Методы окрашивания гистологических препаратов Окраска препаратов позволяет оценить : • морфологию ткани • наличие патологических изменений в ткани или клетке • наличие патогенных микроорганизмов • определенные структуры в тканях По источникам получения Красители Основные (или ядерные) красители. Избирательно окрашивают ядра клеток и базофильные структуры. Кислые (или цитоплазматические) красители. Окрашивают преимущественно цитоплазму, реже клеточные стенки и т. п. Нейтральные красители. Красители, избирательно окрашивающие компоненты цитоплазмы Флюорохромы. Группа красителей, способных флюоресцировать при той или иной длине волны возбуждающего света. По химическому составу По способности окрашивания определенных структур По механизму действия красителя со структурами тканей и клеток: Ионное взаимодействие Слабые электрические взаимодействия Ковалентное связывание Водородные связи Самое распространенное и сильное, но оно чувствительно к pH среды и концентрации солей. обеспечивают прикрепление анионов красителей к незаряженным субстратам в тканях Взаимодействуие с альдегидными группами, образуя окрашенный продукт. Гидрофобное окрашивание является следствием взаимодействия водородных связей молекул воды и агрегации гидрофобных участков молекул силами дисперсионного взаимодействия Образование ковалентных связей между органическими группировками и ионами металлов Гематоксилин-эозин • Один из самых распространённых методов окраски в гистологии. Гематоксилин: • Основной краситель • Окрашивает базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом (клеточное ядро, рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы) Эозин: • Кислый краситель 1 2 • Окрашивает эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом (внутри- и внеклеточные белки; цитоплазма является эозинофильной средой) • Эритроциты всегда прокрашиваются яркокрасным цветом. Рис. 1. Окраска геметоксилин-эозином. 1 – ядра – синефиолетовые; 2 – цитоплазма – розовая. Гематоксилин-пикрофуксин по методу Ван Гизона • Второй наиболее часто используемый в гистологической практике метод. • Данный метод необходим при дифференцировке соединительной ткани от мышечной в случаях, когда их трудно различить на препаратах, окрашенных другими методами Преимущество: По-разному окрашивает различные ткани: соединительная ткань после окраски пикрофуксином имеет ярко-красный цвет, а все остальные ткани – буровато-желтый или желтозеленый. Недостаток: Выцветание препаратов за счет потери окраски фуксинофильных коллагеновых волокон Рис. 2. Мышечная оболочка тонкой кишки. Окраска по методу Ван Гизона: 1 – соединительная ткань – красная; 2 – мышечная ткань – желтая, ядра – буро-черные Механизм действия Сродство кислого фуксина к коллагену: • параллельная волокнистая организация белка, открывающая большое количество пептидных групп, легко образовывающих водородные связи с красителе • наличие ионных связей, которые могут быть нарушены обработкой ткани кислотами Цитоплазматическое окрашивание более характерно для пикриновой кислоты, поскольку она имеет более высокую скорость диффузии в клетки, а также, проявляет более сильное ионное взаимодействие с положительно заряженными аминогруппами цитоплазматических белков Окраска фуксин-резорцином по Вейгерту • Окраска позволяет выявить эластические волокна в тканях, что полезно при изучении заболеваний и патологических процессов, поражающих сосуды или, например кожу. • Есть возможность использовать данный метод в комбинации с окраской по Ван Гизону, что позволяет одновременно выявить также коллаген и окрашивать ядра: • • • • ядра – черные, эластические волокна – от темно-синих до черного, коллагеновые волокна – оттенки красного, цитоплазма, гладкая и поперечнополосатая мышечная ткань, ороговевающий эпителий, нейроглия и эритроциты – желтые Рис. 3. Кровеносный сосуд. Окраска по Вейгерту. Эластичные волокна – темно-синие. Механизм действия Взаимодействие между эластином и красителем осуществляется за счет сложных эфирных групп, а также путем образования водородных связей между фенольными гидроксильными группами красителя и эластином. Хлорид железа: • взаимодействуя с резорцином, дает насыщенный синий цвет, • увеличивая насыщенность раствора солями, препятствует окрашиванию таких базофильных структур, как хроматин и рибосомы цитоплазмы Трихром по Маллори • Для выявления фибрина, хрящевой и мышечной ткани, форменных элементов крови • Метод окрашивания включает в себя несколько компонентов: анилинового синего, фосфомолибденовую кислоту, пикриновую кислоту и фуксин. 2 1 • Ядра – темно-коричневые; 4 • Коллагеновые волокна – темно-синие; • Хрящ, кость, мукополисахариды, амилоид – оттенки синего; 3 • Фиброглия, нейроглия, фибрин – красные; мышечная ткань, миелин и эритроциты – оранжевые или красные; Рис. 4. Кожа мыши. Окраска по методу Маллори: 1 – • Эластические волокна – розовые. мышечная ткань; 2 – эритроциты; 3 – ядра; 4 – коллагеновые волокна Механизм действия Специфичность действия объясняется различной степенью сродства между его компонентами и макромолекулами соединительной ткани, которая обладает высоким сродством к кислым красителям, но низким по отношению к слабым основным и амфотерным красителям Фосфомолибденовая кислота как крупный гетерополианион легко и прочно связывается с катионными группами тканевых структур (волокна коллагена, клеточные мембраны), блокируя таким образом воздействие на них анилинового синего. Окраска мукополисахаридов альциановым синим • Применяются при изучении структур, выделяющих слизь – кишечника, бронхов, муцинозные опухоли и тд. • Альциановый синий по химической структуре является медьсодержащим фталоцианином, который образует прочную связь с полианионами мукополисахаридов, избирательно взаимодействуя с их карбоксильными группами и сульфогруппами. На реакцию значительно влияет кислотность раствора: • альциановый синий рН 1,0 образует связи с мукополисахаридами с большим содержанием сульфогрупп; • альциановый синий рН 2,5 способен к окрашиванию всех кислых мукополисахаридов. • Результат окрашивания будет следующим – кислые мукополисахариды – бирюзово-голубые, хрящевая ткань – от пурпурного до темно синего. Рис. 4. Бронх крысы. Окраска альциановым синим рН 2,5. Мукополисахариды бокаловидных клеток – голубые клетки ШИК-реакция (шифф-йодная кислота) • Для выявления гликогена в нормальных и патологически измененных тканях • Йодная кислота окисляет и разрывает связи в соединениях, содержащих 2 смежные гликолевые группы, образуя диальдегид, который образует с серосодержащим фуксином из реактива Шиффа нерастворимое окрашенное соединение, сходное с основным фуксином. • В результате гликоген окрашивается в красные цвета. • Метод широко используется при изучении болезней накопления гликогена Рис. 5. Включение гликогена в клетках печени аксотля. Судан III • Выявляют все жиры, липоиды и нейтральные жиры, интенсивно окрашивая их в оранжево-красный цвет. • Прежде всего формалиновая фиксация не должна быть более 48 ч. После чего на замораживающем микротоме сразу изготавливают срезы. Препараты заключают в глицерин или глицеринжелатин. • ВАЖНО: Краситель быстро выцветает Рис. 6. Паринхиматозная жировая дистрофия. Окрашивание Судан III.