений. Оба способа микоризации спонтанной популяцией АМГ могут быть использованы в практике возделывания гороха. Введение. В почвенно-климатических условиях Беларуси наиболее продуктивной и распространенной зернобобовой культурой является горох, т.к. он пластичен к условиям произрастания, его зерно не содержит алкалоидов и употребляется для скармливания животным и в пищу человеком. Высокими кормовыми достоинствами отличается и зеленая масса этой культуры. В Республике районировано 10 сортов гороха белорусской селекции: Белус, Агат, Беларус, Свiтанак, Кудесник, Белорусский неосыпающийся, Алесь, Натальевский, Устянский и Гомельский. Эти сорта скороспелы, болезнеустойчивы, экологически стабильны, имеют высокую семенную продуктивность и выращиваются как в чистых посевах, так и в гетероагроценозах [1]. Весьма важным направлением экологизации растениеводства является использование биотехнологий, ориентированных на применение биологических препаратов на основе микроорганизмов, улучшающих азотное и фосфорное питание растений [2–4]. Высокий уровень обеспечения азотом и фосфором особенно необходим современным интенсивным сортам растений, у которых в результате селекции усилена способность к потреблению этих элементов питания [5]. Многолетнее применение минеральных фосфорных удобрений увеличило количество фосфора в почве, т. к. коэффициент усвоения этого элемента из минеральных удобрений растениями в лучшем случае составляет 10–15%. Основная часть неиспользованного фосфора закрепляется в почве [6]. Фосфатмобилизующие микроорганизмы способны трансформировать фосфор из труднодоступных соединений. Наиболее распространенными среди фосфатмобилизующих микроорганизмов, трансформирующих фосфор из труднодоступных соединений, являются эндомикоризные грибы, которые образуют симбиотические ассоциации с 75–90% высших растений. Арбускулярные микоризные грибы (АМГ) играют ключевую роль в снабжении растений фосфатами, а также другими питательными веществами, которые гриб поглощает из почвы и передает растению «в обмен» на фотосинтаты: на долю АМГ приходится не менее 20% объема круговорота веществ в наземных экосистемах [7] Искусственная микоризация эффективными эндомикоризными грибами повышает урожай многих сельскохозяйственных растений и поступление в них фосфора из почвы и фосфорных удобрений. 213 Возникновение симбиотических отношений между грибом и корневой системой бобовых растений – весьма распространенное явление в природе. Установлено, что большинство из них имеет микоризу везикулярно-арбускулярного типа. Анализируя отзывчивость на микоризацию 16 коммерческих сортов гороха Martensson A. и Rydberg I. показали, что при инокуляции Glomus sp. масса растений увеличивалась в среднем на 12,3 ± 4,9%, а накопление в них фосфора – на 27,0 ± 4,45% [8]. Якоби Л.М. и др. показано, что 99 формообразцов гороха посевного из коллекции ВИР обладают способностью к образованию высокоэффективной арбускулярной микоризы. Инокуляция растений гороха грибом Glomus sp. (штамм № 8 из коллекции ВНИИ с.-х. микробиологии) приводила к достоверному повышению всех изученных агробиологических показателей, за исключением содержания в семенах азота (оно снижалось) и калия (не изменялось [9]. Одним из важных агроприемов повышения продуктивности зернобовых культур является использование биопрепаратов на основе высокоэффективных штаммов фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов. Наиболее перспективные биоагенты для создания многокомпонентных препаратов – арбускулярные микоризные грибы и Rhizobium, положительное действие которых проявляется в фосфатмобилизации, азотфиксации и стимуляции роста растений. Важно отметить эффективность двойной инокуляции – клубеньковыми бактериями и эндомикоризными грибами при возделывании бобовых культур. Совместное использование этих микроорганизмов приводит к увеличению числа активных клубеньков и их азотфиксирующей активности и, соответственно – улучшению азотного питания растений. В результате возрастают надземная масса растений и содержание в ней азота и фосфора, последнего – за счет деятельности микоризы [10]. Усиление роста и накопление сухой биомассы клевера красного получали при инокуляции АМГ и клубеньковыми бактериями. При этом усиливалось не только поглощение фосфора, но и калия [11]. Синергизм действия арбускулярных микоризных грибов и ризобий в отношении бобовых растений отмечается в работах ряда исследователей [11, 13]. Борисов А.Ю. и др. показали, что совместная инокуляция растений гороха клубеньковыми бактериями и АМГ, является более эффективной в полевых условиях, чем моноинокуляция и сравнима с применением полной дозы минеральных удобрений [14]. Некоторые исследователи считают, что действие эндомикоризных грибов и клубеньковых бактерий при двойной инокуляции сои примерно соответствует действию псевдомонад и клубеньковых бактерий: возрастает масса корневых клубеньков и количество «биологиче- 214 ского» азота в растениях на 22–30%, вынос азота растениями – на 18–28% и масса зерна сои – на 14–17% [15]. Имеются данные о положительном влиянии на фосфорное питание растений одновременной инокуляции их эндомикоризными грибами и фосфатрастворяющими бактериями, особенно при внесении в почву минеральных фосфорных удобрений. Mandhare et al. установили, что двойная инокуляция на фоне половинной дозы минеральных фосфорных удобрений обеспечивает наибольшую биомассу растений, наибольший вынос фосфора и наибольший процент колонизации корней микоризой, что свидетельствует об усилении усвоения почвенного фосфора и позволяет снижать дозы вносимых под посевы фосфорных удобрений [16]. Цель исследования – установить отзывчивость гороха на микоризацию АМГ, изучить влияние способов искусственной микоризации (корневой и почвенно-корневой) эндомикоризообразующими грибами на развитие гороха и определить наиболее эффективный из них. Объекты и методы исследования. Микробиологические объекты исследования: эндомикоризные грибы, микоризовавшие корневую систему растений гороха. Растительные объекты: горох сортов Агат и Миллениум. Почвенные объекты. Дерново-подзолистая почва, имеющая следующие агрохимические характеристики: рН=6,2; гумус – 1,9– 2,0%; Р2О5 – 17,0–20,0 мг/100 г; К2О – 19,0–22,0 мг/100 г почвы. Смесь дерново-подзолистой почвы с низинным торфом в соотношении 3:1. Исследования проводили по методике, изложенной в руководстве Лабутовой Н.М. [17]: – количественный учет развития АМГ в корнях растений проводили по модифицированному методу Травло; – споры эндомикоризных грибов выделяли из почвы методом мокрого просеивания; – выделенную спонтанную популяцию АМГ накапливали на почвенной смеси того же состава и подготовленной таким же образом, как и при постановке модельного опыта; – влияние разных способов инокуляции АМГ на развитие растений гороха изучали в светокультуре. Растения выращивали в течение 3-х месяцев. Образцы отбирали через 1,5 и три месяца после закладки эксперимента. Схема опыта: 1. контроль (без микоризации); 2. почвенно-корневая форма инокулюма АМГ; 3. корневая форма инокулюма АМГ. Результаты и их обсуждение. Степень насыщенности корневой системы гороха сортов Агат и Миллениум популяцией АМГ 215 определяли в фазе созревания бобов. Результаты микроскопирования их корней представлены в таблице 1 и на рисунке 1. Таблица 1 – Насыщенность корневой системы разных сортов гороха, выращенного в полевых условиях, структурами АМГ Номер образца Класс насыщенности 1 2 3 среднее частота встречаемости микоризной инфекции, % от числа просмотренных полей зрения Миллениум 100 100 100 100 5 Агат 100 100 100 100 5 частота встречаемости микоризной инфекции в форме гиф, % от числа просмотренных полей зрения Миллениум 47,0 39,5 30,0 38,8 2 Агат 32,0 27,5 35,0 31,5 2 частота встречаемости микоризной инфекции в форме арбускул, % от числа просмотренных полей зрения Миллениум 27,0 23,0 20,0 23,0 1 Агат 18,0 14,0 10,0 14,0 1 частота встречаемости микоризной инфекции в форме везикул, % от числа просмотренных полей зрения Миллениум 67,0 71,0 80,0 72,7 2 Агат 45,0 52,0 53,0 50,0 2 Сорт гороха А Б Рисунок 1 – Структуры АМГ в корнях гороха сортов Миллениум (А) и Агат (Б). 1 – везикулы; 2 – гифы (увеличение х 200) В результате спонтанной микоризации растений гороха в полевых условиях в корнях обнаруживаются структуры АМГ: ги- 216 фы, арбускулы, везикулы. У обоих сортов выявлена 100процентная встречаемость микоризной инфекции. Интенсивность развития гиф в корнях гороха сорта Миллениум составляла в среднем 38,8% (30–47%), обилие арбускул – 23% (20–27%), везикул – 72,7% (67–80%). Класс насыщенности корней гифами и везикулами – 2, арбускулами – 1. На этой же стадии развития в корнях гороха сорта Агат при такой же частоте встречаемости микоризной инфекции (100%) и тех же классах насыщенности корней АМГ, процентное содержание гиф, арбускул и везикул было ниже. Оно составляло в среднем 31,5% (гифы), 14% (арбускулы) и 50% (везикулы). Поэтому для искусственной микоризации семян гороха в модельном вегетационном опыте был отобран почвеннокорневой и корневой инокулят гороха сорта Миллениум. Информацию о численности и разнообразии АМГ в почве дает количественный и качественный учет спор. Микроскопирование ризосферной почвы гороха сорта Миллениум показало, что в ней чаще распространены споры коричневого цвета (светлые и темные), которые при одинаковой форме имеют разный размер (рисунок 2). Рисунок 2 – Споры эндомикоризных грибов, выделенные из ризосферной почвы гороха сорта Миллениум (увеличение х 200) Растения гороха сорта Миллениум, микоризованные почвенно-корневой и корневой формами инокулюма, выращивали в модельном вегетационном опыте на светоустановке в течение 3 месяцев. Как показало микроскопирование корней через 1,5 и 3 месяца, структурное состояние микосимбионтов при искусственной микоризации зависит от способа применения инокулята и сроков про- 217 ведения анализа, о чем свидетельствуют данные, представленные в таблице 2 и на рисунке 3. Таблица 2 – Влияние разных способов микоризации гороха сорта Миллениум на насыщенность его корневой системы структурами АМГ Класс Номер образца 2 3 среднее насыщенности вегетация растений гороха 1,5 мес частота встречаемости микоризной инфекции в форме гиф, % от числа просмотренных полей зрения Без микоризации (контроль) – – – – 0 Почвенно-корневая форма инокулюма АМГ 16,5 17,0 23,0 18,8 2 Корневая форма 23,0 20,0 29,0 24,0 2 инокулюма АМГ вегетация растений гороха 3,0 мес частота встречаемости микоризной инфекции в форме гиф, % от числа просмотренных полей зрения Без микоризации (контроль) – – – – 0 Почвенно-корневая форма инокулюма АМГ 33,5 26,0 32,5 30,7 2 Корневая форма 50,0 45,5 30,0 41,8 3 инокулюма АМГ частота встречаемости микоризной инфекции в форме арбускул, % от числа просмотренных полей зрения Без микоризации (контроль) – – – – 0 Почвенно-корневая форма – – – – 0 инокулюма АМГ Корневая форма 22,0 21,0 13,0 18,7 1 инокулюма АМГ частота встречаемости микоризной инфекции в форме везикул, % от числа просмотренных полей зрения Без микоризации (контроль) – – – – 0 Почвенно-корневая форма 15,0 14,0 11,0 13,3 1 инокулюма АМГ Корневая форма инокулюма АМГ 38,0 35,0 30,0 35,5 2 Способ микоризации 1 Установлено, что в стадии стеблевания (1,5 месяца вегетации растений) микоризная инфекция встречается только в форме 218 гиф (рисунок 3-А, 3-Б). Выявлено, что частота встречаемости микоризной инфекции в этой фазе на 5,2% выше в варианте с корневой формой инокулюма. В обоих вариантах класс насыщенности – 2. А Б В Г Рисунок 3 – Структуры АМГ в корнях гороха сорта Миллениум: А – почвенно-корневая форма инокулюма АМГ (1,5 мес); Б – корневая форма инокулюма АМГ (1,5 мес); В – почвенно-корневая форма инокулюма АМГ (3 мес); Г – корневая форма инокулюма АМГ (3 мес). 1 – гифы; 2 – везикулы (увеличение х 200) 219 Аналогичная тенденция отмечалась и на более поздней стадии развития растений (3 мес) (рисунок 3-В, 3-Г). Более высокие показатели микоризации также выявлены в варианте с использованием корневой формы инокулюма. Установлено, что микориза арбускулярно-везикулярного типа формируется только в этом варианте опыта. Частота встречаемости микоризной инфекции в корнях в форме гиф достигала 41,8% (класс насыщенности 3), в форме арбускул – 18,8% (класс насыщенности 1), в форме везикул – 35,5% (класс насыщенности 2). Анализ корней гороха, микоризованных почвенно-корневым инокулятом, арбускул в этой стадии развития растений не выявил. Однако, в сравнении со стадией стеблевания, в корнях возрастала частота встречаемости микоризной инфекции в форме гиф и имела место инфекция в форме везикул: 41,8 и 13,3% (класс насыщенности 2 и 1) соответственно. Получены данные, свидетельствующие о влиянии эндофитов на рост и развитие гороха, отмечено положительное влияние АМГ на биометрические показатели растений (таблица 3). Так, без микоризации высота гороха в фазе стеблевания достигала 8,6 ± 0,24 см, при почвенно-корневой микоризации – 9,4 ± 0,68, корневой – 11,4 ± 0,52 см. Через три месяца вегетации этот показатель превышал контроль на 30% (почвенно-корневая микоризация) и на 75% (корневая). Биомасса растений также возрастала при использовании корневой формы инокулюма (в среднем на 30%). Таблица 3 – Влияние АМГ на рост и развитие гороха сорта Миллениум Способ микоризации Вегетация растений гороха 1,5 мес высота, сухая биомассм са, мг Без микоризации (контроль) 8,6 ± 0,24 Почвеннокорневая форма инокулюма АМГ 9,4 ± 0,68* Корневая форма инокулюма АМГ 11,4 ± 0,52 Вегетация растений гороха 3 мес высота, сухая биомасса, см мг 209,0 ± 0,09 14,2 ± 0,71 297,4 ± 0,13 232,5 ± 0,10 18,4 ± 0,51 331,6 ± 0,11 275,2 ± 0,14 24,6 ± 1,21 379,8 ± 0,12 Примечание. * – данные недостоверны, Р > 5%. 220 Заключение. В модельном эксперименте получены данные о влиянии способов микоризации гороха популяцией абускулярно-микоризных грибов на его рост и развитие. Установлено, что культура наиболее отзывчива на искусственную микоризацию с применением корневой формы инокулюма АМГ. Полученные результаты дают основание для использования двух форм инокулюма в практике возделывания гороха. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Коваль, И.М. Сравнительная продуктивность и приемы повышения урожайности зернобобовых культур: автореф. дис. …канд. с.-х. наук: 06.01.09 / И.М. Коваль; Ин-т земледелия и кормов НАН Беларуси. – Жодино, 2001. – 12 с. Роль диазотрофов в азотном питании зерновых культур / Н.С. Алметов, В.В. Бердников, Е.Г. Волков, П.Н. Семенов: Бюл. / Всесоюз. науч.-исслед. инт удобр. и агропочвовед. – 2000. – № 113. – С. 85–87. Сафронова Г.В., Суховицкая Л.А. Эффективность инокуляции бобовых растений искусственными ассоциациями ризосферных бактерий // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2001. – № 3. – С. 57–61. P-Solubilizacni activita kmenu rodu Rhizobium / G. Storkanova [и др.] // Rostl. vyroba. – 1999. – Vol. 45, № 49. – Р. 403–406. Основы земледелия и растениеводства / В.С. Коссинский [и др.]. – М.:Колос, 1980. Минеев, В.Г. Биотехнологическое земледелие и минеральные удобрения / В.Г. Минеев, Т. Дебрецени, Т. Мазур. – М.:Колос, 1993. Каратыгин, И.В. Коэволюция грибов и растений / И.В. Каратыгин // Тр. бот. инта РАН. – 1993. – Т. 9. – С. 1–118. Martensson, A. Variability among pea varieties for infection with arbuscular mycorrhizal fungi / A. Martensson, I. Rydberg // Swedish J. Agric. Res. – 1994. – Vol. 24. – P. 13–19. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями / Л. М. Якоби [и др.] / Сельскохоз. биология. – 2000. – № 3. – С. 94–102. Маршунова, Г.Н. Эффективность инокуляции вики эндомикоризными грибами и Rhizobium / Г.Н. Маршунова // Бюл. ВНИИ с.-х. микробиол. – 1987. – № 47. – C. 8–11. Dimitrova, F. Influense of VAM and VAM-Rhizobium inoculations on growth and physiological phosphorus use efficiency of red clover grown in plioscene clays / F. Dimitrova, F. Taleva // Почвознан. агрохим. и екол. – 1998. – 33. – № 4. – Р. 59. Pandey, P.N. Response of Cowpea (Vigna fasciculate Linn.Walp.) to VAM fungi Glomus faciculatum (GF) and Rhizobium (Rh) inoculation under different sources and levels of phosphorus / P.N. Pandey, M.M. Verma, R.K. Jain // Proc. Nat. Acad. Sci, India. B. – 1998. – Vol. 68. – № 3–4. – Р. 273–278. Response of graund nut to the inoculation of VA-mycorrhizal fungi and/or Rhizobium in vertisols / G.B. Shasidhra [и др.] // J. Maharashtra Agr. Univ. – 1994. – Vol. 19, № 3. – Р. 464–465. Эффективность использования совместной инокуляции гороха посевного грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями / А.Ю. Борисов [и др.] / Докл. Рос. акад. сельскохоз. наук. – 2004. – № 2. – С. 12–14. 221 15 16 17 Шабаев, В.П. СО2-газообмен растений сои и симбиотическая азотфиксация при двойной инокуляции клубеньковыми бактериями с ризосферными псевдомонадами и эндомикоризными грибами / В.П. Шабаев, Ю.В. Смолин, В.А. Мудрик // Изв. РАН. Сер. биол. – 1995. – № 6. – С. 683–701. Mandhare, V.K. Effect of VA-mycorrhiza, Rhizobium and phosphorus on summer groundnut / V.K. Mandhare, H.B. Kalbhor, P.L. Patil // J. Maharashtra Agr. Univ. – 1995. – Vol. 20, № 2. – Р. 261–262. Лабутова, Н.М. Методы исследования арбускулярных микоризных грибов / Н.М. Лабутова. – С-Пб.: Всесоюз. науч.-исслед. ин-т с.-х. микробиол., 2000, 24 с. EFFECT OF ARTIFICIAL MYCORRHIZATION ON DEVELOPMENT OF PISUM SATIVUM L. IN MODEL EXPERIMENT ALESHCHENKOVA Z.M., SAFRONOVA G.V., SUKHOVITSKAYA L.A., KOROLYENOK N.V. Laboratory of soil microorganisms – higher plants interactions It was revealed in the course of lab model experiment that mycorrhization of peas cultivars with soil-root and root inocula promoted generation of endomycorrhizal fungal structures and increased biometric plant parameters. Both processes of mycorrhization with spontaneous population of AMF order may be applied in peas cultivation practice. УДК 606:63 ВЫДЕЛЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СПОНТАННЫХ ЭНДОМИКОРИЗНЫХ СТРУКТУР В КОРНЯХ ЯЧМЕНЯ И ЛЬНАДОЛГУНЦА, ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА СПОСОБОВ МИКОРИЗАЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛАБОРАТОРНОЙ МОДЕЛИ Суховицкая Л.А., Алещенкова З.М., Мохова С.В., Мельникова Н.В. лаборатория взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений Проведена количественная оценка микотрофности зерновой (ячмень) и технической (лен) культур и установлена более высокая отзывчивость ячменя на спонтанную микоризацию арбускулярными микоризными грибами (АМГ). В микровегетационном опыте получены предварительные данные о положительном влиянии искусственной микоризации ячменя сорта Гонар выделенными спонтанными АМГ. Получена накопительная культура спонтанных АМГ, ассоциированных с корнями ячменя. Введение. Интерес к использованию в земледелии и растениеводстве биологических препаратов на основе ризосферных микроорганизмов обусловлен важностью биологической азотфик- 222 сации и фосфатмобилизации для человека и окружающей среды и небольшими затратами, связанными с применением способов активизации микроорганизмов, осуществляющих эти процессы. Известно, что возделывание сельскохозяйственных культур сопровождается выносом из почвы большого количества питательных веществ, в том числе 70–120 кг/га азота и 25–40 кг/га оксида фосфора. Валовые запасы фосфора в почвах довольно значительны. Культурные почвы могут содержать 10, 20 и даже 30 т этого элемента на гектар пахотного слоя. Однако он находится там в водонерастворимой, малодоступной для растений форме. Это – разнообразные минеральные соединения, в основе которых лежат ортофосфаты кальция, железа, алюминия [1]. Проблема достаточного снабжения сельскохозяйственных культур фосфором может решаться разными путями. Один из них – применение почвенных микроорганизмов для интенсификации процесса фосфатмобилизации. Обширные микробиологические исследования выявили повсеместное распространение почвенных микроорганизмов (бактерий, грибов, актиномицетов), способных растворять трехкальциевый фосфат. В разных типах почв микроорганизмы, способные растворять фосфаты Са, могут составлять 5–95% от общей численности микрофлоры, причем корреляции между их количеством в почве и ее механическим составом, кислотностью, содержанием гумуса, азота и фосфора не обнаружено. Новый этап изучения микробиологической фосфатмобилизации наступил с установлением важной роли эндомикоризных грибов в снабжении растений почвенным фосфором [2]. Симбиоз высших растений с микоризными грибами и ассоциации корней растений и микоризных грибов обычны как для природных экосистем, так и сельскохозяйственных посевов. Существует экто- и эндомикориза. Роль эндомикоризы в снабжении растений фосфором оказалась настолько значительной, что ее по праву сравнивают с хорошо известной ролью клубеньковых бактерий – азотфиксаторов в снабжении бобовых растений азотом. Инокуляция растений эндомикоризными грибами повышает урожай многих сельскохозяйственных культур и поступление в них фосфора из почвы и фосфорных удобрений. В некоторых случаях инокуляция АМГ позволяет сэкономить 25–50% фосфорных удобрений [3]. Миколого-ботанические исследования свидетельствуют о широком присутствии структур АМГ в корнях различных сельскохозяйственных растений, выделены местные расы грибов и экспериментально подтверждена принципиальная возможность 223 улучшения фосфорного питания растений путем использования АМГ [4–7]. Накоплен экспериментальный материал, свидетельствующий о высокой эффективности инокуляции сельскохозяйственных растений смешанными культурами эндомикоризных грибов и ассоциативных бактерий. Так, при совместной инокуляции ячменя, пшеницы и кукурузы [8–11] ассоциативными азотфиксаторами рода Azospirillum и микоризообразующими грибами рода Glomus, урожай и накопление азота и фосфора в растениях повышались в большей степени, чем при использовании чистых культур микроорганизмов. У микоризованных растений кукурузы [12] и перца [13] биомасса растений и содержание в них фосфора была существенно выше при дополнительной инокуляции фосфатмобилизующими бактериями. В перечисленных исследованиях инокуляция ассоциативными бактериями (диазотрофными и фосфатмобилизующими) способствовала более активному развитию микоризных структур в корнях. Установлено также, что эндомикоризные грибы способствовали лучшей приживаемости азоспирилл [14] и фосфатмобилизующих бактерий [15] в ризоплане трав. Зольниковой Н.В. [16] показана перспективность использования Flavobacterium sp. Л30 и азоспирилл для повышения интенсивности образования микоризных структур в корнях кукурузы и суданской травы при совместной инокуляции. В то же время Белимов А.А. с соавт. [17] не выявили положительного влияния Flavobacterium sp. Л30 на развитие микоризы в корнях растений ячменя. Авторы связывают это с видовыми особенностями инокулируемого растения (ячмень), свойствами использованного для инокуляции штамма G. introrradices 7, а также с возможной специфичностью ассоциативных бактерий по отношению к виду эндомикоризного гриба. Ими же показано, что микоризация существенно влияла на выживаемость интродуцированных ассоциативных бактерий в ризоплане растений. Имеются сведения о стимулировании [18], отсутствии влияния [19] или ингибировании [20] развития эндомикоризных грибов рода Glomus некоторыми штаммами Pseudomonas, которые известны как антагонисты фитопатогенных грибов, о синергическом эффекте свободноживущего диазотрофа Azotobacter chroococcum и Glomus mosseae в отношении развития овсяницы тростниковой [21], пшеницы и кукурузы [22]. В настоящее время интенсивно изучаются различные аспекты формирования АМГ, ведется генетический анализ симбиотической системы, а также разрабатываются способы активации симбиоза растений с эндомикоризными грибами [23, 24]. Наименее изучены особенности взаимодействия АМГ с растения- 224 ми,недостаточно разработаны технологии получения препаратов, содержащих АМГ. Немногочисленные примеры, имеющиеся в научной литературе, касаются получения сбалансированных комплексов биологически активных соединений на основе грибовмикоризообразователей [25], применения в сельском хозяйстве отдельных штаммов грибов-микоризообразователей либо корневых препаративных форм на основе АМГ [2]. Учитывая высокую актуальность и значимость для сельскохозяйственного производства АМГ для повышения продуктивности и экологизации растениеводства, в лаборатории взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений Института микробиологии НАН Беларуси впервые в республике начаты исследования в указанном направлении. Цель исследования – дать количественную оценку распространения, частоты встречаемости и уровня спонтанной микоризной инфекции в корнях традиционно возделываемых в Беларуси культур – ячменя и льна-долгунца, установить влияние различных способов микоризации на развитие ячменя в условиях лабораторной модели. Объекты и методы исследования. - спонтанные арбускулярные микоризные грибы, ассоциированные с корневой системой ячменя и льна-долгунца; - ячмень сорта Гонар; лен-долгунец сорта Е-8 – объекты выделения спонтанных эндомикоризных грибов. Зерновое сорго, земляника садовая и плектрантус – растительные объекты для получения накопительных культур спонтанных АМГ, ассоциированных с корнями ячменя; - дерново-подзолистая, легкосуглинистая, развивающаяся на легком пылеватом суглинке, подстилаемом с глубина 50–60 см разнозернистыми песками почва следующей агрохимической характеристики: рНКС1- 6,4–6,6, гидролитическая кислотность – 1,8– 2,1, сумма поглощенных оснований – 8,7–9,2 мг/экв/100 г почвы, гумус по Тюрину – 2,53–2,61% ,Р2О5 – 250–280 и К2О – 260–280 мг/кг почвы. Для получения накопительных культур ВАМ грибов и изучения способов инокуляции ими ячменя указанный субстрат смешивали с низинным торфом, обедненным подвижным фосфором, в соотношении 2:1. Количественную оценку распространения АМГ, частоту встречаемости и уровень развития микоризной инфекции в корнях ячменя сорта Гонар и льна-долгунца сорта Е-8 устанавливали по модифицированному методу Травло, получение накопительных культур спонтанных АМГ, ассоциированных с корнями ячменя, проводили в соответствии с Методическими рекомендациями [26]. 225 Препараты мацерированных и окрашенных корней просматривали с помощью микроскопа МБИ-15 в проходящем свете при увеличении х (100). Фотографировали объекты цифровой камерой Olympus FE-130. Линейные увеличения на фотографиях рассчитывали по формуле: Г= 1,2 . βоб . βнас . βф/ок,, где 1,2 – увеличение тубусной линзы при работе с объективами, рассчитанному на длину тубуса 160 мм; βоб – увеличение применяемого объектива; βнас – увеличение оптовара насадки; βф/ок – увеличение применяемого фотоокуляра [27]. Интенсивность микоризации корней ячменя выделенными спонтанными АМГ грибами, а также влияние способов инокуляции (корневой и субстратно-корневой инокулят) на этот процесс изучали в микровегетационном опыте с использованием двучленной горшочной культуры. Подготовленный почвенно-торфяной субстрат расфасовывали в сосуды по 1,5 кг и стерилизовали при 1 атм. в течение 20 мин. трижды. После стерилизации сосуды выдерживали в течение месяца. Перед закладкой опыта почву увлажняли стерильной водой (60% от полной влагоемкости). Для питания растений в увлажненную почву вносили модифицированную смесь Прянишникова. Для полива растений использовали стерильную воду и один раз в неделю – рекомендованную для этих целей питательную смесь [26]. Семена ячменя стерилизовали 70% этиловым спиртом в течение 10 минут, затем на 30 минут заливали 30% раствором перекиси и промывали стерильной водопроводной водой [28]. Стерильные семена проращивали в термостате в течение суток. Проросшие семена микоризовали субстратно-корневым и корневым инокулятами. Схема опыта: 1. Контроль (без микоризации). 2. Микоризация субстратно-корневым инокулятом. 3. Микоризация корневым инокулятом. Растения выращивали в течение 3-х месяцев в условиях светокультуры. Повторность опыта – трехкратная. Определение интенсивности микоризации корневой системы ячменя проводили через 1,5 и 3 месяца вегетации растений. Математическая обработка данных – общепринятая для биологических исследований [29, 30]. Результаты и их обсуждение. С целью количественной оценки спонтанных АМГ, основанной на выявлении степени насыщенности корневой системы различными структурами АМГ, анализировали растения ячменя в фазу выхода в трубку и растения льна-долгунца – в фазу созревания. Показателем интенсив- 226 ности развития микоризной инфекции, характеризующей распространение в корнях АМГ, служила любая их структура - мицелий, арбускулы, везикулы, либо их сочетание, а количественные соотношения этих структур давали информацию об эффективности функционирования эндомикоризного симбиоза [26]. При микроскопировании корней учитывали три показателя: интенсивность развития микоризной инфекции в корнях, интенсивность развития арбускул и везикул (таблица 1). Таблица 1 – Количественное соотношение спонтанных структур АМГ в корнях растений ячменя и льна, % Растения Ячмень Лен Интенсивность микоризной инфекции 49 48,3 Обилие арбускул 42,3 24,3 Обилие везикул 27,6 10,3 Оценка спонтанной микоризации выявила, что микоризные структуры (везикулы (рисунок 1), гифы (рисунки 2, 3), арбускулы (рисунок 4)) обнаруживаются как у зерновой (ячмень), так и технической (лен) культур. Вместе с тем, почти при одинаковой интенсивности микоризной инфекции (49,0 и 48,3%) обилие арбускул и везикул значительно выше в корнях ячменя (в среднем в 1,7 и 2,7 раза соответственно), что свидетельствует о большей отзывчивости его на спонтанную микоризацию, а интенсивность развития АМГ, обусловленная обилием везикул, указывает на высокую способность гриба, инфицирующего анализируемую зерновую культуру, к выживанию и распространению в почве. В микровегетационном опыте с использованием двухчленной горшочной культуры проведена искусственная микоризация ячменя с использованием субстратно-корневого и корневого инокулюмов спонтанных АМГ. Через 1,5 и 3 месяца после микоризации выявляли уровень насыщенности корней ячменя различными структурами АМГ. Как видно из данных, приведенных на рисунках 5–7, интенсивность развития микоризной инфекции в первый срок определения при использовании субстратно-корневого инокулята составила 13,1%, корневого – 20,8%, частота встречаемости везикул 3 и 7,6% соответственно. По мере развития растений эти показатели значительно увеличиваются: интенсивность развития микоризной инфекции повысилась в 1,6 раза при обоих способах микоризации, частота встречаемости везикул – в 3,5 раза при использовании субстратно-корневого и в 2,5 раза – корневого инокулятов. 227 Рисунок 1 – Везикулы в корнях ячменя Рисунок 2 – Мицелий в корнях ячменя Рисунок 3 – Мицелий в корнях льна Рисунок 4 – Арбускулы в корнях льна Сравнительный анализ развития АМГ в корнях в зависимости от способов микоризации выявил преимущество корневого инокулята. В оба срока количественного учета степень насыщенности корневой системы ячменя различными структурами АМГ и интенсивность развития инфекции при использовании корневого формы инокулята превышали вариант с применением субстратно-корневой формы инокулята на 8–13%, частота встречаемости везикул – на 5–9% в зависимости от фазы развития растения. 228 Микоризация,% 1,5 месяца в егетации 3 месяца в егетации 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 1 2 Способы микоризации - субстратно-корнев ая микоризация - корнев ая микоризация Рисунок 5 – Интенсивность микоризной инфекции и обилие везикул в корнях ячменя при искусственной микоризации Рисунок 6 – Мицелий в корнях ячменя Рисунок 7 – Проросшая спора на корнях Искусственная микоризация существенно влияла на развитие растений. В сравнении с контролем сырой вес зеленой массы растений увеличился почти вдвое, сухой – на 74%, высота надземной части – почти на 20%. При менее существенной разнице по этим показателям (7,5, 14,0 и 7,5% соответственно) эффективность корневого инокулята также выше (таблица 2). 229 Таблица 2 – Влияние микоризации на рост и высоту надземной части растений ячменя Варианты микоризации 1,5 месяца вегетации 3 месяца вегетации сырой вес сухой вес высота рас- сырой вес сухой вес высотаразеленой зеленой тений, мм зеленой зеленой стений, мм массы, мг массы, мг массы, мг массы, мг Контроль без микори- 239,6±2,4 24,6±1,2 зации Субстратнокорневая 429,8±5,3 40,8±1,5 микоризация Корневая микориза468,4±4,5 45,0±1,8 ция 33,0±1,16 291,0±5,4 31,8±1,6 34,7±0,58 35,2±0,85 539,2±4,3 50,8±2,2 39,3±0,67 36,9±0,76 572,0±2,6 60,2±2,0 43,5±0,65 Образующие микоризу грибы – группа организмов, облигатно и непосредственно связанная с корнями растений. Наиболее простым способом размножения и сохранения эндомикоризных грибов является их культивирование в корнях растений, выращиваемых в стерильных субстратах. Для получения накопительной культуры спонтанных АМГ, ассоциированных с корнями ячменя сорта Гонар, использовали растения сорго, земляники и плектрантуса [26]. На примере одной из них (сорго) через три месяца вегетации установлено, что интенсивность микоризной инфекции составила 52,4%, а обилие везикул – 34,6% (рисунок 8), что свидетельствует о размножении и накоплении микоризного гриба в корнях этой культуры. Рисунок 8 – Везикулы в корнях сорго (3 месяца вегетации). 230 Заключение. Таким образом, в результате проведенной количественной оценки микотрофности растений ячменя и льна установлена более высокая отзывчивость зерновой культуры на спонтанную микоризацию АМГ. В микровегетационном опыте получены предварительные данные о положительном влиянии искусственной микоризации ячменя сорта Гонар выделенными спонтанными АМГ и эффективности использования для этих целей корневого инокулята. Получена накопительная культура спонтанных АМГ, ассоциированных с корнями ячменя. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Гинзбург, К.Е. Фосфор основных типов почв СССР / К.Е. Гинзбург // М.: Наука, 1981. – 284 с. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами / Н.А. Проворов [и др.] // Журн. общ. биол. – 2002. – Т. 63, № 6. – С. 451–472. Response of Cowpea (Vigna fasciculate Linn.Walp.) to VAM fungi Glomus faciculatum (GF) and Rhizobium (Rh) inoculation under different sources and levels of phosphorus / P.N. Pandey [et al] // Proc.Nat.ACAD.Sci., India. B. – 1998. – Vol. 68, № 3–4. – Р. 273–278. Почвенная микрофлора и фосфорное питание растений / Г.С. Муромцев [и др.] // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. – 1983. – Т. ХХVIII. – С. 22–27. Occurance and infectivity of endomycorrhizas in Egyptan soils / S.A. Mahmond [et al] // Egypt. J. Microbiol. – 1985(1986), Sept. Issue. – Р. 47–55. Distribution of vesicular-arbuscular mycorrizae in plants growing in a rever floodplain / N. Takayuki [et al] // Bull. JapSoc. Microb. Ecol. – 1994. – Vol. 9, № 3. – С. 109–117. Vesicular-arbuscular mycorrhizal association in plants of Kalakad Reserve Forest / V. Mohaankumar [et al] / India. “Angev. bot.”. – 1987, – Vol. 61, № 3–4. – P. 255–274. Synergistic effect of vesicular-arbuscular mycorrhizas and Azospirillum brasilense on the growth of barley in pots / N.S. Subba Rao [et al] // Soil Biol.Biochem. – 1985. – Vol. 17.31. – Р. 119–121. Baltruschat, H. Der Einfluss einer gemeinsamen Application von Azospirillum und VA Mukorrhza auf den Ertrag und die Nahrstoffaulfnahme von Sommergetreide / H. Baltruschat // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. – 1988. – № 245. – Р. 157. Response of wheat to dual inoculation with VA-mycorrhiza and Azospirillum, fertilized with NPK and irrigated with sewage effluent / S.I. Al-Nahidh [et al] // Arid soil Rech. Rehabilitation. – 1991. – Vol. 5, № 2. – P. 83–96. Interaction effect of VA mycorrhiza and Azospirillum on growth and uptake of nutrients in maize / K.R. Sreeramulu [et al] // Indian J. Microbiol. – 1998. – Vol. 28, № 3. – Р. 247–250. Influence of bacteria on growth and phosphorus nutrition of mycorrhizal corn / H. Vejsadova [et al] // J. Plant Nutr. – 1993. – Vol. 16, № 9. – P. 1857–1866. Synergistic interaction between VA mycorrhizal fungi and a phosphate solubilising bacterium in chilli (Capsicum annuum) / M.N. Sreenivasa [et al] // Zentralbl. Mikrobiol. – 1992. – Vol. 147, № 1–2. – P. 126–130. 231 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Diazotroph establishment and maintenance in the Sorghum-Glomus-Azospirillum association / R.S. Pacovsky // Can. J. Microbiol. – 1989. – Vol. 35, № 11. – P. 977–981. Increasing root colonization by bacteria due to inoculation with VA mycorrhial fungi in chilli (Capsicum annuum) / P.U. Krishnaraj [et al] // Zentralbl. Mikrobiol. – 1992. – Vol. 147, № 1–2. – P. 126–130. Зольникова, Н.В. ВАМ-грибы в агрофитоценозах / Н.В. Зольникова // Разработка экологически безопасных методов ведения сельского хозяйства: сб. ст. / С.-Пб:ОНЗ Россельхозакадемии. – 1993. – С. 125–137. Взаимодействие ассоциативных бактерий и эндомикоризного гриба с ячменем при совместной инокуляции / А.А. Белимов [и др.] // Микробиология. – 1999. – Т. 68, № 1. – С. 122–126. Comparative effect of Pseudomonas, strain F113 (antifungal biocontrol agent) and its isogenic mutant, strain F113G22 (impaired biocontrol ability) on spore germination and mycelial growth on Glomus mosseae under monoxenic conditions / M.T. Vidal [et al] // Proc.4th Euro. Symp.: Mycorrhizas in integrated systems, Granada, July 11–15, 1994 / Granada, 1996. – P. 673–676. Interactions between fluorescent pseudomonads and VA mycorrhizal fungi / T.C. Paulitz [et al] // New Phytol. – 1989. – Vol. 113, № 3. – P. 37–45. Interactions between plant growth promoting rhizobacteria and VA mycorrhizae / J.J. Germida [et al] // Abst.6th Int. SympMicrob. Ekol., Barselona, Sept. 6–11, 1992 / Barselona, 1992. – P. 87. Iwan, Hu Interaction between VA-mycorrhizal fungus and Azotobacter and their combined effect on growth of tall fescue / Hu Iwan // Plant and soil. – 1988. – Vol. 105. – P. 291–293. Nutrients a vability for maize and wheat plants oculated with Azotobacter and vam mycorrhizas / Y.Z. Iscae [et al] // 15th World Congress. Soil-Sci., Acapulco, July, 1994 / Trans. Vol. 4b. Commiss. 3, Poster Sess. – Mexico, 1994. – P. 28–29. Molecular Plant-Microbe Interactions: New bridges between Past and Future // Volume of Abstracts 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Petersburg, July 18–26 2003 / St.-Petersburg, 2003. – Vol. 4. – P. 330–337. Molecular Plant-Microbe Interactions: New bridges between Past and Future // Proceesings of 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Petersburg, July 18–26 2003 / St.-Petersburg, 2003. – Vol. 4. – P. 453–475. Влияние ризосферной бактерии Pseudomonas fluorescens 20 и эндомикоризного гриба Glomus mosseae на урожай и рост редиса в зависимости от условий минерального питания / В.П. Шабаев [и др.] // Агрохимия. – 1998. – № 6. – С. 34–41. Лабутова, Н.М. Методы исследования арбускулярных микоризных грибов / Н.М. Лабутова. – С-Пб.: Всесоюз. науч.-исслед. ин-т с.-х. микробиол., 2000. – 24 с. Микроскоп биологический исследовательский универсальный МБИ-15. // Техническое описание и инструкция по эксплуатации ЛОМО. – 1977. – 53 с. Азотфиксирующая активность в ризосфере и на корнях небобовых растений / О.А. Берестецкий [и др.] // Известия АН СССР. – 1983. – № 1. – С. 44–49. Рокицкий, П.Ф. Основы вариационной статистики для биологов / П.Ф. Рокицкий. – Минск: БГУ, 1973. – 221 с. Алгоритмы биометрии / Н.А. Плохинский // Минск: БГУ, 1980 – 150 с. 232 IZOLATION AND QUARTITATIVE ESTIMATION OF SPONTANEOUS ENDOMYCORRHIZAL STRUCTURES IN ROOTS OF BARLEY AND LONGFIBER FLAX, PRELIMINARY EVALUATION OF MYCORRHIZATION METHODS UNDER LABORATORY MODEL CONDITIONS SUKHOVITSKAYA L.A., ALESHCHENKOVA Z.M., MOKHOVA S.V., MELNIKOVA N.V. Laboratory of soil microorganisms-higher plants interactions Quantitative assessment of mycotrophicity of grain (barley) and technical (flax) crops was carried out and increased barley response to spontaneous AMF mycorrhization was established. Preliminary data on positive impact of artificial mycorrhization of barley, Gonar variety with spontaneous AMF isolates were obtained in microvegetation experiment. Enrichment culture of spontaneous AMF associated with barley roots was derived. УДК 579.2+602.3:579.86 МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ – ОСНОВА ПРЕПАРАТОВ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ Денисенко В.В., Найденко И.А. лаборатория молочнокислых и бифидобактерий Приведены литературные данные о молочнокислых бактериях, входящих в состав препаратов пробиотического действия, современные представления о некоторых механизмах полезного влияния пробиотиков на макроорганизм. Исследования последних десятилетий убедительно доказали, что симбиотическая микрофлора играет ключевую роль в нормальном функционировании кишечника, участвует в сложных метаболических процессах, питании и поддержании здоровья организма-хозяина [1–3]. Микрофлору желудочно-кишечного тракта условно подразделяют на автохтонную (индигенную) и аллохтонную (транзитную). Автохтонные микроорганизмы колонизируют определенные места обитания в организме, в том числе в желудочно-кишечном тракте. Аллохтонные микроорганизмы не могут колонизировать желудочно-кишечный тракт, за исключением патологических состояний макроорганизма. Большинство патогенных микроорганизмов относятся к аллохтонным микроорганизмам, тем не менее, некоторые патогенные микроорганизмы могут быть автохтонными для экосистемы и бессимптомно сосуществуют с хозяином до того момента, когда в системе возникнут нарушения [4]. 233 Желудочно-кишечный тракт колонизирован более чем 400 разными видами микроорганизмов, общая численность которых достигает 1013–1014 живых клеток. Молочнокислые бактерии являются одной из основных групп микробного ценоза желудочнокишечного тракта человека и животных и встречаются во всех его отделах, начиная от ротовой полости и заканчивая толстым кишечником. Преобладание тех или иных бактерий в разных отделах желудочно-кишечного тракта зависит от ряда факторов, таких как рН, перистальтика, окислительно-восстановительный потенциал, секреция слизи, доступность питательных веществ, антагонизм бактерий и др. В желудке и верхнем отделе тонкого кишечника численность микроорганизмов не превышает 103–104 клеток в 1 мл. Такое сравнительно небольшое количество симбиотических микроорганизмов связывают с относительно активной перистальтикой в этих отделах желудочно-кишечного тракта и низким значением рН в желудке. Основными представителями микробного ценоза здесь являются кислотоустойчивые молочнокислые бактерии родов Lactobacillus и Streptococcus [4]. В дистальном отделе тонкого кишечника (подвздошной кишке) микрофлора имеет сходство с микрофлорой толстого кишечника и составляет 107–108 живых клеток в 1 мл содержимого кишечника. Толстый кишечник является главным местом микробной колонизации в организме человека и животных, что обусловлено слабой моторикой кишечника и низким окислительновосстановительным потенциалом. В толстом кишечнике обитает огромное количество микроорганизмов разных видов, преобладающими являются бактерии родов Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus. Содержание микроорганизмов в 1 г фекалий достигает 1011–1012 живых клеток [3, 4]. Кишечный эпителий и нормальная кишечная микрофлора являются основным барьером, препятствующим проникновению в организм из просвета кишечника патогенных бактерий, антигенов и других чужеродных субстанций. В норме этот барьер является интактным и обеспечивает нормальное функционирование кишечника. В случае повреждения эпителиальных клеток и нарушения микроэкологического баланса изменяется проницаемость кишечника, создаются благоприятные условия для инвазии патогенных микроорганизмов, чужеродных антигенов и т.д. Факторами, способствующими нарушению состава микрофлоры (дисбактериозу), могут являться прием антибактериальных препаратов, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания и другие стрессовые воздействия. При дисбактериозах кишечник колонизируют условнопатогенные микроорганизмы, которые оказывают отрицательное 234 влияние на структуру слизистой оболочки, изменяют скорость обновления эпителиального покрова и процессов метаболизма, вызывая и поддерживая воспаление. Токсичные продукты расщепления усиливают проницаемость кишечной стенки, приводят к усилению перистальтики и диспептическим явлениям, что с течением времени способствует формированию хронических заболеваний кишечника. Одним из наиболее безопасных и эффективных методов коррекции и профилактики дисбиотических расстройств является применение пробиотиков – живых микроорганизмов и продуктов их метаболизма, которые при назначении в достаточном количестве оказывают положительное воздействие на здоровье организма-хозяина [5, 6]. Молочнокислые бактерии как важнейшие представители микробного ценоза желудочно-кишечного тракта человека и животных чаще других микроорганизмов используются в составе пробиотических препаратов. Лечебно-профилактическая эффективность препаратов пробиотического действия связана, прежде всего, с высокой конкурентной способностью штаммовпробиотиков, способностью вытеснять нежелательные, патогенные и условно-патогенные микроорганизмы из состава кишечной популяции, ингибировать адгезию патогенных микроорганизмов на поверхности клеток кишечного эпителия. Пробиотики обладают также иммуномодулирующими свойствами, радиопротекторным, противоопухолевым действием, участвуют в обменных процессах макроорганизма. Клинические исследования показали эффективность использования пробиотических микроорганизмов для профилактики и лечения энтероколитов, ротавирусной инфекции, язвенных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, снижения риска возникновения раковых заболеваний, пищевых аллергий [7, 8]. Микроорганизмы, на основе которых создаются биопрепараты, должны удовлетворять следующим основным требованиям: культура должна быть идентифицирована до вида по фено- и генотипическим признакам; предпочтение должно быть отдано представителям нормофлоры того организма, для которого разрабатывается препарат; штаммы должны быть непатогенны, нетоксичны, иммунологически безопасны, эти признаки должны быть стабильны; если установлен факт антибиотикорезистентности, то должна быть установлена природа устойчивости; штаммы должны обладать выраженными антагонистическими свойствами по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, но не должны угнетать представителей нормофлоры; штаммы должны продуцировать полезные для человека биологи- 235 чески активные вещества; оказывать полезное воздействие на организм хозяина, подтвержденное лабораторными исследованиями и клиническими испытаниями. При разработке комплексных препаратов-пробиотиков важное значение имеет совместимость штаммов, которые предполагается включать в препарат [9, 10]. В качестве пробиотических микроорганизмов, отвечающих перечисленным требованиям и обладающих клинически подтвержденным терапевтическим эффектом, широко используются молочнокислые бактерии рода Lactobacillus: штаммы L. acidophilus NCFM, L. casei Shirota, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus GR-1, L. reuteri MM53, L. fermentum RC-14, L. plantarum 299v [11–16]. В России набольшее распространение получили пробиотики на основе штаммов L. plantarum 8PA3, L. fermentum 90-TC4 и L. acidophilus 317/402 [17]. Помимо лактобацилл в состав пробиотических препаратов включают микроорганизмы родов Streptococccus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, Bacillus, Saccharomyces, а также Escherihia coli и др. [18]. На основе монокультур или комбинаций разных штаммов молочнокислых бактерий, а также в комплексе с другими микроорганизмами (чаще всего с бифидобактериями), создан широкий спектр биологических препаратов и пищевых добавок (Аципол, Ацилакт, Наринэ, Лактобактерин, Нормофлор, Витабаланс–3000, Экстралакт, Симбитер, Бактрил, Бифилак, Биовестин-лакто, Полифлор, Полибактерин, Acicur, Biolactyl, Lactobacil, Ribolac, Linex, Proflor, Omniflora, Zyma, Synerlac, Ortobacter и др.), кисломолочных продуктов. Рынок препаратов пробиотического действия стремительно расширяется, разрабатываются препараты новых поколений (препараты-пробиотики метаболитного типа, комплексные препараты про- и пребиотического действия (синбиотики), мультипробиотики и др.) [19–21]. Одной из важнейших задач при коррекции дисбактериоза является удаление патогенных микроорганизмов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Особое внимание при подборе штаммов, перспективных для создания пробиотиков, следует уделять антимикробной активности против патогенных микроорганизмов. В реализации механизма антагонистической активности молочнокислых бактерий ведущая роль отводится снижению рН за счет накопления молочной и других короткоцепочечных жирных кислот, а также продукции перекиси водорода, диацетила, бактериоцинов, молекул пептидной природы, 236 не относящихся к бактериоцинам, и других соединений с бактерицидным действием [22–24]. Молочная кислота – основной метаболит, продуцируемый молочнокислыми бактериями. Показано, что молочная кислота вызывает увеличение проницаемости наружной мембраны таких грамотрицательных бактерий как Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, усиливает чувствительность микроорганизмов к лизоциму, поверхностно активным веществам и бактериоцинам, что некоторые авторы связывают с потерей наружной мембраной липополисахаридов [23, 24]. Помимо молочной кислоты многие молочнокислые бактерии продуцируют в достаточном количестве уксусную кислоту. Перекись водорода проявляет ингибирующий эффект как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Поскольку молочнокислые бактерии не образуют каталазу, Н2О2 аккумулируется в окружающей среде. Летальный эффект перекиси водорода на патогенные бактерии может быть опосредован инактивацией биомолекул посредством супероксиданионной цепной реакции или лактопероксидазо-тиоцианатной системы. Диацетил (2,3–бутандиол), синтезируемый определенными видами и штаммами молочнокислых бактерий из пирувата, ингибирует рост грамотрицательных бактерий и менее активен в отношение грамположительных бактерий [25]. В последнее время пристальное внимание исследователей привлекают бактериоцины молочнокислых бактерий – соединения пептидной природы, обладающие бактерицидным действием преимущественно на близкородственные виды. В настоящее время имеются данные о том, что бактериоцины Pediococcus pentosaceus и P.damnosus ингибируют рост не только грамположительных, но и таких грамотрицательных бактерий как Yersinia enterocolitica, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens. Бактериоцины низин (продуцируется Lactococcus lactis) и педиоцин (продуцируется Pediococcus pentosaceus), антагонистически активные в отношении широкого спектра пищевых патогенных бактерий, нашли практическое применение [22]. В культуральной жидкости многих молочнокислых бактерий обнаружены также нечувствительные к действию протеиназ соединения с антибактериальной активностью в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных патогенных микроорганизмов, в том числе Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae, Helicobacter pylori. Сведений о природе этих веществ, не являющихся бактериоцинами, и механизмах их антибактериального 237 действия немного. Среди низкомолекулярных антагонистически активных метаболитов молочнокислых бактерий выявлены соединения с ароматической и гетероциклической структурой, в том числе бензойная кислота, мевалонлактон и др. [24, 26, 27]. Важным свойством бактерий-пробиотиков является способность к адгезии на энтероцитах – клетках кишечного эпителия, что предотвращает элиминирование бактерий из кишечника и, таким образом, обеспечивает их конкурентное преимущество в экосистеме желудочно-кишечного тракта. В то же время адгезия патогенных микроорганизмов на клетках кишечного эпителия и кишечной слизи играет ключевую роль в патогенезе. В связи с этим особое внимание уделяется подбору таких пробиотических штаммов, которые ингибировали бы адгезию патогенных микроорганизмов к тканям кишечника. Исследования адгезивных свойств пробиотических бактерий к энтероцитам проводятся, как правило, на модели клеточной линии кишечного эпителия человека. Факторы на клеточной поверхности молочнокислых бактерий, ответственные за адгезию, активно исследуются. Для некоторых молочнокислых бактерий показана способность к гемагглютинации эритроцитов, способность связывать маннозу, прикрепляться к компонентам кишечной слизи, связывать гликолипиды кишечного эпителия [28, 29]. Адгезия молочнокислых бактерий к эпителиальным клеткам зависит от физиологического состояния бактерий, физико-химических условий, в том числе рН среды [30]. Для некоторых штаммов молочнокислых бактерий показано, что их адгезия на эпителиальной слизи и эпителиальной ткани желудочно-кишечного тракта зависит от заболевания пациента (дивертикулит, карцинома прямой кишки, воспаление кишечника). Эти данные позволяют предположить, что в перспективе станет возможным подбор микроорганизма с подходящими адгезивными свойствами для лечения определенного заболевания кишечника [31]. Помимо конкурирования с патогенными микроорганизмами за места адгезии, у молочнокислых бактерий–пробиотиков установлены также и другие механизмы блокирования прикрепления патогенов. Для пробиотических бактерий рода Lactobacillus, обладающих способностью к адгезии на клетках кишечного эпителия, показана способность индуцирования синтеза одного из компонентов кишечной слизи – MUC 3, что в свою очередь приводит к ингибированию адгезии энтеропатогенных микроорганизмов [32]. При прохождении через желудочно-кишечный тракт микроорганизмы подвергаются действию разных неблагоприятных фак- 238 торов. В верхних отделах пищеварительного тракта на бактерии действует лизоцим, в желудке – соляная кислота, в кишечнике – высокие концентрации желчи, а также пищеварительные ферменты. Для того, чтобы колонизировать кишечник, бактерии должны быть кислото- и желчеустойчивы, устойчивы к действию пищеварительных ферментов и антимикробных веществ [33]. Помимо конкурентного ингибирования и вытеснения патогенных микроорганизмов, доказанным механизмом положительного влияния пробиотиков на здоровье организма-хозяина является модулирование иммунного ответа. Установлена способность молочнокислых бактерий оказывать влияние на уровень секреторных иммуноглобулинов, изменять численность субпопуляций лимфоцитов периферической крови, фагоцитарную активность нейтрофилов, продукцию цитокинов [3, 34]. При изучении эффективности действия перорально применяемых бактерий Lactobacillus casei показано, что как живые, так и убитые нагреванием клетки молочнокислых бактерий адгезируются на ворсинках кишечного эпителия и оказывают стимулирующее влияние на иммунную систему организма – хозяина [35]. Анализ литературных данных позволяет заключить, что молочнокислые бактерии, как один из основных компонентов микробного ценоза желудочно-кишечного тракта человека и животных, играют важную роль в защите макроорганизма от колонизации экзогенными чужеродными микроорганизмами, в том числе патогенными и условно-патогенными, в поддержании нормального иммунного статуса организма-хозяина. Направленная селекция штаммов молочнокислых бактерий по специально разработанным критериям является важнейшим этапом в создании на основе этих микроорганизмов эффективных препаратов пробиотического действия, позволяющих целенаправленно корректировать микроэкологические нарушения микробного ценоза желудочнокишечного тракта, вызванные действием разных стрессовых факторов. Список литературы 1 2 Lievin-Le Moal, V. The Front Line of Enteric Host Defense against Unwelcome Intrusion of Harmful Microorganisms: Mucins, Antimicrobial Peptides, and Microbiota / V. Lievin-Le Moal, A.L. Servin // Clinical Microbiology Reviews. – 2006. – Vol. 19, № 2. – P. 315–337. Vernazza, C. L. Human Colonic Microbiology and the Role of Dietary Intervention: Introduction to Prebiotics / C.L. Vernazza, B.A. Rabiu, G.R. Gibson // Prebiotics: Development and Application / John Wiley and Sons Ltd; ed. by G.R. Gibson, R.A. Rastall. – Chichester, 2006. – P. 1–28. 