Генетика

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной
медицины»
Кафедра ветеринарной генетики и животноводства
РЕФЕРАТ
По «..название дисциплины..»
Молекулярно-генетические исследования в ветеринарии
Выполнил:
студент ФВМ 1 курса … группы
ФИО
Проверил:
Должность, уч.степень, ФИО преподавателя
Санкт-Петербург
2022
СОДЕРЖАНИЕ
Оглавление
Введение ........................................................................................................................................... 3
1. Создание биоресурсы коллекций животных ............................................................................. 4
2. Значение молекулярно-генетических методов исследования для диагностики
инфекционных болезней у животных ............................................................................................ 7
2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в ветеринарии............................................................. 8
2.2 Косвенные методы ДНК-диагностики .............................................................................. 10
2.3 Метод генетических маркеров ........................................................................................... 13
2.4 Методы генетической экспертизы племенных животных ................................................... 14
3. ДНК маркеры и маркер-зависимая селекция животных ........................................................ 16
Заключение ..................................................................................................................................... 22
Список использованной литературы ........................................................................................... 23
2
Введение
Развитие молекулярной биологии, в частности, молекулярной генетики, привело
к изменениям во многих представлениях о путях и методах прогноза и лечения
заболеваний как у человека, так и у животных. Медицинская молекулярная биология,
так же, как и ветеринарная, в несколько последних десятилетий вышла на ускоренные
темпы развития. Появились качественно новые методы диагностики генетически
детерминированных заболеваний, распространения инфекционных агентов, а также
профилактики и лечения различных заболеваний.
Изменения в поисках новых методов лечения, в общем, сводятся к нескольким
главным направлениям. К ним относятся такие, как увеличение точности, «адресовки»
терапевтических средств на разных уровнях организации биологического материала,
начиная от коротких регуляторных нуклеотидных последовательностей, методов
«адресного» трансгеноза, подгонки синтетического лекарства к домену белка –
ключевых посредников запуска каскада патологических изменений, до разработки
биопрепаратов с целью вытеснения патогенов из метагенома многоклеточных
организмов.
В последние годы, в связи с необходимостью интенсификации живот новодства,
глобальными экологическими изменениями, распространением монопородности и
генетической эрозии пород, актуальность в животноводстве развития применения
молекулярно-генетических исследований существенно возросла.
Цель
работы
–
рассмотреть
молекулярно-генетических
исследования,
применяемые в ветеринарии.
Для достижения цели необходимо решить ряд задач:
Определить роль создания биоресурсных коллекций
Рассмотреть теоретические аспекты использования ДНК технологий в селекции
животных.
Определить
значение
молекулярно-генетических
методов
исследования
диагностики инфекционных болезней у животных
Рассмотреть принцип и значение ПЦР в ветеринарии
Рассмотреть роль косвенных методов ДНК-диагностики
Рассмотреть метод генетических маркеров, генетической экспертизы животных
Определить ДНК маркеры и маркер-зависимая селекцию животных.
3
для
1. Создание биоресурсы коллекций животных
Геномная регистрация живых организмов приобретает все большую актуальность и
является необходимым условием сохранения и рационального использования генетических
ресурсов животных. Активно идет разработка методов генотипирования животных, попытки
создания генетических паспортов для различных биологических объектов ценных как с
экологической, так и с сельскохозяйственной точки зрения. Масштабность и важность
данной тенденции иллюстрируется также тем, что во многих странах уже введены законы,
протоколирующие и регулирующие этот процесс.
Ценность молекулярно-генетической диагностики состоит в том, что она позволяет
достоверно определить таксономическую принадлежность организмов вплоть до уровня
популяции; оценить уровень полиморфизма и его изменение. В случае паспортизации
сельскохозяйственных
видов
животных
оно
также
дает
возможность
точно
идентифицировать вид, породу, а также, при наличии базы данных, и географическую
принадлежность животных.
Современное законодательство, разрабатываемое в Российской Федерации, по
примеру
Европейского
Союза
(EC)
требует
идентификации
и
учета
всех
сельскохозяйственных животных (в том числе электронной). Одним из направлений по
идентификации с.-х. животных является разработка и внедрение методов геномной
паспортизации (комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации
на период до 2020 года)1.
Сельскохозяйственные животные должны будут сопровождаться генетическим
паспортом, что составит фундаментальную часть системы, позволяющей управлять
различными коммерческими потоками и ветеринарными аспектами животноводства.
Данная процедура учета с.-х. животных позволит проводить идентификацию пищевой
(или любой другой) продукции и сырья животного происхождения. Для реализации данного
проекта
необходимы
большие
массивы
данных,
экспериментального
материала,
биологических образцов, которые могут быть доступны в любой момент, с этой целью
каждый исследовательский центр или лаборатория стремиться создавать свою уникальную
коллекцию биологических образцов.
Наличие большого числа экспериментального материала (образцов ДНК, базы данных
продуктивных качеств т.д.) является необходимым условием при разработке молекулярногенетических и математических методов оценки племенной ценности с.-х. животных. В связи
с этим, в лабораториях молекулярной диагностики и биотехнологии с.-х. животных должна
1
Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года" (утв.
