ИФА – диагностика Подготовила ассистент Садвакас А.С. Алматы 2016 Цель модуля 1. Познакомиться с историей создания иммуноферментного анализа. 2. Получить представление об использовании ферментов в методах иммуноферментного анализа. 3. Ознакомиться с классификацией методов иммуноферментного анализа. 4. Ознакомиться с основными схемами и методами проведения иммуноферментного анализа. 5. Ознакомиться с преимуществами иммуноферментного анализа в диагностике инфекционных заболеваний. 6. Получить представление о последовательности выработки иммуноглобулинов. 7. Познакомиться с классификацией аутоиммунных заболеваний. Задачи 1. Знать основные виды ИФА 2. Уметь строить калибровочный график 3. Уметь интерпретировать результаты ИФА по оптической плотности 4. Знать строение иммуноглобулинов 5. Знать функции Fab- и Fc-фрагментов иммуноглобулина IgG 6. Знать последовательные стадии выработки иммуноглобулинов 7. Знать классификацию аутоиммунных заболеваний План 1. История создания ИФА 2. Методика проведения ИФА 3. Механизм иммунной реакции 4. Стадии ИФА 5. Свойства используемого конъюгата 6. Чувствительность метода 7. Ферменты, применяемые в ИФА 8. Классификация методов ИФА 9. Разновидности методов ИФА 10. Твердофазный ИФА 11. Прямой вариант ИФА 12. Непрямой вариант ИФА 13. Сэндвич- метод 14. Конкурентный ИФА 15. Ингибиторный ИФА 16. Метод иммуноферментных пятен ELISPOT 17. Системы усиления сигнала 18. Подсчет результатов 19. Калибровочный график 20. Интерпретация результатов по оптической плотности 21. Практическое применение ИФА 22. Инфекции, выявляемые с помощью ИФА 23. Точки применения ИФА в диагностике инфекционных заболеваний 24. Преимущества ИФА 25. Структура и свойства антител 26. Fab- и Fc-фрагменты иммуноглобулина IgG 27. Последовательность выработки иммуноглобулинов 28. Содержание иммуноглобулинов в зависимости от стадии заболевания 29. Основные паразитарные заболевания органов человека 30. «Золотой стандарт» паразитарной диагностики 31. Иммуноглобулин IgЕ 32. Аутоиммунные заболевания 33. Распространенность аутоиммунных заболеваний 34. Системные аутоиммунные заболевания 35. Органоспецифические аутоиммунные заболевания 36. Тестовые вопросы для самоконтроля 37. Ситуационные задачи для самостоятельной работы 38. Рекомендуемая литература 39. Видеоматериалы История создания ИФА сокращённо ИФА , англ. Enzyme -linked immunosorbent assay, ELISA— лабораторный иммунологический метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса «антиген –антитело » за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс. Методика проведения ИФА Для серодиагностике используются 96 луночные полистирольные планшеты, на стенках ячеек которых заранее адсорбируется антиген. Исследуемая сыворотка вносится в ячейку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляются промыванием. Далее в ячейки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали определяемые антитела, то они на этом этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки хромогенного вещества (красителя) позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в ячейках. Интенсивность окраски при этом пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству антител. При измерении оптическую плотности (ОП) жидкости в ячейке и сравнивании ее с контрольным образцом подсчитывается концентрация антител в единицах объема. Наиболее часто применяется подсчет результатов в единицах оптической плотности. Надо учитывать, что для каждой тест-системы есть свои показатели учета результатов и показатели нормы и патологии на которые надо ориентироваться при интерпретации результатов. Механизм иммунной реакции В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом, а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня. В упрощенном виде механизм реакции можно представить следующим