239 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Perdigon, G. Lactic Acid Bacteria and their Effect on the Immune System / G. Perdigon, R. Fuller, R. Raya // Current Issues in Intestinal Microbiology. – 2001. – Vol. 2, № 1. – P. 27–42. Hao, W.L. Microflora of the gastrointestinal tract: a review / W.L. Hao, Y.K. Lee // Methods Mol. Biol. – 2004. – Vol. 268. – P. 491–502. Walker, R. Probiotic Microbes: The Scientific Basis / R. Walker, M. Buckley // Report of an American Society for Microbiology colloquium, Baltimore, Maryland, November 5–7, 2005 / American Society for Microbiology – Washington, 2006. – 22 p. Parker, R.B. Probiotics, the other half of the antibiotic story / R.B. Parker // Anim. Nutr. Health. – 1974. – Vol. 29. – P. 4–8. Doron, S. Probiotics: their role in the treatment and prevention of disease / S. Doron, S.L. Gorbah. // Expert. Rev. Anti-Infect. Ther. – 2006. – Vol. 4, № 2. – P. 261–275. Huebner, E.S. Probiotics in the prevention and treatment of gastrointestinal infections / E.S. Huebner, C.M. Surawicz // Gastroenterol. Clin. North. Am. – 2006. – Vol. 35, № 2. – P. 355–365. Quality assurance criteria for probiotic bacteria / E. Tuomola [et al] // Am. J. Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73. – P. 393–398. Неcчисляев, В.А. Исследование штаммосовместимости лактобактерий при разработке технологии комплексного пробиотика / В.А. Неcчисляев, И.В. Фадеева, Е.Г. Арчакова // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования: материалы Междунар. науч.практ. конф. пам. Г.И. Гончаровой, Москва, 2002 г. / редкол.: Алешкин В.А. [и др.]. – Москва, 2002. – С. 70. Sanders, M.E. Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic / M.E. Sanders, T.R. Klaenhammer // J. Dairy Sci. – 2001. – Vol. 84. – P. 319–331. A human Lactobacillus strain (Lactobacillus GG) promotes recovery from acute diarrhea in children / D. Fayol-Messaoudi [et al] // Pediatrics – 1991. – Vol. 88. – P. 90–97. Oral administration of the probiotic combination Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 for human intestinal applications / G.E. Gardiner [et al] // International Dairy Journal. – 2002. – Vol. 12. – P. 191–196. Colonization and Immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the Human Gastrointestinal Tract / N. Valeur [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, № 2. – P. 1176–1181. Reid, G. The Scientific Basis for Probiotic Strains of Lactobacillus / G. Reid // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65. – P. 3763–3766. Molin, G. Probiotics in foods not containing milk or milk constituents, with special reference to Lactobacillus plantarum 299v / G. Molin // Am. J. Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 380–385. Глушанова, Н.А. Биологические свойства лактобацилл / Н.А. Глушанова // Бюллетень сибирской медицины. – 2003. – № 4. – C. 50–58. Toma, M.M. Probiotics as functional food: microbiological and medical aspects / M.M. Toma, J. Pokrotnieks // Acta Universitatis Latviensis, Biology. – 2006. – Vol. 710. – P. 117–129. Бережной, В.В. Микроэкологические нарушения у детей и современные возможности повышения эффективности их коррекции / В.В. Бережной // Здоровье женщины. – 2002. – № 12. – С. 79–92. Доронин, А.Ф. Функциональное питание / А.Ф.Доронин, Б.А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2002. – 296 с. Scheinbach, S. Probiotics: functionality and commercial status / S. Scheinbach // Biotechnology Advances. – 1998. – Vol. 16, № 3. – P. 581–608. 240 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Mishra, C. Production of anti-microbial substances by probiotics / C. Mishra, J. Lambert // Asia Pacific J. Clin. Nutr. – 1996. – Vol. 5. – P. 20–24. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane / H.L. Alacomi [et al] // Applied and environmental microbiology. – 2000. – Vol. 66, № 5. – P. 2001–2005. Strong antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid / S. Keersmaecker [et al] // FEMS Microbiol. Lett. – 2006. – Vol. 259, № 1. – P. 89–96. Jay, J.M. Antimicrobial properties of diacetyl / J.M. Jay // Appl. Environ. Microbiol. – 1982. – Vol. 44, № 3. – P. 525–532. Antagonistic Activity of Lactobacillus acidophilus LB against Intracellular Salmonella enterica Serovar Typhimurium Infecting Human Enterocyte-Like Caco-2/TC-7 Cells / M.H. Coconnier [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 3. – P. 1152–1157. Purification and molecular characterization of antibacterial compounds produced by Lactobacillus murinus strain L1 / R.M.D. Nardi [et al] // J. Appl. Microbiol. – 2005. – Vol. 99. – P. 649–656. A new screening method for the selection of Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria with high adhesion to human colonic mucosa / N. Takahashi [et al] // Biosci. Biotech. Biochem. – 1996. – Vol. 60. – P. 1434–1438. Binding specificity of Lactobacillus to glycolipids / K. Yamamoto [et al] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1996. – Vol. 228. – P. 148–152. Greene, J.D. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells / J.D. Greene, T.R. Klaenhammer // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60. – P. 4487–4494. Disease-Dependent Adhesion of Lactic Acid Bacteria to the Human Intestinal Mucosa Clinical and Diagnostic Laboratory / A.C. Ouwehand [et al] // Immunology. – 2003. – Vol. 10, № 4. – P. 643–646. Extracellular MUC3 mucin secretion follows adherence of Lactobacillus strains to intestinal epithelial cells in vitro / D.R. Mack [et al] // Gut. – 2003. – Vol. 52. – P. 827–833. Survival of Lactic Acid Bacteria in a Dynamic Model of the Stomach and Small Intestine: Validation and the Effects of Bile / P. Marteau [et al] // J. Dairy Science. – 1997. – Vol. 80. – P. 1031–1037. Ezendam, J. Probiotics: immunomodulation and evaluation of safety and efficacy / J. Ezendam, H. Loveren // Nutr. Rev. – 2006. – Vol. 64, № 1. – P. 1–14. Galdeano, C.M. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation / C.M. Galdeano, G. Perdigon // Journal of Applied Microbiology. – 2004. – Vol. 97, № 4. – P. 673–681. LACTIC ACID BACTERIA AS A BASIS OF PROBIOTIC PREPARATIONS DENISENKO V.V., NAIDENKO I.A. Laboratory of lactic acid bacteria and bifidobacteria The literature data on lactic bacteria making up a part of probiotic preparations, contemporary knowledge on some mechanisms of beneficial influence of probiotics on macroorganism are presented. 241 УДК 579.663 + 606:62 РОСТ И СТАБИЛЬНОСТЬ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ Романова Л.В., Кузьмина О.Н., Орлова Л.А., Михеева Л.Д., Гладкий Н.Ф., Ерош А.Ю. биотехнологический центр Изучено влияние состава питательной среды на рост и стабильность при хранении молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus. С учетом выявленных питательных потребностей штамма подобран оптимальный состав ферментационной среды, обеспечивающий максимальное накопление жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) и стабильность при хранении. Введение. В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений в области профилактики болезней сельскохозяйственных животных и птиц, увеличения привесов и сохранности молодняка стало применение препаратов пробиотического действия, в состав которых входят различные микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Живые бактерии, входящие в состав препаратов – пробиотиков являются антагонистами патогенных и условно патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующими и общеукрепляющими свойствами. Применение препаратов пробиотического действия позволяет нормализовать состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта макроорганизма, устранить проблемы, связанные с широко распространенными дисбактериозами, приводящими к множеству вторичных заболеваний, в том числе и хронического характера. Из экспериментальных данных, полученных в результате использования пробиотиков в животноводстве и птицеводстве, следует, что препараты этого класса способствуют повышению сохранности животных и их продуктивности. Перспективными микроорганизмами, которые могут использоваться как в составе пробиотических препаратов, так и кормовых добавок, являются молочнокислые бактерии [1–5]. Разработка технологии получения пробиотических препаратов и кормовых добавок основывается на знании физиологических особенностей штаммов-продуцентов и управлении процессами их культивирования [6–10]. Исследование зависимости скорости роста, накопления биомассы, биосинтетической активности штамма-продуцента от состава питательной среды необходимы для отработки подходов к регуляции этих процессов. Улучшение 242 ростовых свойств производственных штаммов непосредственно влияет на продуктивность биотехнологического процесса и биологическую активность препарата за счет увеличения количества вегетативных клеток. Одним из основных факторов, определяющим возможность производственного изготовления микробиологических препаратов, является подбор производственной питательной среды с учетом физиологических потребностей отобранных штаммов бактерий, их биосинтетической активности, стоимости компонентов среды и стабильности готового препарата. Целью настоящего исследования являлась оптимизация состава питательной среды для культивирования отселекционированного штамма Lactobacillus acidophilus – основы добавки кормовой кисломолочной (ДКМ), с целью получения высокого титра (КОЕ/мл) продуцента и обеспечения стабильности и длительности сроков его хранения. Объекты и методы исследования. В качестве объекта исследования использован специально отобранный штамм Lactobacillus acidophilus, характеризующийся высокой биосинтетической активностью и выраженными антагонистическими свойствами в отношении ряда бактериальных патогенов животных. Культивирование проводили периодическим способом при 0 температуре (30±2) С, аэрация и перемешивание отсутствовали. С целью изучения влияния состава питательной среды на рост бактерий использовали следующие среды: - среда №1: восстановленное молоко (сухое обезжиренное молоко в количестве 8–10% от объема среды растворяли в теплой воде (40-50 0С), рН = 6,2–6,6; - среда №2: меласса – 2%, кукурузный экстракт – 1,5%, автолизат пивных дрожжей – 1,0%, рН = 6,2–6,6; - среда №3 (MRS): – дрожжевой экстракт – 0,5%; мясной экстракт – 1,0%; крахмал растворимый – 0,5%; пептон – 1,0%; глюкоза – 2,0%; лимоннокислый аммоний – 0,2%; натрий уксуснокислый – 0,5%; твин-80 – 0,1%; K2HPO4 – 0,2%; MgSO4 x 4H2O – 0,005%. рН = 6,2–6,6. - среда №4 – восстановленное молоко с добавлением автолизата пивных дрожжей в количестве 1% от объема питательной среды, рН = 6,2–6,6. - среда №5 – восстановленная сыворотка (сухую сыворотку в количестве 8-10% от объема среды растворяли в теплой воде (40–50 0С), рН = 6,2–6,6. В качестве основной (контрольной) питательной среды использовали стандартную среду MRS (среда №3) для выращивания молочнокислых бактерий. 243 Изучение влияний условий хранения на стабильность исследуемого штамма осуществлялось при следующих температурах (4±2) 0С; (13±2) 0С; (18±2) 0С. Критерием оценки роста и стабильности продуцента в процессе хранения служило количество жизнеспособных клеток в 1 мл культуральной жидкости, которое определяли методом последовательных разведений по ГОСТ 10444.11., рН определяли потециометрически, за формированием сгустка следили визуально. Все эксперименты проводили в 3-х кратной повторности. Результаты и обсуждение. На первом этапе исследований определяли активность роста продуцента на различных средах в течение 48 часов. Экспериментальные данные показали, что максимальное накопление жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) отмечалось на средах с восстановленным молоком уже в 24-часовой культуре. В тоже время ростовые показатели на богатых поликомпонентных средах (контроль и среда №2) и на молочной сыворотке были невысокими и достигали своего максимального 7 значения (10 КОЕ/мл) только через 48 часов культивирования (таблица 1). Таблица 1 – Рост Lactobacillus acidophilus в зависимости от состава питательной среды. КОЕ/мл Питательная среда №1 №2 №3 №4 №5 24 часа 1010 106 106 1010 107 48 часов 1010 107 107 1010 107 Как следует из таблицы 1, оптимальными питательными средами для выращивания исследуемых бактерий являлись восстановленное молоко (среда №1) и восстановленное молоко с добавлением автолизата пивных дрожжей (среда №4). Следующий этап работы по изучению стабильности культуры при хранении проводили с молочнокислыми бактериями, выращенными на средах 1–5 в течение двух суток при температуре 30 0С. Полученные данные представлены в таблице 2. Как показали полученные результаты, количество жизнеспособных молочнокислых бактерий в процессе хранения снижалось на 2–3 порядка, независимо от исходной величины этого показателя и состава питательной среды. Наиболее высокий уровень стабильности отмечен при выращивании и хранении бакте- 244 рий на средах №4 и №1. В данном случае титр КОЕ/мл через 4 месяца составил 108 и 107 соответственно. Учитывая полученные результаты, изучение влияния температуры на стабильность бактерий проводили с культурой, выращенной на данных средах. Таблица 2 – Влияние исходного титра и состава питательной среды на стабильность молочнокислых бактерий при температуре хране0 ния (4±2) С Питательная среда №1 №2 №3 №4 №5 Исходное значение 1010 107 107 1010 106 КОЕ/мл Срок хранения при температуре (4±2) 0С 1 месяц 2 месяца 3 месяца 4 месяца 109 109 108 107 7 6 6 10 10 10 105 7 7 5 10 10 10 105 109 109 109 108 105 105 105 104 Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют, что повышение температуры хранения до (18±2) 0С вызывало ежемесячное снижение титра на 102, который в конце хранения (4 месяца) стабилизировался на уровне 104 КОЕ/мл при использовании среды №1 на основе восстановленного обезжиренного молока. Добавление в среду автолизата пивных дрожжей приводило к резкому снижению в процессе хранения количества жизнеспособных клеток продуцента, которое уже через 3 месяца хранения составило 102 КОЕ/мл. Падение титра клеток во всех экспериментах сопровождалось снижением рН, которое увеличивалось с повышением температуры. Таблица 3 – Влияние температуры хранения на стабильность отобранного штамма Lactobacillus acidophilus Срок Среда №1 Среда №4 хране 4±2 0С 15±2 0С 18±2 0С 4±2 0С 15±2 0С 18±2 0С ния, КОЕ рН± КОЕ рН± КОЕ рН± КОЕ рН± КОЕ рН± КОЕ рН± сутки /мл 0,2 /мл 0,2 /мл 0,2 /мл 0,2 /мл 0,2 /мл 0,2 2 30 60 90 120 1010 9 10 109 108 107 4,0 1010 8 3,7 10 3,3 108 3,1 107 3,0 106 3,9 1010 8 3,7 10 3,4 106 3,4 104 3,1 104 3,9 1010 9 3,3 10 3,0 109 2,9 109 2,8 108 4,0 1010 8 3,8 10 3,6 105 3,3 104 3,3 102 4,1 1010 8 4,0 10 3,1 104 2,7 102 2,7 102 4,0 4,0 2,8 2,6 2,6 Хранение продуцента при температуре 15±2 0С позволяло сохранить высокий титр культуры в течение 3-х месяцев на среде 245 с восстановленным молоком и 1-го месяца на среде с добавлением автолизата пивных дрожжей (таблица 3). Заключение. Таким образом, полученные результаты позволяют рекомендовать для выращивания исследуемого штамма молочнокислых бактерий среду на основе восстановленного обезжиренного молока, которая позволяет получить максимальное количество жизнеспособных клеток культуры при культивировании 24 часа и обеспечить гарантированный срок ее хранения в достаточно широком диапазоне температур (4–15 0С). Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 Балтаджиева, М. Получение пробиотического продукта из сыворотки / М. Балтаджиева, В. Костадинова, Т. Джурков // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: материалы Междунар. конгресса, С.–Петербург, 15–16 мая 2007 г. / науч.-практ. журнал: Клиническое питание, № 1–2/2007; редкол.: В.Г. Беспалов [и др.]. – Санкт–Петербург, 2007. – С. 21. Бурыкина, И.М. Особенности культивирования симбиотической закваски пробиотических микроорганизмов / И. М. Бурыкина // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: материалы Междунар. конгресса, С.-Петербург, 15–16 мая 2007 г. / науч.-практ. журнал: Клиническое питание, № 1–2/2007; редкол.: В.Г. Беспалов [и др.]. – Санкт–Петербург, 2007. – С. 25. Соколова, К.Я. Биотехнологические аспекты разработки многокомпонентных пробиотиков из различных штаммов лактобактерий / К. Я. Соколова [и др.] // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования: материалы междунар. науч.-практ. конф. памяти Г.И. Гончаровой, Москва, 2002 г. / Мин. здрав. РФ; под ред. В. А. Алешкина. – Москва, 2002. – С. 68. Препараты, нормализующие микрофлору кишечника / Питательные среды [Электронный ресурс]. – 2007. – Режим доступа: http://home.mtsnn.ru/~imbio/Microflora.htm. – Дата доступа: 21.08.2007. Иванов, В.П. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника / В.П. Иванов [и др.]. – Санкт–Петербург: СПБГМА им. И.И. Мечникова, 2002. – 7 с. – (Информационное письмо / кафедра микробиологии СПБГМА им. И.И. Мечникова). Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов: ГОСТ 10444.11-89.– Введ. 28.11.89. – М.: Гос. ком. СССР по упр. качеством продукции и стандартам: изд-во стандартов, 1989. – 19 с. Козьминых, Ю.В. Подбор и конструирование питательных сред для производства жидких пробиотиков / Ю.В. Козьминых, А.В. Малков, В.Н. Марков // Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования: материалы междунар. науч.-практ. конф. памяти Г. И. Гончаровой, Москва, 2002 г. / Мин. здрав. РФ; под ред. В.А. Алешкина. – Москва, 2002. – С. 77. Жаркова, И.М. Культивирование молочнокислых бактерий / И.М. Жаркова, Л.В. Спивакова, Л.Г. Кириллова // Биология – наука XXI века: материалы междунар. Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 18–22 апреля 2005 г. / Пущинский научный центр РАН; редкол.: А. Амелин [и др.]. – Московская обл., г. Пущино, 2005. – С. 25. 246 9 10 11 Найденко, И.А. Культивирование молочнокислых бактерий на средах с различными источниками сбраживаемых углеводов / И.А. Найденко, М.Е. Сафонова, В.В. Денисенко // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. науч. конф., Минск – Раков, 1–2 июня 2006 г. / НАН Беларуси, отдел. биол. наук, Ин-т микробиологии, Белорус. общественное объединение микробиологов; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 100–103. Соловьева, И.В. Конструирование питательной среды для совместного культивирования бифидобактерий и лактобацилл / И.В. Соловьева, И.В. Белова, Т.П. Иванова // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: материалы Междунар. конгресса, С.-Петербург, 15–16 мая 2007 г. / науч.-практ. журнал: Клиническое питание, № 1–2/2007; редкол.: В.Г. Беспалов [и др.]. – Санкт– Петербург, 2007. – С. 67. Цинберг, М.Б. Квасной напиток, содержащий пробиотическую добавку на основе гидролизатно-соевой среды / М.Б. Цинберг, И.В. Денисова, Д.Г. Дерябин // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: материалы Междунар. конгресса, С.-Петербург, 15–16 мая 2007 г. / науч.-практ. журнал: Клиническое питание, № 1–2/2007; редкол.: В.Г. Беспалов [и др.]. – Санкт–Петербург, 2007. – С. 72. EFFECT OF NUTRIENT MEDIUM COMPOSITION ON GROWTH AND STABILITY OF LACTIC ACID BACTERIA ROMANOVА L.V., KUZMINA O.N., ORLOVA L.A., MIHEEVA L.D., GLADKI N.F., EROSH A.Y. Biotechnological center Effect of nutrient medium composition on growth and stability of lactic acid bacteria Lactobacillus acidophilus in the course of storage was studied. Taking into account strain nutrient requirements, optimal make-up of fermentation medium insuring maximal accumulation of viable cells (CFU/ml) was selected. Correlation of bacterial cell stability with preservation conditions was revealed. УДК 579.22:579.24:579.264 БАКТЕРИОЦИНЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Головнева Н.А., Щетко В.А., Грель М.В. лаборатория молочнокислых и бифидобактерий Бактериоцины – антибиотические вещества белковой природы, обладающие бактерицидным действием, преимущественно, по отношению к бактериям филогенетически родственных видов. Наибольший интерес вызывают бактериоцины и бактериоцинподобные соединения грамположительных бактерий, что связано с перспективой их практического использования в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов, а также лекарственных средств. Штаммы, продуцирующие бактериоцины, обнаружены среди представителей всех родов грамполо- 247 жительных бактерий. В настоящее время в пищевой промышленности используются многие бактериоцинпродуцирующие штаммы молочнокислых бактерий. Особое внимание уделяется бактериоцинам, ингибирующим рост условно-патогенной и патогенной микрофлоры. Использование бактериоцинпродуцирующих штаммов молочнокислых и бифидобактерий для усовершенствования процессов ферментации в пищевых производствах представляется перспективным, однако отсутствие фундаментальных сведений о бактериоцинпродуцирующих штаммах препятствует их использованию в промышленности. Бактериоцины – специфические антибиотические вещества белковой природы, обладающие бактерицидным действием, преимущественно, по отношению к бактериям того же или филогенетически родственных видов. Феномен бактериоциногении обнаружен у многих бактериальных культур [1]. Первое достоверное исследование бактериоцинподобного вещества было проведено Gratia [2]. В 1925 г. он продемонстрировал, что штамм E.coli V продуцировал в жидкой среде термостабильное вещество, ингибирующее рост штамма E.coli φ. Термин “бактериоцин” был предложен Jacob с соавторами в 1953 году [3]. В отличие от известных антибиотиков, бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия. Характерной особенностью большинства бактериоцинов является их относительно небольшая молекулярная масса, компактная структура, обуславливающая устойчивость к нагреванию и действию протеолитических ферментов. С другой стороны, некоторые бактерии продуцируют антимикробные пептиды, не соответствующие упомянутым критериям [4]. Эти пептиды упоминаются в литературе как бактериоцинподобные ингибирующие соединения (BLIS) [5]. В естественных условиях бактериоциногения является одним из факторов, влияющих на формирование микробного ценоза, т.к., подавляя развитие бактерий, обладающих сходными пищевыми потребностями, бактериоциногенные штаммы имеют важное селективное преимущество. Широкая распространенность бактериоцинов у штаммов бактерий, изолированных из сложных микробных сообществ, таких как желудочно-кишечный тракт, ротовая полость, эпителиальная ткань и др., свидетельствует о том, что эти вещества играют регуляторную роль в популяции бактериальных экосистем. В зависимости от особенностей структуры, свойств и механизма действия среди бактериоцинов и бактериоцинподобных соединений микроорганизмов выделяют отдельные группы: колицины и микроцины, продуцируемые грамотрицательными бактериями; лантибиотики, обнаруженные у грамположительных бактерий; не содержащие лантионин циклические низкомолекулярные пептиды и другие [6, 7]. Бактериоцины именуются, как правило, в соответствии с видовым названием продуцента, например, 248 бактериоцины, продуцируемые Lactobacillus plantarum, называются плантарицинами, Pseudomonas pyocyanea – пиоцинами, Bacillus megaterium – мегацинами и т.п. До последнего времени прогресс в исследовании бактериоцинов был связан с изучением колицинов – бактериоцинов, продуцируемых различными представителями семейства Enterobacteriaceae. Наиболее полно изучены колицины из E.coli, клоацины из Enterobacter cloacae, аэроцины из Aerobacter aerogenes, марцесцины из Serratia marcescens. Установлено образование бактериоцина Rizobium leguminosarum, клубеньковыми бактериями гороха, который проявляет активность по отношению к бактериям этого же вида, но не действует на Azotobacter и Azospirillum. Уже к 70-м годам прошлого столетия было известно 24 типа колицинов, различающихся своими физико-химическими свойствами и спектром действия, изучены генетические основы, структура, способ действия, биологическая активность этих молекул [8]. Однако практическое применение нашли не более 5% из выделенных субстанций [9]. В последнее десятилетие внимание исследователей привлекают клебоцины (род Klebsiella), колицины, продуцируемые некоторыми бактериями семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella) и бактериоцины из Serratia marcescens, которые используются для регуляции популяций грамотрицательных бактерий в кишечнике животных и человека. В 90-е годы началось активное исследование микроцинов, выделенных из грамотрицательных бактерий. Микроцины – гетерогенная по природе и структуре молекул группа низкомолекулярных антибиотических пептидов, которые продуцируют, в основном, различные штаммы бактерий семейства Enterobacteriaceae [10]. Микроцины отличаются от большинства колицинов более низкой молекулярной массой (менее 5000 Дa) и характеризуются конститутивным синтезом. Термостабильность и устойчивость к проназе или субтилизину, характерные для микроцинов, обусловлены их структурой [11]. Гены, кодирующие образование микроцинов, находятся на плазмидах. Следует отметить, что использование бактериоцинов грамотрицательных бактерий в практике ограничено из-за быстрой инактивации этих соединений протеазами, а также иммуногенности, обусловленной их белковым компонентом. В настоящее время интенсивно исследуются бактериоцины и бактериоцинподобные соединения грамположительных бактерий, что связано с перспективой практического использования этих природных соединений в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов, а также лекарственных средств [12, 13]. В отличие от грамотрицательных бактерий для бактериоцинов 249 грамположительных бактерий характерен более широкий спектр антимикробного действия. Образование бактериоцинов установлено у бактерий родов Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus, Corinebacterium, Mycobacterium [4, 5, 14]. Многие из этих пептидов хорошо изучены, установлены их структура и функции. Наибольший интерес исследователей вызывают бактериоцины молочнокислых бактерий. Впервые бактериоцин молочнокислых бактерий – низин – упоминается в работах Rogers 1928 г. [15], в которых исследовались метаболиты Streptococcus lactis (в настоящее время эти бактерии классифицированы как Lactococcus lactis), ингибирующие рост других молочнокислых бактерий. Антагонистическое действие бактерий, по мнению автора, зависело от накопления ингибирующего вещества, стойкого к нагреванию в кислой среде и способного к адсорбции на фарфоровых фильтрах. Антибиотическое вещество накапливалось в условиях низкой кислотности среды культивирования бактерий и не теряло активности после кипячения в течение 2 час. В 1944 г. Mattick и Hirsch впервые выделили бактериоцин низин из культуры Streptococcus lactis [16]. Штаммы, продуцирующие бактериоцины, обнаружены среди представителей всех родов молочнокислых бактерий. К настоящему времени накоплен обширный фактический материал, касающийся характеристики бактериоцинпродуцирующих культур молочнокислых бактерий, способов очистки и свойств бактериоцинов, их генетической детерминации, практического использования штаммов-продуцентов и бактериоцинов. С применением современных методов генной инженерии проводятся исследования, направленные на получение штаммов-продуцентов бактериоцинов с высокой антимикробной активностью и стабильностью [17]. Бактериоцины, синтезируемые молочнокислыми бактериями, отличаются по свойствам и структуре молекул, спектру и механизму антагонистической активности, что затрудняет их классификацию. Klaenhammer в 1993 г. [18] на основании структурных особенностей разделил бактериоцины молочнокислых бактерий на четыре основных класса. К первому классу относятся лантибиотики – низкомолекулярные (менее 5 кДа) пептиды, содержащие необычные дидегидрои тиоэфирные аминокислоты лантионин или 3-метиллантионин и большое количество дегидратированных аминокислот [18]. К этой группе относятся низин [19], лактицин 481 [20] и двухкомпонентные лантибиотики, такие как цитолизин, продуцируемый Enterococcus faecalis [21], лактицин 3147 из Lac- 250 tococcus lactis [22] и стафилококцин С55 из Staphylococcus aureus [23]. Термин лантибиотики – это сокращённое название лантионин-содержащих пептидных антибиотиков, в состав которых входят остатки аминокислот лантионина или β-метиллантионина, благодаря чему в их структуре формируется тиоэфирная связь. Все лантибиотики, кроме лантионина и его аналога – триметиллантионина, содержат необычные α, β – ненасыщенные аминокислоты дегидроаланин (ДГА) и дегидробутирин (ДГБ). Лантионин образуется при взаимодействии двойной связи в молекуле ДГА с тиогруппой соседнего цистеина [24]. Образование триметиллантионина является результатом взаимодействия ДГБ с соседним треонином. В результате образования таких последовательностей формируется полициклическая структура. Кроме этих аминокислот у лантибиотиков были найдены и другие необычные аминокислотные остатки. Например, тетрациклический пептид эпидермин содержит ненасыщенный (s)-z-2-аминовинил-Dцистеин, который формирует кольцевую структуру. Стабильность лантибиотиков обеспечивается кольцевой конформацией D–аминокислот [25]. На основании структурных и функциональных особенностей лантибиотики делят на два типа – А и В. К типу А относятся линейные катионные пептиды с молекулярной массой от 2200 до 3500 Да, содержащие до 34-х аминокислотных остатков. Эти пептиды, прежде всего, действуют на мембрану, разрушая её структуру [25]. К таким пептидам относят низин Lactococcus lactis, субтилин Bacillus subtilis, эпидермин Staphylococcus epidermis, галлидермин S. gallinarum, Pep5 S. еpidermis 5. Пептиды типа В – это циклические лантибиотики, чаще нейтральные пептиды с молекулярной массой в пределах 1950 – 2050 Да [25, 26], содержащие до 19 аминокислотных остатков. Они инактивируют ферменты, принимающие участие в биосинтезе клеточной стенки. К этой группе соединений относят, например, лантибиотик дуромицин, который продуцируют бактерии рода Streptomyces, меркацидин и актагардин. К пептидам типа В относят также такие лантибиотики как циннамицин и анковенин, продуцируемые Streptomyces sp. [27]. Однако многие лантибиотики не могут быть отнесены ни к одной из этих групп. Классификация данной группы бактериоцинов постоянно уточняется. Синтез лантибиотиков в бактериальной клетке происходит в несколько стадий, включающих синтез предшественника – прелантибиотика, и дальнейшие модификации – дегидратацию, расщепление и др., а также секрецию [28, 29]. К настоящему времени установлены генетические детерминанты многих линейных и 251 циклических лантибиотиков [30]. Изучение их генетических детерминант показывает, что за синтез бактериоцинов отвечает большое количество различных генов. Геномная структура лантибиотиков включает в себя несколько групп генов: гены Lan A, кодирующие синтез препептида; гены Lan B,C/Lan M, кодирующие ферменты, принимающие участие в реакциях модификации пептида; а также гены Lan P, кодирующие протеиназы, обеспечивающие удаление лидерного пептида. Транспортные белки включены в комплекс Lan T; регуляторные белки – в комплексы Lan R и Lan K; белки, отвечающие за иммунитет к собственным лантибиотикам – в Lan I, FEG. Кроме того, имеются гены, функции которых к настоящему времени еще не определены [31] В зависимости от механизма посттрансляционной модификации выделяют два типа генетической организации лантибиотиков. Низин, субтилин и Рер5 относятся к первому типу, так как посттрансляционную модификацию этих лантибиотиков осуществляют Lan B и Lan C ферменты [32] Ко второму классу относятся лантибиотики, которые модифицируются только одним Lan M ферментом (лактицин 481, лактоцин S, цитолизин и мерсацидин) [33]. Структурные гены, кодирующие синтез таких лантибиотиков как галлидермин, субтилин и SA-FF22, расположены на хромосоме [34]. Однако подобно другим антимикробным пептидам, многие лантибиотики кодируются генами, находящимися на плазмидах. К ним относятся, например, эпидермин [35], Рер5 [36], цитолизин [37] и лактицин 3147 [38], стрептин [39], энтероцин EJ97 [40]. Dufour c сотрудниками [41] показали, что гены, кодирующие синтез лактицина 481, расположены на сложном транспозоне Тn5271, который находится на плазмиде размером около 70 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Гены, кодирующие низин у L. lactis NCFB894 и L. lactis NIZO R5, расположены на больших (примерно 70 т.п.н.) коньюгативных транспозонах Tn 5301 и Tn 5276 [42]. Транспозоны встраиваются в реципиентную хромосому путем коньюгативного переноса. Имеется информация, что гены, ответственные за синтез некоторых лантибиотиков, организованы в опероны [43]. Посттрансляционные модификации, с помощью которых осуществляется формирование активной формы антимикробных пептидов, осуществляются специфическими ферментами и являются необходимым этапом для активации и дальнейшего функционирования этих веществ. Циклическая структура обязательна для обеспечения жёсткости пептида, который становится резистентным к протеолитическим ферментам и тепловым воздействиям [44]. У многих штаммов молочнокислых бактерий обнаружены антимикробные пептиды, активно воздействующие на клеточную 252 мембрану, но не содержащие лантионин. Большую часть таких пептидов относят ко второму классу. Биохимические исследования показали, что они устойчивы к высокой температуре, являются гидрофобными и имеют молекулярную массу в пределах от 3,7 до 6,3 кДa. На основании биохимических и структурных особенностей бактериоцины класса II делятся на два подкласса: IIa и IIb [18]. К первому подклассу относятся пептиды педиоцин РА-1 [45], сакацин А [46], и энтероцин А [7], с характерной N-терминальной последовательностью Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys-. Этот подкласс включает пептиды, антагонистически активные против бактерий рода Listeria, в то время как среди других классов бактериоцинов только некоторые пептиды обладают антилистериальной активностью. Во второй подкласс включены комплексные молекулы, формирующие поры в клеточной стенке клеток-мишеней, состоящие из двух различных пептидов, и также обладающие антилистериальной активностью, например, лактококцин G [47], лактицин F [48]. Некоторые исследователи выделяют третий подкласс (IIc), к которому относят так называемые тиол-активируемые бактериоцины, например, ацидоцин В [48]. Для проявления активности этим бактериоцинам необходимо редуцирование их цистеиновых остатков [49]. Самой большой и хорошо изученной группой бактериоцинов класса II является подкласс IIа. Представители этой группы ингибируют рост Listeria monocytogenes [46, 50] и могут использоваться как биоконсерваты при производстве продуктов питания. Бактериоцины подкласса IIa содержат от 37 (леукоцин А и мезентерицин Y10537) до 48 (карнобактериоцин В2) аминокислотных остатков. Характерной особенностью пептидов этого подкласса является наличие больших участков со сходными аминокислотными последовательностями. Особенно важна одинаковая для всех консервативная N-концевая часть, которая отвечает за связывание бактериоцина с мембраной чувствительной клетки. С-концевая часть пептидов этого подкласса вариабельна, однако некоторые исследователи группируют пептиды подкласса IIa именно по этому признаку. Например, в первую группу входят баварицин MN, диверцин V41 и энтероцин А, во вторую – энтероцин Р, карнобактериоцин ВМ1 и сакацин А, в третью баварицин А, мундицин, рисциколин 126 и сакасин Р. Бактериоцины класса IIа сходны по аминокислотному составу на 34–80,5%, а леукоцин А и мезентерицин Y10537 отличаются друг от друга только составом аминокислот в позициях 22 и 26 [51]. Бактериоцины данной группы обладают некоторыми характеристиками, которые не присущи антибактериальным пептидам других классов: высоким содержа- 253 нием неполярных аминокислотных остатков и небольших, например, глицин, аминокислот, придающих молекулам большую конформационную изменчивость; наличием консервативного гидрофильного N-концевого домена и вариабельного гидрофобного и/или амфифильного С-концевого домена. Этим объясняются различия эффективности действия указанной группы соединений на мембраны клеток мишеней [52]. Одной из важных особенностей бактериоцинов класса IIа является наличие у них нескольких цистеиновых остатков. В то время как бактериоцины других групп содержат только один цистеиновый остаток (тиол-активируемые бактериоцины, лактококцин В) [53] или совсем его не содержат (лактококцины А [53], М [54], G [55] и плантарицин А [56]), бактериоцины класса IIа содержат, по крайней мере, два цистеиновых остатка, соединенных дисульфидным мостиком. Цистеиновые остатки данной группы антибактериальных соединений находятся в N-концевом домене в одной и той же позиции, поэтому дисульфидная связь, постоянная у всех бактериоцинов данного класса, формирует кольцо из шести аминокислотных остатков. Однако, в отличие от большинства антибактериальных пептидов класса IIа, которые содержат два цистеиновых остатка и образуют одну дисульфидную связь, педиоцин РА-1/АсН, энтероцин А и диверцин V41 имеют две пары цистеиновых остатков, формирующих второй дисульфидный мостик. Присутствие дисульфидных связей, по-видимому, является решающим для проявления антибактериальной активности этих бактериоцинов, особенно если таких связей в молекуле пептида две [57]. Генетическая организация бактериоцинов класса IIa еще недостаточно хорошо изучена. Генетические детерминанты этих антибактериальных пептидов, в отличие от большинства известных бактериоцинов, в основном, локализованы на хромосомах [58]. Однако, независимо от того, где локализованы структурные гены, кодирующие бактериоцины, генетические детерминанты и прилегающие к ним области организованы в оперонподобные структуры, включающие в себя гены синтеза пептида и его внеклеточной транслокации, гены иммунитета к собственному бактериоцину и гены регуляции синтеза. Наличие регуляторных генов достоверно показано лишь для шести бактериоцинов класса IIа, но можно предполагать, что они существуют у всех пептидов данного класса. Высокомолекулярные (более 30 кДа) термолабильные пептиды, включая некоторые бактериолитические внеклеточные ферменты (например, хемолизины и муромидазы), объединены в III класс [59]. В IV класс выделяют бактериоцины, относящиеся к 254 липо- и гликопротеинам. Однако этот класс антибактериальных соединений еще недостаточно изучен [60]. Действие бактериоцинов на чувствительные клетки определяется как бактерицидное и обусловлено, как правило, образованием гидрофильных пор в цитоплазматической мембране. Эти поры или каналы деполяризуют цитоплазматическую мембрану, нарушая энергетический статус клетки [33]. Способность продуцировать бактериоцины и проявлять устойчивость к гомологичным бактериоцинам (иммунитет) — это основные признаки, отличающие бактериоциногенные микроорганизмы от небактериоциногенных. Показано, что устойчивость к бактериоцинам обусловлена наличием механизма двойной экспрессии белков иммунитета, с помощью которого штаммыпродуценты становятся резистентными к летальному действию собственных бактериоцинов [61]. Однако пока не вполне ясно, как такой механизм действует на молекулярном уровне. В настоящее время у грамположительных бактерий известны две системы устойчивости к собственным бактериоцинам. Первая система (LanI) действует с помощью специфических белков иммунитета. Основной белок этой системы содержит 67 аминокислот и имеет гидрофобный N-терминальный домен и гидрофильный С-терминальный участок. Предполагается, что этот белок взаимодействует с поверхностью мембраны клеткипродуцента, благодаря чему не происходит адсорбции антибактериальных пептидов на поверхности бактериальной клетки. Вторая система содержит специализированные транспортные белки LanFEG. Синтез транспортных белков кодируется специфической областью генов. Так, ген lanF кодирует внутриклеточную АТФ, а гены lanG и lanE - синтез субъединиц мембранных белков. В экспериментах было показано, что молекулярный механизм иммунитета осуществляется при экспорте соответствующих белков на поверхность мембраны. Белки иммунитета идентифицированы у продуцентов некоторых лантибиотиков (низин, субтилин, эпидермин) [62]. Бактериоцины первых двух классов, в частности низин (тип Iа) и так называемые антилистериальные антибиотики (класс IIа), используются в пищевой промышленности и к настоящему времени наиболее изучены. Как правило, это относительно небольшие пептиды, состоящие из 50 или немногим более аминокислот, для многих из них установлена аминокислотная последовательность. Низин, продуцируемый некоторыми штаммами Lactococcus lactis, состоит из 35 аминокислотных остатков [63]. Педиоцин АсН (педиоцин РА-1) из Pediococcus acidilactici включает 44 аминокислоты [64]. Примерами некоторых других бактериоцинов с уста- 255 новленной структурой могут быть состоящий из 43 аминокислотных последовательностей и продуцируемый штаммом Lactobacillus sake LTH 676 сакацин P [65], включающий 37 аминокислот лейкоцин А из Leuconostoc gelidum UAL 187 [66]; лактацин F – полипептид из 57 мономеров, продукт жизнедеятельности Lactobacillus acidophilus 11988 [67], содержащий 55 аминокислот лактококцин А из Lactococcus lactis subsp. cremoris 9B4 [68, 69] и др. Бактериоцины кодируются как плазмидной, так и хромосомной ДНК [70]. Для многих бактериоцинов была установлена локализация структурных генов и генетическая организация. Оказалось, что в большинстве случаев структурные гены ассоциированы в один кластер с генами, кодирующими протеины, обусловливающие устойчивость к бактериоцину, процессинг, мембранную транслокацию молекул. Характерной особенностью бактериоцинов является их биосинтез на рибосомах в виде препропептида, который затем подвергается посттрансляционному процессингу. Активные молекулы секретируются в окружающую среду. Транслокация через мембрану происходит с участием транспортных протеинов [22, 28, 30]. Продукция бактериоцинов, как и других биологически активных веществ, зависит от условий культивирования бактерий: состава питательной среды, рН, температуры, и определяется фазой роста бактериальных штаммов. Для эффективного коммерческого применения бактериоцинов и продуцирующих их штаммов грамположительных бактерий необходимо детальное изучение факторов и условий, влияющих на продукцию бактериоцинов, а также оптимизация условий культивирования штаммовпродуцентов. Анализ литературных данных показывает, что многие из исследованных бактериоцинов являются первичными метаболитами, их синтез происходит в экспоненциальной стадии роста культуры с максимумом продукции в середине или конце этой фазы [71]. В некоторых случаях продукция бактериоцинов продолжается и в стационарной стадии роста бактерий, однако их количество сильно снижается [72]. Для лактострепсина 3 [73] и плантарицина Т [74] показано, что их синтез продолжается и в стационарной фазе роста бактерий продуцентов. Продукция бактериоцинов на поздних стадиях роста микроорганизмов может быть вызвана различными внешними воздействиями. Только для двух бактериоцинов – педиоцина и низина – доказано, что они являются вторичными метаболитами, и основная продукция данных бактериоцинов происходит в стационарной стадии роста [75]. Было показано, что ацидоцин В синтезируется клетками Lactobacillus acidophilus M46, находящимися в состоянии анабиоза [76]. 256 Влияние условий культивирования грамположительных бактерий на синтез бактериоцинов наиболее полно изучено на примере низина [77], педиоцина, энтероцина 1146 [78], лактоцина S, энтерококцина [79], курвацина [80] и некоторых других бактериоцинов. Установлено, что максимальная продукция бактериоцинов обычно происходит при культивировании бактерий на сложных, богатых питательными веществами средах [81], хотя некоторые антибактериальные пептиды могут накапливаться и на относительно простых питательных средах. Синтез бактериоцинов на синтетических средах был показан только у некоторых видов микроорганизмов [82]. Показано, что различные источники углерода, азота, фосфора, другие питательные компоненты оказывают значительное влияние на продукцию бактериоцинов [83]. Так, увеличение концентрации источников азота и углерода в среде культивирования лактококков подавляет синтез низина [84], а изменение количества фосфора в среде не оказывает влияния на накопление этого бактериоцина. Продукция педиоцина, наоборот, ингибируется при увеличении концентрации фосфора, но практически не зависит от изменения концентрации углеводов и азота. Повышение количества дрожжевого экстракта и триптона в среде вызывает усиление роста Lactobacillus sakei и уровня накопления сакацина Р [85]. Для практического использования молочнокислых и других грамположительных бактерий в качестве стартовых заквасочных культур при производстве пищевых продуктов важно также исследование влияния концентрации хлорида натрия на продукцию ими бактериоцинов [86]. Показано, что при повышении концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 8% увеличивается продукция некоторых бактериоцинов. Однако при дальнейшем увеличении концентрации соли скорость роста бактерий и бактериоцинпродукция резко снижаются [87]. Значительное влияние на синтез антибактериальных пептидов оказывают температура и кислотность среды культивирования. Часто оптимальные для роста бактерий температура и кислотность среды неблагоприятны для максимальной продукции бактериоцинов. Понижение или повышение этих параметров вызывает уменьшение скорости роста бактерий и увеличение уровня накопления бактериоцинов [88]. Показано, что при неблагоприятных для роста бактерий условиях, таких как экстремальные температура, кислотность среды культивирования, осмомолярность, воздействии токсичных для многих бактерий повышенных концентраций хлорида натрия, этанола, кислорода [89] наблюдается стимуляция бактериоцинпродукции. Стрессовые воздействия на бактериальные клетки 257 могут быть использованы для направленного увеличения синтеза антимикробных пептидов и сокращения времени культивирования бактерий до накопления максимального количества бактериоцинов в среде роста. Стимуляция бактериоцинпродукции в неблагоприятных условиях роста важна при использовании бактерий в качестве заквасок или консервантов, так как многие технологические процессы, такие как производство сырокопченых и сыровяленых колбас, мясных продуктов, сыров происходят в условиях, неблагоприятных для роста бактериоцинпродуцирующих штаммов. Особый интерес представляют прикладные аспекты исследования бактериоциногении, в результате которых было продемонстрировано отсутствие токсического воздействия бактериоцинов на организм человека и животных, установлена антагонистическая активность продуцентов низина, сакацина А, педиоцинов РА-1, АСН и JD, и многих других бактериоцинов по отношению к различным патогенным и условно патогенным микроорганизмам. Бактериоцины и бактериоцинподобные соединения перспективны для практического применения как пищевые консерванты при изготовлении колбасных и других мясных изделий, молочных продуктов, а также как лекарственные вещества для предотвращения бактериальных инфекций. В настоящее время в пищевой промышленности используются многие бактериоцинпродуцирующие штаммы молочнокислых бактерий. Наиболее востребованным на сегодняшний день является лантибиотик низин, продуцируемый некоторыми штаммами Lactococcus lactis. Низин используется уже более 50 лет в 40 странах мира, включая США и страны ЕС, в качестве биоконсерванта при производстве сыров, молочных и молочнокислых продуктов, вина, консервировании мяса и мясопродуктов. Крупнейшим производителем низина является компания Aplin&Barrett Ltd (Англия), которая выпускает коммерческий препарат «Nisaplin». Поиск и изучение штаммов – продуцентов бактериоцинов активно ведутся во многих научных центрах. Особое внимание уделяется бактериоцинам, ингибирующим рост условнопатогенной и патогенной санитарно-показательной микрофлоры, которая включает бактерии группы кишечной палочки, сальмонеллы, листерии, протей, коагулазоположительные стафилококки, сульфитредуцирующие клостридии. Продуценты бактериоцинов имеют преимущество в качестве заквасочных культур в различных пищевых производствах [7]. Образующиеся бактериоцины обеспечивают доминирование нужных микроорганизмов и подавление нежелательной микрофлоры, что обеспечивает безопасное протекание микробиологических процессов. Так, при производст- 258 ве сыровяленой колбасы в качестве заквасочной культуры используется штамм Lactobacillus curvatus, образующий курвацин, который ингибирует рост близкородственных лактобацилл, а также условнопатогенных бактерий, что обеспечивает безопасное протекание необходимых биохимических процессов созревания продукта [9]. Lactobacillus plantarum, продуцент плантарицина, используется в качестве заквасочной культуры при ферментации зеленых оливок [7]. При изготовлении йогуртов и других кисломолочных продуктов в качестве стартовых культур используют штаммы молочнокислых бактерий, синтезирующие бактериоцины. Некоторые препараты на основе бактериоцинов грамположительных бактерий нашли применение в медицине. Препарат томицид, получаемый из бактерий рода Streptococcus, успешно используется как средство для местного применения при лечении ангин, дерматозов, нагноений ран [16]. В последние годы в связи с широким коммерческим использованием бактерий рода Bifidobacterium в составе лечебнопрофилактических препаратов и пищевых продуктов, возрос интерес к изучению их антагонистической активности, однако сведения о бактериоцинах бифидобактерий немногочисленны. На протяжении многих лет в механизме антагонистической активности бифидобактерий большое значение придаётся продукции органических кислот, оказывающих ингибирующий эффект на гнилостную и патогенную микрофлору кишечника. Известно, что многие штаммы бифидобактерий являются антагонистами сальмонелл, а также ингибируют рост бактерий родов Pseudomonas, E.сoli, Staphylococcus, Enterococcus, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Campylobacter, Klebsiella, Gardnerella [90–93]. Следует отметить, что высокую активность кислотообразования, являющуюся общим биологическим признаком рода бифидобактерий, не всегда правомерно идентифицировать с их антагонистической активностью, т.к. культуры с выраженной активностью кислотообразования могут проявлять себя как слабые антагонисты, а среди антагонистически активных бифидобактерий встречаются слабые кислотообразователи. Результаты исследований [91, 92] показали, что антагонистическая активность в ряде случаев обусловлена продукцией бактериоцинов и бактериоцинподобных соединений. Lievin с сотрудниками [94] исследовали антимикробную активность четырнадцати штаммов бифидобактерий, выделенных из толстого кишечника грудных детей. Было обнаружено, что два штамма бифидобактерий, обозначенных как СА1 и F9, ингибировали рост штамма Salmonella typhimurium SL1344. Антибактериальными веществами, ингибирующими рост S. typhimurium 259 SL1344, являлись небольшие липофильные молекулы с молекулярной массой 3500 Да. Toure с сотрудниками [93] исследовали антагонистическую активность 34 штаммов бифидобактерий по отношению к Listeria monocytogenes. Шесть изолятов, обозначенных как RBL67, RBL68, RBL69, RBL70, RBL85 и RBL86, обладали высокой антагонистической активностью. Из культуральной жидкости бифидобактерий были выделены термоустойчивые бактериоцинподобные пептидные соединения, которые сохраняли активность после нагревания при 100 0С в течение 5 мин, но теряли активность под действием протеолитических ферментов, таких как проназа Е, протеиназа К и трипсин. Желче- и кислотоустойчивые штаммы бактерий рода Bifidobacterium выделены и идентифицированы группой испанских исследователей [95]. У 24 штаммов на основании изучения активности нейтрализованных супернатантов культуральной жидкости обнаружены антимикробные соединения белковой природы. Наиболее широким спектром ингибирования обладали 6 штаммов. Отобранные штаммы были активны в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжей, которые имеют значение для безопасности пищи и здоровья человека. Установлено, что антагонистический эффект отобранных штаммов обусловлен бактериоцинподобными соединениями, которые сохраняли активность при рН от 3 до 10, были стабильны 10 мин 0 при нагревании до 100 С, устойчивы к действию α-амилазы и липазы, но чувствительны к протеиназам (трипсину, протеиназе К, протеиназе А, пепсину, катепсину В). Молекулярные массы антимикробных соединений, продуцируемых штаммами Bifidobacterium BIR-0312 и BIR-0324 находятся в области от 10 до 30 kDa, а штаммами Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0326, и BIR0349 - менее 10 kDa. Все штаммы проявляют максимум антимикробной активности в поздней логарифмической фазе роста и в присутствии Tween 80. Эти результаты подтверждают, что синтез бактериоцинподобных ингибиторных соединений является ключевым фактором в ингибировании бактериями рода Bifidobacterium патогенных и спорулирующих бактерий в условиях in vitro. Пробиотические штаммы бифидобактерий ингибировали рост чувствительных и устойчивых к антибиотикам штаммов Helicobacter pylori [96]. Их антагонистический эффект обусловлен термостабильными белковыми соединениями, устойчивыми к нагреванию при 100 °C 10 мин, но чувствительными к протеиназам. Предполагается, что синтез антимикробных пептидов может быть одним из механизмов борьбы с H pylori инфекцией. Yildirim Z. с сотрудниками [97, 98] изучил бактериоцин бифидоцин В, продуцируемый штаммом Bifidobacterium bifidum 260 NCFB1454. Этот бактериоцин имеет молекулярную массу 3,3 кДа, чувствителен к действию протеолитических ферментов (протеиназе К, проназе Е, протеазе XVII, протеиназе К, папаину и трипсину), но устойчив к воздействию каталазы, пероксидазы, липазы, лизоцима, целлюлазы, рибонуклеазы А и амилазы. Бифидоцин В сохраняет активность в широком диапазоне рН (2,0–10,0), после нагревания при температуре 90 0С в течение 30 мин и автоклавирования при 121 0С в течение 15 мин. Устойчив к воздействию органических растворителей, таких, как этиловый спирт, ацетон, хлороформ, метанол и другим. Антагонистическая активность бактериоцина сохраняется при хранении в условиях охлаждения (0 0С) и замораживания (-20 0С) в течение трех месяцев. Авторы установили [103], что бактериоцин B.bifidum NCFB1454 ингибирует рост отдельных видов бактерий родов Listeria, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc и Pediococcus. По своим характеристикам бифидоцин В может быть отнесен к классу бактериоцинов IIа по классификации Klaenhammer. Бифидоцин В способен сорбироваться на клеточной стенке грамположительных, но не грамотрицательных бактерий. Адсорбция определяется кислотностью среды, но не зависит от времени. При рН 5,0–7,0 происходит полная адсорбция бактериоцина на поверхности чувствительных клеток в течение 5 мин. Бифидоцин В обнаруживается в экспоненциальной, а максимум его продукции наблюдается в ранней стационарной фазе роста B.bifidum NCFB1454. Показано, что аминокислотная последовательность бифидоцина В сходна с таковой других бактериоцинов класса IIа. N-концевая область содержит последовательность Lys-Tyr-TyrGly-Asp-Gly-Val, идентичную некоторым другим бактериоцинам класса IIа, таким как баварицин А, курвацин А, леукокцин А, педиоцин РА-1, педиоцин АсН, писцикоцин VIa, писцикоцин VIb, сакацин А, сакацин Р, мезентерицин Y105 и карнобактериоцин В2. Генетические детерминанты продукции бифидоцина В находятся на плазмиде размером около 8 кb. Синтез бактериоцинов установлен также у штаммов Bifidobacterium adolescentis MC-42 и Bifidobacterium bifidum 791 [99– 103]. Максимальный уровень активности антимикробных пептидов установлен к 12–15 час инкубации клеток на среде MRS с цистеином, что соответствует концу логарифмической фазы роста бактерий. Показана продукция бактериоцинов при культивировании бифидобактерий на питательных средах различного состава. Установлено, что накопление бактериоцинов в среде роста бактерий зависит от физико-химических факторов: рН, температуры, состава среды культивирования. Усиление бактериоцинпродукции наблюдается при повышении или понижении темпера- 261 туры культивирования на 5 ºС, поддержании на постоянном уровне рН среды культивирования (рН=7,0). Бактериоцины Bifidobacterium adolescentis MC-42 и Bifidobacterium bifidum 791 характеризуются термостабильностью, сохраняют активность в широком диапазоне рН от 2 до 9, полностью инактивируются трипсином. По данным электрофоретического анализа молекулярная масса бактериоцинов B.adolescentis МС-42 составляет ~12 кДa. Таким образом, анализ имеющихся в литературе сведений показал, что бактериоцинпродукция широко распространена среди грамположительных бактерий. Штаммы, продуцирующие бактериоцины, обнаружены среди представителей всех родов грамположительных бактерий. К настоящему времени накоплен фактический материал, касающийся характеристики бактериоцинпродуцирующих культур грамположительных бактерий, свойств бактериоцинов, их генетической детерминации, практического использования штаммов-продуцентов и бактериоцинов. Однако в литературе весьма ограничены сведения, касающиеся бактериоцинпродукции бактериями рода Bifidobacterium. Имеются лишь отдельные сообщения, подтверждающие продукцию бифидобактериями бактериоцинподобных пептидов, обладающих антибактериальными свойствами. Особое внимание заслуживает изучение бактериоцинов микробиоты кишечника, которая играет важную роль в нормальном функционировании и поддержании здоровья организма-хозяина. Одна из основных физиологических функций резидентной микрофлоры состоит в том, что она является барьером против микробных патогенов. Механизм реализации этой функции пока не ясен. В последнее время накопились доказательство того, что лактобациллы и бифидобактерии проявляют антимикробную активность, которая является частью системы защиты желудочно-кишечного тракта хозяина. Несомненный интерес представляют исследования, направленные на практическое использование бактериоцинов грамположительных бактерий. Использование бактериоцинпродуцирующих штаммов молочнокислых и бифидобактерий для усовершенствования процессов ферментации в пищевой промышленности представляется перспективным, однако отсутствие фундаментальных сведений о бактериоцинпродуцирующих штаммах препятствует их использованию в промышленности. Обоснование возможностей и перспектив использования биологически активных пептидов в биотехнологии послужит основой разработки новых поликомпонентных биопрепаратов для сельского хозяйства, медицины и пищевой промышленности. 