Правительством РФ 24.04.2012 N 1853п-П8) URL: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_130043/
4
постоянно пополняться биоколлекция племенных ресурсов с.-х. животных, создаваться
информационная база данных и осуществляться сбор образцов по племенным хозяйствам
РФ.
Современные исследования в области животноводства, в частности изучение
генетических основ селекционных ценных признаков, требуют комплексного анализа
большого массива информации по собственной продуктивности животных и молекулярногенетических данных, характеризующих индивидуальные особенности каждого животного.
Коллекции биологического материала, или биобанки, играют центральную роль в
объединении этих двух потоков информации и консолидируют большой объем
биологических образцов и сопроводительной информации. Биобанки сегодня — новое
направление, которое развивается как самостоятельная область исследования со многими
специфическими компонентами, требующая специализированного персонала.
Появление новых биотехнологий и развитие современных концепций изучения
продуктивности сельскохозяйственных животных, разработки тест- систем диагностики,
проведения таргетного и полногеномного секвенирования ужесточили требования к
высококачественным, хорошо аннотированным биологическим образцам для молекулярно-генетических исследований. В настоящее время описаны и утверждены стандарты в
отношении забора и хранения биологических образцов.
Сегодня биологические данные и коллекции биологического материала собирают во
всех уголках мира. Базы данных - это необходимый элемент организации структуры и
эффективного функционирования биобанков.
Все племенные заводы, репродукторы и генофондные хозяйства обязаны проходить
генетическую экспертизу для подтверждения происхождения животных. Проводимые в
течение ряда лет исследования показали, что наиболее эффективным методом оценки в этой
связи являются ДНК-маркеры (уникальные нуклеотидные последовательности). По
отношению к традиционным методам (анализ групп крови и иммунологический анализ) они
имеют ряд преимуществ: точность, высокую чувствительность, независимость от возраста и
пола, простоту получения образцов для исследования, высокую достоверность и хорошую
воспроизводимость.
В настоящее время для исследования генофонда различных пород и популяций,
установления их генетической структуры и оценки сходства, контроля происхождения и
чистопородности племенного материала лабораторий разрабатываются методы и тестсистемы, позволяющие с высокой точностью проводить генетическую дифференциацию
пород, типов и линий животных.
Одним из необходимых условий всех упомянутых выше исследований является
5
работа с большим массивом качественного биологического материала. С этой целью в
лаборатории создается био-коллекция основных видов и пород сельскохозяйственных
животных. Сбор образцов, создания базы данных, описывающей фенотипические и
молекулярно-генетические характеристики, позволяют создать уникальную коллекцию
племенных ресурсов для создания конкурентоспособных отечественных технологий
молекулярной селекции в животноводстве.
Биоколлекция племенных ресурсов с.-х. животных служит ценным материалом:

при разработке селекционных программ для совершенствования и создания
пород и внутрипородных типов и линий с целью повышения количества и качества
животноводческой продукции;

при разработке методов геномной селекции сельскохозяйственных животных;

при разработке методов геномной паспортизации сельскохозяйственных
животных;

развитию племенной базы животноводства и планирования стратегий с целью
повышения продовольственной безопасности страны2.
Наличие биоколлекции позволяет соединить в единую базу все хозяйства и
систематизировать все данные по селькохозяйственным животным. Это позволяет проводить
анализ достоверности происхождения по имеющимся в коллекции образцам. При анализе
потомства уже не будет необходимости в дополнительном анализе родителей, так как все
данные по этим животным уже будут в базе. Наличие всей необходимой информации по
животным позволит проводить эффективную селекционно-племенную
работу,
своевременно выявлять генетические аномалии в рецессивном состоянии и проводить
раннюю диагностику продуктивных качеств по ДНК- маркерам.
Таким образом, создание информационной базы данных и сбор образцов для
биоколлекции по племенным хозяйствам РФ позволит приступить к крупномасштабным
исследованиям молекулярно-генетической структуры с.-х. животных.
2
Глазко В.И., Белопухов С.Л. Нанотехнологии и нано- материалы в сельском хозяйстве. /Под ред. акад.
РАСХН В.М. Баутина. – М: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. - 2008. – 228 с.
6
2. Значение молекулярно-генетических методов
исследования для диагностики инфекционных болезней
у животных
Болезни крупного рогатого скота, вызываемые бактериями, вирусами и их ассоциациями, являются одной из актуальных проблем в ветеринарии. Инфекционная патология в
ветеринарии охватывает широкий круг болезней, различных как по характеру течения
(острые, хронические, латентные), степени распространения (от спорадических случаев до
эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Возбудители заразных болезней, такие как
вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирус диареи крупного рогатого скота (ВД),
хламидии, микоплазмы широко распространены на территории Российской Федерации3.