образом: Первая реакция происходит между определяемым Ig (Ab) и очищенным антигеном возбудителя (Ag), фиксированным к поверхности лунок иммунологического планшета Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую иммунологическую реакцию, в которой в качестве антигена выступает связавшийся специфический Ig, а в качестве антител к нему — конъюгат, представляющий собой Ig (Ab) к соответствующему Ig человека, меченный ферментом - пероксидазой (K) Далее происходит ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы конъюгата. Субстратом данной реакции служит бесцветное вещество — хромоген, который в ходе реакции образует окрашенное вещество. Интенсивность окраски в лунке определенным образом зависит от количества содержащихся в пробе иммуноглобулинов. Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса; 2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. Свойства конъюгата Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами: - высоким антительным титром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание; - достаточной специфичностью в рабочем разведении; - преобладанием мономерных форм над полимерными, - оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1); - достаточной ферментативной активностью конъюгата. Чувствительность метода ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. По сравнению с вышеназванными методами ИФА менее трудоемок и менее продолжителен по времени, удобен для выполнения большого числа однотипных анализов. В ИФА сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Различные варианты ИФА различаются по своей чувствительности. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Средняя чувствительность ИФА – 10-9 – 10-12 моль. Ферменты, используемые в ИФА Фермент Источник получения Пероксидаза хрена Молекулярная масса (кДа) 40 Хрен (Armoracia rusticana) β-Dгалактозидаза E. Coli Щелочная фосфатаза E. Coli, слизистая кишечника теленка 540 84-150 Субстрат (длина волны при фотометрии, нм) Конъюгирующий реагент Офенилендиаминдигидро хлорид (ОФД, 492 нм) 5-аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, одианизидин. Глутаральдегид Мета-периодат натрия N-сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат О-нитрофенил-β-D- Метагалактозид (420 малеимидобенз нм) ол-Nгидроксисукцин имидный эфир РГлутаральдегид нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4хлоро-3-индолил фосфат Классификация ИФА 1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы. А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания. 2. Все методы ИФА делятся на гомогенные и гетерогенные. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело. Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами. 3. По принципу определения тестируемого вещества: А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу. Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала. Методы ИФА Тип I Тип II Определение специфического иммунного комплекса анализируемого соединения Определение оставшихся свободных центров специфического связывания Неконкурентные Неконкурентные Гете ро ген ные Гетерогенные Конкурентные Ге теро ген ные Го мо ген ные Го мо г ен ные Твердофазные Твер до фаз ные Гетерогенно-гомогенные Твер до фаз ные Различные схемы проведения анализа Гетерогенно-гомогенные Твердофазный ИФА В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки. Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями: – пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью; – ковалентное прикрепление к твердой фазе; – иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение). Прямой вариант ИФА 1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый материал). В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим исследуемого антигена. 2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе). 