Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва» Медицинский институт Кафедра иммунологии, микробиологии и вирусологии Л. В. МАТВЕЕВА, Л. В. НОВИКОВА ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие Саранск 2016 УДК 61:001.4:612.017.1 ББК Р58 М 333 Рецензенты: кафедра нормальной и патологической физиологии с курсом гигиены; доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней с курсами эпидемиологии, фтизиатрии, кожных и венерических болезней В.Ф. Павелкина М 333 Матвеева Л. В. Общая микробиология : учебное пособие / Л. В. Матвеева, Л. В. Новикова. – Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 2016. – 88 с. ISBN 978-5-7103Учебное пособие подготовлено в соответствии с учебной программой по микробиологии, вирусологии - микробиологии полости рта для студентов медицинских вузов и посвящено изучению раздела «Общая микробиология». Пособие содержит основные и дополнительные сведения по морфологии, физиологии, генетике микроорганизмов, общим принципам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний человека, дезинфекции, стерилизации. Материал изложен по определенным темам, имеет стройную концепцию. В конце каждой темы содержатся вопросы для самоконтроля. В пособии имеются список сокращений, список рекомендованной литературы. Для лучшего усвоения материала в пособие включены ситуационные задачи и тестовый контроль. Предназначено для студентов медицинских вузов специальности «Стоматология». Учебное пособие Издается по решению Учебно-методической комиссии Медицинского института ФГБОУ ВО «НИ МГУ им. Н. П. Огарёва» СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ А+Т Г+Ц ДНК ИФА КС ЛПС МПА МПБ НК ОВП ПГ – антиген – аденин+тиамин – гуанин+цитозин – дезоксирибонуклеиновая кислота – иммуноферментный анализ – клеточная стенка – липополисахарид – мясо-пептонный агар – мясо-пептонный бульон – нуклеиновая кислота – окислительно-восстановительный потенциал – пептидогликан ПСО – предстерилизационная очистка ПЦР – полимеразная цепная реакция РИФ – реакция иммунофлюоресценции РНК – рибонуклеиновая кислота РСК – реакция связывания комплемента РТ – ретикулярное тельце ЦПМ – цитоплазматическая мембрана ЭПР – эндоплазматический ретикулум ЭТ – элементарное тельц Hfr-клетки – клетки с высокой рекомбинативной активностью – иммуноглобулин Ig – константа седиментации S © Л.В. Матвеева, Л.В. Новикова, 2016 © Оформление. Издательство Мордовского университета, 2016 2 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Тема 1. ЗНАЧЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИИ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ. КЛАССИФИКАЦИЯ, МОРФОЛОГИЯ, МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ Микроорганизмы – мельчайшие живые существа, не различимые невооруженным глазом. В открытии и изучении морфологии и жизнедеятельности микробов участвовали множество иностранных и отечественных ученых. В развитии микробиологии как науки можно выделить пять периодов: эвристический, морфологический, физиологический, иммунологический, молекулярно-генетический. Эвристический период ведет отчет с III–IV века до нашей эры с предположения Гиппократа об участии невидимых веществ («миазм») в распространении болезней среди людей. В ХV–ХVI в.в. итальянский врач Д. Фракасторо обосновал способность «живых контагий»передавать болезни через воздух или предметы. Морфологический период начинается с конца ХVII – начала ХVIII, когда голландский натуралист Антоний ван Левенгук первым увидел и описал шаровидные, палочковидные и извитые микробы (анималькули) в зубном налете, крови, испражнениях, воде при помощи отшлифованных стекол с увеличением до 300 раз. Дмитрий Иосифович Ивановский в 1892 г. выявил возбудителя мозаичной болезни табака – мельчайшие частицы, способные проходить через бактериальные фильтры и вызывать специфические поражения, что стало началом вирусологии. Этот период создал условие для перехода к следующему, физиологическому, этапу в развитии микробиологии (с середины ХIХ в.). Французский ученый-химик Луи Пастер изучил брожение, открыл явление анаэробиоза, предложил для уничтожения бактерий нагревать напитки до 50-60 °С (пастеризация), разработал принципы асептики, дезинфекции, стерилизации, вакцинации, методы снижения (аттенуации) вирулентности микробов, открыл стафилококки, стрептококки, предложил методы получения вакцин против сибирской язвы, бешенства. Немецкий ученый Роберт Кох впервые предложил плотные питательные среды (мясо-пептонный желатин и мясо-пептонный агар) для выделения чистой культуры микробов, триаду признаков для доказательства роли бактерий в развитии инфекционного заболевания, разработал методы окраски микроорганизмов анилиновыми красителями, применил иммерсионную микроскопию, обосновал теорию и практику дезинфекции, выявил возбудителей сибирской язвы, туберкулеза, холеры человека, получил туберкулин. С. Н. Виноградский разработал накопительные питательные среды, выделил и изучил азотфиксирующие и нитрифицирующие бактерии почвы, установил роль микробов в круговороте азота, углерода, фосфора, железа и серы; впервые доказал существование бактерий, самостоятельно синтезирующих органические вещества, что позволило открыть новый тип питания микробов – аутотрофизм. 3 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Иммунологический период начинается с применения английским врачом Эдуардом Дженнером пустул больного коровьей оспой для создания невосприимчивости здорового человека к вирусу. Илья Ильич Мечников создал фагоцитарную теорию иммунитета (Нобелевская премия в 1908 г.), раскрыл сущность воспаления как защитной реакции организма, исследовал патогенез холеры человека, сифилиса, туберкулеза, возвратного тифа, явился основоположником учения о микробном антагонизме, ставшем основой для развития науки об антибиотикотерапии, предлагал для достижения долголетия использовать молочнокислые бактерии. Пауль Эрлих обосновал важную роль антител в иммунном ответе и предложил гуморальную теорию иммунитета (Нобелевская премия в 1908 г.). Н. Ф. Гамалея изучал инфекции и иммунитет, изменчивость бактерий, профилактику сыпного тифа, холеры, туберкулеза и других болезней, впервые (в 1898 г.) наблюдал и описал явление спонтанного лизиса бактерий под влиянием неизвестного в то время агента – бактериофага, ввел в практику прививки против бешенства. Г. Н. Габричевский в 1895 г. создал в Москве первый бактериологический институт, изготавливал и ввел во врачебную практику противодифтерийную сыворотку, установил значение гемолитического стрептококка как возбудителя скарлатины, изучал свойства и роль кишечной палочки в патологии человека. А. М. Безредка создал учение о местном иммунитете, разработал метод постепенного (дробного) введения лечебных сывороток для предупреждения нежелательных анафилактических реакций – принцип десенсибилизации. Д. К. Заболотный выявил пути заражения и распространения чумы, изучал методы иммунизации против этой болезни. Совместно с И. Г. Савченко провел героический опыт самозаражения холерой для выяснения возможности создания невосприимчивости к холере после приема энтеральной вакцины из убитых холерных вибрионов. Молекулярно-генетический период начинается во 2-й половине ХХ в., когда с помощью методов молекулярной биологии, генетики, генной и белковой инженерии, цитологии были расшифрованы молекулярная структура, состав генома многих бактерий, вирусов, факторов их патогенности, иммунных защитных факторов, синтезированы рекомбинантные ДНК для разработки вакцин, диагностических и лечебных препаратов на основе моноклональных антител. В настоящее время достаточно широко применяется генодиагностика инфекционных заболеваний, разрабатывается генопрофилактика и генотерапия иммунодефицитов. Открытие системы гистосовместимости позволило глубже раскрыть механизмы иммунного реагирования на антигены микроорганизмов. Микробиология – наука о строении, жизнедеятельности и экологии микроорганизмов – мельчайших форм жизни, не видимых невооруженным глазом (менее 0,1 мм). 4 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Медицинская микробиология тесно связана с биологией, биохимией, иммунологией, нормальной и патологической анатомией, физиологией, стоматологией, эпидемиологией, инфекционными болезнями, фармакологией, терапией, хирургией и другими медицинскими науками. Медицинская микробиология изучает: • биологические свойства (строение, физиология, генетика) возбудителей инфекционных болезней, • экологические взаимоотношения между микроорганизмами и человеком, • этиологию и патогенез вызываемых микроорганизмами болезней, • методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Предмет изучения медицинской микробиологии – патогенные (болезнетворные) и условно-патогенные микробы. В деятельности врача-стоматолога знание микробиологии, вирусологии находит практическое применение. Без знания биологических свойств микроорганизмов, состава и функционирования нормальной микробиоты, этиопатогенеза и диагностики инфекционных болезней невозможны качественная неспецифическая и специфическая (вакцинация) профилактика инфекционных заболеваний и лечение больных. Контроль соблюдения санитарно-эпидемиологического режима (дезинфекция помещений, стерилизация инструментов) и мероприятия по профилактике внутрибольничных инфекций позволяют снизить риск передачи инфекционных заболеваний, обезопасить медицинский персонал и пациентов. Микроорганизмы представлены: неклеточными, или доклеточными формами: (вирусы (нуклеопротеиды) – царство Vira, вироиды (небольшие молекулы кольцевой, обычно одноцепочечной РНК, лишенные белковой оболочки), прионы (инфекционные белки)), клеточными формами (бактерии, архебактерии, грибы, простейшие). Для классификации микроорганизмов согласно руководству Берджи применяют следующие таксономические категории: домен, царство, тип, класс, отдел, порядок, семейство, род, вид, подвид, штамм, биовар, серовар, фаговар. Среди клеточных форм микробов различают 3 домена: Bacteria – прокариоты-эубактерии: - с толстой клеточной стенкой (КС), грамположительные (фирмикуты), - с тонкой КС, грамотрицательные (грациликуты), - без КС (тенерикуты – класс Mollicutes (микоплазмы)); Archaea – прокариоты-архебактерии, не содержат пептидогликан в КС (мендозикуты), имеют особые рибосомы и рРНК, не патогенны, обитают в экстремальных условиях (метанобразующие, экстремально галофильные бактерии (в присутствии 12-32% NaCl), термоацидофильные бактерии (при 75-90 °С и низком рН)); Eukaria – эукариоты, включают царства Fungi (грибы), Animalia (животные) подцарство Protozoa (простейшие), Plantae (растения). 5 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Вид (species) – совокупность микроорганизмов, объединенных общими свойствами, отличающаяся от других представителей рода. Видовое название – бинарное, включает название рода и собственно вида. Примеры: Actinomices odontolyticis, Bifidobacterium dentium, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus mitis, Treponema denticola. Штамм – совокупность потомков одной микробной клетки. По морфологии различают несколько форм микробов – кокковидные, палочковидные, извитые, ветвящиеся, нитевидные. Среди кокковидных (шаровидных) микробов по взаиморасположению в мазке выделяют микрококки (одиночные клетки малых размеров), диплококки (парные клетки, не расходящиеся при делении – пневмококк (ланцетовидная форма), гонококк и менингококк (форма кофейного зерна, вогнутой поверхностью обращены друг к другу)), стрептококки (делятся в одной плоскости, не расходятся при делении, располагаются цепочками), тетракокки (делятся во взаимно перпендикулярных плоскостях, располагаются по 4 клетки), сарцины (делятся во взаимно перпендикулярных плоскостях, располагаются по 8, 16, 32, 64 клетки), стафилококки (делятся в разных плоскостях, располагаются в виде грозди винограда). Палочковидные бактерии могут быть длинными, короткими, тонкими, толстыми, прямыми, изогнутыми (вибрионы), с обрезанными, закругленными, заостренными, утолщенными концами (сибиреязвенная бацилла, кишечная палочка, фузобактерии, дифтерийная палочка соответственно). Располагаться могут одиночно, попарно (диплобациллы), цепочками (стрептобациллы), скоплениями, под углом друг к другу (рис. 1). Рис. 1. Палочковидные бактерии в мазке Извитые микробы – спиралевидные бактерии: кампилло-, хеликобактерии, спириллы, спирохеты (боррелии, трепонемы, лептоспиры). Ветвящиеся формы микробов определяются у актиномицетов – бактерий, имеющих ряд общих признаков с грибами. Нитевидные формы микробов могут наблюдаться у риккетсий в начальной стадии размножения (тип D), микоплазм, актиномицетов, грибов. Методы исследования, применяемые в микробиологии: • микроскопический (световая, иммерсионная, темнопольная, люминесцентная, фазово-контрастная, электронная микроскопия), • микробиологический (бактерио-, вирусологический), • серологический (иммунологический), • биологический (экспериментальный), • кожно-аллергический, 6 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология • молекулярно-генетический, • хемотаксономический. Микроскопический (бактерио-, вирусоскопический) метод основан на приготовлении и микроскопии мазков-препаратов из исследуемого материала с целью изучения морфологических (форма, размеры, ультраструктура, взаиморасположение в мазке) и тинкториальных (способность м/о воспринимать и удерживать красители) свойств микробов. Этапы приготовления мазков-препаратов: 1) подготовка мазка, 2) высушивание, 3) фиксация, 4) окраска. Техника приготовления мазка из бактериальной культуры: - исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло, очертив предварительно с обратной стороны стекла восковым карандашом границы препарата. - если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора; - нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки; - берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони; - обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю (петлю остужают о внутреннюю стенку пробирки) и берут исследуемый материал; - вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой; - микробиологический материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени горелки; - мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, удерживая предметное стекло высоко над пламенем горелки. Нельзя допускать закипания материала, так как при этом может нарушиться структура микроорганизмов; - фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло мазком вверх проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие растворы: формалин, спирты, глутаральдегид, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Методы окраски препаратов: простые и сложные. При окраске простым методом используется только один краситель (окрашивание водным фуксином в течение 1–2 мин или метиленовым синим в течение 3–5 мин). Простые методы окраски позволяют определить наличие микроорганизмов в препарате, их форму, размеры и взаиморасположение. При окраске сложным методом используют несколько последовательно наносимых красителей (окраска по методу Грама, Бурри-Гинса, Ожешко, Романовскому-Гимзе и др.). Сложные методы окраски позволяют определить уль7 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология траструктуру микроорганизмов – строение клеточной стенки, наличие капсулы, спор, ядра, включений. Техника иммерсионной микроскопии: - установить микроскоп на малое увеличение (×8); - навести максимальную освещенность; - установить препарат на предметный столик и закрепить его зажимами; - найти изображение предмета на малом увеличении (×8); - нанести на препарат каплю иммерсионной жидкости; - установить микроскоп на большое увеличение (×90) до щелчка; - под контролем глаза макровинтом опустить объектив микроскопа вниз до иммерсионной жидкости; - наблюдая в окуляр, поднимать макровинтом вверх тубус до появления изображение предметов; - микровинтом установить более четкое изображение; - провести микроскопию препарата-мазка. - при завершении работы поднять вверх тубус макровинтом; - снять исследуемый препарат; - объектив ×90 отвести в сторону и чистой салфеткой удалить остатки иммерсионной жидкости; - установить микроскоп на малое увеличение (×8) и опустить тубус вниз; - предметный столик покрыть марлевой салфеткой. Измерение размера микробной клетки проводится с помощью окулярмикрометра (для непосредственного измерения объекта – пластинка с 50 делениями в окуляре) и объект-микрометра (определяет цену деления окулярмикрометра – стекло, закрепляющееся на предметном столе). В начале работы добиваются совпадения их делений. Затем отмечают число делений объектмикрометра, в которые умещается исследуемый микроорганизм. Микробиологический метод основан на выделении и идентификации чистой культуры микробов путем посева исследуемого материала на питательные среды. Чистая культура – совокупность микробов одного вида, выращенных на одной питательной среде и сходных по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам, факторам патогенности, чувствительности к бактериофагам и антибиотикам. Серологический метод основан на изучении антигенных свойств микроорганизмов путем определения антигенов микробов в исследуемом материале и/или антител к антигенам микробов в сыворотке крови. Примеры серологических реакций: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция агглютинации (РА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция связывания комплемента (РСК). Биологический метод основан на заражении исследуемым материалом лабораторных животных с целью выделения и идентификации чистой культуры 8 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология микробов и/или воспроизведения клинической картины инфекционного заболевания. Чаще используют белых мышей, морских свинок, кроликов. Животные содержатся в вивариях с соблюдением гигиенических требований, правовых и этических норм. Кожно-аллергический метод основан на выявлении сенсибилизации (повышенной чувствительности иммунной системы) макроорганизма к антигенам микробов путем внутрикожного (в/к) введения исследуемого материала (аллергена) в нижнюю треть плеча или верхнюю треть предплечья. Примером служит проведение пробы Манту: в/к введение туберкулина позволяет выявить сенсибилизацию макроорганизма к антигенам микобактерий по наличию и характеру гиперемии (покраснения), инфильтрата. Молекулярно-генетический метод основан на выделении и идентификации генетического материала микробов (ДНК, РНК) из исследуемого материала. Применяют полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), секвенирование и гибридизацию ДНК и другие реакции в специализированных лабораториях по высокотехнологическим методикам. Хемотаксономический метод основан на изучении микробов по продуктам их жизнедеятельности в организме без предварительного культивирования на питательных средах – газовая и газово-жидкостная хроматография. Оснащение микробиологической лаборатории. Микробиологическая лаборатория снабжена рядом обязательных приборов и аппаратов: Рис. 2 приборы для микроскопии (рис. 2): биологический иммерсионный микроскоп с приспособлениями (осветитель, фазовоконтрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентный микроскоп; термостаты и холодильники; приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистиллятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппаратура для фильтрования, водяные бани, центрифуги; набор инструментов для манипуляций с микробами: бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.; лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки, микродозаторы, аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок и др.; аппаратура для стерилизации: автоклавы, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы. Каждое рабочее место оснащено спиртовкой и сосудом с дезинфицирующим раствором. 9 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Вопросы для самоконтроля 1. Опишите периоды развития микробиологии. 2. Дайте определение микробиологии как науки и предмета ее изучения. 3. Классификация микроорганизмов по Берджи. 4. Какие морфологические формы бактерий выделяют? 5. Опишите возможные варианты расположения бактерий в мазке. 6. Перечислите методы изучения микроорганизмов. 7. Охарактеризуйте микроскопический метод исследования. 8. Укажите варианты и особенности способов окраски. 9. Что такое чистая культура микроорганизмов? 10. Чем должна быть оснащена микробиологическая лаборатория? Тема 2. УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ Бактериальная клетка окружена оболочкой, состоящей из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны (ЦПМ), образующей при избыточном росте инвагинаты (мезосомы), может сверху покрываться капсулой. Над оболочкой у некоторых бактерий могут быть закрепленные в ней жгутики, пили. Под оболочкой располагается протоплазма, образованная цитоплазмой, нуклеоидом, рибосомами, иногда включениями, плазмидами и другими внехромосомными генетическими элементами. В неблагоприятных условиях некоторые бактерии могут образовывать споры. К постоянным структурным элементам бактериальной клетки относятся клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, нуклеоид, цитоплазма, мезосомы, рибосомы (рис. 3). Непостоянными структурными элементами бактериальной клетки являются капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки, внехромосомные генетические элементы – плазмиды, транспозоны, IS-последовательности. Различают поверхностные и внутренние органеллы клетки. К поверхностным относятся капсула (макрокапсула, микрокапсула, слизь), клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, жгутики, пили; к внутренним – нуклеоид, цитоплазма, мезосомы, рибосомы, включения, внехромосомные генетические элементы. Капсула является поверхностной структурой ряда бактерий, различают макрокапсулу, микрокапсулу и слизь. Макрокапсула (чаще используют определение «капсула») имеет четкие границы, толщину более 0,2 мкм, прочно связана с клеточной стенкой, образована полисахаридами, реже полипептидами (у возбудителей чумы, сибирской язвы), гидрофильна, обладает антигенными свойствами, препятствует фагоцитозу. Антитела к капсульному антигену (К-АГ) вызывают ее увеличение – реакция набухания капсулы. Выявляется при окраске по Бурри-Гинсу – бесцветная капсула на темном фоне туши вокруг красного цвета клеток. 