262 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Klaenhammer, T.R. Bacteriocin of lactic acid bacteria / T.R. Klaehammer // Biochimie – 1988. – Vol. 70, № 3. – P. 337–349. Gratia, A. Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille / A. Gratia // R.C. Seanses Soc. Biol. Fil. – 1925. – Vol. 94, № 6. – P. 1040–1041. Definition de quelques termes relatifs a la lisogenie / F. Jacob [et al] // Ann. Inst. Pasteur. – 1953 – Vol. 84, № 4. – P. 222–224. Bacteriocins of gram-positive bacteria / J. R. Tagg [et al] // Microbiol. Rev. – 1976. – Vol. 40, № 3. – P. 722–756. Tagg, J.R. Bacteriocins of gram-positive bacteria: an opinion regarding their nature, nomenclature and nambers / J.R. Tagg // Microbiol. Rev. – 1992. – Vol. 340, № 3. – P. 1324–1336. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides in prokariotic and eukaryotic organisms / C.M. Holz [et al] // Food Biotech. – 1993. – Vol. 9, № 3. – P. 85–117. Bacteriocin: Evolution, Ecology and Application / A.R. Margaret [et al] // Annu. Rev. Microbiol – 2002. – Vol. 56. – P. 117–137. Pugsley A.P. The ins and outs of colicins. I. Production and translocation across membranes // Microbiol. Sci. – 1984. – Vol. 1. – P. 168–175. Блинкова, Л.П. Перспективы использования бактериоцинов для профилактики и терапии инфекций / Л.П. Блинкова // Микробиол. эпидемиол. – 1984. – № 5 – С. 10–15. A new family of low molecular weight antibiotics from enterobacteria / C. Ansencio [et al] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1976. – Vol. 69, № 1. – P. 7–14. The microcins / F. Baquero [et al] // FEMS Microbiol. Lett. – 1984. – Vol. 23, № 3. – P. 117–124. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria / I. F. Nes [et al] // Antonie Van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Microbiol. – 1996. – Vol. 70, № 2–4. – P. 113–128. Purification and primary structure of pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici PAC-1.0 / J.T. Henderson [et al] // Arch. Biochem. Biophys. – 1992. – Vol. 295, № 1. – P. 5–12. A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides / J. Nissen-Meyer [et al] // J. Bacteriol. – 1992. – Vol. 174, № 17. – P. 5686–5692. Rogers, L. The inhibiting effect of Streptococcus lactis on Lactobacillus bulgaricus / L. Rogers // J. Bacteriol. – 1928. – Vol. 16, № 5. – P. 321–325. Квасников, Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. – М: Наука, 1975. – 384 с. Bacteriocins of gram-positive bacteria / R.W. Jack [et al] // Microbiol. Rew. – 1995. – Vol. 59, № 2. – P. 170–200. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer [et al] // FEMS Microbiol. Rev. – 1993. – Vol. 12, № 1/3. – P. 39–86. The structure of nisin / E. Gross [et al] // J. Am. Chem. Soc. – 1971. – Vol. 16, № 18. – P. 4634–4635. Structure, organization and expression of the lct gene for lacticin 481, a novel lantibiotic produced by Lactococcus lactis / J.-C. Piard [et al] // J. Biol. Chem. – 1993. – Vol. 268, № 22. – P. 16361–16368. An HlyB-type function is required for expression of the Enterococcus faecalis hemolysin bacteriocin / M.C. Gilmor [et al] // Infect. Immun. – 1990. – Vol. 58, № 12. – P. 3914–3923. Extensive-translational modification, including a serine to d-alanine conversion, in the two-component lantibiotic, lacticin 3147 / M.P. Ryan [et al] // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274, № 53. – P. 37544–37550. 263 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Two component anti Staphylococus aureus lantibiotic activity produced by Staphylococcus aureus C55 / M.A.D.B. Navaratna [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – Vol. 64, № 12. – P. 4803–4808. Ingram, L. C. Synthesis of the lantibiotic nisin: formation of lanthionine and βmethillanthionine / L. C. Ingram // Biochim. Biophys. Acta. – 1969. – Vol. 184, № 6. – P. 216–219. Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from Gram-positive bacteria / H.-G. Sahl [et al] // Annu. Rev. Microbiol. – 1998. – Vol. 52. – P. 41–79. Jung, G. Lantibiotics: a survey. In: Nisin and novel lantibiotics / G. Jung, H.-G. Sahl – Leiden: ESCOM, 1995. – 34 p. Lantibiotika, eine klasse ribosomal synthesierter peptid antibiotica / K.D. Entian [et al] // Naturwissenschaften. – 1993. – Vol. 80. – P. 454–460. Antibiotics synthesized by post-translational modification / J. N. Hansen // Annu. Rev. Microbiol. – 1993. – Vol. 47. – P. 535–564. Biosynthesis of the lantibiotic Pep5: isolation and characterization of a prepeptide containing dehydroamino acids / H.-P. Weil [et al] // Eur. J. Biochem. – 1990. – № 194. – P. 217–223. Maturation pathway of nisin and other lantibiotics: post-translationally modified antimicrobial peptides exported by Gram-positive bacteria / W.M. de Vos [et al] // Mol. Microbiol. – 1995. – Vol. 17, № 3. – P. 427–437. Biosynthesis and biological activities of lantibiotic with unique post-translational modifications / H.-G. Sahl [et al] // Eur. J. Biochem. – 1995. – Vol. 230, № 7. – P. 827–853. Heterologous expression and purification of SpaB involved in subtilin bisynthesis / L. Xie [et al] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2002. – Vol. 295, № 4. – P. 952–957. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action / O. McAuliffe [et al] // FEMS Microboil. Rev. – 2001. – Vol. 25, № 3. – P. 285–308. Nucleotide sequence of the streptococcin A-FF22 lantibiotic regulon,: model for production of the lantibiotic SA-FF22 by strains of Streptococcus pyogenes / R.E. McLaughlin [et al] // FEMS Microbiol. Lett. – 1999. – Vol. 175, № 2. – P. 171–177. Prepeptide sequece of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four suiphide rings / N. Schnell [et al] // Nature Lond. – 1988. – Vol. 333, № 6170. – P. 276–278. Pep5, a new lantibiotic: structural gene isolation and prepeptide sequence / C. Kaletta [et al] // Arch. Microbiol. – 1989. – Vol. 152, № 1. – P. 16–19. Genetic analysis of the pDA hemolysin/bactericin determinant in Enterococcus faecalis: Tn917 insertional mutagenesis and cloning / Y. Ike [et al] // J. Bacteriol. – 1990. – Vol. 172, № 3. – P. 155–163. Sequence and analysis of the 60 kb conjugative, bacteriocin-producing plasmid pMRC01 from Lactococcus lactis DPC3147 / B.A. Dougherty [et al] // Mol. Microbiol. – 1998. – Vol. 29, № 4. – P. 1029–1038. New gene cluster for lantibiotic streptin possibly involved in streptolisin S formation / K. Karaya [et al] // J. Biochem. – 2001. – Vol. 129, № 5. – P. 769–775. The genes coding for enterocin EJ97 production by Enterococcus faecalis EJ97 are located on a conjugative plasmid / M. Sanchez-Hidalgo [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – Vol. 69, № 3. – P. 1633–1641. IS1675, a novel lactococcal insertion element, forms a transposon-like structure including the lacticin 481 lantibiotic operon / A. Dufor [et al] // J. Bacteriol. – 2000. – Vol. 182, № 19. – P. 5600–5605. Maturation pathway of nisin and other lantibiotics: post-translationally modified antimicrobial peptides exported by Gram-positive bacteria / W.M. de Vos [et al] // Mol. Microbiol. – 1995. – Vol. 17, № 3. – P. 427–437. 264 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 LasX, a transcriptional regulator of the lactocin S biosynthetic genes in Lactobacillus sakei L45, acts both as an activator and a repressor / E. L. Rawlinson [et al] // Biochemie. – 2002. – Vol. 84, № 5/6. – P. 559–567. Pep5: structure elucidation of a large lantibiotic / R. Kellner [et al] // Angew. Chem. Int. Engl. – 1989. – Vol. 28, № 3. – P. 616–619. Purification and primary structure of pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici PAC-1.0 / J.T. Henderson [et al] // Arch. Biochem. Biophys. – 1992. – Vol. 295, № 1. – P. 5–12. Purification and amino acid sequence of sakacin A, a bacteriocin from Lactobacillus sake Lb706 / A.L. Holck [et al] // J. Gen. Microbiol. – 1992. – Vol. 138, № 12. – P. 2715–2720. A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides / J. Nissen-Meyer [et al] // J. Bacteriol. – 1992. – Vol. 174, № 17. – P. 5686–5692. Purification and partial characterization of lactacin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus 11088 / P. M. Muriana [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1991. – Vol. 57, № 1. – P. 114–121. Mutation analysis and chemical modifications of Cys24 of lactococcin B, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis / K. Venema [et al] // Microbiology – 1996. – Vol. 142, № 10. – P. 2825–2830. Inhibition of Listeria monocytogenes by bavaricin produced by Lactobacillus bavaricus Mi401 / A.G. Larsen [et al] // Lett. Appl. Microbiol. – 1996. – Vol. 17, № 7. – P. 132–134. Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity / S. Ennahar [et al] // FEMS Microbiol. Rev. – 2000. – Vol. 24, № 1. – P. 85–106. Dynamic relationships among type IIa bacteriocins: temperature effects on antimicrobial activity and on structure of the C-terminal amphipathic alpha helix as a receptor-binding region / K. Kaur [et al] // Biochemistry – 2004. – Vol. 43, № 28. – P. 9009–9020. Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris isolation and characterization of the protein and its gene / H. Holo [et al] // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173, № 12. – P. 3879–3887. Molecular analyses of the lactococcin A gene cluster from Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. Diacetylactis WM4 / G. W. Stoddard [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – Vol. 58, № 6. – P. 1952–1961. Bacteriolytic activity cauced by the presence of a novel lactococcal plasmid encoding Lactococcus A, B and M / S. Morgan [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1995. – Vol. 61, № 10 – P. 1995–3001. Purification and characterization of plantaricin A, a Lactobacillus plantarum bacteriocin whose activity depends on the action of two peptides / J. Nissen-Meyer [et al] // J. Gen. Microbiol. – 1993. – Vol. 139, № 9. – P. 1973–1978. Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid bacteria / V.G.H. Eijsink [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – Vol. 64, № 9. – P. 3275–3281. Divercin V41, a new bacteriocin with two disulphide bonds produced by Carnobacterium divergenes V41: primary structure and genomic organizations / A. Metivier [et al] // Microbiology – 1998. – Vol. 144, № 10 – P. 2837–2844. Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481 / M. C. Joerger [et al] // J. Bacteriol. – 1986. – Vol. 167, № 2. – P. 439–446. Purification and partial amino acid sequence of plantaricin S, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the activity of which depends on the complementary action of two peptides / R. Jimenez-Diaz [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1995. – Vol. 61, № 12. – P. 4459–4463. 265 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 Kinetic studies of the action of lacticin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus johnsonii that forms poration complexes in the cytoplasmic membrane / T. Abee [et al] // Appl. Enviro. Microbiol. – 1994. – Vol. 60, № 3 – P. 1006–1013. Genes involved in self-protection against the lantibiotic subtilin produced by Bacillus subtilis / C. Klein [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – Vol. 60, № 8. – P. 2793–2801. Kaletta, C. Nisin, a peptide antibiotic: cloning and sequencing of the nis 4 gene and posttranslational processing of its peptide product / C. Kaletta // J. Bacteriol. – 1989. – Vol. 171. – P. 1597–1601. Henderson, J.T. Purification and primary structure of pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici PAC-1.0 / J.T. Henderson // Arch. Biochem. Biophys. – 1992. – Vol. 295. – P. 5–12. Tichaczer, P.S. Cloning and sequences of sak P encoding, the bacteriocin produced by Lactobacillus sake LTH 673 / P.S. Tichaczer // Microbiology. – 1994. – Vol. 140. – P. 361–367. Hastings, J.W. Characterization of leucocin A-UAL 187 and cloning of the bacteriocin gene from Leuconostoc gelidium / J.W. Hastings // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 7497–7500. Premaux, C. Molecular analysis of the lactacin F operon / C. Premaux // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – Vol. 59. – P. 3906–3915. Holo, H. Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. Cremoris: isolation and characterization of the protein and its gene / H. Holo // J. Bacteriol. – 1991. – Vol. 173. – P. 3879–3887. Venema, K. Mode of action of LciA, the lactoccin A immunity protein / K. Venema, // Molec. Microbiol. – 1994. – Vol. 14. P. 521–533. Motlagh, A.M. Complete nucleotide sequences of pSMB74, a plasmid encoding production of pediocin AcH in Pediococcus acidilactici / A.M. Motlagh // Lett. Appl. Microbiol. – 1994. – Vol. 18. – P. 305–312. Production kinetics of acidophilin 801, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus IBB 801 / M. Zamfir [et al] // FEMS Microbiol Lett. – 2000. – Vol. 190, № 2. – P. 305–308. Production and pH-dependent bactericidal activity of lactocin S, a lantibiotic from Lactobacillus sakei L45 / C.I. Mortvedt-Abildgaard [et al] // Appl. Inviron. Microbiol. – 1995. – Vol. 61, № 1. – P. 175–179. Lactostrepcins – acid bacteriocins produced by lactic streptococci / W. Kozak [et al] // J. Dairy Res. – 1978. – Vol. 45, № 2. – P. 247–257. Plantaricin S and T, two new bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum LPCO10 isolated from a green olive fermentation / R. Jimenez-Diaz [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – Vol. 59, № 5. – P. 1416–1424. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H / S.R. Biswas [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1991. – Vol. 57, № 4. – P. 1265–1267. Antimicrobial activity of lactobacilli: preliminary characterization and optimization of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus M46 / B. Ten Brink [et al] // J. Appl. Bacteriol. – 1994. – Vol. 77, № 2. – P. 140–148. Hirsch, A. Growth and nisin production of a strain of Streptococcus lactis / A. Hirsch // J. Gen. Microbiol. – 1951. – Vol. 5, № 1. – P. 208–221. Influence of pH on the production of enterocin 1146 during batch fermentation / E. Parente [et al] // Lett. Appl. Microbiol. – 1994. – Vol. 19, № 1. – P. 12–15. Effect of nitrogen sources on bacteriocin production by Enterococcus faecium A 2000 / A. Pantev [et al] // Folia Microbiol. – 2002. – Vol. 47, № 6. – P. 659–662. Influence of complex nutrient source on growth of and curvacin a production by sausage isolate Lactobacillus curvatus LTH 1174 / J. Verluyten [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, № 9. – P. 5081–5088. 266 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 A comparison of factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria / E. Parente [et al] // J. Appl. Bacteriol. – 1992. – Vol. 73. – P. 290–298. Production of sacacin P by Lactobacillus sakei in a comletely defined medium / T. Moretro [et al] // J. Appl. Microbiol. – 2000. – Vol. 88, № 3. – P. 536–545. Influence of growth conditions on the production of a nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis A164 isolated from kimchi / C.I. Cheigh [et al] // J. Biotechnol. – 2002. – Vol. 93, № 3. – P. 225–235. Nutritional factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria on whey / N.P. Guerra [et al] // Int. J. Food Microbiol. – 2001. – Vol. 70, № 3. – P. 267–281. Influence of complex nutrients, temperature and on bacteriocin production by Lactobacillus sakei CCUG 42687 / I.M. Aasen [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – Vol. 53, № 2. – P. 159–166. The curing agent sodium nitrite, used in the production of fermented sausages, is less inhibiting to the bacteriocin-producting meat starter culture Lactobacillus curvatus LTH 1174 under anaerobic conditions / J. Verluyten [et al] // Appl. Inviron. Microbiol. – 2003. – Vol. 69, № 7. – P. 3833–3839. Biphasic kinetics of growth and bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus DCE 471 occur under stress conditions / P. Neysens [et al] // Microbiology – 2003 – Vol. 149, № 4. – P. 1073–1082. The presence of salt and a curring agent reduces bacteriocin production by Lactobacillus sakei CTC 494, a potential starter culture for sausage fermentation / F. Leroy [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65, № 12. – P. 5350–5356. Primary metabolite kinetics of bacteriocin biosynthesis by Lactobacillus amylovorus and evidence for stimulation of bacteriocin production under unfavorable growth condition / L. De Vuyst [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1996. – Vol. 42. – P. 817–827. Isolation of Bifidobacterium infantis and antagonistic activity against ETEC 0157 and Salmonella typhimurium S-285 in weaning foods / R.M. Yosof [et al] // Asia Pacific J. Clinic Nutr. – 2000. – Vol. 9, № 2. – P. 130–137. In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 by bifidobacterial strains of human origin / M. Gagnon [et al] // Int. J. Food. Microbiol. – 2003. – Vol. 92, № 1. – P. 69–78. Screning of Bifidobacterium strains isolated from human faeces for antagonistic activities against potentially bacterial pathogens / L. Bevilacqua [et al] // Microbiol Res. – 2003. – Vol. 158, № 2. – P. 179–185. Servin, A.L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial patogens / A.L. Servin // FEMS Microbiol. Rev. – 2004. – Vol. 28, № 4. – P. 405–440. Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinal microflora exert antimicrobial activity / V. Lievin [et al] // Gut. – 2000. – Vol. 47, № 5. – P. 646–652. Collado, M.C. Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bifidobacterium strains / M.C. Collado // J Food Prot. – 2005. – Vol. 68, № 5. – P. 1034–1040. Collado, M.C. Antimicrobial peptides are among the antagonistic metabolites produced by Bifidobacterium against Helicobacter pylori / M.C. Collado // Int. J. of Ant. Ag. – 2005. – Vol. 25, № 5 – P. 385–391. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454 / Z. Yildirim [et al] // J. Food Prot. – 1998. – Vol. 61, № 1. – P. 47–51. Purification, amino acid sequence and mode of action of bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB1454 / Z. Yildirim [et al] // J. Appl. Microbiol. – 1999. – Vol. 86, № 1 – P. 45–54. 267 99 100 101 102 103 Сравнительная характеристика активности роста некоторых представителей р. Bifidobacterium / В.А. Щетко [и др] // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2002. – № 3. – С. 50–55. К механизму антимикробной активности бифидобактерий / Н.И Aстапович [и др] // Доклады НАН Беларуси – 2004. – Т. 48, № 4. – С. 57–61. Продукция бактериоцинов бактериями р. Bifidobacterium в зависимости от условий культивирования / Н.И. Астапович [и др] // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2006. – № 2. – С. 87–91. Локализация генов бактериоцинпродкуции бифидобактерий – компонентов пробиотических препаратов / В.А. Щетко [и др] // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества: материалы междунар. науч.-практ. конф., Минск–Нарочь, 25–28 мая 2005 г. / Белорус. гос. ун-т.; сост. и общ. ред А.Н. Евтушенкова, – Минск, 2005. – С. 268–269. Выделение и некоторые свойства бактериоцинов Вifidobacterium adolescentis MC-42 / В.А. Щетко [и др] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы междунар. конф., Минск–Раков, 1–2 июня 2006г. / Ин-т микробиологии НАН Беларуси; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 200–203. BACTERIOCINS OF GRAM-POSITIVE BACTERIA AND PROSPECTS OF THEIR PRACTICAL APPLICATION Golovneva N.A., Shchatko V.A., Grel M.V. Laboratory of lactic acid bacteria and bifidobacteria Bacteriocins are antibiotic proteins showing bactericidal activity towards mainly bacteria of phylogenetically related species. Of special interest are bacteriocins and bacteriocin-like compounds of gram-positive bacteria due to their potential application as bioconservating agents in foodstuffs, fodder and as medicines. Strains producing bacteriocins are found among representatives of all genera of gram-positive bacteria. Now many bacteriocin-generating strains of lactic acid bacteria are used in food industry. Especially attractive are bacteriocins inhibiting growth of pathogenic microflora. Utilization of bacteriocin- synthesizing strains of lactic acid bacteria and bifidobacteria to improve fermentation processes in food industries appears a promising trend, yet lack of fundamental data on bacteriocin-producing strains prevents their broad industrial application. УДК 637.146:616.34-008:579.8.017 КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ: НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Рахуба Д. В., Новик Г. И. лаборатория «Коллекция микроорганизмов» Обзор посвящен проблемам сохранения жизнеспособности, стабильности и активности пробиотических микроорганизмов при криоконсервации. Рассматри- 268 ваются основные механизмы повреждения клеток при замораживании и отогреве, роль криопротекторов и других факторов, влияющих на выживаемость молочнокислых и бифидобактерий при криоконсервации. Также приведены имеющиеся в литературе данные об оптимальных режимах замораживания пробиотических микроорганизмов. Криоконсервация – совокупность методов хранения биологических объектов при низких температурах. Теоретическая основа криоконсервации – криобиология – раздел биологии, изучающий действие на живые системы низких и сверхнизких температур – от 0 °С до близких к абсолютному нулю. Основные задачи криобиологии - изучение жизни в условиях холода, выяснение причин устойчивости организмов к переохлаждению и замерзанию, исследование повреждающего действия отрицательных температур. Микроорганизмы-пробиотики обладают иммуномодулирующими свойствами и способностью к продукции антимикробных метаболитов. Препараты на их основе используются в клинической практике для регрессии опухолей и уменьшения действия канцерогенов и мутагенов, снижения содержания холестерина в сыворотке крови и артериального давления, предотвращения запоров и диареи, профилактики и лечения ряда стоматологических заболеваний и др. Впервые термин «пробиотики» (от греческого “pro bio”, «для жизни») был введен в 1954 году F. Vergio, который в своей монографии «Anti- und Probiotika» проводил сравнение различных соединений, обладающих как антимикробными, так и позитивными эффектами воздействия на кишечную микрофлору. В последующем Lilly и Stillwell (1965) под термином пробиотики предложили понимать живые микроорганизмы, усиливающие рост представителей нормальной микрофлоры. История применения пробиотиков для лечения и профилактики инфекционных заболеваний слизистых оболочек человека насчитывает уже более 100 лет. С появлением антибиотиков эти препараты были практически вытеснены из врачебной практики. В настоящее время, в связи с ростом количества резистентных к антибиотикам штаммов бактерий, использование пробиотиков вновь становится актуальным. Чаще всего в качестве пробиотиков применяют штаммы молочнокислых и бифидобактерий, которые являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. В настоящее время препараты и продукты, созданные на их основе, рассматриваются в качестве основы функционального питания человека и составов, способствующих профилакти- 269 ке ряда заболеваний. Положительный эффект достигается как путем введения живых клеток пробиотических бактерий непосредственно в организм человека, так и путем использования этих микроорганизмов в составе продуктов питания, в том числе кисломолочных продуктов [1]. В связи с вышеизложенным актуальной является проблема длительного сохранения штаммов молочнокислых и бифидобактерий, используемых в производстве продуктов функционального питания и коммерческих лечебно-профилактических препаратов. Целью данной публикации является обзор немногочисленных, имеющихся в литературе данных, касающихся практического использования криоконсервации, как одного из методов, позволяющего длительно сохранять жизнеспособность пробиотических микроорганизмов без изменения их промышленно-ценных свойств. Теоретические аспекты криоконсервации. Основной принцип криобиологии заключается в том, что степень повреждения при замораживании зависит от количества свободной воды в биологической системе и способности этой воды кристаллизоваться в течение замораживания [2]. Вода – главный компонент всех живых клеток и должна присутствовать для протекания химических реакций. При замораживании микроорганизмов большинство воды превращается в лед и клеточный метаболизм прекращается. Поэтому с точки зрения теоретической криобиологии процесс криоконсервирования рассматривают как способ перевода клетки в состояние глубокого холодового анабиоза с последующим возвратом в исходное состояние. Разработка методов и технологических приемов криоконсервации микробиологических объектов требует предварительной многоплановой исследовательской работы, связанной с изучением механизмов криозащиты и криоповреждения клеток, установлением закономерностей, характеризующих изменения физиолого-биохимических свойств микроорганизмов после криоконсервирования. Большинство повреждений клеток возникает на этапах замораживания-отогрева, их частота и интенсивность зависят от скоростей отвода и подвода тепла, скорости кристаллизации и рекристаллизации, характера действия изменяющихся концентраций солей и т.д. В ходе замораживания вода, окружающая клетку, замерзает раньше, чем внутри клетки [3, 4]. Это происходит за счет того, что концентрация цитоплазмы выше, чем концентрация окружающей среды. Более того, термодинамически в пространствах с большим объемом быстрее формируются центры кристаллиза- 270 ции. В результате замерзания воды, возрастает концентрация солей в оставшейся жидкой фазе. Таким образом, формируется концентрационный фактор, который действует как осмотический шок, в результате которого внутриклеточная вода выходит из клетки в более концентрированный окружающий раствор [5]. Кроме того, повреждающий эффект при замораживании может быть связан с формированием внутриклеточных кристаллов льда. На жизнеспособность микроорганизмов и сохранение их физиолого-биохимических свойств при замораживании могут оказывать влияние различные факторы. Наиболее значимые из них – скорость охлаждения и отогрева, использование криопротекторов. Устойчивость микроорганизмов к низким температурам в ряде случаев, определяется степенью аэрации культуры. У хорошо аэрируемых культур обнаружена более высокая устойчивость в процессе замораживания – отогрева. На результат криоконсервирования влияет концентрация клеток в суспензии микроорганизмов. Это связано с тем, что при возрастании количества клеток в суспензии уменьшается содержание внеклеточной воды [6]. Криоустойчивость зависит также от исходного морфофункционального состояния клеток, которое определяется фазой роста. Клетки в стационарной фазе роста обладают наиболее высокой устойчивостью [7]. Скорость охлаждения и отогрева. В результате многочисленных исследований установлено, что не только для каждого вида, но и для штаммов одного и того же вида микроорганизмов необходимо в ряде случаев подбирать оптимальные скорости замораживания и отогрева. Для большинства микробных клеток показано два оптимума на шкале скоростей охлаждения, при которых отмечается максимальная выживаемость клеток при замораживании. Один из них наблюдается в зоне медленных скоростей охлаждения, второй – в зоне сверхбыстрых скоростей охлаждения [8]. При высоких скоростях замораживания снижается влияние концентрационных градиентов в результате короткого времени их действия. При низких скоростях клетка теряет большое количество воды, что приводит к минимизации эффекта образования внутриклеточных кристаллов льда [9]. Скорость отогрева не менее важна, чем скорость замораживания. Наиболее оптимальны для бактерий быстрые скорости отогрева, при которых удается максимально избежать процесса рекристаллизации в интервале температур (-196)–(-130) °С [6]. Использование криопротекторов. Криопротекторами принято называть вещества, которые при их добавлении в суспензию клеток, обладают способностью повышать устойчивость микроорганизмов к криоповреждениям, увеличивать их выживае- 271 мость при заморозке и последующем отогреве. Наиболее часто используемыми криопротекторами являются глицерол и диметилсульфоксид (ДМСО). Кроме этого криопротекторным действием обладает ряд углеводов, декстраны, крахмал, поливинилпирролидон (ПВП), а также многие многокомпонентные вещества, в том числе такие, как молоко, яичный желток, элективные среды, мясопептонный бульон и др. [10]. Несмотря на то, что криопротекторы являются предметом многочисленных исследований во всем мире на протяжении более чем пятидесяти лет, механизмы их действия окончательно не установлены. Среди наиболее вероятных приводятся следующие: - подавление возрастания концентрации солей в растворах, - снижение поражения поверхности клеток при дегидратации, - уменьшение количества кристаллов образовавшегося льда внутри клетки. Для криопротекторов внутриклеточного действия важно определение отрезка времени после смешивания с бактериальной суспензией, необходимого для эффективного проникновения протектора в клетку. Этот отрезок времени называется эквилибрацией. Если время эквилибрации слишком велико, это, как правило, приводит к токсическому действию криопротектора на микроорганизм. Оптимальное время эквилибрации устанавливается эмпирически для каждого вида клеток [8]. Криоконсервирование пробиотических микроорганизмов. В ведущих коллекциях мира (CBS, ATCC, NRRL) для длительного хранения промышленно-ценных культур пробиотических микроорганизмов применяются методы лиофилизации и криоконсервации с использованием жидкого азота t (-196) °C или ультранизких морозильников – t (-40) – (-70) °C. Создаются коллекционные банки, задачей которых является долгосрочное хранение культур для нужд медицины, биотехнологических производств и научно-исследовательских работ. Примером может явиться низкотемпературный банк, созданный более 30 лет назад на базе Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины в Харькове, которому с 2002 года присвоен статус Национального достояния Украины. Метод криоконсервации является имеет ряд преимуществ, поскольку сохраняемые таким образом микроорганизмы могут использоваться в технологическом процессе сразу же после отогрева, в то время как использование лиофилизированных объектов требует длительной процедуры репарации. В связи с этим перспективным направлением является разработка безотмывоч- 272 ных технологий криоконсервации пробиотических микроорганизмов, т.е. низкотемпературного консервирования с криопротекторами, не требующими их удаления из клеточной суспензии перед использованием в медицине, пищевой промышленности, ветеринарии. Криоконсервирование молочнокислых бактерий. Отдельные представители бактерий, относящихся к роду Lactobacillus, обладают низкой устойчивостью к криоконсервированию. Так, замораживание L. bulgaricus в жидком азоте при скорости охлаждения 400 °С/мин не дает удовлетворительных результатов выживаемости клеток. Добавление в среду таких криопротекторов как глицерол и DMSO также не приносит желаемых результатов, что свидетельствует о том, что действие концентрационного градиента не является основным повреждающим фактором при замораживании клеток данного организма. Повысить криорезистентность бактерий можно путем добавления в среду культивирования Tween 80, который обладает стимулирующим действием на рост L. bulgaricus [11]. Для L. acidophilus показана зависимость криорезистентности от температуры культивирования и рН среды [12, 13]. Так, наибольшей устоичивостью обладают бактерии, выращенные при 30 °С и рН=5, в то время как наилучшие показатели кислотообразующей активности у бактерий, не подвергавшихся криоконсервации, наблюдаются при выращивании их при температуре 37 °С и при рН=6. Это объясняется тем, что клетки, культивируемые при более низких относительно оптимума температурах, адаптируются и становятся более устойчивыми при последующей криоконсервации. Механизм холодовой адаптации заключается в возрастании в мембранах клеток процентного соотношения ненасыщенных жирных кислот. В отличие от лактобацилл, среди видов молочнокислых стрептококков наблюдается различная степень устойчивости к повреждающему действию низких температур [6]. Например S. cremoris обладает выраженной криолабильностью; наиболее стабилен к замораживанию – отогреву S. lactis. Промежуточное положение по степени устойчивости к низким температурам занимает S. diacetilactis. Хорошей протекторной средой для криоконсервирования молочнокислых стрептококков является 10%-ное восстановленное молоко либо среда культивирования. Необходимая концентрация бактерий в суспензии составляет 1010–1011 КОЕ/мл. Оптимальный режим криоконсервирования стрептококков – скорость охлаждения 400 °С/мин, хранение при -196 °С и отогрев на водяной бане в интервале температур 20–45 °С. 273 Криоконсервирование бифидобактерий. Бифидобактерии обладают достаточно высокой криоустойчивостью и хорошо переносят процессы замораживания и хранения. Подобрав оптимальные режимы криоконсервирования и криопротекторы, можно добиться 100% сохранения жизнеспособности клеток. Для Bifidobacterium adolescentis выявлена зависимость жизнеспособности от скорости охлаждения и концентрации клеток в суспензии [14]. Так, для концентрированных суспензий оптимальными являются высокие скорости охлаждения (100–400 °С/мин), в то время как для суспензий с низкой концентрацией клеток, высокая выживаемость культур достигается при низких скоростях охлаждения (4 °С/мин). Добавление 10% раствора сахарозы в суспензию увеличивает выживаемость бифидобактерий, что свидетельствует о криозащитном эффекте углеводов. Оптимальным режимом является хранение бифидобактерий при температуре – 196 °С в жидком азоте. Клетки Bifidobacterium animalis, замораживаемые при -135 ºС с использованием в качестве криопротекторов сахарозы и обезжиренного молока, обладают высокой криоустойчивостью. Высокая выживаемость при данных условиях криоконсервирования характерна также для видов Bifidobacterium breve и Bifidobacterium catenulatum. Однако существуют различия в чувствительности разных штаммов к замораживанию в присутствии данных криопротекторов [15]. При исследовании влияния pH среды культивирования на выживаемость Bifidobacterium longum при криоконсервации не было обнаружено каких либо различий. Количество выживших клеток было максимальным во всех вариантах рН среды культивирования (5.5, 6.0, 6.5 и 7.0) для исследуемых штаммов [16]. Следует также отметить, что метод криоконсервации обеспечивает большую выживаемость данных видов, чем метод лиофилизации. Заключение. Подводя итог, необходимо отметить, что анализ литературных данных однозначно свидетельствует о том, что, несмотря на высокую устойчивость пробиотических микроорганизмов к процессам замораживания, для каждого отдельного вида и даже штамма необходимо в ряде случаев подбирать индивидуальные режимы криоконсервации. Для достижения данной цели необходимо решение следующих задач: - разработка криопротекторных сред для эффективной криозащиты пробиотических микроорганизмов; - изучение криоповреждений клеток и их репарации после действия холода; - исследование индивидуальной устойчивости культур к холоду и эффективности криозащиты; 274 - разработка оптимальных режимов безотмывочного способа криоконсервации пробиотических микроорганизмов. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Пробиотики и функциональное питание / Б.А. Шендеров [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. – 1997. – Т. 42, № 7. – С. 30–34. Cryopreservation manual: a guide to cryopresevation techniques. / G.M. Kelvin – Brockbank; Thermo Electron Corporation, 2004, – 25 p Farrant, J. General observations on cell preservation / J. Farrant //. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology, Pitman Medical Limited, Kent, England. – 1980. – P. 1–18. Mazur, P. Cryobiology: the freezing of biological systems / P. Mazur // Science. – 1970. – № 168 – P. 939–949. Pegg, David E. Long-term preservation of cells and tissues: a review / David E. Pegg // J. Clin. Path. – 1976. – Vol. 29. – P. 271–285. Криобиология и биотехнология. / А.А. Цуцаева [и др.]; под общ. ред. А.А. Цуцаевой. – Киев: Наук. Думка, 1987. – 165 с. Heckly, R.J. Preservation of microorganisms / R.J. Heckly // Advances in Applied Microbiology. – 1978. – Vol. 24, – P. 1–53. Simione, Frank P. Cryopreservation manual / Frank P. Simione. – American Type Culture Collection (ATCC) in cooperation with Nalge Nunc International Corp. – 1998. – 8 p. A two factor hypothesis of freezing injury / P. Mazur [et al.] // Experimental Cell Research. – 1972. – Vol. 71. – P. 345–355. Hubalek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms / Z. Hubalek // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46. – P. 205–229. Death of Lactobacillus bulgaricus Resulting from Liquid Nitrogen Freezing / R.B. Smittle [et al] // Applied Microbiology. – 1972. – Vol. 24, № 4. – P. 551–554. Influence of growth temperature on cryotolerance and lipid composition of Lactobacillus acidophilus / M. L. Fernandez Murga [et al] // Applied Microbiology. – 2000. – Vol. 88. – P. 342–348. Fermentation pH and Temperature Influence the Cryotolerance of Lactobacillus acidophilus RD758 / Y. Wang [et al] // J. Dairy Sci. – 2005. – Vol. 88. – P. 21–29. Сохранение жизнеспособности и физиологических свойств бифидобактерий при криоконсервации и лиофилизации / Г.И. Новик [и др.] // Микробиология. – 1998. – Т. 67, № 5. – С. 637–642. Resistance to freezing and freeze-drying storage processes of potential probiotic bifidobacteria / M. Modesto [et al] // Ann. Microbiol. – 2004. – Vol. 54. – P. 43–48. Bifidobacterium longum Survival During Frozen and Refrigerated Storage as Related to pH during Growth / S.S. Reilly [et al] // Journal of Food Science. – 1999. – Vol. 64. – P. 714–718. CRYOPRESERVATION OF PROBIOTIC MICROORGANISMS: SCIENTIFIC BASES OF PRACTICAL USE RAKHUBA D. V., NOVIK G. I. Laboratory “Microbial collection” The review is devoted to problems of preservation of viability, stability and activity of probiotic microorganisms at cryopreservation. The basic mechanisms of damage of cells at freezing and warming, a role of cryoprotectans and other factors influencing at survival of microorganisms at cryopreservation are considered. Also, data available in the literature on optimum freezing conditions of various groups of probiotic microorganisms are cited. 275 БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И ПРОМЫШЛЕННОСТИ УДК 579.22:663.051.2 КОМБИНИРОВАННЫЕ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ГРИБОВ Щерба В.В.1, Бабицкая В.Г.1, Пленина Л.В.2, Гвоздкова Т.С.1, Пучкова Т.А.1, Смирнов Д.А.1, Лопатенто Ю.С.2, Осадчая О.В.2 1 2 Институт микробиологии НАН Беларуси Республиканское унитарное предприятие «Диалек» На основе трех лекарственных грибов (Ganoderma lucidum, Lentinus edodes, Laetiporus sulphureus) созданы лечебно-профилактические препараты (2 композиции) многофункционального назначения. Препараты содержат белок (до 30%), полисахариды (до 11%), каротиноиды (до 10 мг/г), липиды (до 13%), фосфолипиды (до 30% от суммы липидов), фенольные соединения (до 1790 мг%). Антиоксидантная активность препаратов – 90–95% по отношению к ионолу. Установлено in vivo иммуностимулирующее, гепатопротекторное и антиоксидантное действие композиций. Введение. В современном мире сверхскоростей, стрессов, загрязненной окружающей среды проблема здоровья становится особенно актуальной. За последние 20 лет многие болезни возникают у людей все более молодого возраста – "помолодели" атеросклероз, сахарный диабет, злокачественные новообразования. Нарушения иммунитета регистрируются в 50–80% случаев. Одновременно с этими тревожными тенденциями врачи отмечают падение эффективности традиционных методов лечения. Все исследователи сходятся во мнении, что причиной подобных явлений в решающей степени является неблагоприятное воздействие экологической обстановки. Одними из важнейших факторов, определяющими состояние здоровья населения, являются лечебно-профилактические меры, а также рациональное питание. Результаты широкомасштабных эпидемиологических исследований, проведенных Институтом питания РАМН, свидетельствуют о следующих наиболее важных нарушениях в пищевом статусе: избыточное потребление животных жиров и дефицит полиненасыщенных жирных кислот, полноценных белков, большинства витаминов, минеральных веществ (кальция, железа), неза- 276 менимых микроэлементов (йода, фтора, цинка, селена) и пищевых волокон. Научно обоснованным, наиболее быстрым и экономичным путем решения проблемы восполнения алиментарных дефицитов, коррекции различных иммунных и метаболических нарушений является регулярное и целенаправленное применение препаратов (биологически активных добавок к пище), представляющих собой натуральные комплексы, удовлетворяющие потребности в эссенциальных веществах, таких как витамины, минералы и микроэлементы, пищевые волокна, аминокислоты, ненасыщенные жирные кислоты и др. О лечебных свойствах высших грибов известно давно, традиция их применения для лечения и профилактики различных болезней сформировалась еще в древнейшие времена. Об этом свидетельствуют литературные источники Древнего Китая, датированные периодом около 1 в. н.э. Так, в "Священной Книге о чудодейственных лекарственных растениях" (Китай) гриб ганодерма (Ganoderma lucidum) назван "лучшим среди 365 самых ценнейших лекарственных растений Востока", превосходящим по адаптогенным и тонизирующим свойствам знаменитый женьшень. Не менее знаменитым, является и гриб шиитаке (Lentinus edodes). Он съедобен и относится к деликатесным продуктам. Изучение химического состава гриба шиитаке показало, что в нем содержится полисахарид лентинан (β-1,3–D-глюкан с разветвленной структурой), обладающий по экспериментальным данным ряда исследователей противоопухолевой и иммунотропной активностями. В мицелии шиитаке содержится 18 аминокислот, витамины группы В, фенольные соединения. Эндогенные полисахариды гриба оказывают иммуномодулирующий эффект, способствуют увеличению продукции Т-лимфоцитов. Таким образом, физиологически активные соединения грибов привлекали и привлекают внимание специалистов всего мира. И это естественно: многие из них стали основой широкого спектра антибиотиков, другие – препаратов онкостатического, иммуномодулирующего действия. К концу ХХ и началу ХХI веков были накоплены данные, показывающие, что именно грибы благодаря большой гетерогенности физиолого-биохимических свойств становятся основными продуцентами в биотехнологии и могут заменить растения, животных и бактерии. Повышенному интересу к грибам способствовали многочисленные исследования, показавшие, что эти организмы могут стать незаменимыми источниками для получения лекарственных препаратов, имеющих ранозаживляющую, антиспидовую, иммуномодулирующую и особенно антираковую активности. Именно на основании этих дос- 277 тижений к 90-м годам прошлого столетия была создана новая область медицины – фармацевтическая микология. Созданные на основе лекарственных грибов препараты выполняют не только функции нутрицевтиков, но и парафармацевтиков, применяемых для профилактики, вспомогательной терапии и поддержки в физиологических границах функциональной активности органов и систем. Отсутствие в рационе питания физиологически функциональных, незаменимых для человека соединений приводит к нарушениям обмена веществ и, как следствие, к тем или иным заболеваниям. С этой точки зрения необходимо отметить, что наиболее дефицитным компонентом в питании людей является полноценный белок. Белки ряда грибов содержат все 18 аминокислот, входящих в формулу сбалансированного питания, из которых особую ценность представляют незаменимые: лизин, треонин, валин, триптофан, тирозин и др., содержание которых может достигать 30% от общей суммы аминокислот. Наряду с белком, важное место в питании занимают липиды, причем их ценность тем выше, чем выше содержание в их составе полиненасыщенных жирных кислот. Содержание липидов в мицелии лекарственных грибов может достигать 15–20% и выше. Причем преобладающими жирными кислотами в составе липидов являются полиеновые – олеиновая, линолевая, линоленовая, необходимые для синтеза простагландинов. Не менее ценными среди биологически активных соединений являются углеводы, содержание которых достигает 60% от сухой биомассы грибов. Особую ценность среди углеводных компонентов грибной клетки представляют полисахариды (β-D-глюканы) [1–4]. Кроме полисахаридов иммуномодулирующей и антиоксидантной активностями обладают каротиноидные пигменты. Гидрофобная природа и наличие делокализованной π-электронной структуры с низким уровнем триплетного возбужденного состояния определяют биологические функции каротиноидов, связанные с антиоксидантной активностью и гашением свободнорадикальных процессов в фосфолипидах и белковых системах, торможением перекисного окисления липидов, а также ингибированием промоторной фазы канцерогенеза. Эти функции, как полагают, и лежат в основе антимутагенных, радиопротекторных, гиполипидемических, антисклеротических и др. свойств каротиноидов. Съедобный базидиальный гриб Laetiporus sulphureus в условиях глубинного культивирования накапливает свыше 10 мг/г сухого мицелия ксантофилов. Кроме того, в мицелии гриба содержится свыше 20% липидов, более 70% полиненасыщенных жирных кислот и др. не менее ценных соединений [5]. 278 Биотехнологии, применяющие грибы как продуценты биологически активных веществ, дали новые препараты и биодобавки, которые находят приложение в лечении и профилактике различных заболеваний человека. Некоторые из этих средств уже внедряются в клиническую практику, другие находятся в стадии исследования. Современные биотехнологии на основе грибов могут стать основой ценных лекарственных препаратов, обладающих широким спектром биологического действия. Особую ценность наряду с монопрепаратами представляют композиции на основе двух, трех и более грибов. Цель исследования – создание композиций на основе лекарственных грибов L. edodes, G. lucidum и L. sulphureus. Объекты и методы исследования. В работе использовали ранее отобранные штаммы грибов L. edodes, G. lucidum и L. sulphureus. Грибы выращивали в ферментерах объемом 630 л на соответствующих промышленных питательных средах. Общий белок определяли по [6], липиды − по [7], идентификацию жирных кислот проводили по относительным удерживаемым объемам, а также в сопоставлении с показателями метиловых эфиров чистых жирных кислот [8, 9], фосфолипиды − по [10], полисахариды − по [11], каротиноиды – по [12]. Сумму моно- и полифенолов определяли с реактивом Фолина-Дениса [13]. Антиокислительную активность (АОА) спиртовых экстрактов определяли по [14, 15]. Об антиокислительных свойствах судили по способности экстрактов тормозить образование продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов). За 100% принимали величину АОА ионола – известного антиоксиданта. Результаты и их обсуждение. На основании исследования биохимического состава мицелия составлены композиции лечебно-профилактических препаратов многофункционального назначения: Композиция 1 Композиция 2 G. lucidum БИМ F-323 Д – 30%; G. lucidum БИМ F-323 Д – 40%; L. edodes БИМ F-305 Д – 70%. L. edodes БИМ F-305 Д – 40%; L. sulphureus БИМ F-326 Д – 20%. По содержанию отдельных компонентов композиция 1 аналогична исходным субстанциям, в композиции 2 несколько снизилось содержание липидов, в то же время повысилось содержание эргостерина и фосфолипидов (таблица 1). 279 Таблица 1 – Биохимический состав композиций Показатели Влажность, % от АСБ Общий белок, % от АСБ Истинный белок, % от АСБ Полисахариды, % от АСБ Каротиноды, мг/г АСБ Общие липиды, % от АСБ Эргостерин, % от общих липидов Фосфолипиды, % от общих липидов Фенольные соединения, мг% АОА, % от ионола Композиции №1 №2 5,50 6,10 32,80-34,00 29,90-30,50 17,00-17,20 14,00-15,50 11,20 9,20 1,17 9,08 12,96 10,91 8,10 31,64 20,39 1746,0-1788,0 84,80-91,30 861,0-1030,0 91,30-93,50 В композициях, как и в субстанциях, преобладающими оказались полиненасыщенные жирные кислоты, содержание которых составило 75–80%. Аминокислотный состав белков композиций аналогичен таковому белков субстанций. Лимитирующие аминокислоты – метионин, цистин. Разработанные композиции обладают высокой сорбционной активностью по отношению к наиболее опасным металламтоксикантам – свинцу, кадмию и стронцию и превосходят сорбционную активность коммерческого энтеросорбента «Полифепан». Полученные результаты показали возможность регулирования сорбционного потенциала композиций путем изменения содержания в мицелии структурных полисахаридов, в т.ч. хитина. В экспериментах in vivo на модели тетрахлорметанового токсического гепатита у крыс показана высокая антиоксидантная активность композиций, выявлено их иммунотропное действие. При исследовании действия композиций на экспериментальных животных выявлены следующие результаты: - усиление миелопоэза, проявляющееся в увеличении содержания лейкоцитов; - изменение лейкоцитарной формулы в сторону увеличения доли полинуклеарных лейкоцитов; - увеличение функциональной активности нейтрофильных фагоцитов, проявляющееся в увеличении фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа; Более эффективной по биологическому действию оказалась композиция №1. Хранение препаратов в течение 12 месяцев показало следующие результаты (таблица 2). 280 Таблица 2 − Биохимический состав композиций при хранении Показатели Композиция 1 6 м* 9м 12 м 5,50 5,55 5,60 Влажность, % от АСБ Общий белок, % от 32,80 31,20 30,80 АСБ Истинный белок, % 17,00 17,80 17,60 от АСБ Полисахариды, % 11,20 11,02 10,90 от АСБ Каротиноды, мг/г АСБ Общие липиды, % 9,08 9,80 9,03 от АСБ Эргостерин, % от 10,91 10,85 10,80 общих липидов Фосфолипиды, % от 31,64 31,50 31,08 общих липидов Фенольные соеди- 1746,0 1790,0 1710,0 нения, мг% АОА, % от ионола 84,80 90,50 89,90 Композиция 2 6м 9м 12 м 6,10 6,28 6,30 29,90 29,50 28,00 14,00 14,85 14,30 9,20 9,80 9,20 1,17 0,50 0,49 12,96 13,00 12,70 8,10 8,08 8,05 20,39 20,31 17,17 861,0 1010,0 850,0 91,30 92,14 90,20 Примечание. М – месяцы. Анализируя результаты биохимического состава композиций в процессе хранения в течение 12 месяцев (таблица 2) с таковыми исходных (таблица 1), необходимо отметить, что содержание белка, полисахаридов, общих липидов практически не изменяется. Содержание фосфолипидов в составе общих липидов также остается на том же уровне, что и в исходных препаратах. В то же время количество каротиноидов в композиции №2 к 9 мес. хранения уменьшилось более чем в 2,3 раза и составило 0,5 мг/г АСБ. К 12 месяцам количество каротиноидов практически не изменилось. Значительно изменился и жирнокислотный состав липидов композиции №2 (таблица 3). Увеличение количества насыщенных жирных кислот произошло за счет окисления полиненасыщенных, содержание которых составило 60,95% к 9-ти месяцам хранения против 79,65% в начале хранения. Однако преобладающей в исследуемых композициях была по-прежнему полиненасыщенная жирная кислота С18:2. Практически не изменилась в процессе хранения антиокислительная активность композиций. 281 Таблица 3 – Жирнокислотный состав композиций в процессе хранения Кислота С14:0 С15:0 С16:0 С16:1 С18:0 С18:1 С18:2 Сумма ненасыщенных Сумма насыщенных Отношение ненасыщеных к насыщенным К ненасыщенности 6 м* 0,73 0,05 20,11 0,05 4,13 11,35 63,58 74,98 Композиция 1 9м 12 м 0,94 0,70 сл. 0,08 18,00 20,04 0,08 0,24 3,50 4,00 10,36 11,30 67,12 63,64 77,56 75,18 6м 1,01 0,02 14,02 0,16 5,30 11,02 68,47 79,65 Композиция 2 9м 12 м 4,30 4,28 сл. 0,03 33,87 33,80 сл. сл. 0,88 0,95 3,71 3,70 57,24 57,25 60,95 60,94 25,02 22,44 24,82 20,35 39,05 39,06 2,99 4,14 3,03 3,91 1,56 1,60 1,39 1,71 1,70 1,48 1,18 1,20 Примечание. М – месяцы. Заключение. На основании полученных результатов наиболее стабильный биохимический состав и более высокое биологическое действие имела композиция №1. Эта композиция взята за основу нового лечебно-профилактического препарата многофункционального назначения. Список литературы 1 2 3 Бісько, Н.А. Фактори регуляціі біосинтетичноі активності лікарських грибів / Н.А. Бісько // Пріоритети науковоі співпраці ДФФД і БРФФД – матеріали спільних конкурсних проектів Державного фонду фундаментальних досліджень і Белоруського республіканьского фонду фундаментальних досліджень / Бібліотека державного фонду фундаментальних досліджень – Киіів, 2007 – С. 312–325. Влияние полисахаридов глубинной культуры Ganoderma lucidum, Lentinus edodes и Crinipellis schevzenkovi на фагоцитарную активность нейтрофилов / Д.А. Смирнов [и др.] // Биотехнология. − 2007. − № 1. − С. 47−51. Гвоздкова, Т.С. Оценка возможности использования базидиальных грибов в качестве источников биоактивных липидных компонентов / Т.С. Гвоздкова // Успехи медицинской микологии: материалы Пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, 28–30 марта 2007 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – М.: Национальная академия микологии, 2007. – Т. 9. – С. 151−154. 282 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Щерба, В.В. Лечебно-профилактические препараты многофункционального назначения на основе комплекса соединений лекарственных грибов / В.В. Щерба // Успехи медицинской микологии: материалы Пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, 28–30 марта 2007 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – М.: Национальная академия микологии, 2007. – Т. 9. – С. 204−206. Гвоздкова, Т.С. Cерно-желтый трутовик – перспективный объект биотехнологии / Т.С. Гвоздкова [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. конф., Минск–Раков 1–2 июня 2006 г. / ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси»; редкол.: З.М. Алещенкова [и др.]. – Минск, 2006. – С. 232–235. Ермаков, А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков. – Л.: Агропромиздат, 1987. – 256 с. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues / I. Folch [et al] // J. Biol. Chem. − 1957.− Vol. 226, N 1.− P. 491−509. Состав триглицеридов масла хлопчатника / А.Г. Верещагин [и др.] // Биохимия. − 1963. − Т. 28, №5. − С. 868−878. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. − М.: Мир, 1975. − 322 с. Молочкина, Е.М. Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии / Е.М. Молочкина // Исследование синтетических и природных фосфолипидов in vitro и in vivo: сб. науч. ст. / М.: «Наука», 1992. – С. 100–109. Полисахариды глубинного мицелия Ganoderma lucidum / Д.