Клинические формы заболеваний, обусловленные этими возбудителями, варьируют от
острых, приводящих к летальному исходу, до субклинических и бессимптомных. Они наносят значительный экономический ущерб животноводческой отрасли сельского хозяйства.
Экономические потери складываются из снижения молочной продуктивности, нарушения
воспроизводительной функции животных и гибели молодняка4.
Для успешного перехода к высокопродуктивному и экологически чистому агрохозяйству необходимо внедрение эффективных программ лечебно-профилактических и
оздоровительных мероприятий по защите животных от инфекционных болезней. Диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота является неотъемлемой частью
таких комплексных программ.
Важное, а при некоторых болезнях решающее значение имеют серологические
исследования, направленные на выявление антител, вырабатываемых организмом животного
в ответ на внедрение инфекционного агента или вакцины. Несмотря на ряд достоинств,
методы, основанные на этом принципе, обладают недостаточной чувствительностью и
специфичностью.
Поэтому одной из актуальных проблем современной медицины и ветеринарии
является разработка методов экспресс-обнаружения возбудителей инфекционных болезней в
организме животных, а также в воде, продуктах питания, кормах, почве и других объектах
внешней среды. Профилактику и лечения инфекционных болезней значительно облегчает
ранняя и точная диагностика.
Каждый из методов, используемых ветеринарии для идентификации патогенного
3
Будулов Н.Р. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота в Республике Дагестан: особенности
распространения, клинические проявления и организация ветеринарно-профилактических мероприятий //
Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2008. № 3. С. 78-83.
4
Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учебное пособие / И.Ф. Жимулев ; под ред. Е.С. Беляева,
А.П. Акифьева. - 4- е изд., стер. - Новосибирск : Сиб. унив., 2007. - 479 с.
7
возбудителя, имеет определенные недостатки. Так, например, микроскопический метод, хотя
и является простым и доступным, не позволяет разграничить под микроскопом сходные
микроорганизмы; изоляция чистой культуры возбудителя с помощью бактериологического
метода – бесспорное доказательство инфекционной болезни, однако он требует длительного
времени и не выявляют тех возбудителей, которые плохо растут на искусственных
питательных средах либо вообще не поддаются культивированию; серологический метод,
диагностирующий болезнь на основе обнаружения в крови специфических к возбудителю
антител, не всегда специфичен. В этой связи подходы молекулярно-генетической
диагностики, основанные на методах обнаружения специфической ДНК возбудителя
болезни в исследуемом материале, нацелены на устранение указанных принципиальных
ограничений, и, следовательно, имеют большую практическую значимость.
Молекулярно-генетические методы предназначаются для выявления вариаций в
структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы). В основе
этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. Это сложные методы диагностики,
требуют определённых лабораторных условий и подготовки квалифицированного
персонала. Молекулярно-генетические методы проводят в несколько этапов. Первый
этап всех методов – получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют каплю
крови, лейкоциты, культуры фибробластов, соскоб эпителия со слизистой оболочки,
волосяные луковицы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения
различных вариантов и может долго сохраняться в замороженном состоянии.
Следующим этапом молекулярно-генетических методов является накопление
(амплификация) нужных фрагментов ДНК. Его обеспечивает полимеразная цепная
реакция (ПЦР),
2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в ветеринарии
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод молекулярной диагностики, ставший для
многих инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован
клинически. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяют гарантированно
обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их
генетической информации. Аналитическая чувствительность ПЦР для большинства вирусов
и бактерий составляет 1000 микроорганизмов в 1 мл пробы5. Метод амплификации
(умножение числа копий определённого фрагмента ДНК) с помощью ЦПР позволяет в
течение короткого времени размножить определённую последовательность ДНК в
5
. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия : учеб.-справ. издво / С. Н. Щелкунов. - 3-е изд., испр. и доп. Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2008. - 514 с
8
количестве, превышающем исходную в миллион раз. Специфичность ПЦР для вирусных,
хламидийных, микоплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает
100%.
ПЦР
в
лабораторной
диагностике
инфекций
характеризуется
быстротой,
непревзойдённой чувствительностью и высокой специфичностью. При этом ДНК
инфекционных агентов может быть достаточно эффективно экстрагирована из любой
биологической жидкости или ткани, а также из проб объектов окружающей среды (почвы,
воды и т.д.) и продуктов питания.
Высокая специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале
выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов. Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаружить единичные фрагменты бактериальных или
вирусных нуклеиновых кислот6. Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении
возбудителей внутриклеточных инфекций, труднокультивируемых, некультивируемых или
требующих сложной питательной среды. Применение ПЦР-диагностики также очень
эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью. Метод
прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности: от одного до
нескольких возбудителей в пробе. Количество исследуемого материала, как правило,
составляет несколько десятков микролитов. Высокая чувствительность метода позволяет
контролировать эффективность проводимого лечения. Кроме того, при болезнях, вызванных
вируснобактериальными ассоциациями, при бессимптомных и субклинических формах
течения
инфекционного
процесса
метод
ПЦР
является
зачастую
единственным,
позволяющим определить этиологический агент заболевания7. Длительность анализа не
превышает 5-6 часов.