10 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Микрокапсула – слизистое образование менее 0,2 мкм, выявляется при электронной микроскопии. Слизь образована мукоидными экзополисахаридами, не имеет четких внешних границ, растворима в воде. Рис. 3. Структурные элементы бактериальной клетки (http://meduniver.com/) Клеточная стенка у бактерий имеет разную толщину, особенности строения и окраски. Принято различать бактерии с толстой клеточной стенкой (КС) – грамположительные (фирмикуты), с тонкой КС – грамотрицательные (грациликуты), без КС – тенерикуты (микоплазмы). КС придает клетке форму, регулирует осмотическое давление, участвует в делении клетки, транспорте метаболитов, имеет рецепторы для бактериофагов и ряда веществ, обладает антигенными свойствами, определяется при окраске по Граму. У фирмикутов КС однослойная, толщиной до 50 нм и более, содержит небольшое количество полисахаридов, липидов, белков, магниевую соль рибонуклеиновой кислоты (РНК), 6–8–20 рядов муреина или пептидогликана (ПГ), ковалентно связанного с тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами, выполняющими антигенную функцию, образованными остатками глицерола и рибитола. У грациликутов КС тонкая двухслойная. Наружный слой включает фосфолипиды, белки и липополисахарид (ЛПС), по строению сходен с ЦПМ, соединяется с подлежащим слоем липопротеином. Внутренний слой КС содержит 1– 11 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 2 ряда ПГ. Магниевая соль РНК отсутствует. Между слоями КС располагается периплазматическое пространство (рис. 4). Рис. 4. Строение клеточной оболочки грамотрицательных бактерий (http://probakterii.ru/) Пептидогликан состоит из тетрапептида и гликана. Гликан образован повторяющимися остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенными β-гликозидными связями. Молекулы гликана связаны через N-ацетилмурамовую кислоту тетрапептидом. Тетрапептид состоит из четырех L- и D-аминокислот (аланин, глутаминовая кислота, лизин). У грамотрицательных микробов в состав тетрапептида вместо лизина входит мезо-диаминопимелиновая кислота, отсутствующая у грамположительных бактерий. У грамположительных микроорганизмов тетрапептиды соединены цепочками пентаглицина, придающими большую ригидность КС (рис. 5). Рис. 5. Схема строения пептидогликана грамположительных бактерий: 1 - N-ацетилглюкозамин, 2 - N-ацетилмурамовая кислота, 3 - β-гликозидная связь, 4 - тетрапептид, 5 - пентаглицин 12 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Липополисахарид грамотрицательных бактерий образован тремя компонентами: липид А обуславливает токсичность ЛПС и отождествляется с эндотоксином, практически одинаков у грамотрицательных микробов; стержневая (коревая) часть или ядро состоит из полисахаридов; О-специфическая цепь олиго- и полисахаридов является О-соматическим антигеном, определяет серогруппу, серовар микроорганизмов. Окраска по методу Грама. Все бактерии по отношению к окраске по методу Грама делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного, что зависит от строения и химического состава клеточной стенки бактерий. Техника окраски по методу Грама: - окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу); - бумагу удалить, оставшуюся краску слить; - окрасить мазок раствором Люголя (1 мин); - раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30–40 с осторожно покачивая стеклом); - тщательно смыть спирт водой; - окрасить водным фуксином (2 мин); - промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги. Так как в однослойной КС фирмикутов до 80% массы составляет ПГ, поры которого при обработке спиртом сужаются и препятствуют выходу комплекса генцианового фиолетового с магниевой солью РНК в присутствии йода, входящего в раствор Люголя, грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет. У грамотрицательных микробов КС содержит малое количество ПГ (5-10%), отсутствует магниевая соль РНК. В связи с этим компоненты КС легко обесцвечиваются этиловым спиртом и окрашиваются в цвет последнего наносимого на их поверхность красителя (водный фуксин) – в красный (рис. 6). Рис. 6. Мазок-препарат, окраска по методу Грама При действии лизоцима (ацетилмурамидаза разрывает β-гликозидные связи в ПГ), бета-лактамных антибиотиков (пенициллин и др.), защитных факторов макроорганизма КС может частично или полностью разрушаться. Различают протопласты – бактерии, полностью утратившие КС и не способные ее восстанавливать и сферопласты – бактерии, частично утратившие КС, способные ее восстанавливать при прекращении действия неблагоприятного фактора. Если у бактерий, утративших КС, сохраняется способность к размножению, они называются L-формами. Различают стабильные L-формы – размножающие13 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология ся бактерии, полностью утратившие КС, не способные ее восстанавливать, нестабильные L-формы – размножающиеся бактерии, частично утратившие КС, способные ее восстанавливать при прекращении действия неблагоприятного фактора. Между КС и ЦПМ находится периплазматическое пространство (периплазма), содержащее ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, беталактамазы). Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) образована бислоем фосфолипидов, поверхностными и интегральными белками (пермеазы и др.), придает клетке форму, регулирует осмотическое, онкотическое давление, участвует в дыхании, делении клетки, в синтезе пептидогликана, транспорте метаболитов, выявляется при электронной микроскопии. Мезосомы – инвагинаты ЦПМ, образующиеся при превышении роста ЦПМ над КС, участвуют в делении клетки, секреции веществ, спорообразовании, являются энергетическим депо клетки, определяются при электронной микроскопии. Цитоплазма – внутренняя полужидкая среда клетки, содержит внутренние органеллы, включения гликогена, полисахаридов, полифосфатов, растворимые в воде белки, РНК, придает объем клетке, участвует в поддержании гомеостаза, транспорте метаболитов. Генетический материал бактериальной клетки представлен нуклеоидом и иногда внехромосомными генетическими элементами – плазмиды, транспозоны, IS-последовательности. Нуклеоид – аналог ядра, обеспечивает хранение и передачу генетической информации, состоит из одной суперспирализованой двухцепочечной ДНК диаметром до 2 нм, замкнутой в кольцо, интегрированной с РНК, РНК-полимеразой и белком в соотношении 1:1:3, занимает центральную часть клетки, имеет неправильную форму и не отмежевывается от цитоплазмы оболочкой, соединяется с ЦПМ и мезосомой. Нуклеоид имеет молекулярную массу – 1-3х109 дальтон, включает до 8х106 нуклеотидных пар (н.п.), содержание пар азотистых оснований А+Т и Г+Ц является постоянным для определенного вида микробов. Может обнаруживаться при электронной, иммунофлуоресцентной, радиоиммунной микроскопии, при окраске по Робиноу, Фельгену, Пикарскому, Романовскому-Гимзе. Внехромосомные ДНК значительно меньших размеров, скрученные в кольцо, локализованные в цитоплазме – плазмиды – детерминируют синтез некоторых веществ, ферментов, обеспечивают стойкость бактерий к антибиотикам и др. Рибосома – органоид клетки сферической или слегка эллипсоидной формы, диаметром 100-200 ангстрем, состоящий из большой и малой субъединиц, располагается свободно в цитоплазме, служит для биосинтеза белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой матричной РНК (мРНК) – трансляции, выявляется при электронной микроскопии. Константа седиментации (скорость оседания в ультрацентрифуге) рибосом бактериальных клеток – 70S (большая и малая субъединицы – 50S и 30S соответственно). 14 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Жгутики бактерий обеспечивают подвижность, состоят из закрученных нитей белка флагеллина, обладающего антигенными свойствами (Н-АГ). У них выделяют три основных части: спиральная нить (филамент), крюк (колено) и базальное тельце (центральный стержень и специальные прикрепительные диски: 2 – у грамположительных, 4 – у грамотрицательных, с помощью которых жгутик закрепляется в ЦПМ и КС – рис. 7). Рис. 7. Строение жгутикового аппарата у грамотрицательных бактерий (www.medbiol.ru) Число жгутиков у бактерий различно. Может быть 1 жгутик (монотрих), пучок жгутиков на одном полюсе клетки (лофотрих), по 1 жгутику или по пучку жгутиков на разных полюсах клетки (амфитрих), много жгутиков по всей поверхности клетки (перитрих) – рис. 8. Жгутики выявляются при электронной микроскопии, при световой микроскопии после серебрения мазка, косвенно (по подвижности микробов) при микроскопии препаратов «висячая» или «раздавленная» капля. Рис. 8. Варианты расположения жгутиков у бактерий (www.myshared.ru) Пили (ворсинки, фимбрии) – нитевидные структуры, состоят из белка пилина, отходят от поверхности клетки, обладают антигенными свойствами. Различают пили адгезии – обеспечивают прикрепление к клетке-мишени, пили, ответственные за питание, водно-солевой обмен, половые (конъюгационные) пили, выявляются при электронной микроскопии. Некоторые грамположительные бактерии (клостридии, бациллы) в неблагоприятных условиях внешней среды образуют эндогенные споры (процесс споруляции) для сохранения вида, но не для размножения как у грибов. В отличие от вегетативной клетки спора содержит меньше свободной воды, много липидов и кальция. Форма споры может быть овальной, шаровидной; расположение в клетке – центральное (у сибиреязвенной бациллы), субтерминальное – ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены), терминальное – на конце палочки (у возбудителя столбняка). Формирование споры (рис. 9) начинается с угнетения метаболизма, дегидратации и уплотнения цитоплазмы, которая вместе с нуклеоидом, рибосомами, включениями обособляется от остальной клетки с помощью перегородки – бипо15 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология лярного впячивания ЦПМ внутрь клетки с соединением. Далее обособленный участок цитоплазмы с генетическим материалом обрастает мембраной вегетативной клетки и образуется проспора, окруженная двумя мембранами, между которыми формируется кортикальный слой (кортекс). Затем поверх наружной мембраны проспоры синтезируются споровые покровы, состоящие из нескольких слоев. Рис. 9. Схема образования споры (www.old.ssmu.ru): А, Б – образование септы; В, Г – окружение протопласта споры протопластом материнской клетки; Д – образование кортекса и оболочек споры; Е – схема строения зрелой споры: 1 – экзоспориум; 2 – наружная оболочка споры; 3 – внутренняя оболочка споры; 4 – кортекс; 5 – КС зародыша; 6 – ЦПМ; 7 – цитоплазма с ядерным веществом У многих бактерий поверх покровов споры формируется экзоспориум. Все слои, окружающие протопласт эндоспоры (рис. 10), находятся внутри материнской клетки. Одновременно происходит накопление в сердцевине споры дипиколиновой кислоты, ионов кальция и др. катионов (Mg2+, Mn2+, К+), обеспечивающих термоустойчивость споры. Спорообразование сопровождается активным синтезом белка. Белки эндоспор в отличие от белков вегетативных клеток богаты цистеином и гидрофобными аминокислотами, с чем связывают устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов. Содержание ДНК и РНК в споре несколько ниже, чем в исходной вегетативной клетке, поскольку в спору переходит лишь часть генетического материала материнской клетки. Рис. 10. Строение споры (www.dic.academic.ru) 16 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология В благоприятных условиях (в кишечнике животных, человека) спора прорастает. Данный процесс включает 3 стадии: активация, инициация, прорастание. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. Проницаемость оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом. Выявляется окраской по Ожешко, Циль-Нильсена – споры красного цвета, вегетативные клетки синего цвета. При избыточном содержании питательных веществ в окружающей среде микроорганизмы могут накапливать белки, липиды, полисахариды, полифосфаты в виде внутриклеточных включений. У бактерий могут быть зерна волютина – включения полифосфатов, обладающих метахромазией – способностью окрашиваться более интенсивно в цвет отличный от самой клетки. Волютин выявляется при окраске по Леффлеру (темно-синие включения на голубом фоне – рис. 16), Нейссеру (сине-черные включения на желтом фоне – рис. 17). Таким образом, между грамположительными и грамотрицательными бактериями существует ряд различий, отраженных в таблице 1. Таблица 1 Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов Признак Грамположительные микробы Грамотрицательные микробы Представители Кокковидные м/о, кроме гоно- Гонококк, менингококк, кокка, менингококка, вейлонелл, вейлонеллы, спорообразующие палочки (кло- неспорообразующие палочки, стридии, бациллы), риккетсии, коринебактерии, хламидии, микобактерии, спирохеты, актиномицеты, спириллы, бифидобактерии, лактобациллы вибрионы Строение КС Однослойная, состоящая из 6-8- Двухслойная: внутренний слой – 1-2 20 рядов ПГ + полисахарид + ряда ПГ, наружный – комплекс литейхоевые кислоты пополисахаридов, фосфолипидов, белков и липопротеидов Магниевая соль РНК Имеется Отсутствует Строение ЦПМ Не связана с КС, имеет много- Тесно связана с КС, имеет незначичисленные выросты в цитоплаз- тельное число выростов в цитоплазму му Строение жгутиков 2 прикрепительных кольца на 2 прикрепительных кольца на уровне уровне ЦПМ ЦПМ, 2 – в наружном слое КС Спорообра-зование Может быть Нет Токсинообразование Экзотоксины Экзо- и эндотоксины Основные антигены Тейхоевые кислоты Соматический О-АГ (в составе ЛПС) Действие лизоцима Бактерицидное (приводит к гибе- Бактериостатическое (замедляет рост ли) и размножение) Действие пеОбразуются протопласты Образуются сферопласты нициллина 17 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Техника окраски по Фельгену: - обработать фиксированный препарат фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа), промыть водой и высушить. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет. Техника окраски по Робиноу: - обработать фиксированный препарат децинормальным раствором соляной кислоты при температуре 60°, окрасить по Романовскому-Гимзе. Техника окраски по Романовскому-Гимзе: - из готового красителя Романовского-Гимзе, состоящего из щелочной (азур II – ярко-синий цвет) и кислой части (эозин – розово-красный цвет) приготовить рабочий раствор – 1 капля на 1 мл дистиллированной воды; - фиксированный мазок поместить в рабочий раствор на 25–40 минут; - промыть водой и высушить. Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубой, ядра – в красный (рис. 11). Рис. 11. Мазок-препарат, окраска по методу Романовского-Гимзе Техника окраски по Пикарскому: - обработать фиксированный препарат 1 н раствором соляной кислоты в течение 7 мин при подогревании до 60 º; - промыть водой; - окрасить по Романовскому. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в темнокрасный цвет, цитоплазма – в розовый цвет (рис. 12). Рис. 12. Мазок-препарат, окраска по методу Пикарского Техника обнаружения капсул по методу Бурри-Гинса: - приготовить тушевой препарат по Бурри (смешать каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем приготовить мазок, как мазок из крови), затем высушить и зафиксировать (налить на поверхность мазка 96% этиловый спирт и поджечь); - окрасить препарат водным фуксином (1-2 мин); - промыть препарат водой, высушить на воздухе и микроскопировать. Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы выявляются на фоне туши (рис. 13). Рис. 13. Мазок-препарат, окраска по методу Бурри-Гинса Техника обнаружения спор по методу Ожешко: - нанести несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2–3 мин); - слить кислоту, промыть водой, высушить; 18 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология - зафиксировать на пламени; - окрасить по методу Циля-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, тело клетки и вегетативные формы – в синий (рис. 14). Рис. 14. Мазок-препарат, окраска по методу Ожешко Техника окраски по методу Циля-Нильсена: - нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой и подогреть до появления паров (3–5 мин); - мазок охладить, бумагу снять; - обесцветить 5% раствором серной кислоты и 3% раствором солянокислого спирта (2–4 с); - тщательно промыть водой; - окрасить синькой Леффлера (3–5 мин); - промыть водой и высушить. Кислото- и спиртоустойчивые бактерии окрашиваются в рубиново-красный, остальные – в синий (рис. 15). Рис. 15. Мазок-препарат, окраска по методу Циля-Нильсена Техника обнаружения спор по методу Шеффера-Фултона: - приготовленный препарат фиксируют на пламени; - нанесьти 5% водный раствор малахитового зеленого; - нагреть до появления пара 3-4 раза; - промыть водой; - окрашивают 30 с 0,5%-раствором водного фуксина. Споры окрашиваются в зеленый цвет, тело клетки и вегетативные формы – в красный. Рис. 16. Мазок-препарат, окраска по методу Леффлера Рис. 17. Мазок-препарат, окраска по методу Нейссера Прижизненная (витальная) окраска Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001%раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля, предназначенные для выявления подвижности микроорганизмов. Приготовление препарата «висячая капля»: - берут предметное стекло с лункой (углублением); - края лунки смазывают тонким слоем вазелина; - исследуемую культуру наносят на середину необезжиренного покровного стекла: если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берут каплю культуры, если 19 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология на плотной, то вначале на покровное стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора, а затем культуру микробов; - предметное стекло переворачивают на 180° и аккуратно накладывают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре лунки; - готовый препарат переворачивают в прежнее положение; - препарат рассматривают под микроскопом с плоским зеркалом и суженной диафрагмой, при малом увеличении (х8) находят край капли, видимый в затемненном поле, устанавливают его в центре поля зрения, не сдвигая препарат, переходят на иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму. Приготовление препарата «раздавленная капля»: - на поверхность предметного стекла наносят каплю микробной культуры; - покровное стекло ставят на ребро у края капли, опускают, раздавливая ее и вытесняя воздух, если жидкость выступает, ее удаляют фильтровальной бумагой; - препарат рассматривают под микроскопом с большим увеличением (объектив 40, окуляр 10 или 15, при опущенном конденсоре). Вопросы для самоконтроля 1. Перечислите постоянные и непостоянные органеллы микробной клетки. 2. Охарактеризуйте поверхностные и внутренние структурные элементы бактерий. 3. Укажите особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 4. Каков принцип сложного метода окраски по Граму? 5. Охарактеризуйте строение и функции жгутиков бактерий. 6. Опишите процесс спорообразования. 7. Перечислите отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 8. Перечислите методы окраски для выявления генетического материала бактерий. 9. Какие структурные элементы микробной клетки выявляются методами Шеффера-Фултона, Ожешко, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Леффлера, Нейссера? Тема 3. ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ И СТРОЕНИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Некоторые прокариотические микроорганизмы имеют специфические морфологические особенности, сходны с неклеточными и эукариотическими микробами (рис. 18). простейшие актиномицеты грибы бактерии спирохеты хламидии микоплазмы вирусы риккетсии Рис. 18. Морфологическая и физиологическая общность микроорганизмов 20 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Актиномицеты – грамположительные бактерии, образующие подобие мицелия – нитевидные переплетающиеся клетки (гифы) (примитивный мицелий без септ – межклеточных перегородок с отверстиями), связаны с микобактериями и коринеформными бактериями. Мицелий, образующийся в результате врастания клеток в питательную среду, – субстратный, растущий на поверхности среды – воздушный. Для актиномицетов характерно нитевидное, палочковидное или кокковидное строение, наличие боковых выростов. В отличие от грибов не имеют в КС хитина, целлюлозы. Жгутиков, пилей, капсулы не имеют. В пораженных тканях образуют друзы – гранулы из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся колбовидными утолщениями, поэтому актиномицеты называют лучистыми «грибами». Как бактерии делятся поперечным делением. Как грибы в спорангиях на ветвях воздушного мицелия образуют круглые или продолговатые, бесцветные споры (рис. 19), служащие для размножения, нетермостойкие, могут делиться путем фрагментации мицелия на палочковидные и кокковидные формы. Рис. 19. Актиномицеты: а) мицелий, б) спороносцы (http://studopedia.org) При окраске по Граму: споры темно-фиолетового цвета, мицелий – фиолетовый, друзы – розовые; по Цилю-Нильсену: мицелий – синий, споры – красные. Представители – Actinomices naeslundii, A. odontolyticis, A. bovis – могут вызывать актиномикоз кожи, слизистых оболочек, внутренних органов с гранулематозным гнойным воспалением. Чувствительны к антибиотикам, устойчивы к противогрибковым препаратам. Спирохеты – прокариотические подвижные микроорганизмы спирально извитой формы, имеющие общие признаки с грамотрицательными бактериями и простейшими. Семейство Spirochaetaceae включает 3 рода: Borrelia, Treponema, Leptospira, отличающиеся по морфологическим (рис. 20), тинкториальным, культуральным свойствам. Рис. 20. Спирохеты: 1) боррелии, 2) трепонемы, 3) лептоспиры (http://intranet.tdmu.edu.ua) У спирохет спирально извитой протоплазматический цилиндр (цитоплазма с нуклеоидом, рибосомами, покрытая ЦПМ) обвит осевой (аксиальной) нитью (фибриллами, эндофлагеллами), один конец которой крепится на полюсе клетки. Фибриллы (рис. 21) в периплазматическом простанстве (между слоями КС, над ЦПМ) направляются от обоих концов клетки и посередине или по всей длине перекрывают друг друга, количество их колеблется: у лептоспир – 1-2, у трепонем – 3-4, у боррелий – 7-20 и более. Осевая нить – упругое образование, устойчивое к действию трипсина, спирта, иммунных сывороток, обеспечивает 21 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология многообразные движения спирохет, придает извитую форму (первичные завитки). Спирохеты подвижны за счет фибрилл (не имеют поверхностных жгутиков), в неблагоприятных условиях спор не образуют, но способны переходить в фильтрующиеся L-формы или подобно простейшим в цисты (кроме лептоспир). Рис. 21. Строение тела спирохеты (http://www.myshared.ru) Выявляются по методу Романовского-Гимзы, Бурри, Морозову (серебрением – коричнево-черные спирохеты на желтом фоне – рис. 22), в темном поле микроскопа. Рис. 22. Мазок-препарат, окраска по методу Морозова (www.studfiles.ru) Боррелии имеют 3-8 крупных неравномерных первичных завитков, движения толчкообразные, сгибательнопоступательные, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в фиолетовый цвет (рис. 23). Являются возбудителями возвратного тифа (Borrelia recurrentis), болезни Лайма. Рис. 23. Мазок-препарат, окраска по методу Романовского-Гимзе (www.studfiles.ru) Трепонемы имеют 8-12 мелких равномерных первичных завитков, движения плавные, сгибательно-поступательные, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет. Treponema denticola – представитель нормальной микробиоты ротовой полости, T. pallidum является возбудителем сифилиса. Лептоспиры имеют 20-40 мелких первичных завитков, движения вращательно-поступательные, при этом образуются вторичные завитки, придающие форму S или C, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в розово-сиреневатый цвет (по некоторым источникам – в красный цвет). Leptospira interrogans способна вызывать лептоспироз с поражением сосудов, печени, почек. 22 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Техника окраски по Бурри: - на тщательно обезжиренном предметном стекле каплю исследуемой культуры микроорганизмов смешивают с каплей китайской туши; - краем другого стекла тонким, ровным слоем распределяют по поверхности предметного стекла, как это делается при исследовании крови; - высушивают на воздухе; - исследуют с иммерсионной системой под микроскопом. На равномерно серо-черном фоне спирохеты имеют вид серебристо-белой спирали (рис. 24). Рис. 24. Мазок-препарат, окраска по методу Бурри (http://medpuls.net/) Риккетсии представлены полиморфными, чаще кокковидными или палочковидными, реже – нитевидными, неподвижными прокариотическими клетками, форма и размеры которых могут изменяться в зависимости от фазы роста, имеющими общие признаки с грамотрицательными бактериями и вирусами. Имеют фимбрии. Не образуют спор. На поверхности КС располагается капсулоподобный слизистый покров и микрокапсула, содержащие группоспецифичный «растворимый» антиген. В КС локализуются основные белки, большинство из которых являются видоспецифичными антигенами, липополисахарид и ПГ. В ЦПМ преобладают ненасыщенные жирные кислоты, она осмотически активна, имеет специфическую транспортную систему АТФ-АДФ. Нуклеоид клетки – кольцевая хромосома. Согласно классификации П.Ф. Здродовского выделяют 4 морфологических типа риккетсий (рис. 25): тип А – кокковидные (шаровидные микробы, имеют 1-2 зерен хроматина), тип В – палочковидные (короткие палочки, содержат 2 зерна хроматина), тип С – бациллярные (длинные палочки, имеют 2-4 зерен хроматина), тип D – мицеллярные (нитевидные микробы, содержат 48 и более зерен хроматина). Нитевидные формы соответствуют наиболее ранней фазе развития риккетсий, тогда как кокковидные и короткие палочковидные формы представляют конечную стадию их деления. Рис. 25. Морфологические типы риккетсий Размножаются путем бинарного деления, обладают независимым от клеткихозяина метаболизмом. Источником энергии у внеклеточных риккетсий служит глутамат. Способны индуцировать свой фагоцитоз эукариотной клеткой. Жизненный цикл риккетсий имеет две стадии – вегетативную и покоящуюся. В вегетативной стадии микробы представлены палочковидными, бинарно делящимися клетками. Покоящиеся формы риккетсий – сферические клетки, располагающиеся в клетках членистоногих и теплокровных. 23 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Как вирусы, риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами и размножаются только в клетках живого организма: в цитоплазме и ядре клеток. Культивируют их в организме животных (морские свинки, белые мыши), насекомых-переносчиков (вши, клещи), в перевиваемой культуре ткани и курином эмбрионе (в желточном мешке). Риккетсий идентифицируют в мазках при окраске по Романовскому-Гимзе (кокковидные формы приобретают розовато-красный цвет, палочковидные окрашиваются с голубоватым оттенком), по Гименесу (ярко-красные м/о на зеленом фоне клетки-мишени), Маккиавелло, Здродовскому, в мазках, обработанных флюоресцирующими и энзиммечеными антителами. В связи с наличием в составе риккетсий большого количества липоидов рекомендовано окрашивать их разведенным карболовым фуксином – окраска по методу Маккиавелло в модификации П.Ф. Здродовского, при этом риккетсии окрашиваются в ярко-розовый или рубиново-красный цвет, протоплазма клеток-мишеней – в голубой, ядра клетокмишеней – в синий (рис. 26). Рис. 26. Мазок-препарат, окраска по методу Маккиавелло в модификации П.