А. Смирнов [и др.] // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. біял. навук. – 2006. – № 5. – С. 177–179. Britton, G. Carotenoids / G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Phander. // Isolation and analysis. – 1995. – Vol. 1A. – P. 328–336. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения / М.Н. Запрометов. − М.: Наука, 1993. – 272 с. Антиокислительная активность экстрактов мицелия настоящей губки / А.Н. Капич [и др.] // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1991. – № 5. – С. 58–62. Капич, А.Н. Антиоксиданты грибного происхождения – модификаторы радиоустойчивости / А.Н. Капич, Ю.М. Леонтьев // Радиобиол. последствия аварии на Чернобыльской АЭС: материалы Всес. конф., Минск, 30 октября – 1 ноября 1991 г. / Нац. акад. наук Респ. Беларусь. Ин-т радиобиол. – Минск, 1991. − С. 50–51. COMBINED MULTIFUNCTIONAL MEDICATED PRODUCTS ON THE BASIS OF MEDICINAL MUSHROOMS SHCHERBA V.V. 1, BABITSKAYA V.G. 1, PLENINA L.V. 2, GVOZDKOVA T.S.1, PUCHKOVA T.A.1, SMIRNOV D.A.1, LOPATENTO J.S. 2, 2 OSADCHAYA O.V. 1 The Institute of Microbiology NAS of Belarus 2 Dialek republican unitary enterprise Multifunctional medicated products (2 compositions) on the basis of medicinal fungi (Ganoderma lucidum, Lentinus edodes, Laetiporus sulphureus) have been elaborated. The products contain proteins (up to 30%), polysaccharides (up to 11%), carotinoids (up to 10 mg/g), lipids (up to 13%), phospholipids (up to 30% from sum of lipids), phenol compounds. Antioxidative activity of the products work out 90–95% relative to ionol. Immunostimulating, hepatoprotective and antioxidative activities of composition have been established. 283 УДК 579.222:547.992.3 ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ЛИПОКАРОТИНОИДНОГО КОМПЛЕКСА ГРИБА LAETIPORUS SULPHUREUS Гвоздкова Т.С.1, Бирман Б.Я 2, Щерба В.В.1, Насонов И.В. 2, Черноок Т.В. 1, Бабицкая В.Г.1 1 2 Институт микробиологии НАН Беларуси Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского НАН Беларуси Отобран штамм – продуцент каротиноидов. Гриб активно растет на пшеничной, пшенично-ячменной муке и крахмале. Оптимальные условия глубинного культивирования: рН среды 3,0–3,5, температура 26±2 °С, аэрация 0,5–1 л/л среды / мин. Лучшим экстрагентом для извлечения липокаротиноидного комплекса является 96-ный % этанол. Введение. Каротиноиды относятся к одной из наиболее распространенной в природе группе пигментов, синтезируемых в основном высшими растениями, водорослями и микроорганизмами. Каротиноиды – это высоконенасыщенные полиеновые углеводороды терпенового ряда, подразделяющиеся на собственно каротины и ксантофиллы – кислородсодержащие производные каротина. В природе в настоящее время выявлено и идентифицировано свыше 500 каротиноидных пигментов и лишь несколько десятков имеют важное биохимическое и коммерческое значение. Разнообразие каротиноидов в природе объясняется различиями в строении и конфигурации молекул, а также способностью образовывать множество различных биологически активных комплексов с белками, липидами и др. соединениями. Несмотря на то, что к настоящему времени химическое строение имеющихся пигментов достаточно хорошо изучено, этого нельзя сказать об их функциональной роли. Известно, что одной из наиболее важных функций каротиноидов является защитная, которая состоит в предохранении клеточных структур от повреждающего действия свободных радикалов и различных продуктов перекисного окисления, образующихся в процессе воздействия на клетку ряда окислительных агентов (свет, кислород, ионизирующее облучение и другие негативные факторы среды) [1, 2]. Эта функция, как полагают, лежит в основе антимутагенных, радиопротекторных, 284 гиполипидемических и антисклеротических свойств каротиноидов [3–6]. Среди каротиноидных пигментов особое место принадлежит β-каротину. Наличие делокализованной π-электронной структуры с низким уровнем триплетного возбужденного состояния определяет, очевидно, и его биологические функции, связанные с антиоксидантной активностью и гашением свободнорадикальных процессов в фосфолипидах и белковых системах. Установление антиоксидантного эффекта β-каротина способствовало активизации исследований не только этого соединения, но и других пигментов каротиноидной природы. Было показано, что различные каротиноиды различаются своей реактивностью к пероксидным радикалам, а, следовательно, и антиоксидантной активностью, что напрямую связано со структурными различиями пигментов. Оказалось, что такие каротиноиды как ликопин, зеаксантин, астаксантин, кантаксантин (класс ксантофиллов) и др. обладают более мощной антиоксидантной системой по сравнению с β-каротином и α-токоферолом [7, 8]. Основным источником каротиноидов в птицеводстве является травяная мука, красная морковь, тыква и др. Потребность животноводства и птицеводства в каротиноидсодержащих (А-провитаминных) препаратах удовлетворяется лишь на 40–60%, в основном за счет каротиноидов (каротин, ксантофиллы) растительного происхождения. При этом получение растительных кормов связано с потребностью в значительных посевных площадях, сезонностью и неизбежными потерями активности биологических соединений при длительном хранении. Этих недостатков лишены микробные препараты, производство которых позволит в известной мере сократить дефицит в каротиноидах для нужд животноводства и птицеводства. Способность к синтезу различных каротиноидных пигментов широко распространена у представителей разнообразных систематических групп микроорганизмов: бактерий, актиномицетов, дрожжей и мицелиальных грибов. Однако, как правило, содержание каротиноидов в большинстве из них низко для коммерческого использования и не превышает 100–800 мкг/г сухого мицелия. В биотехнологии пока только один вид мицелиальных грибов – продуцентов β-каротина нашел практическое применение – это совместное культивирование разнополых штаммов Blakeslea trispora (Россия, Украина, США). Создан кормовой препарат микробиологического каротина. Однако, несмотря на все достоинства препарата, в его производстве существует и ряд недостатков: дорогая и дефицитная среда, наличие в биотехнологическом процессе двух штаммов, подверженных естественной и искусст- 285 венной изменчивости, а также необходимость в достаточно высокой стерильности производства. Что касается каротинообразующих дрожжей, то их промышленное производство недостаточно технологично, так как они уступают (в 2–3 раза) по скорости роста другим дрожжам, применяемых в промышленности, характеризуются сравнительно низким содержанием каротиноидов (300–800 мкг/г сухой биомассы), при их получении используют дорогостоящие субстраты, а также необходима высокая стерильность производства. Одним из представителей базидиальных грибов, способных к синтезу полиеновых пигментов каротиноидной природы (ксантофиллы), является серно-желтый трутовик (Laetiporus sulphureus). Базидиальный ксилотрофный гриб L. sulphureus растет преимущественно на лиственных породах деревьев и образует плодовые тела, окрашенные в оттенки желтого, оранжевого и розового цвета. Имеются сведения об антимикробных, противоопухолевых, цитотоксических свойствах плодовых тел гриба [9, 10]. В лаборатории экспериментальной микологии Института микробиологии НАН Беларуси имеется ряд штаммов, выделенных из плодовых тел серно-желтого трутовика, которые в определенных условиях глубинного культивирования накапливают в мицелии (в виде оранжево-красных пеллет) значительные количества каротиноидных пигментов (2–10 мг/г сухого мицелия). Способность к активному синтезу полиеновых пигментов у данного вида гриба является в определенной мере уникальной, поскольку среди ксилотрофных базидиомицетов, как и среди базидиальных грибов активные их продуценты до сих пор не были известны. По сравнению с каротинообразующими дрожжами и микромицетами базидиальный ксилотроф L. sulphureus обладает определенными преимуществами. Данный гриб относится к съедобным. Он активно растет в глубинной культуре на относительно дешевых субстратах (ржаная, гороховая, соевая мука, крахмал, отходы крахмалопаточного производства) при низких значениях рН (3,0–3,5) питательной среды, а, следовательно, обладает высокой устойчивостью к инфицированию посторонней микрофлорой, что создает возможность вести процесс ферментации в полустерильных условиях. Гриб неприхотлив к минеральному питанию, отличается ограниченными потребностями в физиологически активных веществах, характеризуется крупноклеточной структурой (диаметр пеллет 2–3 мм), позволяющей легко отделять его от культуральной жидкости. Биомасса гриба является не только источником каротиноидов (ксантофиллов), но и таких ценных биологически активных 286 соединений, как белки, в состав которых входят все незаменимые аминокислоты, липиды, полиеновые эссенциальные жирные кислоты, фосфолипиды, стерины, витамины, минеральные элементы и др. Эффективность антиоксидантного действия липокаротиноидного комплекса экстракта мицелия гриба L. sulphureus подтверждена в экспериментах in vitro и in vivo. На лабораторных животных установлены его радиопротекторные и противовирусные свойства [11, 12]. Цель исследования – отбор продуцента каротиноидов, подбор промышленных питательных сред, отработка условий культивирования гриба, выбор экстрагентов для извлечения липокаротиноидного комплекса. Объекты и методы исследования. В работе использовали штаммы гриба L. sulphureus. Каротиноиды из мицелия гриба экстрагировали 96%-ным этиловым спиртом из расчета 100 мл этанола на 1 г сырого мицелия после предварительного замораживания жидким азотом и растирания влажного мицелия с кварцевым песком. Количественное содержание каротиноидов в мицелии определяли спектрофотометрически по поглощению при 450 нм [13]. Антиокислительную активность (АОА) экстрактов мицелия гриба определяли на модели окисления линолевой кислоты по методу [14]. Cодержание липидов в мицелии гриба определяли методом Фолча в модификации Блайя и Дайэра [15, 16]. Результаты и их обсуждение. В результате направленного скрининга среди 14 штаммов каротиноидобразующего гриба L. sulphureus отобран штамм – продуцент каротиноидов L. sulphureus 205. Оптимальной для выращивания гриба оказались два варианта промышленных сред: пшеничная мука и крахмал; пшеничноячменная мука и крахмал. Наиболее активный рост и синтез каротиноидных пигментов грибом происходит при рН среды 3,0–3,5, что позволяет отнести его к ацидофильным организмам. Выявление этого факта указывает на возможность проведения процесса фермантации в полустерильных условиях. Оптимальные условия культивирования гриба на ферментационном оборудовании – температура 26±2 °С, аэрация 0,5–1 л/л среды / мин, скорость вращения мешалки – 50 об/мин. Установлено, что образование каротиноидов индуцируется светом (рисунок). 287 а г/л; мг/г 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 б 10 г/л; мг/г 8 6 4 2 0 18-20 22-24 26-28 32-34 Биомасса, г/л температура, 0 С Биомасса, г/л Каротиноиды, мг/г АСБ Освещение Без освещения Каротиноиды, мг/г АСБ Рисунок – Влияние температуры (а) и освещения (б) на рост и образование каротиноидов грибом L. sulphureus 205 Создание лечебно-профилактического препарата на основе глубинного мицелия гриба предусматривает различные способы его получения, в том числе в виде экстрактов, содержащих в нативном виде липокаротиноидный комплекс, обогащенный такими ценными биоактивными липофильными соединениями, как каротиноиды, фосфолипиды, эссенциальные жирные кислоты и др. Для промышленного использования экстрактивных форм препаратов важен выбор наиболее эффективного и экологически безопасного способа извлечения ценных липофильных компонентов из глубинного мицелия гриба. Выход и состав общих липидов, фосфолипидов, эссенциальных полиеновых жирных кислот и каротиноидов меняется в зависимости от экстрагента. Наиболее полная экстракция липофильных веществ, в том числе каротиноидов (до 12 мг/г АСБ) из глубинного мицелия гриба при сохранении сравнительно высокой степени ненасыщенности общих липидов (1,54) достигается при использовании системы растворителей хлороформ, этанол, вода в соотношении 1:2:0,8. Исследование степени извлечения из мицелия гриба каротиноидных пигментов (ксантофиллов) различными концентрациями этанола – 96, 80, 60, 40 и 20% позволило установить, что наиболее эффективная экстракция происходит при использовании 96% этанола. Несмотря на то, что извлечение биоактивных липофильных соединений при использовании в качестве экстрагента 96% этанола была несколько ниже, чем при использовании вышеуказанной хлороформенной смеси, этанол полнее экстрагирует фосфолипиды, содержание которых в 1,6 и 3,4 раза выше, 288 чем при использовании ацетона и хлороформа. Кроме того, этанол достаточно полно извлекает и каротиноидные пигменты (11,04 мг/г АСБ) (таблица). Таблица – Выделение липокаротиноидного комплекса L. sulphureus различными экстрагентами Показатели этанол Общие липиды, % от АСБ Фосфолипиды, % от АСБ Фосфолипиды, % от общих липидов Каротиноиды, мг/г АСБ (в экстрагенте) Каротиноиды, мг/г АСБ (перерастворенные в этаноле) АОА, % от ионола С 12:0 С 14:0 С 15:0 С 16:0 С 16:1 С 17:0 С 18:0 С 18:1 С 18:2 С 18:3 СН ∑1 ненас. ∑2 насыщ. ∑ 1ненасыщ. / ∑2 насыщ. Экстрагенты хлороформ ацетон хлороформ : этанол : вода – 1:2:0,8 17,2 5,5 15,4 20,85 3,01 0,89 1,88 3,9 17,45 16,3 12,2 18,53 11,04 7,5 12,0 12,0 11,04 7,4 12,0 10,1 90,4 Сл. 0,09 9,19 0,1 0,36 8,16 82,1 1,65 90,26 9,74 9,27 85,2 0,16 15,46 0,17 Сл 1,22 16,74 66,25 0,17 1,49 83,16 16,84 4,94 79,3 0,06 0,10 16,71 0,06 0,24 0,76 18,36 63,54 1,46 82,13 17,87 4,60 94,4 Сл. 0,05 16,58 Сл 0,1 0,31 11,59 71,25 1,54 82,96 17,04 4,86 Сравнительные исследования жирнокислотного состава липидов мицелия гриба, экстрагированных разными растворителями, позволило установить, что удельное содержание наиболее ценной эссенциальной линолевой кислоты (С18:2) в суммарном составе жирных кислот липидов колебалось от 63,5% при извле- 289 чении их из мицелия гриба ацетоном до 82,1% в липидах, извлеченных 96% этанолом. Высокое содержание эссенциальной линолевой кислоты в липидах, экстрагируемых 96% этанолом, обеспечивало и более высокую степень их ненасыщенности. Проведенные исследования указывают на перспективность использования этанола для экстракции липокаротиноидного комплекса из глубинного мицелия гриба L. sulphureus. Липокаротиноидный комплекс этанольного экстракта мицелия гриба проявлял высокую антиокислительную активность (до 80% и выше). Полученный экстракт явился основой разработки нового лечебно-профилактического препарата для промышленного птицеводства. Препарат содержит комплекс биологически активных веществ: каротиноиды, липиды, в т.ч. фосфолипиды, эссенциальные жирные кислоты, провитамин Д. Предназначен для профилактики инфекционных заболеваний, нормализации иммунного статуса, улучшения роста молодняка. Заключение. Результаты проведенных исследований показали, что использование этанола как более безопасного экстрагента позволяет практически полностью извлекать из мицелия гриба L. sulphureus все биоактивные липофильные компоненты – субстанцию нового лечебно-профилактического препарата. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Феофилова, Е.П. Каротиноиды грибов: биологические функции и практическое использование / Е.П. Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология. – 1994. – Т. 30, № 2. – С.181–194. Каротиноиды как антиоксидантные модуляторы клеточного метаболизма / А.Б. Капитанов [и др.] // Успехи современной биологии. – 1996. – Т. 116, № 2. – С.124–193. Радиозащитная эффективность ликопина / А.Б. Капитанов [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1994. – Т. 34, № 3 – С. 439–442. Antioxidant potentials of vitamin A and carotenoids and their relevance to heart disease / V.P. Palace [et al] // Free Radical Biology and Medicine. – 1999. – Vol. 26, № 5–6. – P. 746–761. Антимутагенные свойства препаратов, содержащих β-каротин / М.А. Шлянкевич [и др.] // Вопросы мед. химии. – 1992. – Т. 38, № 6. – С.23–25. Сергеев, А.В. Иммуномодулирующая и антиканцерогенная активность каротиноидов / А.В.Сергеев, С.А. Коростылев, Н.И. Шеренешева // Вопросы мед. химии. – 1992. – Т. 38, № 4. – С. 42–45. Oxidation of carotenoids by free radical: relationship between structure and reactivity / A.A. Woodall [et al] // Biochim et Biophys Acta. – 1997. – Vol. 1336, № 1. – P. 33–42. Miki, W. Biologocal function and activities of animal carotenoids / W. Miki // Pure Appl. Chem. – 1991. – Vol. 63, № 1. – P. 141–146. Юцковский, А.Д. К перспективе применения препаратов полученных из грибов / А.Д. Юцковский, С.В.Черных, Е.В.Новикова // Успехи медицинской мико- 290 10 11 12 13 14 15 16 логии: материалы II Всерос. конгресса по медицинской микологии, Москва, 24–25 марта 2004 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – Москва, 2004. – Т. 5. – С. 284–285. Ефременкова, О.В. Антимикробные свойства базидиального гриба Laetiporus sulphureusв условиях глубинного культивирования / О.В. Ефременкова [и др.] // Успехи медицинской микологии: материалы IV Всерос. конгресса по медицинской микологии, Москва, 29–31 марта, 2006 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – Москва, 2006. – Т. 7. – С. 280–281. Оценка радиозащитных свойств липокаротиноидного экстракта из мицелия базииального гриба в условиях внешнего облучения / Е.Ф. Конопля [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1999. – Т. 39, № 2–3. – С. 277–281. Капич, А.Н. Антиоксидантные, радиозащитные и противовирусные свойства экстрактов мицелия гриба Laetiporus sulphureus. / А.Н. Капич [и др.] // Успехи медицинской микологии: материалы II Всерос. конгресса по медицинской микологии Москва, 24–25 марта 2004 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – Москва, 2004. – Т. 5. – С. 146–148. Капич, А.Н. Антиокислительная активность экстрактов мицелия ксилотрофных базидиомицетов / А.Н. Капич // Микология и фитопатология. – 1995. – Т. 29, № 5–6. – С. 35–40. Britton, G. Carotenoids / G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Phander // Isolation and analysis. – 1995. – Vol. 1A. – P. 328–336. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues / I. Folch [et al] // J. Biol. Chem. – 1957. – Vol. 226, № 1. – P. 491–509. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. – М.: Мир, 1975. – С.72. MEDICATED PRODUCT WITH IMMUNOSTIMULATING ACTIVITY ON THE BASIS OF FUNGUS LAETIPORUS SULPHUREUS LIPIDS AND CAROTINOIDS COMPLEX 1 2 1 2 GVOZDKOVA T.S. , BIRMAN B.Y. , SHCHERBA V.V. , NASONOV I.V. , 1 1 CHERNOOK T.V. , BABITSKAYA V.G. 1 The Institute of Microbiology NAS of Belarus 2 The S.N. Vyshelesskij Institute of Experimental Veterinary Medicine NAS of Belarus Fungal strain that is a carotinoids producer has been selected. The fungus grows well on wheat flour, wheat and barley flour, and on starch. The optimal conditions for submerged cultivation are as follows: medium pH 3.0–3.5, temperature 26±2 °С, aeration 0.5–1.0 l/l of medium/min. Ethanol 96% was shown to be the best extractant for lipids and carotinoids complex. 291 УДК 579.22:663.051.2 НОВЫЙ ПРОДУКТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ С ГРИБАМИ РОДА ВЕШЕНКА Бабицкая В.Г.1, Щерба В.В.1, Паромчик И.И.2, Осадчая О.В1, Филимонова Т.В1, Рожкова З.А.1 1 2 Институт микробиологии НАН Беларуси, Центральный Ботанический сад НАН Беларуси Изучен состав грибов вешенки обыкновенной и картофеле-грибного продукта. Энергетическая ценность продукта близка таковой сушеных грибов (362 кКал/100 г). Установлено высокое содержание в продукте эссенциальных жирных кислот С18:2 и С18:3 – компонентов витамина F. Доказана стабильность всех его показателей (белок, липиды, общие углеводы, фосфолипиды, фенольные соединения, жирные кислоты) при естественном хранении. Введение. Статистические исследования заболеваний, проведенные в РБ в течение последних лет, свидетельствуют о неуклонном росте числа болезней, связанных именно с проблемами питания. Сверхобработка пищи приводит к окислению и разрушению термически неустойчивых витаминов (А, В, С, Е). Химический, физический и эмоциональный стрессы усиливают потребность организма в витаминах В2, В3, В6 и С, загрязнение воздуха - в витамине Е. Большая часть почв, на которых выращиваются растения, из-за интенсивной их эксплуатации, содержит мало минеральных веществ. Что же касается Республики Беларусь, то здесь в почве и воде нет или мало селена, йода, фтора. Экологические проблемы, употребление рафинированных продуктов привели к тому, что только пищей невозможно в полной мере обеспечить организм аминокислотами, микроэлементами, витаминами. Без этих необходимых организму веществ человек больше подвержен болезням, особенно «болезням цивилизации». Считается, что причиной ряда заболеваний белорусов является несбалансированное питание. 61% потребляемого в Беларуси мяса – жирная свинина и лишь 23% – мясо птицы. 500 г картофеля, основного продукта республики, который ежедневно съедает среднестатистический белорус, удовлетворяют его суточную потребность в углеводах, но не в белках, витаминах и минеральных элементах. Следует напомнить, что в картофеле очень мало белка (3,9%), жира (0,2%), мало калия, фосфора, натрия, магния, и совсем незначительное количество кальция. 292 Очень мало необходимых для организма микроэлементов, витаминов, клетчатки. В последние годы в экономически развитых странах для улучшения структуры питания и профилактики распространенных заболеваний современного человека широкое распространение получили функциональные пищевые продукты (functional foods) как новое и перспективное направление в пищевой индустрии. По мнению ученых, к функциональным препаратам относятся: БАДы, премиксы, тонизирующие и лечебно-оздоровительные напитки, диетические продукты, специальная пища для спортсменов. Одним из источников для получения функциональных продуктов во многих странах мира являются базидиальные грибы, в частности, вешенки обыкновенные, рейши, шиитаке, которые обладают не только высокой питательной ценностью, но и определенными лечебными свойствами. По данным ВОЗ в 2000 г 80% американцев и японцев, 50% европейцев и только 1% белорусов употребляли функциональные препараты регулярно. В Японии, где функциональные препараты грибного происхождения применяются около 50 лет, самая высокая продолжительность жизни (более 80 лет). Вместе с тем, на сегодняшний день на белорусском рынке представлено свыше 900 БАДов, из которых только 85 отечественных. Из них на основе лекарственных грибов всего 4. Получение функциональных препаратов относится к приоритетным направлениям развития науки и технологии. Цель исследования – разработка нового функционального пищевого продукта на основе картофеля с использованием грибов вешенки обыкновенной и пряно-ароматических растений. Объекты и методы исследования. В работе использовали сушеные (влажность 12%) грибы рода вешенка и картофелегрибной продукт (картофель 95%, грибы 5%). Общий белок определяли по [1], углеводы − [6], липиды − методом Фолча [2], идентификацию жирных кислот проводили по относительным удерживаемым объемам, а также в сопоставлении с показателями метиловых эфиров чистых жирных кислот [3, 4], фосфолипиды − спектрофотометрически [5], энергетическую ценность продукта рассчитывали по требованиям СанПин [7]. Сумму моно- и полифенолов определяли с реактивом Фолина-Дениса [8]. АОА спиртовых экстрактов определяли с тиобарбитуровой кислотой [9, 10]. Об антиокислительных свойствах картофелегрибного продукта судили по способности экстрактов тормозить образование продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов). За 100% принимали величину АОА ионола – известного антиоксиданта. 293 Результаты и их обсуждение. Исследование биохимического состава сушеных грибов вешенки обыкновенной показало, что грибы содержат 29,9% общего белка, 3,1% общих липидов, 52,9% общих углеводов. Зольные элементы составляют 3,8%, а фенольные соединения – 1320 мг%. Энергетическая ценность сушеных грибов, рассчитанная согласно требованиям СанПин 1163 РБ-98, составила 359 ккал/100 г. Изучение аминокислотного состава белка сушеных грибов показало, что лимитирующей биологическую ценность белка оказалась аминокислота лейцин. Белок по сумме незаменимых аминокислот соответствует норме ФАО (36,03 и 36,00). Известно, что существует определенная взаимосвязь между аминокислотным составом белка и степенью его расщепления пищеварительными ферментами, что выражается отношением суммы аминокислот аргинин + лизин к пролину. И чем выше значение этого показателя, тем выше переваримость. Для белка сушеных грибов вешенки обыкновенной это отношение равно 3,82 и приближается к значению высокоусвояемого белка риса (4,0). Содержание общих липидов в сушеных грибах составило 3,1%, в составе их преобладающими оказались олеиновая С18:1 – 12,30% и линолевая С18:2 – 64,28% жирные кислоты, степень ненасыщенности липидов составила 3,69. Состав липидов сходен с составом растительных масел высших сортов. Биологическую активность грибов связывают, главным образом, с наличием в них углеводов, в т. ч. гликанов, гетерогликанов, глюкозаминогликанов. В грибной клетке они представлены свободными и связанными сахарами, количество которых достигает 60% и более от сухой биомассы. Углеводы цитозоля клеток грибов по современным представлениям выполняют множество функций: резервную, осморегулирующую, регуляторную и протекторную, основанную на способности замещать воду в липидном бислое мембран. Фракционный состав углеводов сушеных грибов вешенки обыкновенной представлен в таблице 1. Таблица 1 – Фракционный состав углеводов сушеных грибов вешенки обыкновенной водная 16,20 полисахарид 5,39 Фракции, % от сухой биомассы кислотщелочная щелочная I ная II 9,80 8,60 9,80 хитин всего 3,14 52,93 Основная часть углеводов грибов представлена хитинглюкановым комплексом (31,3%), в состав которого входят ки- 294 слотная, щелочные фракции и хитин. На долю свободных углеводов водной фракции и водорастворимого полисахарида приходится 21,6%, а общее содержание углеводов составляет 52,9%. Исследование углеводного состава водорастворимой фракции плодовых тел позволило установить в ней полиолы арабит и манит, причем преобладающим оказался манит (91,2%), а содержание глюкозы и трегалозы составило 10,4%. Кроме водорастворимых низкомолекулярных сахаров в цитозоле клетки содержится водорастворимый полисахарид – 5,39%. Как показали наши исследования, вешенка – это превосходная кладовая с уникальным набором самых необходимых человеку минеральных солей и других ценных веществ. Помимо микроэлементов (калий, магний, железо, кобальт и др.), фосфора она содержит целый комплекс витаминов: А, С, D, группы РР, пантотеновая кислота и др. Уровень биотина в вешенке в несколько раз выше, чем в яйце, молоке и шпинате, а количество тиамина соответствует содержанию его в овсяной крупе, пшеничном хлебе, фасоли и капусте. Гриб обладает высочайшими адсорбирующими свойствами, которые способствуют выводу из организма тяжёлых металлов и радиоактивных элементов. Таким образом, вешенка является универсальным диетическим продуктом, который можно употреблять с пользой для здоровья любым группам населения, поскольку в ней нет значительных количеств трудноперерабатываемого хитина, полностью отсутствуют горчичные масла и другие раздражающие вещества. Антиокислительная активность экстрактов гриба составляет 85–90% от ионола. Проведенные исследования показали, что сушеные плодовые тела вешенки обыкновенной в своем составе содержат высокоусвояемый белок, который по сумме незаменимых аминокислот соответствует норме ФАО; липиды с преобладанием полиненасыщенных жирных кислот и углеводные компоненты, представленные водорастворимыми полисахаридами и свободными сахарами, структурными полисахаридами. Известно, что корнеплоды картофеля в значительном количестве (до 30% сухих веществ) накапливают углеводы – важнейший источник легкодоступной энергии. Обогащение картофельного продукта биомассой гриба вешенки и другими физиологически активными соединениями позволит создать новый комплексный продукт функционального назначения (картофеле-грибной продукт). 295 Картофеле-грибной продукт имеет следующий состав, %: белок − 16, липиды − 1,5, зольные элементы − 1,8, общие углеводы − 68. Фенольные соединения составили 302 мг%, энергетическая ценность – 361,5 ккал/100г. В липидах преобладают кислоты С18:2 − 47,5 %, С16:0 – 29%, С18:1 − 15,6%. Сумма ненасыщенных жирных кислот составила около 66%, насыщенных − 34%. Антиокислительная активность − 50%. Анализируя соотношение биологически активных соединений в картофеле-грибном продукте и образце сушеных грибов необходимо отметить, что исходный компонент (сушеные грибы) превосходит конечный продукт по содержанию белка, липидов и фенольных соединений и значительно уступает по содержанию углеводов. Вместе с тем, наличие полиненасыщенной жирной кислоты (С18:3) в конечном продукте характеризует его более физиологически активным, чем исходные продукты. Таким образом, введение грибов вешенки в состав картофельных продуктов обогащает их белком, липидами с физиологически функциональными полиеновыми жирными кислотами. Это приводит не только к улучшению питательной ценности и вкусовых качеств конечных продуктов, но и увеличению их антиоксидантных свойств. Хранение картофеле-грибного продукта в течение 6 месяцев при температуре 20−25 °С не влияло на изменение показателей (рисунок). % % 20 15 10 5 0 А 1 2 3 4 месяц 5 % 2 1,5 1 0,5 0 1 6 Б 2 3 4 5 6 месяц 80 60 40 20 0 В 1 2 3 4 5 6 месяц Рисунок − Содержание белка (А), липидов (Б) и общих углеводов (В) в картофеле-грибном продукте при хранении в течение 6 месяцев 296 Общий белок оставался практически на одном уровне (16,0%). Не изменилось содержание липидов и количество общих углеводов. Фенольные соединения составляли 280−310 мг%, энергетическая ценность продукта колебалась в пределах 360−370 ккал/100 г, фосфолипиды составляли 25−27% от общих липидов (таблица 2). Таблица 2 − Содержание физиологически активных соединений в картофеле-грибном продукте Длительность хранения продукта, месяцы 1 2 3 4 5 6 Фенольные соединения, мг% 280,0 290,0 310,0 300,0 300,0 290,0 Фосфолипиды, % от общих липидов 26,0 24,0 27,0 25,0 26,0 26,0 Энергетическая ценность, ккал/100 г 359,0 340,0 350,0 360,0 355,0 350,0 Таблица 3 − Жирнокислотный состав липидов картофеле-грибного продукта Жирные кислоты, % С16:0 С16:1 С17:0 С18:0 С18:1 С18:2 С18:3 Сумма ненасыщенных Сумма насыщенных 1 29,03 сл. сл. 5,02 15,55 47,45 2,95 65,95 Длительность хранения, месяцы 2 3 4 5 28,00 24,55 28,50 25,05 1,50 2,00 сл. 0,50 0,60 сл. сл. 0,75 4,20 5,45 5,95 4,05 16,45 14,50 15,00 14,75 46,00 50,50 46,70 52,00 3,25 3,00 3,85 2,90 67,20 70,00 65,55 70,15 6 27,45 1,10 0,80 5,55 14,00 48,65 2,45 66,20 34,05 32,80 33,80 30,00 34,45 29,85 Постоянным оставалось содержание в продукте зольных элементов (1,7−2,0%). Антиоксидантная активность продукта находилась в пределах 48−50%. Не произошло изменений и в составе жирных кислот липидов картофеле-грибного продукта (таблица 3). Длительность хранения не вызвала уменьшения ненасыщенных жирных кислот, в частности, олеиновой (С18:1) и леноливой (С18:2). Их количество колебалось от 14,0 до 16,45% и от 46,0 до 52,0%. Сумма ненасы- 297 щенных жирных кислот составила 65,0−70,0, насыщенных – 30,0−34,5. Заключение. Результаты проведенных исследований показали целесообразность обогащения картофеля физиологически активными соединениями грибов и стабильность практически всех показателей картофеле-грибного продукта при естественном хранении в течении 6 месяцев. Есть основания полагать, что эти показатели не изменяться и при дальнейшем, более длительном хранении продукта. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ермаков, А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков. – Л.: Агропромиздат, 1987. – 256 с. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues / I. Folch [et al] // J. Biol. Chem.− 1957.− Vol. 226, N 1.− P. 491−509. Состав триглицеридов масла хлопчатника / А.Г. Верещагин [et al] // Биохимия.− 1963.− Т. 28, № 5.− С. 868−878. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. − М.: Мир, 1975. − 322 с. Молочкина, Е.М. Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии / Е.М. Молочкина. – Сб. Исследование синтетических и природных фосфолипидов in vitro и in vivo. – М.: «Наука», 1992. – С. 100–109. Внеклеточные полисахариды некоторых видов базидиомицетов / В.В. Щерба [и др.] // Весцi АН Беларусi, Сер.бiял.навук. – 1994. − №3. – С. 49-52. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов / СанПин 11-63 РБ 98. − Мн., 2000. − С. 212. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения / М.Н. Запрометов. − М.: Наука, 1993. – 272 с. Антиокислительная активность экстрактов мицелия настоящей губки / А.Н. Капич [и др.] // Весцi АН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1991. – № 5. – С. 58–62. Капич, А.Н. Антиоксиданты грибного происхождения – модификаторы радиоустойчивости / А.Н. Капич, Ю.М. Леонтьев // Радиобиол. последствия аварии на Чернобыльской АЭС: материалы Всес. конф., Минск, 30 октября – 1 ноября 1991 г. / Нац. акад. наук Респ. Беларусь. Ин-т радиобиол. – Минск, 1991. − С. 50–51. NEW FUNCTIONAL FOOD PRODUCT WITH FUNGI GENUS OYSTER BABITSKAYA V.G.1, SHCHERBA V.V.1, PAROMCHIK I.I.2, 1 1 1 OSADCHAYA O.V , FILIMONOVA T.V , ROZHKOVA Z.A. 1 The Institute of Microbiology NAS of Belarus 2 The Central Botanic Garden NAS of Belarus Composition of the oyster mushrooms as well as potato and mushrooms containing product has been studied. Product’s energy value is similar to that of dried mushrooms (362 kCal/g). High content of essential fatty acids С18:2 and С18:3 – components of vitamin F – was established. Stability of all its components (proteins, lipids, total carbohydrates, phospholipids, phenol compounds, fatty acids) was proved. 298 УДК 579.22:663.051.2 БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ГРИБА CORDYCEPS MILITARIS – НОВОГО ОБЪЕКТА БИОТЕХНОЛОГИИ Пучкова Т.А., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Гвоздкова Т.С., Рожкова З.А., Черноок Т.В. лаборатория экспериментальной микологии Изучен биохимический состав глубинного мицелия гриба Cordyceps militaris. Выход биомассы составил 10,0−17,0 г/л, общий белок – 23,0−24,5%, полисахариды − 10−12%, липиды – 15−17%. В составе общих липидов на долю фосфолипидной фракции приходится до 21,2% или свыше 3−3,5% от АСБ. В мицелии отмечено высокое содержание эргостерина – до 2% от АСБ, в липидах гриба преобладают ненасыщенные жирные кислоты (62−80%), содержание олеиновой кислоты составило более 50%. Введение. В последние годы во всем мире отмечается усиление внимания общественности к проблемам питания населения. Современный человек не может с адекватным рационом из обычных натуральных продуктов получить микронутриенты и биологически активные вещества в необходимых количествах, что приводит к снижению устойчивости организма к неблагоприятным факторам окружающей среды, формированию иммунодефицитных состояний, нарушению функции систем антиоксидантной защиты, повышению риска развития заболеваний и снижению качества жизни. Одной из главных причин возрастающей востребованности в биологически активных добавках к пище (БАД) является необходимость ее обогащения витаминами, минеральными веществами и микроэлементами с целью коррекции питания, поддержания и укрепления здоровья, нормализации обменных процессов, профилактики заболеваний, ускорения процесса выздоровления. Перспективным источником для получения БАД во многих странах мира становятся мицелиальные грибы, которые обладают не только высокой питательной ценностью, но и лекарственными свойствами. В культивируемых грибах обнаружены вещества, стимулирующие иммунную систему, обладающие противоопухолевой, антибактериальной, противовирусной и противогрибной активностью, способные регулировать кровяное давление, понижать содержание холестерина и сахара в крови и др. Профилактические и лечебные средства из мицелиальных грибов способствуют адаптации человека и животных к неблагоприятным фак- 299 торам, повышая, с одной стороны, сопротивляемость организма, оказывая на него общеукрепляющее и тонизирующее действие и, с другой, ускоряя выведение из него радионуклидов, тяжелых металлов, различных токсинов [1]. Стратегический путь развития данной отрасли - расширение круга природных источников биологически активных веществ. Особый интерес представляют грибы р. Cordyceps – применяемые в Китае на протяжении 1200 лет. Эти грибы относятся к классу аскомицетов, сем. Clavicipitaceae, как и известные грибыпродуценты антибиотиков – Cephalosporium acremonium (цефалоспорин), Tolypocladium inflatum (циклоспорин) и алкалоидов Claviceps purpurea. Именно кордицепс в странах Восточной Азии считается самым лучшим и универсальным средством для укрепления организма и профилактики различных заболеваний. В народной медицине Китая, Японии, Кореи, Малайзии применяются C. militaris, C. sinensis, C. sobolifera, C. ophioglossoides и др. [2, 3]. C. militaris обитает в лесах Азии, Европы и Северной Америки. Очень редкий вид. Является энтомопатогенным грибом, паразитирующим на гусеницах и куколках бабочек. В народной медицине Китая используют и плодовое тело гриба, и наполненное мицелием тело гусеницы. Соединения, входящие в состав этого лекарственного гриба, улучшают состояние иммунной системы, усиливают резистентность к различным патогенным бактериям и другим микроорганизмам, оказывают противоопухолевое действие, повышают адаптационные возможности организма, обладают антиоксидантной активностью и препятствуют процессам старения, гармонизируют обменные процессы. Кордицепс также благотворно влияет на нервную, эндокринную, дыхательную и половую системы, обладает антиаритмическим и гипотензивным действием, понижает содержание холестерина, улучшает микроциркуляцию и препятствует тромбообразованию. Применяется при заболеваниях легких и почек, хроническом бронхите, нехватке жизненной энергии, гиперлипидемии, циррозе печени, ослаблении полового влечения, импотенции. Регулярное употребление кордицепса способствует повышению устойчивости к инфекционным заболеваниям, он применяется после истощения и длительной болезни. Известны публикации, согласно которым в рацион китайских спортсменов при подготовке к олимпийским играм и мировым чемпионатам обязательно включают кордицепс [4−6]. Кордицепс содержит уникальный комплекс физиологически активных веществ: белки, незаменимые аминокислоты, полиамины, липиды, ненасыщенные жирные кислоты, эргостерол, витамины B1, B2, B12, E и K, углеводы (моно-, ди-, олиго- и полисаха- 300 риды), стеролы, нуклеозиды, макро- и микроэлементы (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Se, Al, Ni и др.), антибиотики. Биологическое действие кордицепса определяют, в первую очередь, иммуномодулирующие полисахариды (β-D-глюканы), активирующие иммунные клетки, увеличивающие продукцию цитокининов и интерферона, а также другие производные сахаров, такие как кордицепсовая кислота (D-маннитол). Противоопухолевое действие полисахаридов кордицепса связано с повышением иммунитета организма. Препараты кордицепса, как и другие грибные полисахариды (PSP, PSK, AHCC, лентинан, арабиноксиланы) уменьшают тяжесть и продолжительность побочных эффектов, связанных с хемо- и радиотерапией [7−9]. Противоопухолевым действием обладают также измененные нуклеозиды: кордицепин (3′-дезоксиаденозин), дидезоксиаденозин. При синтезе новых цепей ДНК эти соединения встраиваются вместо аденозина, препятствуя репликации ДНК. Кордицепин ингибирует синтез ДНК у раковых клеток, поскольку у них нарушен механизм репарации ДНК. Этим объясняют и противовирусное действие кордицепса [10]. Ресурсы кордицепса в природе довольно ограничены. Сбор личинок насекомых, зараженных этим грибом-паразитом, происходит в ограниченное время в труднодоступных районах. Его лечебная ценность и рыночная стоимость далеко превысили подобные показатели женьшеня и пантов: рыночная цена за 1 кг кордицепса достигает примерно 1200–1300 долларов США. В настоящее время для получения препаратов на его основе используется мицелий, полученный биотехнологическим путем. При этом наиболее распространено твердофазное культивирование этого гриба с использованием субстратов на основе шелковичных червей или зерновых субстратов. При этом имеется мало данных о глубинном культивировании C. militaris как наиболее перспективном способе получения грибной биомассы и метаболитов, позволяющим за короткое время получать стандартные продукты с заданными свойствами. Цель исследования – изучение биохимического состава глубинного мицелия гриба, влияние различных источников углеродного питания на рост гриба, выход общих липидов и фосфолипидов, жирнокислотный состав липидов. Объекты и методы исследования. Гриб выращивали 7 суток в условиях глубинного культивирования на качалке со скоростью вращения 180 об/мин в колбах Эрленмейера на питательной среде следующего состава (г/л): сахароза – 40,0; КН2РО4 – 0,5; К2НРО4 – 0,5; Мg SO4×7Н2О – 0,5; Fe2(SO4)3 – 0,1; кукурузная мука – 10,0. Выращенный грибной мицелий отделяли от культу- 301 ральной жидкости фильтрованием через плотную нейлоновую ткань, промывали дистиллированной водой и использовали для проведения соответствующих анализов. Определяли: общий белок [11], полисахариды [12], липиды [13], фосфолипиды [14], эргостерин [15]. Идентификацию жирных кислот проводили по относительным удерживаемым объемам, а также в сопоставлении с показателями метиловых эфиров чистых жирных кислот [16, 17]. Результаты и их обсуждение. Выход биомассы у C. militaris составил 10,0–12,0 г/л, общий белок – 23,0–24,5%. Мицелий С. militaris является прекрасным источником полисахаридов, по содержанию которых (свыше 10% от АСБ) не уступает таким истинным продуцентам, как G. lucidum, L. edodes и T. versicolor. Отличительной чертой этого гриба явилось относительно высокое содержание в его мицелии общих липидов – более 15%, в составе которых на долю фосфолипидной фракции приходится до 21,2% или свыше 3% от АСБ. В мицелии отмечено высокое содержание эргостерина – до 2% от АСБ. Характерной особенностью жирнокислотного состава липидов гриба C. militaris оказалось низкое содержание эссенциальной линолевой кислоты (до 10%). Как показали исследования, синтез ненасыщенных жирных кислот идет у этого гриба по пути преимущественного образования олеиновой кислоты, удельный вес которой в составе жирных кислот липидов составляет более 50%. Проверено влияние различных источников углеродного питания на рост гриба, выход общих липидов и фосфолипидов, на жирнокислотный состав липидов. Лучшими источниками, способствующими одновременно активному накоплению биомассы (11,0–13,0 г/л), липидов (12–17% от АСБ) и фосфолипидов (2,0– 3,5% от АСБ) оказались глюкоза, сахароза и меласса. При выращивании гриба на средах с лактозой и крахмалом отмечалось снижение до 7,0–9,0 г/л биомассы и до 11% липидов. Однако наиболее существенные изменения наблюдались в составе жирных кислот липидов (таблица). Преобладающими оказались С16:0 и С18:1 кислоты. Особенно высоким был удельный вес моноеновой олеиновой кислоты (56– 76%). Синтез же линолевой кислоты (С18:2) в липидах гриба был несколько подавлен. Относительное содержание ее колебалось и составило 3,2–27,9%. Существенная перестройка метаболизма жирных кислот липидов произошла при выращивании гриба на среде с лактозой: в составе жирных кислот резко сократилась доля моноеновой олеиновой кислоты (более чем в 2,3–3,0 раза) и увеличилось содержание диеновой линолевой кислоты (до 27,93%). Значительно возросло и количество насыщенных паль- 302 митиновой и пентадекановой кислот. Высокое содержание пентадекановой кислоты гриб синтезировал и на среде с мелассой. Однако практически во всех случаях в липидах гриба преобладают ненасыщенные жирные кислоты (62–80%). Таблица – Влияние источника углерода на жирнокислотный состав липидов гриба C. militaris Жирные кислоты C14:0 С15:0 С16:0 С16:1 С18:0 С18:1 С18:2 Σ1 ненасыщенных Σ2 насыщенных Отношение Σ1 / Σ2 К ненасыщенности глюкоза следы 0,40 25,32 0,62 0,97 66,09 6,60 73,31 Источник углерода лактоза сахароза меласса 12,44 2,64 12,98 37,93 35,30 18,02 сл. 0,34 0,64 сл. 0,48 2,27 21,70 56,07 58,02 27,93 5,17 8,07 49,63 61,58 66,73 крахмал следы 3,50 16,42 0,49 0,42 75,93 3,24 79,66 26,69 2,75 50,37 0,98 38,42 1,60 33,27 2,00 20,34 3,92 0,79 0,77 0,66 0,74 0,83 Наиболее активный рост гриба и синтез им физиологически активных соединений происходил при рН 5,0–6,0. Подбор источников углеродного питания позволил оптимизировать промышленные питательные среды. Лучшими оказались: сыворотка молочная + кукурузная мука, сыворотка молочная + ржаная мука или меласса. Урожай биомассы при выращивании на этих средах достигал 16,0–17,0 г/л, выход экзополисахаридов – 5,0–6,0 г/л, эндополисахаридов – 11–12%. Заключение. Проведенные исследования показали, что гриб C. militaris дает хороший урожай биомассы в погруженной культуре, содержащей комплекс биологически активных веществ (белок − 23,0−24,5%, полисахариды − 10−12 %, липиды − свыше 15−17%, фосфолипиды − 3−3,5 %, эргостерин − 2%). Лучшими источниками, способствующими одновременно активному накоплению биомассы, липидов и фосфолипидов оказались глюкоза, сахароза и меласса. В липидах гриба преобладают ненасыщенные жирные кислоты (62–80%), содержание олеиновой кислоты − 56– 76%. Таким образом, глубинный мицелий гриба C. militaris может стать перспективным источником создания новых функциональ- 303 но-корригирующих препаратов, обогащенных биологически активными полисахаридами и липидами. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Гарибова, Л.В. Пищевая и лечебно-профилактическая ценность съедобных грибов / Л.В. Гарибова // Успехи медицинской микологии: материалы Пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, 28–30 марта 2007 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – М.: Национальная академия микологии, 2007. – Т. 9. – С. 236−237. Исангалин, Ф.Ш. Поиск метаболитов энтомопатогенных грибов с фармакологическими свойствами / Ф.Ш. Исангалин // Успехи медицинской микологии: материалы Четвертого Всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, 29–31 марта 2006 г. / Национальная академия микологии; редкол.: Ю.В. Сергеев [и др.]. – М.: Национальная академия микологии, 2006. – Т. 7. – С. 241−242. Pharmacological action of Cordyceps, a prized folk medicine / T.B. Ng [et al] // J. of Pharmacy and Pharmacology. − 2005. – Vol. 57, № 12. − P. 1509−1519. The varieties of antioxidant activity of Cordyceps militaris during the submerged fermentation / Y. Gu [et al] // Electronic J. of Biology. − 2006. − Vol. 2, № 2. − P. 30−33. Pharmacological function of Chinese medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species / S.Y. Wang [et al] // J. Food and Drug Analysis. − 2000. − Vol. 8, № 4. − P. 248−257. Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage / H.M. Yu [et al] // J. Agric. Food Chem. − 2006. − Vol. 54, № 8. − P. 3132−3138. Mycelium cultivation, chemical composition and antitumor activity of a Tolypocladium sp. fungus isolated from wild Cordyceps sinensis / P.H. Leung [et al] // J. Appl. Microbiol. − 2006. − Vol. 101. − P. 275−283. Isolation, purification and identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris / R. Yu [et al] // Fitoterapia. − 2004. − Vol. 75. − P. 662−666. A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures / H.O. Kim [et al] // J. Appl. Microbiol. − 2005. − Vol. 99. − P. 728−738. A simple and rapid method for identification and determination of cordycepin in Cordyceps militaris by capillary electrophoresis / Y.K. Rao [et al] // Anal. Chim. Acta. − 2006. − Vol. 566, № 2. − P. 253−258. Ермаков, А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков. – Л.: Агропромиздат, 1987. – 256 с. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid / Y.J. Tang [et al] // Enzyme and Microbial Technology. – 2002. – Vol. 31. – P. 20–28. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues / I. Folch [et al] // J. Biol. Chem.− 1957.− Vol. 226, N 1.− P. 491−509. Молочкина, Е.М. Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии / Е.М. Молочкина. – Сб. Исследование синтетических и природных фосфолипидов in vitro и in vivo. – М.: «Наука», 1992. – С. 100–109. К содержанию эргостерина в различных дрожжах / Н.И. Проскуряков [и др.] // Биохимия – 1938 – Т. 3, вып. 3. – С. 397–405. 304 16 17 Состав триглицеридов масла хлопчатника / А.Г. Верещагин [и др.]// Биохимия. − 1963.− Т. 28, № 5.− С. 868−878. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. − М.: Мир, 1975. − 322 с. THE BIOCHEMICAL COMPOSITION OF FUNGUS CORDYCEPS MILITARIS – A NEW BIOTECHNOLOGY SUBJECT PUCHKOVA T.A., BABITSKAYA V.G., SHCHERBA V.V., GVOZDKOVA T.S., ROZKOVA Z.A., CHERNOOK T.V. Laboratory of experimental mycology The Institute of Microbiology NAS of Belarus The biochemical composition of Cordyceps militaris submerged mycelium was -1 studied. Yield of biomass made up 10,0−17,0 g·l , total protein content – 23,0−24,5%, polysaccharides − 10−12%, lipids – 15−17%. Phospholipid fraction composed up to 21,2% of total lipids and over 3−3,5% of absolutely dry biomass. High content of ergosterine (up to 2% of absolutely dry biomass) was noted in mycelium, unsaturated fatty acids prevailed in fungal lipids (62−80%), oleic acid content composed more than 50%. УДК 601.2:602.3 КРИТЕРИИ ОТБОРА ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩЕВЫХ И МЕДИЦИНСКИХ БИОТЕХНОЛОГИЯХ Новик Г.И., Сидоренко А.В. лаборатория “Коллекция микроорганизмов” Бифидобактерии являются одними из преобладающих представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Благодаря важной роли в поддержании здоровья организма хозяина, бактерии рода Bifidobacterium широко используются для производства лечебнопрофилактических препаратов и продуктов питания, позволяющих нормализовать микрофлору кишечника и снижать риск многих заболеваний. С целью повышения эффективности пробиотиков необходимы новые подходы к селекции пробиотических штаммов, перспективных для использования в биотехнологиях. При выборе промышленных штаммов целесообразно предварительно исследовать их пробиотические (продукция органических кислот и биологически активных веществ, адгезия, участие в метаболизме различных соединений) и технологические (устойчивость к воздействию кислой среды и солей желчных кислот, степень толерантности к кислороду, скорость роста в производственной питательной среде и молоке и т.д.) свойства. Одним из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии является разработка и производство пробиотиков − лечебно-профилактических препаратов и продуктов функционального питания, оказывающих позитивное влияние на 305 здоровье человека и животных. Пробиотики, согласно наиболее общему и распространенному определению, − это живые микроорганизмы или вещества микробного происхождения, оказывающие, при естественном способе введения в соответствующих дозах, положительное влияние на организм хозяина посредством оптимизации состава микрофлоры [1]. Виды, принадлежащие к роду Bifidobacterium, являются одними из наиболее значимых представителей нормальной микрофлоры кишечника человека и животных. Бифидобактерии колонизируют пищеварительный тракт новорожденных в течение нескольких дней после рождения и на 99% составляют микрофлору кишечника здорового грудного ребенка. С возрастом количество бифидобактерий снижается, и они становятся третьими по численности, уступая видам Eubacterium и Bacteroides [1]. Именно бифидофлоре принадлежит ведущая роль в нормализации микробиоценоза кишечника, поддержании неспецифической резистентности организма, улучшении процессов всасывания и гидролиза жиров, белкового и минерального обмена, синтезе биологически активных веществ, в том числе витаминов и ряда незаменимых аминокислот. Установлена антимутагенная и антиканцерогенная активность бифидобактерий, способность снижать уровень холестерина в крови, облегчать симптомы непереносимости лактозы, стимулировать иммунную систему организма [1, 2, 3]. Данные многолетних клинических испытаний показали, что профилактические и лекарственные препараты, созданные на основе представителей рода Bifidobacterium, обладают минимальными побочными эффектами. Введение бифидобактерий в состав кисломолочных продуктов не оказывает отрицательного влияния на их органолептические свойства. Все это позволяет рассматривать представителей рода Bifidobacterium как перспективную основу для создания препаратов и продуктов, обладающих многофакторным регулирующим и стимулирующим воздействием на организм. В настоящее время при производстве пробиотических препаратов чаще всего используются виды B. bifidum, B. longum subsp. infantis, B. longum subsp. lactis [4]. Однако часто, даже при длительном систематическом употреблении, положительный эффект пробиотических препаратов и продуктов питания носит временный характер, а иногда полностью отсутствует [1, 4, 5, 6]. С целью повышения эффективности пробиотиков разработаны требования, согласно которым эффективный препарат должен обладать следующими свойствами: 1) быть непатогенным и нетоксичным; 2) оказывать положительное влияние на организм хозяина; 306 3) иметь в своем составе жизнеспособные клетки микроорганизмов или продукты их метаболизма; 4) обладать способностью к функционированию и оказанию соответствующего положительного влияния в условиях, характерных для разных отделов желудочно-кишечного тракта; 5) быть стабильным и сохранять жизнеспособные клетки бактерий в течение всего срока хранения [6]. Исходя из этого, для производства пробиотических препаратов и продуктов питания предлагается использовать штаммы бактерий, полученные от человека или вида животного, которому предполагается введение препарата, совместимые с представителями нормальной микрофлоры ЖКТ. Пробиотические микроорганизмы должны обладать широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и, в то же время, быть безопасными для людей, включая возможность иммунных реакций. Кроме того, производственные штаммы должны быть стабильны по биологической активности и удовлетворять определенным технологическим требованиям. Наконец, все штаммы, использующиеся в производстве, должны быть точно идентифицированы на видовом уровне и иметь генетический паспорт [1, 6]. Согласно современным требованиям, отбор штаммов пробиотических бактерий для использования в биотехнологиях, должен осуществляться на основе таких критериев как безопасность, технологичность и позитивное влияние на состояние здоровья. С точки зрения безопасности, бифидобактерии рассматриваются как комменсальные непатогенные микроорганизмы, благотворно влияющие на состояние кишечного тракта. Длительная история использования представителей рода Bifidobacterium при производстве кисломолочных продуктов подтверждает их GRAS (признанный полностью безвредным) статус, так как не было зарегистрировано ни одного случая системных или локальных инфекций, связанных с употреблением бифидобактерий [4]. В качестве одного из важнейших показателей эффективности препаратов рассматривают количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов. Принято, что для получения терапевтического эффекта, живые пробиотические бактерии должны присутствовать в препаратах и продуктах питания в ко6 7 личестве не менее 10 –10 КОЕ/г на момент потребления [7]. Исходя из этого, необходимо, чтобы производственные культуры были способны образовывать достаточную биомассу в процессе культивирования, по крайней мере, чтобы содержание микроорганизмов составляло не менее 107 КОЕ/г или мл продукта через 6–12 часов культивирования [4]. Применение многих коммерче- 307 ских штаммов бифидобактерий затруднено в связи с низкой скоростью роста в производственных средах и молоке, а также их слабой жизнеспособностью при замораживании и лиофилизации. Согласно имеющимся данным, медленный рост бифидобактерий в молоке связан, в первую очередь, с низкой протеолитической активностью данных микроорганизмов [2]. Исходя из этого, важным критерием отбора промышленных штаммов является наличие высокой протеолитической активности и скорости роста. Одним из подходов, используемых для повышения активности роста и кислотообразования бифидобактерий, является внесение большего, чем для заквасок молочнокислых бактерий, количества инокулята. Согласно имеющимся рекомендациям, при производстве продуктов, обогащенных бифидобактериями, количество вносимых клеток бактерий должно примерно соответствовать титру клеток в продукте на момент его поступления в продажу [4]. Положительное влияние на рост и метаболическую активность бифидобактерий в молочных продуктах оказывает добавление дрожжевого экстракта, гидролизата казеина или комбинации аминокислот, нуклеотидов и минеральных солей. Так как большое значение для роста и поддержания жизнеспособности бактерий рода Bifidobacterium имеет окислительно-восстановительный потенциал среды культивирования, добавление в кисломолочные продукты аскорбиновой кислоты, цистеина или тиогликолата натрия делает среду более благоприятной для роста бифидобактерий [4]. Одной из серьезных проблем, связанных с использованием бактерий рода Bifidobacterium в производстве, является их высокая чувствительность к кислороду, обусловленная внутриклеточным образованием и накоплением перекиси водорода (Н2О2). Полагают, что высокое количество Н2О2 блокирует фруктозо-6фосфат фосфокетолазу – ключевой фермент метаболизма сахаров, что, в конечном итоге, приводит к гибели клеток [8]. Представителей рода Bifidobacterium традиционно относят к анаэробным микроорганизмам, хотя чувствительность к кислороду у разных видов и даже штаммов варьирует [3, 9]. Установлено, что в некоторые виды Bifidobacterium могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10% углекислого газа [3]. Недавно показано, что B. breve, B. infantis, B. longum, B. adolescentis нормально развиваются в присутствие небольшого количества кислорода [9], а представители B. psychraerophilum способны к росту в аэробных условиях [10]. Согласно одним данным, устойчивость некоторых видов бифидобактерий к кислороду обусловлена наличием супероксиддисмутазы, а степень толерантности определяется активностью фермента [9]. Другие исследователи полагают, что ус- 308 тойчивость бифидобактерий к кислороду связана с синтезом НАД-оксидазы и НАДН-пероксидазы, так как высокие концентрации данных ферментов были обнаружены в клетках большинства аэротолерантных видов Bifidobacterium [4]. Возможно, это объясняет и тот факт, что в процессе культивирования многие бифидобактерии приобретают способность развиваться в присутствие некоторого количества кислорода. Таким образом, важным критерием отбора промышленных штаммов является степень устойчивости к кислороду. Отобранные культуры, обладающие желаемыми технологическими свойствами, должны быть совместимы с представителями нормальной микрофлоры ЖКТ, устойчивы к антимикробным соединениям, в частности, антибиотикам и бактериоцинам, естественно присутствующим в кишечнике, а также к специфическим условиям, характерным для разных отделов пищеварительного тракта [1]. Одним из важнейших требований к пробиотическим бактериям является сохранение жизнеспособности во время прохождения через ЖКТ. Следовательно, пробиотические штаммы должны обладать резистентностью к высокой кислотности желудочного сока и наличию желчных кислот в кишечнике, а также хорошим колонизационным потенциалом [11, 12]. Таким образом, целесообразной является проверка штаммов на их чувствительность к рН среды и отбор наиболее устойчивых к низким значениям. В настоящее время имеются сведения о селекции кислотоустойчивых производственных штаммов. Однако вопрос, сохраняют ли эти культуры с приобретением резистентности к низким значениям рН присущие исходным организмам специфические полезные для человека эффекты, остается открытым [1]. Согласно данным некоторых исследователей, устойчивость пробиотических штаммов B. animalis subsp lactis к желудочному соку человека была значительно выше, чем к химически синтезированному желудочному соку и соляной кислоте при одном значении рН [4]. Соответственно, данный этап изучения пробиотических штаммов требует более детальных и тщательных исследований. Следует учитывать и тот факт, что жизнеспособность бифидобактерий зависит не только от рН, но и от продолжительности воздействия кислой среды, наличия в среде других соединений (так, установлены протекторные свойства муцина и белков молока, действующих в качестве буферных агентов), а также от используемых штаммов. В тонком кишечнике устойчивость к солям желчных кислот является одним из важнейших свойств, обеспечивающих выживание и сохранение функциональных свойств бифидобактерий. 