3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата. 4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают. 5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для более точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотности от концентрации. Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. Сэндвич-метод Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности. При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело. Конкурентный ИФА Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы. Ингибиторный ИФА В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, связывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональна содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стандартного антигена. Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT) В 1983 году адаптировали технологию твердофазного ИФА для определения лимфоидных клеток, секретирующих антитела или антигены (например, цитокины), in vitro. Метод получил название ELISPOT (метод иммуноферментных зон или пятен). • Образовавшиеся пятна подсчитывают под микроскопом, это и будет количество секретирующих клеток. • В качестве твердой фазы может быть использована нитроцеллюлозная мембрана В этом случае есть ряд преимуществ: из-за высокой адсорбционной способности НЦМ требуется значительно меньшее количество антигена, используемого в качестве «ловушечного» реагента, кроме того, отпадает необходимость во включении агарозы в субстрат. • При параллельном определении количества секретирующих клеток и общего количества секретируемого антигена или антитела в лунке, что возможно при использовании другого субстрата, можно выявить количество секретируемого вещества единичной клеткой. • Данный метод нашел широкое применение для оценки количества клеток, секретирующих антиген, улавливаемый адсорбированными антителами, используется для определения количества клеток, секретирующих цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а). Системы усиления сигнала На основе взаимодействия авидин-биотин. Белок авидин может неспецифически сорбироваться на других молекулах, поэтому все чаще используют другой биотинсвязывающий белок - стрептавидин, обнаруженный в бактериях Streptomyces avidinii. Стрептавидин также образует прочный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц. Использование хемилюминесцентных реакций. Хемилюминесцентные реакции можно использовать для получения сигнала в ИФА, при этом повышается чувствительность метода и сокращается время проведения анализа. В качестве метки в ИФА широко применяют пероксидазу хрена, для ее выявления можно использовать и различные хемилюминесцентные реакции. Хемилюминесцентные реакции основаны на способности люминола светиться при окислении перекисью водорода. На основе каскадных систем. Для повышения чувствительности ИФА можно использовать ферментные каскадные системы. В этом случае первый фермент, связанный с антителами, приводит к образованию восстанавливаемого субстрата для второй ферментной системы. Вторая ферментная система может быть субстрат-циклической или редоксициклической. Ферментными метками в этом случае могут служить фосфо-глюкоизомераза, альдолаза, щелочная фосфатаза. Конечный продукт реакции определяют визуально или спектрофотометрически. Системы амплификации в ИФА позволяют добиться высокой чувствительности. Такие ИФА-системы используются для определения уровня гормонов (тиреостимулирующего, прогестерона и др.). Подсчет результатов После остановки реакции проводят фотометрирование лунок с помощью специальных приборов. Для учета результатов используют специальные приборы. При сравнении со значений оптической плотности контрольных проб проводят математическую обработку результатов анализа. Чем выше оптическая плотность в данной ячейки, тем большее количество специфических антител содержится