Ф. Здродовского (http://medpuls.net/) При окраске по Морозову (импрегнация серебром) суспензии риккетсий из культур, а также из легких экспериментально зараженных животных микроорганизмы под микроскопом выглядят темно-коричневыми или угольно-черными на светло-коричневом фоне. Риккетсии обладают тропизмом к клеткам эндотелия сосудов. Rickettsia prowazekii вызывает эпидемический (вшивый) сыпной тиф и его рецидив (болезнь Брилля-Цинссера), Rickettsia typhi – эндемический (блошиный) сыпной тиф, Rickettsia rickettsa – пятнистую лихорадку Скалистых гор. Техника окраски риккетсий по методу Здродовского: - окрасить фиксированный мазок разведенным фуксином Циля (10-15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин, - промыть водой, - обработать 0,5% раствором лимонной кислоты или 0,01% раствором соляной кислоты, - промыть водой, - окрасить метиленовым синим в течение 1 мин, - промыть водой, высушить. Хламидии – мелкие, шаровидные, неподвижные прокариотические микроорганизмы, размеры которых зависят от стадии жизненного цикла (рис. 27), проходящего только в цитоплазме клеток-мишеней, имеют общие признаки с грамотрицательными бактериями и вирусами. КС подобна грациликутным бактериям – 24 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология тонкая, двухслойная, содержит остатки ПГ: мало N-ацетимурамовой кислоты, отсутствует диаминопимелиновая кислота. Не имеют макрокапсулу, жгутиков. Не подвижны. Не образуют спор. Главные стадии развития хламидий: • элементарное тельце (ЭТ) – мелкая сферула (0,2–0,4 мкм), содержит компактный нуклеоид, много рибосом, окружена ригидной клеточной стенкой (имеются перекрестно сшитые пептидные мостики); внеклеточная инфекционная форма. • ретикулярное (инициальное) тельце (РТ) – крупная тонкостенная сферула (0,8–1,5 мкм), содержит фибриллярный нуклеоид и рибосомные элементы; внутриклеточная вегетативная форма; не инфекционна. • промежуточное тельце – переходная форма между РТ и ЭТ. Рис. 27. Жизненный цикл хламидий Хламидии грамотрицательны, но основной метод окраски – по Романовскому-Гимзе: в микроколониях внутри клеток ЭТ – в красный цвет, РТ – в голубой или фиолетовый. В неокрашенном состоянии хорошо видны при фазовоконтрастной микроскопии влажных препаратов инфицированных клеток. Во внеклеточной среде хламидии не размножаются и осуществляют очень мало метаболических функций. Не способны синтезировать АТФ и ГТФ – «энергетические паразиты». У C. trachomatis имеются 2 признака: способность синтезировать гликоген, что выявляется йодной пробой, и предшественники фолиевой кислоты. Йодная проба – мазки из исследуемого материала фиксируются метанолом, окрашиваются раствором Люголя – коричневое окрашивание на бледном фоне клетки. 25 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Хламидий имеют общие признаки с бактериями: клеточная форма жизни; содержат ДНК и РНК в характерном для бактерий сочетании; рибосомы прокариотического типа – 70S, подразделяемые на 30S и 50S; имеют клеточную оболочку, сходную с грамотрицательными бактериями; размножаются бинарным делением; чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам, азалидам и фторхинолонам. Общими признаками хламидий с вирусами являются абсолютный внутриклеточный паразитизм, ограниченные метаболические возможности, цитопатическое действие на клетки хозяина; особенности культивирования – в желточном мешке куриных эмбрионов и на тканевых культурах. Хламидии обладают тропизмом к эпителию слизистых оболочек, поражая глаза, дыхательный, пищеварительный, мочеполовой тракт, суставы. Chlamydia trachomatis способна вызывать заболевания глаз – трахома, паратрахома, урогенитальный хламидиоз, пневмонию новорожденных, венерический лимфогранулематоз, Chlamydia pneumonia – пневмонию, острые респираторные заболевания. Микоплазмы – особая группа мелких простоорганизованных полиморфных прокариотических микроорганизмов, отличающихся полным отсутствием КС и минимальным набором генов, что обусловливает ограниченность биосинтетических возможностей и высокие требования к условиям культивирования. Образуют выраженный слизистый слой. Не имеют макрокапсулы, жгутиков. Не образуют спор. Микоплазмы считаются самыми мелкими бактериями (0,1–0,3 мкм), могут проходить через бактериальные фильтры как и вирусы. Так как микоплазмы не способны синтезировать предшественники ПГ (мурамовую и диаминопимелиновую кислоты), у них отсутствует ригидная КС, что обусловливает ряд свойств: полиморфизм – шаровидные, вакуолизированные, нитевидные формы; пластичность (способны изменять форму клетки); осмотическую чувствительность; скользящую подвижность (не имея жгутиков за счет изменения формы и волнообразных сокращений тела клетки могут передвигаться по клетке-мишени); устойчивость к пенициллинам и другим β-лактамным антибиотикам. Имеют минимальный набор органелл: цитоплазма, нуклеоид с низким суммарным содержанием Г+Ц в ДНК, необходимые только для минимального синтеза белка и обменных процессов, рибосомы 70S, ЦПМ состоит из белков, погруженных в 2 фосфолипидных слоя, стеролов, основной компонент – холестерин. Микоплазмы – мембранассоциированные микробы, уникальные мембранные паразиты, способные к длительной персистенции в организме человека, при эндоцитозе клеткой-мишенью могут становиться внутриклеточными паразитами и оказывать подобно вирусам цитопатическое действие. 26 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Минимальная репродуктивная единица – элементарное тельце размером 0,2–0,7 мкм сферической или овальной формы, которое переходит в нитевидную, а после деления вновь в шаровидную (ЭТ). Микоплазмы могут размножаться как бактерии бинарным (поперечным) делением, как грибы – почкованием, фрагментацией нитевидных или цепочечных форм с образованием элементарных телец. Выявляются микоплазмы при окраске мазков по Романовскому-Гимзе (нитевидные формы) – бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток-мишеней – в голубой, ядра – в красный цвет; фазово-контрастной, люминисцентной и электронной микроскопии. На плотных питательных средах образуют типичные колонии с двумя зонами роста: приподнятым центром и тонкой периферией. Mycoplasma pneumoniae способна вызывать респираторный микоплазмоз (бронхит, атипичная пневмония), М. hominis – урогенитальный микоплазмоз. Вопросы для самоконтроля 1. Охарактеризуйте структурно-морфологические особенности актиномицетов. 2. Опишите морфологию и структуру спирохет, межродовые особенности. 3. Спирохеты как переходная группа от прокариот к простейшим. 4. Опишите морфологию и структуру риккетсий. 5. Охарактеризуйте морфологические, физиологические особенности хламидий. 6. Укажите особенности морфологии и структуры микоплазм. 7. Охарактеризуйте тип паразитизма по отношению к клетке у риккетсий, хламидий, микоплазм. 8. Перечислите основные методы окраски актиномицетов, спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм. Тема 4. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ. СИСТЕМАТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ Эукариоты имеют ряд существенных отличий от прокариотических микроорганизмов, основными из которых являются наличие ядра, обособленного от цитоплазмы ядерной мембраной, и внутренних мембранных органелл. В эукариотической клетке генетический материал представлен оформленным ядром с ядрышками хроматина и ядерной мемраной, а также внехромосомной ДНК, расположенной в митохондриях. Рибосомы располагаются на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭПР), реже свободно в цитоплазме. Нередко с одной молекулой мРНК ассоциировано несколько рибосом, такая структура называется полирибосомой. Синтез рибосом у эукариот происходит в специальной внутриядерной структуре – ядрышке. Рибосомная РНК составляет около 70 % всей РНК клетки. Рибосомы эукариот включают четыре молекулы рРНК, из них 28S, 18S и 5,8S рРНК синтезиру27 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология ются в ядрышке РНК-полимеразой I в виде единого предшественника (45S), который затем подвергается модификациям и нарезанию. 5S рРНК синтезируется РНК-полимеразой III в другой части генома и не нуждается в дополнительных модификациях. Почти вся рРНК находится в виде магниевой соли, что необходимо для поддержания структуры, при удалении ионов магния рибосома подвергается диссоциации на субъединицы. Константа седиментации (скорость оседания в ультрацентрифуге) рибосом эукариотических клеток равняется 80S (большая и малая субъединицы 60S и 40S, соответственно). Представителями эукариотов являются грибы, простейшие (табл. 2). Таблица 2. Отличительные признаки прокариотических и эукариотических микроорганизмов Признаки Прокариоты Эукариоты Представители Бактерии Простейшие, грибы Размер 1-10 мкм 10-100 мкм Генетический аппарат Нуклеоид без ядерной мембраны Ядро, окруженное мембраной Особенности ДНК Одна двухцепочечная ДНК, замкнутая в кольцо, суперспирализованная, не связана с гистонами Набор ДНК, ДНК имеют свободные концы, связаны с гистонами Мембранные органеллы отсутствуют имеются митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, ЭПР Клеточная стенка Содержит пептидогликан Не содержит пептидогликан, имеет хитин, целлюлозу Рибосомы Малые – 70S (30S, 50S), рассеяны по всей цитоплазме Крупные – 80S (40S и 60S) расположены на поверхности гранулярного ЭПР Жгутики Трубчатые образования, прикрепленные к ЦПМ и КС Особое строение Могут существовать в аэробных и анаэробных условиях Могут существовать в аэробных условиях Голофитный Голозойный, голофитный Поперечное (бинарное) деление Митоз, мейоз Отношение О2 Способ ния к пита- Способ размножения Грибы – это многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофильные) эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой, относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). 28 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, ЦПМ и многослойную, ригидную КС, состоящую из нескольких типов полисахаридов (маннанов, глюканов, целлюлозы, хитина), белка, липидов и др. Некоторые грибы образуют капсулу. ЦПМ содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы (не имеют холестерина в отличие от мембран клеток животных). Грибы являются грамположительными микробами, вегетативные клетки – некислотоустойчивые. Тело гриба – таллом. Различают гифальные и дрожжевые формы грибов. Гифальные (плесневые) грибы образуют ветвящиеся тонкие нити (гифы), сплетающиеся в грибницу, или мицелий (плесень) – рис. 28. Рис. 28. Плесневые грибы: а – пенициллы; б – аспергиллы; в – мукор (http://www.fly-cat.com/) Гифы, врастающие в питательный субстрат, – вегетативные гифы (отвечают за питание гриба), растущие над поверхностью субстрата – воздушные или репродуктивные гифы (отвечают за бесполое размножение). Гифы низших грибов – фикомицетов – не имеют септ (перегородок с отверстиями между клетками); представлены многоядерными клетками и называются ценоцитными. У высших грибов – эумицетов – гифы разделены перегородками; их мицелий многоклеточный. Дрожжевые грибы (дрожжи), в основном, имеют вид отдельных овальных клеток (одноклеточные грибы). По типу полового размножения они распределены среди высших грибов – аскомицет и базидиомицет. При бесполом размножении дрожжи образуют почки или делятся, что приводит к одноклеточному росту. Могут образовывать псевдогифы и ложный мицелий (псевдомицелий) в виде цепочек удлиненных клеток – «сарделек». Грибы, аналогичные дрожжевым, но не имеющие полового способа размножения, называют дрожжеподобными. Они размножаются только бесполым способом – почкованием или делением. 29 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Многие грибы характеризуются диморфизмом – способностью к гифальному (мицелиальному) или дрожжеподобному росту, в зависимости от условий культивирования. Например, в инфицированном организме они растут в виде дрожжеподобных клеток, а на питательных средах образуют гифы. Размножение грибов происходит половым и бесполым (вегетативным) путями. Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к совершенным. Несовершенными называют грибы, у которых отсутствует или не описан половой путь размножения. Половое размножение грибов происходит с образованием гамет, половых спор и других половых форм. Половые формы называются телеоморфами. Выделяют 3 типа грибов, имеющих половой способ размножения (совершенные грибы): зигомицеты (Zygomycota), аскомицеты (Ascomycota) и базидиомицеты (Basidiomycota). Бесполое (вегетативное) размножение грибов происходит с образованием соответствующих форм, называемых анаморфами. Такое размножение происходит почкованием, фрагментацией гиф и бесполыми спорами. Эндогенные споры (спорангиоспоры) созревают внутри округлой структуры – спорангия, располагающегося на спорангиеносце. Экзогенные споры (конидии) формируются на кончиках плодоносящих гиф – конидиеносцах. Отдельно выделяют условный, формальный тип/группу грибов – дейтеромицеты (Deiteromycota), у которых имеется только бесполый способ размножения (несовершенные грибы). Аскомицеты – грибы многоклеточные, септированные (разделенные перегородками), образуют сумки; к ним относятся пенициллы, аспергиллы. Пенициллы (Penicillium), или кистевики, имеют строение конидиеносцев с конидиями в виде кисточки Аспергиллы (Aspergillus), или леечные грибы, конидиеносцы их располагаются по шару радиусами, в виде струи воды из лейки. Конидии разных видов аспергиллов бывают окрашены: в желтый цвет (Aspergillus flavus), черный (A. niger), светло-зеленый (A. glaucus) и т. д. Фикомицеты, или мукоровые грибы, образуют одноклеточный несептированный, т. е. без перегородок, ветвистый мицелий с шарообразным или булавовидным плодовым телом, наполненным спорами (табл. 3, рис. 29). Таблица 3 Морфологические признаки плесневых грибов Мицелий Вегетативные споры вегетативный репродуктивный тип расположение Penicillium септированный септированный экзоспоры в виде «кисточек» конидиеносец (конидии) Aspergillus септированный несептированный экзоспоры ответвление на концах репроконидиеносец (конидии) дуктивных гиф, в виде «лейки» Mucor несептированный несептированный эндоспоры в спорангии спорангиеносец Род 30 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Рис. 29. Строение гифальных грибов Penicillium: 1) метулы, 2) стеригмы (фиалиды), 3) конидии, 4) конидиеносец, 5) гифа; Aspergillus: 1) булавовидное расширение конидиеносца, 2) конидии, 3) стеригмы (фиалиды), 4) конидиеносец, 5) вегетативная гифа; Mucor: 1) споры, 2) спорангий, 3) мицеллий. Основные типы конидий: 1 – артроконидии (артроспоры) или таллоконидии (таллоспоры) образуются путем равномерного септирования или расчленения гиф; 2 – бластоконидии образуются в результате почкования; 3 – микроконидии – одноклеточные небольшие конидии; 4 – макроконидии – многоклеточные большие конидии; 5 – хламидоконидии (хламидоспоры) – бесполые конидии (толстостенные крупные покоящиеся клетки или комплекс мелких клеток); 6 – склероции – многоклеточные с оболочкой (покоящиеся органы грибов, способствующие их выживанию в неблагоприятных условиях). Грибы в зависимости от локализации, первичной колонизации, токсического, аллергического действия могут вызывать следующие заболевания: - поверхностные микозы (кератомикозы) – отрубевидный, черный лишай, - эпидермофитии (эпидермомикозы, дерматомикозы) – микроспория, трихофития – поражение кожи, ногтей, волос, - подкожные микозы – поражение дермы, мышц, фасций, лимфоузлов, - системные (глубокие) микозы – язвенное поражение внутренних органов, чаще легких, слизистых оболочек ротовой полости, носа, - оппортунистические микозы (при снижении иммунитета кожно-слизистый кандидоз, пневмоцистная пневмония, аспергиллез), - аллергии (респираторные, кожные), - микотоксикозы (пищевые отравления). 31 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Важное медицинское значение, в т.ч. и в стоматологии, имеют грибы рода Candida, вызывающие у человека кандидоз кожи, слизистых оболочек и внутренних органов. Семейство Cryptococcaceae включает род Candida, патогенные виды: C. аlbicans, С. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei – дрожжеподобные грибы (рис. 30), имеют две фазы развития – дрожжевую и мицелярную. Рис. 30. Грибы рода Candida (www.medicine-live.ru) Дрожжевая фаза представлена овальными или круглыми бластоспорами (клетки споры), размножающимися многополюсным почкованием. Мицелярная фаза – нити из удлиненных клеток, образующих псевдомицелий, отличающийся от истинного отсутствием общей КС и перегородок (септ). На перетяжках псевдомицелия располагаются бластоспоры. На терминальных расширениях образуются хламидоспоры – споры с двойной оболочкой, превосходят псевдомицелий по размеру (рис. 31). Чередование фаз связано с температурным фактором: при температуре ниже 37 °С образуется псевдомицелий, при 37 °С и выше – дрожжеподобные клетки. Рис. 31. Морфология грибов рода Candida (www.medicine-live.ru) КС состоит в основном из углеводов – бета-глюкан, хитин (неветвящийся полимер N-ацетилглюкозамина), маннан (полимеры маннозы), связанных с поверхностными белками: инвертазы, кислые фосфатазы, аминопептидазы, образующими на поверхности КС осмиофильный белковый слой. У кандид на поверхности располагаются и липиды, повышающие осмиофильность, фимбрии. 32 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология ЦПМ кандид содержит много эргостерола и систему энзимов, обеспечивающих его биосинтез, является мишенью для антифунгальной терапии (противогрибковые препараты нарушают функционирование ЦПМ). Грибы легко окрашиваются простыми методами (метиленовым синим), по методу Грама (грамположительные за счет наличия хитина), по методу Романовского-Гимзы (ядро – красное, цитоплазма – голубая). Можно микроскопировать неокрашенные грибы – метод «раздавленная капля». Техника окраски по методу Гридли: - препарат из исследуемого материала обрабатывают хроматом лейкофуксина, - наносят фуксиновый альдегид и метаниловый желтый. При микроскопии мазка клетки грибов розово-пурпурные на желтом фоне. Вопросы для самоконтроля 1. Охарактеризуйте структурно-морфологические особенности эукариотов. 2. Опишите отличительные особенности прокариотических и эукариотических микробов. 3. Охарактеризуйте морфологические особенности грибов. 4. Укажите особенности морфологии и структуры гифальных грибов. 5. Перечислите основные разновидности конидий грибов. 6. Охарактеризуйте структурно-морфологические особенности дрожжевых грибов. 7. Укажите способы размножения грибов. 8. Перечислите основные методы окраски грибов. 9. Заболевания, вызываемые грибами. Тема 5. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА БАКТЕРИЙ. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. Физиология бактерий изучает жизнедеятельность, метаболизм бактерий, вопросы питания, дыхания, получения энергии, роста и размножения бактерий, их взаимодействие с окружающей средой. В химический состав бактерий входят вода, белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, минеральные вещества. Вода существует в двух видах: свободная вода – служит дисперсионной средой для коллоидов и растворителем для кристаллических веществ, в которой протекают реакции, необходимые для жизнедеятельности клетки; химические вещества проникают в клетку в растворенном виде, связанная вода – является структурным элементом цитоплазмы; входит в состав органических соединений и не является растворителем, не подвержена замерзанию. Белки в микробной клетке могут быть свободными (моно-, ди-, олиго-, полипептиды) и связанными с углеводами (гликопептиды), жирами (липопротеиды), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды). Функции белков многообразны: ● структурная (входят в состав КС, ЦПМ); 33 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология ферментативная (все ферменты клетки – белки, катализирующие окислительно-восстановительные, метаболические реакции); репродуктивная (участвуют в росте и размножении микробов); антигенная и иммуногенная (жгутиковый термолабильный антиген (Н-АГ), иногда капсульный термолабильный АГ (у сибиреязвенной бациллы) индуцирует (запускает) развитие специфической иммунной реакции); токсигенная (экзотоксины (гемолизины, гистотоксин, энтеротоксин) – белки, выделяемые микробами в процессе жизнедеятельности в макроорганизме); транспортная (белки – пермеазы, порины – способствуют поступлению питательных веществ в клетки и выведению токсических метаболитов). Углеводы в микробной клетке могут быть свободными (моно-, ди-, олиго-, полисахариды) и связанными с белками (гликопептиды), жирами (липополисахарид КС грамотрицательных бактерий). Функции углеводов: структурная (входят в состав КС); антигенная (О-соматический (О-АГ), капсульный (К-АГ) полисахаридные антигены – сильные раздражители иммунной системы, на них формируется иммунный ответ); энергетическая (являются запасными веществами, энергетическими резервуарами); токсическая (эндотоксин – белково-липополисахаридный комплекс, выделяемый при гибели грамотрицательных бактерий). Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами, глицеридами, стеролами, восками. Функции липидов: структурная (входят в состав ЦПМ, мезосом, КС грамотрицательных бактерий); токсическая (эндотоксин – белково-липополисахаридный комплекс, выделяемый при гибели грамотрицательных бактерий – основной токсический компонент липид А); энергетическая (являются запасными веществами, энергетическими резервуарами); регуляция проницаемости ЦПМ (липофильность). Нуклеиновые кислоты бактерий составляют 10-30% сухой массы клетки. Молекула ДНК представляет собой хромосому бактерии (единственную) и определяет наследственность. Она суперспирализована и замкнута в кольцо, находится свободно в цитоплазме, не отграничена мембраной. ДНК входит в состав внехромосомных генетических структур. Молекулы РНК (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка. 34 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Минеральные вещества бактерий составляют 2-14% их сухой массы – фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.), участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав витаминов и структурных компонентов микробной клетки. В основе жизнедеятельности бактериальной клетки лежит метаболизм – совокупность всех обменных процессов. Всю совокупность метаболических реакций можно разделить на 3 группы: катаболизм – окисление и распад (диссимиляция) поступивших в клетку питательных веществ с выделением энергии АТФ – энергодающий процесс; амфиболизм – образование промежуточных продуктов в реакциях катаболизма и анаболизма – центральный обмен; анаболизм – ассимиляция мономерных структур и превращение их в сложные химические биосоединения клетки (биосинтез, конструктивный обмен, анаболизм) – энергопотребляющий процесс. Подавляющее большинство метаболических процессов протекают в прокариотической клетке одновременно и представляют замкнутый цикл. Так, в процессе катаболизма образуются продукты, которые усваиваются клеточными структурами, и запускается реакция биосинтеза определенных ферментов, которые, в свою очередь, регулируют процессы энергетического синтеза. Жиры (сложные эфиры глицерина и жирных кислот) и воска (сложные эфиры жирных кислот и одноатомных спиртов) – восстановленные субстраты, доступны бактериям в качестве источников энергии. Первоначально эфиры жирных кислот гидролизуются до глицерина или одноатомного спирта и свободных жирных кислот (гидролиз катализируют внутри- и внеклеточные липазы). После фосфорилирования глицерин может включаться в гликолитический путь и утилизироваться с образованием АТФ. Жирные кислоты метаболизируются через каскад окислительных реакций. Цель этих превращений – образование ацетил-КоА, вступающего в цикл Кребса (ЦТК – цикл трикарбоновых кислот). Доступные субстраты для получения углерода, азота и энергии – аминокислоты, пурины и пиримидины. Как аэробные, так и анаэробные бактерии используют эти соединения для синтеза белка либо непосредственно, либо после ряда превращений и вовлечения в промежуточный обмен. Первой реакцией катаболизма аминокислот может быть декарбоксилирование либо дезаминирование. Декарбоксилазы действуют обычно в кислой среде, образуя СО2 и первичные амины (биогенные амины, трупные яды – кадаверин, путресцин, агматин). Этот процесс – механизм нейтрализации кислой среды и сохранения рН в физиологических пределах. 