309 Экспериментально установлено, что данные соединения являются высокотоксичными для микрофлоры кишечника, так как повреждают мембраны клеток. Однако некоторые штаммы пробиотических микроорганизмов могут продуцировать специфические гидролазы, расщепляющие соли желчных кислот и, таким образом, предохраняющие клетки от разрушения во время прохождения через ЖКТ [13]. Исходя из этого, одним из критериев оценки биотехнологической перспективности штаммов бифидобактерий является устойчивость к солям желчных кислот и наличие гидролазной активности. Для оказания позитивного эффекта на организм хозяина, бифидобактерии должны прикрепляться к слизистой кишечника. Процесс адгезии позволяет бактериям удерживаться в определенной нише и обеспечивает возможность эффективной колонизации слизистой. Быстрое заселение кишечника бифидобактериями способствует нормализации качественного и количественного состава микрофлоры, стимулирует репаративный процесс слизистой оболочки кишечника. Колонизация кишечника бифидобактериями играет важную роль в защите слизистой от заселения патогенными и условно-патогенными бактериями, благодаря конкуренции за рецепторы для связывания. Согласно имеющимся данным, способность бифидобактерий прикрепляться к слизистой является видо- и даже штаммоспецифичной и зависит от поверхностных свойств бактериальной клетки. Таким образом, важным критерием отбора пробиотических штаммов бифидобактерий является хорошая адгезивная способность. Одним из самых существенных факторов при отборе штаммов Bifidobacterium для создания пробиотических препаратов является наличие полезного воздействия на организм хозяина, подтвержденного клиническими наблюдениями [1]. Антагонистическое действие бифидобактерий по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам связано, прежде всего, с продукцией органических кислот, являющихся конечными продуктами метаболизма. Конечными продуктами ферментации глюкозы у бифидобактерий являются молочная и уксусная кислоты в теоретическом соотношении 3:2, хотя на практике это соотношение может варьировать. Некоторые штаммы также способны продуцировать небольшие количества янтарной кислоты и углекислого газа [3, 14, 15]. Антибактериальный эффект молочной и уксусной кислот хорошо изучен: кислоты проникают через мембрану клеток в нейтральную цитоплазму, где диссоциируют с освобождением иона гидроокиси, что приводит к снижению внутриклеточного рН и подавлению жизненных функций клетки. При рН выше 4,5 более выраженным эффектом обладает уксусная кислота, а при рН ни- 310 же 4,0 более сильная противомикробная активность характерна для молочной кислоты. Таким образом, положительное влияние бифидобактерий на физиологические функции организма-хозяина связывают с продукцией молочной и уксусной кислот, создающих в кишечнике кислую реакцию, которая препятствует размножению гнилостной и патогенной микрофлоры и улучшает перистальтику кишечника [16]. Антагонистическая активность бифидобактерий обусловлена также способностью данных микроорганизмов продуцировать антибиотикоподобные вещества бактериоцины. Эти соединения – бифидин и бифилонг – стабильны при температуре 100 0С, активны при кислом значении рН и проявляют антибактериальную активность в отношении многих видов энтеробактерий, вибрионов, стрептококков и стафилококков [17]. Согласно мнению ряда авторов, при создании пробиотиков для лечебнопрофилактического потребления следует использовать приемы селекции производственных штаммов по критерию антагонистической активности в условиях смешанных популяций, близких к естественным экологическим. При этом преимущество следует отдавать умеренным кислотообразователям и активным продуцентам антибиотикоподобных субстанций. Кроме того, необходимо обязательно учитывать генетические особенности этих штаммов, включая наличие плазмид, а также способность к адгезии на поверхности слизистых оболочек, которые являются их естественными биотопами [18]. При отборе штаммов бифидобактерий для использования при производстве лечебно-профилактических препаратов и продуктов функционального питания, следует учитывать, что не все штаммы, обладающие выраженным положительным влиянием на организм человека и животных, можно использовать в промышленности в связи с их низкими технологическими свойствами. В то же время высокотехнологичные штаммы могут не оказывать ожидаемого позитивного эффекта в достаточной степени [1, 2, 19]. Поэтому необходимо комплексное и всестороннее изучение каждого штамма до его внедрения в производственный процесс. Таким образом, согласно современным требованиям, отбор пробиотических штаммов бифидобактерий необходимо проводить с учетом следующих критериев: 1) предлагаемые для производства штаммы должны быть выделены от здоровых людей; 2) идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам; 3) иметь генетический паспорт; 311 4) обладать широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов; 5) быть безопасны для людей, включая иммунологическую безопасность; 6) обладать резистентностью к высокой кислотности желудочного сока и воздействию солей желчных кислот в кишечнике; 7) иметь хороший колонизационный потенциал; 8) должны быть стабильны по биологической активности и удовлетворять технологическим требованиям. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Шендеров, Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. / Б.А. Шендеров – М.: Издательство «ГРАНТЪ», 2001. – Том III: Пробиотики и функциональное питание. – 288 с. Technologies with free and immobilized cells for probiotic bifidobacteria production and protection / Y. Doleyres [et al] // Int. Dairy J. – 2005. – Vol. 15. – P. 973–988. Getting better with bifidobacteria / S.C. Leahy[et al] // J. Appl. Microbiol. – 2005. – № 98. – P. 13031315. Roy, D. Technological aspects related to the use of bifidobacteria in dairy products / D. Roy // Lait. – 2005. № 85. P. 3956. Осипенко, М.Ф. Применение пробиотиков при лечении патологии внутренних органов / М.Ф. Осипенко // Фарматека. – 2005. № 14. – С. 1620. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials / C. Dunne [et al] // Antonie van Leeuwenhoek. – 1999. № 76 – P. 279–292. Selective enumeration of Bifidobacterium bifidum, Enterococcus faecium and streptomycin-resistant Lactobacillus acidophilus from a mixed probiotic product / M.L. Callicchia [et al] // J. Food protect. 1993. Vol. 56, № 11. P. 954957. Sensitivity of Bifidobacteria to oxygen / W. de Vries [et al] // J. Gen. Microbiol. – 1969. – Vol. 55. – P. 13. Arunachalam, K. D. Role of bifidobacteria in nutrition, medicine and technology / K.D. Arunachalam // Nutr. Research. 1999. Vol. 19, № 10. P. 15591597. Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov. and Aeriscardovia aeriphila gen. nov. sp. nov., isolated from porcine caecum / P.J. Simpson [et al] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. Vol. 54. P. 401406. Fuller, R. Probiotics in man and animals / R. Fuller // J. Appl. Bacteriol. 1989. Vol. 66. P. 365378. Probiotics: how should they be defined? / S. Salminen [et al] // Food Science & Technology. 1999. Vol. 10. P. 107110. Purification and characterization of three different types of bile salt hydrolases from Bifidobacterium strains / G.-B. Kim [et al] // J. Dairy Sci. – 2004. № 87. – P. 258266. de Vuyst, L. Application of functional starter cultures / L. de Vuyst // Food technol. biotechnol. − 2000. − № 38. − P. 105112. Tannock, G.W. Identification of lactobacilli and bifidobacteria / G. W. Tannock // Curr. Iss. Molec. Biol. – 1999. – Vol. 1, № 1. – P. 5364. Шендеров, Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции “Функциональное питание” / Б.А. Шендеров // Пищевая промышленность. – 2003. № 5. – С. 47. 312 17 18 19 Пробиотики и механизмы их лечебного действия / В.М. Бондаренко [и др.] // Эксперим. клин. гастроэнтерол. 2004. № 3. С. 8387. Поспелова, В.В. Биопрепараты, нормализующие микрофлору кишечника: итоги двадцатилетних исследований по проблеме / В.В. Поспелова, Н.Г. Рахимова, Г.И. Ханина, М.П. Халенова // Антибиотики и колонизационная резистентность под ред. Б.А. Шендерова. М., 1990. – С. 172181. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: composition and succession / G. Reuter // Intestinal Microbiol. 2001. Vol. 2. P. 4353. SELECTION CRITERIA FOR BIFIDOBACTERIA VALUABLE FOR BIOTECHNOLOGIES NOVIK G.I., SIDARENKA A.V. Laboratory “Microbial collection” Bifidobacteria are one of the predominant microorganisms of gastro-intestinal microflora in human and animals. Due to their important role in maintaining healthy host organism, members of the genus Bifidobacterium are widely used in therapeutic preparations and food products to improve the intestinal microbial balance and prevent different diseases. Nevertheless, probiotic preparations sometimes have transient or even no beneficial effect, which results from low viability and functional activity of bacterial strains used in preparations. To improve the efficacy of probiotics new selection criteria for probiotic bacterial strains have been recently proposed. They suggest that probiotic (adhesion, production of organic acids and biologically active compounds, metabolism of certain chemical substances) and technological (acid and bile salts resistance, oxygen tolerance, growth rate in milk and industrial media, etc.) properties of commercial strains should be carefully studied. УДК 579.22:575.2:577.152.1 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УЛЬТРА- И МИКРОФИЛЬТРАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПЕКТИНАЗА Г20х Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Кудряшов В.Л.1, Сапунова Л.И., Павловская Ж.И., Семашко Т.В., Жуковская Л.А., Казакевич И.О., Мороз И.В., Осока О.М., Чихаева О.В., Шляхотко Е.А. Лаборатория ферментов Института микробиологии НАН Беларуси 1 Отдел мембранных технологий ВНИИ пищевой биотехнологии РАСХН Проанализирована возможность использования ультра- и микрофильтрации в технологии получения ферментного препарата Пектиназа Г-20х. Показано, что применение композитных мембран ПС-10М на основе полисульфона («МИФИЛ», Беларусь) и мембран УПМ-20 или УПМ-10 («Владипор», Россия) для ульт- 313 рафильтрационного концентрирования культуральной жидкости гриба Penicillium digitatum 27П обеспечивает получение комплексного ферментного препарата с выходом по активности пектингидролаз 90-92%, пектинлиаз – 34-55%, целлюлаз – 53,8-90%. Установлено, что мембраны III и IV поколения из керамики и металлокерамики с диаметром пор 0,2 мкм могут быть использованы для холодной стерилизации культуральной жидкости, содержащей пектолитические и целлюлолитические ферменты. Выявлено, что из исследованных мембран максимальной удельной производительностью характеризуются керамические мембраны. Представлена схема технологической линии производства препарата Пектиназа Г20х применительно к существующему на Пинском РУП «Энзим» оборудованию. Введение. Особое место в современной биотехнологии занимает производство микробных ферментов для различных отраслей промышленности, медицины, сельского хозяйства и научных исследований. В пищевой промышленности в технологиях, основанных на переработке растительного сырья, широко используются пектолитические ферменты, осуществляющие деструкцию пектинов – одного из основных компонентов растительной клеточной стенки и срединной пластинки. Пектиназы незаменимы в виноделии и необходимы для производства соков и их концентратов, гомогенных пюре, нектаров, а также чая и кофе [1–8]. Ведущая роль в деструкции пектиновых веществ растительной ткани принадлежит пектиндеполимеразам – ферментам, которые катализируют гидролитическое или трансэлиминативное расщепление α-1,4-гликозидных связей пектинов и классифицируются по субстратной специфичности и механизму действия. Гидролиз пектиновых веществ осуществляют полиметилгалактуроназы (эндоПМГ и экзоПМГ) и полигалактуроназы (эндоПГ, КФ 3.2.1.15; экзоПГ, КФ 3.2.1.40). Ответственными за реакцию трансэлиминирования являются пектинтрансэлиминазы (ПТЭ), или пектинлиазы (эндоПЛ, КФ 4.2.2.10; экзоПЛ) и пектаттрансэлиминазы, или пектатлиазы (эндоПкЛ, КФ 4.2.2.2; экзоПкЛ, КФ 4.2.2.9). В расщеплении растительной ткани участвуют также и целлюлолитические ферменты. Наличие в Республике Беларусь сети предприятий, перерабатывающих плодово-ягодное и овощное сырье, обусловливает необходимость разработки промышленной технологии получения пектолитического ферментного препарата, важными стадиями получения которого являются концентрирование и очистка культуральной жидкости [9]. В настоящее время в производстве ферментных препаратов для очистки, фракционирования и концентрирования ферментных растворов широко применяются мембранные технологии – ультра- и микрофильтрация. 314 Цель исследования – детальное изучение процессов ультра- и микрофильтрации культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П для использования в технологии получения ферментного препарата Пектиназа Г20х. Объекты и методы исследования. Основной объект исследований – культуральная жидкость Penicillium digitatum 27П. Штамм гриба – продуцента комплекса пектолитических и целлюлолитических ферментов хранится в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси». Глубинное культивирование гриба проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл среды на качалке (180– о 200 об/мин) при температуре 24–26 C в течение 4 сут. Гриб выращивали на питательной среде следующего состава (в г/л): свекловичный жом – 10,0; глюкоза – 10,0; пшеничные отруби – 2,5; NH4NO3 – 3,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4 7H2O – 0,5; KCl – 0,5; исходный рН – 4,8–5,0. В исследованиях использовали полимерные, керамические и металлокерамические мембраны. Полимерные ультрафильтрационные мембраны УПМ-5, УПМ-10 и УПМ-20 изготовлены на основе ароматического полисульфонамида «Сульфон-4Т» на подложке из полипропилена, тканого и нетканого лавсана («Владипор», Россия), ультрафильтрационные мембраны ПАН-20, ПАН-10М, ПАН-15МС и ПС-10М – на базе сополимеров акрилонитрила без и с дополнительно модифицированной поверхностью («МИФИЛ», Беларусь). При изучении процесса отделения биомассы Penicillium digitatum 27П и холодной стерилизации культуральной жидкости применяли керамические (НПО «Керамикфильтр», Россия), металлокерамические (ОАО «АСПЕКТ», Россия) и алюмосиликатные керамические мембраны (ГНУ «Институт общей и неорганической химии НАН Беларуси», Беларусь). Керамические мембраны имеют двухслойную структуру, состоящую из подложки на основе порошкообразного α–Al2O3 и собственно мембранного селективного слоя, образованного волокнистым β-SiC. Селективный слой мембраны имеет сетчатую структуру, представленную супертонкими (< 0,1 мкм) керамическими волокнами, связанными с керамической подложкой керамической связкой на основе ZrO2. Начальная их водопроницаемость по дистиллированной воде при 20 °С составляет 1, 4, 10, 17 или 20 м3/м2·атм·ч; допускаемое давление – не менее 10 атм, диапазон рН – от 0 до 13; рабочая температура – до 300 °С. 315 В исследованиях использовали одноканальные керамические фильтры в виде трубок с наружным диаметром 10 мм и толщиной стенки 2 мм. Металлокерамические мембраны «TrumemTM», в которых на подложку из нержавеющей стали марки 316 L (Х18Н910Т) нанесен тонкий керамический слой диоксида титана, также двухслойны. Мембраны характеризуются высокой термоустойчивостью (до 300 °С), имеют поры от 0,07 до 1,0 мкм и выпускаются в виде листов размером 285х285 мм. Их начальная удельная производительность по дистиллированной воде составляет от 2800 до 18000 л/м2·ч при перепаде давления 2 атм. Исследования проводили на универсальной мембранной установке отдела мембранной технологии Всероссийского НИИ пищевой биотехнологии (г. Москва, Россия), которая может быть укомплектована мембранами нескольких типов из различных материалов. Предподготовку культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П проводили: 1) комбинированным двухступенчатым способом, включающим предварительное отделение биомассы путем фильтрации через бельтинг или центрифугирования и стерилизацию фильтрата культуральной жидкости на металлокерамических и керамических мембранах; 2) одноступенчатым методом на металлокерамических и керамических мембранах, позволяющих одновременно отделять биомассу и проводить холодную стерилизацию фильтрата культуральной жидкости. По окончании культивирования биомассу гриба отделяли фильтрованием, промывали дистиллированной водой, высушио вали при 105 С до постоянного веса, и ее количество определяли весовым методом. Активность ферментов определяли в фильтратах культуральной жидкости и ферментных препаратах и выражали в ед/мл фильтрата культуральной жидкости, ед/мг абсолютно сухой биомассы (продуцирующая способность мицелия) и ед/мл ферментного препарата. Общую пектолитическую (ПкА) активность измеряли согласно ГОСТу 20264.3-81 [10]. Об активности пектинлиазы (ПЛ) судили по появлению характерных хромогенов, образуемых продуктами ферментативного расщепления 1%-ного раствора яблочного пектина, приготовленного на 1/15 М фосфатном буфере, с тиобарбитуровой кислотой и имеющих максимум поглощения при 547 нм [11]. За единицу активности принимали такое количество фермента, в результате о действия которого на субстрат в течение 2 ч при 37 С оптическая плотность раствора увеличивалась на 0,1. Замер оптической 316 плотности проводили на спектрофотометре СФ-46, используя кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см. Активность целлюлазы определяли по скорости деполимеризации натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (NaKMЦ) [12]. Замер вязкости реакционной смеси, включающей 5 мл 0,9%-ного раствора NaKMЦ, 0,5 мл ферментного раствора и 0,5 мл 0,5 М ацетатного буфера (рН 5,0), проводили в вискозиметре ВПЖ-4 с диаметром капилляра 0,82 мм. За единицу активности целлюлазы принимали такое ее количество, которое вызывало снижение вязкости субстрата на 30% за 10 мин при рН 5,0 и температуре 30 оС. Белок определяли по методу Bradford [13], редуцирующие вещества (РВ) – c 3’,5’-динитросалициловой кислотой [14], сухие вещества (СВ) – рефрактометрически. Все опыты проводили в трехкратной повторности. Результаты и их обсуждение. Ранее было установлено, что при ультрафильтрации растворов с низким содержанием белков (< 50 мкг/мл) возникают потери, связанные с их адсорбцией в матрице мембраны и уменьшением их задержания [15]. Анализ использования для концентрирования и частичной очистки фильтрата культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П серийно выпускаемых мембран из полисульфона и сополимера акрилонитрила марок ПАН-50 и ПАН-20 (ГОСТ РБ 14742403.001-96) показал, что потери активности компонентов ферментного комплекса гриба при 15–20-кратном концентрировании составляли от 40 до 80%. Еще более низкой селективностью в отношении ферментов, продуцируемых грибом Penicillium digitatum 27П, характеризовались мембраны из полисульфона марки ПС-50. Поэтому для определения оптимальных полимерных мембран, позволяющих провести процесс ультрафильтрационного концентрирования фильтрата культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П с минимальными потерями ферментных белков, мы использовали модифицированные мембраны («МИФИЛ», Беларусь) [16, 17] и промышленно выпускаемые мембраны типа УПМ («Владипор, Россия»). В результате проведенных исследований установлено, что при концентрировании культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П с использованием модифицированных мембран из полиакрилонитрила потери ферментативной активности с пермеатом практически не происходили (таблица 1). Удалось также значительно снизить потери компонентов ферментного комплекса, возникающие в результате адсорбции и возможной инактивации на поверхности мембраны. Наилучшие результаты получены при использовании в процессе ультраконцентрирования композитных 317 мембран ПС-10М на основе полисульфона, позволяющих довести выход целевого продукта до 90%. Таблица 1 – Распределение ферментативных активностей и белка при ультрафильтрации культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П Марка ультрафильтрационной мембраны* ПАН-20 ПС-10М ПАН-15МС ПАН-10М Относительная ферментативная активность, %: целПкА ПЛ люлаза Вариант опыта Фильтрат культуральной жидкости Пермеат Концентрат Пермеат Концентрат Пермеат Концентрат Пермеат Концентрат Белок, % 100 100 100 100 11,0 33,5 0,0 90,3 3,7 75,6 0,9 74,2 13,2 20,2 14,3 20,2 20,0 25,1 10,9 24,4 0,0 51,4 0 53,8 0 57,4 0 73,5 14,6 42,8 0 64,1 7,9 56,1 0 60,0 Примечание. * Условия ультрафильтрации: фильтрационная ячейка ФМ02-200, ω = 10 с-1, ∆ Р = 0,2 МПа, Т = 298 К. Результаты анализа использования ультрафильтрационных мембран типа УПМ для концентрирования фильтрата культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П приведены в табл. 2. Анализ полученных результатов показал, что при ведении процесса с использованием мембраны УПМ-100 практически весь ферментный белок переходит в фильтрат, в концентрате обнаружено только 16% исходной активности пектингидролаз, 15% – пектинлиазы, 14,4% – целлюлазы (таблица 2). При использовании мембраны УПМ-50 в концентрате выявлено 40% пектингидролазной, 45,5% – пектинлиазной, 76,4% – целлюлазной активности. Следует отметить значительную сорбцию на мембране пектингидролаз (27%) и пектинлиаз (13%). Максимальная ферментативная активность пектингидролаз (92% и 91,0%) выявлена в концентратах, полученных при использовании соответственно мембран УПМ-20 и УПМ-10. Что касается пектиназ трансэлиминативного способа действия, то в этом случае потери их активности составляют 35–36,3%. Максимальный (90 и 84%) выход целлюлазной составляющей комплексного ферментного препарата получен при концентрировании фильтра- 318 та культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П на мембранах УПМ-20 и УПМ-10. Таблица 2 – Распределение ферментативных активностей при ультрафильтрации культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П Марка ультрафильтрационной мембраны* УПМ 100 УПМ 50 УПМ 20 УПМ 10 Относительная ферментативная активность, %: целлюПкА ПЛ лаза Вариант опыта Фильтрат культуральной жидкости Пермеат Концентрат Пермеат Концентрат Пермеат Концентрат Пермеат Концентрат 100 100 100 80,0 16,0 33,0 40,0 8,0 92,0 9,0 91,0 84,0 15,0 41,5 45,5 36,3 54,9 35,0 53,9 85,6 14,4 23,8 76,0 6,4 90,1 10,0 84,0 Примечание. * Условия ультрафильтрации: фильтрационная ячейка -1 ФМ02-200, ω = 10 с , ∆Р = 0,2 МПа, Т = 298 К. В результате проведенных исследований по подбору мембран для ультрафильтрационного концентрирования фильтрата культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П установлена целесообразность использования композитных мембран ПС-10М на основе полисульфона («МИФИЛ», Беларусь) или мембран УПМ20 и УПМ-10 («Владипор», Россия). Исследования по предподготовке культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П показали, что как двухступенчатый, так и одноступенчатый процессы обеспечивают отделение биомассы без потерь ферментативной активности. Удельная производительность керамических и металлокерамических мембран при холодной стерилизации культуральной жидкости, из которой биомасса была предварительно удалена фильтрованием через бельтинг или центрифугированием, достаточно высока и состав2 ляет в среднем 120 л/м ·ч. При этом удельная производительность мембран из керамики была в 1,5 раза более высокой, чем удельная производительность металлокерамических мембран «TrumemTM». Результаты анализа эффективности использования алюмосиликатных мембран для микрофильтрации культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П представлены в таблице 3. 319 Таблица 3 – Микрофильтрация культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П с использованием алюмосиликатных керамических мембран Культуральная жидкость рН конечный Белок, мг/мл РВ, мг/мл ПкА, ед/мл ПЛ, ед/мл Исходная Стерильная 5,8 5,8 124 96 0,36 0,30 1,13 0,83 2,6 2,0 Целлюлаза, ед/мл 0,15 0,15 Приведенные данные свидетельствуют о том, что для микрофильтрации культуральной жидкости гриба-продуцента могут быть использованы алюмосиликатные мембраны отечественного производства. По завершении процесса отмечены незначительные потери белка (22,6%), что, объясняется, в основном, сорбцией ферментов: потери пектингидролаз и пектинлиаз составили соответственно 24,6 и 23,1%. Аналогичные результаты получены и при стерилизации опытных образцов ферментного препарата. В результате выполненных исследований разработана линия производства ферментного препарата Пектиназа Г20х применительно к существующему на Пинском РУП «Энзим» оборудованию. Схема технологической линии представлена на рисунке 1. Согласно представленной схеме, культуральная жидкость с биомассой продуцента из производственных ферментеров (позиция 1) по существующему на заводе трубопроводу подается в рамные фильтр-прессы (позиция 2), где разделяется на биомассу и культуральную жидкость. До 5% биомассы возвращается на стадию приготовления питательной среды, а остальное ее количество высушивается с целью получения кормовой белковой добавки. Для обеспечения «кристальной» прозрачности и проведения холодной стерилизации культуральная жидкость подается на микрофильтрационную (МФ) установку, укомплектованную мембранами из керамики (или металлокерамики) с диаметром пор 0,2 мкм, работающую в проточном режиме со скоростью в межмембранном канале 4 м/с. В этой установке до 95% культуральной жидкости проходит через МФ-мембраны. Часть (5–7%) концентрата культуральной жидкости для исключения потерь возвращается на фильтр-пресс (позиция 2). МФ-установка и керамические мембраны для нее могут быть приобретены в России. 320 1 3 2 Консервант Ультраконцентрат 5% биомассы 95% биомассы на сушку 25% концентрата УФ-пермеата 6 4 УФ-пермеат 5 На упаковку В канализацию 75% ОО-пермеата (розлив) и отгрузку 25% ОО-пермеата Рисунок – Блок-схема технологической линии производства ферментного препарата Пектиназа Г20х: 1– ферментер; 2 – фильтр-пресс; 3 – микрофильтрационная (МФ) установка; 4 – ультрафильтрационная (УФ) установка; 5 –обратноосмотическая (ОО) установка; 6 – сборник ультраконцентрата пектиназы 321 Стерильный пермеат с МФ-установки подается в существующую на РУП «Энзим» ультрафильтрационную установку, где концентрируется ориентировочно в 20 раз по объему и в автоматическом режиме сбрасывается в сборник (позиция 6). В этот же сборник вводятся консерванты и наполнители. При этом дополнительная стерилизация ультраконцентрата (ферментного препарата Пектиназа Г20х) не требуется. Стерильность процесса обеспечивается за счет периодической химической стерилизации УФ-установки (позиция 4) и дополнительного монтирования в ее контур ультразвуковой установки. Пермеат с УФ-установки дополнительно очищается на обратноосмотической (ОО) мембранной установке до уровня, позволяющего сбрасывать его в городскую канализацию. Установку (позиция 5) необходимо приобрести. Четверть полученного ОО-пермеата подается на фильтрпресс для извлечения остаточного количества фермента из биомассы. Весь концентрат УФ-пермеата возвращается на стадию приготовления питательной среды. Заключение Выполненные исследования показали, что для ультрафильтрационного концентрирования фильтрата культуральной жидкости Penicillium digitatum 27П целесообразно использовать композитные мембраны ПС-10М на основе полисулфона («МИФИЛ», Беларусь) или мембраны УПМ-20 или УПМ-10 («Владипор», Россия). Установлено, что мембраны III и IV поколения из керамики и металлокерамики с диаметром пор 0,2 мкм могут успешно использоваться для холодной стерилизации культуральной жидкости, содержащей пектолитические и целлюлолитические ферменты. При этом мембраны из керамики отличаются от мембран из металлокерамики в 1,5 раза более высокой средней удельной производительностью. Алюмосиликатные мембраны отечественного производства также обеспечивают стерилизацию культуральной жидкости и опытных образцов ферментного препарата Пектиназа Г20х. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности реализации мембранных процессов в биотехнологических производствах и, в частности, о необходимости оснащения соответствующим оборудованием технологических линий существующих и вновь создаваемых в России и Беларуси предприятий по производству ферментных препаратов. 322 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Microbial pectinolytic enzymes: A review / R.S. Jayani [et al] // Proc. Biochem. – 2005. – Vol. 40. – Р. 2931–2944. Microbial alkaline pectinases and their applications: a review / G.S. Hoondal [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – Vol. 59. – P. 409–418. Applications of pectinases in the commercial sector: a review / D.R. Kashyap [et al] // Bioresour. Technol. – 2001. – Vol. 77. – P. 216285. The influence of enzymatic treatment of mash on the analytical composition of apple juice / F. Will [et al] // Int. J. Food Sci. Technol. – 2002. – Vol. 37. – P. 653–660. Recent application of biotechnology in wine production—review / O. Colagrande [et al] // Biotechnol. Prog. – 1994. – Vol. 10. – P. 2–18. Effect of addition of biopectinase on biochemical composition of CTC black tea / S.Marimuthu [et al] // Rec. Adv. Plant Crop Res. – 2000. – Vol. 28. – P. 265–269. Jones, K.L. Fermentation involved in the production of cocoa and tea / K.L. Jones, S.E. Jones // Progress in Industrial microbiology. Modern applications of traditional biotechnology / Jones K.L., Jones S.E.; ed. by M.B. Bushel. – Elsevier: Amsterdam–Oxford–N.Y.–Tokyo, 1984. – Vol. 19. – P. 413–456. Jalles, S.A. Application of fungal pectic enzymes in coffee curing / S.A. Jalles, K.R. Sreekantiah // J. Food Sci. Technol. – 1984. – Vol. 21. – P. 5–8. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1987. – 335 с. Препараты ферментные: ГОСТ 20264.3-81. – Введ. 01.07.1982. – Mocква: Государственные стандарты Союза ССР: Государственный комитет СССР по стандартам, 1985. – 71 с. Neukom, H. Uber farbenreaktionen von uronsauren mit thiobarbitursaure / H. Neukom // Chimia. – 1960. – Vol. 14. – P. 165–167. Fractionation and some properties of cellulase components in meicelase a cellulase preparation from Trichoderma viride / T. Niwa [et al] // J. Ferment. Technol. – 1965. – Vol. 43, №. 5. – P. 286–301. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microorganism quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72, № 1–2. – P. 248–254. Miller, C.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar C.L. Miller // Anal. Chem. – 1959. – Vol. 31. – P. 426–428. Белявский, К.М. Использование метода ультрафильтрации для концентрирования пектолитических ферментов Penicillium digitatum 27П / К.М. Белявский [et al] // Микробиология и биотехнология XXI столетия: материалы Междунар. конф., Минск, 22-24 мая 2002 г. / Мн.: ОДО «НоваПринт», 2002. – С. 207–208. Касперчик, В.П. Физико-химическая модификация поверхности ультрафильтрационных мембран из полиакрилонитрила и полисульфона // В.П. Касперчик, А.Л. Яскевич, А.В. Бильдюкевич // Фундаментальная наука в интересах развития критических технологий: материалы конф. РФФИ, г. Владимир, 12–14 сентября 2005 г. / Новосибирск, 2005. – С. 58–59. Гидрофилизация ультрафильтрационных мембран окисленными полисахаридами / А.Л. Яскевич [и др.] // Весцi НАН Беларусi. Сер. хiм. навук. – 2003. – № 2.– С. 76–79. 323 APPLICATION OF ULTRA- AND MICROFILTRATION FOR PRODUCTION OF ENZYME PREPARATION PECTINASE G20X MIKHAILOVA R.V., LOBANOK A.G., KUDRYASHOV V.L.1, SAPUNOVA L.I., PAVLOVSKAYA ZH.I., SEMASHKO T.V., ZHUKOUSKAYA L.A., KAZAKEVICH I.O., MOROZ I.V., OSOKA O.M., CHYKHAYEVA O.V., SHLYAKHOTKA E.A. Laboratory of enzymes, Institute of Microbiology, National Academy of Sciences 1 Department of membrane technology, All-Russian Research Institute of Food Biotechnology, Russian Academy of Agricultural Sciences Processes of ultra- and microfiltration of Penicillium digitatum 27P cultural liquid as a source of pectolytic enzymes were studied in detail for further use in technologies of producing enzyme preparation Pectinase G20x. The advantage of composite membrane based on polysulphone (PS-10M, “MIPHYL”, Belarus) and membranes UPM-20 or UPM-10 (“Vladipore”, Russia) for ultrafiltration was demonstrated. Application of above-mentioned membranes during ultrafiltration of complex enzyme preparation ensured the following activity yields 90–92% for pectinhydrolases, 34–35% for pectinlyases, 53.8–90% for cellulases. It was found that membranes of III and IV generation made from ceramic and metal-ceramic material with pore size 0.2 µm were essential for cold sterilization of cultural liquid containing pectolytic and cellulolytic enzymes. Ceramic membranes are preferential in average specific productivity. The technology of manufacturing enzyme preparation Pectinase G20x was elaborated and flowsheet for production of Pectinase G20x adapted to equipment of Pinsk Enzyme Plant (Belarus) has been presented. 324 БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ УДК 661.744.224:615.917:579.222.2 ДИМЕТИЛОВЫЙ ЭФИР ФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ: СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ, БИОДОСТУПНОСТЬ Волкова К.В., Самсонова А.С. лаборатория деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Обсуждается роль диметилового эфира ортофталевой кислоты (ДМФ) в загрязнении биосферы. Приведены данные о химических свойствах данного вещества, использовании его в промышленности, путях миграции в объекты окружающей среды. Представлены современные данные о токсическом влиянии ДМФ на организм человека и животных. Рассмотрен процесс деструкции ДМФ в естественных биогеоценозах как результат взаимодействия биологических и физикохимических факторов. Особое внимание уделено роли гетеротрофных микроорганизмов в биодеградации ДМФ. Эфиры фталевой кислоты получили столь широкое распространение в современном индустриальном обществе, что Агенство по защите окружающей среды США включило их в группу приоритетных загрязнителей биосферы [1]. Промышленные предприятия, производящие пластификаторы, синтетические волокна, пластические массы и изделия из них, загрязняют окружающую среду фталевыми эфирами, содержащимися в атмосферных выбросах и сточных водах [2, 3]. Фталаты обнаруживаются в почве, воде, озерных и морских отложениях, атмосферном воздухе, ракообразных, рыбе, готовых пищевых продуктах, оливковом масле, молоке, консервах, длительно хранившихся в полимерной упаковке, в крови, моче и жировой клетчатке животных и людей [4–7]. В объекты окружающей среды вещества-загрязнители могут попадать вследствие несовершенства технологических процессов, в процессе утилизации промышленных и бытовых отходов, а также, из-за отсутствия прочных химических связей с полимерами, из пластиковых упаковочных материалов и изделий бытового назначения [8]. Фталевые эфиры в высоких концентрациях попадают в природные водоемы, где их содержание в настоящее время выше, чем пестицидов [9]. Диметиловый эфир орто-фталевой кислоты (C10H10O4, Mr 194.18) – бесцветная прозрачная маслянистая жидкость со сла- 325 бым эфирным запахом. При температуре ниже -2 0С выглядит как кристаллическое вещество светло-желтого цвета. Относительно малолетуч при комнатной температуре (t0 кипения – 283,7 0С). Малорастворим в воде (0,45% при 20 0С), легко смешивается со спиртами, эфирами, хлороформом. Фотостабилен. Химически инертен [10]. Наиболее часто используемые синонимы: диметил-1,2бензодикарбоксилат, фермин, мипакс, NTM, сольваном, сольварон, палатион М, аволин, репефтал. Производство диметилфталата широкомасштабно, а использование повсеместно: это вещество применяется в промышленности при пластификации эфиров целлюлозы, ПВХ, поливинилацетата, каучуков, полиакрилатов, твердого ракетного топлива, при переработке стирола, а также в металургии, как вспениватель при флотации металлического концентрата. Часто его используют в смеси с другими пластификаторами, например, с трифенилфосфатом, триацетином, диэтил- и дибутилфталатами. Кроме того, ДМФ используется при производстве косметики, парфюмерии, смазочных материалов, ковровых покрытий, декоративных тканей, входит в состав репеллентов против кровососущих насекомых и некоторых пестицидов [11, 12, 13]. В Европе заводы по производству ДМФ находятся на территории Германии, Италии, Голландии, Бельгии, Великобритании, а также стран СНГ. Использование диметилового эфира фталевой кислоты в промышленности и его миграция в окружающую среду. Сообщения ряда авторов свидетельствуют о загрязнении водных бассейнов диметилфталатом. Это соединение было обнаружено в воде и иле рек и озер США [14, 15, 16], Англии [9, 17], Голландии [18], Малайзии [19], Германии [20], Нигерии [21], в подземных водах Хорватии [22]. По данным Клюева и Бродского содержание ДМФ в водах реки Дунай достигает 4,9 мкг/л [23]. Следовые количества диметилфталата обнаружены в реке Урал [24] и даже в озере Байкал [25]. Корейские ученые обнаружили, что ДМФ способен мигрировать в воду из бумаги и картона через защитную полиэтиленовую пленку, что может создавать опасность загрязнения пищевых продуктов, хранящихся в упаковке из бумаги, подвергшейся вторичной переработке [26]. В воздух ДМФ поступает преимущественно с промышленными атмосферными выбросами, поскольку испарение этого вещества с поверхности почвы и воды несущественно [27]. С повышением температуры концентрация фталатов в воздухе увеличивается. Из воздуха, где пластификатор может находиться в газообразном, аэрозольном или адсорбированном на пылевых части- 326 цах виде, он с осадками поступает в почву [28], из которой легко аккумулируется растениями, а по трофическим цепям – животными и человеком. Процессы адсорбции обеспечивают Ван-дерВаальсовы силы или гидрофобные взаимодействия. Адсорбция фталатов обратно пропорциональна их растворимости в воде и зависит от количества в почве солей. Так показано, что почвенные частицы, суспендированные в морской воде, способны адсорбировать 0,9 мг ДМФ/г почвы, а в дистиллированной – <0,2 мг/г [29]. Проблема загрязнения почв диметилфталатом актуальна не только для промышленных зон – исследования, проведенные в Китае, показали, что ДМФ обнаруживается в значительной части образцов сельскохозяйственных почв, отобранных из разных областей страны [30]. ДМФ был обнаружен даже в известковых отложениях, образовавшихся в результате действия погодных условий на стенах одного из старейших кафедральных соборов в Севилье (Испания), что свидетельствует о наличии этого вещества в атмосфере данной области [31]. Опасность загрязнения питьевой воды фталатами, в том числе и ДМФ, связана с возможностью их миграции в воду из материалов водопроводных труб и различных пластифицированных покрытий. Установлены некоторые закономерности их миграции – отмечается ее зависимость от температуры, «возраста» изделия, марки ПВХ [32]. Наличие диметилфталата в питьевой воде было обнаружено в США [33] и Японии [34]. Велика также вероятность поступления ДМФ в организм человека вследствие дермального контакта с репеллентами, дезодорантами и косметикой, в состав которых входит это вещество [35, 36]. ДМФ может накапливаться живыми организмами. Это вещество было обнаружено в устрицах, собранных в различных местах у побережья Лос-Анджелеса. Концентрация ДМФ составляла от 8,4 до 44 нг/г живого веса исследованных моллюсков [37]. Наблюдался также процесс биоаккумуляции ДМФ в креветках и рыбе [38]. Признание потенциала биоконцентрации эфиров офталевой кислоты обусловлено их липофильностью и низкой растворимостью в воде [39]. Токсичность ДМФ. Диметиловый эфир ортофталевой кислоты относится к токсикантам группы D (вещества с низкой токсичностью) и считается веществом, не являющимся канцерогеном для человека. Однако результаты исследований мутагенной, тератогенной и канцерогенной активности данного вещества зачастую противоречивы. Поскольку для других эфиров ортофталевой кислоты подобные эффекты были показаны, то не исключена 327 вероятность потенциальной опасности ДМФ для здоровья человека и животных. Диметилфталат широко используется, как репеллент против комаров и мошек со времен второй мировой войны. С тех пор не появлялось сообщений о возникновении каких-либо патологий кожи, связанных с его применением человеком [40]. Доказано, что через неповрежденную кожу это вещество поступает в организм чрезвычайно медленно [41]. При попадании в глаза ДМФ вызывает боль и обратимые нарушения эпителия [42]. При проглатывании вызывает ожоги губ и языка, раздражение пищевода и желудка, рвоту, диарею, угнетение центральной нервной системы, кому. При вдыхании – повреждения дыхательных путей, кашель [43]. Хроническое ингаляционное воздействие на уровне ПДК сопровождается атеросклеротическими изменениями аорты, которые в сочетании с нарушением артериального давления и липидного обмена, приводят к ускорению естественного старения сердечно-сосудистой системы [44, 45]. Наблюдалось также уменьшение подвижности сперматозоидов человека в присутствии ДМФ [46], при этом монометилфталат токсичного действия на сперму не оказывает [47]. Показано, что у животных ДМФ вызывает раздражение слизистых оболочек, функциональные сдвиги в нервной системе, некроз печени, отек легких, изменения почек, селезенки и лимфоузлов, снижение уровня холестерина и тестостерона [48]. При кормлении LD50 для кроликов составляет 4,4 г/кг, для морских свинок – 2,4 г/кг /57/, для крыс и мышей – 6,8 г/кг [50]. Было установлено, что при воздействии на куриные эмбрионы ДМФ вызывает замедление и уродства развития центральной нервной системы [51]. По данным Singh A.R. et al. (1972), добавление токсиканта в подстилку беременных самок крыс в количестве 10, 33 и 50% от LD50 вызывало аномалии развития скелета у эмбрионов: отсутствие хвоста, искривление лапок, удлинение или срастание ребер [52]. Однако более поздние аналогичные исследования у крыс и мышей отмечали лишь снижение веса беременных самок и отдельные случаи появления лишних ребер у потомства [53]. В настоящее время ДМФ отнесен к классу веществ, не обладающих эмбриотоксическим эффектом, но способных влиять на эмбрионы по механизму, аналогичному токсическому воздействию на организм матери [54]. ДМФ хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте и распространяется по всему телу лабораторных животных, но депонируется он в печени. Выделяется ДМФ или в неизмененном виде, или гидролизованным в моноэфир и фталевую кислоту [55]. Монометилфталат накапливается больше, чем остальные моно- 328 эфиры фталевых кислот, поскольку обладает наибольшей полярностью (метил > бутил > октил ~ этилгексил) [56]. Тимофиевская Л.А. с сотр. [57], изучая токсикологические признаки ДМФ, ДЭФ, ДБФ, ДЭГФ, ДНФ, ББФ, пришли к выводу, что ДМФ является наиболее токсичным, что согласуется с опубликованными ранее результатами исследований Krauskopf L.G. (1973) [58]. Максимально чувствительной к действию эфиров является нервная система. Согласно теории Зильбера Ю.Д. [59], чувствительность нервных волокон связана с высоким содержанием липидов в миелиновой оболочке. Мембраноповреждающее действие эфиров о-фталевой кислоты обусловлено прооксидантами ненасыщенных жирных кислот, которые, накапливаясь в тонком кишечнике, инициируют перекисное окисление. Метаболизм ДМФ у лабораторных животных осуществляется гидролизом одной (с образованием монометилфталата) или двух эфирных групп (с образованием фталевой кислоты) [55, 57]. У крыс, получивших 0,1 мл ДМФ, через 24 часа в моче были обнаружены монометилфталат (77,5%), фталевая кислота (14,4%) и диметилфталат (8,1%) [60]. В эритроцитах человека, кроме этих продуктов гидролиза, выявлялось еще небольшое количество метанола [61]. In vitro показана способность кожи метаболизировать ДМФ и, тем самым, защищать организм от мутагенного и канцерогенного воздействия ДМФ [62]. Однако при длительном нанесении диметилфталата на кожу кроликов (в течение 2-х месяцев) отмечались её стойкие изменения: повышалась складчатость эпидермиса, уменьшалось количество волос, истончалась дерма и стенки сосудов [63]. В экспериментах in vitro на мембранах эпидермиса человека и крысы также наблюдались необратимые изменения барьерных функций мембран после контакта с ДМФ. При этом отмечалось, что кожа крысы была менее подвержена повреждающему действию фталата, чем кожа человека [64]. Установлено, что диметилфталатгидролизирующая активность эпидермиса в 60 раз ниже, чем печени в расчете на сырой вес [59]. Выявлено ингибирующее действие ДМФ на ферменты печени: аминопуринN-деметилазу и анилингидроксилазу [65, 66], а также на липидный обмен [67]. В тестах на тератогенность in vitro обнаружена способность ДМФ ингибировать пролиферацию фибробластов L929 [68]. Данные исследований мутагенного эффекта ДМФ противоречивы: в результате одних экспериментов наблюдался стойкий мутагенный эффект ДМФ в тестах с бактериальным штаммом Salmonella typhimurium ТА100 [59, 69] и клетками лимфомы мышей L5178Y [70]. При этом способность индуцировать мутации 329 исчезала после добавления микросомального препарата печени S-9, расщепляющего ДМФ до монометилфталата за счет действия неспецифических эстераз [71]. В других работах отмечается, что ДМФ не является мутагеном для бактериальных штаммов S. typhimurium ТА98, ТА1535 и ТА1537, не вызывает хромосомных аберраций в яйцеклетках китайских хомячков, но в присутствии S-9 способен вызывать в них обмен сестринских хроматид [72, 73]. Изучение влияния эфиров фталевых кислот на беспозвоночных пресноводного бентоса (Hyalella azteca, Chironomus tentans, и Lumbriculus variegatus) выявили токсическое действие ДМФ: LC50 составила 28,1 мг/л для H. azteca, 68,2 мг/л для C. tentans и 246 мг/л для L. variegatus [74]. Наблюдалось также токсическое влияние ДМФ на морских жгутиковых (Gymnodium breve) [75], почвенных и пресноводных олигохет (Lumbricus terrestris, Eisenia foetida, Lumbriculus variegatus) [76], зеленые водоросли (Pseudokirchneriella subcapitata), ракообразных (Daphnia magna) [77] и радужную форель [78], а также на тигровых креветок (Artemia salina) [79] и их яйца [80]. Таким образом, по итогам рассмотрения литературных данных, по реакциям острых токсических проявлений диметилфталат может быть отнесен к малотоксичным веществам. Наиболее существенной особенностью его биологического действия является направленное влияние на нервную систему. Присущая ему широкая зона хронического действия, отсутствие различий в коэффициентах кумуляции в зависимости от дробности вводимой дозы указывают на потенциальную опасность хронического воздействия ДМФ. К сожалению, в проанализированной литературе нами не обнаружено работ, освещающих токсическое действие ДМФ на микрофлору почвенных и водных ценозов. Разрушение ДМФ микробными сообществами и чистыми культурами микроорганизмов. Деградация ДМФ в естественных биогеоценозах осуществляется в результате взаимодействия биологических и физико-химических факторов. Однако сорбция, фотолиз, химический гидролиз незначительно влияют на судьбу диметилового эфира в окружающей среде [81]. Решающую роль в его разрушении играют гетеротрофные микроорганизмы. Способность утилизировать диметилфталат была показана как для почвенных [82], так и для водных микроорганизмов [83]. В основном большинство литературных источников освещает деструкцию невысоких концентраций ДМФ в почве и воде (от 0,02 до 0,1%), характеризующихся относительно высокой ско- 330 ростью разрушения. Так, в лабораторных тестах, накопительная культура из почвы и сточных вод способна полностью минерализовать 86% ДМФ за 28 дней [84]. От 2 до 13 дней требовалось для полного разрушения диметилового эфира микроорганизмами ила и воды в пробах, отобранных из 6 различных пресноводных источников и эстуариев, окружающих побережье залива в Мехико [85]. При этом концентрация загрязнителя не превышала 80мкг/л. С повышением концентрации ДМФ скорость его разрушения падает: к примеру, по данным исследований японских ученых, для деградации 100 мг/л токсиканта на 90% микроорганизмам активного ила необходимо 4 недели [86]. Скорость разложения эфира в почве зависит не только от его количества, но и от богатства почвы микрофлорой и видового разнообразия микробных популяций. На деградацию фталата влияет также температура, уровень рН, влажность почвы, обеспеченность ее кислородом, а также содержание в ней органического вещества. Оптимальный температурный режим для микробной утили0 зации ДМФ создается в интервале 22–32 C. Разрушение ДМФ активным илом в концентрации 0,1 мг/г при температурах 4 и 20 0С после 3 дней инкубации составило 2 и 98% соответственно [87]. Уровень рН почвы влияет прежде всего на начальную скорость разрушения фталатов, поскольку увеличение кислотности приводит к частичной инактивации эстераз [88]. Влажность почвы оказывает на деградацию эфиров фталевых кислот прямое и косвенное действие. Помимо обеспечения оптимальных условий для развития микроорганизмов, уровень влажности влияет на сорбцию эфиров [89]. Насыщение почвы влагой способствует ускорению расщепления ДМФ. Так, в почве, насыщенной влагой, полная деградация ДМФ происходит за 72 часа, тогда как в сухой на это требуется вдвое больше времени [90]. Ряд ксенобиотиков разрушается микроорганизмами только в условиях обеспечения кислородом, что связано с участием в превращении чужеродных соединений окислительных ферментов. В связи с этим, обеспеченность почвенной среды кислородом – одно из необходимых условий для ускорения разрушения фталатов [91]. Исследование деградации в почве ДМФ в анаэробных и аэробных условиях показывает, что в аэробных условиях он полностью разрушаются за 15 дней, а в почве, затопленной водой, в конце периода наблюдения остается еще 60% токсиканта [88]. Максимальный уровень анаэробной деструкции ДМФ, наблюдавшийся в пресноводных болотах, составлял 30% после 56 дней инкубирования [92]. 331 Способность микроорганизмов расщеплять ДМФ в анаэробных условиях отмечена в ряде работ [93, 94]. Условия метаногенеза в процессе очистки сточных вод в очистном сооружении способствуют полной метаболизации ДМФ в течение 50–100 суток инкубации, в случае, если концентрация эфира не превышает 20 мг/л [95, 96]. Повышение концентрации оказывает значительный ингибирующий эффект на метаногенность – при моделировании аварийных выбросов с повышением концентрации до 200 мг/л уровень деструкции ДМФ за тот же период составлял 25% [95]. Использование метода накопительных культур позволило выделить чистые культуры микроорганизмов, утилизирующие фталевые эфиры. Способность метаболизировать ДМФ до о-фталевой кислоты была обнаружена у одноклеточных зеленых водорослей Chlorella pyrenoidosa [97, 98], Dunaliella tertiolecta [99], Closterium lunula [100] и у многих микроскопических грибов, относящихся к родам Aspergillus, Penicillium, Rhisopus, и др. Грибной штамм Fusarium 2P3 способен использовать ДМФ в качестве единственного источника углерода и энергии [101]. Однако особое внимание в литературе уделяется бактериальным деструкторам фталатов, как наиболее активным и перспективным [102]. Способность деградировать ДМФ была показана для представителей рода Micrococcus: для штаммов M. roseus, M. luteus, M. pulcher, M. sp. 12B, M. sp. 3, выделенных Eaton & Ribbons [103, 104], выявлена способность утилизировать ДБФ и ДМФ в концентрации до 0,1%. Установлено, что штамм Bacillus sp. способен расти в присутствии 0,2% ДМФ [105]. Выделены штаммыдеструкторы ДМФ, относящиеся к видам Enterobacter aerogenes [106] и Pseudomonas acidovorans [107]. Обнаружены активные деструкторы и среди нокардиоподобных микроорганизмов: И.