От животных (телят, коров, быков-производителей) с подозрением на заболевания,
вызванные ассоциациями вирусных и бактериальных патогенов, отбирают биоматериалы для
исследований: соскобы со слизистой оболочки носовой полости, влагалища, цервикального
канала,
препуция;
пробы
спермы,
синовиальной
жидкости;
кусочки
плаценты;
патологические материалы от абортированных плодов - пробы паренхиматозных органов
(печени, селезенки, лимфатических узлов, легких, почек).
Выделение ДНК возбудителя из биологического материала и постановку ПЦР
6
Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Городов B.C. Перспективы использования методов генодиагностики в
ветеринарной практике // БИО журнал для специалистов птицеводческих и животноводческих хозяйств. 2003.
№ 12. С. 31-32.
7
Красиков А.П., Алексеева И.Г. Комплексная диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота //
Электронный научно-методический журнал Омского ГАУ. 2015. № 1. С. 9.
9
проводят в соответствии с инструкциями производителя по применению тест-систем.
Высокая чувствительность и специфичность ПЦР-метода позволяет выявить ДНК
возбудителей при латентных и персистентных формах течения болезни, при которых
репродукция возбудителя в организме животного минимальна.
Следующий этап молекулярно-генетической диагностики является рестрикция ДНК
на фрагменты. Рестрикция ДНК (разрезание, разрывание) производится с помощью
рестриктаз, относятся к группе бактериальных эндонуклеаз.
Разделение фрагментов ДНК обеспечивается методом электрофареза на агарозном
или полиакриламидном геле. В процессе электрофареза каждый фрагмент ДНК занимает
определённое положение в геле. После обработки геля этидия бромидом, который
связывается с ДНК, проводят ультрофиолетовое облучение и обнаруживают участки
свечения. Существуют и другие методы окраски геля и выявления фрагментов ДНК.
Применение ПЦР-метода в комплексной лабораторной диагностике инфекционных
болезней способствует адекватной оценке антигенной нагрузки на организм животного, что
позволяет применять эффективные лечебные схемы и производить их коррекцию в процессе
лечения. Кроме того, выявление животных вирусо- или бактерионосителей позволяет
своевременно предупреждать распространение инфекции.
Но наряду с достоинствами имеется определённый недостаток, который можно
охарактеризовать как технологический. Подразумеваются повышенные требования к
оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента
исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества
анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной
сертификации лаборатории.
Ветеринарными специалистами уже разработаны тест-системы для диагностики
методом ПЦР таких заболеваний, как туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного
рогатого скота, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных,
классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная
инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз,
болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц,
ньюкаслская болезнь; чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и
др.
2.2 Косвенные методы ДНК-диагностики
Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в тех случаях, когда при
наследственных заболеваниях ген не клонирован или заболевания сопровождается
10
повреждением различных генов, либо молекулярная организация гена не позволяет
использовать прямые методы.
Косвенная ДНК-диагностика в основном сводится к анализу полиморфных
генетических маркеров. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в
популяции в нескольких аллельных вариантах (по составу нуклеотодов, числу
нуклеотидных поворотов). На основании изменчивости состава маркеровых участков
ДНК дифференцируют материнское или отцовское происхождение конкретного
варианта маркера, сцепленного с геном болезни (маркер и ген близко располагаются
друг к другу) 8.
При проведении косвенных методов ДНК-диагностики исследованных болезней
осуществляют те же этапы подготовительных операций, что и при осуществлении
прямых методов ДНК-диагностики. Методами ДНК-диагностики широко пользуются
в зоотехнической практике.
Широкий обмен генетическим материалом между разными странами через семя
производителей
часто
приводит
к
распространению
не
только
различных
инфекционных заболеваний, но также и болезней, вызываемых редкими мутациями,
возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. Поэтому
осуществляется
строгий
генетический
контроль
используемого
генетического
материала. В странах с высокой культурой племенного дела в каталогах быков производителей
морфологических
делается
отметка
наследственных
о
наличии
дефектов
и
в
родословной
результатах
выявленных
анализа
на
три
генетические мутации, определяемые по специфическим участкам ДНК: BLAD (Bovine
Leykocyte Adhesion Deficiensy)- дефицит адгезии лейкоцитов; DUMS( Deficiensy of
Uridine Monophosphat Synthase) – дефицит активности уридинофосфатсинтезы и CVM
(Complex Vertebral Malformation) – комплекс аномалий позвоночника 9.
Известно, что BLAD является мутацией, проявляющейся в дефиците адгезии
лейкоцитов. Такой тип мутации вызывает заболевания у крупного рогатог о скота
- Гранулоцитарный синдром. Клинически оно проявляется предрасположенностью к
вирусным и бактериальным респираторным и желудочно-кишечным инфекциям 10.