35 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Дезаминирование аминокислот идет с выделением аммиака. Различают дезаминирование окислительное (наиболее распространенное), гидролитическое и приводящее к образованию ненасыщенных соединений. Ферменты, катализирующие эти реакции, обычно специфичны для D- и L-изомеров аминокислот. Углеродные фрагменты, не содержащие азота, используются в процессах брожения или дыхания. Если в состав аминокислот входит сера, то последняя высвобождается в форме сероводорода или меркаптанов. Разложение ароматических аминокислот (например, триптофана) происходит с образованием индола и скатола. Некоторые бактерии обладают специальными механизмами получения энергии при расщеплении аминокислот. Например, аргининдегидролазная система, состоящая из нескольких ферментов, расщепляет аргинин: аргининдезаминаза катализирует его превращение в цитруллин, который через реакцию, сопряженную с синтезом АТФ, превращается в орнитин. Многие клостридии на средах, содержащих смесь аминокислот, получают большую часть энергии не из отдельных компонентов, а путем сопряжения окислительно-восстановительных реакций между парами подходящих аминокислот (механизм Стиклэнда). Поэтому аминокислоты можно разделить на акцепторы (глицин, орнитин, пролин) и доноры водорода (аланин, изолейцин и валин). Первоначально донор окисляется до кетокислоты, затем «доокисляется» до жирной кислоты. Образующийся при этом НАДН+ утилизируется для восстановления другой аминокислоты – акцептора (или, реже, другого азотистого соединения). Кроме реакций дезаминирования и декарбоксилирования, L-аминокислоты могут подвергаться переаминированию – переносу целой аминогруппы от аминокислоты к α-кетокислотам без промежуточного образования аммиака. Реакции катализируют специфические трансферазы. Пурины и пиримидины становятся доступными для энергетического метаболизма после гидролиза нуклеотидов и нуклеозидов. В результате их разложения образуются углекислота, аммиак, муравьиная, уксусная и молочная кислоты, часть из которых включается в рассмотренные выше энергетические пути. Эндогенный энергетический метаболизм. Большинство бактерий способно длительно выживать при отсутствии экзогенных источников энергии, что связано со способностью бактерий продуцировать энергию окислением внутриклеточных компонентов. Основные эндогенные источники энергии – ЛПС, липиды и поли-β-масляная кислота. Они расщепляются деполимеризующими ферментами до мономеров, которые включаются в вышеперечисленные пути. Совокупность биосинтетических реакций включения низкомолекулярных соединений в клеточные полимеры составляет суть конструктивного метаболизма (пластического обмена). Для биосинтеза клеточных компонентов необходимы соответствующие низкомолекулярные соединения-предшественники (сахара, аминокислоты, жирные кислоты). При наличии таких предшественников в окружающей среде они непо36 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология средственно вовлекаются в различные биосинтетические пути. Но чаще микроорганизмы приходится предварительно синтезировать большую часть молекулпредшественников из доступных исходных продуктов. Огромное разнообразие субстратов, которые бактерии могут использовать в качестве источников питания, вытекает из широкого спектра их метаболических возможностей. Исходные продукты для биосинтеза образуются в ходе различных путей катаболизма, включая гликолиз, КДФГ-путь, пентозофосфатный путь, окисление пирувата и ЦТК. Например, углеродные фрагменты из ЦТК – сукцинил-КоА и ацетил-КоА – используются соответственно для образования тетрапирролов и жирных кислот. Большинство свободно живущих бактерий способно синтезировать все необходимые им аминокислоты. Аминокислоты могут находиться в окружающей среде и быть доступными для утилизации. Кроме того, бактерии способны получать аминокислоты из белковых молекул, расщепляя их бактериальными протеазами и пептидазами. Образующиеся при этом олигопептиды и аминокислоты транспортируются в клетку, где включаются в биосинтетические пути либо расщепляются на низкомолекулярные продукты. Паразитические бактерии потребляют готовые аминокислоты из организма хозяина. Основное назначение источников азота питательных сред – поступление в бактериальную клетку «сырья» для формирования аминных (NH2) и иминных (NH) групп в молекулах аминокислот, нуклеотидов, гетероциклических оснований и других химических компонентов. При этом азотсодержащие вещества, помимо сырья для пластического обмена, могут включаться в энергетический метаболизм (у анаэробов некоторые аминокислоты могут образовывать окислительновосстановительные системы). Наиболее доступные минеральные источники азота в природе – аммонийный ион (NH4+) и аммиак (NH3) легко проникают в клетки и трансформируются в амино- и иминогруппы. Основные исходные соединения для синтеза аминокислот – пируват (образуется в гликолитическом цикле), α-кетоглутарат и фумарат (образуются в ЦТК). При синтезе молекул аминокислот атом азота вводится на последних этапах биосинтеза путем переаминирования; лишь L-аланин, L-глутамат и аспартат образуются через прямое аминирование. Бактериальная клетка способна синтезировать несколько тысяч различных белков, каждый из которых содержит в среднем 200 аминокислотных остатков. Информация, направляющая синтез этих белков, закодирована в последовательности нуклеотидов ДНК. Синтез полипептидной цепи происходит в цитоплазме клетки на рибосомах в сочетании с молекулой мРНК или информационной РНК (иРНК), которая синтезируется на матрице ДНК в процессе транскрипции. Образование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов из низкомолекулярных соединений происходит независимыми друг от друга путями. 37 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Пуриновые нуклеотиды построены на основе фосфорибозилпирофосфата, с которого и начинается путь их синтеза. Девятичленное пуриновое кольцо синтезируется последовательным присоединением аминогрупп и мелких углеродсодержащих групп. Источник рибозилфосфатной части всех нуклеотидов– 5фосфорибозил-1-пиро-фосфат – образуется после взаимодействия рибозо-5фосфата с АТФ. Дезоксирибонуклеотиды образуются путем восстановления соответствующих рибонуклеотидов. Пиримидиновые нуклеотиды формируются в серии последовательных превращений карбоксилсодержащих интермедиатов, начиная с карбамоилфосфата. Рибозофосфатный остаток присоединяется только после того, как шести членное пиримидиновое кольцо полностью синтезировано конденсацией аспарагиновой кислоты и карбамоилфосфата. Большинство синтезируемых нуклеотидов полимеризуется в РНК и ДНК, небольшая часть используется для синтеза коферментов и богатых энергией соединений. Синтез ДНК из субстратов-мономеров, четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ), катализируют ДНК-полимеразы. Процесс удвоения клеточной ДНК – репликация. Если цепь ДНК служит матрицей, на которой полимеризуется цепь РНК (мРНК), то этот процесс – транскрипция. При отсутствии сахаров в окружающей среде бактерии синтезируют их из доступных источников углерода. Например, бактерии синтезируют гексозофосфаты из пирувата с помощью реакций фруктозодифосфатного пути. Характерная особенность синтеза олиго- и полисахаридов, как и в случае синтеза ДНК, – необходимость затравки – короткого фрагмента того же полисахарида, который будет синтезироваться – акцептор новых мономерных фрагментов. Жирные кислоты синтезируются отдельно, а затем с помощью эфирной связи включаются в липиды. Число типов жирных кислот у каждого вида бактерий строго определено. У прокариот преимущественно встречают насыщенные жирные кислоты, образование которых начинается с переноса ацетильной группы с ацетил-КоА на особый ацил-переносящий белок. Этот комплекс служит акцептором, к которому последовательно присоединяются двухуглеродные фрагменты. Метаболизм микроорганизмов регулируется факторами внешней среды (содержанием питательных субстратов, окислительно-восстановительным потенциалом, осмотическим, онкотическим давлением, рН, температурой и др.). По отношению к температуре все микроорганизмы делятся на: ● психрофилы (от -18 °С до +18 °С) (Nitrosomonas criotolerans – обитатель холодных вод, Yersinia psichrophila вызывает порчу продуктов в холодильнике до -18 °С); 38 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология мезофилы (от +18 °С до +40 °С) – большинство патогенных микробов (температурный диапазон у стафилококков +18-37 °С). термофилы (от +40 °С до +70 °С) – обитатели горячих источников, саморазогревающихся субстратов – навоза, торфа, сена, силоса, некоторые обитатели кишечного тракта человека и животных. Питание микроорганизмов Питательным веществом для микробов может служить любое вещество, являющееся эффективным источником энергии или пластическим материалом для синтеза необходимых клетке соединений. Различают две разновидности поступления питательных веществ в организм: голозойное (переваривание и усвоение готовых органических веществ, характерно для простейших, животных и человека), голофитное (питательные вещества поступают в виде небольших молекул; характерно для растений и микроорганизмов). В зависимости от источника питательных веществ бактерии подразделяют по типам питания на: автотрофы, использующие для построения своих клеток неорганические вещества и неорганический углерод в виде СО2; гетеротрофы, использующие органические вещества и готовый органический углерод; источниками органического углерода являются гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты. Организмы, для которых источником энергии является свет ( фотосинтез), называются фототрофами (не патогенны для человека). Микроорганизмы, которые получают энергию за счет окислительновосстановительных реакций, называются хемотрофами (авто- и гетеротрофы). Источниками энергии для них могут быть нитраты, нитриты, H2S. Среди хемотрофов выделяют: литотрофы (от греч. lithos – камень), способные использовать неорганические доноры электронов (Н2, NH3, H2S, Fe~+ и др.); органотрофы – используют органические соединения в качестве доноров электронов или Н+. Бактерии, изучаемые медицинской микробиологией, – гетерохемоорганотрофы, для которых источник углерода является источником энергии. Среди гетеротрофных бактерий выделяют: сапрофиты – питаются остатками органических веществ и независимы от других организмов, не вызывают заболевания человека и животных; паразиты – гетеротрофные микрорганизмы, зависимые в получении питательных веществ от макроорганизма. Среди паразитов различают: ● облигатные паразиты – полностью лишены возможности жить вне организма 39 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология человека. К ним относятся представители родов Rickettsia, Coxiella, Ehrlichia, Chlamydia, размножающиеся только внутри клеток макроорганизма. ● факультативные паразиты – могут жить без хозяина, размножаться, так же как и сапрофиты, на питательных средах in vitro, т. е. вне организма. Существует два типа транспорта веществ в бактериальную клетку: 1) пассивный – по градиенту концентрации веществ без затраты энергии – - простая диффузия, - облегченная диффузия (с помощью белков-переносчиков – пермеаз)); 2) активный – против градиента концентрации веществ с затратой энергии – - в клетку «накачиваются» небольшие молекулы (аминокислоты, сахара), - транспортируются с помощью белков-переносчиков – пермеаз, - перенос питательных веществ с изменением их химической структуры (перенос или транслокация радикалов) – фосфорилирование углеводов. Питательная среда – одно- или многокомпонентная система, содержит питательный субстрат, служит для роста и размножения микроорганизмов (бактерий, грибов). Этапы приготовления питательных сред: 1) варка (согласно составу питательной среды в дистиллированную воду вносят необходимые компоненты и растворяют при нагревании); 2) установление рН с помощью потенциометра (для подщелачивания используют 0,1 н раствор NaOH, для подкисления – 0,1 н раствор HCI); 3) осветление среды с помощью яичного белка, лошадиной сыворотки или путем отстаивания (осаждения); 4) фильтрация через фильтровальную бумагу (жидкие среды) или ватномарлевые фильтры (агаровые среды); 5) разливка питательных сред (по пробиркам или чашкам Петри); 6) стерилизация; 7) контроль готовых сред (стерильности, химический, биологический). Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических термотестов и искусственных биотестов. Химические термотесты представляют собой вещества, изменяющие свой цвет или физическое состояние при стерилизации и имеющие различную температуру плавления. Запаянные ампулы с порошком, смешанным с красителем, помещают в стерилизационную камеру. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленного красителя. Бактериологический контроль режима стерилизации заключается в том, что в стерилизационную камеру помещают искусственные биотипы – пробирки с полосками марли или фильтровальной бумаги, зараженными микроорганизмами с известной устойчивостью к температурным воздействиям. Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны содержать воду, набор питательных веществ, макро- и микроэлементов, иметь определенный физико-химический состав, быть стерильными. 40 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Питательные среды должны: 1) содержать воду, т. к. процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде; 2) должны содержать органический источник углерода и энергии – углеводы, аминокислоты, липиды: наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, часто используется пептон – продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-, олиго- и дипептидов, поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков; 3) должны содержать источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы, для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов: источником азота могут служить пептон, соли аммония; серу и фосфор бактерии способны утилизировать в виде сульфатов и фосфатов; ионы Са2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, добавляемые в питательную среду в виде солей, чаще фосфатов, необходимы для функционирования ферментов; 4) иметь определенный рН среды: с этой целью питательную среду забуферивают, чаще используя фосфатный буфер, при сильном выделении бактериями кислот как продуктов обмена, к питательной среде добавляют карбонат кальция – СаO2; 5) обладать определенным осмотическим давлением: большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, что достигается добавлением NaCl в концентрации 0,9%; некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1% – галофильные бактерии; при необходимости к питательной среде добавляют факторы роста (аминокислоты, нативные белки крови, витамины), ингибиторы роста определенных бактерий (антибиотики), субстраты для действия ферментов, индикаторы (Андреде и др.); 6) быть стерильными во избежание искажения результатов исследования. В зависимости от консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотность среды достигается добавлением агара или свернувшейся сыворотки крови, свернувшегося яичного белка. Агар – полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 °С, но при охлаждении остывает при температуре 45-50 °С. Агар добавляют в концентрации 0,3-0,7 % для полужидких сред и 1,5-2 % – для создания плотных сред. Преимущество плотных питательных сред – возможность получения чистых культур м/о, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газонов), имеющих макроскопические размеры. Питательные среды различают по происхождению: нативные (естественные), полусинтетические, синтетические. Естественные питательные среды – неизмененные нативные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок, молоко и др.). 41 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Полусинтетические среды включают наряду с переработанными нативными компонентами неопределенного состава – гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт химически чистые соединения. Синтетические питательные среды состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Преимуществом синтетических сред являются их строго постоянный состав и воспроизводимость. По составу питательные среды делят на простые и сложные. Простые питательные среды состоят из 1 компонента (среда Ру – сыворотка крови). Сложные питательные среды образутся несколькими компонентами (TCBS-агар – тиосульфат-цитрат-бромтиоловый-сахарозный агар для культивирования холерного вибриона). По целевому назначению питательные среды делят на основные, накопительные, элективные, дифференциально-диагностические, транспортные. Основные среды применяют для выращивания большинства бактерий. Это пептические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду – питательный бульон (МПБ – мясопептонный бульон) и плотную – питательный агар (МПА – мясо-пептонный агар). Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред – сахарных, кровяных и др. Накопительные питательные среды (среды обогащения) применяют для увеличения количества микроорганизмов в материале (желчный бульон – для культивирования бактерий, содержащихся в крови, желчи, селенитовый бульон – для накопления микробов, выделяемых из испражнений). Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микробов определенного вида (группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору, т.е. создают благоприятные условия для некоторых бактерий и неблагоприятные для большинства. Избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия – применяют желточно-солевой, молочно-солевой агар; холерный вибрион лучше растет в щелочной среде – культивируют на щелочном агаре, в пептонном бульоне; грамотрицательные бактерии – на средах с пенициллином. Дифференциально-диагностические питательные среды (среды Гисса, Эндо, Левина) применяют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред основан на различиях в биохимической активности бактерий разных видов вследствие неодинакового набора ферментов, чаще сахаролитических. В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный субстрат (например, лактоза), способность использовать который является диагностическим признаком для данного вида, в) цветной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого 42 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую Рис. 32 сторону вследствие ферментации соответствующего субстрата (рис. 32 – среды Гисса). Транспортные питательные среды применяют для доставки исследуемого материала до микробиологической лаборатории в условиях, не допускающих высушивания материала (изотонический физиологический раствор, специальные транспортные среды). Вопросы для самоконтроля 1. Химический состав микробной клетки. 2. Функции соединений, входящих в состав микробной клетки. 3. Метаболизм бактериальной клетки. 4. Катаболизм и анаболизм как составные части процесса метаболизма. 5. Источники питания для микроорганизмов. 6. Типы питания микроорганизмов. 7. Классификация микробов по способам питания. 8. Транспорт питательных веществ в клетку микроорганизмов. 9. Этапы приготовления питательных сред. 10. Контроль готовых сред. 11. Требования, предъявляемые к питательным средам. 12. Классификация питательных сред по происхождению, консистенции, составу, назначению. Тема 6. ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ. РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРОБОВ Ферменты (энзимы) – специфичные, эффективные белковые катализаторы химических реакций, обеспечивают взаимодействия и превращения соединений. Классификация ферментов по месту действия: эндоферменты – контролируют синтетические процессы, энергосинтез, локализованы внутри клетки – в цитоплазме и ЦПМ; экзоферменты – ферменты, выделяемые в окружающую среду, осуществляют внеклеточное переваривание с последующим транспортом более простых соединений в клетку, изменяют окружающую среду, вызывают патологические процессы. Классификация ферментов по механизму действия: оксидоредуктазы – осуществляют окислительно-восстановительные реакции; трансферазы – обеспечивают транспорт молекул через ЦПМ; гидролазы – участвуют в диссимиляции (расщеплении) веществ путем гидролиза; лиазы – участвуют в диссимиляции (расщеплении) веществ негидролитическим путем; 43 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология изомеразы – обеспечивают образование изомеров за счет переноса групп атомов в составе исходной молекулы; лигазы (синтетазы) – осуществляют синтетические реакции. Классификация ферментов по времени образования и действия в клетке: 1) конституитивные – постоянно синтезируются в клетке в определенных концентрациях; 2) индуцибельные (катаболические) – синтезируются по необходимости, концентрация их резко возрастает в зависимости от наличия соответствующего питательного субстрата – «индукция субстратом»; 3) репрессибельные (анаболические) – образование их регулируется путем репрессии конечным синтезированным продуктом. Микробиологическая классификация (по типу ферментируемого субстрата): 1) сахаролитические – осуществляют расщепление углеводов; 2) протеолитические – обеспечивают расщепление белоксодержащих субстратов; 3) липолитические – осуществляют расщепление липидов, жиров, утилизацию жирных кислот; 4) окислительно-восстановительные ферменты. Исследование ферментативной активности микробов способствует межродовой и внутривидовой дифференциации бактерий, грибов. Наличие сахаролитических ферментов определяют на дифференциально-диагностических сахаросодержащих питательных средах (среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина, Клиглера) по изменению цвета среды и/или появлению окрашенных колоний. Активность протеолитических ферментов оценивают при посеве бактериальной культуры на МПБ (при выделении сероводорода наблюдают почернение индикаторной полоски, аммиака – посинение, индола – покраснение), желатину (разжижение), молоко (сворачивание). Микробиологические ферменты широко используются в медицине и промышленности. Так, получаемые из Aspergillus niger кислотоустойчивая амилаза и протеаза применяются как лекарственные средства, способствующие пищеварению. Для заживления ран и ожогов могут применяться стрептокиназа (из Streptococcus spheroides) и коллагеназа (из Clostridium hystolyticum). Рост бактерий – координированная репликация (удвоение) всех компонентов клетки. На рост микроорганизмов влияют условия среды обитания, количество воды, питательных субстратов, токсических метаболитов. Бактерии размножаются путем бинарного (поперечного) деления, реже путем почкования (франциселлы – возбудители туляремии). Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки. Актиномицеты 44 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология могут размножаться путем фрагментации нитевидных клеток как ветвящиеся бактерии, спорами как и грибы. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь материнской ДНК раскручивается и каждая нить достраивается дочерней комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекулы ДНК нуклеоида. Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация или рост цепи, и терминация. Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру – периодической. Если условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование – непрерывное, а культура – непрерывная. При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий (рис. 33). Рис. 33. Колонии бактерий на плотной среде: 1 – S-колонии, 2 – R-колонии Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов: оптимального состава питательной среды, температуры, рН, окислительновосстановительного потенциала и др. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов: 1) лаг-фаза (начальная); 2) фаза логарифмического роста; 3) фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; 4) фаза гибели бактерий. Лаг-фаза – период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы составляет в среднем 2–5 ч, зависит от состава питательной среды и свойств самих микробов. Бактерии при этом адаптируются к условиям среды, увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает ко45 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология личество нуклеиновых кислот, белка, индуцибельных ферментов и других компонентов. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста – период интенсивного деления бактерий продолжительностью около 5–6 ч, может увеличиваться до 24 ч. у микобактерий. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20–40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность – несколько часов, колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. Снижение скорости размножения происходит за счет снижения в среде содержания питательных субстратов, парциального давления кислорода, большой плотности микробных клеток, накопления токсических метаболитов. Фаза гибели характеризуется отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательных субстратов и накопления в среде токсических метаболитов. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования. Рядом ученых предлагается 4 большие фазы размножения бактерий подразделить на более короткие фазы, без изменения сути отражаемых процессов. При этом лаг-фаза (начальная) – исходная. Фаза логарифмического роста включает фазы ускорения роста, собственнологарифмического роста, замедления роста. Фаза стационарного роста – стационарная фаза. Фаза гибели бактерий включает фазы ускорения гибели, логарифмической гибели, замедления гибели, собственно гибели или спорообразования (у грамположительных бактерий) - рис. 34. Рис. 34. Фазы роста микробной популяции: I - исходная фаза; II - фаза ускорения роста; III - фаза логарифмического роста; IV - фаза замедления роста; V стационарная фаза; VI - фаза ускорения гибели; VII - фаза логарифмической гибели; VIII - фаза замедления гибели; IX - фаза гибели или спорообразования (www.studfiles.ru) 46 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Колонии на плотной среде характеризуют по следующим признакам: форма, величина, рельеф, характер поверхности, краев, прозрачность, цвет, внутренняя структура, консистенция, эмульгирование в капле воды. Форма колоний может быть круглой, овальной, звездчатой, амебовидной, др. Величина колоний определяется ее диаметром, различают точечные (карликовые) – диаметр меньше 1 мм, мелкие – 1-2 мм, средние – 2-4 мм, крупные колонии – 4-6 мм и более. Рельеф колоний характеризуется приподнятостью ее над поверхностью среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Рельеф колонии определяется невооруженным глазом или с лупой при рассмотрении ее сверху и сбоку. Различают колонии плоские, выпуклые, куполообразные, каплеобразные, конусообразные, с вдавленным центром. Характер поверхности: ровная, гладкая (S-форма) или складчатая, шероховатая (R-форма), исчерченная, матовая или блестящая, сухая или влажная. Контур краев колоний может быть ровным, изрезанным, фестончатым, бахромчатым, волокнистым и т.д. По прозрачности колонии подразделяются на прозрачные, полупрозрачные или непрозрачные. По цвету колонии могут быть бесцветными, окрашенными. Цвет колоний определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Красный цвет образуют некоторые актиномицеты, дрожжи, бактерии. Синий цвет характерен для синегнойной палочки, желтый, лимонный, золотистый пигмент образуют стафилококки, сарцины. Черные и бурые пигменты вырабатывают некоторые грибы, фузобактерии и другие микроорганизмы. Большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, поэтому колонии их бесцветны или молочномутного цвета. Внутренняя структура колонии может быть гомогенная, зернистая, неоднородная. Консистенция колоний: пастообразная, вязкая, слизистая, крошковидная, волокнистая, плотная, хрупкая, сухая и т.д. Консистенцию колонии определяют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей. Колонии в капле воды могут эмульгировать хорошо или плохо. Колонии на жидких питательных средах характеризуют по следующим признакам: поверхностный рост: пристеночное кольцо, нежная пленка, грубая морщинистая пленка, поверхностный рост отсутствует; помутнение среды: слабое, умеренное, сильное, стойкое, отсутствует; осадок: плотный, зернистый, вязкий, в виде клочка ваты, в виде хлопьев, крошковатый и т.д.; количество осадка: обильное, скудное, отсутствует; 47 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология цвет среды: не изменен, изменен (приобретает окраску пигмента, образуемого микроорганизмом); газообразование: наличие или отсутствие пузырьков газа. Рост микробов на полужидкой питательной среде характеризуют по следующим признакам: форма колоний: круглые, овальные, разветвленные; размеры колоний: точечные, средние, крупные; края: ровные, разорванные, лопастные, зубчатые; поверхность: матовая, блестящая, ровная или складчатая; разжижение среды: быстрое, медленное, отсутствует. Изучение культуральных свойств микроорганизмов является необходимым этапом при идентификации их чистой культуры. Вопросы для самоконтроля 1. Классификация ферментов бактерий по месту действия, механизму, времени образования, типу ферментируемого субстрата. 2. Исследование ферментативной активности микробов. 3. Рост и размножение микроорганизмов. 4. Признаки размножения бактерий в жидкой питательной среде. 5. Признаки размножения бактерий на плотной питательной среде. 6. Фазы роста бактерий. 7. Характеристика культуральных свойств микробов. Тема 7. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЛОСТИ РТА, БИОПЛЕНОК. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ И ДЕЗИНФЕКЦИИ В СТОМАТОЛОГИИ, ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА Полость рта человека – уникальная экологическая система для разнообразных микроорганизмов, формирующих постоянную (аутохтонную, индигенную) микрофлору, которая играет важную роль в здоровье и болезнях людей. В состав нормальной микрофлоры полости рта входят бактерии, вирусы, грибы и простейшие. Наиболее многочисленны бактериальные биоценозы, поддерживающие постоянство данного биотопа. Микробы попадают в полость рта с пищей, водой и из воздуха. В полости рта встречаются 1) аутохтонные – виды, специфические для данного биотопа, 2) аллохтонные – иммигранты из других биотопов хозяина (носоглотки, иногда кишечника) и из окружающей среды. Аутохтонную микрофлору подразделяют на 1) облигатную, которая постоянно обитает в полости рта, и 2) факультативную (условно-патогенные бактерии). Главное значение имеют облигатные виды аутохтонной микрофлоры полости рта; факультативные виды встречаются реже, наиболее характерны для отдельных заболеваний зубов, пародонта, слизистой оболочки полости рта и губ. 48 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Около половины постоянных (резидентных) видов являются факультативными и облигатными анаэробными стрептококками (S. mutans, S. sanguis, S. mitis, S. salivarius и пептострептококки). Основные биотопы полости рта – слизистые оболочки, спинка языка, десневая борозда, ротовая жидкость и зубной налет. Кроме слюны, микроорганизмы находятся в трех зонах: 1) в зубных бляшках на коронках зубов, а в случае кариеса – в кариозных полостях; 2) в гингивальных (десневых) бороздах: десневая щель и прилегающие поверхности зубов (поверхности между зубами) имеют низкий (отрицательный) окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) – наиболее активно размножаются облигатные анаэробы; 3) на спинке языка, особенно в задних ее отделах, слизистых щек и неба (аэробная среда с позитивным ОВП – лучший рост факультативных анаэробов). Количество бактерий в слюне колеблется от 43 млн. до 5,5 млрд. в 1 мл (в среднем 750 млн. в 1 мл). Микробная концентрация в бляшках и десневой борозде почти в 100 раз выше – примерно 200 млрд. клеток в 1 г пробы, в которой около 80% воды. Формирование микрофлоры полости рта. В ротовой полости новорожденных детей первыми появляются стрептококки (S. mitis, S. oralis и S. salivarius), заполняют определенные ниши и в их пределах изменяют условия среды, в результате чего могут размножаться новые популяции микробов. Взаимодействия (синергические и антагонистические) между различными видами помогают в сохранении гомеостаза оральной микрофлоры и формировании отдельных биотопов. С течением времени возрастают разнообразие и сложность микробного сообщества. Процесс заканчивается, если нет соответствующей ниши, доступной для новых популяций. Таким образом, достигается относительная стабильность микрофлоры полости рта, базирующаяся на гомеостазе, который включает компенсаторные механизмы, поддерживающие необходимые параметры. Адгезия микробов может осуществляться: 1) путем неспецифического взаимодействия между поверхностями микроорганизмов и клеток макроорганизма (за счет водородных, ионных связей, гидрофобного отталкивания, ван-дер-ваальсовых сил) (тейхоевые кислоты бактерий связываются с отрицательно заряженными компонентами клетки-мишени через ионы кальция, водородные, гидрофобные связи); 2) путем специфического взаимодействия адгезинов поверхности микробов и рецепторов эпителиоцитов ротовой полости, структурами зубной эмали по принципу комплементарности. Микробные адгезины – поверхностные полисахариды, липотейхоевые кислоты, гликозилтрансферазы, белки, связанные с углеводами (лектины) – компоненты клеточной стенки, пилей, фимбрий, фибрилл, капсулы. Рецепторы – компоненты слюны (муцины, гликопротеины, амилаза, лизоцим, IgA, IgG, богатые пролином белки, статерин), микробные компоненты 49 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология (гликозилтрансферазы или глюканы), связанные с поверхностями ротовой полости. Пили или фимбрии Actinomyces viscosus и поверхностный антиген (белок Р1) Streptococcus mutans могут прикрепляться к богатым пролином белкам;A. viscosus и Fusobacterium nucleatum – к статерину. Возможен контакт лектиноподобного протеина бактерий с комплементарным углеводным рецептором – гликопротеинами клетки хозяина. S. sanguis может прикрепляться к олигосахарам, содержащим сиаловую кислоту, низкомолекулярным муцинам слюны. Фимбрии 2 типа актиномицетов присоединяются через бета-связь галактозы гликопротеина на поверхностях клеток эпителия. Некоторые бактерии могут колонизировать поверхность слизистых или зубов, закрепляясь на поверхностных структуpax других бактерий, т. е. осуществляя коагрегацию – пример комменсализма и синергизма между микробами. Большинство коагрегаций – межродовые. Внутривидовая коагрегация возможна только у зеленящих стрептококков. Стрептококки разных видов коагрегируют с актиномицетами, F. nucleatum, Veillonella, Haemophilus parainfluenzae. F. nucleatum связывается с Porphyromonas gingivalis, Haemophilus parainfluenzae, Treponema spp. Другой пример коагрегации – синтез S. mutans внеклеточных полисахаридов из сахарозы, способствующих прикреплению бактерий к зубам и благоприятствующих увеличению стабильности матрикса бляшки. Различные виды бактерий могут кооперироваться в использовании субстратов, которые они не способны метаболизировать в одиночку. F. nucleatum и P. gingivalis синергически гидролизуют казеин. Деградация гликопротеина может включать синергическое действие различных микробов, обладающих взаимно дополняющими видами гликозидазной и протеазной активности. Метаболизм углеводов стрептококками и актиномицетами до лактата стимулирует рост вейллонелл. P. gingivalis вырабатывает жирные кислоты, стимулирующие рост T. denticola. Факультативные анаэробы понижают концентрацию О2 и ОВП до уровней, пригодных для колонизации слизистых строгими анаэробами. Антагонистические взаимодействия: 1) продукция лактата S. mutans снижает рН и тормозит рост S. oralis и S. sanguis, грамотрицательных неспорообразующих бактерий. 2) продукция Н2О2 оральными стрептококками ослабляет рост пародонтопатогенных бактерий, лишенных защитных ферментов (пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы); 3) бактерии (S. mutans) могут продуцировать бактериоцины (пептидные антибиотики, специфически подавляющие рост близкородственных микробы). Конкуренция за рецепторы адгезии, питательные вещества и продукция ингибиторов – наиболее важные механизмы, регулирующие колонизацию микробов, предупреждающие чрезмерное размножение бактерий в полости рта, влияющие на формирование родового состава биотопов полости рта. 50 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Таким образом, при формировании микробиоценоза полости рта имеют значение: 1) скорость адгезии и колонизации; 2) конкуренция за источники питания; 3) изменение рН и ОВП среды; 4) выделение ингибиторов, влияющих на размножение микробов. Биопленка – совокупность микроорганизмов, колонизирующих поверхность и внедренных в полимерный субстрат (зубной налет, зубная бляшка). Свойства биопленки: 1) взаимодействующая общность разных микробов; 2) микроорганизмы биопленки собраны в микроколонии (рис. 35); 3) микроколонии окружены защитным высокогидратированным экзополисахаридно-муциновым матриксом, образованным из микробных полимеров, пронизанным каналами для циркуляции питательных веществ, продуктов жизнедеятельности, ферментов, метаболитов и О2; 4) внутри микроколонии формируется микроэкологическая среда, отличающаяся уровнем pH, усваяемостью питательных веществ, концентрацией О2; 5) микробы имеют примитивную систему связи, «общаются между собой» посредством химических раздражений (сигналов), вызывающих выработку бактериями потенциально вредных белков и ферментов; 6) микробы в биопленке устойчивы к антибиотикам, антимикробным средствам и защитным реакциям макроорганизма. Микробы в биопленках устойчивы к воздействию антибиотиков за счет: замедления проникновения антибиотиков через внеклеточный матрикс; адсорбции антибиотиков на полисахаридном матриксе; сниженной скорости роста микробы в составе биопленки. Рис. 35. Строение биопленки: 1) микроколонии микробов, 2) межмикробный матрикс, 3) пелликула, 4) проводящие каналы, 5) зуб Стадии формирования биопленок полости рта: 1) обратимое связывание бактерий с поверхностью субстрата, 2) стойкое прикрепление бактерий к поверхности, 3) размножение микробов, выработка полимеров, включение новых видов микробов путем межбактериальных взаимодействий, 4) образование зрелой биопленки (климаксового сообщества) – рис. 36. Рис. 36. Стадии формирования биопленок полости рта 51 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Факторы, осуществляющие взаимодействия микроорганизмов и эпителиальных клеток полости рта: цитокины, лиганды рецепторов апоптоза, ростовые факторы, бактериальные метаболиты бактерий, специальные толлподобные рецепторы (TLR), которые определяют инвазию бактерий в клетки. Дезинфекция – это методы и средства уничтожения болезнетворных микроорганизмов на путях передачи от источника инфекции к здоровому организму. Основная задача дезинфекции – прерывание механизма передачи инфекции обеззараживанием различных объектов (вода, поверхности объектов, пищевые продукты, предметы бытовой обстановки и др.). Виды дезинфекции: механическая, физическая, химическая. Механическая дезинфекция включает влажную уборку помещений, мытье, стирку, вытряхивание и выколачивание, фильтрацию воздуха и воды. Механический способ не приводит к полному освобождению от микроорганизмов, поэтому часто сочетается с физическим и химическим способами. Физическая дезинфекця – кипячение, обработка паром и горячим воздухом, ультрафиолетовое облучение. Дезинфекция лучше всего достигается при кипячении (100 ºС, не менее 10 мин). Кипячение используется для обработки белья (кипятят в мыльно-содовом растворе в течение 2 ч), посуды (в 2% содовом растворе в течение 15 мин), питьевой воды, игрушек, остатков пищи. Паровоздушная смесь используется в дезинфекционных камерах, где обеззараживают вещи и постельные принадлежности. Ультрафиолетовое облучение используется для обеззараживания воздуха помещений. Химическая дезинфекция состоит в применении химических средств, губительно действующих на возбудителей инфекционных заболеваний. Химические дезинфицирующие средства (дезинфектанты): 1) хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин, дезам, дихлор, хлорцин, гипохлориты и др.), 2) детергенты дезинфицирующего действия («Универсальный», «Санитарный», «Санита» и др.), 3) окислители (перекись водорода, перманганат калия), 4) спирты (метанол, этанол, изопропранолол), 5) чистые растворимые фенолы (стеркол и хайколин) – убивают большинство бактерий, включая микобактерии туберкулеза, ограниченная противовирусная активность, 6) альдегиды (Глутарал, Гигасепт ФФ, Лизоформин-3000, Дезаформ, Альдазан2000 (производные глютаральдегида и формальдегида) активны против бактерий, вирусов и грибов, но медленно работают против микобактерий, раздражают кожу и глаза. Аппаратная дезинфекция. Основана на сочетании всех способов дезинфекции и специального оборудования: паровые камеры – дезинфекция текучим паром при температуре около 105 ºС; 52 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология пароформалиновые камеры – смесью паров формалина и воды дезинфицируются матрасы, постельные принадлежности, одежда, обувь и другая утварь, в т. ч. книги и архивные материалы, которые нельзя дезинфицировать растворами; моечно-дезинфекционные автоматы – качественно моют и дезинфицируют стеклянную и фарфоровую посуду, хирургический инструментарий, анестезиологическое оборудование, жесткие эндоскопы, обувь; ультразвуковая очистка незаменима в качестве предстерилизационной обработки хирургического инструментария, процесс очистки основан на образовании под воздействием ультразвуковой волны мельчайших пузырьков воздуха, которые отрывают от поверхности очищаемого предмета все посторонние частички. Дезинфекцию стоматологических оттисков осуществляют после их предварительного промывания. Оттиски, предварительно отмытые водой (с соблюдением противоэпидемических мер – с использованием резиновых перчаток, фартука), дезинфицируют путем их погружения в рабочий раствор дезинфицирующего средства, выбор которого определяется видом оттискного материала. По окончании дезинфекции оттиски и зубопротезные заготовки промывают проточной водой. Карпульные шприцы после каждого пациента обрабатываются как и другие стоматологические инструменты (дезинфекция, ПСО, стерилизация). Наружные поверхности бормашин и каналы для бора протирают стерильным марлевым тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, наконечники к бормашинам – двухкратно (до и после лечения пациента). Наконечники для диатермокоагуляции, скеллеры для снятия зубных отложений, наконечники для ополаскивания после каждого использования подвергают дезинфекции, ПСО, стерилизации. Стерилизация – метод, обеспечивающий гибель в стерилизуемом материале вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микробов. Этапы стерилизации: дезинфекция; предстерилизационная очистка (ПСО); стерилизация. Качество предстерилизационной очистки изделий оценивается путем постановки азопирамовой или амидопириновой проб на наличие остаточных количеств крови, а также путем постановки фенолфталеиновой пробы на наличие остаточных количеств щелочных компонентов моющих средств. Методы стерилизации: термические (паровой, воздушный, глассперленовый); химические (газовый, растворы химических соединений); радиационный; 53 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология плазменный и озоновый (группа химических средств). Стерилизацию стоматологических изделий осуществляют физическим и химическим методом. Стерилизация физическими методами: - сухим жаром – в воздушном стерилизаторе при 180 °C в течение 60 мин. или при 160 °С в течение 150 мин. (стерилизуемый материал: стеклянная посуда, пипетки, вата, металлические инструменты); - паром под давлением – в паровом стерилизаторе (автоклаве) при 132 °C, 2 атм в течение 20 мин. или при 120 °C, 1 атм в течение 45 мин. (стерилизуемый материал: питательные среды, заразный материал, изделия из стекла и металла, резины и латекса, халаты, белье, перчатки, перевязочный и шовный материал, зеркала); - в среде нагретых стеклянных шариков – при t до 250 °C в глассперленовых стерилизаторах (стерилизуемый материал: мелкие стоматологические инструменты, не подлежащие длительному хранению – боры, эндодонтические инструменты, зубоврачебные зеркала). Стерилизацию можно осуществлять химическим методом, который является вспомогательным в стоматологической практике. Данный метод следует применять только, если особенности материалов изделий не позволяют использовать другие рекомендованные методы стерилизации. Контроль эффективности работы стерилизационного оборудования осуществляется физическими, химическими и биологическим (бактериологическим) методами. Физические и химические методы предназначены для оперативного контроля и позволяют контролировать соблюдение параметров режимов паровой, газовой, воздушной стерилизации. Достоверным для определения эффективности стерилизации является только бактериологический метод. Физические методы контроля осуществляются с помощью средств измерения температуры (термометры), давления (манометры), времени (таймеры). Современные стерилизаторы оснащены записывающими устройствами, фиксирующими отдельные параметры каждого цикла стерилизации. Критическими параметрами являются: для парового метода стерилизации – температура, время воздействия данной температуры, водяной насыщенный пар; для воздушного метода стерилизации – температура и время воздействия данной температуры; для газовых методов стерилизации – концентрация используемого газа, температура, время воздействия, уровень относительной влажности; для радиационной стерилизации – полная поглощенная доза. Химические методы – при меняют бензойную кислоту для контроля паровой стерилизации, сахарозу, гидрохинон и ряд др. веществ – для контроля воздушной стерилизации. При изменении цвета и расплавлении указанных веществ результат стерилизации признавается удовлетворительным. Однако даже при удовлетворительных результатах химического контроля с помощью химиче54 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология ских индикаторов, бактериологический контроль в ряде случаев (до 12 %) выявляет неудовлетворительный результат стерилизации. В настоящее время для проведения бактериологического контроля используются биотесты, имеющие дозированное количество спор тест-культуры. Контроль эффективности стерилизации с помощью биотестов рекомендуется проводить 1 раз в 2 недели. Вопросы для самоконтроля 1. Разновидности микроорганизмов полости рта. 2. Виды и примеры взаимодействия между микроорганизмами полости рта. 3. Факторы, влияющие на микроорганизмы полости рта 4. Биопленка: определение, свойства. 5. Стадии формирования биопленок полости рта. 6. Факторы, осуществляющие взаимодействия бактерий и эпителиальных клеток полости рта. 7. Понятие о дезинфекции. 8. Виды дезинфекции в зависимости от вида предмета медицинского назначения и цели его применения. 9. Основные классы дезинфицирующих средств. 10. Характеристика аппаратной дезинфекции. 11. Стерилизация: определение, этапы, виды. 12. Определение эффективности стерилизации. Тема 8. ДЫХАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. ЭТАПЫ, СПОСОБЫ И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБОВ, АНАЭРОБОВ Дыхание (биологическое окисление) – процесс получения энергии в результате окислительно-восстановительных реакций, сопряженных с окислительным фосфорилированием, при котором донорами электронов или протонов водорода могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором – только неорганические вещества. Энергия необходима микроорганизмам для жизнедеятельности. Акцептором электронов или протонов водорода может быть молекулярный кислород – аэробное дыхание или нитрат, сульфат, фумарат – анаэробное дыхание – нитратное, сульфатное, фумаратное. Если в процессе получения энергии акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожение. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов сахаролитическими микробами различают следующие виды брожения: спиртовое (у дрожжевых грибов), молочнокислое гомоферментативное (Streptococcus pyogenes, S. salivarius, Lactobacillus lactis), 55 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология молочнокислое гетероферментативное (Lactobacillus, Bifidobacterium), уксуснокислое, маслянокислое (сахаролитические строгие анаэробы – бактероиды, фузобактерии), муравьинокислое (Enterobacteriaceae, Vibrionaceae). В результате расщепления глюкозы расходуется 2 молекулы, а синтезируется 4 молекулы АТФ. Общий выход АТФ при брожении составляет 2 молекулы АТФ и 2 молекулы НАДН2, а при дыхании – 38 молекул АТФ. Полученный в ходе реакции пируват утилизируется клеткой по-разному в зависимости от того, какому типу брожения она следует. В ферментации белков пептолитическими микробами участвуют Clostridium histoliticum, C. botulinum – гидролизуют белки, сбраживают аминокислоты до кетокислот, а затем жирных кислот. По отношению к молекулярному кислороду (по типу дыхания) бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные (обязательные) аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы. В свою очередь облигатные аэробы подразделяются на строгие аэробы (растут и размножаются только в присутствии О2 – коринебактерии, бордетеллы, гонококки и др.) и микроаэрофилы (растут и размножаются при пониженной концентрации О2 – кампиллобактерии, хеликобактерии). Облигатные анаэробы подразделяются на строгие анаэробы (погибают в присутствии О2 – бактероиды, клостридии, фузобактерии) и аэротолерантные анаэробы (могут переносить кратковременное воздействие О2 – бифидобактерии, лактобактерии). Факультативные анаэробы способны расти и размножаться как в присутствии О2, так и в его отсутствии – большинство условно-патогенных микроорганизмов (стрептококки, стафилококки и др.). Микроорганизмы, вызывающие поражения пародонта, (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, спирохеты) являются облигатными анаэробами и обитают в зубных бляшках (больше в поддесневых). Большинство обитателей полости рта (стрептококки) – факультативные анаэробы. Рост и размножение Actinobacillus actinomycetemcomitans и Capnocytophaga gingivalis, способствующих поражению пародонта, стимулируются СО2 – капнофилы. Среда с содержанием кислорода является агрессивной по отношению к органическим формам жизни. Это связано с образованием активных форм кислорода в процессе жизнедеятельности или под действием различных форм ионизирующего излучения, значительно более токсичных, чем молекулярный кислород O2. 