в пробе Опт. плотность 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 Опт. плотность Концентрация 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 Концентрация 30 40 Калибровочный график зависимости уровня регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого вещества; а) для определения специфического иммунного комплекса анализируемого соединения; б) для определения оставшихся свободных центров специфического связывания Практическое применение ИФА ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для: • массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним); • выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах; • определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена; • выявления иммунных комплексов; • выявления онкомаркеров; • определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.); • определения общего IgE и специфических IgE антител; • скрининга моноклональных антител; • определения цитокинов в биологических жидкостях. Инфекции, выявляемые с помощью ИФА В основном в современной венерологии применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями), ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов. Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции, цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций. Определение наличия и уровня антител в крови не рекомендуется применять для первичной диагностики инфекций, передающихся половым путем. Единственное исключение - по результатам ИФА возможно распознавание сифилиса в комплексе с реакцией микропреципитации. Но необходимо отметить, что наличие антител в сыворотке крови может свидетельствовать только о контакте организма с возбудителем в настоящее время или в прошлом. Точки приложения ИФА в диагностике инфекционных заболеваний: ПЕРВИЧНАЯ (АКТИВНАЯ ИНФЕКЦИЯ) — МОЖЕТ БЫТЬ ИДЕНТИФИЦИРОВАНА ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМОГО УРОВНЯ АНТИТЕЛ КЛАССА IGM В ЕДИНСТВЕННОМ ОБРАЗЦЕ РЕИНФЕКЦИЯ — ВЫЯВЛЯЕТСЯ БЫСТРЫМ ПОДЪЕМОМ УРОВНЯ АНТИТЕЛ КЛАССА IGG (И/ИЛИ IGA). СЕРОКОНВЕРСИЯ — АНТИТЕЛА МОГУТ НЕ ВЫЯВЛЯТЬСЯ В ПЕРВИЧНОМ ОБРАЗЦЕ И СТАНОВЯТСЯ ПОЗИТИВНЫМИ ВО ВТОРОМ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДАВНОСТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ — ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИЗКОАВИДНЫХ АНТИТЕЛ, КАК ПРАВИЛО, ХАРАКТЕРНО ДЛЯ ОСТРОГО ПРОЦЕССА СО СРОКАМИ ИНФИЦИРОВАНИЯ НЕ БОЛЕЕ 4 — 6 МЕСЯЦЕВ. РЕКОНВАЛЕСЦЕНЦИЯ — КОНЦЕНТРАЦИЯ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IGA И IGG СУЩЕСТВЕННО СНИЖАЕТСЯ (ПАДЕНИЕ ТИТРА В 2-4 РАЗА) ВО ВРЕМЯ ВЫЗДОРОВЛЕНИЯ, А АНТИТЕЛА КЛАССА IGM ИСЧЕЗАЮТ. ПЕРЕНЕСЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ — ОТМЕЧАЕТСЯ ПЕРСИСТЕНЦИЯ АНТИТЕЛ КЛАССА IGG БЕЗ РОСТА ИХ КОНЦЕНТРАЦИИ В ПАРНЫХ СЫВОРОТКАХ И ОТСУТСТВИЕ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IGA И IGM. СОСТОЯНИЕ ПОСЛЕ УСПЕШНОГО ЛЕЧЕНИЯ — ИСЧЕЗНОВЕНИЕ ИЛИ СНИЖЕНИЕ ТИТРА В 2-4 РАЗА АНТИТЕЛ КЛАССА IGA ПРИ СОХРАНЯЮЩИХСЯ IGG ЧЕРЕЗ 2 НЕДЕЛИ ПОСЛЕ КУРСА ЛЕЧЕНИЯ. НАЛИЧИЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА — ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ КЛАССА IGG В ВЫСОКИХ ТИТРАХ ЧЕРЕЗ 4 НЕДЕЛИ ПОСЛЕ ВАКЦИНАЦИИ Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами - высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата; — возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала; — стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); — простотой проведения реакции; — наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; — возможностью автоматизации всех этапов реакции — относительно низкой стоимостью диагностических наборов. Благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности, тИФА (твердофазный ИФА) перешел в разряд стандартных, «рутинных» анализов. Структура и свойства антител АНТИТЕЛА