Б. Ившиной с соавторами [108] выделены штаммы Rhodococcus ruber и R. luteus, разрушающие 0,2% ДМФ; штамм R. erythropolis 29Ф, полученный в Институте микробиологии НАН Беларуси, способен полностью метаболизировать 0,1% ДМФ за 48 ч и 50% ДМФ за 28 дней при исходной концентрации 1% [109, 110, 111]. В Институте микробиологии НАНБ были получены штаммы, способные эффективно деградировать высокие концентрации ДМФ: R. erythropolis 14 Ф, способный полностью утилизировать ДМФ в концентрации 2–3% [112] и Ps. putida MK55, полностью разрушающий 5% ДМФ и способный расти в среде, содержащей до 30 г/л токсиканта [113, 114]. Многие исследователи отмечают, что разрушение ДМФ затруднено по сравнению с остальными представителями данного 332 класса соединений. К примеру, Mathur S.P., Rouatt J.W (1975) выделили из аэротенков очистных сооружений предприятия по производству пластических масс неидентифицированные бактериальные штаммы, способные утилизировать высокие концентрации (до 1%) ДБФ, ДЭФ, ДОФ и бутилфталилбутилгликолат, а также штамм Serratia marcescens, способный расти в присутствии 2,5% ДЭГФ и ДОФ. Однако все эти микроорганизмы были не способны утилизировать ДМФ [115]. Из 9 изолятов, выделенных из вод реки Темпаку (Япония), и способных эффективно метаболизировать ДБФ, ДЭФ, ДЭГФ, ни один не разрушал ДМФ [116]. Штамм Micrococcus sp., изолированный из обогащенной ДЭФ почвы, утилизирует ДЭФ, ДБФ, ДЭГФ, фталат, терефталат, изофталат в концентрации 0,2%. Исключение составляет диметилфталат, не вовлекаемый данной культурой в метаболизм [117]. В настоящее время все больший интерес вызывает микробиологическая очистка сточных вод, основанная на использовании активных бактериальных штаммов-деструкторов, закрепленных в условиях локальных установок [118]. Значительное количество публикаций свидетельствует о явном преимуществе иммобилизованных систем, где клетки микроорганизмов закреплены на невымываемом, нерастворимом в воде носителе [119, 120]. Известно, что прикрепленные микроорганизмы более устойчивы к действию токсикантов, размножаются быстрее, чем во взвешенном состоянии, характеризуются повышенной метаболической активностью [121]. Исследования разрушения ДМФ микроорганизмами неизменно подтверждают преимущество иммобилизованных клеток перед свободноплавающими [122]. Исследования Niazi J.H. и Karegoudar T.B. [123] показали, что клетки Bacillus sp., разрушающие в жидкой среде не более 20 мМ диметилфталата, при иммобилизации на полиуретановом носителе или в альгинатном геле, приобретают способность метаболизировать 40 мМ ДМФ за 12–15 суток инкубации. Изучение деструкции ДМФ двумя консорциумами микроорганизмов, включающими Pseudomonas fluorescens, P. aureofaciens и Sphingomonas paucimobilis (1), а также Xanthomonas maltophilia и S. Paucimobilis (2), позволило установить, что метаболическая активность иммобилизованных микроорганизмов повышается. Деградация ДМФ достигла 400 мг/л менее чем за 5 дней [124]. Аналогичные данные были получены в лаборатории деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Института микробиологии НАН Беларуси: деструктивная активность иммобилизованных на капроновых нитях кле- 333 ток штамма Ps. putida MK55 была в 3 раза выше, чем свободноплавающих [125]. Приведенные литературные источники свидетельствуют об активном деструктирующем влиянии микроорганизмов на эфиры фталевой кислоты. Использовать диметилфталат в качестве единственного источника углерода способны микроорганизмы различного таксономического положения, которые могут быть успешно использованы в технологиях биоремедиации загрязненных фталатом почвы и воды. Однако многие авторы отмечают, что микробная деградация диметилфталата по сравнению с другими фталатами существенно затруднена. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ghisalba, O. Chemical wastes and the biodegradation - an overview / O. Ghisalba // Experientia. – 1983. – Vol. 39, № 11. – P. 1247–1257. Грушко, Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах / Я.М. Грушко. – Ленинград: Химия, 1982. – 216 с. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник / под ред. Э.Н. Левиной, И.Д. Гадаскиной. – Ленинград: Химия. – 1985. – 460 с. Thuren, A. Determination of phthalates in aquatic environments / Thuren A. // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. – 1986. – Vol. 36, № 1. – P. 33–40. Levels of seven urinary phthalate metabolites in a human reference population / Blount B.C. [et al] // Environ. Health. Perspect. – 2000. – Vol. 108, № 10. – P. 979–982 Monitoring of phthalic acid monoesters in river water by solid-phase extraction and GC-MS determination / T. Suzuki [et al] // Environ. Sci. Technol. – 2001. – Vol. 35, № 18. – P. 3757–3763. New methodology for the determination of phthalate esters, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether, and nonylphenol in commercial whole milk samples / N. Casajuana [et al] // J. Agric. Food Chem. – 2004. – Vol. 52, № 12. – P. 3702–3707. Pyrolytic evaporation of a plasticizer from polyvinyl chloride meat wrapping film / R.J. Jaeger [et al] // Bull. environ. contam. toxicol. – 1974. – Vol. 11, № 1. – P. 45–48. Dissolved and particulate phthalate esters in the river Mersey estuary / M.R. Preston [et al] // Mar. Pollut. Bull. – 1986. – Vol. 17, № 12. – P. 548–553. The Merck Index – An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals / ed. by S. Budavari. – New York: Merck and Co., 1996. – 550 p. Hawley's Condensed Chemical Dictionary / ed. by R.J. Lewis. – 12th ed. – New York: Van Nostrand Rheinhold Co., 1993. – 420 p. The Pesticide Manual – World Compendium / ed. by C.D.S. Tomlin. – 10th ed. – Surrey, UK: The British Crop Protection Council, 1994. – 354 p. Schreck, C.E. Permethrin and dimethyl phthalate as tent fabric treatments against Aedes aegypti / C.E. Schreck // J. Am. Mosq. Control. Assoc. – 1991. – Vol. 7, № 4. – P. 533–535. Organics in the water column of Lake Pontchartrain / J. A. McFall [et al] // Chemosphere. – 1985. – Vol. 14, № 9. – P. 1253–1265. Trace organic and heavy metal pollutants in the Mississippi River / I. R. DeLeon [et al] // Chemosphere. – 1986. – Vol. 15, № 6. – P. 795–805. 334 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Phthalate esters and other industrial organic chemicals in the North and Irish seas / R.J. Law [et al] // Wat. Sci. Tech. – 1991. – Vol. 24, № 10. – P.127–134. Phthalate ester speciation in estuarine water, suspended particulates and sediments / M.R. Preston [et al] // Environ. Pollution. – 1989. – Vol. 62, № 2. – P. 183–193. Persistent organic pollutants in river water and ground water of the Netherlands / B.C.J. Zoeteman [et al] // Chemosphere. – 1980. – Vol. 9, № 4. – P. 231–249. Tan, G.H. Residue levels of phthalate esters in water and sediment samples from the Klang River basin / G.H. Tan // Bull. Environ. Toxicol. – 1995. – Vol. 54, № 2. – P. 171–176. Identification and quantification of volatile organic components in emissions of waste incineration plants / K. Jay [et al] // Chemosphere. – 1995. – Vol. 30, № 7. – P. 1249–1260. Determination of phthalate ester plasticizers in the aquatic environment of southwestern Nigeria / O.S. Fatoki [et al] // Env. Intern. – 1993. – Vol. 19, № 6. – P. 619–623. Phthalates in underground waters of the Zagreb area / M. Mihovec-Grdic [et al] // Croat. Med. J. – 2002. – Vol. 43, № 4. – P. 493–497. Определение органических загрязняющих веществ в воде Дуная методом хромато-масс-спектрометрии / Н.А. Клюев [и др.] // Водные ресурсы. – 1993. – Т. 29, № 4. – С. 479–483. Органические загрязнения реки Урал в зоне действия открытого водозабора Оренбурга / Цинберг М.Б. [и др.] // Гигиена и санитария. – 1998. – N 6. – С. 22–24. Кирюхина, Е.Д. ВЭЖХ-анализ диэфиров О-фталевой кислоты в различных объектах / Кирюхина Е.Д., Барам Г.И. // Байкал – природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата: материалы Междунар. симпоз., Иркутск, 11–17 мая 1994 г. / ЛИСНА. – Иркутск, 1994 – Т. 3. – С. 47. Migration of surrogate contaminants in paper and paperboard into water through polyethylene coating layer / Choi J.O. [et al] // Food Addit. Contam. – 2002. – Vol. 19, № 12. – P. 1200–1206. Fate of toxic organic compounds in wastewater treatment plants / A.C. Petrasek [et al] // J. Water pollut. Control. Fed. – 1983. – Vol. 55, № 10. – P. 1286–1296. Shields, H.C. Analysis of ambient concentrations of organic vapors with a passive sampler / H.C. Shields, C.J. Weschler // J. Air Pollut. Control Assoc. – 1987. – Vol. 37, № 9. – P. 1039–1045. The interactions of phthalate esters with suspended particulate material in fresh and marine waters / L.A. Al-Omran [et al] // Environ. Pollut. – 1987. – Vol. 46, № 3. – P. 177–186. Survey of phthalate pollution in arable soils in China / X.Y. Hu [et al] // J. Environ. Monit. – 2003. – Vol. 5, № 4. – P. 649–653. Organic and inorganic compounds in Limestone weathering crusts from cathedrals in southern and western Europe / B.O. Fobe [et al] // Environ. Sci. Technol. – 1995. – Vol. 29, № 6. – P. 1691–1701. Катаева, С.Е. Миграция химических веществ из полимерных материалов в воду / С.Е. Катаева // Пластмассы. – 1989. – № 10. – С. 82–84. Gas chromatography-mass spectrometry identification of trace organics in Philadelphia, Pennsylvania, USA, drinking waters during a 2-year period / I.H. Suffet [et al] // Water Res. – 1980. – Vol. 14, № 7. – P. 853–867. Identification and determination of trace organic substances in tap water by computerized gas chromatography-mass spectrometry and mass fragmentography / R. Shinohara [et al] // Water Res. – 1981. – Vol. 15, № 5. – P. 535–542. Scented sticks agarbatties as source of phthalate pollution / S.P. Srivastava [et al] // Indian J. Environ. Health. – 1988. – Vol. 30, № 4. – P. 372–375. 335 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Reifenrath, W.G. Evaporation and skin penetration characteristics of mosquito repellent formulations / W.G. Reifenrath, G.S. Hawkins, M.S. Kurtz // J. am. mosq. control. assoc. – 1989. – Vol. 5, № 1. – P. 45–51. McFall, J.A. Base-neutral extractable organic pollutants in biota and sediments from Lake Pontchartrain / J.A. McFall, R.A. Shelley, I.R. DeLeon // Chemosphere. – 1985. – Vol. 14, № 10. – P. 1561–1569. Bioaccumulation and metabolism of phthalate esters by oysters, brown shrimp, and sheepshead minnows / H.W. Wofford [et al] // Ecotoxicol. Environ. Saf. – 1981. – Vol. 5, № 2. – P. 202–210. Wolfe, N.L. Use of linear free energy relationships and an evaluative model to assess the fate and transport of phthalate esters in the aquatic environment / N.L. Wolfe, L.A. Burns, W.C. Steen // Chemosphere. – 1980. – Vol. 9, № 7–8. – P. 393–402. Natural-based repellent products: efficacy for military and general public uses / R. J. Novac [et al] // Journal of the American Mosquito Control Association. – 2005. – Vol. 21, № 4. – P. 7–11. Elston, DM. Insect repellents: an overview / J. Am. Acad. Dermatol. – 1998. – Vol. 36. – P. 644–645. Grant, W.M. Toxicology of the eye / W.M. Grant. – 3rd ed. – Springfield IL: Charles C. Thomas Publisher, 1986. – 349 р. Sittig, M. Handbook of Toxic And Hazardous Chemicals / M. Sittig. – Park Ridge, NJ: Noyes Data Corporation, 1981. – 270 p. Климов, В.С. Влияние эфиров о-фталевой кислоты и бензина БР-1 на морфологическую структуру сосудистой системы / В.С. Климов // Основные вопросы проблемы отдаленных последствий воздействия профессиональных ядов: cб. науч. тр. / ВНИИГ. – Москва, 1976. – С. 126–130. Evidence for toxic anthropogenic chemicals in human thrombogenic coronary plaques / J.B. Ferrario [et al] // Arch. Environ. Contam. Toxicol. – 1985. – Vol. 14, № 5. – P. 529–534. Human sperm motility is affected by plasticizers and diesel particle extracts / B. Fredricsson [et al] // Pharmacol. Toxicol. – 1993. – Vol. 72, № 2. – P. 128–133. The relationship between environmental exposure to phthalates and computeraided sperm analysis motion parameters / S.M. Duty [et al] // J. Androl. – 2004. – Vol. 25, № 2. – P. 293–302. Clayton, G.D. Patty's Industrial Hygiene and Toxicology. / G.D. Clayton, F.E. Clayton // Toxicology. – 1993. – Vol. 2F – 3052 p. Lehman, A.J. Insect repellents / A.J. Lehman // Q. Bulletin assoc. Food drug off U.S. – 1955. – Vol. 19. – P. 8790. Токсикология эфиров о-фталевой кислоты и их гигиеническая регламентация / Л.А. Тимофиевская [и др.] // Гиг. труда и профзаб. – 1980. – № 3. – С. 25–28. Effects of phthalate esters (plasticizers) on chick embryos and chick embryonic cells / H.-Y. Lee [et al] // Growth. – 1974. – Vol. 38, № 3. – P. 301–302. Teratogenicity of phthalate esters in rats / A.R. Singh [et al] // J. Pharm. Sci. – 1972. – Vol. 61, № 1. – P. 51–55. Developmental toxicity evaluation of diethyl and dimethyl phthalate in rats / E.A. Field [et al] // Teratology. – 1993. – Vol. 48, № 1. – P. 33–44. Brown, N.A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods / N.A. Brown // Altern. Lab. Anim. – 2002. – Vol. 30, № 2. – P. 177–198. Kluwe, W.M. Overview of phthalate ester pharmacokinetics in mammalian species / W.M. Kluwe // Environ. Health Perspect. – 1982. – Vol. 45, № 1 – P. 3–10. Pharmacokinetics of dimethylphthalate / S.E. Gleiberman [et al] // Med. Parazitol. Parazit. Bolezni. – 1978. – Vol. 47, № 3. – P. 58–63. 336 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 Закономерности токсического действия и ускоренное нормирование в ряде эфиров о-фталевой кислоты / Тимофиевская Л.А. [и др.] // Гиг. труда и проф. заболев. – 1988. – №7. – С. 52–55. Krauskopf, L.G. Studies of the toxicity of phthalates via ingestion / L.G. Krauskopf // Environ. health perspect. – 1973. – Vol. 3. – P. 61–72 Assessment of the mutagenicity of phthalate esters / W.J. Kozumbo [et al] // Environ. Health Perspect. – 1982. – Vol. 45. – P. 103–109. Identification of the metabolites of simple phthalate diesters in rat urine / P.W. Albro [et al] // J.Chromatogr. – 1974. – Vol. 94, № 1. – P. 209–218. 1H NMR spin-echo spectroscopy of human erythrocytes. Transformation of exogenous compounds / U. Skibsted [et al] // NMR Biomed. – 1990. – Vol. 3, № 6. – P. 248–258. Vehicle effects on in vitro percutaneous absorption through rat and human skin / J. Hilton [et al] // Pharm. Res. – 1994. – Vol. 11, № 10. – P. 1396–1400. Toxic effects of diethyltoluamide and dimethylphthalate creams as mosquito repellents on rabbit’s skin / Al-Sagaff S. [et al] // Anat. Soc. Ind. – 2001. – Vol. 50, № 2. – P. 148–152. In vitro absorption of some o-phthalate diesters through human and rat skin / R.C. Scott [et al] // Environ. Health Perspect. – 1987. – Vol. 74. – P. 223–227. Effect of phthalic acid esters on drug metabolizing enzymes / P.K. Seth [et al] // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 1981. – Vol. 26, № 6. – P. 764–768. Seth, P.K. Hepatic effects of phthalate esters / P.K. Seth // Environ. Health. Perspect. – 1982. – Vol. 45. – P. 27–34. Bell, F.P. Effects of phthalate esters on lipid metabolism in various tissues, cells and organelles in mammals / F.P. Bell // Environ. Health Perspect. – 1982. – Vol. 45. – P. 41–50. Discriminative power of an assay for automated in vitro screening of teratogens / Walmod P.S. [et al] // Toxicol. in vitro. – 2004. – Vol. 18, № 4. – P. 511–525. Mutagenicity evaluation of phthalic acid esters and metabolites in Salmonella typhimurium cultures / D.K. Agarwal [et al] // J. Toxicol. Environ. Health. – 1985. – Vol. 16, № 1. – Р. 61–69. Results of the L5178Y mouse lymphoma assay and the Balb/3t3 cell in vitro transformation assay for eight phthalate esters / E.D. Barber [et al] // J. Appl. Toxicol. – 2000. – Vol. 20, № 1. – P. 69–80. Mutagenicity and metabolism of dimethyl phthalate and its binding to epidermal and hepatic macromolecules / W.J. Kozumbo [et al] // J. Toxicol. Environ. Health. – 1991. – Vol. 33, № 1. – P. 29–46. Chromosome aberration and sister chromatid exchange tests in Chinese hamster ovary cells in vitro: V. Results with 46 chemicals / K.S. Loveday [et al] // Environ. mol. Mutagen. – 1990. – Vol. 16, № 4. – P. 272–303. NTP toxicology and carcinogenesis studies of diethylphthalate (CAS No. 84-66-2) in F344/N rats and B6C3F1 mice (Dermal Studies) with dermal initiation / promotion study of diethylphthalate and dimethylphthalate (CAS No. 131-11-3) in male Swiss (CD-1(R)) mice // Natl. Toxicol. Program. Tech. Rep. Ser. – 1995. – Vol. 429. – P. 1–286. An assessment of the toxicity of phthalate esters to freshwater benthos. 1. Aqueous exposures / Call D.J. [et al] // Environ. Toxicol. Chem. – 2001. – Vol. 20, № 8. – P. 1798–1804. The toxicity of phthalates to the marine dinoflagellate Gymnodinium breve / W.B. Wilson [et al] // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 1978. – Vol. 20, № 2. – P. 149–154. Drewes, C.D. Sublethal effects of environmental toxicants on oligochaete escape reflexes / C.D. Drewes // Americ. Zoolog. – 1997. – Vol. 37, № 4. – P. 346–353. 337 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 Toxicity of mono- and diesters of o-phthalic esters to a crustacean, a green alga, and a bacterium / S. Jonsson [et al] // Environ. Toxicol. Chem. – 2003. – Vol. 22, № 12. – P. 3037–3043. Chronic toxicity of 14 phthalate esters to Daphnia magna and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) / J.E. Rhodes [et al] // Environ. Tox. and Chem. – 1995. – Vol. 14, № 11. – P. 1967–1976. Sugawara, N. Effect of phthalate esters on shrimp / N. Sugawara // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 1974. – Vol. 12, № 4. – P. 421–424. Sugawara, N. Toxic effect of a normal series of phthalate esters on the hatching of shrimp eggs / N. Sugawara // Toxicol. Appl. pharmacol. – 1974. – Vol. 30, № 1. – P. 87–89. Ultraviolet absorption, aqueous solubility, and octanol-water partition for several phthalates / F. Leyder [et al] // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 1983. – Vol. 30, № 2. – P. 152–157. The Biodeteriomtion of the plasticizer dioctylphthalate / G.R. Williams [et al] // Intern. Biodeterioration Bull. – 1983. – Vol. 19, № 1. – P. 37–38. Potential for biodegradation of phthalic acid esters in marine regions / B.F. Taylor [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1981. – Vol. 42, № 4. – P. 590–595. Shake flask biodegradation of 14 commercial phthalate esters / R.H.Sugatt [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – Vol. 47, № 4. – P. 601–606. Dibutylphthalate degradation in estuarine and freshwater sites / W.W. Walker [et al] // Chemosphere. – 1984. – Vol. 13, № 12. – P. 1283–1294. Biodegradation and Bioaccumulation Data of Existing Chemicals Based on the CSCL / Ed. by Chemicals Inspection and Testing Institute. – Japan: Japan Chemical Industry Ecology, Toxicology and Information Center. – 1992. – ISBN, 4-89074101-1. – P. 3–90. Trace-level analysis of phthalate esters in surface water and suspended particulate matter by means of capillary gas chromatography with electron capture and mass selective detection / R.Ritsema [et al] // Chemosphere. – 1989. – Vol. 18. – P. 2161–2175. Degradation of some phthalic acid esters in soil / R. Shanker [et al] // Environ. Pollut. – 1985. – Vol. A39, № 1. – P. 1–7. Measurement of mobility of organic compounds in soils / H.M. Seip [et al] // Sci. Total. Environ. – 1986. – Vol. 50. – P. 87–102. The effect of biodegradation on the determination of some chemodynamie properties of phthalate esters / D.J. Russell [et al] // J. Environ. Sci. Health. – 1985. – Vol. A20. – P. 927–941. Microbial degradation of the endocrine-disrupting chemicals phthalic acid and dimethyl phthalate ester under aerobic conditions / Y. Wang [et al] // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 2003. – Vol. 71, № 4. – P. 810–818. Anaerobic biodegradation potentials in digested sludge, a freshwater swamp and a marine sediment / T. Madsen [et al] // Chemosphere. – 1995. – Vol. 31, № 10. – P. 4243–4258. Behavior of phthalic acid esters during batch anaerobic digestion of sludge / K. Ziogou [et al] // Water Res. – 1989. – Vol. 23, № 6. – P. 743–748. Survey of the anaerobic biodegradation potential of organic chemicals in digesting sludge / N.S. Battersby [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – Vol. 55. – P. 433–439. Toxicity and biodegradation of phthalic acid esters under methanogenic conditions / O.A. O’Connor [et al] // Env. Toxicol. Chem. – 1989. – Vol. 8, № 7. – P. 569–576. Anaerobic degradation of xenobiotics by organisms from municipal solid waste under landfilling conditions / J. Ejlertsson [et al] // Antonie Van Leeuwenhoek. – 1996. – Vol. 69, № 1. – P. 67–74. Kinetics of phthalate ester biodegradation by Chlorella pyrenoidosa / H. Yan [et al] // Environ. Toxicol. and Chem. – 1995. – Vol. 14, № 6. – P. 931–938. 338 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 Effect and mechanism of inorganic carbon on the biodegradation of dimethyl phthalate by Chlorella pyrenoidosa / H. Yan [et al] // J. Environ. Sci. Health. Part. a Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. – 2002. – Vol. 37, № 4. – P. 553–562. Yan, H. Dimethyl phthalate biodegradation by Dunaliella tertiolecta / H. Yan, Y.-X. Lui // J. Env. Sci. – 1998. – Vol. 10, № 3. – P. 296–301. Yan, H. Increase in biodegradation of dimethyl phthalate by Closterium lunula using inorganic carbon / H. Yan, Pan G. // Chemosphere. – 2004. – Vol. 55, № 9. – P. 1281–1285. Klausmeier, R.E. Microbial degradation of plasticizers / R.E. Klausmeier, W.A. Jones // Dev. Indust. Microbiol. − 1961. − Vol. 2. − P. 47–53. The environmental fate of phthalate esters: A literature review / C.A. Staples [et al] // Chemosphere. − 1997. − Vol. 35, № 4. − P. 667–749. Eaton, R.W. Metabolism of dimethylphthalate by Micrococcus sp. strain 12B / R.W. Eaton, D.W. Ribbons // J. Bacteriol. − 1982. − Vol. 151, № 1. − P. 465–467. Eaton, R.W. Utilization of phthalate esters by micrococci / R.W. Eaton, D.W. Ribbons // Arch. Microbiol. − 1982. − Vol. 132, № 2. − P. 185–188. Degradation of 3-hydroxybenzoic acid dy a Bacillus species / S.B. Mashetty [et al] // Indian J. Biochem. Biophys. − 1996. − Vol. 33. − P. 145–148. The utilization of the plasticizer dimethyl phthalate by an isolated strain of Enterobacter aerogenes / J.A. Perez [et al] // Bull. Environ. Contam. Toxicol. − 1977. − Vol. 18, № 1. − P. 104–107. Isolation of microorganisms growing on phthalate esters and degradation of phthalate esters by Pseudomonas acidovoraus 256-1 / R. Kurane [et al] // Agric. Biol. Chem. − 1977. − Vol. 41, № 11. − P. 2119–2123. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.В. Ившина [и др.] // Микробиология. − 1995. − Т. 64, № 4. − С. 507–513. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis 29Ф – деструктор пластификаторов – диметилфталата, дибутилфталата, ди(2-этилгексил)фталата: а.с. 1800799 СССР, МКИ5 С 02 F 3/34, C 12 N 1/20 / А.С. Самсонова, З.М. Алещенкова, Н.Ф. Семочкина; Институт микробиологии АН БССР – № 4882461; заявл. 15.11.90, опубл. 09.10.92 Алещенкова, З.М. Утилизация фталевых эфиров родококками / З.М. Алещенкова // Докл. НАН Беларуси. − 1998. − Т. 42, № 3. − С. 87–90. Интенсификация разрушения диметилфталата в почве / Байкова С.В. [и др.] // Почвоведение. − 1999. − № 6. − С. 774–779. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis, используемый для очистки сточных вод от диметилфталата: а.с. 1639055 СССР, МКИ5 С12 N 1/20, C 12 S 13/00 / А.С. Самсонова, З.М. Слизень, Н.Ф. Семочкина, А.И. Шалашная; Институт микробиологии АН БССР – № 4753209; заявл. 27.10.89; опубл. 01.12.90. Волкова, К.В. Деструкция диметилфталата Pseudomonas putida MK55 / К.В. Волкова // Биотехнология – состояние и перспективы развития: материалы 1-го Междунар. конгресса, Москва, 14–18 октября 2002 г. / Москва, 2002. – С. 281–282. Волкова, К.В. Разрушение ДМФ в воде штаммом Pseudomonas putida MK55 / К.В. Волкова // Ломоносов: сб. тезисов XIII Межд. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых, Москва, МГУ им. М.В, Ломоносова 12–15 апреля 2006 г. – Москва, 2006. – Т.IV. – С.29. Mathur, S.P. Respirometric evidence of the utilisation of di-octyl and di-2ethylhexylphthalate plasticizers / S.P. Mathur // J. Environ, Qual. − 1974. − Vol. 3, № 3. − P. 207–209. Phthalate esters detected in various water samples and biodegradation of the phthalates by microbes isolated from river water / K. Hashizume [et al] // Biol. Pharm. Bull. − 2002. − Vol. 25, № 2. − P. 209–214. 339 117 Karegoudar, T.B. Biodegradation of phthalates and phthalate esters / T.B. Karegoudar, B.G. Pujar // Proc. Indian. Acad. Sci. Chem. Sci. − 1984. − Vol. 93, № 7. − P. 1155–1158. 118 Способ очистки сточных вод, содержащих диметилфталат, дибутилфталат, ди-(2-этилгексил)фталат: пат. 3187 Респ. Беларусь, МКИ6 С 02 F 3/30, C02 F 3/34 / Самсонова А.С., Алещенкова З.М., Семочкина Н.Ф., Щербаков В.С., Бухина Э.В., Крошкин В.М.; заявитель Институт микробиологии НАН Беларуси – № 970053; заявл. 06.02.97, опубл. 30.12.99. 119 Первушин, Ю.В. эффективность систем биоочистки с закрепленными микроорганизмами / Ю.В. Первушин, О.Г. Бобров // Пластические массы. − 1990. − № 11. − С. 81–85. 120 Семочкина, Н.Ф. Адгезия микроорганизмов-деструкторов эфиров о-фталевой кислоты на капроновом носителе / Н.Ф. Семочкина // Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия: материалы Междунар. конф., Минск, 1−2 июня 2000 г. / Ин-т микробиологии НАНБ. − Минск, 2000. − С. 92–94. 121 Takehiko, О. Bioreactor for waste water treatment using immobilized microorganisms / О. Takehiko, Н. Akira // Takenaka Techn. Res. Rept. - 1991. – Vol. 45, № 1. – P. 17–26. 122 Comparison of di-n-methyl phthalate biodegradation by free and immobilized microbial cells / J.L. Wang [et al] // Biomed. Environ. Sci. − 2003. − Vol. 16, № 2. − P. 126–132. 123 Niazi, J.H. Degradation of dimethylphthalate by cells of Bacillus sp. immobilized in calcium alginate and polyurethane foam / J.H. Niazi, T.B. Karegoudar // J. Environ. Sci. Health. Part A Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. − 2001. − Vol. 36, № 6. − P. 1135–1144. 124 Dimethyl phthalate ester degradation by two planktonic and immobilized bacterial consortia / Y. Wang [et al] // Int. Biodeter. Biodegrad. − 2004. − Vol. 53, № 2. − P. 93–101. 125 Волкова К.В. Влияние иммобилизации микроорганизмов на эффективность деструкции диметилфталата / К.В. Волкова // Сб. трудов молодых ученых НАН Беларуси: Т.2. Отделение биол. наук. − Минск: ИООО «Право и экономика», 2003. − С. 241−244. DIMETHYL ESTER OF PHTHALIC ACID: PROPERTIES, APPLICATION, BIOACCESSIBILITY VOLKOVA K.V., SAMSONOVA A.S. Laboratory of xenobiotic degradation and bioremediation of natural and industrial media The role of dimethyl ester of ortho-phthalic acid (DMP) in pollution of biosphere is discussed. The data on chemical properties of this compound, its industrial applications, migration routes into environmental objects are provided. Latest finding on toxic effect of DMP on huvans and animals are presented. DMP degradation in natural biogeocenoses resulting from interaction of biological and physucal-chemical factors is described. The part of heterotrophic microorganisms in DMP biodecomposition is emphasized. 340 УДК 579.222.2 МИКРООРГАНИЗМЫ-ДЕСТРУКТОРЫ ХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ Глушень Е.М., Самсонова А.С., Сёмочкина Н.Ф., Петрова Г.М. лаборатория деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Проведен скрининг штаммов среди музейных культур, способных к росту на изомерных моно-, ди- и трихлорфенолах, использующих органические ароматические соединения. Выделение микроорганизмов-деструкторов хлорированных фенолов проводили методом накопительных культур с использованием почв, загрязненных ароматическими веществами и активного ила очистных сооружений предприятий органического синтеза. Изучена деструктивная активность микроорганизмов, активно растущих на хлорированных фенолах. Наиболее активно разрушают хлорфенолы бактерии рода Rhodococcus. Штаммы Rhodococcus opacus 31Д и Rhodococcus erythropolis 5Д деградировали 100 и 200 мг/л монохлорфенолов на 100% за 24−72 часа. Трансформационная активность Rhodococcus opacus 31Д и Rhodococcus erythropolis 70Ф − деструкторов 2,3- и 3,4-дихлорфенолов, выраженная в процентах разрушения токсикантов, составила за 240 часов 85 и 91% соответственно. Наибольшую активность в отношении трихлорфенола проявила культура Rhodococcus ruber 1В, которая разрушала 50 мг/л токсиканта на 62% за 144 часа. Введение Проблема очистки окружающей среды от устойчивых поллютантов не теряет своей остроты и заслуживает постоянного пристального внимания. Особую тревогу вызывает накопление в объектах окружающей среды остатков различных хлорароматических соединений и, в первую очередь, хлорфенолов, способных образовывать полихлорированные структуры с канцерогенными свойствами. Опасность таких органических загрязнителей усугубляется высокой персистентностью их к фотолитическому, химическому и биологическому разложению. Медленная деструкция хлорированных фенолов в окружающей среде почвенной микрофлорой обусловлена их высокой токсичностью. Частичная трансформация хлорфенолов в почве может приводить к образованию еще более опасных и устойчивых метаболитов [1, 2]. Природные штаммы микроорганизмов-деструкторов, способные разрушать практически любые ксенобиотики, привлекают все большее внимание исследователей в связи с возможностью применения их в биологических очистных технологиях. Согласно оценкам экспертов такие технологии значительно экономичнее традиционных физико-химических. Для создания биотехнологий 341 микробной очистки важным является получение и использование микроорганизмов, полностью утилизирующих токсичные вещества и способных расти при высоких концентрациях ксенобиотиков [3, 4]. Скорость и эффективность процессов деструкции ксенобиотиков при использовании микробных технологий в значительной степени определяются свойствами микроорганизмов, которые используют токсиканты в качестве единственного источника углерода и энергии или трансформировуют их в условиях кометаболизма. Среди известных путей получения бактерий-деструкторов галогенароматических соединений наиболее часто примененим способ накопительной культуры и генноинженерные методы. Большинство известных в настоящее время бактерийдеструкторов хлорфенолов выделено методом накопительных культур из окультуренных почв, сточных вод и активного ила. Материалы и методы исследований. Объектами исследований явились: - хлорированные фенолы: 2-хлорфенол (2-ХФ); 3-хлорфенол (3-ХФ); 4-хлорфенол (4-ХФ); 2,3-дихлорфенол (2,3-ДХФ); 3,4- дихлорфенол (3,4-ДХФ); 2,4,5-трихлорфенол (2,4,5-ТХФ); - музейные штаммы микроорганизмов, использующие органические ароматические соединения; - микроорганизмы-деструкторы хлорфенолов, выделенные в процессе исследований. Выделение микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, проводили методом накопительных культур. В качестве источников выделения использовали: 1) почву, длительное время подвергавшуюся загрязнению ароматическими соединениями в естественных условиях; 2) почву, загрязненную хлорфенолами в модельных условиях; 3) активный ил очистных сооружений г. Могилева. Для выделения и культивирования бактерий-деструкторов хлорфенолов использовали мясо-пептонный агар (МПА), мясосусловый агар (МСА), а также жидкую и агаризованную минеральную среду Е-8. Хлорфенолы вносили в среду в качестве единственного источника углерода после стерилизации в концентрации 40–200 мг/л. Для изучения трансформационной активности микроорганизмов-деструкторов моно-, ди- и трихлорфенолов культуры выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жид- 342 кой минеральной среды в условиях интенсивной аэрации на качалке, обеспечивающей 180 об./мин., при 29 0С. Количественный анализ монохлорфенолов проводили на газовом хроматографе «Хром-5» с использованием пламенноионизационного детектора (ПИД). Хлорфенолы из культуральной жидкости экстрагировали диэтиловым эфиром. К 50 мл культуральной жидкости, помещенной в колбу с притертой пробкой, добавляли 10 мл экстрагента и помещали в лабораторный встряхиватель КДМ-1 на 10 минут. Смесь разделяли в делительной воронке, слой экстрагента собирали в сухую колбу с притертой пробкой. Экстракцию проводили дважды, фракции экстрагентов объединяли и упаривали с помощью роторного испарителя РВО-64 до объема 1 мл. Условия хроматографирования: газохроматографическая колонка из нержавеющей стали длиной 120 см, наполненная Хроматон N−super (0,125−0,160 мм)+ 5% OV−17. Для определения 2-ХФ: Ттермостата − 175 0С, Тдетектора − 200 0С, Тиспарителя − 225 0С; скорость водорода − 30 мл/мин, скорость гелия − 30 мл/мин, скорость воздуха − 300 мл/мин. Для определения 3-ХФ и 4-ХФ: Ттермостата − 215 0С, Тдетектора − 250 0С, Тиспарителя − 275 0С; скорость водорода − 30 мл/мин, скорость гелия − 30 мл/мин, скорость воздуха − 300 мл/мин. Качественный и количественный анализ ди- и трихлорфенолов проводили методом газожидкостной хроматографии совместно с сотрудниками кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ на газовом хроматографе Hewlett Packard (ПИД и ДЭЗ). Определение осуществляли в надосадочной жидкости, полученной центрифугированием культуральной жидкости (КЖ) исследуемых микроорганизмов в течение 15 мин при 5 тыс. об./мин. При применении пламенно-ионизационного детектора (ПИД) использовали капиллярную колонку НР-INNOWAX длиной 30 метров, внутренним диаметром 0,32 мм, с нанесенной неподвижной фазой из полиэтиленгликоля толщиной 0,5 мкм. При работе с детектором по электронному захвату (ДЭЗ) пользовались капиллярной колонкой НР-5 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, с нанесенной неподвижной фазой из 5% бифенила и 95% диметилполисилоксана толщиной 0,25 мкм. Анализ образцов проводили в режиме программирования 0 температуры от 100 до 200 С с целью определения как летучих интермедиатов биотрансформации, так и высококипящих соединений. Условия хроматографирования: температура испарителя – 275 0С; температура детектора – 300 0С; начальная температура 343 в термостате в течение 5 минут − 100 0С; нагрев до 200 0С осуществляли со скоростью 10 0С в минуту; изотермического режима достигали в течение 20 минут; расход газа-носителя при 100 0С − 0,78 мл/мин, а коэффициент деления потока – 1:10; объем вводимой пробы – 0,8 мкл. Результаты и их обсуждение. Скрининг микроорганизмов, способных к росту на изомерных моно-, ди- и трихлорфенолах, провели среди штаммов музейных культур микроорганизмов, использующих органические ароматические соединения, относящихся к пяти таксономическим группам. Исследования показали, что большинство из проверенных штаммов хорошо растут на агаризованной среде с монохлорфеналами в качестве единственного источника углерода в концентрации 100 мг/л. Рост на среде со 100 мг/л 2-хлорфенола зарегистрирован у 30 исследованных штаммов, на среде с 3-ХФ – у 12 и у 24 культур на среде с 4-ХФ. Увеличение концентрации монохлорфенолов до 200 мг/л приводило к снижению активности роста музейных штаммов. Наиболее обильный рост на агаризованной среде, содержащей 2-ХФ в концентрации 150 мг/л, выявлен у 5 культур: Pseudomonas fluorescens 12B, Pseudomonas fluorescens 106B, Bacillus coagulans 1710, Rhodococcus ruber 88Ф и Rhodococcus luteus П, и у 3-х штаммов при 200 мг/л: Pseudomonas fluorescens 106B, Bacillus coagulans 1710 и Rhodococcus luteus П. Активно использовали 3-хлорфенол как в концентрации 150, так и 200 мг/л культуры Rhodococcus erythropolis 3B, Rhodococcus erythropolis 5 Д, Bacillus coagulans 1710, Bacillus sp. 97B (таблица 1). Способность к росту на среде с 2,3-дихлорфенолом в концентрации 100 мг/л выявлена у 6 штаммов: Rhodococcus erythropolis 1Д, 5Д, 31Д, 70Ф, Bacillus coagulans 1710 и Bacillus sp. 97В. При увеличении концентрации в среде до 200 мг/л хорошо росли в присутствии дихлорфенолов 3 штамма: Rhodococcus erythropolis 1Д, Bacillus coagulans 1710 и Bacillus sp. 97В. Активный рост на среде, содержащей 100 мг/л 3,4дихлорфенола, отмечен у 4 штаммов: Rhodococcus erythropolis 31Д, 70Ф, Bacillus coagulans 1710 и Bacillus sp. 97В. При концентрации в среде 200 мг/л 3,4-ДХФ активный рост проявили 2 культуры —Bacillus coagulans 1710, Bacillus sp. 97. Наиболее труднодоступным в качестве источника питания и роста для музейных штаммов оказался 2,4,5-трихлорфенол. На среде с 40 мг/л ТХФ среди 5 исследованных штаммов: Rhodococcus ruber 1B, 2B, Rhodococcus erythropolis 10Ф, 31Д и Rhodococcus luteus П наиболее активно росла культура Pseudomonas fluorescens 106 B. 344 Таблица 1 – Способность музейных культур к росту на хлорфенолах Тестируемый микроорганизм 1 R.ruber 1В R.ruber 2В R.erythropolis 3В R. luteus 4B Ps. fluorescens 12B R.erythropolis 100B Ps.fluorescens 106B R.erythropolis 1Д R.erythropolis 5Д R.erythropolis 7Д R.erythropolis 14Д R.erythropolis 29Д R.erythropolis 31Д R.opacus 7Ф R.ruber 9Ф R.opacus 14Ф R.erythropolis 10Ф R.erythropolis 23Ф R.erythropolis 29Ф R.erythropolis 37Ф R.erythropolis40Ф R.erythropolis 41Ф R.erythropolis 43Ф R.ruber 50Ф R.ruber 58Ф Ent. сloacae 64Ф R.erythropolis 70Ф R.ruber 88Ф R.maris 100Ф B. coagulans 1710 Methylobacterium sp. 2209 B. cereus 2006 R.maris П R. rhodochrous П R. luteus П R.opacus П B. cereus 91Т 96Т В. sp. 97B Хлорфенол, мг/л 2-ХФ, 100 3-ХФ, 100 4-ХФ, 100 2 +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ + 3 + + +++ − + +++ ++ +++ +++ + ++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ + +++ + ++ + ++ + + ++ + + + +++ + ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ + ++ + ++ + + +++ +++ 345 4 +++ +++ + + +++ +++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ + ++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ + 2,3ДХФ, 100 5 ++ ++ ++ − − ++ +сл. +++ +++ + ++ ++ +++ +сл. ++ ++ + ++ ++ + + + ++ + + ++ +++ + + +++ + 3,4ДХФ, 100 6 ++ ++ + ++ +сл. ++ + + ++ + +++ +сл. ++ ++ + + ++ + +сл. + + + + + +++ + + ++ 2,4,5ТХФ, 40 7 ++ ++ + + + + +++ + + + + − ++ + + + ++ − + + − + + + + + + + + + − ++ + + +++ + ++ +++ +++ + + + + + + ++ +++ + + + + + + + +++ + + + ++ + + − − Этот же штамм сохранял способность к активному росту при увеличении концентрации в среде ТХФ до 60 мг/л. Выделение микроорганизмов-деструкторов хлорированных фенолов проводили методом накопительных культур с использованием почв, загрязненных ароматическими веществами и активного ила очистных сооружений предприятий органического синтеза. Из накопительных культур выделено 23 штамма микроорганизмов, способных утилизировать хлорфенолы в качестве единственного источника углерода, в том числе из накопительной культуры с: 2-ХФ − 5, 3-ХФ − 3, 4-ХФ − 4, 2,3-ДХФ − 3, 2,4,5-ТХФ − 4 штамма. Из почвы, загрязненной хлорфенолами в искусственных условиях, было выделено 17 культур. Из 40 выделенных в чистую культуру микроорганизмовдеструкторов отобрано 9 штаммов, обильно растущих на минеральной среде с 2-ХФ, 6 − с 3-ХФ, 4 − 4-ХФ, 5 − 2,3-ДХФ в концентрации 200 мг/л, и 4 штамма − с 2,4,5-ТХФ в концентрации 60 мг/л. Наиболее активные микроорганизмы-деструкторы монохлофенолов на основании изучения морфологических, физиолого-биохимических свойств и хемотаксономических признаков идентифицированы нами как Rhodococcus opacus, Rhodocoссus erythropolis, Rhodococcus ruber, Pseudomonas fluorescens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, дихлорфенолов − как Bacillus cereus, Bacillus licheniformis и трихлофенола − как Bacillus coagulans. Поиск микроорганизмов-деструкторов хлорфенолов, наиболее полно отвечающих требованиям для разработки микробной технологии очистки воды и почвы от токсикантов провели среди культур, обладающих активным ростом на среде, содержащей их в качестве источника питания (таблицы 1, 2). Культура Pseudomonas fluorescens 106B разрушает 2-ХФ, 3ХФ и 4-ХФ в концентрации 100 мг/л за 48 часов на 17,0; 31,2 и 57,9%, а за 144 часа − на 69,6, 95,9 и 98,4% соответственно. Деструктивная активность микроорганизмов рода Bacillus значительно ниже, чем у представителей рода Pseudomonas. Так, штамм Bacillus coagulans 1710 трансформирует 2-ХФ за 48 часов всего на 3,4%, а за 144 часа на 48,2%; 3-ХФ разрушается этой культурой за 48 часов на 9,9%, а за 144 часа на 65,2%. Всего 11,5 и 69,5% 4-ХФ утилизируется бациллярной культурой за 48 и 144 часа соответственно. Изученные нами представители рода Rhodococcus наиболее активно разрушают монохлорфенолы. 346 Таблица 2 – Способность к росту выделенных культур на изомерных хлорфенолах Тестируемый микроорганизм 1 1ХФ 2ХФ 3ХФ 4ХФ 5ХФ 6ХФ 7ХФ 8ХФ 9ХФ 10ХФ 11ХФ 12ХФ 13ХФ 14ХФ 15ХФ 16ХФ 17ХФ 18ХФ 19ХФ 20ХФ 21ХФ 22ХФ 23ХФ 24ХФ 25ХФ 26ХФ 27ХФ 28ХФ 29ХФ 30ХФ 31ХФ 32ХФ 33ХФ 34ХФ 35ХФ 36ХФ 37ХФ 38ХФ 39ХФ 40ХФ 2-ХФ, 100 3-ХФ, 100 2 ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ + + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ + ++ + + ++ ++ + + ++ + + ++ ++ ++ + ++ + + + ++ + + + 3 ++ + +++ +− ++ ++ +++ ++ + + + +++ ++ +++ +++ +++ ++ + + + ++ ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + +++ Хлорфенол, мг/л 4-ХФ, 2,3100 ДХФ, 100 4 5 ++ + + + ++ + + − + + +++ + +++ ++ ++ + ++ ++ + + ++ + ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ + + ++ + + + + +++ + ++ + + + + + ++ + ++ + ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ + + ++ + + + + ++ + + + + + + ++ +- 347 3,4ДХФ, 100 + + + ++ +++ + ++++ + +++ ++ +++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + ++ ++++- 2,4,5ТХФ, 40 6 ++ ++ ++++ ++ − + ++ + + +++ − + + − ++ ++ + + + + + − + + + ++ +- 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ в концентрации 100 мг/л разрушаются культурой R. ruber 88 за 48 часов на 40,6; 22,97 и 5,9%, и на 95,1; 96,3 и 97,1% за 144 часа соответственно. Полное разрушение 100 мг/л 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ осуществляется за 72, 48 и 24 часа соответственно культурой R. opacus 31Д. Изучение деградации наиболее труднометаболизируемого 2-хлорфенола в концентрации 100 и 200 мг/л исследованными культурами R. ruber 7ХФ, R. erythropolis 3В, Bacillus sp. 96В, B. licheniformis 16ХФ и Pseudomonas fluorescens 106B подтверждает вывод о том, что наиболее высокая деструктивная активность характерна для микроорганизмов-деструкторов рода Rhodococcus. Разрушение изомерных дихлорфенолов в жидкой среде наблюдали при культивировании на них R. erythropolis 70Ф и R. opacus 31Д, наиболее активно растущих в присутствии 2,3- и 3,4-дихлорфенолов на агаризованной среде. Через 72 часа наблюдения эффективность деградации 2,3-ДХФ культурой R. opacus 31Д составляет 37,0, а 3,4-ДХФ − 62,0%. Культура R. opacus 31Д разрушает как 2,3-, так и 3,4-ДХФ в концентрации 100 мг/л за 240 часов на 85,0%. Полное разрушение токсикантов родококком отмечается через 312 часов. Наиболее активно исследованные дихлорфенолы разрушает культура R. erythropolis 70Ф во все сроки наблюдения. Культура деградирует 2,3-ДХФ и 3,4-ДХФ на 91,0% за 240 часов наблюдения, а полное разрушение изомерных дихлорфенолов отмечается через 288 часов. Способность разрушать 2,4,5-ТХФ в жидкой среде наблюдали у культур Bacillus coagulans 1710 и Rhodococcus ruber 1В, наиболее активно растущих в присутствии ТХФ на агаризованной среде. Штамм Bacillus coagulans 1710 трансформировал за 144 часа 20 и 50 мг/л трихлорфенола на 43,2 и 47,3% соответственно. Культура Rhodococcus ruber 1В проявила большую трансформационную активность по сравнению с Bacillus coagulans 1710. ТХФ в концентрации 50 мг/л был разрушен ею на 62% за такой же промежуток времени. Заключение. Из 38 штаммов музейных культур микроорганизмов, использующих органические ароматические соединения, относящиеся к пяти родам, были отобраны 15 культур, способных расти на изомерных моно- и дихлорфенолах в концентрации 200 мг/л, и 1 штамм − на 2,4,5-трихлорфеноле в концентрации 60 мг/л. Из накопительных культур выделены и селекционированы 23 штамма микроорганизмов, способных использовать 100 мг/л моно- и дихлорфенола, и 4 штамма − 60 мг/л трихлорфенола. Из почвы, загрязненной хлорфенолами в модельных условиях в концентрации 100 мг/л, выделено в чистую культуру 348 36 микроорганизмов. Из почвы, загрязненной хлорфенолами в искусственных условиях, было выделено 17 культур. Из 40 выделенных в чистую культуру микроорганизмовдеструкторов были отобраны 9 штаммов, обильно растущих на минеральной среде с 2-ХФ, 6 − с 3-ХФ, 4 − 4-ХФ, 5 − 2,3-ДХФ в концентрации 200 мг/л, и 4 штамма − с 2,4,5-ТХФ в концентрации 60 мг/л и идентифицированных как Rhodococcus opacus, Rhodocoссus erythropolis, Rhodococcus ruber, Pseudomonas fluorescens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans. Наиболее активно разрушают бактерии рода Rhodococcus. Штаммы Rhodococcus opacus 31Д и Rhodococcus erythropolis 5Д деградировали 100 и 200 мг/л монохлорфенолов на 100% за 24−72 часа. Трансформационная активность R. opacus 31Д и R. erythropolis 70Ф − деструкторов 2,3- и 3,4-дихлорфенолов, выраженная в процентах разрушения токсикантов, составила за 240 часов 85 и 91% соответственно. Наибольшую активность в отношении трихлорфенола проявила культура Rhodococcus ruber 1В, которая разрушала 50 мг/л токсиканта на 62% за 144 часа. Список литературы 1 2 3 4 Chlorophenol degradation / D.D. Hale [et al] // Biological degradation and bioremrdiation of toxic chemicals / Ed. G.R. Chaudhry – Dioscorides Press: Portland, Oreg., 1994 – P. 74–91. Biological and chemical interactions of pesticides with soil organic matter / J.M. Bollag [et al] // Science of the Total Environment. – 1992. – Vol. 123. – P. 202–217. Bioreclamation of chlorophenol-contaminated soil by composting / R.Valo [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1986. – № 25. – P. 68– 5. Papiernik, S.K. A review of in situ measurement of organic compound transformation in groundwater / S.K. Papiernik // Pest. Manag. Sci. – 2001. – Vol. 57, № 4. – P. 325–332. MICROORGANISMS-DEGRADERS OF CHLORINATED PHENOLS HLUSHEN E.M., SAMSONOVA A.S., SEMOCHKINA N.F., PETROVA G.M. Laboratory of xenobiotic degradation and bioremediation of natural and industrial media Screening was performed among collection strains utilizing organic aromatic compounds for the ability to grow on isomeric mono-, di- and trichlorophenols. Isolation of microorganisms degrading chlorinated phenols was carried out by enrichment culture technique, using soils contaminated with aromatics and activated sludge from decontamination units of organic synthesis plants. 349 Decomposing ability of microorganisms actively growing on chlorinated phenols was investigated. Bacteria of genus Rhodococcus most rapidly break down chlorophenols. Strains Rhodococcus opacus 31D and Rhodococcus erythropolis 5D degraded 100% monochlorophenols at concentrations 100 and 200 mg/l in 24-72 hours. Transformation activity of Rhodococcus opacus 31D and Rhodococcus erythropolis 70F – degraders of 2,3- and 3,4-dichlorophenols expressed as percentage of pollutant decomposition constituted by 240 hours 85% and 91%, respectively. The maximal activity towards trichlorophenols was displayed by culture Rhodococcus rubber 1B utilizing 62% of the pollutant at concentration 50 mg/l in 144 hours. УДК 579.22.606 СУРФАКТАНТОБРАЗУЮЩАЯ МИКРОФЛОРА: СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Кононова В.В. , Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф. лаборатория деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Проведен анализ литературных данных о микроорганизмах- продуцентах поверхностно-активных веществ (биоПАВ). Рассмотрены стратегии увеличения образования ПАВ микробными клетками. Описаны свойства и функции бисурфактантов, приведена их классификация. Показаны возможности применения биоПАВ в нефтедобывающей, химической, фармацевтической промышленности и очистке окружающей среды от углеводородов нефти. Введение. Нефть и продукты ее переработки стали одним из самых распространенных источников загрязнения почвы, поверхностных и подземных вод. Углеводороды нефти наносят существенный ущерб окружающей среде. В настоящее время используются различные методы удаления нефтепродуктов из объектов окружающей среды: испарение загрязнителя в почве, складирование почвы с последующей самоочисткой, извлечение загрязненного грунта с последующим захоронением или термической обработкой, биологическая очистка. Одной из наиболее щадящих для окружающей среды технологий ликвидации последствий нефтяного загрязнения является биоремедиация. Существует два принципиальных подхода к биодеградации углеводородов в почве и воде: 1) биоаугментация – интродукция специально селекционированных ассоциаций микроорганизмов, разрушающих различные углеводороды; 350 2) биостимуляция – активация аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры с помощью создания оптимальных условий для их роста. Углеводороды в виде высокомолекулярных парафинов, ароматических и полициклических соединений, связываясь с частицами почвы, становятся ограниченно доступными для микроорганизмов, что приводит к снижению скорости их биодеградации. Использование сурфактантов может увеличить десорбцию и растворимость углеводородов нефти и тем самым повысить биодоступность гидрофобных соединений для микробных клеток [1]. Следовательно, присутствие ПАВ способно увеличить скорость и степень биодеструкции углеводородов. Однако, синтетические сурфактанты, традиционно используемые для этих целей, сами являются высокотоксичными и малодеградабельными [2, 3]. Применение синтетических ПАВ приводит к накоплению в почве веществ, не свойственных для окружающей среды. Более экологически безопасно и экономически выгодно использование биосурфактантов, они менее токсичны, лучше деградируются, обладают высоким пенообразованием, селективностью и специфической активностью, устойчивостью к повышенным температурам, рН и солям, а их производство экономично, так как основано на использовании дешевых субстратов [4, 5]. Биосурфактанты, как и ПАВ, полученные путем химического синтеза, могут быть с успехом использованы не только в различных отраслях сельского хозяйства, медицины, промышленности, но и в процессах добычи и переработки нефти, включающих биоремедиацию экосистем от водонерастворимых поллютантов и тяжелых металлов. Одним из потенциальных потребителей биосурфактантов является нефтяная промышленность, которая может использовать микробные препараты как на основе суспензии целых клеток, так и их метаболитов. Их применение возможно в качестве детергентов для очистки емкостей от нефтяных фракций, ускорения и повышения эффективности процесса бурения, увеличения добычи нефти [6–9]. БиоПАВ могут найти применение при мицеллярном заводнении нефтяных коллекторов, при извлечении тяжелых нефтей из битумных песчаников, уменьшения вязкости нефти и облегчения ее транспортировки по нефтепроводам, при очистке танкеров и других емкостей от остатков нефти, для стабилизации и дестабилизации эмульсий, улучшения горючих свойств высокоасфальтеновых нефтей [10, 11]. Показано, что нефтеотдача из подземных песчаников увеличивается до 30% при использовании трегалолипидов Nocardia rhodochrous. Фирма “Multy-biotech”, субсидируемая ”Geodyne Technology”, освоила промышленное производство биосурфак- 351 тантов для повышения нефтеотдачи. Показано, что обработка сырой тяжелой нефти Венесуэлы биосурфактантом эмульсаном снижает её вязкость с 200 000 до 100 сР. Это позволяет перекачивать тяжелую нефть насосами по промышленному трубопроводу на расстояния до 26 000 миль, что невозможно достичь при обработке её химическими сурфактантами. В Кувейте показаны преимущества использования биосурфактанта для перекачки сырой нефти в нефтехранилища. Компанией Petrogen Inc. (США) достигнуто 90%-удаление нефти, включенной в осадок сточных вод, за счёт использования образующих биосурфактант микроорганизмов [12]. Образуемый культурой Acinetobacter calcoaceticus гетерополисахарид эмульсан в концентрации 0,1 г/л способен отмыть до 89% сырой нефти от нефтесодержащего песка [13]. К эффективным биоПАВ, действующим в присутствии высоких концентраций минеральных солей в нефти (до 15%), относится лихенизин – липопротеин, синтезируемый Bacillus licheniformis [14]. Важным направлением использования микроорганизмов, образующих биосурфактанты, является разработка технологий биоремедиации почв, загрязненных углеводородами [6]. Так, рамнолипид Pseudomonas aeruginosa удалял значительные количества разлитой нефти из галечного песка Аляски, загрязненного фирмой Exxon Valdez. Показано также, что этот биосурфактант способен удалять до 25−70% и 40−80% углеводородов из загрязненной супеси и суглинков, соответственно. Кроме того, высокую эффективность биосурфактанты проявляют и в ремедиации почв от тяжелых металлов, включая уран, кадмий и свинец [15], а также от фенантрена и полихлорированного бифенила [16]. Биосурфактанты микроорганизмов. Cурфактанты являются амфипатическими молекулами, имеющими две функциональные части: полярную, с головной гидрофильной группой, и неполярную, с липофильным хвостом. Свойства сурфактанта определяются балансом между его гидрофильным и липофильным компонентами. В растворе молекулы сурфактанта имеют тенденцию к агрегации с образованием мицелл между фазами различной полярности, такими как нефть/вода. Сурфактанты характеризуются по их способности снижать поверхностное и межфазное натяжение, по критической концентрации мицеллообразования (ККМ) и по гидрофильно-липофильному балансу (ГЛБ) [17]. Многие биологические молекулы обладают амфифильными свойствами и способны адсорбироваться на межфазной поверхности вода/воздух или вода/масло. Соединения, обладающие особенно высокой поверхностной активностью, называют биосурфактантами. Физико-химические свойства биосурфактантов, такие как способность снижать поверхностное и межфазное на- 352 тяжение, эмульгирующая активность, тепло- и рН-стабильность, сравнимы с синтетическими [18]. Однако, существует ряд преимуществ применения биологических ПАВ по сравнению с синтетическими. В отличие от синтетических сурфактантов, соединения образованные микроорганизмами, легко деградируются, менее токсичны, что особенно важно при экологическом использовании их для биоремедиации воды и почвы, а также диспергирования нефтяных загрязнений. В производстве биоПАВ возможно использование широкого круга дешевых субстратов, таких, например, как сельскохозяйственные отходы [4]. Благодаря своим физико-химическим свойствам, способности проявлять их в присутствии высоких концентраций солей и не адсорбироваться на известняках и песчаниках, биоэмульгаторы в смеси с другими (например, неионогенными) ПАВ могут быть эффективным средством повышения нефтедобычи [8, 10, 11, 19]. Введение микроорганизмов-продуцентов ПАВ в нефтяное месторождение с последующими размножением их и образованием биоПАВ непосредственно в пластах может существенно влиять на вытеснение нефти. Биогенные ПАВ синтезируются бактериями, дрожжами, микроводорослями и некоторыми мицеллиальными грибами. Наиболее изучены биосурфактанты бактерий Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. brevis, B. polimixa, Acinetobacter calcoaceticus, и дрожжей Torulopsis [9, 20−24]. Впервые образование сурфактантов (рамнолипидов) культурой Pseudomonas aeruginosa было показано Джарвисом и Джонсоном в 1949 году [25]. Межфазные свойства сурфактантов зависят от ионного состава водной фазы. Например, высокая концентрация NaCl инактивирует гликолипиды Torulopsis apicola. С другой стороны, величина межфазного натяжения ферментационной среды при культивировании Bacillus licheneformis JF-2 снижается более, чем на порядок в присутствии 10% NaCl, но не подвергается воздействию солей кальция [26, 27]. Классификация биосурфактантов. В отличие от синтетических сурфактантов, которые классифицируются в зависимости от заряда полярных групп, систематизация биосурфактантов основана на их химической структуре и микробном происхождении [4]. Биосурфактанты условно могут быть разделены на две группы. К первой группе относятся ПАВ с низким молекулярным весом, такие как гликолипиды (рамнолипиды, трегалозолипиды, софоролипиды, трегалозотетраэфиры, дикогиномиколат), липопептиды (сурфактин, вискозин, стрепофактин, полимиксин, грамицидин), которые обладают также эффективным противомикробным 353 действием. Гликолипиды и липопептиды способны снижать поверхностное и межфазное натяжение жидкостей, но, как правило, не образуют стабильных эмульсий. Вторую группу составляют полимерные ПАВ большого молекулярного веса, представленные полисахаридами, липопротеинами, липополисахаридами и их комплексами. Эти сурфактанты образуют стабильные эмульсии, однако не снижают поверхностное натяжение. Образование стабильной эмульсии позволяет микроорганизмамсурфактантобразователям закрепиться на гидрофобной поверхности и активно деградировать субстрат [28, 29]. Биосурфактанты имеют гидрофильную часть, состоящую из аминокислотных или пептидных анионов или катионов; моно-, диили полисахаридов и гидрофобную, состоящую из ненасыщенных или насыщенных жирных кислот. Поэтому, в соответствии с химической природой, биосурфактанты разделяют на следующие группы [30]: 1) гликолипиды (рамнолипиды – Pseudomonas aeruginosa, P. sp; трегалозолипиды – Rhodococcus erythropolis, Nocardia rhodochrous, N. erythropolis, Мycobacterium phlei; cофорозолипиды – Torulopsis bombicola, T. ampicola, T. petrophilum); 2) липопротеины и липопептиды (лихенизин – Bacillus licheniformis; сурфактин – B. subtilis; субтилизин – B. subtilis, циркулоцины – B. circularis; полимиксины – B. polimixa; вискозин – Pseudomonas fluorescens; эмульсан – Phormidium sp.; липозан – Candida lypolytic); грамицидин – B. brevis); 3) полисахариды (эмульсаны – Arthrobacter sp., A. calcoaceticus; Phormidium sp.; ксантан – Xanthomonas campestris); 4) жирные кислоты – Candida sp., C. lepus; 5) фосфолипиды – Tiobacillus thiooxidans; Corynebacterium sp.; Candida sp.); 6) нейтральные липиды − N. Erythropolis. Наиболее изученными биоПАВ являются гликолипиды, которые содержат углеводные участки, соединенные с длинноцепочечными алифатическими или гидроксиалифатическими кислотами. Среди гликолипидов наиболее исследованы рамнолипиды, трегалолипиды и софоролипиды (рисунок 1). Рамнолипиды, продуцируемые Pseudomonas sp., способны снижать межфазное натяжение против н-гексадекана до 1 мН/м и поверхностное натяжение до 25–30 мН/м [23]. Установлено, что трегалолипиды, продуцируемые бактериями Mycobacterium, Nocardia и Corynebacterium, отличаются по размеру и структуре миколовой кислоты, количеству атомов углерода и степени насыщения [31–34]. Детально исследован трегалозодимиколат, синтезируемый Rhodococcus erythropolis [35, 36]. Трегалолипиды, проду- 354 цируемые R. еrythropolis и Arthrobacter sp., снижают поверхностное и межфазное натяжение культуральной жидкости до 25−40 и 1–5 мН/м соответственно [31, 36, 37]. Софоролипиды, которые образуются главным образом дрожжами Torulopsis bombicola [38– 40], T. рetrophilum [41] и T. apicola [42], состоят из димерного углевода софорозы, соединенного с длинноцепочечной гидроксижирной кислотой. Рамнолипид Трегалозолипид Софоролипид Рисунок 1 – Структура гликолипидных биосурфактантов (А) Рамнолипид типа 1 из Pseudomonas aeruginosa, (B) Трегалозодимиколат из Rhodococcus erythropolis, (C) Софоролипид из Torulopsis bombicola Циклический липопептид сурфактин, продуцируемый Bacillus subtilis АТТСС 21332, является одним из наиболее активных биосурфактантов (рисунок 2), который снижает поверхностное натяжение с 72 до 27,9 мН/м при концентрации 0,005% [43]. Рисунок 2 – Структура сурфактина, продуцируемого Bacillus subtilis 355 Детально изучены такие полимерные биосурфактанты, как эмульсан (рисунок 3), продуцируемый Acinetobacter calcoaceticus [44], и липозан, образуемый Candida lipolytica [45, 46]. Использование эмульсана в концентрации 0,001-0,01% очень эффективно в качестве эмульгирующего агента для получения прямых эмульсий. Эмульсан – один из активных стабилизаторов эмульсий, при использовании этого биоПАВ даже в соотношении вода/масло, равном 1/4, не происходит инверсия фаз. Липозан − водорастворимый эмульгатор, состоящий из 83% углеводов и 17% протеина [45]. Углеводная фракция содержит глюкозу, галактозу, галактозамин и галактуроновую кислоту [47−49]. Рисунок 3 – Структура эмульсана, продуцируемого Acinetobacter calcoaceticum Физиологическая роль биоПАВ. Биосурфактанты, продуцируемые различными микроорганизмами, секретируются либо внеклеточно, либо в виде клеточно-связанных соединений [27, 50]. Функции биосурфактантов в клетках микроорганизмовпродуцентов мало изучены. Известно, что биоПАВ являются вторичными метаболитами, принимают участие в эмульгировании водонерастворимых субстратов и облегчают транспорт питательных веществ через мембраны. Например, биосурфактанты, образованные Serratia marcescens, регулируют гидрофобность клеточной поверхности, которая является важным фактором для клеточной адгезии и колонизации различных межфазных поверхностей [51]. Основная функция трегалозолипида трегалоздимиколата (ТДМ) состоит в формировании липофильной клеточной стенки, что приводит к уменьшению межфазного натяжения на 356 границе раздела фаз вода/алкан и увеличению площади поверхности нерастворимого субстрата. Это повышает биодоступность и, впоследствии, биодеградируемость алкана. Миколовые кислоты формируют основу наружного липидного барьера непроницаемости, дополненного нековалентно связанными миколатами трегалозы. Таким образом, избыточное количество миколатов трегалозы необходимо для придания клеткам большей гидрофобности, что облегчает прикрепление и последующий пассивный транспорт водонерастворимых субстратов в клетку [53]. Установлено, что биоПАВ участвуют в образовании биопленок и адгезии клеток к различным поверхностям. Некоторые штаммы Streptococcus thermophilus, при росте на глюкозе в качестве единственного источника углерода, образуют биоПАВ, осуществляющие роль антиадгезивов [53]. БиоПАВ выступают в качестве биоцидов по отношению к другим микроорганизмам [54, 55]. Некоторые биосурфактанты, такие как рамнолипиды, образуемые P. aeruginosa [56], и сурфактин, продуцируемый B. subtilis [57], функционируют как антибиотики, растворяя большинство компонентов клеточных мембран. Выделение антибиотиков в культуральную среду помогает микроорганизмам выживать в изменяющемся природном окружении. Фосфолипиды играют важную роль в мембранных вставках белков и могут быть ответственны за промежуточную мембранную вставку белкового токсина [58]. Факторы, влияющие на продукцию биоПАВ. Количество и тип сурфактантов зависит, главным образом, от штаммапродуцента. Однако условия культивирования, такие как источник углерода, азота, микроэлементы, температура, рН, аэрация, также значительно воздействуют на продукцию биоПАВ. При использовании для роста неполярных субстратов в качестве единственного источника углерода микроорганизмы для обеспечения себя питанием выделяют в среду сурфактанты. Например, бактерии рода Rhodococcus синтезируют биосурфактанты в ответ на присутствие в среде n–алканов [59, 60]. Физиологическая роль биосурфактантов при росте родококков на углеводородах состоит в солюбилизации гидрофобных субстратов в клетках. Некоторые углеводородокисляющие микроорганизмы образуют пониженное количество биосурфактантов при росте на водорастворимых субстратах, где эмульгирование углеродного субстрата не требуется [61]. Так при росте на минимальной среде с гексадеканом в клетках штамма R. ruber Ас-75 происходит увеличение синтеза трегалозомонокориномиколата (ТММ) по сравнению с синтезом на среде, не содержащей гидрофобный субстрат. Мутант штамма R. ruber Ас-75, названный R. ruber RМ 13, проду- 357 цирует меньшее количество этого липида. Анализ метиловых эфиров жирных кислот клеточных липидов обоих штаммов показал их одинаковый состав, однако, жирные кислоты мутантного штамма имеют меньшую среднюю длину, в 1,4 раза большую степень насыщенности и в 2 раза меньшую степень разветвления ацильных цепей. Исследования двух штаммов R. ruber АС 75 и КМ 13 показали отставание роста в начальной экспоненциальной фазе мутантного штамма на гидрофобном субстрате, которое, вероятно, обусловлено недостаточным синтезом ТММ, несвоевременным модулированием гидрофобности клеточной поверхности [52]. Аналогичным образом поверхностное натяжение супернатанта культуральной жидкости, полученной при выращивании R. erythropolis AP-25 на гексадекане, составляет 30,3 мН/м, а на глюкозе – около 50 мН/м. В составе биосурфактанта, синтезируемого этими бактериями при росте на глюкозе, отсутствует трегалозомонокориномиколат, а спектр липидов значительно беднее, чем при росте культуры на среде с гексадеканом [62]. При использовании водорастворимых источников углерода, таких как глицерин, глюкоза, маннит и этанол, для образования рамнолипидов продукция биосурфактантов культурой Pseudomonas sp. ниже, чем при росте на водонерастворимых субстратах, таких как н-алканы и оливковое масло [63−65]. Некоторые мутантные штаммы микроорганизмов, напротив, образуют повышенное количество сурфактантов на водорастворимых субстратах. Так, при росте на среде, содержащей глюкозу, мутантный штамм P. aeruginosa, не способный расти на гексадекане, продуцирует в два раза больше рамнолипидов, чем штамм дикого типа [66−67]. Бактерии B. subtilis образуют биосурфактант только при росте на водорастворимых субстратах [68]. Рядом исследователей [64, 69−70] обнаружено, что различные источники углерода в среде оказывают неоднозначное влияние на состав биосурфактантов, продуцируемых Pseudomonas sp. Выявлена качественная зависимость между числом атомов углерода в алканах, используемых в качестве источника углерода, и структурой биоПАВ, синтезируемых клетками Acinobacter sp. H13A и H01-N [71−72]. Corynebacterium lepus, при росте на глюкозе синтезируют большое количество клеточно-связанного биосурфактанта [73]. Добавление гексадекана облегчает выделение биоПАВ в среду. Установлено, что при выращивании некоторых микроорганизмов на водорастворимом источнике углерода наблюдается незначительное образование биосурфактанта, а добавление в среду гидрофобного субстрата приводит к резкому увеличению синтеза биоПАВ [74–75]. Так при культивировании Arthrobacter paraffineus 358 ATCC 19558 на Д-глюкозе добавление гексадекана в среду в течение стационарной фазы приводит к значительному увеличению выхода биоПАВ [76]. Добавление растительного масла в среду, содержащую 10% глюкозы в процессе роста T. bombicola стимулирует образование гликолипидов до уровня 80 г/л [77–78]. Добавление этилового эфира жирных кислот рапсового масла в среду с Д-глюкозой при культивировании Candida bombicola CBS 6009 увеличивает выход софоролипидов [79]. Стувер с соавторами [80] получили выход гликолипидов на уровне 90 г/л при использовании среды, содержащей Д-глюкозу и подсолнечное масло для культивирования Torulopsis apicola MET 43747. При периодическом культивировании Torulopsis bomicola 37% внесенного источника углерода израсходовано клетками для синтеза 80 г/л софоролипидов, а при культивировании клеток в режиме с подпиткой более 60% внесенного субстрата послужило источником образования биосурфактанта, при этом выход продукта увеличился до 120 г/л [81]. Таким образом, режим внесения источника углерода оказывает существенное влияние на продукцию биоПАВ [82–84]. На образование биосурфактантов кроме источника углерода оказывает влияние и минеральный состав среды. Например, для продукции биоПАВ культурой Arthrobacter paraffineus предпочтительны соли аммония и мочевины в качестве источника азота. Синтез биосурфактантов этими бактериями увеличивается при добавлении в среду L-аминокислот: аспарагиновой и глутаминовой, а также аспарагина и глицина [85]. При добавлении Lглутаминовой аминокислоты и L-аспарагина в среду культивирования B. licheniformis BAS 50 продукция лихенизина А увеличивается в 2 и 4 раза соответственно [86]. На структуру сурфактантов влияет также и обогащение среды L-аминокислотами [87]. Установлено, что нитрат является лучшим источником азота для образования биосурфактантов культурами Pseudomonas sp. и Rhodococcus sp. при росте на оливковом масле и парафине соответственно [63, 88]. Продукция биоПАВ начинается после 30 ч роста, когда культура достигает лимита по азоту, и продолжает возрастать даже после 58 ч ферментации. При достижении лимитирования по азоту рост культуры P. aeruginosa замедляется и одновременно увеличивается образование рамнолипидов и активности глутамин синтетазы [89–90]. Сходным образом лимитирование по азоту вызывает увеличение продукции биосурфактантов клетками Сandida tropicalis [91] и Nocardia sp. [92]. Установлено, что лимитирование по азоту вызывает не только сверхсинтез микробных ПАВ, но также изменения в составе сурфактантов [69]. Максимальное образование рамнолипидов P. aeruginosa наблю- 359 дается при лимитировании по азоту на уровне соотношения С:N от 16:1 до 18:1. Образование сурфактанта не наблюдается при соотношении С:N ниже чем 11:1, когда культура не лимитирована по азоту [93, 22]. Условия роста микроорганизмов, такие как рН, температура, перемешивание и доступность кислорода, также влияют на образование биосурфактантов. На продукцию софоролипидов, образованных T. bambicola, рН среды играет важную роль [94]. Синтез культурой рамнолипидов был максимален при рН в диапазоне 6–6,5 и резко снижался при рН выше 7 [19]. С другой стороны, на продукцию пента- и дисахаридных липидов культурой Nocardia corynebacteroides не влияет рН в пределах от 6,5 до 8 [95]. При этом поверхностное натяжение и ККМ биосурфактантного продукта остаются стабильными в широком диапазоне рН, в то время как эмульгирование осуществляется в узком диапазоне рН [87, 96]. Изменение температуры приводит к изменению состава биосурфактантов, образуемых A. paraffinneus и Pseudomonas sp. [64, 97]. Заключение. Приведенные в обзоре результаты исследований свидетельствуют о многообразии проявления сурфактантной активности микроорганизмами. Наиболее перспективными областями возможного применения биосурфактантов в качестве биопротекторов и биостимуляторов, эмульгирующих и гидрофобирующих агентов являются биотехнологии, а так же препараты для биоремедиации природных и производственных сред. Список литературы 1 2 3 4 5 6 Oleophilic biofertilizer based on a Rhodococcus surfactant complex for the bioremediation of crude oil-contaminated soil / I.B. Ivshina [et al] // Sediment and Water. – 2001. – Vol. 1. – P. 20–24. Toxicity testing with marine microorganisms and comparison with syntheticfactants / K.Poremba [et al] // Marine biosurfactants III. Zeitschrift für Naturforschung. – 1991. – Vol. 46. – P. 210–216. Studies on environmental compatibility Influence of (bio)surfactants on marine microbial and enzymatic systems / B.Munstermann [et al] // Soil Decontamination Using Biological Processes: mat. of the Int. Symposium, Karlsruhe, Germany, 6–9 December, 1992 / Dechema: Frankfurt, Germany, 1992. – P. 414–420. Christofi, N. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation / N. Christofi, I.B. Ivshina // Journal of Applied Microbiology. – 2002. – Vol. 93. – P. 915–929. Velikonja, J. Biosurfactant in food applications / J. Velikonja // Biosurfactant production, properties, applications / ed. by N. Kosaric. – Marcel Dekker, 1993. – P. 419–446. Banat, I.M. Biosurfactant production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review / I.M. Banat // Bioresource Technol. – 1995. – Vol. 51. – P. 1–12. 360 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Emulsifying and surface active agent from Corynebacterium hidrocarboclastus / J.E. Zajic [et al] // Biotech. Bioeng. – 1977. – Vol. 19. – P. 1285–1301. Микробиологические методы повышения нефтеотдачи пластов / Е.П. Розанова [и др.] – М.: ВНИИОЭГ, 1987. – С. 3. Ганиткевич, Я.В. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения. Я.В. Ганиткевич // Биотехнология. – 1988. – Т. 4, № 5. – С. 575–583. Нефтеотмывающий биоэмульгатор, образуемый Bacillus sp. / С.А Елисеев [и др.] // Микробиологический журнал. – 1991. – Т. 53, № 6. – С. 56–59. Образование нефтевытесняющих соединений микроорганизмами из нефтяного месторождения Дацин (КНР) / Т.Н. Назина [и др.] // Микробиология. – 2003. – Т. 72. – № 2. – С. 206–211. Benerjee, S. Biosurfactant for desludging crude/fuel oil storage tank / S. Benerjee // Chem. Ind. Dig. – 1998. – Vol. 4. – P. 75–78. Gutnik, D. Perspectives on microbial surfactants / D. Gutnik, W. Minas // Biochem. Soc. Transakt. – 1987. – Vol. 15, № 6. – P. 19–35. Biosurfactant and enhanced oil recovery: pat. 4.522.261 USA, C09K 8/60; C09K 8/901; E21B 043/22 / M. I. Mc. Inerney, E.E. Jenneman, R.M. Knapp, M.E. Menzie; assignee The Board of Regents for the University of Oklahoma. – № 06/482,308; filed 05.04.83; publ. 11.06.85. Miller, R.M. Biosurfactant – facilitaded remediation of metal contaminated spils / R.M. Miller // Environ. Health Perspect. – 1995. – Vol. 103. – P. 59–62. Evaluation of microbial surfactants for recovery of hydrophobic pollutants from soil. M.I. Van Dyke [et al] // J. Jnd. Microbiol. – 1993. – Vol. 11. P. 163–170. Cooper, D.G. Surface active compounds from microorganisms / D.G. Cooper, J.E. Zajic // Adv. Appl.Microbiol. – 1980. – Vol. 26. – P. 229–253. Lin, S.-C. Biosurfactants: recent advances / S.-C. Lin // J. Chem. Technol. – 1996. – Vol. 66. – P. 109–120. Микробиологические процессы в призабойной зоне нагнетательных скважин нефтяных месторождений / С.С. Беляев [и др.] // Микробиология. – 1982. – Т. 51, № 6 – С. 997. Lin, S.-C. Biosurfactants: recent advances / S.-C. Lin // J. Chem. Technol. – 1996. – Vol. 66. – P. 109–120. Ron, E.Z. Natural role of biosurfactants / E.Z. Ron., E. Rozenberg // Environ. Microbiol. – 2001. – Vol. 3. – P. 229–236. Guerra-Santos, O. Dependence of Pseudomonas aeruginosa continuous culture biosurfactant production on nutritional and environmental factors / O. GuerraSantos, A. Kappeli // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1986. – Vol. 24. – P. 443–448. Lang, S. Structure and properties of biosurfactants / S. Lang // Biosurfactants and biotechnology / Marcel Dekker: Inc., ed. by N. Kosaric, W.L. Cairns, N.C. Gray – New York. – 1987. – P. 21–47. Chemical characterization and physicochemical behaviour of biosurfactants / J.L. Parra [et al] // J. Am. Oil Chem. Soc. – 1989. –Vol. 66. – P. 141–145. Jarvis, F.G. A glycolipid produced by Pseudomonas aeruginosa / F.G. Jarvis, M.J. Johnson // J. Am. Chem. Soc. – 1949. – Vol. 71. – P. 4124–4126. McInerney, M.J. Properties of the biosurfactant produced by Bacillus licheniformis strain JF-2 / M.J. McInerney, M. Javaheri, D.P. Nagle // J. Ind. Microbiol. – 1990. – Vol. 5. − P. 95–102. Production of biosurfactant by Bacillus lichenformis strain JF-2 / S.C. Lin [еt аl] // Microbial Enhancement of Oil Recovery-Recent Advances. – 1990. – Vol. 5. – P. 219–245. Karanth, N.G.K. Microbial production of biosurfactants and their importance / N.G.K. Karanth, P.G. Deo, N.K. Veenanadig / Current Science. – 1999. − Vol. 77. − P. 116–126. High- and low-molecular-mass microbial surfactants / E. Rosenberg, E.Z. Ron // Applied Microbiology and Biotechnology. − 1999. − Vol. 52. − P. 154–162. 361 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Georgiou, G. Surface-active compounds from microorganisms / G. Georgiou, S.C. Lin, M.M. Sharma // Biol. Technol. − 1992. − Vol. 10 − P. 60–65. Lang, S. Structure and properties of biosurfactants / S. Lang // Biosurfactants and biotechnology / Marcel Dekker: Inc., ed. by N. Kosaric, W.L. Cairns, N.C. Gray – New York. – 1987. – P. 21–47. Asselineau, C. Trehalose containing glycolipids / C. Asselineau, J. Asselineau // Prog. Chem. Fats Lipids. − 1978. − Vol. 16. − P. 59–99. Surface activities of Mycobacterium and Pseudomonas / D.G. Cooper [et al] // J. Ferment. Technol. − 1989. − Vol. 59. − P. 97–101. Syldatk, C., and F. Wagner. Production of biosurfactants// Biosurfactants and biotechnology: N. Kosaric, W.L. Cairns, and N.C.C. Gray. – Marcel Dekker, Inc., New York. – 1987. – Р. 89–120. Kretschmer, A. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkane / A. Kretschmer, H. Bock, F. Wagner // Appl. Environ. Microbiol. − 1982. − Vol. 44. − P. 864–870. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes / P.Rapp [et al] // J. Gen. Microbiol. − 1979. − Vol. 115. − P. 491–503. Formation and identification of interfacial-active glycolipids from resting microbial cells of Arthrobacter sp. and potential use in tertiary oil recovery / S. Li [et al] // Appl. Environ. Microbiol. − 1984. − Vol. 48. − P. 610–617. Cooper, D.G. Production of a biosurfactant from Torulopsis bombicola / D.G. Cooper, D.A. Paddock. // Appl. Environ. Microbiol. − 1984. − Vol. 47. − P. 173–176. Gobbert, U. Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola // U. Gobbert, S. Lang, F. Wagner // Biotechnol. Lett. − 1984. − Vol. 6. − P. 225–230. Inoue, S. Sorphorolipids from Torulopsis bombicola asт microbial surfactants in alkane fermentation / S. Inoue, S. Itoh // Biotechnol. Lett. − 1982. − Vol. 4. − P. 3–8. Cooper, D.G. Torulopsis petrophilum and surface activity / D.G. Cooper, D.A. Paddock // Appl. Environ. Microbiol. − 1983. − Vol. 46. − P. 1426–1429. Tulloch, P. A new type of macrocyclic lactone from Torulopsis apicola / P. Tulloch, A. Hill, J.F. Spencer / J. Chem. Soc. Chem. Commun. − 1967. − Vol. 4. − P. 584–586. Studies on the biosynthesis of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis ATCC / B. Kluge [et al] // FEBS Lett. – 1989. – Vol. 231. − P. 107−110. Emulsifier Arthrobacter RAG-1: isolation and emulsifying properties / E. Rosenberg [et al] // Appl. Environ. Microbiol. – 1979. – Vol. 37 – Р. 402–408. Cirigliano, M.C. Isolation of a bioemulsifier from Candida lipolytica / M.C. Cirigliano, G.M. Carman // Appl. Environ. Microbiol. – 1984 – Vol. 48. – Р. 747–750. Kappeli, O. / Component from the cell surface of the hydrocarbon-utilizing yeast Candida tropicalis with possible relation to hydrocarbon transport / O. Kappeli, A. Fiechter // J. Bacteriol. – 1977. – Vol. 131 – P. 917–921. Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: determination of emulsifier bound fatty acids / Belsky I. [et al] // FEBS Lett. – 1979. – Vol. 101. − P. 175−1778. Gutnick, D.L. Exopolysaccharide bioemulsifiers / D.L. Gutnick, Y. Shabtai // Biosurfactants and biotechnology / ed. by N. Kosaric [at al]. – New York, 1987. – P. 211−246. Zosim, Z. Properties of hydrocarbon-in-water emulsions stabilized by Acinetobacter RAG-1 emulsan / Z. Zosim, D. L. Gutnick, E. Rosenberg // Biotechnol. Bioeng. – 1982. – Vol. 24. – P. 281-292. Singh, M. Hydrocarbon ernusifying activity of bacterial strains: potential of Arthrobacter parafineus / M. Singh, J.D. Desai // Curr. Sci. − 1988. − Vol. 57. − P. 1307–1314. 362 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Bar-Ness, R. Increased cell surface hydrophobicity of a Serratia marcescens NS 38 mutant lacking wetting activity / R. Bar-Ness [et al] // J. Bacteriol. − 1988. − № 170. − Р. 4361–4365. Волкова, М.А. Изучение роста Rhodococcus ruber RМ 13 на гидрофобном субстрате / М.А. Волкова, Л.И. Кононова, Л.Б. Филатова // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. науч. конф., Минск−Раков, 1−2 июня 2006 г. / НАН Беларуси, Институт микробиологии. − Минск, 2006. − С. 120−122. Busscher, H.J. Biosurfactant production by thermophilic dairy streptococci / H.J. Busscher, T.R. Neu, H.C. van der Mei // Appl. Microbiol. Biotechnol. − 1994. − Vol. 41. − Р. 4–7. Jenny, K. Biosurfactants from Bacillus lichenformis: structural analysis and characterization / K. Jenny, O.Kappeli, A. Fiechter // Appl. Microbiol. Biotechnol. − 1991. − Vol. 36. − P. 5–13. Margaritis, A. Application of an air-lift fermentor in the production of biosurfactants / A. Margaritis, K. Kennedy, J.E. Zajic // Dev. Ind. Microbiol. − 1980. − Vol. 21. − P. 285–380. Rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa grown on n-paraffin / A. Itoh [et al] // J. Antibiot. − 1971. − Vol. 24. − P. 855–894. Bernheimer, A.W. Nature and properties of a cytolytic agent produced by Bacillus subtilis / A.W. Bernheimer, L.S. Avigad // J. Gen. Microbiol. − 1970. − Vol. 61. − P. 361–670. Anionic phospholipids can mediate membrane insertion of the anionic part of a bound peptide / J.M. Leenhouts [et al] // FEBS Lett. − 1995. − Vol. 370. − P. 189– 281. Образование поверхностно-активных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гидрофильных и гидрофобных субстратах / Пирог Т.П. [и др.] // Прикл. биохим. и микробиол. – 2004. – Т. 40. – С. 544–550. Влияние условий культивирования на биосинтез полисахаридов культурой Rhodococcus erythropolis штамм ВКМ Ас-858Т / Е.Г. Костина [и др.] // Наука и инновации в республике Мордовия: материалы IV Респ. науч.-практ. конф.,Саранск, 22 декабря 2004 г. / Мордовский гос. ун-т; редкол. В.А. Нечаев [и др.]. – Саранск, 2005. – С. 583–588. Production of water-soluble surface-active exolipids by Torulopsis apicola / R. Hommel [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. − 1987. − Vol. 26. − Р. 199−205. Биосурфактанты: продуценты, свойства и практическое использование / И.Н. Гоготов [и др.] // Биотехнология и бизнес [Электронный ресурс]. – 2006. – Режим доступа: http://www.rusbio.biz/ru/nb2006_22.shtml. – Дата доступа: 17.11.2006. Effect of the carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T / M. Robert [et al] // Biotechnol. Lett. − 1989. − Vol. 11. − Р. 871–874. Production of four interfacial active rhamnolipids from n-alkanes or glycerol by resting cells of Pseudomonas sp. DSM 2874 / C. Syldatk [et al] // Z. Naturforsch. − 1985. − Vol. 40. – Р. 61–67. Yamaguchi, M. Microbial production of sugar lipids / M. Yamaguchi, A. Sato, A. Yukuyama // Chem. Ind. − 1976. − Vol. 17. − Р.741–742. Itoh, S. Effect of rhamnolipids on growth of Pseudomonas aeruginosa mutant deficient in n-parafinutilizing ability / S. Itoh, T. Suzuki // Agr. Biol. Chem. − 1972. − Vol. 36. − Р. 2233–2238. Hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants / A. K. Koch [et al] // Bacteriol. − 1991. − Vol. 173. − Р. 4212–4222. Enhanced production of surfactin from Bacillus subtilis by continuous product removeal and metal cation additions / D.G. Cooper [et al] // Appl. Environ. Microbiol. − 1981. − Vol. 42. − Р. 408–420. 363 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 Syldatk, C. Chemical and physical characterization of four interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas sp. DSM 2874 grown on n-alkanes / C. Syldatk, S. Lang, F. Wagner // Z. Naturforsch. − 1985. − Vol. 40. − C. 51–60. Edmonds, P. Lipids of Pseudomonas aeruginosa cells grown on hydrocarbons and on trypticase soybean broth / P. Edmonds, J.J. Cooney // J. Bacteriol. − 1969. − Vol. 98. − Р. 16–22. Finnerty, W.R. A microbial biosurfactant — physiology, biochemistry and applications / W.R. Finnerty, M.E. Singer // Dev. Ind. Microbiol. − 1985. − Vol. 25. − Р. 31–46. Neidleman, S.L. Biotechnology and leochemicals: changing patterns / S. L. Neidleman, J. Geigert // J. Am. Oil Chem. Soc. − 1984. − Vol. 61. − Р. 290–297. Duvnjak, Z. Production and release of surfactant by Corynebacterium lepus in hydrocarbon and glucose media / Z. Duvnjak, N. Kosaric // Biotechnol. Lett. − 1985. − Vol. 7. − Р.793–796. Banat, I.M. Characterization of biosurfactants and their use in pollution removal − state of the art / I.M. Banat // Acta Biotechnol. − 1995. − Vol. 15. − Р. 251–267. Biosurfactant production and use in oil tank clean-up / I. M. Banat [et al] // World J. Microbiol. Biotechnol. − 1991. − Vol. 7. − Р. 80–84. Duvnjak, Z. Production of surfactant by Arthrobacter paraffineus ATCC 19558 / Z. Duvnjak, D.G. Cooper, N. Kosaric // Biotechnol. Bioeng. − 1982. − Vol. 24. − Р. 165–175. Microbial production, structure, elucidation and bioconversion of sophrose lipi / H. J. Asmer [et al] // J. Am. Oil Chem. Soc. − 1988. − Vol. 65. − Р. 1460–1466. Cooper, D.G. The effect of surfactants on peat dewatering / D.G. Cooper, E.R.A. Eccles, J.D. Sheppard // Can. J. Chem. Eng. − 1988. − Vol. 66. − Р. 393–397. Davila, A. Kinetics and balance of a fermentation free from product inhibition: sophorose lipid production by Candida bombicola / A. Davila, F. Marchal, J. Vandecasteele // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1992. – Vol. 38. – P. 6−11. Production of crystalline surface-active glycolipids by a strain of Torulopsis apicola / O. Stuwer [et al] // J. Вiotechnol. − 1987. − Vol. 6. − Р. 259–269. Lee, L.H. Distribution of substrate carbon in sophorose lipid production by Torulopsis bombicola / L.H. Lee, J.H. Kim // Biotechnol. Lett. − 1993. − Vol. 15. − Р. 263–266. Itoh, S. Fructose lipids of Arthrobacter, Corynebacteria, Nocardia and Mycobacteria grown on fructose / S. Itoh, T. Suzuki // Agric. Biol. Chem. − 1974. − Vol. 38. − Р. 1443–1449. Formation and identification of interfacial-active glycolipids from resting microbial cells of Arthrobacter sp. and potential use in tertiary oil recovery / Z.Y. Li [et al] // Appl. Environ. Microbiol. − 1984.− Vol. 48. − Р. 610–617. Suzuki, T. Sucrose lipids of Arthrobacteria, Corynebacteria and Nocardia grown on sucrose / T. Suzuki, H. Tanaka, S. Itoh // Agric. Biol. Chem. − 1974. − Vol. 38. − Р. 557–563. Duvnjak, Z. Effect of nitrogen source on surfactant production by Arthrobacter paraffines ATCC 19558 / Z. Duvnjak, D.G. Cooper, N. Kosaric // Microbial enhanced oil recovery / Pennwell Books, ed. by J.E. Zajic., D.G. Cooper, T.R. Jack. – Tulsa, 1983. − Р. 66–72. Yakimov, M.M. Effect of heterogeneity of hydrophobic moieties on surface activity of lichenysin A, a lipopeptide biosurfactant from Bacillus licheniformis BAS50 / M.M. Yakimov, H.L. Fredrickson, K.N. Timmis // Biotechnol. Appl. Biochem. – 1996. – Vol. 23. – Р. 13–18. Peypoux, F. Control biosynthesis of Val-7 and Leu-7 surfactins / F. Peypoux, G. Michel // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1992. – Vol. 36. – Р. 515–517. 364 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 Nutritional requirements and growth characteristics of a biosurfactant producing Rhodococcus bacterium / A. S. Abu-Ruwaida [et al] // World J. Microbiol. Biotechnol. − 1991. − Vol. 7. – Р. 53–61. Mulligan, C.N. Correlation of nitrogen metabolism with biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa / C. N. Mulligan, B. F. Gibbs // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – Vol. 55. – Р. 3016–3019. Ramana, K.V. Factors affecting biosurfactants production using Pseudomonas aeruginosa CFTR-6 under submerged conditions / K.V. Ramana, N.G. Karanth // J. Chem. Technol. Biotechnol. – 1989. – Vol. 45. – Р. 249–257. Production of bioemulsifier by SCP producing strain of Candida tropicalis during hydrocarbon fermentation / M. Singh [et al] // Biotechnol. Lett. – 1990. – Vol. 12. – Р. 743–746. Kosaric, N. Biosurfactant production from Nocardia SFC-D / N. Kosaric, H. Y. Choi, R. Bhaszczyk // Tenside Surf. Det. – 1990. – Vol. 27. – Р. 294–297. Guerra-Santos, L.H. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source / L.H. Guerra-Santos, O. Kappeli, A. Fiechter // Appl. Environ. Microbiol. − 1984. − Vol. 48. − Р. 301–305. Production of water-soluble surface-active exolipids by Torulopsis apicola / R.K. Hommel [et al] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1987. – Vol. 26. – Р. 199–205. Powalla, M. Penta- and disaccharide lipid formation by Nocardia corynebacteroides grown on n-alkanes / M. Powalla, S. Lang, V. Wray // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1989. – Vol. 31. Р. 473–479. Isolation of biosurfactant producing bacteria—product characterization and evaluation / A.S. Abu-Ruwaida [et al] // Acta. Biotechnol. – 1991. – Vol. 11. – Р. 315–324. Drouin, C.M. Biosurfactant and aqueous twophase fermentation / C.M. Drouin, D.G. Cooper // Biotechnol. Bioeng. – 1992. – Vol. 40. – Р. 86–90. SURFACTANT-PRODUCING MICROFLORA: PROPERTIES AND PRACTICAL APPLICATION KONONOVA V.V., SAMCONOVA A.S., SEMOCHKINA N.F. Laboratory of degradation of xenobiotics and bioremediation of environmental and industrial media In this paper, the literature evidence of surfactant producing microorganisms are reviewed. Strategies of enhance biosurfactant production by microbial cells are discussed. The general properties, functions and classification of biosurfactants are introduced. The potential applications of biosurfactants in oil-producing, chemical, pharmaceutical, industrial processes and bioremediation of hydrocarbons are presented. 365 УДК 579.22+579.695 МИКРООРГАНИЗМЫ-ДЕСТРУКТОРЫ ТРИЭТИЛАМИНА ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф., Алещенкова З.М., Петрова Г.М. лаборатория деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред Среди 82 изолированных из различных объектов окружающей среды микроорганизмов, использующих триэтиламин (ТЭА) в качестве единственного источника углерода, лишь два штамма родококков обладали высокой деструктивной активностью. Штамм Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д получен методом накопительной культуры из почвы, загрязненной ингредиентами выбросов предприятия органического синтеза в естественных условиях; штамм Rhodococcus ruber БИМ В−300Д выделен из активного ила очистных сооружений. Изучены культурально-морфологические, биохимические и деструктивные свойства выделенных микроорганизмов. Показано, что штаммы Rhodococcus ruber БИМ В−300Д и Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д, использованные совместно для очистки воды от триэтиламина в биореакторе, разрушают токсикант гораздо интенсивнее, чем каждая из использованных культур в отдельности: в концентрации 1000,0; 3000,0 и 7000,0 мг/л за 96, 240 и 312 ч соответственно. Введение. Создание экологически безопасных способов защиты водных бассейнов является важнейшей проблемой современности. Серьезную угрозу для водоемов представляют промышленные сточные воды, содержащие токсические соединения. Решение проблемы очистки промышленных сточных вод может быть достигнуто с помощью физико-химических и биологических методов. Традиционные физико-химические методы очистки сточных вод требуют значительных энергетических и материальных затрат. Наиболее экономичны и эффективны биологические методы, преимущества которых заключаются в полной минерализации органических загрязнений, содержащихся в очищаемой сточной воде, и их абсолютной биологической безопасности. Внедрение новых прогрессивных технологий, а также интенсификация работы действующих очистных сооружений являются важными и актуальными этапами в решении проблем очистки производственных и предупреждения загрязнения природных водных объектов. Известен способ обезвреживания сточных вод, содержащих ароматические амины, который включает обработку нитритом на0 трия при 15−25 С, фильтрацию продукта, подвергнутого процес- 366 су диазотирования, нейтрализацию, разбавление водой и направление на биологическую очистку активным илом [1]. Физикохимическая предобработка сточных вод является трудоемкой и дорогостоящей. Очистка воды с помощью активного ила сопряжена с двумя проблемами: необходимостью повышения деструктивной активности илового ценоза в условиях увеличения содержания токсических веществ и неизбежностью утилизации накапливающихся избыточного активного ила и осадков сточных вод. В настоящее время в связи с неуклонным повышением содержания в стоках трудноразлагаемых органических загрязнителей, а также общим увеличением объема бытовых и промышленных органических отходов традиционная биологическая очистка не дает уже удовлетворительных результатов. Очистные сооружения испытывают существенные нагрузки при поступлении стоков с повышенным содержанием загрязняющих веществ, а также содержащих токсические и трудноразлагаемые соединения. Для решения этой проблемы необходима предварительная очистка сточных вод с использованием принципиально новых методов. Наиболее перспективными в этом плане являются микробиологические методы очистки. Микробиологическая очистка воды эффективна для многокомпонентных сильнозагрязненных стоков. Она базируется на применении высокоактивных культур микроорганизмов-деструкторов, способных разрушать токсические соединения в концентрациях, в десятки раз превышающих предельно допустимые концентрации этих веществ, принятые для подачи на биологические очистные сооружения [2]. Микробиологическая очистка экономична, не требует больших капитальных и эксплуатационных затрат. Локальные установки, в которых реализуется данная очистка, занимают незначительные площади, просты и надежны в обслуживании. Для успешного осуществления микробиологического метода важное значение имеет поиск и получение штаммов бактерий с повышенной деструктивной активностью и использование их в специально разработанных для этой цели биотехнологических процессах очистки производственных сточных вод. Цель исследования: получение новых штаммов микроорганизмов, способных полностью разлагать триэтиламин в высокой концентрации при локальной очистке содержащих его сточных вод. Объекты и методы исследования. Выделение бактерий, разрушающих триэтиламин, проводили методом накопительных культур. В качестве источников выделения использовали: почву, длительное время подвергавшуюся загрязнению в естественных условиях ингредиентами выбросов предприятия органического 367 синтеза; почву, загрязненную триэтиламином в искусственных условиях; активный ил очистных сооружений предприятия органического синтеза (г. Могилев). Объектами исследований также были 23 штамма из рабочей коллекции лаборатории деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред. Для выделения и культивирования бактерий-деструкторов триэтиламина использовали полноценные среды (МПА, МПБ, МСА), а также жидкую и агаризованную минеральную среду Е-8 [3] следующего состава (в г/л): NaCl − 0,5; (NH4)2HPO4 − 1,5; KH2PO4 − 0,7; MgSO4 .7H2O − 0,8; pH=7,3−7,5. ТЭА добавляли в качестве единственного источника углерода и энергии в количестве 0,1−7,0 г/л. Селекцию аэробных бактерий-деструкторов триэтиламина проводили в условиях периодического культивирования в колбах Эрленмейера объемом 500 мл на качалке, обеспечивающей 180 об/мин при 29 0С. Накопительные культуры получали путем 10кратных пассажей культуры, сопровождающихся повышением концентрации триэтиламина в среде с 0,01 до 0,7%. Одновременно контролировали снижение содержания ТЭА в культуральной жидкости фотометрическим методом [4]. Культуры накопления рассевали на поверхности агаризованной минеральной среды с триэтиламином в качестве единственного источника углерода. Для выявления деструкторов выросшие изолированные колонии вносили в жидкую минеральную среду с ТЭА (0,5%). Отобранные, активно растущие в жидкой среде культуры, проверяли на чистоту, рассевая на МПА с последующим микроскопированием. Чистые культуры получали путем шестикратной реизоляции микроорганизма из одной колонии. Идентификацию бактерий-деструкторов проводили, руководствуясь определителем Берги [5], Procariotes [6], монографиями [7, 8], руководствами [9,10], а также оригинальными работами [11−12]. Морфологию и структуру колоний регистрировали на мясо-пептонном агаре. Форму, подвижность клеток, окрашиваемость по Граму, наличие спор определяли под микроскопом. Отношение к NaCl фиксировали на МПБ с 1, 5, 7% NaCl. Способность бактерий использовать различные углеводы и спирты определяли на пептонно-фосфатной среде с бромтимоловым синим, содержащей 1% изучаемого субстрата. Усвоение натриевых солей органических кислот: лимонной, пропионовой, бензойной, молочной, уксусной, α-кетоглутаровой, цис-аконитовой, щавелевой устанавливали на среде, г/л: (NH4)2HPO4 − 0,5; MgSO4·7H2O − 0,2; NaCl – 0,1; агар-агар − 15,0; 368 соль органической кислоты − 2,0; 20 мл 0,04%-го водного раствора фенолового красного, рH=6,8. Анаэробное усвоение глюкозы проверяли на среде ХьюЛейфсона. Протеолитические свойства бактерий устанавливали по разжижению желатины, пептонизации молока. На МПБ учитывали образование индола, сероводорода, аммиака. Способность бактерий к восстановлению нитратов и образованию газообразных продуктов денитрификации устанавливали на МПБ с 1% KNО3. Оксидазную активность определяли при помощи 1% раствора дигидрохлорида тетраметил-n-фенилендиамина. Наличие каталазы и амилазы выявляли общепринятыми методами. Деструктивные свойства выделенных микроорганизмов– деструкторов изучали в 3-х стеклянных биореакторах объемом 1,0 л. Посевной материал культур-деструкторов триэтиламина выращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой минеральной среды Е-8 с ТЭА в концентрации 1 г/л. Культуру вносили петлей с косяков, посевной материал инкубировали на качалке, обеспечивающей 180 об./мин при 29 0С в течение 168 ч. Первый биореактор заполняли 200 мл полученного посевного материала культуры Rhodococcus erythropolis БИМ В−300 Д, второй – 200 мл полученного посевного материала культуры Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д, третий – смесью данных культур 100 мл каждой. Биоректоры заполняли жидкой минеральной средой Е-8 и добавляли ТЭА до конечной концентрации 1000, 3000 и 7000 мг/л, рН доводили до 7,3−7,5. Процесс разрушения триэтиламина вели при температуре 20 0С и интенсивной аэрации (30 л/ч на 1 л аэрируемой жидкости). Эффективность разрушения ТЭА определяли по содержанию токсиканта до и после очистки [4]. Результаты и их обсуждение. Из почвы, длительное время подвергавшейся загрязнению в естественных условиях ингредиентами выбросов предприятия органического синтеза, почвы, загрязненной триэтиламином в искусственных условиях и из активного ила очистных сооружений предприятия органического синтеза изолировано 57 штаммов, использующих триэтиламин в качестве единственного источника углерода. Скрининг микроорганизмов, способных расти на триэтиламине, осуществляли также среди 25 культур микроорганизмовдеструкторов рабочей коллекции лаборатории деградации ксенобиотиков и биоремедиации природных и производственных сред. Для исследований отобраны штаммы, обладающие высокой деструктивной активностью: 37Ф, полученный методом накопительной культуры из почвы, загрязненной ингредиентами выбросов 369 предприятия органического синтеза в естественных условиях и 2В, выделенный из активного ила очистных сооружений. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании их культуральных, морфологических и физиологобиохимических свойств. Колонии штамма 2В на мясо-сусловом агаре оранжево−красные, диаметром 1−5 мм, круглые с ровным краем, выпуклые, неблестящие, сухие, легко снимаются с агара; на минеральной агаризованной среде с триэтиламином -- бледно оранжевые, диаметром 1 мм, круглые, выпуклые, маслянистые, пастообразные. Клетки образуют на ранней стадии развития первичный мицелий, который к 24−28 ч роста фрагментируется и колонии 2−3-х суточного возраста состоят из кокковидных овальных клеток. Колонии штамма 37Ф на мясо-сусловом агаре кремово−розовые, диаметром 2,5 мм, круглые с ровным краем, выпуклые, гладкие, пастообразные, на минеральной агаризованной среде с триэтиламином -- кремовые, диаметром 1 мм, круглые, выпуклые, с ризоидным краем, матовые, пастообразные. Клетки в возрасте до 10−12 часов после посева нитевидные, длиной 8−12 мкм, иногда слабоветвящиеся, которые через 12−14 часов роста фрагментируются. Образующиеся палочковидные клетки располагаются V-образно и палисадовидно, а также одиночно. Они быстро (через 16−24 часа) укорачиваются до кокковидных. Изученные физиолого-биохимические свойства выделенных микроорганизмов показали, что оба штамма грамположительные аэробы, неподвижны, некислотоустойчивы, неспорообразующие, оксидазоотрицательны, имеют каталазу, не имеют ДНК-азу, анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный, гидролитические ферменты отсутствуют (желатин не разжижают, крахмал не гидролизуют, казеин не разлагают). В клеточной стенке обнаружены: галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид LCN-A (IV тип). Штамм 2В образует кислоту из глюкозы, фруктозы, сорбита, инозита, маннита, глицерина. Хорошо ассимилирует цитрат, пропионат, α-кетоглутарат, лактат, ацетат натрия, но не оксалат натрия на среде, г/л: (NH4)2HPO4 − 0,5; MgSO4·7H2O − 0,2; NaCl – 0,1; агар-агар − 15,0; натриевая соль органической кислоты − 2,0; 20 мл 0,04%-го водного раствора фенолового красного, рH=6,8. Восстанавливает нитраты в нитриты, не имеет уреазы, растет в присутствии 7% NaCl. Штамм 37Ф образует кислоту из глюкозы, фруктозы, ксилозы, сорбита, маннита, глицерина, но не использует арабинозу, галактозу, лактозу, рамнозу, дульцит. Усваивает натриевые соли 370 органических кислот: лимонной, пропионовой, бензойной, молочной, уксусной, α-кетоглутаровой, цис-аконитовой, но не щавелевой. Растет на нитритном агаре, на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5% NaCl. Штаммы при росте на общепринятых средах и минеральной среде с ТЭА не требуют стимуляторов роста. Штаммы потребляют триэтиламин в качестве единственного источника углерода и не нуждаются в стимуляторах деструкции; сохраняют жизнеспособность и деструктивные свойства в течение 6 месяцев на МПА, МСА и агаризованной минеральной среде с ТЭА (0,5%). Штаммы нетоксичны и непатогенны. На основании изученных свойств культуры отнесены к роду Rhodococcus: штамм 2В – к виду ruber, штамм 37Ф – к виду erythropolis. Штаммы Rhodococcus ruber 2В и Rhodococcus erythropolis 37Ф депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (научной коллекции типовых и промышленноценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии Национальной академии наук Беларуси), где им присвоены коллекционные номера БИМ В−300Д и БИМ В−301Д соответственно. Деструктивные свойства выделенных микроорганизмов изучали в лабораторных биореакторах, содержащих ТЭА в концентрации 1000,0; 3000,0 и 7000,0 мг/л. Результаты фотометрического анализа остаточного количества ТЭА, представленные в таблице 1, показывают, что культура Rhodococcus ruber БИМ В−300Д полностью разрушает токсикант в концентрации 1000,0; 3000,0 и 7000,0 мг/л за 240, 360 и 384 ч соответственно. Таблица 1 − Разрушение триэтиламина Rhodococcus ruber БИМ В−300Д Исходное соОстаточное содержание ТЭА, мг/л держание 72 ч 96 ч 168 ч 240 ч 312 ч 360 ч ТЭА, мг/л 1000,0 230,0 175,0 115,0 0 3000,0 2100,0 1750,0 950,0 350,0 95,0 0 7000,0 6100,0 5050,0 3900,0 2200,0 1315,0 350,0 384 ч 0 Культура Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д полностью разрушает токсикант в концентрации 1000,0; 3000,0 и 7000,0 мг/л за 240, 312 и 360 ч соответственно (таблица 2). 371 Таблица 2 − Разрушение триэтиламина Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д Исходное содержание ТЭА, мг/л 1000,0 3000,0 7000,0 Остаточное содержание ТЭА, мг/л 96 ч 168 ч 240 ч 312 ч 72 ч 190,0 2000,0 5900,0 140,0 1800,0 4900,0 95,0 110,0 3000,0 0 70,0 1950,0 360 ч 0 1050,0 0 Культуры Rhodococcus ruber БИМ В−300Д и Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д, использованные совместно, разрушают токсикант гораздо интенсивнее, чем каждая из использованных культур в отдельности. Так, ТЭА, содержащийся в воде в концентрации 1000,0; 3000,0 и 7000,0 мг/л, разрушается культурами полностью за 96, 240 и 312 ч соответственно (таблица 3). Таблица 3 − Разрушение триэтиламина Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д и Rhodococcus ruber БИМ В−300Д Исходное содержание ТЭА, мг/л 1000,0 3000,0 7000,0 72 ч Остаточное содержание ТЭА, мг/л 96 ч 168 ч 240 ч 312 ч 120,0 1800,0 5750,0 0 1150,0 3900,0 325,0 2500,0 0 1350,0 0 Таким образом, 1000 мг/л ТЭА при совместном использовании его культурами Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д и Rhodococcus ruber БИМ В−300Д разрушается на 144 ч быстрее, чем каждой из культур, использованной отдельно. Аналогичное ускорение процесса деструкции наблюдали в вариантах с 3000,0 и 7000,0 мг/л ТЭА, который смесью культур разрушался на 120 и 72 часа быстрее соответственно, чем культурой Rhodococcus ruber БИМ В−300Д, а также на 72 и 48 ч быстрее соответственно, чем культурой Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д. На основании проведенных исследований штаммы Rhodococcus erythropolis БИМ В−301Д и Rhodococcus ruber БИМ В−300Д при совместном применении предлагается использовать для локальной очистки сточных вод от ТЭА до поступления их в общий сток предприятия. 372 Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Способ обезвреживания сточных вод, содержащих ароматические амины: пат. №2136609 RU МПК6 С 02 F 3/00, СО2 1/58 / М.В. Хохлова [и др.]; заявитель Государственный научный центр РФ «НИОПиК». – №98100730/25; заявл. 22.01.98; опубл. 10.09.99, бюл. №25. Способ биологической обработки сточных вод, содержащих соль тетраалкиламмония и метиламин: патент №6015080 B4 JP, МКИ5 С 02 F 3/34, С 12 N 1/20, С 12 R 1:365 / Мисава Тэрухатиро; заявитель Сумитомо дзюкикай когё К К. – №85243900; заявл.01.11.85; опубл. 02.03.94// Изобретения стран мира. – 1996. – № 11. – С. 6. О росте грибов Mucorales на парафине / В.К. Ерошин [и др.] // Микробиология. – 1965. – Т. 34, № 5. – С. 883–887. Лурье, Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод / Ю.Ю. Лурье. – М.: Химия, 1984. – 447 с. , Bergey s manual of systematic bacteriology: 2 vol. / Ed. J.G. Holt [at al]. – Baltimore; London: Williams, Wilkins, 1986. – Vol. 1, 2. – 1599 p. The Prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification, applications: 4 vol. / Ed. A. Balows. – Berlin, Heidelberg: SpringerVerlag, New York, 1992. – Vol. 2. – P. 1188–1213. Аристархова, В.И. Нокардиоподобные микроорганизмы / В.И. Аристархова. – М.: Наука, 1989. – 247 с. Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии/ О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина; под ред. Н.С. Агре. – Киев: Наук. думка, 1985. – 336 с. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. – 2-е изд. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983.- 215 с. Методы общей бактериологии: в 3т. / редкол.: Ф. Герхардт [и др.].-- М.: Мир, 1984.- Т. 3.- 286 с. Goodfellow, M. The actinomycete genus Rhodococcus: a home for “rhodochrous” complex / M. Goodfellow, , G.Alderson // J. Gen. Microbiol.- 1977.- Vol. 100, № 1.P. 99-122. Numerical classification of some rhodococci, corynebacteria and related organisms / M. Goodfellow [at al] // J. Gen. Microbiol.- 1982.- Vol. 128, № 4.- P.731-745. MICROORGANISMS DEGRADING TRIETHYLAMINE IN EFFLUENTS SAMSONOVA A.S., SYOMOCHKINA N.F. ALESHCHENKOVA Z.M., PETROVA G.M. Laboratory of xenobiotic degradation and bioremediation of natural and industrial media Among 82 microbial cultures isolated from different environmental objects and utilizing triethylamine as the sole carbon source, only 2 rhodococcal strains displayed high decomposing activity. Strain Rhodococcus erythropolis BIM B-301D was obtained by enrichment culture technique from soil contaminated with ingredients discharged by chemical synthesis factory; strain Rhodococcus ruber BIM B-300D was isolated from activated sludge of decontamination units. Cultural-morphological, biochemical and degradative characteristics of microbial isolates were examined. It was shown that strains Rhodococcus ruber BIM B-300D and Rhodococcus erythropolis BIM B-301D applied in mixed culture for removal of triethylamine from wastewater in bioreactor degraded the pollutant much faster than separate cultures: concentrations 1000,0; 3000,0 and 7000,0 mg/l were totally consumed in 96, 240 and 312 hours, respectively. 373 УДК 579.22:582.28:66.081 СВЯЗЫВАНИЕ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ СТРУКТУРНЫМИ БИОПОЛИМЕРАМИ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Ровбель Н.М. группа по биоповреждениям Исследования состава клеточной стенки ксилотрофных базидиомицетов, а также роли отдельных структурных компонентов в связывании ионов тяжелых металлов позволили выявить доминирование в процессе сорбции хитин-глюканового комплекса (ХГК). Выявлено, что обработка грибных клеточных стенок мочевиной, способствующая наиболее полному удалению белков матрикса, значительно повышает доступность активных центров ХГК для связывания ионов металлов. Установлено, что связывание ионов меди мицелием и его структурными компонентами осуществляется посредством взаимодействия между ионом металла и кислород-, азотсодержащими и карбоксильными группами. Введение. В настоящее время во всем мире большое внимание уделяется защите внутренней среды человека от воздействия постоянно возрастающих концентраций токсичных веществ антропогенного и природного характера. Сорбционные методы, применяемые для детоксикации организма, отличающиеся относительной простотой и доступностью, находят широкое применение как при экстренных ситуациях, так и в качестве неспецифической компоненты комплексного лечения хронических заболеваний [1]. Энтеросорбенты способствуют выведению из организма эндотоксинов, радионуклидов, а также ионов тяжелых металлов, основная масса которых поступает при вдыхании воздуха с высокими концентрациями выхлопных газов, а также с водой и продуктами питания. Особое значение придается таким профилактическим средствам, которые, способствуя выведению из организма ксенобиотиков и снижению содержания токсичных продуктов метаболизма, могли бы применяться в течение продолжительного периода в виде добавок к обычным продуктам питания, не нарушая при этом обмена веществ в организме человека. С этих позиций наиболее приемлемыми являются природные сорбенты, к которым относят производные целлюлозы, пектиновые вещества, хитин и др. В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает сорбционный потенциал грибов, в частности базидиомицетов [2, 3]. 374 Архитектура клеточной стенки у разных грибов имеет общие черты. В клеточной стенке базидиальных грибов обычно различают несколько компонентов: аморфный глюкан, растворяющийся в холодной щелочи и содержащий α-1,3-связи; аморфный щелоченерастворимый глюкан, содержащий глюкозные остатки, соединенные β-1,3 и β-1,4-связями, микрофибриллы хитина, прочно связанные с β-глюканом ковалентной связью и составляющие в нативном мицелии единый хитин-глюкановый комплекс (ХГК), а также дискретный слой белка [4]. Эти высокомолекулярные соединения связывают токсические вещества и выводят их без переваривания. Это и причина, почему грибы традиционно используются для лечения пищевых, алкогольных и других отравлений [5]. Таким образом, хитин-содержащая биомасса может служить эффективным энтеросорбентом токсических металлов. Учитывая сложность состава клеточной стенки грибов, можно предположить, что сорбция тяжелых металлов – весьма сложный процесс, включающий различные компоненты и механизмы и зависящий от структуры и состава клеточной стенки. Множество функциональных групп, расположенных на поверхности грибной клеточной стенки может быть вовлечено в связывание металлов, включая карбоксильные, амино-, гидроксильные, фосфатные и сульфитные группы. Наличие ацетомидной группы в молекуле хитина определяет ее специфические сорбционные свойства, вызванные пространственным сближением амидной и карбоксильной групп. Все три атома в цепи О–С–N потенциально реакционно способны, что частично связано с делокализацией неподеленной электронной пары атома азота (с двойной связью) карбонильной группы [6]. В частности, основным механизмом связывания ионов кадмия является хелатирование, в то время как для ионов никеля – в основном, ионный обмен. Для катионов свинца механизм связывания включает комбинацию ионного обмена, хелатирования, окислительно-восстановительных реакций, сопровождаемых осаждением ионов свинца в матриксе клеточной стенки. В процессе ионнообменных реакций ионы кальция, магния, водорода, а также возможно калия и натрия, замещаются ионами тяжелых металлов [7]. Цель исследования – изучить закономерности связывания ионов тяжелых металлов клеточными стенками глубинного мицелия базидиомицетов и их основными структурными биополимерами. Объекты и методы исследования. В работе использованы штаммы ксилотрофных базидиальных грибов из коллекции лаборатории экспериментальной микологии Института микробио- 375 логии НАН Беларуси: Ganoderma lucidum (Curtis.: Fr.) P. Karst., Lentinus edodes (Berk.) Sing., Pleurotus ostreatus (Fr.) P. Kumm., Trametes hirsuta (Wulfer: Fr.) Pilat. Для получения глубинного инокулюма в колбы емкостью 250 мл с 50 мл глюкозо-пептонной среды вносили 10 агаровых дисков с маточной культурой гриба и инкубировали в течение 7 сут. на качалке. Затем мицелий гриба переносили в свежую среду и культивировали в течение 4 сут. Полученная культура служила посевным материалом, который вносили в питательную среду в количестве 0,2–0,5 г/л в пересчете на сухую биомассу. Культивирование грибов осуществляли в колбах Эрленмейера на качалке. Фракцию клеточных стенок получали путем трехкратного последовательного замораживания (при -20 ºС) и оттаивания (при +20 ºС) грибного мицелия в сочетании с гомогенизацией, центрифугированием при 9000 об/мин в течение 10 мин и отмывкой дистиллированной водой полученного осадка с целью удаления внутриклеточного содержимого. На следующем этапе проводили ультразвуковое дезинтегрирование (УЗДН, Россия) с последующим центрифугированием со скоростью 9000 об/мин в течение 15 мин и отмывкой клеточных стенок дистиллированной водой. Полноту удаления внутриклеточного содержимого и степень измельчения клеточных стенок контролировали путем микроскопирования в проходящем свете (при увеличении x 900 раз). ХГК выделяли из нативных клеточных стенок (влажность 60–70%) путем щелочного гидролиза 2М раствором гидроксида натрия в соотношении 1:10 в течение 18 ч при комнатной температуре. Далее проводили диализ полученной фракции в дистиллированной воде в течение 16 ч для удаления излишков гидроксида натрия и получения Nа–формы ХГК. Последующее промывание Nа–формы ХГК 0,01 мМ в течение 2 ч раствором соляной кислоты и диализ в течение 16 ч в приводили к получению Н– формы ХГК. Хитин был получен в результате последовательного кислотно-щелочного гидролиза. Для удаления белков 0,5 г клеточных стенок (влажность 60– 70%) заливали 2,5 мл 4М мочевины и инкубировали в термостатирующем шейкере при температуре 37 ºС при постоянном перемешивании в течение 14–16 ч. Полученную суспензию дважды центрифугировали при 11000 об/мин в течение 15 мин. Клеточные стенки после экстракции белков отмывали дистиллированной водой. Для характеристики и сравнительного анализа сорбционной способности использовали следующие показатели [6]: сорбционная емкость – СЕ (мМ/г или мг/г) СЕ = (Сисх - Скон). V/m, 376 где Сисх и Скон – исходная и конечная концентрации ионов металла в растворе, соответственно (мМ или мг/л); V– объем раствора (л); m – масса сорбента (г, в пересчете на сухое вещество). Удельная поверхность – Sуд (м2/г) образцов определялась по количеству адсорбированной мицелием, клеточными стенками, ХГК и хитином метиленового голубого [7]. Концентрацию метиленового голубого определяли колориметрическим методом. Удельную поверхность образцов рассчитывали по формуле [8]: Sуд= А·S·Na, где А – количество cорбированного метиленового голубого (мг/г); S = 0,57·10-18 (площадь, занимаемая одной молекулой метиленового голубого в монослое при мономолекулярном заполнении сорбента, м2); Na – число Авогадро. В исследованиях использовали 0,25 мМ растворы солей Pb(NO3)2, CuSO4 и Cd(CH3COO)2. Содержание ионов металлов в пробах до и после сорбции анализировали методом атомноабсорбционной спектроскопии на приборе AAS-30 (Carl Zeiss Jena, Германия). ИК–спектры поглощения клеточных стенок, депротоинизированных клеточных стенок, ХГК и хитина до и после взаимодействия с ионами меди изучали на «Specord M-80» (Carl Zeiss Jena, Германия) в диапазоне 3800–400 см-1 с разрешением 0,5 см-1. Образцы для получения спектров готовили в виде таблеток прессованием при нагрузке 7 атм. в течение 30 с. Измерения исходной и конечной концентрации ионов металлов в образце – проводили в 3-х кратной повторности. Обработку результатов проводили с использованием статистических функций Microsoft Excel и пакета программ STATISTICA 5.5, уровень значимости – 95%. Результаты и их обсуждение. Биополимеры клеточных стенок ксилотрофных базидиальных грибов включают несколько классов макромолекул: щелочерастворимые α 1,3-глюкан и β 1,6глюкан, щелоченерастворимые β 1,3-глюкан и хитин, образующие ХГК, а также белки [9]. Более 75% полисахаридов грибного мицелия приходится на клеточные стенки. Культуры G.lucidum 14, L. edodes 104, P. ostreatus 43 и T. hirsuta 27, отобранные в качестве потенциальных продуцентов сорбирующих субстанций, значительно отличались друг от друга по ростовым характеристикам. Выход глубинного мицелия P. ostreatus 43 на разбавленном пивном сусле был почти в 2 раза выше, чем данный параметр у L. edodes 104. Различия в содержании клеточных стенок были также довольно значительными, в мицелии P. ostreatus 43 их удельная масса была в 2,5 раза больше, чем у L. edodes 104 (таблица 1). 