56 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Фактор, определяющий жизнеспособность микробов в присутствии кислорода – наличие функциональной антиоксидантной системы, способной к элиминации супероксид-аниона (O2−), перекиси водорода (H2O2), синглетного кислорода (O), молекулярного кислорода (O2) из внутренней среды организма. Наиболее часто подобная защита обеспечивается одним или несколькими ферментами: супероксиддисмутаза, элиминирующая супероксид-анион (O2−) без энергетической выгоды для организма, каталаза, пероксидаза, элиминирующие перекись водорода (H2O2) без энергетической выгоды для организма, цитохром – фермент, отвечающий за перенос электронов от NADH к O2, обеспечивает существенную энергетическую выгоду организму. Аэробные микроорганизмы содержат чаще всего три цитохрома, факультативные анаэробы – один или два, облигатные анаэробы не содержат цитохромов. Дополнительная антиоксидантная защита может обеспечиваться синтезом или накоплением низкомолекулярных антиоксидантов: витамина С, А, E, лимонной и др. кислот. В зависимости от содержания О2 в питательной среде существуют особенности роста микроорганизмов по ходу укола в столбик среды. Строгие аэробы в основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество O2 (исключение: микобактерии (факультативные анаэробы) – рост пленкой на поверхности из-за воско-липидной мембраны). Строгие анаэробы собираются в нижней части, чтобы избежать действия активных форм O2, либо не дают роста. Факультативные анаэробы собираются в основном в верхней части (окислительное фосфорилирование энергетически более выгодно, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как не зависят от присутствия O2. Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но не у поверхности, их оптимум – сниженная концентрация O2. Аэротолерантные анаэробы не реагируют на присутствие O2 и равномерно распределяются по среде (рис. 37). Рис. 37. Рост аэробов и анаэробов в жидкой питательной среде в зависимости от концентрации O2: 1) строгие аэробы, 2) строгие анаэробы, 3) факультативные анаэробы, 4) микроаэрофилы, 5) аэротолерантные анаэробы Культивирование микроорганизмов осуществляют посевом их на питательные среды с последующей инкубацией в оптимальных условиях температуры, влажности, газового состава атмосферы и т.д. С этой целью материал, содержащий микробы (материал от больного, из чистой культуры, из изолированной колонии и т.д.), помещают (засевают) в жидкие, полужидкие или на плотные среды. 57 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология В зависимости от техники посева (посев петлей, шпателем на плотную среду в чашку Петри, посев петлей в жидкую питательную среду) и концентрации микробов в посевном материале бактерии на поверхности плотной питательной среды могут образовывать изолированные колонии или давать равномерный сплошной рост – бактериальный газон, «сливной рост» (возникает при помещении большого количества микроорганизмов на ограниченный участок поверхности агара). При биохимической дифференциации микробов определяют их свойства: 1) сахаролитические – способность сбраживать углеводы с образованием кислоты и газа или только кислоты; 2) протеолитические – способность разлагать белковые продукты с образованием сероводорода, индола, аммиака и др. веществ; 3) редуцирующие – способность восстанавливать некоторые химические вещества (нитраты и др.). Сахаролитические свойства микроорганизмов определяют путем посева ЧК на дифференциально-диагностические питательные среды, содержащие различные углеводы (лактозу, сахарозу, глюкозу, мальтозу, маннит и др.) и индикатор (нейтральный красный, лакмус, фуксин основной и др.). Наиболее распространенной является среда Гисса. На дно пробирки со средой опускают «газовки» – поплавки для улавливания газа. При разложении микробами углевода происходит закисление среды и изменяется цвет среды благодаря присутствию индикатора (желтая окраска среды Гисса меняется на красную). Короткий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и 6-атомным спиртом – маннитом. В длинный «пестрый ряд» наряду с перечисленными углеводами вводят среды с моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Определение протеолитических свойств микроорганизмов проводят на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. Пептон – промежуточный продукт распада белков, смесь полипептидов и аминокислот, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Желатин – животный клей, состоящий из белка сухожилий, костей, хрящей, плавится при 32–34 °С, застывает при 16 °С. При посеве уколом в столбик желатина микробы, разлагающие желатин, разжижают среду. Действие микробов, разлагающих казеин, проявляется в пептонизации молока, которое приобретает вид молочной сыворотки. В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуют индол, сероводород, аммиак и др. соединения. При наличии H2S фильтровальная бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. При наличии индола индикаторная бумага, пропитанная раствором щавелевой кислоты (метод Морелли), краснеет или розовеет. 58 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Аммиак определяют при помощи увлажненной красной лакмусовой бумаги, в присутствии аммиака бумага синеет. Продукцию H2S можно определить также путем посева исследуемой культуры микроорганизмов уколом в столбик с питательной средой, содержащей различные соли (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). При образовании Н2S среда окрашивается в черный цвет за счет образования сульфида железа (FeS). Индол можно определить по методу Эрлиха. Для этого в пробирку с исследуемой культурой микроорганизмов добавляют 2–3 мл эрифа, энергично перемешивают и прибавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор параметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). При наличии индола наблюдается розовое окрашивание или розовое кольцо. Для обнаружения каталазы на предметное стекло наносят каплю 1–3 % раствора перекиси водорода и в нее вносят бактериологической петлей исследуемую культуру микробов. При положительном результате наблюдают выделение пузырьков газа в результате разложения Н2О2 на кислород и воду. При необходимости исследуют другие признаки, например способность восстанавливать нитраты, карбоксилировать аминокилоты, образовывать оксидазу, плазмокоагулазу, фибринолизин и другие ферменты. Культивирование бактерий применяют для выделения и идентификации чистых культур. Выделение чистой культуры бактерий проводят в 3 этапа: 1) получение изолированных колоний, 2) накопление чистой культуры (ЧК), 3) идентификация ЧК. При наличии небольшого числа микроорганизмов в исследуемом материале предварительно производят посев на среды обогащения. Некоторые микробы (пневмококки, возбудители туляремии) сначала вводят в организм восприимчивых животных (биологическая проба), затем выделяют ЧК. Идентификацию ЧК проводят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам, факторам патогенности, чувствительности к бактериофагам (фаготипирование) и антибиотикам. В зависимости от типа дыхания схема выделения и идентификации ЧК бактерий будет различаться. При культивировании аэробов на первом этапе берут исследуемый материал, наносят на предметное стекло, готовят мазок-препарат, окрашивают по Граму, микроскопируют. Далее проводят посев материала (микроорганизмов) штрихами на чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), инкубируют в термостате 1 сутки при 37 ºС – для получения изолированных колоний. На 2-й день микробы с изолированной колонии наносят на предметное стекло, готовят мазок-препарат, окрашивают по Граму, микроскопируют. Проводят 59 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология пересев с той же изолированной колонии штрихами на скошенный агар, пробирку с посевом инкубируют в термостате 1 сутки при 37 ºС – для накопления ЧК. На 3-й день микроорганизмы с колонии на скошенном агаре наносят на предметное стекло, готовят мазок-препарат, окрашивают по Граму, микроскопируют. Приготавливают мазки, окрашенные по Бурри-Гинса, Ожешко, препарат «висячая капля», микроскопируют, проводя тем самым идентификацию ЧК по морфологическим и тинкториальным свойствам. Оценивают характер колоний на скошенном агаре, определяя культуральные свойства микроорганизмов выделенной ЧК. Для изучения биохимической активности микробов, проводят их посев с колонии на скошенном агаре на среды, содержащие сахара (среды Гисса, Эндо), белки (МПБ), инкубируют в термостате 1 сутки при 37 ºС. Антигенные свойства микроорганизмов выделенной ЧК исследуют в серологических реакциях (РСК, ИФА). Наличие факторов патогенности оценивают по определению капсулы (мазок по Бурри-Гинса), токсинообразования (реакция преципитации в агаре), др. Для определения чувствительности к бактериофагам проводят фаготипирование микробов ЧК, к антибиотикам – применяют метод дисков. На 4-й день оценивают сахаролитическую и протеолитическую активность микроорганизмов ЧК, наличие факторов патогенности, результат фаготипирования, антибиотикочувствительности. Делают заключение о выделенном в ЧК микроорганизме. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты – биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам – сероварами, по чувствительности к фагу – фаговарами и т.д. Для культивирования анаэробов создают анаэробные условия с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов. Физические методы культивирования анаэробов 1. Кипячение среды – непосредственно перед посевом материала пробирки с жидкими питательными средами кипятят на водяной бане в течение 15-20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Среду быстро охлаждают, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1,0-1,5 см). Засев среды проводят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. 2. Посев уколом в столбик питательной среды. Пробирку с питательной средой, застывшей в виде столбика, берут в левую руку и в центр столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом. Пробирку закрывают пробкой, в верхней третьей части подписывают. В штативах помещают в термостат для инкубирования. 3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из анаэростатов (рис. 38), анаэробных боксов с помощью вакуумного насоса с 60 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология последующей заменой его инертным газом (азот, аргон, гелий). Анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. В прибор помещают чашки с посевами, откачивают воздух, кран закрывают, ставят в термостат для Рис. 38 культивирования анаэробов при определенной температуре. Для поглощения водных паров на дно анаэростата помещают 5–6 г хлористого кальция, 10–12 г силикогеля или 20–30 г хлористого натрия. Анаэробные условия в микроанаэростате могут быть созданы и при использовании коммерческих газогенерирующих пакетов для анаэробов (BioMerioux; Becton Dickinson). 4. Метод Вейон-Виньяля. В узкую стеклянную пипетку заливают расплавленный агар, смешанный с исследуемой культурой микроорганизмов. После чего пипетку запаивают с обоих концов парафином. Пипетку инкубируют одни сутки в термостате при температуре 37 ºС. В расплавленном агаре микробы распределяются равномерно и по истечении времени инкубации образуются хорошо видимые на просвет их изолированные колонии. Пипетку просматривают, после чего производят распил пипетки в месте локализации отдельных колоний и забирают их бактериологической петлей для идентификации. Химические методы культивирования анаэробов 1. Метод Аристовского. На дно эксикатора кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфат натрия или пирогаллол. Исследуемый материал засевают на питательную среду в чашку Петри и помещают на подставку в эксикатор с дальнейшей инкубацией в термостате при 37 ºС в течение 24–48 ч. 2. Применение редуцирующих веществ для связывания кислорода в питательных средах – используются тиогликолевая кислота, тиогликолят натрия (0,01–0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), сахара (0,1–3%), цистин и цистеин (0,03–0,05%), муравьинокислый натрий (0,25–0,75%) и др. Биологические методы культивирования анаэробов 1. Метод Фортнера – совместное выращивание анаэробов и аэробов. На одну половину чашки Петри засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой заливают парафином. 2. Помещение в питательную среду тканевых кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают кислород, в результате в среде создаются анаэробные условия. Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками. Пример, среда Китта-Тароцци (мясо-пептонный бульон, 0,5% раствор натрия хлорида, глюкоза, кусочки печени или мышц для адсорбции кислорода). На поверхность среды тонким слоем наслаивают вазелиновое масло. 61 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология При культивировании анаэробов на первом этапе берут исследуемый материал, наносят на предметное стекло, готовят мазок-препарат, окрашивают по Граму, микроскопируют. Далее проводят посев материала (микроорганизмов) в пробирку со средой Китта-Тароцци, инкубируют в термостате 1 сутки при 37 ºС – для разобщения аэробов и анаэробов. На 2-й день микроорганизмы со среды Китта-Тароцци наносят на предметное стекло, готовят мазок-препарат, окрашивают по Граму, микроскопируют. Проводят пересев со среды Китта-Тароцци методом Цейсслера, Вейнберга или Перетца – для получения изолированных колоний. 1. Метод Цейсслера. Материал засевают штрихами последовательно на три чашки Петри с агаром Цейсслера, помещают в анаэробные условия, инкубируют в термостате при 37 ºС 24–72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта-Тароцци для накопления ЧК. 2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4–5 мл раствора хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным до 45–50 °С полужидким сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще в четыре пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды, инкубируют в термостате при 37 ºС 24–72 ч. Выросшие в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта-Тароцци для накопления ЧК. Многократный перенос петли с материалом по вышеуказанным методам повышает степень разобщения микробов и вероятность их изолированного роста. 3. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала как указано в методе Вейнберга. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка размером 6х6 см. Среду заливают таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри, инкубируют в термостате при 37 ºС 24–72 ч. При появлении роста микроорганизмов стеклянную пластинку удаляют, а изолированные колонии засевают в пробирку со средой Китта-Тароцци для накопления ЧК. На следующий день микроорганизмы со среды Китта-Тароцци наносят на предметное стекло, готовят мазок-препарат, окрашивают по Граму, микроскопируют. Приготавливают мазки, окрашенные по Бурри-Гинса, Ожешко, препарат «висячая капля», микроскопируют, проводя тем самым идентификацию ЧК по морфологическим и тинкториальным свойствам. Оценивают характер роста микроорганизмов на среде Китта-Тароцци, определяя культуральные свойства выделенной ЧК. Для изучения биохимической активности микробов, проводят пересев со среды Китта-Тароцци на среды, содержащие сахара (среды Гисса, Эндо), белки (МПБ), инкубируют в термостате 1 сутки при 37 ºС. Антигенные свойства микроорганизмов выделенной ЧК исследуют в серологических реакциях 62 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология (РСК, ИФА). Наличие факторов патогенности оценивают по определению капсулы (мазок по Бурри-Гинса), токсинообразования (реакция преципитации в агаре), др. Для определения чувствительности к бактериофагам проводят фаготипирование микробов ЧК, к антибиотикам – применяют метод дисков. В последний день оценивают сахаролитическую и протеолитическую активность микроорганизмов ЧК, наличие факторов патогенности, результат фаготипирования, антибиотикочувствительности. Учитываю результаты, делают заключение о выделенном в ЧК микроорганизме. Для дифференциации патогенных анаэробов используют среды: кровяной агар Цейсслера, сахарный МПА, молоко, железо-сульфатный агар (среда Вильсона-Блера) и др. На среде Вильсона-Блера анаэробы образуют колонии черного цвета в глубине агарового столбика за счет восстановления сульфита до сульфиданиона, который соединяясь с катионами железа (II) дает соль черного цвета. При ферментации субстратов в среде накапливаются конечные продукты (лактат, бутират, ацетон, 2-пропанол, этанол, ацетоин и др.). Определение этих продуктов применяют для идентификация анаэробов. Например, в реакции Фогеса-Проскауэра при образовании ацетоина и 2,3-бутандиола в присутствии αнафтола наблюдается красно-бурое окрашивание среды. Кислотообразование определяют в тесте с метиловым красным. Многие микроорганизмы полости рта не культивируются на питательных средах. Для их выявления и идентификации успешно применяется молекулярно-генетический метод – секвенирование 16S рРНК. Вопросы для самоконтроля. 1. Дайте определение дыхания микроорганизмов. 2. Классификация микроорганизмов по типу дыхания. 3. Охарактеризуйте микроорганизмы в зависимости от типа дыхания. 4. Механизмы антиоксидантной защиты микроорганизмов. 5. Идентификация микроорганизмов по биохимическим свойствам. 6. Определение сахаролитической активности микробов. 7. Определение протеолитической активности микробов. 8. Этапы выделения чистой культуры микроорганизмов. 9. Физические методы создания условия для культивирования анаэробов. 10. Химические методы создания анаэробных условий. 11. Биологические методы создания анаэробных условий. 12. Методы выделения чистой культуры анаэробов: Цейсслера, Вейнберга, Перетца. Тема 9. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ БАКТЕРИЙ. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК. ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ Генетический аппарат бактериальной клетки представлен нуклеоидом и иногда внехромосомными генетическими элементами – плазмиды, транспозоны, 63 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология IS-последовательности. Генетическими элементы, способные к самостоятельной репликации – репликоны – бактериальная хромосома, плазмиды. Ген – это участок ДНК, последовательность нуклеотидов которого определяет в процессе транскрипции последовательность оснований в молекуле иРНК, а при трансляции – последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Ген у бактерий работает по принципу 1 ген – 1 белок. Выделяют: структурные или кодирующие гены, регуляторные гены – определяют транскрипцию структурных генов, ген-оператор. Генотип (генофор, геном) микробной клетки – это полный набор генов, которым обладает клетка и который определяет потенциальную способность к выражению (экспрессии) записанной в них информации в виде определенных признаков. Проявление деятельности генов при определенных условиях составляет фенотип микробной клетки. Условия окружающей среды способствуют экспрессии генов или подавляют их функциональную активность. Генетический аппарат бактерий имеет следующие особенности. 1. Гаплоидность – наличие у бактерий одной хромосомы: молекулярный вес – от 3×108 до 3×109 Да; содержит 3-8×106 н.п. Исключение: Brucella melitensis стабильно содержит две кольцевые хромосомы. У вирусов в ДНК содержится в среднем 103 н.п., у дрожжей – 107 н.п. 2. Высокая скорость размножения: бактерии делятся путем поперечного деления в геометрической прогрессии. 3. Среди бактериальных клеток существуют клетки-доноры и клеткиреципиенты. 4. Наличие у бактерий внехромосомных генетических структур: плазмиды, транспозоны, Is-последовательности, отличающиеся молекулярной массой, объемом закодированной в них информации, способностью к автономной репликации, подвижностью и др. 5. Генетический материал нуклеоида обладает консерватизмом в передаче наследственных признаков. Особенности репликации ДНК микробной клетки: 1) происходит полуконсервативным способом (каждая из двух нитей ДНК хромосомы служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи ДНК), 2) надежность репликации обеспечивается связью с ЦПМ, 3) репликация начинается в определенном локусе ДНК и происходит одновременно по обеим цепям, 4) синтез одной дочерней цепи ДНК идет непрерывно, другой – ступенчато, короткими фрагментами – по 1000-2000 нуклеотидов, которые сшиваются ферментами – лигазами, 64 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 5) параллельно с репликацией идет образование межклеточной поперечной перегородки, 6) на последней стадии дочерние клетки отделяются друг от друга, в каждой клетке оказываются идентичные молекулы ДНК, сходные с материнской. Характеристики процесса репликации: • матричный – последовательность синтезируемой цепи ДНК однозначно определяется последовательностью материнской цепи в соответствии с принципом комплементарности азотистых оснований (А-Т, Г-Ц); • полуконсервативный – одна цепь молекулы ДНК, образовавшейся в результате репликации, является вновь синтезированной, а вторая – материнской; • идет в направлении от 3’-конца к 5’-концу согласно полярности цепей (цепи двойной спирали ДНК имеют противоположную полярность – антипараллельны); • полунепрерывный – одна из цепей ДНК синтезируется непрерывно, а вторая – в виде набора отдельных коротких фрагментов (фрагментов Оказаки); • начинается с определенных участков ДНК, которые называются сайтами инициации репликации (англ. origin) – рис. 39. Рис. 39. Схема репликации ДНК (http://rudocs.exdat.com/) Плазмиды – экстрахромосомные генетические структуры бактерий – кольцевидные суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, содержат от 103 до 106 н.п., кодируют не основные функции для жизнедеятельности микробов, а функции, создающие для клетки преимущества в неблагоприятных условиях. Размеры – от 1,5 до 200 млн. Да, мелкие имеют молекулярный вес 3-6 млн. Да, крупные – 50-70 млн. Да. Чем больше молекулярная масса, чем больше и сложнее набор генов, тем многообразнее функции плазмид. 65 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Они несут: гены саморепликации, гены, кодирующие самоперенос в другие бактериальные клетки (tra-опероны), гены, определяющие свойства самой плазмиды. Могут находиться в клетках в 2 состояниях: 1) автономно – в цитоплазме и реплицируются независимо от хромосомы, 2) интегрированы в хромосому и реплицируются вместе с ней (интегративные плазмиды – эписомы). Для плазмид характерны следующие свойства: 1) способность к саморепликации (удвоению ДНК), 2) явление поверхностного исключения, 3) явление несовместимости (две плазмиды не способны стабильно сохраняться в одной клетке, если обе обладают высоким сходством репликонов), 4) контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки: различают малокопийные (1-4 копии), многокопийные (12-38 копий), число копий регулируют гены саморепликации, 5) контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине, 6) контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки, 7) способность к самопереносу, 8) способность к мобилизации на перенос, 9) способность наделять клетку важными для нее биологическими свойствами. Плазмиды распространяются между бактериями 2 способами: 1) вертикальный – в процессе клеточного деления, 2) горизонтальный – путем переноса от одной клетки в другую с помощью трансдуцирующих фагов или при образовании цитоплазматических мостиков при конъюгации при наличии tra-оперона. Классификация плазмид: 1) по способности передаваться из одной микробной клетки в другую: конъюгативные, неконъюгативные, 2) по размерам: большие, мелкие. 3) по генетической организации и функциональной активности: - «чистые» факторы генетического переноса, - плазмиды-коинтеграты (с бактериофагами) – конъюгационные коинтегративные плазмиды-коинтеграты состоят из фактора генного переноса (RTF) и генов, детерминирующих фенотипические свойства бактерий, - детерминанты. Плазмиды выполняют в основном 3 важнейшие функции: 1) контролируют у бактерий обмен генетическим материалом, 66 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 2) контролируют синтез факторов патогенности микроорганизмов и обеспечивают благоприятные возможности для сохранения и размножения микробов в организме человека или животных, 3) являются уникальным биологическим средством самозащиты бактерий, т.