ИЛИ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ В ХИМИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ ЯВЛЯЮТСЯ ГЛИКОПРОТЕИДАМИ, СОСТОЯЩИМИ ИЗ АМИНОКИСЛОТ И ОЛИГОСАХАРИДОВ. ПО СВОИМ ЭФФЕКТОРНЫМ СВОЙСТВАМ И СТРУКТУРНЫМ ОСОБЕННОСТЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ ПОДРАЗДЕЛЯЮТСЯ НА ПЯТЬ ОСНОВНЫХ КЛАССОВ: IGA, IGD, IGG, IGМ, IGE. Fab- и Fc- фрагменты Ig G ПРИ ДЕЙСТВИИ НА МОЛЕКУЛУ IGG ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ПАПАИНА ОБРАЗУЕТСЯ ТРИ ФРАГМЕНТА. ДВА ИДЕНТИЧНЫХ ФРАГМЕНТА, ЗА СПОСОБНОСТЬ СВЯЗЫВАТЬ АНТИГЕН ПОЛУЧИВШИХ НАЗВАНИЕ FAB-ФРАГМЕНТ (ОТ АНГЛИЙСКОГО FRAGMENT ANTIGEN BINDING), И ТРЕТИЙ, ЗА СПОСОБНОСТЬ К КРИСТАЛЛИЗАЦИИ НАЗВАННЫЙ FC-ФРАГМЕНТ (ОТ АНГЛИЙСКОГО FRAGMENT CRISTALLINE). FAB-ФРАГМЕНТ МОЛЕКУЛЫ АНТИТЕЛА ОТВЕТСТВЕНЕН ЗА СПЕЦИФИЧЕСКОЕ РАСПОЗНАВАНИЕ АНТИГЕНА, FC-ФРАГМЕНТ ОТВЕТСТВЕНЕН ЗА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ АНТИТЕЛ – СВЯЗЫВАНИЕ С КОМПОНЕНТАМИ СИСТЕМЫ КОМПЛИМЕНТА, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МЕМБРАННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ И Т.Д. Последовательность выработки иммуноглобулинов разных классов следующая: Первыми появляются IgM-антитела. Как правило, это происходит через 1–3 недели с момента заражения. Время обнаружения антител зависит как от самой инфекции, так и от особенностей иммунной системы конкретного человека. Появляются симптомы острой инфекции. Обнаружение IgM-антител в анализе указывает на наличие острой фазы заболевания или на обострение хронических инфекционных заболеваний. Через месяц начинают вырабатываться IgA-антитела, основная часть которых концентрируется на слизистых оболочках, где реализуется их защитная функция. Последними появляются IgG-антитела, как правило, на 4 неделю с момента заражения. После лечения хламидиоза, микоплазмоза, трихомониаза их уровень значительно снижается, так как иммунитет против этих заболеваний не развивается. Содержание иммуноглобулинов в зависимости от стадии заболевания Стадия заболевания IgM IgA IgG - + - + + - + + + - + + Хроническая фаза - +/- + Прошедшая (излеченная инфекция) - - + Первичная фаза (2 неделя от инфицирования) Первичная фаза (2, 5-3 недели от инфицирования) Первичная фаза (3-4 недели от инфицирования) Обострение хронической фазы (2 недели от начала заболевания) Выздоровление - Отрицательный результат - снижение титра в 2-4 раза после успешного лечения - снижение титра в 4-8 раз через 1-1,5 мес. после успешного лечения - Основные паразитарные заболевания органов человека Глаза: демодекоз, миазы, онхоцеркоз, телязиоз, цистицеркоз. Головной мозг: альвеококкоз, миазы (редко), цистицеркоз, эхинококкоз, токсоплазмоз. Желудочно-кишечный тракт: анкилостомоз, аскаридоз, кишечные миазы, лингватулидозы, метагонимоз, скарабиаз, стронгилоидоз,трихинеллёз, трихостронг илоидоз, трихоцефалёз, энтеробиоз. Кожа: зерновая чесотка, Larva migrans, крысиный клещевой дерматит, миазы, педикулёз, пуликоз, саркопсиллёз, тромбидиаз, фтириаз,хемиптероз, чесотка. Кровеносные сосуды: филяриатозы, шистосомоз. Лёгкие: акариаз легочный, аскаридоз, метастронгилёз, парагонимоз, стронгилоидоз, томинксоз, эхинококкоз. Молочная железа: альвеококкоз, эхинококкоз. Мочевой пузырь, половые органы: уринарный миаз, альвеококкоз, эхинококкоз. Носовая полость: миаз. Печень: альвеококкоз, клонорхоз, описторхоз, фасциолёз, эхинококкоз. Рот: миаз. Сердце: дирофиляриоз, эхинококкоз. Уши: миаз. «Золотой стандарт» паразитарной диагностики «Золотой стандарт» паразитарной диагностики – исследование кала с применением специальных методик (обогащения, флотации, с использованием фильтров), дуоденальное зондирование и анализ крови на определение антител к паразитам. Иммуноглобулин Е ВПЕРВЫЕ IGE БЫЛ ИЗОЛИРОВАН В 1960-Х ГОДАХ ИЗ СЫВОРОТОК БОЛЬНЫХ АЛЛЕРГИЕЙ. В 1968 Г. ВОЗ ВЫДЕЛИЛ IGE КАК САМОСТОЯТЕЛЬНЫЙ КЛАСС ИММУНОГЛОБУЛИНОВ. СОГЛАСНО ВОЗ 1 МЕ/МЛ (МЕ — МЕЖДУНАРОДНАЯ ЕДИНИЦА) СООТВЕТСТВУЕТ 2,4 НГ. ОБЫЧНО КОНЦЕНТРАЦИЯ IGE ВЫРАЖАЕТСЯ В МЕ/МЛ ИЛИ КЕ/МЛ (КЕ/МЛ — КИЛОЕДИНИЦА). СОДЕРЖАНИЕ IGE В СЫВОРОТКЕ В НОРМЕ КРАЙНЕ МАЛО, СОСТАВЛЯЕТ ~0,001% ОТ ВСЕХ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ. ОДНАКО КОНЦЕНТРАЦИЯ IGE ЗНАЧИТЕЛЬНО ПОВЫШАЕТСЯ ПРИ ПАРАЗИТАРНЫХ ИНВАЗИЯХ И АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ. Аутоиммунные заболевания Существует две группы аутоиммунных заболеваний (АИЗ): – Органоспецифические АИЗ: характеризуются поражением одного органа или ткани. Например, при диабете типа 1 поражается поджелудочная железа, а при тиреоидите Хашимото – щитовидная железа. – Органонеспецифические АИЗ (системные АИЗ): в патологический процесс вовлекаются разные органы и ткани с участием аутоантигенов. Например, заболевание Системная красная волчанка (СКВ). Распространенность аутоиммунных заболеваний • Аутоиммунные заболевания представляют собой группу из более 80 заболеваний с низким коэффициентом заболеваемости и распространенности: – Они поражают около 8%* населения (В зависимости от страны) – Большинство из них наблюдается у женщин (75-80%) Системные аутоиммунные заболевания Органоспецифические аутоиммунные заболевания Тестовые вопросы для самоконтроля 1. Для чего используют ферменты в биохимическом анализе? А. Увеличения скорости взаимодействия антигена с антителом Б. Увеличение активности антигена. В. Увеличения предела обнаружения определяемого вещества. Г. Уменьшение активности антигена. Д. Снижения предела обнаружения определяемого вещества. 2. Из чего получают моноклональные антитела? А. Любых иммунных клеток Б. Инфицированного животного В. Гибридом Г. Иммунизированного животного Д. Комплексов антиген-антитело 3. Что одновременно присутствует на первой стадии анализа в растворе при Конкурентных методах ИФА ? А. Анализируемое соединение, его аналог, несущий ферментную метку, и центры специфического связывания Б. Анализируемое соединение, его аналог В. Анализируемое соединение, антиген несущий ферментную метку, и центры специфического связывания Г. Анализируемый антиген и специфические антитела Д. Анализируемый антиген и неизвестный антиген 4.Чем является метод ELISA? А. Твердофазным гомогенным методом Б. Методом осаждения иммунных комплексов В. Твердофазным гетерогенным методом Г. Гомогенным методом Д. Гетерогенным методом 5. Что является отличительным признаком непрямого метода от прямого? А. Использование антигенов имеющих два и более неперекрывающихся антигенных эпитопа Б. Использование антител с радиоактивной меткой В. Использование антител конъюгированных с пероксидазой С. Использование двух видов антител специфичных к одному антигену Д. Использование антивидовых антител 6. Какой прибор необходим для проведения ИФА? А. Центрифуга Б. Хроматограф В. Проточный цитометр Г. Биохимический анализатор Д. Планшетный фотометр или спектрофотометр 7. Что является заключительным этапом ИФА? А. Определение оптической плотности Б. Сорбция антигена В. Раститровка антител Г. Блокировка Д. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта 8. За что ответственен Fab-фрагмент молекулы антитела? А. Уничтожение антигена Б. Специфическое распознавание антигена В. Связывание с компонентами системы комплимента Г. Взаимодействие с мембранными рецепторами Д. Активацию макрофагов Ситуационные задачи для самостоятельной работы 1. Женщину 43 лет в течение последних 3 лет беспокоит фурункулез по поводу которого часто производятся оперативные вмешательства, назначают антибиотики. Из анамнеза известно, что 10 лет страдает микозом стоп, до 18 лет часто наблюдались обострения хронического тонзиллита, у отца также отмечались рецидивирующие панариции, хронический тонзиллит. В иммунограмме: лейкоциты – 6,7.109 /л, палочкоядерные нейтрофилы – 2%, сегментоядерные нейтрофилы – 55%, эозинофилы – 6%, базофилы - 3%, лимфоциты – 34%, Т-лимфоциты – 50%, Т-лимфоциты активные -34%, ТФЧ – 11%, ТФР – 37%, В-лимфоциты – 12%, То – 38%, ФАЛ – 21%, фагоцитарное число – 0,30, IgA, M в норме, уровень IgG снижен. Укажите тип развития иммунодефицитного состояния. Какие параметры иммунограммы патологически изменены? Дополнительные исследования. Ответ: Вторичное иммунодефицитное состояние по фагоцитарному типу (резко снижены ФАЛ, фагоцитарное число). Снижена концентрация Ig G. Дополнительные исследования: мазок из зева и носа, соскоб на грибок, кал на дисбактериоз. 2. Ребенку 4 года. Родился кесаревым сечением, мать при кормлении принимала антибиотики, на первых месяцах жизни наблюдались проявления пищевой аллергии, стоматит, дисбиоз кишечника. С 2,5 лет начал посещать детское дошкольное учреждение, с этого периода болеет ОРВИ ежемесячно. В иммунограмме: лейкоциты – 8,8.109 /л, палочкоядерные нейтрофилы – 2%, сегментоядерные нейтрофилы – 31%, эозинофилы – 5%, моноциты – 4%, лимфоциты – 58%, Т-лимфоциты – 55%, Т-лимфоциты активные – 32%, ТФЧ – 4%, ТФР – 38%, В-лимфоциты – 10%, ФАЛ – 53%, фагоцитарное число – 0,86, фагоцитарный индекс – 1,62, IgA – следы, IgG – снижен, уровень комплемента несколько снижен. Какой иммунодефицит у пациента (первичный или вторичный), по какому типу он развивается? Ответ: Первичный иммунодефицит по гуморальному типу, селективный дефицит Ig A. 3. Женщина 35 лет обратилась к врачу с жалобами на учащение случаев герпетической инфекции (ежемесячно). При гинекологическом исследовании выявлен хламидиоз. В иммунограмме: лейкоциты – 3,6.109 /л, сегментоядерные нейтрофилы – 54%, эозинофилы – 2%, моноциты – 8%, лимфоциты – 36%, Тлимфоциты – 35%, Т-лимфоциты активные 26%, ТФЧ – инверсия теста, ТФР – 37%, То – 53%, ФАЛ – 48%, фагоцитарное число – 0,80, фагоцитарный индекс – 1,66, IgA, G снижены, IgM повышен, ЦИК ниже нормы. Определите тип иммунодефицита. Характеризуйте изменения в иммунограмме. Подсчитайте абсолютные значения Т и В-лимфоцитов, То. Дополнительные исследования. Ответ: Вторичный иммунодефицит по клеточному типу. В иммунограмме лейкопения, снижение уровня Т-лимфоцитов, инверсия теофиллинового теста, увеличение То (незрелых клеток), повышение Ig M свидетельствует об обострении процесса. Абсолютное число Т-лимфоцитов – 453 в мкл, В-лимфоцитов – 155 в мкл, То – 686 в мкл. Дополнительные исследования: ИФА на выявление внутриклеточных инфекций, ПЦР (герпес, хламидиоз). Использованные информационные источники 1.Самойликов П.В. Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики» Российский государственный медицинский университет 2009 2. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство, 2009 г. 3. Кондратьева И.А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗов. Академия,2004 г. 4. Круглов С.В. Малышев И.Ю. Основы метода иммуноферментного анализа Учебное пособие для студентов лечебного факультета Москва 2010 5. http://venuro.ru/diagnostika/EIA.php 6.http://www.km.ru/referats Рекомендуемая литература 1. Иммунологические методы. /Под ред. Г. Фримеля , пер. с нем. А.П.Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с. 2. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. – М.: Высш. шк., 1991. – 288 с Видеоматериалы 1. https://www.youtube.com/watch?v=gBUbOFCLr5c 2.ВИДЕО-РОЛИК "ПАРАЗИТАРНАЯ ИНФЕКЦИЯ" выступление с Х11 Международной конференции "Новые технологии в висцеральной терапии" ЕШТОКИНА ГАЛИНА МИХАЙЛОВНА 3.ВИДЕО-РОЛИК "ПАРАЗИТЫ В ЧЕЛОВЕКЕ" интервью с специалистами медицинского центра Предтеча - Огулов А.Т. и Ештокина Галина Михайловна 4. http://meduniver.com/Medical/ophtalmologia/paraziti_cheloveka.html MedUniver 5. http://netglista.ru/drugie-paraziti/kakie-analizy-sdayut-na-gelmintov/