377 Таблица 1 – Выход мицелия и содержание в нем клеточных стенок при глубинном культивировании базидиальных грибов G. lucidum 14 Выход мицелия, г/л 9,15 L. edodes 104 5,91 26,82 1,58 P. ostreatus 43 11,35 35,88 4,09 T. hirsuta 27 6,11 30,18 1,84 Культура Содержание кле- Выход клеточных точных стенок, % стенок, г/л 22,32 2,04 С целью изучения роли отдельных полисахаридов в связывании ионов тяжелых металлов был проведен ступенчатый кислотно-щелочной гидролиз клеточных стенок грибов G. lucidum 14, L. edodes 104, P. ostreatus 43 и T. hirsuta 27. После каждого этапа обработки определяли сорбционную емкость непрогидролизовавшегося остатка по отношению к ионам меди. Удаление из клеточных стенок щелочерастворимых полисахаридов способствовало повышению сорбционной способности остатка, более 96% которого составляет ХГК. В процессе выделения ХГК после водной отмывки щелочи образуется Na–форма комплекса, которая после обработки слабой кислотой переходит в Н–форму. Данные формы ХГК отличались по величине сорбционной емкости, что можно объяснить тем, что карбоксилат-ионы, характерные для Na–формы, более активно замещаются ионами меди, чем гидроксил-ионы, преобладающие в Н–форме. Наиболее высокую сорбционную емкость имела Na–форма ХГК гриба T. hirsuta 27 (таблица 2). Ступенчатый кислотно-щелочной гидролиз ХГК, приводящий к выделению чистого хитина, вызвал значительное уменьшение его способности связывать ионы меди. Таблица 2 – Сорбционная емкость (мг/г) клеточных стенок и их структурных биополимеров по отношению к ионам меди G.lucidum 14 Клеточные стенки 2,88 ХГК (Na-форма) 4,88 ХГК (Н-форма) 4,49 L. edodes 104 1,41 3,58 3,32 1,41 P.ostreatus 43 2,56 4,42 4,51 1,66 T.hirsuta 27 3,32 4,95 4,35 1,80 Культура Хитин 1,71 Сравнительное изучение сорбционной способности клеточных стенок грибов и их структурных компонентов по отношению к 378 ионам опасных для здоровья и широко распространенных тяжелых металлов (кадмий, свинец, медь) показало наличие как сходных черт, так и различий. Сорбционная емкость нативных клеточных стенок по отношению к ионам тяжелых металлов убывала в ряду: T. hirsuta 27 > G. lucidum 14 > P. оstreatus 43 > L. edodes 104, сохраняя при этом предпочтительность связывания свинца: Pb2+ >Cd2+ >Cu2+. Сорбционная емкость по отношению к ионам свинца клеточных стенок T. hirsuta 27 была в 1,8 раза выше, чем данный параметр L. edodes 104. Для клеточных стенок этих же грибов были характерны и максимальные различия в значениях сорбционной емкости по отношению к ионам кадмия и меди – соответственно в 2,0 и 2,4 раза. Изолированный ХГК изученных грибов (Н-форма, которая ближе по своим свойствам к ХГК в нативном состоянии) в сравнении с клеточными стенками характеризовался более высокой сорбционной способностью и селективностью связывания ионов кадмия. Ряд сорбируемости в этом случае имел следующий вид: 2+ 2+ 2+ Cd > Pb > Cu . Наиболее значительно (в 2,3 раза) возросла сорбционная емкость ХГК по отношению к ионам кадмия при отделении его от других компонентов клеточной стенки у L. edodes 104 (у других грибов в среднем в 1,6 раза). Депротеинизированные клеточные стенки были близки к ХГК по уровню сорбционной емкости и избирательности связывания. Экстракция белков из клеточной стенки создает обширную сеть микропустот, сорбционная поверхность которых становится сопоставимой с поверхностью микрофибрилл ХГК [10]. Аналогичный процесс происходит и при обработке клеточных стенок холодной щелочью в процессе выделения ХГК. Согласно литературным данным, интенсивность сорбции ионов тяжелых металлов в значительной степени зависит от соотношения биополимеров, составляющих ХГК. В исследовании, проведенном с грибом A. niger, изменение соотношения хитин/глюкан в ХГК в сторону увеличения глюкана уменьшило его способность к связыванию уранил-ионов при одновременном возрастании сорбционной способности в отношении кобальта и марганца [10]. Снижение способности связывать тяжелые металлы при ступенчатом удалении глюканов из ХГК отмечено также З.А.Канарской и соавторами [11]. Превалирование полисахаридов над хитином в ХГК ксилотрофных базидиомицетов, вероятно, и обуславливают его высокую активность сорбции ионов тяжелых металлов. По степени доминирования глюкана в комплексе исследованные культуры располагались в той же последовательности, что и сорбционная способность: T. hirsuta (1:0,71) > G. lucidum (1:0,74) > P. ostreatus (1:0,78) > L. edodes (1:0,85). 379 Фракции чистого хитина характеризуются наиболее низкими значениями сорбционной емкости и отсутствием статистически значимых различий в селективности извлечения металлов. Причиной данного явления может быть уменьшение его удельной поверхности и увеличение степени кристалличности. Так, удельная поверхность волокон хитина была в 2,5–3,1 раза меньше, чем клеточных стенок и в 3,8–4,7 раза меньше, чем у ХГК (таблица 3). Таблица 3 – Удельная поверхность клеточных стенок и их структурных компонентов, м2/г Культура Клеточные стенки ХГК G.lucidum 14 L. edodes 104 P.ostreatus 43 T.hirsuta 27 139,9 95,8 118,4 150,6 204,7 150,1 193,8 223,5 Депротеинизированные клеточные стенки 211,7 169,6 201,9 231,3 Хитин 47,7 40,1 44,9 49,3 Механизмы связывания ионов тяжелых металлов грибными клеточными стенками до сих пор остаются не до конца выясненными. Определенную информацию о процессах, происходящих в результате взаимодействия клеточных структур с ионами тяжелых металлов, можно получить, используя метод ИК-спектроскопии. Изменения в химической структуре биополимеров грибного мицелия в процессе связывания ионов меди исследовали путем сравнения ИК-спектров Н–форм (до взаимодействия с ионами меди) и Cu–форм (после взаимодействия) клеточных стенок, ХГК и хитина. В спектрах нативных клеточных стенок обоих грибов наблюдались полосы поглощения, соответствующие валентным (ν) и деформационным (δ) колебаниям следующих функциональных групп: 3380 – ν(OH…, NH…), 2930-2860 – ν(СН2), 1740 – ν(С=О), 1650 и 1600 (1550) – ν(С=О) и ν(NH) (первичных амидов), 1450-1400 – δ(СН2), 1315-1260 – δ(NН2) (вторичных амидов), 1150-1050 – δ(С-ОН) (полисахаридов). Взаимодействие с ионами меди приводило к уменьшению интенсивности поглощения и смещению в областях, соответствующих вторичным амидам 1570 и 1315 см-1 хитина, аналогично тому, что наблюдается в процессе связывания меди с хитином крабов координационной связью с образованием хелатных комплексов [12]. ИК-спектры Н– и Cu–форм депротеинизированных клеточных стенок, обработанных мочевиной, обнаруживают значительное сходство со спектрами хитозана, аминогруппы которого взаи- 380 модействуют с ионами меди по хелатному типу. В ИК-спектрах ХГК обоих грибов после контакта с ионами меди поглощение в области вторичных амидов (1570 и 1400-1375-1315 см-1) возрастает, а интенсивность полосы поглощения 1740 – ν(С=О) уменьшается, что может быть связано с наличием свободных карбоксильных групп, которые связываются с катионами меди по ионному типу с образованием карбоксилат-ионов. Сравнительный анализ ИК-спектров грибного хитина свидетельствует о наличии, кроме водородно-связанных групп NН… N, более сильной связи NН…О=С, повышающей степень кристалличности биополимера и снижающей его способность связывать ионы тяжелых металлов. Полученные результаты показывают, что взаимодействие ионов меди с грибными клеточными стенками и их структурными компонентами осуществляется посредством координационного взаимодействия между ионом металла и кислород- и азотсодержащими группами, а также ионной связи с карбоксильными группами. Заключение. Таким образом, сорбционная способность клеточных стенок и их структурных компонентов по отношению к ионам тяжелых металлов (кадмий, свинец, медь) возрастает в ряду: хитин – нативные клеточные стенки – депротеинизированные клеточные стенки – ХГК. На эффективность процесса сорбции и предпочтительность связывания металлов существенное влияние оказывает структура и состав клеточных стенок, а также соотношение глюкана и гетерогликана и хитина в ХГК. Удаление из клеточных стенок биополимеров аморфного матрикса (белки, щелочерастворимые гетерогликаны) повышает доступность для связывания сорбционно-активных центров микрофибрилл ХГК. Установлено, что взаимодействие ионов меди с клеточными стенками грибов и их структурными компонентами осуществляется посредством координационного взаимодействия между ионом металла и кислород- и азотсодержащими группами, а также ионной связи с карбоксильными группами. Список литературы 1 2 3 Кручинский, Н.Г. Природные энтеросорбенты в лечебно-профилактическом питании / Н.Г. Кручинский, А.Н. Петровский, З.В. Василенко, В.В. Редько // Рациональная политика здорового питания в Республике Беларусь: материалы Междунар. конф., Минск, 2001 г. / Минск, 2001. – С. 82–85. Щербин, А.А. Антацидные и сорбционные свойства грибного порошка из вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) / А.А. Щербин // Вопросы питания. – 1999. – Т. 68, № 5–6. – С. 23–25. Wasser, S.P. Dietary supplements from medicinal mushrooms: how we are going to ensure their quality and safety / S.P. Wasser, D. Sokolov, E. Nevo // Int. J. Med. 381 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mushrooms. – 2001. – Vol. 3, № 2–3. – P. 94. Терешина, Н.В. Различная способность полисахаридов клеточной стенки Aspergillus niger к сорбции металлов / Н.В. Терешина, А.П. Марьин, В.Н. Косяков // Прикл. биохим. и микробиол. – 1999. – Т. 35. – № 4. – С. 432−436. Yetis, U. The removal of Pb (II) by Phanerochaete chysosporium / U. Yetis, A. Dolek, F. Dilek B., G. Ozcengiz // Wat. Res. – 2000. – Vol. 34, № 16. – P. 4090–4100. Сорбция ионов переходных металлов и свинца на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52 / А.В. Иванов [и др.] // Вестник Московского университета. Химия. – 2003. – Т. 44, № 6. – С. 412–416. ГОСТ 4453-74(88) Уголь активированный осветляющий древесный порошкообразный, М.: Госстандарт, 1989. – 24 с. Машукова, Н.В. Сорбция катионов цинка, меди и кобальта отработанной биомассой и полисахаридным комплексом клеточных стенок Penicilliun chrysogenum / Н.В. Машукова, П.В. Миронов, С.Р. Лоскутов // Биотехнология. – 2004. – № 4. – С. 60–66. Nobel de, H. Cell wall maintance in fungi / H. Nobel de, H. Ende van den, F.M. Klis // Trends in Microbiology. – 2000. – Vol. 8, № 8. – P.344–345. Терешина, Н.В. Различная способность полисахаридов клеточной стенки Aspergillus niger к сорбции металлов / Н.В. Терешина, А.П. Марьин, В.Н. Косяков // Прикл. биохим. и микробиол. – 1999. – Т. 35. – № 4. – С. 432–436. Влияние условий обработки биомассы мицелиального гриба Aspergillus niger на надмолекулярную структуру и адсорбционные свойства выделяемого хитин-глюканового комплекса / З.А. Канарская [и др.] // Биотехнология. – 2000.– № 3. – С. 63–66. Muzzareli, R.A.A. Chitin / R.A.A.Muzzareli. – Oxford, New York: Pergamon Press.– P. 309. BINDING HEAVY METALS IONS WITH STRUCTURAL COMPONENTS OF BASIDIAL MUSHROOMS CELL WALLS ROVBEL N.M. Biodeterioration group The research of cell walls content for xylotrophic basidial mushrooms and the role of individual structural components in heavy metals binding allow to reveal chitinglucan complex dominating in the sorption process. It was revealed that treatment of mushroom cell walls with carbomide considerable increased accessible of chitin-glucan complex active centers for heavy metals binding. It was established that heavy metals binding by mycelium and its structural components realized by mean of coordination interaction between metal ions and oxygen-, nitrogen contained and carboxyl groups. 382 УДК 606:62 ВИДОВОЙ СОСТАВ МИКРОМИЦЕТОВ–ДЕСТУКТОРОВ БИОЦИДСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ Ровбель Н.М., Мицкевич А.Г., Гончарова И.А., Грек Д.С. группа по биоповреждениям Проведено выделение и идентификация грибов-биодестукторов из различных очагов плесневого поражения биоцидсодержащих природных и синтетических материалов, используемых в строительстве, реставрации и прикладном искусстве. Установлено, что наиболее часто исследованные материалы колонизируют микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus и Penicillium, менее чем из 20% проб выделены грибы родов Alternaria, Stemphillium, Paecilomyces, Cladosporium и Verticillium. Введение. Споры микромицетов, попавшие на поверхность различных природных и синтетических материалов, начинают развиваться, выделяя различные метаболиты (кислоты, ферменты и др.), что может вызывать повреждения субстрата. Известно, что легко доступными субстратами для развития микроорганизмов являются натуральные материалы, такие как бумага или кожа. Синтетические полимерные материалы более грибостойкие, однако, микромицеты способны к ним адаптироваться и со временем разрушать, используя компоненты субстрата в качестве источника питательных веществ и энергии. Помимо контаминации и поражения промышленных и строительных материалов микроорганизмы обладают потенциальной возможностью воздействовать на здоровье людей, вызывая аллергию, снижение защитных функций иммунной системы и разных форм микотоксикозов, особенно характерно для городской среды, где наблюдается рост числа аллергических заболеваний среди населения, проводящего значительную часть времени в закрытых помещениях [1, 2]. Рост и размножение плесневых грибов зависят от совокупности многих факторов: температуры, влажности, аэрации, кислотности среды. Оптимальный диапазон температур для развития микромицетов составляет 20−30 °С, при отклонении от него рост грибного мицелия замедляется, однако даже при температуре ниже 5 °С мицелий и споры грибов не погибают. Процессам биокоррозии материалов способствуют перепады температуры и относительной влажности воздуха, что в свою 383 очередь вызывают увлажнение конструкций и образование конденсата на их поверхности [3]. Для эффективной борьбы с плесневым поражением рекомендуется целая система мероприятий. Основным способом защиты от биоповреждений плесневыми грибами является введение в состав материалов различных биоцидных добавок. Поскольку абсолютно безопасных методов биоцидной обработки нет, их применение показано только в крайних случаях, если развитие грибов нельзя остановить иными более безопасными средствами (очисткой, ликвидацией источника инфекции, стабилизацией температурно-влажностного режима) [4]. Термин “биоциды” употребляется применительно к веществам, которые применяются для борьбы с разными биодеструкторами. Вместе с этим термином в литературе достаточно широко используются и термины “антисептик” и “дезинфектант”. Данная терминология, не конкретизирующая объект воздействия химического вещества вполне оправдана, так как часто препарат либо соединение активны против разных типов деструкторов, либо спектр их биологической активности изучен недостаточно [1, 4]. Ближайшие и отдаленные последствия влияния биоцидов на материалы, как правило, мало известны. До настоящего времени не разработаны надежные методы «ускоренного старения», которые были бы адекватны процессам натурального старения материалов. Следует учитывать, что негативное воздействие на объект могут вызвать растворители и присадки, которые входят в состав промышленных препаратов. Некоторые биоциды оказывают мутагенное действие на грибы, в результате которого могут появиться более активные биодеструкторы [5]. Степень проявления и многообразие «вторичных эффектов», возникающих в присутствии биоцидов, могут быть весьма существенными. Проблема адаптации микроорганизмов к биоцидсодержащим материалам как единственным источникам энергии, приобретает все большее значение в связи с санитарногигиеническим состоянием жилых и общественных помещений. Цель исследования – определение видового состава микромицетов-деструкторов биоцидсодержащих природных и синтетических материалов, используемых в строительстве, реставрации и прикладном искусстве, а также изучить особенности роста и развития выделенных штаммов в присутствие биоцидов. Объекты и методы исследования. В работе использовали грибы, выделенные из очагов плесневого поражения биоцидсодержащих строительных материалов, а также изделий из металла, керамики, древесины, текстиля, кожи и произведений живописи. Для первичной изоляции, поддержания в культуре и 384 идентификации микромицетов использовали агаризованные питательные среды: Чапека—Докса (г/л: глюкоза – 20,0, KH2PO4 – 0,7, K2HPO4 – 0,3, NaNO3 – 2,0, MgSO4 – 0,5, KCl – 0,5, FeSO4 – 0,01, агар-агар – 15,0) и пивное сусло (4 0Б). Культивирование осуществляли в чашках Петри при температуре 28 0С. Микромицеты выделяли из очагов поражения общепринятыми методами, в том числе: - рассев крошек и мелких фрагментов субстрата на поверхность питательной среды; - метод смыва с поверхности субстрата, последующего разведения полученной суспензии и посева на питательную среду; - метод селективной изоляции микроколониальных грибов с субстрата на питательную среду с помощью инъекционной иглы; - перенос на питательную среду структур грибов, выделенных с отпечатков с поверхности пораженного материала; - предварительная активация микромицетов на образцах во влажной камере с последующим переносом на питательную среду развивающихся пропагул грибов [6, 7]. Для определения видовой принадлежности культур пользовались определитель Domsch K.H. [8]. Степень доминирования видов в комплексе грибов рассчитывали, используя показатель частоты встречаемости. К доминирующим относили виды, встречаемость которых была выше 40%; к часто встречающимся − 20−40%, к редким видам − встречаемость ниже 20% [9]. Зону пигментации вокруг колоний определяли через 0 5−8 сут. культивирования при температуре 28 С как среднее значение двух измерений во взаимоперпендикулярных направлениях. Пигменты, образуемые культурами и выделяемые ими в среду, экстрагировали из среды водно-щелочным раствором (рН=9,0), экстракты анализировали спектрофотометрически в области 400−600 нм. Токсическое действие биоцида оценивали по подавлению роста колоний грибов через 7 и 14 сут. культивирования при 28 0С, используя формулу Эббота [10]: R = (c – t) • 100 / c, где R – подавление роста, %; c – средний диаметр колоний в контроле, мм; t – средний диаметр колоний в опыте, мм. Результаты и их обсуждение. Важным этапом изучения процессов биоповреждения биоцидсодержащих материалов является определение видового состава микромицетов, вызывающих деструктивные процессы в субстрате, и их их специфичность 385 по отношению к нему [11]. При микологическом обследовании жилых и производственных помещений, строящихся объектов, предметов, находящихся в условиях нерегулируемого температурно-влажностного режима, объектов музейного хранения и т.д. было отобрано больше 500 проб непосредственно из мест плесневого поражения. При высеве образцов в чашки Петри в абсолютном большинстве проб наблюдалось доминирование одной культуры. В 40% проб доминировали грибы рода Aspergillus, 32% – Penicillium, в 15,1% проб преодладали темноокрашенные грибы родов Alternaria, Cladosporium и Stemphillium, в 3% – Paecilomyces и Verticillium. Родовую принадлежность других изолятов установить не удалось. Известно, что грибы именно родов Cladosporium, Penicillium и Аspergillius формируют ядро микобиоты в жилых помещениях Москвы и Санкт-Петербурга [12, 13]. Из культур, выделенных из мест биоповреждения материалов, идентифицированных до вида, была составлена рабочая коллекции грибов-технофилов, включающая 61 штамм грибов, принадлежащих к 13 родам, 42 видам. По видовому разнообразию и встречаемости доминировали роды Aspergillus (17 видов) и Penicillium (11 видов), остальные рода представлены 1−2 видами (таблица 1). Родовую принадлежность остальных изолятов установить не удалось. Важной характеристикой грибов, вызывающих плесневое поражение биоцидсодержащих материалов, является скорость их роста. При этом большое значение имеет не только видовая, но и штаммовая специфичность микромицетов. Внутри одного вида могут встречаться штаммы узкой специализации, способные развиваться на материалах определенной химической природы. Показано, что такие некоторые штаммы Penicillium cyclopium, P. martensii, P. expancum, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. nidulans могут использовать биоциды как единственный источник азота и растут на голодных агаризованных средах, содержащих высокие концентрации (> 100мкг/мл) химического препарата [14]. Штаммы, представленные в рабочей коллекции, характеризовались низкой требовательностью к ростовым факторам. Скорость роста колоний, значительно варьирующая в зависимости от вида, на богатом ростовыми факторами сусло-агаре была лишь незначительно выше, чем на минимальной среде Чапека-Докса. Данный показатель для выделенных культур варьировал от 4 до 14 и от 2 до 12 мм/сут, соответственно. 386 Таблица 1 – Видовой состав микромицетов, выделенных очагов плесневого поражения биоцидсодержащих материалов Характеристика очагов биоповреждения Микроколонии в лаковой пленке Сажистые пятна на древесине Пятна в пленке лака, серый налет на бетоне Бурые пятна в лаке и налет на штукатурке Бурый налет на бетоне и пятна на древесине Пылящий налет на гипсокартоне Спороносящий мицелий на керамике Мицелий на деструктированной керамике Темные пятна на обработанной древесине Мицелий на утеплителе линолеума и бетоне Мицелиальный налет на древесине Темный налет на штукатурке и керамике Светлый налет на гипсокартоне Сине-зеленые пятна на металле Темные пятна в пленке лака Пятна на сыромятной коже Налет на биоогнеобработанной древесине Пигментные темные на живописи и обоях Поврежденная поверхность живописного лака Белый налет и пятна на музейной керамике Налет на керамике, обои с плесневым налетом Потемневшая древесина Черное образование в живописном лаке Черное пятно на штукатурке Темные пятна на древесине и лаке Красноватые пятна на обоях Черное пятно в живописном лаке Налет на биоогнеобработанной древесине Пятна на штукатурке и на живописи Зеленоватый налет на бетоне и керамике Отшелушивание краски Пятна на музейной коже Заплесневевшая кожа Мицелиальный налет на штукатурке и керамике Деструктурированный лак Зеленоватые пятна на белой керамике Мицелиальный налет на живописном лаке Розовые пятна на обоях Деструктурированный живописный лак Поверхностное шелушение керамики Штукатурка с высаливанием Паутинистый налет на бетоне Черные пятна на кирпичной стене Темные пятна на обоях Рыжие пятна на побелке 387 Гриб-биодеструктор Acremonium strictum Auerobasidium pullulans Alternaria alternata Alternaria oleacea Aspergillus awamory A. candidus A. сervinus A. clavatus A. flavus A. fumigatus A. glaucus A. niger A. niveus A. ornatus A. proliferans A. repens A. sclerotiorum A. sydowii A. unguis A. ustus A. versicolor Chaetomium globosum Cladosporium herbarum C. clаdosporioides C. elatum Fusarium oxysporum Macrosporium bifurcum Paecilomyces marguandii P. variotii Penicillium chrysogenum P. cyclopium P. decumbens P. jensenii P. funiculosum P. lanosum P. notatum P. paxilli P. рurpurogenum P. tardum P. verruculosum Trichoderma viride T. koningii Stemphillium piriforme S. verruculosum Verticillium lateritium Меланиногенез – одна из основных адаптивных неспецифических реакций микромицетов, играющих негативную роль в жизнедеятельности человека (патогены человека, фитопатогены, биодеструкторы и др.) и могут иметь общие механизмы адаптации к среде обитания. Пигменты обеспечивают устойчивость грибных клеток к различным стрессовым условиям, следовательно наличие в среде соединений с биоцидной активностью может стимулировать их синтез. Грибы, вызывающие плесневое поражение обработанных биоцидами материалов, в процессе развития образуют часто пигментные пятна желтого, красного, бурого и других цветов. Большинство пигментов, характерных для видов Aspergillus и Penicillium относят к эктопигментам, так как они окрашивают субстрат [15]. Оценка пигментирующей способности грибов на агаризованных средах представляет значительную сложность из-за неравномерности распределения в среде, отсутствием четких границ распространения и субъективности измерения интенсивности и т.д. Эти недостатки устраняет проведение щелочного гидролиза, переводящее среды в жидкое состояние и позволяющее использовать в качестве критерия интенсивности окрашивания оптическую плотность. Для изучения влияния биоцидов на медленно растущие грибов с высоким уровнем синтеза темных экзопигментов можно использовать непосредственное измерение ширины зоны пигментации вокруг колонии (таблица 2). Таблица 2 – Влияние бензалкониум хлорида на рост и пигментообразование A. proliferans SL-5 через 10 суток роста на среде ЧапекаДокса Концентрация биоцида, % 0 0,0001 0,0005 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 Диаметр колоний, мм 32 40 35 30 25 12 6 0 Ширина зоны пигментации, мм 3 3 4 7 16 20 13 0 Способность синтезировать экзопигменты выявлена у всех культур, выделенных с пораженной живописи, у 70% грибов, колонизировавших строительные материалы, у 50% микромицетов – деструкторов изделий из древесины. Способность выделять 388 черно-бурые, красно-коричневые и желтые пигменты проявлялась преимущественно на среде Чапека-Докса. У отдельных видов пигментообразующая способность варьировала в зависимости от штаммовой принадлежности. При культивировании на сусло-агаре пигментация среды была выражена в значительно меньшей степени. Микромицеты, проявляющие способность к резидентному заселению конструкционных материалов и оборудования, известны своими аллергическими и условно патогенными свойствами оппортунистических грибов. Результаты исследования свидетельствуют об экспансии подобных видов грибов, среди которых по частоте распространения лидируют Aspergillus fumigatus, A.versicolor, Penicillium chrysogenum [2, 12, 16]. Негативное влияние плесневых грибов на экологическую обстановку проявляется, в первую очередь, в их способности выделять в воздушную среду огромное количество спор [17]. Присутствие биоцидов может оказать значительное влияние на конидиеобразование: в одних случаях формирование спор замедляется, в других – усиливается. Было установлено, что низкие концентрации бензалкониум хлорида (0,0005%), не оказывающие заметного влияния на скорость роста гриба A. versicolor, способствуют стимуляции синтеза экзопигментов и более раннему и обильному спорообразованию, а также нарушению морфологии конидииеносцев и конидий. Таким образом, использование биоцидных препаратов, не вызывающих полное подавление роста грибов, может усилить негативные последствия плесневого поражения. Для разработки способов решения данной проблемы необходима предварительная оценка надежности и экологической безопасности биоцидных составов для антисептической обработки конкретных материалов с использованием тест-культур, выделенных из очагов биоповреждения. Заключение. Проведено выделение и идентификация грибов-биодестукторов из различных очагов плесневого поражения из природных и синтетических материалов (бетон, металл, керамика, древесина, бумага, текстиль, кожа и др.). Установлено, что наиболее часто колонизируют обследованные биоцидсодержащие природные и синтетические материалы микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus и Penicillium, в менее чем 20% проб доминировали грибы родов Alternaria, Stemphillium, Paecilomyces, Cladosporium и Verticillium. Культивирование выделенных грибов-деструкторов в присутствии биоцидных соединений вызывало у большинства культур увеличение длительности лаг-фазы, более раннее и обильное спорообразование, но со сниженнной 389 жизнеспособностью и скоростью прорастания спор, а также и усиление пигментообразования. Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Иванов, Ф.М. Биокоррозия неорганических строительных материалов / Ф.М. Иванов // Биоповреждения в строительстве: сб. науч. трудов / Стройиздат, под ред. Ф.М. Иванова, С.И. Горшина. – М., 1984. – С. 183–193. Иванова, А.М. Микромицеты в различных экосистемах Санкт-Петербурга / А.М. Иванова, И.Ю. Кирцидели // Грибы в природных и антропогенных экосистемах: тр. междунар. конф., посв. 100-летию начала работы проф. А.С.Бондарцева в Ботан. ин-те им. В.Л.Комарова РАН, Санкт-Петербург, 24– 28 апреля 2005 г. / Ботан. ин-т им. В.Л.Комарова РАН. – СПб, 2005.– Т. 1.– С. 227–231. Кондратюк, Т.А. Развитие микромицетов на произведениях станковой живописи / Т.А. Кондратюк, Н.Н. Жданова // Микология и фитопатология.– 2002. – Т. 36, вып. 2. – С. 53–58. Скороходов, В.Д. Защита неметаллических строительных материалов от биокоррозии: учеб. пособие для системы доп. образования / В.Д. Скороходов, С.И. Шестакова. – М.: Высшая школа, 2004. – 204 с. Герасименко А.А. Защита машин от биоповреждений / А.А. Герасименко. – М.: Машиностроение, 1984.– 112 с. Коваль, Э.З. Микодеструкторы промышленных материалов / Э.З. Коваль, Л.П. Сидоренко; отв. ред. В.И. Билай. – Киев: Наукова думка, 1989. – 190 с. Власов, Д.Ю. Микобиота каменистого субстрата в городской среде / Д.Ю. Власов, М.С. Зеленская, Е.В. Сафронова // Микология и фитопатология. – 2004. – Т.38, вып. 4. – С. 13–22. Domsch, K.H. Compendium of soil fungi / K.H. Domsch, W. Gams, T.H. Anderson. – London: Acad.Press., 1980.– Vol. 1.– 859 p. Петрова-Никитина, А.Д. Микобиота домашней пыли г. Москвы / А.Д. ПетроваНикитина и [др.] // Микол. и фитопатол.– 2000.– Т. 34, № 3.– С. 25–33. Abbott, W.S. A method for computing the effectiveness of an insecticide / W.S. Abbott // Journal of Economic Entomology. – 1925. – Vol. 18. – Р. 265–267. Новикова, Г.М. Особенности выделения и культивирования микромицетов, поражающих музейную керамику / Г.М.Новикова, Э.З.Коваль // Выделение, идентификация и культивирование микромицетов и других микроорганизмов: сб. науч. Трудов / Вильнюс: АН ЛитССР. – 1990. – С. 106–110. Богомолова, Т.С. Микобиота некоторых жилых помещений в г. СанктПетербурге и Ленинградской области / Т.С. Богомолова, Н.В. Васильева, Г.И. Горшкова // Проблемы медицинской микологии. – 1999. – № 3.– С. 41–42. Антропова, А.Б. Аэромикота жилых помещений г.Москвы. / А.Б. Антропова и [др.] // Микол.и фитопатол. – 2003. – Т. 37, вып. 6. – С. 1–11. Харченко, С.Н. Влияние антропогенных факторов на видовой состав и токсикогенный потенциал микобиоты кормов / С.Н.Харченко // Грибы в природных и антропогенных экосистемах: тр. междунар. конф., посв. 100-летию начала работы проф. А.С.Бондарцева в Ботан. ин-те им. В.Л.Комарова РАН, СанктПетербург, 24–28 апреля 2005 г. / Ботан. ин-т им. В.Л.Комарова РАН; под. ред. М.А.Бондарцевой. – СПб, 2005. – Т. 2. – С. 277–280. Марчева, Р.Д. Целлюлазная активность темноокрашенных микромицетов, повреждающих документы на бумажной основе / Р.Д.Марчева // Микол. и фитопатол.– 1985. – Т. 19, Вып. 2. – С. 135–138. 390 16 17 Геворкян, С.А. Распространение оппортунистических грибов в микробиоте биоповреждений полимеров космической техники / С.А.Геворкян и [др.] // Успехи мед микологии. – 2005. – Т. 5, гл. 3. – С. 58–60. Марфенина, О.Е. Антропогенная экология почвенных грибов / О.Е. Марфенина. – М.: Медицина для всех, 2005. – 196 с. SPECIES COMPOSITION OF MYCROMYCETES–BIODESTRUCTORS OF BIOCIDE-CONTAINING MATERIALS ROVBEL N.M., MICKEVICH A.G., GONTCHAROVA I.A., GREK D.S. Biodeterioration group It was carried out isolation and identification fungi-biodestructors from different sites of mouldy damaged biocide-contained natural and artificial materials used in constructio, restoration and applied art. It was revealed that materials are more often colonizated by micromycetes belong to genera Aspergillus и Penicillium, fungi genera Alternaria, Stemphillium, Paecilomyces, Cladosporium and Verticillium was isolated from 20% samples. УДК 606:62 ДЕЙСТВИЕ СУЛЬФАТА МЕДИ НА РОСТ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS NIGER Гончарова И.А., Грек Д.С., Ровбель Н.М. группа по биоповреждениям В условиях глубинного и поверхностного культивирования изучено действие медного купороса на рост микромицета Aspergillus niger, выделенного из очага плесневого поражения. Установлено, что при посеве спорами чувствительность гриба к токсическому действию биоцида выше, чем при использовании в качестве посевного материала вегетативного мицелия. Присутствие сульфата меди стимулирует синтез меланина, связывающего ионы металла. Снижение концентрации ионов меди в среде способствует ускорению роста мицелия и усилению повреждающей способности гриба. Введение. Плесневые грибы, к которым относят микромицеты, способные использовать в качестве источников питания различные природные и промышленные, составляют существенную часть биоты жилых помещений, содержась преимущественно в воздухе и домашней пыли [1]. В условиях повышенной влажности помещений грибы колонизуют строительные материалы, вызывая их функциональную деградацию. Выявлено, что основным фактором, влияющим на рост плесневых грибов, является относительная влажность воздуха и активность влаги, температура и кислотность среды имеют второстепенное значение. Споры неко- 391 торых микромицетов при достаточной влажности способны уже через 1 час прорастать на новых бумажных обоях, через сутки наблюдается развитие мицелия и споруляция, в течение недели вся поверхность стены может быть поражена грибами [2]. Люди, длительное время находящиеся в помещениях, колонизированных оппортунистическими (потенциально патогенными) грибами, подвергаются опасности развития заболеваний, объединенных под общим названием «синдром больных зданий» (sick building syndrome). Серьезную опасность для здоровья и жизни человека представляет аспергиллез, вызываемый грибами рода Aspergillus, составляющими, как правило, значительную часть аэромикофлоры жилых помещений [3]. Известно, что в носовой полости и носоглотке задерживаются частицы размером более 50 мкм, частицы диаметром 30−50 мкм проникают в трахею, 10−30 мкм − в бронхи, 3−10 мкм − в бронхиолы и 1−3 мкм в альвеолы. Конидии многих грибов рода Aspergillus имеют размеры от 0,5 до 3 мкм и более, и, благодаря, этому проникают до самых отдаленных участков бронхиального дерева, включая и область альвеол A. fumigatus 2,5−3,0 мкм, A. niger 2,5−4,0 мкм, [4]. Для борьбы с плесневым поражением зданий рекомендуется целая система мероприятий, включающая наряду с устранением источника сырости применение химических средств защиты (фунгицидов) [5]. Однако, выбор эффективного средства для подавления роста плесени, несмотря на кажущееся разнообразие препаратов в торговой сети, является довольно сложной проблемой. Так как большинство традиционных биоцидных композиций запрещено к применению в связи высокой токсичностью, многие современные коммерческие составы, часто не только не обеспечивают ликвидацию очагов биоповреждения, но иногда даже усугубляют ситуацию. Известно, что под действием биоцидов возможно не только ингибирование, но и стимуляция синтеза таких «агрессивных» метаболитов, как органические кислоты, ферменты, эфиры, алкалоиды и др. Степень проявления и многообразие «вторичных эффектов» могут быть весьма существенными, поэтому их необходимо учитывать при оценке эффективности биозащитных препаратов и выборе области их использования. В связи с тем, что в настоящее время в Беларуси отсутствуют научно обоснованные нормативные документы по применению антисептиков в строительной отрасли, работники строительных организаций и учреждений жилищно-коммунального хозяйства до настоящего времени широко применяют традиционные сельскохозяйственные фунгициды, в первую очередь медный ку- 392 порос (сульфат меди), хотя достижения желаемого эффекта при этом, как правило, не наблюдается. При повторной колонизации микроскопическими грибами строительных материалов, обработанных сульфатом меди, доминирующее положение обычно занимают грибы рода Aspergillus, наиболее часто Aspergillus niger. Ранее отмечалось, что при внесении высоких доз солей меди в дерново-подзолистые почвы северных широт, микобиота которых характеризуется преобладанием видов рода Penicillium, появляются специфические для данных экологических условий комплексы микромицетов, отличающиеся высокой частотой встречаемости видов рода Aspergillus [6]. В условиях модельных экспериментов в Ленинградской области, проведенных Е.В. Лебедевой с соавт., в почвах с высоким содержанием сульфата меди также наблюдалась стимуляция развития грибов рода Aspergillus, группы не типичной для почв Северо-Западного региона России. В структуре комплекса микромицетов медьсодержащих почв отчетливо доминировали опасные для здоровья людей грибы A.fumigatus и A.flavus, практически отсутствовавшие как в «естественных почвах», так и в контроле модельного эксперимента [7]. Выяснение причин повышенной резистентности к меди представителей рода Aspergillus является важной экологической задачей. Цель исследования – изучение влияние различных концентраций сульфата меди на рост одного из наиболее распространенных оппортунистических грибов Aspergillus niger van Tiegh. Объекты и методы исследования. В работе использован штамм гриба A.niger из рабочей коллекции группы по биоповреждениям Института микробиологии НАН Беларуси, который был выделен из обширной колонии, развившейся на древесине, обработанной медным купоросом. Культура поддерживалась на стандартной среде Чапека. Глубинное культивирование гриба осуществляли в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл с 50 мл среды Чапека на лотковой качалке (180−200 об/мин) при температуре 26 °С в течение 7 сут, поверхностное – на агаризованной среде Чапека в чашках Петри (d 90 мм) при температуре 28 °С. Сульфат меди вносили в расчетных количествах из 0,5%-ного стерильного раствора в жидкую среду непосредственно перед посевом, в агаризованную – перед разливом в чашки Петри. Посевным материалом служила суспензия спор 10 суточной поверхностной культуры или пеллеты трехсуточной глубинной культуры. Выход биомассы и количество в ней меланина определяли весовым методом после высушивания до постоянной 393 массы при температуре 90 °С. Экстракцию меланина проводили 2%-ным раствором NaOH с коэффициентом разбавления 1:10 в течение 2-х часов на кипящей водяной бане. Полученный экстракт охлаждали, подкисляли до рН=2,0 концентрированной HСl и коагулировавший пигмент отделяли центрифугированием при 6000g в течение 15 мин. Содержание меланина в среде культивирования определяли прямым фотометрированием на фотоэлектрокалориметре КФК- 2МП (Россия) при длине волны 490 нм. Кислотность среды измеряли с помощью иономера И-160 1МП (Беларусь). Сорбцию ионов меди из 0,1 н раствора CuSO4 оценивали методом комплексометрического титрования 0,1 н раствором Na2ЭДТА (трилон Б) в присутствии индикатора мурексида. Сорбционную ёмкость (СОЕ) рассчитывали по формуле: S= (Сi-Cs)V/m, где S − сорбционная ёмкость, мг-экв/г, Сi − концентрация исходного раствора, мг-экв/л, Cs − концентрация раствора после сорбции, мг-экв/л, V − объём пробы, л, m − масса навески, г. Результаты и их обсуждение. Наибольшая интенсивность колонизации микромицетами штукатурки, краски и других строительных материалов возникает при распространении вегетативного мицелия из очагов плесневого поражения, содержащих легкодоступные источники питания (натуральные клеи, загрязнения и т.д.). В то же время в экспериментальной работе при изучении действия биоцидов на жизнедеятельность грибов посевным материалом служат обычно споры, при использовании которых легко достигается стандартизация инокулята. Получение гифальной биомассы, не содержащей спорового материала, обеспечивает глубинное культивирование грибов. Для A.niger характерен пеллетный рост глубинного мицелия. Известно, что пеллеты данной культуры образуются по коагуляционному типу, при котором формирование пеллет происходит при любой концентрации конидий за счет их коагуляции на ранних стадиях развития [8]. В данном исследовании в качестве посевного материала были использованы как суспензия спор A.niger , так и мицелий гриба в виде пеллет глубинной культуры. Сравнительное изучение действия различных концентраций сульфата меди на рост колоний A.niger показало, что замена спорового инокулюма на активно растущий мицелий не только значительно ускоряет рост на ранних стадиях развития, но и повышает устойчивость гриба к токсическому действию биоцида. При посеве спорами концентрационнозависимое торможение роста A.niger наблюдалось в первые трое суток культивиро- 394 вания при всех исследованных концентрациях сульфата меди, и лишь затем происходила интенсификация радиального роста колоний в вариантах с содержанием CuSO4 0,001–0,005 %. Полное ингибирование роста наблюдалось при концентрациях биоцида выше 0,05% (таблица 1). Таблица 1 – Рост колоний A.niger на агаризованной среде Чапека с различным содержанием сульфата меди при посеве спорами Концентрация CuSO4, % 0 0,0010 0,0050 0,0075 0,010 0,025 0,050 0,075 2 сут 6,3 4,1 3,2 2,5 0 0 0 0 Среднее значение радиуса колоний, мм 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 14 сут 21 сут 10,8 22,3 33,6 44,5 45,0 45,0 8,3 28,7 41,6 45,0 45,0 45,0 6,2 26,3 42,2 45,0 45,0 45,0 5,4 22,0 28,4 34,6 45,0 45,0 2,6 5,8 10,6 16,5 28,2 39,6 0,5 1,4 4,3 9,0 15,5 26,7 0 0 0,5 1,0 7,8 12,4 0 0 0 0 0 0 Инокуляция агаризованной среды пеллетами ослабляла эффект зависимости лаг-фазы от содержания ионов меди, уже на вторые сутки инкубации проявлялась стимуляция роста низкими концентрациями биоцида (0,001-0,0075 %). Способность гриба к активному росту, несмотря на длительный лаг-период (10 сут), сохранялась даже при внесении в среду 0,1% сульфата меди (таблица 2). Таблица 2 – Рост колоний A.niger на агаризованной среде Чапека с различным содержанием сульфата меди при посеве пеллетами Концентрация CuSO4, % 0 0,0010 0,0050 0,0075 0,010 0,025 0,050 0,075 0,100 2 сут 13,7 14,1 15,3 14,8 13,4 5,8 0 0 0 Среднее значение радиуса колоний, мм 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 14 сут 21 сут 20,2 33,4 40,3 45,0 45,0 45,0 20,7 33,9 40,8 45,0 45,0 45,0 25,1 32,7 41,5 45,0 45,0 45,0 23,3 31,9 40,0 44,6 45,0 45,0 21,6 28,5 36,8 42,6 45,0 45,0 15,7 21,4 28,3 32,7 45,0 45,0 0,5 2,2 5,1 10,5 41,6 45,0 0 0 2,7 5,0 27,5 43,8 0 0 0 0 22,8 40,2 В условиях глубинного культивирования выявлены аналогичные закономерности (таблица 3). 395 Таблица 3 – Рост и пигментация A.niger в жидкой среде Чапека с различным содержанием сульфата меди при посеве спорами и пеллетами Концентрация CuSO4, % 0 0,0010 0,0025 0,0050 0,0075 0,0100 Конечный рН споры 2,6 2,6 2,6 2,6 4,5 4,7 пеллеты 2,5 2,5 2,4 2,6 3,8 3,9 Биомасса, г/л споры пеллеты 7,5 7,1 6,8 7,6 5,9 8,0 5,4 7,4 3,7 6,2 0,1 1,9 Пигментация пеллет споры пеллеты – ± ± ++ + ++ ++ +++ +++ + +++ + На среде с 0,001−0,0075% CuSO4 при посеве пеллетами выход биомассы был выше, чем в контроле, а при посеве спорами в изученном диапазоне концентраций сульфата меди стимулирующий эффект не проявлялся. В жидкой среде более заметно проявлялось влияние сульфата меди на пигментацию мицелия (таблица 3). Пеллеты гриба, сформировавшиеся при прорастании спор, имели различное строение в зависимости от концентрации биоцида. В контроле пеллеты были гладкие и пустотелые, в присутствии ионов меди – ворсистые, имеющие компактный центр и более рыхлый наружный слой. Чем выше была концентрация сульфата меди, тем больше был средний диаметр пеллет (рисунок 1). В присутствии экстремально высоких концентраций меди пеллеты не формировались, а биомасса состояла из бесформенных гифальных скоплений. В вариантах инокуляции питательной среды мелкими пеллетами (диаметр 1,5−1,8 мм) в зоне стимуляции выхода биомассы средний диаметр пеллет был выше, чем в контроле, в зоне ингибирования – ниже (см. рисунок 1). Вид пеллет в разрезе отличался большой вариабельностью в зависимости от содержания ионов меди в среде, что наиболее заметно проявлялось при посеве вегетативным мицелием. В контроле вокруг инокулята формировались пустотелые пеллеты из светлого компактного мицелия. На среде с низким содержанием ионов меди (0,001%) центральная область пеллет приобретала черно-коричневую окраску с четко выраженной концентрической зональностью, рыхлая переферическая часть оставалась бесцветной. С увеличением концентрации меди в среде внутренняя темноокрашенная область расширялась и 396 происходило накопление пигмента на внешней стороне пеллет (рисунок 2). D,мм 8 6 4 2 0 0 0,001 0,0025 0,005 0,0075 0,01 концентрация споры пелеты Рисунок 1 – Средний диаметр пеллет A.niger через 7 сут культивирования в жидкой среде Чапека с разным содержанием сульфата меди при посеве спорами и пеллетами Контроль 0,001 % CuSO4 0,005 % CuSO4 Рисунок 2 – Вид в разрезе пеллет гриба A.niger через 7 сут культивирования в жидкой среде Чапека с разным содержанием сульфата меди при посеве пеллетами Способность биоцидных препаратов оказывать значительное влияние на процессы биосинтеза окрашенных метаболитов хорошо известна [9]. Считается, что на средах с фунгицидами субстратный мицелий и среда окрашиваются более интенсивно, чем в оптимальных условиях, независимо от вида грибов и химической природы фунгицида. При этом усиливается вариабельность в окраске, хотя изменения касаются главным образом интенсивности окрашивания без принципиального изменения цвета [10]. 397 Синтез черно-коричневых пигментов является одной из основных адаптивных неспецифических реакций микромицетов, обеспечивающих устойчивость грибных клеток в состоянии стресса при возникновении неблагоприятных жизненных условий [11]. Протекторная функция меланинов детерминируется их физико-химическими свойствами и локализацией в поверхностных структурах на границе контакта организма со средой. У гриба A.niger меланиновые пигменты могут составлять значительную часть их массы: до 10% от массы мицелия и 28% от массы конидий [11]. Ферменты фенолоксидазного комплекса грибов, ответственные за синтез предшественников меланина, являются медьзависимыми и нуждаются в присутствии в среде ионов меди [12]. Изучение динамики роста биомассы A.niger и содержания в ней меланина в процессе культивирования в жидкой среде Чапека с 0,005 % сульфата меди показало, что накопление меланина в биомассе происходит в период активного роста гриба, значительно снижаясь при переходе культуры в стационарную фазу (рисунок 3). Снижение содержания меланина в мицелии сопровождалось потемнением среды и повышением ее оптической плотности среды (с 0,012 на 6 сут до 0,046 на 10 сут), вероятно, за счет выхода пигмента в окружающую среду. г/л 8 % 16 6 12 4 8 2 4 0 0 0 2 4 6 8 10 12 сут. Рисунок 3 – Динамика роста биомассы (––), г/л, и содержания в ней меланина ( - - ), %, в процессе культивирования A.niger в жидкой среде Чапека с 0,005 % сульфата меди (■) и без него (□) при посеве пеллетами Большинство грибных культур, выделенных из экониш, испытывающих хронический стресс в результате действия тяжелых 398 металлов, как правило, содержат в своей биомассе чернокоричневые пигменты [13]. Есть все основания полагать, что преимущественное развитие меланизированных культур в районах техногенного загрязнения в значительной мере связано с широкими протекторными свойствами меланина, включающими высокую способность связывать ионы металлов [14]. По сорбционным свойствам выявлены заметные различия между темнопигментированными штаммами и апигментными мутантами тех же видов [15]. Значительное влияние на процессы извлечения ионов тяжелых металлов из растворов оказывает кислотность среды, определяющая состояние, как металла, так и сорбента. В щелочных или нейтральных растворах большинство металлов выпадает в осадок, в растворах с высокой кислотностью большое количество + + Н и Н30 конкурирует с катионами металлов за центры связывания. Эффективность сорбции тяжелых металлов меланином и темноокрашенной грибной биомассой, как правило, возрастает по мере приближения кислотности растворов к нейтральной области [16]. Гриб A.niger в процессе роста на среде с относительно низким содержанием ионов меди значительно подкислял питательную среду, снижая ее рН с 6,0 до 2,4–2,6. Сравнительная оценка сорбционной способности по отношению к ионам меди биомассы с содержанием меланина 14% и чистого пигмента при различном рН показала, что в диапазоне высокой кислотности среды пигментированная биомасса связывает медь более активно, чем чистый пигмент, при рН выше 3,5 – данный параметр у чистого меланина был выше, чем у мицелия (рисунок 4). Таким образом, сорбция ионов меди пигментированной биомассой и чистыми меланинами может играть значительную роль в снижении токсичности среды в широком диапазоне кислотности среды. Проведенные исследования показали, что высокая встречаемость Aspergillus niger в очагах плесневения строительных материалов, обработанных ранее медным купоросам, может быть обусловлена способностью микромицета к синтезу меланина, способного связывать ионы меди. Интенсификация биосинтеза пигментов под действием фунгицида является фактором, усугубляющим негативные последствия плесневого поражения материалов. 399 100 иии мг/г 75 50 25 0 1 2 3 4 5 рН 6 Рисунок 4 – Сорбционная емкости биомассы (□) и меланина (■) A.niger по отношению к ионам меди в зависимости от рН среды Список литературы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Антонов, В.Б. Микозы и микогенная аллергия как антропогенно-очаговые заболевания / В. Б. Антонов // Успехи медицинской микологии: материалы III Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 24–25 марта, 2005 г. / М., 2005. – Т. 5. – С. 54–56. Cooley, J.D.Correlation between the prevalence of certain fungi and sick building syndrome / J. D. Cooley [et al] // Occup. Environ. Medicine. – 1998. – Vol. 55, № 9. – P. 579–584. Соболев, А.В. Значение микромицетов в патологии легких у человека / А.В. Соболев // Проблемы медицинской микологии. – 1999. – Т. 1. № 3.– C. 4–9. Скороходов, В.Д. Защита неметаллических строительных материалов от биокоррозии: учеб. пособие для системы доп. образования / В.Д. Скороходов, С.И. Шестакова. – М.: Высшая школа, 2004. – 204 с. Сухаревич, В.И. Влияние биоцидов различной химической природы на синтез пигментов у целлюлозоразрушающих грибов / В.И. Сухаревич, Т.В. Зайцева, Н.Г. Медведева // Микол. и фитопатол. – 2000. – Т. 34, Вып. 3. – С. 39–42. Лебедева, Е.В. Влияние возрастающих концентраций меди на почвенные микромицеты / Е.В. Лебедева и [др.] // Микол. и фитопатол. 1999. – Т. 33, № 4. – С. 257–263. Metz, B. The growth of molds in the form of pellets / B. Metz, N. W. F. Kossen // Biotechnology and bioengineering.– 1977.–Vol.19.– P. 781-799. Butler, M.J. Fungal melanins: a review / M.J. Butler, A.W. Day // Can. J. Microbiol. – 1998. – Vol. 44. – P. 1115–1136. Лях, С.П. Микробный меланиногенез и его функции / С.П. Лях; под ред. А.А. Имшенецкий. – М.: Наука, 1981. – 273 с. Carley, N.E. Inhibition of pigmentation in Aspergillus niger by dimethylsulphoxid / N.E. Carley, R.D. Watson, D.M. Huber // Can. J. Bot. – 1967. – Vol. 45. – № 8 – P. 1451–1453. 400 11 12 13 14 15 16 Сухаревич, В.И. Рост микромицетов и синтез пигментов на средах, содержащих фунгициды и ингибиторы пигментообразования / Сухаревич В.И. и [др.] // Микол. и фитопатол. – 2000. – Т. 42, № 3. – С. 43–47. Жданова, Н.Н. Особенности микобиоты загрязнённых радионуклидами почв зоны влияния ЧАЭС / Н.Н. Жданова, А.И. Василевская, В.А. Захарченко // Мiкробiол. ж. – 1994. – Т. 56, № 2. – С. 68. Brakhage, A. Melanin biosynthesis and virulence of Aspergillus fumigatus / A. Brakhage [et al] // Human fungal pathogens: fungal dimorphism and disease: Proc. Res. Conf., Granada, Spain, 4–8 Sept., 1999 / Granada, 1999. – P. 17. Прохорова, Н.В. Влияние тяжелых металлов на рост и развитие грибов рода Alternaria / Прохорова Н.В., Панкратов Т.А., Студнева Т.А. // Успехи медицинской микологии: материалы II Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва, 24–25 марта 2004 г. / М., 2004. – Т. 3. – С. 37–39. Gadd, G.M. Interaction of fungi with toxic metals / G.M. Gadd // New Рhytol.– 1993. – Vol. 124.– P. 25–60. Fogarty, R.V. Fungal melanins and their interaction with metals / R.V. Fogarty, J.M. Tobin // Enzyme and Microbial Technology. – 1996. – Vol. 19, № 4. – P. 311– 317. INFLUENCE OF COPPER SULPHATE ON MICROMYCETE ASPERGILLUS NIGER GROWTH. GONTCHAROVA I.A., GREK D.S., ROVBEL N.M. Biodeterioration group Influence of copper sulphate on micromycete Aspergillus niger growth eliminated from а moulded place in conditions of submerged and surface cultivation was studied. It was shown that colonization of materials treated with copper sulphate by A. niger due to its ability of melanin synthesis and excretion to the environment. Copper ions binding by melanin decreases their concentration in the medium and protects fungi from copper toxicity. 401 Научное издание МИКРОБНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Сборник научных трудов Основан в 2007 году Том 1 Ответственный за выпуск А.Ю. Ерош 1 Подписано в печать 04.12.2007 г. Формат 60х84 /16. Бумага офсетная. Гарнитура Ариал. Офсетная печать. Усл. печ. л. 26,92. Уч.-изд. л. 22,67. Тираж 150 экз. Заказ № 1136. Издатель И. П. Логвинов ЛП № 02330/013307 от 30.04.2004 г. 220050, г. Минск, пр-т Независимости, 19/5 logvinovpress@mail.ru Типография ОДО «НовоПринт» ЛП 02330/0056647 от 27.03.2004 г. 220047, г. Минск, ул. Купревича, 2.