к. обеспечивают устойчивость к различным химическим веществам. По функциональной активности в клетке различают виды плазмид: F-плазмида кодирует перенос генетического материала при конъюгации; Col-плазмиды – плазмиды бактериоциногенности, контролируют синтез белков, летальных для других бактерий; Hly-плазмиды отвечают за синтез гемолизинов, являются конъюгативными; R-плазмиды обеспечивают устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам; tox-плазмиды кодируют синтез токсинов; Ent-плазмиды – синтез энтеротоксинов и др. Транспозоны – подвижные линейные нуклеотидные последовательности, содержащие 2000-2500 пар нуклеотидов, несут генетическую информацию. Важным свойством транспозонов является способность к перемещению: а) вдоль хромосомы, б) от хромосомной ДНК на плазмидную и т.д. Находятся в 2 состояниях: 1) в связанном с хромосомной ДНК состоянии – в виде линейной молекулы, интегрированы в хромосому: при включении в бактериальную ДНК они вызывают дупликации, а при перемещении – инверсии; вместе с хромосомой происходит их репликация, 2) транспозоны могут находиться в свободном состоянии в цитоплазме клетки в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Различают 2 класса транспозонов: 1) ретротранспозоны , которые перемещаются по геному путем обратной транскрипции с РНК клетки; 2) ДНК-транспозоны перемещаются путем прямого вырезания и вставки с использованием кодируемого транспозоном фермента транспозазы. Они несут в своем составе гены: 1) кодирующие=структурные гены, 2) регуляторные гены. Транспозоны могут приводить: 1) к изменению биологических свойств микробной популяции за счет встраивания или делеции структурных генов; 2) к инактивации генов ДНК микробной клетки, куда они, переместившись, встраиваются; 3) к слиянию плазмиды с хромосомой; 4) к повреждению генетического материала. Транспозоны имеются и в клетках растений, насекомых, животных и человека. 67 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Is-последовательности – (от англ. insertion – вставка, sequences – последовательности) – подвижные генетические структуры, «вставки последовательностей оснований». Эти фрагменты ДНК состоят в среднем из 1000 нуклеотидных пар и более (800-1400). В Is-последовательностях содержится информация для транспозиции=перемещения в различные участки ДНК хромосомы, т.к. они способны синтезировать специфический фермент рекомбинации – транспозазу, которая обеспечивает исключение Is-элемента из ДНК или его интеграцию в новый локус. Они всегда связаны с хромосомой, не обнаруживаются в свободном состоянии и реплицируются с хромосомой. Is-последовательности выполняют в микробной клетке функции: 1) координирование взаимодействия транспозонов, плазмид, умеренных фагов между собой и с хромосомой бактерий и обеспечения их рекомбинаций, 2) вызывают инактивацию или активацию структурных генов, 3) играют роль в мутациях типа делеций или инверсий в 5-9 парах нуклеотидов. Вопросы для самоконтроля 1. Организация генетического материала у бактерий. 2. Укажите особенности генетического материала бактерий. 3. Дайте определение генотипа и фенотипа. 4. Процесс репликации ДНК. 5. Перечислите внехромосомные генетические элементы. 6. Охарактеризуйте строение, классификацию, функции плазмид. 7. Охарактеризуйте строение, классификацию, функции транспозонов. 8. Is-последовательности как внехромосомные генетические элементы: строение, функции. Тема 10. ИЗМЕНЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ. МУТАЦИИ И РЕКОМБИНАЦИИ. Изменчивость микробов – изменение свойств бактериальной клетки. Может происходить изменение морфологических признаков (полиморфизм, потеря капсулы, жгутиков и др.), культуральных свойств (S-R-диссоциации колоний), метаболической активности (прототрофы, ауксотрофы), ферментативных свойств, снижение или повышение болезнетворных свойств микробов, продукция лекарственных препаратов и др. Виды изменчивости микроорганизмов: 1) генотипическая: мутации, рекомбинации, 2) фенотипическая (модификация), 3) внехромосомная. Мутации – любое стабильное изменение последовательности отдельных нуклеотидов в молекуле ДНК, проявляющееся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. 68 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология По происхождению мутации делятся на: 1) спонтанные («дикие»), возникают в результате: а) ошибки репликации, б) неправильного формирования комплементарных пар оснований, в) деформации спирали ДНК, г) вследствие перемещения подвижных генетических элементов; 2) индуцированные мутации возникают в результате действия на бактерии специальных мутагенных факторов: химических: азотистая кислота, акридиновые красители, аналоги оснований, др.; физических: УФО, рентгеновские лучи и др. виды излучений; биологических: антибиотики, продукты метаболизма и др. Они происходят с большей частотой – одна мутантная клетка на 103-104 клеток. Различают точковые, генные, хромосомные мутации. Точковые мутации – затрагивают только одну пару нуклеотидов ДНК, возникают: а) в результате замены одного нуклеотида другим – выделяют простую замену оснований или транзицию, когда пурин заменяется на пурин, а пиримидин на пиримидин, и сложную или трансверсию, когда пурин заменяется на пиримидин и наоборот; б) при вставке дополнительного нуклеотида, в) при утрате нуклеотида. Генные мутации затрагивают один ген. Хромосомные мутации затрагивают часть хромосом. В основе генных и хромосомных мутаций лежит перемещение с одного участка хромосомы на другой внехромосомных генетических структур – транспозонов и Is-последовательностей. Генные и хромосомные мутации возникают в результате: а) поворота участка хромосомы на 180° – инверсия, б) выпадения большого числа нуклеотидов – делеция, в) повторения участка хромосомы – дупликация, г) перестановки сегментов хромосомы – дислокация (транслокация). По изменению признака различают мутации: прямые – приводят к появлению нового признака, обратные (реверсии) – возвращают мутировавшую клетку к исходному генетическому состоянию. Их наблюдают с частотой – 1 клетка на 107–108 клеток. По фенотипическим проявлениям выделяют мутации: 1) видимые или явные мутации – миссенс-мутации – мутации со смыслом, 2) молчащие – вследствие вырожденности генетического кода, 3) летальные, 4) бессмысленные мутации – нонсенс-мутации. Практическое использование учения о мутациях основывается на возможностях направленного воздействия мутагенными факторами на бактериальный геном для ослабления (аттенуации) вирулентности патогенных микробов, снижения и/или ликвидации лекарственной резистентности бактерий, разра69 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология ботки медикаментозных препаратов (гормоны, витамины, ферменты), вакцинных компонентов и др. Генетическая рекомбинация – это взаимодействие между двумя геномами, т. е. между двумя ДНК, обладающими различными генотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК – дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей. В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые воспринимают его. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, что приводит к формированию неполной зиготы – мерозиготы. В результате рекомбинации в мерозиготе образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента, с включенным в него фрагментом хромосомы донора. По молекулярному механизму генетическая рекомбинация у бактерий делится на три вида: гомологичную, сайт-специфическую и незаконную. При гомологичной рекомбинации в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Гомологичная рекомбинация происходит через образование промежуточного соединения, крестообразной структуры Холидея или полухиазмы. В полухиазме осуществляется комплементарное спаривание между одноцепочечными участками, принадлежащими разным родительским молекулам ДНК. Процесс гомологичной рекомбинации находится под контролем генов, объединенных в REC-систему, состоящую из генов recA, B, C, D. Продукты этих генов производят расплетание нитей ДНК и их переориентацию с образованием структуры Холидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации. Сайт-специфическая рекомбинация происходит в определенных участках генома и не требует высокой степени гомологии ДНК (в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15-30 п.н.). Этот тип рекомбинации не зависит от функционирования генов recA, B, C, D. Примером этого типа рекомбинации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными Is-элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага в хромосому Е. coli. Сайт-специфическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении активности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгутикового Н-антигена. Незаконная или репликативная рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК и не зависит от функционирования генов recA, B, C, D. Механизмы незаконной рекомбинации малоизучены, общим для них является соединение концов негомологичных молекул ДНК. Примером является транспозиция подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами, сопровождающаяся репликацией ДНК. Другой пример: захват ретро- 70 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология вирусом некоторых клеточных генов при его эксцизии из хромосомы хозяйской клетки. Рекомбинация у бактерий является этапом передачи генетического материала между бактериями, которая осуществляется тремя механизмами: трансформацией (при помощи высокополимеризованной ДНК), конъюгацией (при контакте бактерий, одна из которых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (при помощи умеренного бактериофага). Трансформация – непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора реципиентной клетке. Впервые воспроизведена Ф. Гриффитсом в 1928 г. в экспериментах с пневмококком на белых мышах. В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и К. Мак-Карти установили, что в этих опытах активным началом, содержащимся в экстракте убитых пневмококков, и сообщающим свойство вирулентности не патогенным пневмококкам, является ДНК. Условия, способствующие трансформации: 1) трансформирующей активностью обладают двунитевые фрагменты ДНК с молекулярной массой не менее 0,5-1х106 Да; 2) эффективно происходит между близкородственными бактериями; 3) трансформирующему воздействию ДНК поддается только часть клеток бактериальной популяции – компетентные клетки, способные воспринимать донорскую ДНК, что возникает в логарифмическую фазу роста бактериальной культуры. Процесс трансформации бактерий происходит в несколько фаз: - адсорбция двухцепочечного фрагмента ДНК-донора на мембране клеткиреципиента; - проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента: внутрь клетки проникает 1 нить ДНК, другая на наружной поверхности клеточной мембраны подвергается деградации с высвобождением энергии, необходимой для проникновения 1 нити ДНК в клетку; после проникновения внутрь клетки трансформирующая ДНК деспирализуется; - соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией – физическое включение ДНК донора в геном реципиента в гомологичном участке. Трансдукция – передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью умеренного бактериофага. Данный процесс описан в следующей теме совместно с бактериофагом – непосредственным участником трансдукции. Коньюгация – перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при их скрещивании (аналог полового процесса) с участием Fплазмиды. Процесс конъюгации у бактерий был впервые обнаружен Д. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г. Передача генетической информации осуществляется через плазмиду. Было показано, что донорами генетического материала являлись клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор) – F+-клетки. 71 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, являются реципиентами генетического материала и обозначаются как F--клетки. Первым этапом конъюгации является прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок (sex pili). Затем между обеими клетками образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент могут передаваться F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора. 1) В том случае, если при конъюгации передается только F-фактор от F+«мужской» донорной клетки в F--«женскую» реципиентную клетку, последняя также становится донорской. При этом двунитевая плазмидная ДНК расплетается, одна нить передается по коньюгационному мостику в другую клетку при помощи tra-оперона, затем в обеих клетках идет достраивание вторых нитей по принципу комплементарности азотистых оснований. При скрещивании F+-клетки с F--клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора с высокой частотой, близкой к 100%. При этом все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся F+-клетками. 2) Важнейшим свойством F-плазмиды является способность включаться (интегрировать) в определенные участки бактериальной хромосомы и становиться ее частью. Штаммы, в которых плазмида находится в интегрированном состоянии, переносят свои хромосомные гены бесплазмидным клеткам с высокой частотой, называются Hfr-клетки (от англ. High frequency of recombination – высокая частота рекомбинации). Процесс переноса хромосомных генов при скрещивании Hfr-клетка x F-клетка начинается с расщепления ДНК бактерии в месте интеграции F-фактора. Одна нить донорской ДНК передается по конъюгационному мостику в реципиентную клетку (сама плазмида передается последней – замыкает процессию). Переданная в другую клетку нить ДНК достраивается сразу по ходу проникновения до двунитчатой структуры и затем рекомбинирует с гомологичным участком реципиентной ДНК. Вследствие хрупкости конъюгационного мостика F-плазмида, интегрированная в хромосому, редко передается клетке-реципиенту, поэтому образуемые рекомбинантные клетки донорскими функциями не обладают. Фенотипическая изменчивость – временные, наследственно незакрепленные изменения свойств микроорганизмов. Виды: кратковременные и длительные модификации. Особенности модификаций: зависят от условий среды и ими определяются, подвержены все клетки в микробной популяции, происходят в пределах генотипа, не передаются по наследству. Примеры модификаций: полиморфизм, накопление запасных веществ, образование спор, утрата капсулы или жгутиков, изменение культуральных свойств. 72 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Молекулярно-генетический метод основан на выделении из исследуемого материала и идентификации генетического материала (ДНК, РНК) микроорганизмов, позволяет осуществлять раннюю и более полную диагностику и дифференциацию инфекционных заболеваний, осуществлять контроль эффективности терапии. В настоящее время имеется 2 направления генетической диагностики: 1 – гибридизационный анализ нуклеиновых кислот, 2 – диагностика с использованием амплификации. Гибридизационный анализ использует способность нуклеиновых кислот в определенных условиях образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНК-ДНК-гибридизацией является трудоемким, длительным и дорогостоящим. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНКполимеразы определенный фрагмент ДНК. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНКполимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллионы раз, что упрощает дальнейший анализ. Основным прибором для проведения ПЦР является амплификатор (термоциклер) – аппарат, в гнезда которого устанавливаются специальные амплификационные пробирки, изготовленные из термопроводимого пластика, с реакционной смесью или предметные стекла с образцами тканей. Мультиплексная ПЦР позволяет проводить ПЦР с 2-4 и более неперекрещивающимися праймерами нескольких возбудителей, что дает возможность определить в одной пробе нуклеиновые кислоты сразу нескольких возбудителей, что особенно актуально при диагностике микст-инфекций. Преимущества ПЦР: 1) является диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей инфекционных заболеваний за счет увеличения количества копий специфических последовательностей ДНК; 2) обладает высокой чувствительностью (около 10 клеток), позволяют обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы тогда, когда их выявление другими (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) методами невозможно (их чувствительность колеблется в пределах 103–106 клеток); 3) эффективна при диагностике труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий; 73 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 4) абсолютная специфичность позволяет избежать ложноположительных результатов, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами; 5) может проводиться непосредственно в клиническом материале (кровь, сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, смывы) и в материале, получаемом из внешней среды (вода, почва). ПЦР чаще используется как качественный метод диагностики, но в настоящее время существует количественная ПЦР в реальном времени, использующая флуоресцентно меченные реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов. В последние годы молекулярная биология, генетика, химия имеют бурное развитие с выделением перспективных научных разделов в отдельные дисциплины, суть которых отражена далее. Геномика – раздел молекулярной генетики, посвященный изучению генома и генов живых организмов с помощью биологических, физических, химических и компьютерных методов. Основными задачами геномики являются секвенирование геномов (т.е. определение нуклеотидной последовательности суммарного набора молекул ДНК клетки какого-либо организма), их картирование (т.е. идентификация генов и локализация места их расположения на хромосоме) и сравнительный анализ структур геномов разных организмов (структурная геномика). Структурная геномика изучает содержание и организацию геномной информации. Имеет целью изучение генов с известной структурой для понимания их функции, а также определение пространственного строения максимального числа «ключевых» белковых молекул и его влияния на взаимодействия. Первыми свободно живущими организмами, чьи геномы были полностью прочитаны, стали Micoplasma genitalium и Haemophilus influenzae. Эти микроорганизмы оказались выбраны, т.к. являются патогенами (т.е. вызывают заболевания) человека. Кроме того, микоплазма обладает наименьшим размером генома среди известных организмов, способных к самостоятельной репликации (т.е. удвоению геномной ДНК в процессе клеточного цикла). Следовательно, установление структуры ее генома позволило бы иметь представление о наборе генов и генных продуктов, минимально необходимом клетке для автономного развития. Функциональная геномика изучает реализацию информации, записанной в геноме, от гена – к признаку. Сравнительная (эволюционная) геномика проводит сравнительные исследования содержания и организации геномов разных организмов. Получение полных последовательностей геномов позволило определить степень различий между геномами разных живых организмов. Задача протеомики – определить все белки, синтезируемые в клетке, выяснить их строение, количество, локализацию, модификацию и механизмы взаимодействия. 74 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Важное направление функциональной геномики – транскриптомика – изучает координированную работу генов, образование первичных транскриптов, процессы сплайсинга и формирования зрелых мРНК. Технология микрочипов позволяет одновременно анализировать картину транскрипции мРНК со ста тысяч генов и установить различия между экспрессией генов в разных тканях, проанализировать характер экспрессии в разные периоды болезни, разделить белки на секретируемые и связанные с мембранами, определяя положение их мРНК. Вопросы для самоконтроля 1. Дайте определение изменчивости микроорганизмов. 2. Виды изменчивости микробов. 3. Классификации мутаций по происхождению, молекулярным механизмам. 4. Классификация мутаций по фенотипическим последствиям для бактериальной клетки. 5. Практическое использование учения о мутациях. 6. Рекомбинация как обмен генетической информацией, типы. 7. Трансформация, ее механизм, основные этапы. 8. Коньюгация: роль полового фактора, основные механизмы, понятие об F+-, F- и Hfr-клетках. 9. Укажите примеры модификаций у бактерий. 10. Молекулярно-генетические методы исследований в клинической практике (гибридизационный анализ нуклеиновых кислот, методы амплификации). Тема 11. БАКТЕРИОФАГ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФАГА С БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКОЙ. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГИИ Бактериофаг (с древнегреч. – «поедающий бактерии») – это вирус бактерии, способный проникать и репродуцироваться в ней, образуя многочисленное потомство, вызывать лизис (гибель) клетки, сопровождающийся выходом новых фаговых частиц в среду обитания бактерий. Бактериофагия – процесс взаимодействия фагов с бактериями, нередко заканчивающийся разрушением, лизисом бактерий. Впервые в 1898 г. Н. Ф. Гамалея наблюдал и описал явление спонтанного лизиса бактерий под влиянием неизвестного в то время агента. В 1915 г. Ф. Туорт описал способность фильтрата стафилококков растворять свежую культуру данных бактерий. В 1916 г. Ф. ДʼЭррель выделил из испражнений больных дизентерией фильтрующийся агент, способный разрушать дизентерийные палочки, и назвал его бактериофагом. Отличительные признаки (свойства) бактериофагов: 1) не имеют клеточного строения – это неклеточная форма жизни; 2) чрезвычайно малые размеры (видны только при электронной микроскопии, проходят через бактериальные фильтры); 3) содержат один тип НК: или ДНК, или РНК (соответственно различают ДНКсодержащие бактериофаги и РНК-содержащие бактериофаги); 75 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 4) являются облигатными (абсолютными) внутриклеточными паразитами: отсутствуют синтетические и энергетические ферменты, используют составные части микробной клетки для построения новых фаговых частиц; 5) являются паразитами на генетическом уровне (в бактериальную клетку проникает лишь НК фага); 6) характерен особый тип размножения (репродукции) – разобщенный или дизъюнктивный способ: раздельный синтез составных частей (НК, белков) фага, а затем их сборка с образованием новых бактериофагов; из 1 бактериофага через 20-30 мин образуется 200 и более новых бактериофагов; 7) специфичность: каждый фаг лизирует только свой тип (род, вид) бактериальных клеток: дизентерийный фаг – дизентерийную палочку, брюшнотифозный – брюшнотифозную палочку и т. д. Бактериофаги широко распространены в природе и встречаются повсеместно, где есть бактерии: в воде, почве, организмах животных, человека. По химической природе бактериофаг является нуклеопротеином. Строение бактериофагов изучают при помощи электронной микроскопии. Размеры фагов варьируют – от 20 до 800 нм. По морфологии принято различать следующие типы бактериофагов: 1) нитевидные (спиральный тип симметрии белков, ДНК-содержащие), 2) без отростка (кубический тип симметрии), 3) с аналогом отростка (кубический тип симметрии, большинство – РНКсодержащие), 4) с коротким отростком (бинарный тип симметрии, ДНК-содержащие), 5) с длинным отростком (бинарный тип симметрии, ДНКсодержащие), 6) с длинным отростком и сокращающимс я чехлом (бинарный тип симметрии, ДНКсодержащие – рис. 40). Рис. 40. Морфологические типы бактериофагов Сложноустроенный бактериофаг состоит из головки, в которой содержится НК, окруженная белковой оболочкой, воротничковой части, отростка (полый стержень, сверху покрытый сократительным чехлом), на конце отростка находится шестиугольная базальная пластинка, содержащая не менее 15 белков для адсорбции фага на бактериальной клетке и структурной перестройки хвоста вируса, 76 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология необходимой для инфицирования клеток (в том числе лизоцимоподобный и др. литические ферменты), нити (фибриллы) прикрепления (рис. 41). Оболочечные структуры фага имеют белковую природу. У сложноустроенного бактериофага бинарный (смешанный) тип симметрии, т.