8
9
Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учебное пособие / И.Ф. Жимулев ; под ред. Е.С. Беляева,
А.П. Акифьева. - 4- е изд., стер. - Новосибирск : Сиб. унив., 2007. - 479 с.
10
Донник И.М. Молекулярно-генетические и иммуно-биохимические маркеры оценки здоровья сель
скохозяйственных животных // Вестник РАН. 2017.
№ 4. С. 362-366.
11
Фенотипическое проявление BLAD дефекта обусловлено точечной мутацией в
кодирующей части аутосомного гена CD18 11. Этот ген контролирует синтез
гликопротеида В-интегрина, играющего ключевую роль миграции нейтрофилов
(палочкоядерные и сегментоядерные лейкоциты) к очагу воспаления.
Фенотипические мутации проявляются только у гомозиготных потомков,
которые чаще гибнут в первые месяцы жизни. Оставшиеся в живых новорожденные
переболевают желудочно-кишечными и легочными болезнями, трудно поддающимися
лечению.
При дефиците уродинмонофосфатсинтеазы (DUMS) фенотипически мутация
проявляется только у гомозиготных (клетка или организм, содержащие два
одинаковых аллеля в конкретном локусе гомолитических хромосом) животных,
вызывали гибель эмбрионов после первых 40 дней развития.
CVM (комплекс аномалий позвоночника) открыт в Дании. Он вызывает уродства
телят и аборты у коров. Частота распространения этого дефекта в гетерозиготном
состоянии достигает 20% и выше.
В
настоящее
время
методом,
позволяющим
безошибочно
определить
носительство мутаций BLAD и DUMS в гетерозиготе, является полимеразная цепная
реакция с помощью специально подобранных праймеров.
Для диагностики стресс-синдрома у свиней (ССС) используется галотановый
тест, молекулярно-генетический контроль стресс-чувствительности 12.
С
развитием
ДНК-технологии
стало
возможной
идентификация
генов,
связанных с хозяйственно полезными признаками, делать оценку полиморфизма гена
RVRI свиней.
В свиноводстве нежелательным генетическим грузом является мутация в
рианадин-рецепторном гене RVR1. Была установлена положительная коррекция
между селекцией свиней на мясность с высокой долей чувствительности к стрессам. В
результате возникает заболевания, сопровождающееся злокачественной гипертермией
и снижением естественной резистентности (ССС). Стало известным, что влияние
11
Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области
применения // Успехи современной биологии, 2004. Т. 3. С. 260–271.
12
Гетманцева Л. В. Использование ДНК-маркеров в селекции свиней / Л. В. Гетманцева, Е. А. Карпенко, Д. В.
Чекотин// Перспективное свиноводство: теория и практика. 2012. № 1. С. 4.
12
RVR+ генотипа на признаки туши составляет от 3,5 до 27%, на критерий качества мяса
– 60% 13.
В зоотехнии используют метод индексной оценки устойчивости коров к
маститу, лейкозу, поражению конечностей. В расчете индексных коэффициентов
используют стандартное отклонение 6, нормированное отклонение t и коэффициент
наследуемости h² (А. Коровушкин,2004).[ 56 ].
2.3 Метод генетических маркеров
В селекционно-племенной работе широко используют Метод генетических
маркеров.
Современные молекулярно-биологические методы позволяют по образцу ДНК,
выделенной от животного, установить генотип по тому или иному локусу - области
локализации определённого генетического элемента на хромосоме, и, следовательно,
прогнозировать развития определённых признаков. С использованием методов
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин
фрагментов реакции (ПДРФ), можно выявить носительство BLAD - мутации,
устанавливать генотип по генам – казеина, BOLADRB3. Методом ПЦР в пробе крови
или спермы возможно выявление ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Анализ ДНК позволяет обнаружить животных, устойчивых к лейкозу. При завозе
быков проводят тестирование с целью выявления аллелей, отрицательно влияющих на
хозяйственно-полезные признаки и устойчивость к заболеваниям 14.
Для анализа наследования животными отдельных признаков используются
маркеры групп крови. Иммуногенетические маркеры могут быть использованы для
выявления сцепления генов групп крови с генами, влияющими на продуктивность
потомков оцениваемых быков, анализа генофонда рекордистов, совершенствования
методов подбора и отбора молочного скота.
В последние годы интенсивно ведутся исследования по использованию групп
крови для раннего прогнозирования продуктивности
животных и выявления
различных аномалий. Группы крови у животных вполне могут быть использованы в
13
Методика формирования лаборатории молекулярно-генетических исследований сельскохозяйственных
животных :научно-методическое пособие / Л.В. Гетманцева [и др.] ; Донской ГАУ. – Персиановский : Донской
ГАУ, 2015. - 32 с.
14
Глазко В. И. ISSR-PCR маркеры и мобильные генетические элементы в геномах сельскохозяйственных видов
млекопитающих / В. И. Глазко, Е. А. Гладырь А. В. Феофилов Н. В. Бардуков др.// Сельскохозяйственная
биология — 2013. — № 2. — С. 71–76.