к. головка имеет кубический (икосаэдрический) тип симметрии белков, а отросток – спиральный. Рис. 41. Строение бактериофага (www.ng.ru) По характеру взаимодействия с микробной клеткой различают: 1) вирулентный бактериофаг, для которого характерен продуктивный тип взаимодействия с микробной клеткой, заканчивающийся образованием фагового потомства и лизисом клетки, что проявляется просветлением питательного бульона или «стерильными пятнами» («бляшки», «негативные колонии») в посевах на плотной питательной среде; 2) умеренный бактериофаг может репродуцировать в клетке и вызывать ее лизис (продуктивный тип) или сохраняться при делении клетки и передаваться ее потомкам в виде профага (интегративный тип взаимодействия – обусловливает явления лизогении, фаговой конверсии, трансдукции) или сохраняться в цитоплазме клетки, не репродуцируя, не образуя потомства, не приводя к гибели клетки (абортивный тип взаимодействия). Отличия умеренного бактериофага от вирулентного: 1) под действием умеренного бактериофага на твердых питательных средах бактериальные колонии мутные за счет вторичного роста микробов, а под действием вирулентного фага колонии прозрачные (гибель микробов) без вторичного роста; 2) при взаимодействии с бактерией умеренный бактериофаг адсорбируется медленнее, латентный период короче, выход фагового потомства меньше. Формы существования бактериофагов: 1) зрелая или инфекционный фаг – это внеклеточная форма, свободная, инертная макромолекула, способная проникать в микробную клетку; 2) вегетативная – это внутриклеточная форма, размножающийся фаг или фагпаразит, приводит к разрушению микробной клетки; 77 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 3) профаг – внутриклеточная форма, ведет себя как плазмида, находится: 1) автономно в цитоплазме, 2) включается в хромосому микробной клетки и реплицируется вместе с ней; может переходить в вегетативную форму. Вирулентный фаг существует в природе в зрелой и вегетативной формах, а умеренный – во всех 3-х формах. По специфичности взаимодействия бактериофагов с бактериями различают: 1) поливалентные – взаимодействуют с родственными видами бактерий; 2) моновалентные – взаимодействуют с бактериями одного определенного вида; 3) типовые – взаимодействуют с отдельными типами (вариантами) бактерий данного вида. Этапы взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой: адсорбция, проникновение нуклеиновой кислоты, репродукция (синтез нуклеиновой кислоты и белка с самосборкой), выход фагов из клетки. Адсорбция (прикрепление отростком или белками оболочки) фага осуществляется на клеточной стенке бактерий (рис. 42), имеющих специфические липопротеиновые, липополисахаридные рецепторы (например, F-пили). На бактериях, лишенных КС (протопласты, L-формы, микоплазмы), бактериофаги не адсорбируются. Рис. 42. Жизненный цикл бактериофага (http://plantlife.ru/) Проникновение НК фага с хвостовым отростком в бактериальную клетку происходит при помощи лизоцимоподобного и др. литических ферментов, последовательно расщепляющих участок КС и ЦПМ и готовящих канал для впрыскивания НК путем сокращения белкового чехла отростка фага, при этом оболочка фага остается на поверхности клетки. 78 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Проникновение НК мелких кубических фагов, адсорбировавшихся на Fпилях, осуществляется через канал этих пилей. Проникновение ДНК нитевидных фагов происходит вместе с капсидным белком, действующем по типу лизоцимоподобного и/или другого литического фермента, последовательно расщепляя участок КС и ЦПМ. Синтез фаговых частиц осуществляется подобно синтезу вирусов в эукариотической клетке. НК фага подавляет синтез компонентов клетки, индуцируя синтез НК и белков фага. Происходит репликация НК бактериофага с образованием множественных копий (вегетативный фаг), а на рибосомах бактериальной клетки – синтез фаговых белков. Далее происходит самосборка фаговых частиц с формированием зрелых бактериофагов. Полые капсиды головок фагов заполняются фаговыми НК и соединяются с хвостовыми отростками. Выход фага из бактериальной клетки происходит путем лизиса клетки изнутри за счет изменения внутриклеточного осмотического давления и свободного лизоцимоподобного фермента, выделяемого бактериофагом. Лизогения – сосуществование бактериальной клетки и умеренного бактериофага в форме профага, интегрированного в хромосому клетки. Клетки, сосуществующие с профагом – лизогенные. Переход профага в вегетативную форму и образование фагового потомства подавляются белком-репрессором. У малой части лизогенных бактерии возможна дерепрессия и спонтанная или индуцированная физическими, химическими воздействиями активация профага с исключением из хромосомы бактерии и переходом в вегетативную форму, образованием фагового потомства и гибелью бактерии. Фаговая конверсия – изменение свойств бактерии под влиянием профага, придающего новые признаки своим геномом. Например, присутствие профага в дифтерийной палочке обусловливает способность продуцировать экзотоксин. Трансдукция – передача ДНК бактерии между клетками при помощи умеренного бактериофага. При репликации фага внутри бактерии фрагмент бактериальной ДНК отщепляется профагом и переносится в клетку-реципиент. Этот вид рекомбинации открыт Н. Циндером и Дж. Ледербергом в 1951 г. Различают три типа трансдукции: неспецифическую (общую), специфическую, абортивную. Неспецифическая трансдукция – перенос бактериофагом любого фрагмента бактериальной хромосомы. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какойлибо фрагмент ДНК бактерии-донора – формируется дефектный фаг. При последующем заражении в клетку-реципиент вместе с фаговой ДНК переносится фрагмент ДНК клетки-донора, который рекомбинирует с гомологичным участком хромосомы клетки-реципиента с образованием рекомбинанта. Трансдуцирующие фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, поскольку сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов. 79 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Специфическая трансдукция (характерна для умеренного бактериофага) характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактериидонора к бактерии-реципиенту. Главный участник – профаг. При образовании трансдуцирующего фага происходит выщепление профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При последующем взаимодействии дефектных фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента. Абортивная трансдукция – принесенный фагом фрагмент ДНК бактериидонора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора передается только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследуется однолинейно и в итоге утрачиваться в потомстве. Методы индикации фагов подразделяются на качественные (выявляют наличие бактерий, чвствительных к специфическому фагу – метод Отто, фаготипирование) и количественные (определяют количество фага – метод Аппельмана). Определение специфичности бактериофага (метод Отто) Растопленный 3% мясопептонный агар разливают в стерильные чашки Петри. Охлажденные чашки Петри подсушивают в термостате в течение 10–15 мин. На поверхность питательной среды засевают «газоном» бульонную культуру бактерий, гомологичных искомому бактериофагу, наносят каплю известного фага, чашку наклоняют и дают капле фага стечь к противоположному краю. Чашки инкубируют в термостате 16–18 ч и учитывают результат. Если фаг гомологичен микроорганизму и биологически активен, то по пути стекания капли роста микробов не будет, среда останется прозрачной. Фаготипирование На чашку Петри с питательным агаром засевают газоном (для сплошного роста микроорганизма) чистую культуру бактерий, делят среду на квадраты, пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических бактериофагов, подписывая их. После инкубации (1 сутки при 37 °С в термостате) отмечают квадраты с негативными колониями – лизисом бактерий, определяя тем самым фаготип исследуемых бактерий. Титрование бактериофага на жидких средах (метод Аппельмана) В 10 пробирок помещают по 4,5 мл МПБ. В первую вносят 0,5 мл фага (разведение 10–1), перемешивают покачиванием, затем берут 0,5 мл из первой и переносят во вторую (разведение 10–2) и так далее до десятой пробирки включительно (разведение 10–10) и из нее 0,5 мл выливают. Далее во все пробирки вносят по 1 капле культуры чувствительной бактерии (например, кишечную палочку), помещают в термостат. Через сутки проводят учет результатов. В пробирках, где оказался хотя бы 1 фаг, роста культуры не будет, среда останется прозрачной, в остальных – при росте бактерии помутнение среды. Титр фага – последнее разведение, в котором произошел лизис микробов (обозначается 10–4 и т.д.). 80 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Определение лизогении Исследуемую чистую культуру бактерий (суточная бульонная) центрифугируют (для отделения фага от бактерий). Если бактерии спонтанно продуцируют бактериофаг (профаг переходит в вегетативную форму и образуется фаговое потомство), последний окажется в надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость наносят на питательный агар, засеенный газоном индикаторной (чувствительной) бактериальной культурой. После инкубации (1 сутки при 37 °С в термостате) образуются зоны лизиса бактерий. Если получают отрицательный результат – сплошной рост микроорганизмов без стерильных пятен, то исследуемую чистую культуру бактерий подвергают ультрафиолетовому облучению (для индукции (активации) профага к переходу в вегетативную форму), после чего центрифугируют и опыт повторяют. Практическое значение бактериофагии многогранно. Бактериофаги используют: - для фаготипирования бактерий – определение фаготипа по лизису штаммов бактерий одного вида типоспецифическими фагами – для эпидемиологического анализа заболевания; - для внутривидовой фагоидентификации бактерий; - для фагодиагностики – выделение фага вида бактерий из организма больного (определение в кале, раневом отделяемом); - для фагопрофилактики – предупреждение распространения инфекционного заболевания в эпидемическом очаге (прием дизентерийного бактериофага лицами, контактировавшими с больными дизентерией); - для разработки аттенуированных вакцин путем воздействия фагов на бактерии; - для получения рекомбинантных вакцин (в генной инженерии применяют в качестве векторов, переносящих определенные участки ДНК). - для фаготерапии некоторых инфекционных заболеваний, альтернативной приему антибиотиков. Например, применяют бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллезный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и др. Достоинство фаговых препаратов – специфичность действия: они вызывают гибель определенного вида бактерий, но, в отличие от антибиотиков, не подавляют нормальную микробиоту больных и не вызывают токсического действия на клетки макроорганизма. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Вопросы для самоконтроля Строение, особенности бактериофага. Виды и формы существования бактериофага. Типы взаимодействия бактериофага с микробной клеткой. Отличия вирулентного и умеренного бактериофага. Этапы взаимодействия бактериофага с микробной клеткой Явление лизогении, фаговой конверсии, трансдукции. Качественные и количественные методы определения фагов. Применение бактериофага в практической медицине. 81 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ а) основная: 1. Микробиология, вирусология и иммунология : учебник / под ред. В. Н. Царёва. – М. : Практическая медицина, 2010. – 581 с. 2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология : учебник / под ред. А.А.Воробьева – М.: Медицинское информационное агентство, 2012. – 691 с. 3. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии : учебн. пособие для студентов мед. вузов / под ред. А. А. Воробьева, А. С. Быкова. – М. : Мед. информ. агентство, 2003. – 236 с. 4. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. В. В. Теца. – М. : Медицина, 2002. – 352 с. б) дополнительная: 1. Микробиология и иммунология для стоматологов / Под ред. Р.Дж. Ламонта, М.С. Лантц, Р.А. Берне, Д. Дж. Лебланка. – М.: Практическая медицина, 2010. – 504 с. 2. Зеленова Е.Г., Заславская М.И., Салина Е.В., Рассанов СП. Микрофлора полости рта: норма и патология: Учеб. пособие. Нижний Новгород: Издательство НГМА, 2004. - 158с. 3. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. – М. : ГЭОТАР-Мед, 2001. – 768 с. 82 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ Задача 1 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения на темном фоне обнаруживались палочковидные микроорганизмы красного цвета, расположенные коротким цепочками, окруженные неокрашенным ореолом. Определите: 1) какой способ окраски был применен, 2) этапность окраски, 3) предмет исследования, 4) характер расположения микроорганизмов в мазке. Задача 2 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались скопления шаровидных микроорганизмов фиолетового цвета в виде грозди винограда. Определите: 1) какой способ окраски был применен, 2) этапность окраски, 3) предмет исследования, 4) особенность деления наблюдаемых микроорганизмов. Задача 3 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались одиночные извитые микробы с 5-8 крупными неравномерными завитками сине-фиолетового цвета. Определите: 1) какой способ окраски был применен, 2) таксономическую принадлежность микробов, 3) особенности ультраструктуры наблюдаемых микробов. Задача 4 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались одиночные извитые микроорганизмы с 8-12 мелкими равномерными завитками коричневого цвета на желтом фоне. Определите: 1) какой способ окраски был применен, 2) таксономическую принадлежность микробов, 3) особенности ультраструктуры наблюдаемых микробов. Задача 5 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались внутриклеточные включения сине-фиолетового цвета с красным центром, окруженные оболочкой. Определите: 1) какой способ окраски применен, 2) таксономическую принадлежность микробов, 3) особенности ультраструктуры и физиологии наблюдаемых микробов. Задача 6 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались палочковидные бактерии желтого цвета с утолщениями на полюсах клеток коричнево-черного цвета, располагающиеся под углом друг к другу. Определите: 1) какой способ окраски был применен, 2) предмет исследования, 3) таксономическую принадлежность микробов, 4) особенность деления наблюдаемых микроорганизмов. Задача 7 При световой микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались одиночные извитые микробы с 8-12 мелкими равномерными завитками бледно-розового цвета. 83 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология Определите: 1) какой способ окраски был применен, 2) таксономическую принадлежность микробов, 3) особенности ультраструктуры наблюдаемых микробов. Задача 8 Материал со скошенного агара пересеяли на «пестрый» ряд сред Гисса и поместили в термостат при 37 °С на 1 сутки. После инкубации в части пробирок наблюдалось изменение цвета среды – покраснение. Определите: 1) какой этап выделения чистой культуры микробов осуществлялся, 2) назначение сред Гисса, 3) о чем свидетельствует изменение цвета у части сред Гисса? Задача 9 Материал со среды Китта-Тароцци последовательно одной петлей пересеяли на 3 чашки Петри с кровяным агаром Цейсслера, поместили в термостат при 37 °С на 1 сутки. После инкубации с изолированной колонии приготовили мазок-препарат, окрасили сложным методом. При микроскопии обнаружили клетки синего цвета и споры красного цвета, расположенные на полюсах клеток. Определите: 1) какой этап выделения чистой культуры микробов осуществлялся, 2) назначение среды Китта-Тароцци, 3) тип дыхания изучаемых бактерий, 4) какой способ окраски был применен и предмет его исследования? Задача 10 Материал со среды Китта-Тароцци пересеяли на «пестрый» ряд сред Гисса, МПБ, молоко, поместили в термостат при 37 °С на 1 сутки. После инкубации в большей части пробирок наблюдалось покраснение сред Гисса и всплывание поплавка, в пробирках с МПБ – почернение индикаторной полоски, с молоком – образование крупноячеистого сгустка. При микроскопии мазка обнаружили палочковидные клетки синего цвета с прямыми концами, округлым образованием в центре клеток, превышающем их толщину. Определите: 1) какой этап выделения чистой культуры микробов осуществлялся, 2) тип дыхания изучаемых бактерий, 3) какова биохимическая активность микробов, 4) морфологический тип бактерий, 5) какой способ окраски был применен и предмет его исследования? Задача 11 При микроскопии мазка-препарата, окрашенного сложным методом, в поле зрения обнаруживались длинные палочки сине-фиолетового цвета с прямыми концами, расположенные цепочками. После инкубации материала на среде с пенициллином при микроскопии мазка наблюдались округлые клетки сине-фиолетового цвета, расположенные цепочками. Определите: 1) морфологический тип бактерий, 2) тинкториальные свойства микробов, 3) какие структуры образовались под действием пенициллина? ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ 1. К неклеточным формам микроорганизмов относятся: 1) вироиды, 2) вирусы, 3) прионы, 4) прокариоты. 2. По ультраструктуре клетки выделяют: 1) микоплазмы, 2) прокариоты, 3) споры, 4) эукариоты. 84 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 3. По наличию и строению КС микробы подразделяются на: 1) грациликуты, 2) прионы, 3) тенерикуты, 4) фирмикуты. 4. Микробы с толстой клеточной стенкой называют: 1) грациликуты, 2) прионы, 3) тенерикуты, 4) фирмикуты. 5. Микробы с тонкой клеточной стенкой называют: 1) грациликуты, 2) прионы, 3) тенерикуты, 4) фирмикуты. 6. Пептидогликан КС состоит из: 1) гликана, 2) липополисахарида, 3) пептида, 4) тейхоевых кислот. 7. Гликан в составе пептидогликана КС образован: 1) N-ацетилглюкозамином, 2) N-ацетилмурамовой кислотой, 3) гликозидными связями, 4) тейхоевыми кислотами. 8. В пептидную часть пептидогликана КС фирмикутов входят: 1) L-аминокислоты, 2) D-аминокислоты, 3) пентаглицин, 4) тетрапептид. 9. Отличиями КС грациликутов от КС фирмикутов являются: 1) малое количество пептидогликана, 2) наличие ЛПС, 3) отсутствие магниевой соли РНК, 4) наличие мезодиаминопимелиновой кислоты. 10. Микробы, полностью утратившие КС при неблагоприятном воздействии и не способные ее восстанавливать – 1) протопласты, 2) споры, 3) сферопласты, 4) хлоропласты. 11. Микробы, частично утратившие КС при неблагоприятном воздействии и способные ее восстанавливать – 1) протопласты, 2) споры, 3) сферопласты, 4) хлоропласты. 12. Разновидности L-форм: 1) легкие, 2) нестабильные, 3) стабильные, 4) тяжелые. 13. Жгутик состоит из: 1) белка флагеллина, 2) белка пилина, 3) липидов, 4) полисахаридов. 14. По количеству и расположению жгутиков среди бактерий выделяют: 1) амфитрихи, 2) монотрихи, 3) лофотрихи, 4) перитрихи. 15. Жгутики бактерий обеспечивают: 1) антигенные свойства, 2) движение, 3) питание, 4) прикрепление. 16. Фимбрии образованы: 1) белком флагеллином, 2) белком пилином, 3) липидами, 4) полисахаридами. 17. Волютин – это включения: 1) гликопептидов, 2) липидов, 3) полисахаридов, 4) полифосфатов. 18. Способ размножения бактерий – 1) бинарное, 2) митоз, 3) спорообразование, 4) фрагментация. 19. Укажите этапы прорастания споры бактерии: 1) активация, 2) инактивация, 3) инициация, 4) прорастание. 20. Стадии развития хламидий: 1) промежуточное тельце, 2) ретикулярное тельце, 3) хламидоспора, 4) элементарное тельце. 21. Способ размножения грибов – 1) бинарное, 2) почкование, 3) спорообразование, 4) фрагментация. 22. Какие формы грибов выделяют: 1) гифальные, 2) дрожжевые, 3) дрожжеподобные, 4) спиральные. 23. Укажите разновидности мицеллия: 85 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 1) вегетативный, 2) несептированный, 3) септированный, 4) субстратный. 24. Перечислите разновидности конидий грибов: 1) артроконидии, 2) бластоконидии, 3) микроконидии, 4) хламидоконидии. 25. Укажите метод окраски для выявления КС: 1) по Бурри-Гинсу, 2) по Граму, 3) по Ожешко, 4) по Романовскому-Гимзе. 26. Укажите методы окраски для выявления спор: 1) по Бурри-Гинсу, 2) по Граму, 3) по Ожешко, 4) по Шефферу-Фултону. 27. Укажите метод окраски для выявления капсул: 1) по Бурри-Гинсу, 2) по Граму, 3) по Ожешко, 4) по Пикарскому. 28. Укажите метод окраски для выявления кислотоустойчивых бактерий: 1) по Бурри-Гинсу, 2) по Граму, 3) по Ожешко, 4) по Цилю-Нильсену. 29. Укажите методы окраски для выявления ядра: 1) по Граму, 2) по Ожешко, 3) по Пикарскому, 4) по Романовскому-Гимзе. 30. Укажите методы окраски для выявления волютина: 1) по Бурри-Гинсу, 2) по Леффлеру, 3) по Нейссеру, 4) по Цилю-Нильсену. 31. Укажите методы выявления жгутиков: 1) окраска по Граму, 2) препарат «висячая капля», 3) препарат «раздавленная капля», 4) электронная микроскопия. 32. Укажите методы окраски для выявления актиномицетов: 1) по Граму, 2) по Морозову, 3) по Ожешко, 4) по Шефферу-Фултону. 33. Укажите методы выявления микоплазм: 1) окраска по Граму, 2) окраска по Морозову, 3) окраска по Романовскому-Гимзе, 4) электронная микроскопия. 34. Укажите методы окраски для выявления спирохет: 1) по Бурри, 2) по Граму, 3) по Морозову, 4) по Романовскому-Гимзе. 35. Укажите методы окраски для выявления риккетсий: 1) по Граму, 2) по Гименесу, 3) по Здродовскому, 4) по Романовскому-Гимзе. 36. Укажите методы окраски для выявления хламидий: 1) по Граму, 2) по Морозову, 3) по Ожешко, 4) по Романовскому-Гимзе. 37. Питательные среды по консистенции подразделяются на: 1) жидкие, 2) основные, 3) плотные, 4) полужидкие. 38. Питательные среды по назначению подразделяются на: 1) дифференциально-диагностические, 2) основные, 3) среды накопления, 4) элективные. 39. По типу ферментируемого субстрата среди ферментов различают: 1) липолитические, 2) нуклеолитические, 3) протеолитические, 4) сахаролитические. 40. Бактерии в зависимости от источника питательных веществ разделяют на: 1) автотрофы, 2) гетеротрофы, 3) литотрофы, 4) органотрофы. 41. Бактерии в зависимости от способа получения энергии подразделяют на: 1) автотрофы, 2) гетеротрофы, 3) фототрофы, 4) хемотрофы. 42. Этапы выделения чистой культуры (ЧК) микробов: 1) идентификация ЧК, 2) накопление ЧК, 3) получение изолированных колоний, 4) учет результатов. 43. Микробы в зависимости от типа дыхания подразделяют на: 86 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология 1) облигатные аэробы, 2) облигатные анаэробы, 3) факультативные аэробы, 4) факультативные анаэробы. 44. Методы культивирования анаэробов: 1) биологические, 2) генетические, 3) физические, 4) химические. 45. Совместное культивирование аэробов и анаэробов на одной питательной среде – это 1) метод Вейон-Виньяля, 2) метод Перетца, 3) метод Фортнера, 4) метод Цейсслера. 46. К методам выделения чистой культуры анаэробов относятся: 1) метод Вейнберга, 2) метод Вейон-Виньяля, 3) метод Перетца, 4) метод Цейсслера. 47. Виды дезинфекции: 1) биологическая, 2) механическая, 3) физическая, 4) химическая. 48. Методы стерилизации: 1) плазменный, 2) радиационный, 3) термические, 4) химические. 49. Совокупность генов клетки – это 1) генотип, 2) нуклеотидная последовательность, 3) транспозон, 4) фенотип. 50. Виды изменчивости: 1) внехромосомная, 2) генотипическая, 3) модификационная, 4) фенотипическая. 51. По происхождению мутации подразделяют на: 1) бессмысленные, 2) индуцированные, 3) летальные, 4) спонтанные. 52. Плазмида – это 1) внехромосомный генетический элемент, 2) кольцевая молекула двухцепочечной ДНК, 3) линейная подвижная молекула двухцепочечной ДНК, 4) нуклеоид. 53. Передача генетической информации между бактериями при помощи F-плазмиды – 1) конъюгация, 2) рекомбинация, 3) трансдукция, 4) трансформация. 54. Бактериофаг – это 1) бактерия, 2) вирус бактерии, 3) внутриклеточный паразит, 4) прокариот. 55. Свойства бактериофага: 1) внутриклеточный паразитизм, 2) не имеет клеточного строения, 3) рибосомы 70S, 4) специфичность. 56. Способ размножения бактериофага: 1) бинарное деление, 2) дизъюнктивный, 3) митоз, 4) фрагментация. 57. Виды бактериофага: 1) активный, 2) вирулентный, 3) пассивный, 4) умеренный. 58. Формы существования бактериофага: 1) вегетативная, 2) зрелая, 3) незрелая, 4) профаг. 59. Типы взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой: 1) абортивный, 2) интегративный, 3) конструктивный, 4) продуктивный. 60. Передача генетической информации между бактериями при помощи умеренного бактериофага – это 1) конъюгация, 2) рекомбинация, 3) трансдукция, 4) трансформация. 87 Матвеева Л.В., Новикова Л.В. Общая микробиология СОДЕРЖАНИЕ Тема 1. Значение микробиологии для медицины. Классификация, морфология, методы изучения микроорганизмов. Микробиологическая лаборатория Тема 2. Ультраструктура бактериальной клетки Тема 3. Особенности морфологии и строения прокариотических микроорганизмов Тема 4. Общая характеристика эукариотических микроорганизмов. Систематика и классификация грибов Тема 5. Физиология микроорганизмов. Особенности метаболизма бактерий. Питание микроорганизмов. Питательные среды Тема 6. Ферменты бактерий. Рост и размножение микробов Тема 7. Физиология микроорганизмов полости рта, биопленок. Методы стерилизации и дезинфекции в стоматологии, дезинфицирующие средства. Тема 8. Дыхание микроорганизмов. Этапы, способы и методы выделения чистой культуры аэробов, анаэробов Тема 9. Генетический аппарат бактерий. Репликация ДНК. Внехромосомные факторы наследственности Тема 10. Изменчивость микроорганизмов. Мутации и рекомбинации Тема 11. Бактериофаг. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Практическое применение явления бактериофагии Библиографический список Ситуационные задачи Тестовый контроль 88 3 10 20 27 33 43 48 55 63 68 75 82 83 84