13
качестве объективного показателя в целях уточнения не только отдельных особей, но
и целой группы; объединённых потому или иному принципу 15.
2.4 Методы генетической экспертизы племенных животных
Успешная селекция и реализация крупного рогатого скота предполагают получение
прибыли от реализации молочной и мясной продукции была наибольшей. Качество мяса и
молока, их количество и скорость получения продукции напрямую зависят от методов
селекционно-племенной
работы,
которые
предполагают
активное
использование
результатов анализа ДНК племенных животных. Чтобы получить статус племенных
хозяйств, племенных заводов или племенных репродукторов по разведению крупного
рогатого
скота
необходима
генетическая
экспертиза,
включающая
генетическую
идентификацию, подтверждение достоверности происхождения племенных животных и
диагностику генетических аномалий. Результаты генетических исследований отправляют в
Федеральные базы данных по племенным животным отечественного аграрного ведомства.
Методы анализа ДНК. Генетическую экспертизу проводят методами анализа ДНК. В
частности, методами генетической идентификации определяют генотипы животных по
микросателлитным локусам ДНК или по ОНП (однонуклеотидному полиморфизму) с
помощью генетических чипов. Для их анализа используют панель микросателлитных
локусов или панель ОНП (SNPsingle nucleotide polymorphism), рекомендованных
Международным обществом генетики животных (ISAG). Результаты генетической
идентификации по SNP и STR (микросателлитные маркеры) используют для обязательной
проверки происхождения племенных животных по родителям.
Для каждого племенного животного необходимы данные о происхождении как
минимум в трех поколениях родства. Наследственные заболевания определяют путем
выявления мутаций в генах, ответственных за развитие соответствующих синдромов. Анализ
аллелофонда крупного рогатого скота по локусам генома, ответственным за развитие
хозяйственно-значимых признаков, и создание на этой основе племенного ядра – стад
животных с высоким потенциалом продуктивности, свободных от носительства негативного
груза мутаций, является для хозяйств серьезной задачей, На одном из этапов ее решения
применяют в селекционной практике методы ДНК-маркирования и используют их
результаты для отбора животных желательных генотипов, а также корректировки программ
15
Дейкин А.В., Селионова М.И., Криворучко А.Ю., Коваленко Д.В., Трухачев В.И. Генетические маркеры в
мясном овцеводстве // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2016. Т. 20. № 5. С. 576–583.
14
разведения и выращивания ремонтного молодняка для формирования высокопродуктивного,
генетически однородного оздоровленного поголовья племенного скота.
Оценка
потенциала
продуктивности.
Оценивают
потенциал
молочной
продуктивности методом ДНК маркирования племенных животных по генам, связанным с
молочной продуктивностью. В частности, ген бета-казеина А1/А2, ген каппа-казеина CSN3,
ген альфа-лактоглобулина (LAG), ген бета-лактоглобулина (BLG), ген пролактинового
рецептора (PRL), ген гормона роста (GH), ген гипофизарно-специфического фактора
транскрипции (Pit 1). Скрининг по этим генам нужен для выработки стратегий селекционноплеменной работы в хозяйстве, формирования высокопродуктивного племенного стада на
основе особей, в геноме которых находятся аллели генов, позволяющие получать высокие
удои, а также проводить отбор молодняка для формирования племенного ремонтного стада
с
высокими
показателями
качества
молока
для
молочно-перерабатывающей
промышленности.
Оценивают потенциал мясной продуктивности методом ДНК маркирования
племенных животных по генам, связанных с мясной продуктивностью, таких как ген
рилизинг-фактора, ген диацилглицерол О-ацилтралсферазы 1 (DGAT1), ген кальпаина
(CAPN1), ген лептина (LEP), ген тиреоглобулина (TG5). Скрининг по этим генам необходим
для формирования высокопродуктивного племенного стада на основе особей, в геноме
которых находятся аллели генов, позволяющие получать высокие привесы, отбирать
молодняк для формирования племенного ремонтного стада с высокими показателями
качества мяса. Выявление генетических аномалий сокращает экономические потери, таких
как заболевание синдрома иммунодефицита (BLAD - CD18), заболевание комплексного
порока позвоночника (CVM), мутация дефицита уридинмонофосфатсинтетазы (DUMPS),
заболевание синдрома Brachyspina (BS), выявление цитруллинемии (BC), заболевание
дефицита коагуляционного фактора крови XI (FXI).
Оценка генетической чистоты пород животных, используемых для разведения,
проводится методом генотипирования животных разных пород. Для правильного выбора
племенных животных в хозяйство с высоким генетическим потенциалом, формируют и
непрерывно поддерживают базы данных о происхождении и генетической идентификации
животных, что позволяет точно определять откуда животное произошло и какие признаки
оно несет потомкам. Также проводить генетическую идентификацию животных при помощи
микросателлитного анализа и SNP, который позволяет точно определить достоверность
происхождения животных согласно международным стандартам. Необходимо исправлять
ошибки учета, обеспечивать непрерывное хранения генетического банка и использовать
15
специализированное оборудование для обеспечения биобанка и генотеки ДНК и
биологических образцов. Особенно важно проведение наиболее полного анализ генома
быков-производителей ввиду их важной роли в разведении пород, в том числе с
использованием новейших методов - ДНК-чипов высокой плотности. Результаты ДНКчипирования быков-производителей вкупе с оценкой по потомству является основой
разработки геномной селекции в мясном и молочном скотоводстве.
3. ДНК маркеры и маркер-зависимая селекция
животных
На сегодняшний день для большинства важнейших сельскохозяйственных видов
созданы подробные генетические карты, на которые нанесены сотни молекулярногенетических маркеров. Многие из этих данных находятся в свободном, публичном доступе,
еще больше данных по генетическим маркерам можно получить на специально оговоренных
условиях и для коммерческого использования. Этот последний факт свидетельствует сам за
себя: генетические маркеры начинают все шире использовать в практике и, в первую очередь,
с целью применения их как нового и многообещающего инструмента в селекционных
программах. Для такого нового подхода в селекции в англоязычной научной литературе был
выработан специальный термин - Marker assisted selection (MAS), который впервые был
принят в литературе в 1986 году. Согласно «Словарю терминов по биотехнологии для
производства продовольствия и ведения сельского хозяйства» Продовольственной и
сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (The Food and Agriculture
Organization of the United Nations, FAO), MAS - это «маркерная селекция - использование
ДНК-маркеров для повышения эффективности селекционной работы, которое базируется на
выявлении маркеров селекционных признаков»16.
Принцип маркер-зависимой селекции, состоит в том, что если известна локализация
гена, который влияет на проявление хозяйственно важного признака, то по этому признаку
следят не за его собственным проявлением, а по наследованию гена, который его
контролирует.
Такой
отбор
особенно
эффективен
при
работе
с
признаками,
контролируемыми генами с не полной пенетрантностью, а также с количественными
признаками, контролируемыми группами генов с достаточно выраженным влиянием
каждого гена группы на проявление признака. Данный подход широко используется в
селекционных программах экономически развитых стран в качестве методического приема
16
Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области
применения // Успехи современной биологии, 2004. Т. 3. С. 260–271.
16
для интенсификации селекционных процессов.
Необходимым условием любой программы MAS является наличие молекулярных
маркеров. Таким маркером может выступать любой фрагмент ДНК, который используется
для обнаружения полиморфизма и находится в тесной генетической связи с геном, который
отвечает за рассматриваемый признак. Для живых организмов характерно сцепленное
наследование, при котором фрагменты ДНК, локализованные на одной хромосоме в
непосредственной близости друг от друга, наследуются вместе. Благодаря этому маркер
может использоваться для уточнения механизмов наследования гена, который еще не был
точно локализован.
Использование определенных участков ДНК, для которых установлен полиморфизм,
в качестве генетических маркеров получило широкое распространение в восьмидесятых
годах ХХ века для решения таких задач, как, сохранение генофондов пород
сельскохозяйственных животных, идентификация родственных связей, происхождения
пород и отдельных особей, повышение эффективности селекции по отдельным признакам и
др. В Европе генетические маркеры стали активно использовать в селекции свиней вначале
1990 г. с целью освобождения популяций от гена, который вызывает синдром стресса у
свиней17.
Фундаментальная основа селекции животных - отбор конкретных особей с
желательными признаками. Масштабы и сложность отбора, количество и размер популяций
в традиционных селекционных программах требуют новых инструментов, к которым с
уверенностью можно отнести MAS. Отбор по молекулярным маркерам имеет огромный
потенциал для повышения эффективности и точности традиционной селекции животных.
Развитие молекулярно-биологических исследований привело к появлению нового
типа генетических маркеров - ДНК маркеров. Первыми молекулярными маркерами были
биохимические маркеры, основанные на белковом полиморфизме, а еще ранее классические генетические маркеры. В животноводстве сегодня все большую популярность
приобретают ДНК-маркеры селекционных признаков, которые используют для проведения
отбора и подбора животных по генотипу.
В настоящее время насчитывается несколько десятков типов молекулярных маркеров.
Микросателлиты - это повторяющиеся участки ДНК длиной в 2 - 6 п.н. При этом для
различных аллелей характерно различное число повторов. Микросателлиты были первыми
высокополиморфными маркерами для индивидуальных локусов. Эти маркеры имеют
несколько названий: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short
17
Взаимосвязь полиморфизма гена LIF/DRAIII с продуктивными качествами свиней / Л.В. Гетманцева [и др.] //
Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. -2014. - № 3. - С. 36-39.
17
tandem repeat), SSR (simple sequence repeat)18. На сегодняшний день считается, что в основе
полиморфизма микросателлитов лежат ошибки (эффект «проскальзывания») в процессе
репликации или репарации ДНК. За счет высокого уровня полиморфизма, равномерного
распределения в эухроматиновой части геномов и относительно широкой представленности,
микросателлиты имеют достаточную популярность.
Несмотря на это, недостатки, связанные с неравномерной скоростью мутирования
разных микросателлитов и некоторыми техническими проблемами, создают сложности для
популяционно-генетического анализа. Кроме того, при создании маркеров для локусов
количественных признаков микросателлитов бывает недостаточно. Микросателлиты
применяют для определения степени гетерозиготности небольших популяций, пород,
консолидированности
сельскохозяйственных
линий
и
животных.
групп,
оценки
Благодаря
достоверности
высокой
степени
происхождения
полиморфизма
микросателлитные маркеры используют также и при оценке генетических расстояний между
популяциями домашних животных и их диких предков.
Многие ученые отмечают, что при создании маркеров для локусов количественных
признаков микросателлитов, как правило, бывает недостаточно. Для того, чтобы более
оценить генетический потенциал по селекционно-значимым
признакам
сельскохозяйственных животных проводятся исследования по выявлению информативных
однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и разработке систем ДНК-анализа генов,
влияющих на проявление признаков19.
Согласно общепринятому определению, SNP - это однонуклеотидные позиции в
ядерной ДНК, для которых в популяции могут встречаться различные варианты
последовательностей (аллели) с частотой редкого аллеля не менее 1%. Причиной этих замен
могут служить спонтанные мутации и влияние мутагенов. Отличие последовательностей
даже по одной паре нуклеотидов может вызвать различное проявление признака. Для SNP
характерна высокая частота встречаемости в геноме (например, у человека соотношение
между количеством SNP и числом пар нуклеотидов составляет примерно одна замена на 1000
п.н., соответственно). SNP характеризуются малым числом мутаций из расчета на одно
поколение. Это выгодно отличает SNP от микросателлитов с точки зрения удобства для
популяционно-генетического анализа. Также для SNP разработаны автоматические методы
идентификации.
В последнее время иностранные компании стремятся объединить свои усилия по
18
Оценка силы статистического влияния полиморфизма гена ESR1 на воспроизводительные признаки свиней
/ А.Ю. Колосов [и др.] // Аграрный вестник Урала. - 2016. - № 2 (144). - С. 17-19.
19
Разработка современных методов селекции свиней в ЗАО «Племзавод-Юбилейный» / С.Н. Мамонтов [и др.]
// Свиноводство. - 2015. - № 5. - С. 35-37.
18
систематизации данных полученных в результате применения на практике ДНК-маркеров,
создавая единую базу данных, тем самым обеспечивая к ней широкий доступ для
постоянного пополнения информацией о результатах тестирования большого количества
животных по известным SNP.
Геном сельскохозяйственных животных имеет миллионы точечных мутаций. Никакой
другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность маркеров. С
помощью ДНК- маркеров можно оценить частоту предпочтительных аллелей для породы
или линии, и с учетом этого проводить селекцию животных с целью увеличения
концентрации желательного аллеля в изучаемой популяции.
ДНК маркеры имеют ряд преимуществ, которые делают их важным инструментом
селекции:
1.
Позволяют однозначно отличить гомозиготный генотип от гетерозиготного.
2.
Не подвержены влиянию условий среды и имеют коэффициент наследуемости h2
3.
Как правило, определяются независимо от возраста (в клетках эмбриона, в
=1,0.
образцах крови, ткани животного и т.д.).
4.
Могут быть определены у обоих полов (например, маркер генотипа,
определяющего число поросят в гнезде, относится как к маткам, так и к хрякам).
5.
Маркирование признака, который может быть определен после убоя 20.
Маркерные гены особенно актуальны для оценки признаков, фенотипическое
проявление которых происходит относительно поздно, ограничено полом или на проявление
которых большое влияние оказывают факторы окружающей среды. Такими признаками
являются: резистентность или предрасположенность к болезням, плодовитость, молочная и
мясная продуктивности и т.д. По числу генов, влияющих на проявление признака, все
признаки можно подразделить на две категории:
1. Моногенные или олигогенные признаки (главные гены). Для таких признаков, в
случае приблизительной локализации гена, существует возможность идентификацииДНКмаркеров, расположенных внутри главного гена или в непосредственной близости от него.
2. Полигенные признаки (локусы количественных признаков, QTL). К признакам с
полигенной природой наследования относятся большинствоважных хозяйственно полезных
признаков сельскохозяйственных животных. Полигенная природа признака означает, что его
количественный уровень генетически определяется различными аллельными вариантами
целого ряда локусов, разбросанных по всему геному.
20
Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области
применения // Успехи современной биологии, 2004. Т. 3. С. 260–271.
19
Определенная часть генов может кодировать продукт, участвующий в ряде ключевых
процессов, и, следовательно, оказывать более сильное влияние на формирование признака.
Это так называемые «мажорные» гены. В качестве «мажорных» условно принято считать те
гены, у которых различие по величине признака между альтернативными гомозиготами
равно стандартному отклонению или превышает его.
Селекция на улучшение интересующего признака, базируется изначально на выборе
генов, детерминирующих биохимические процессы, связанные с формированием признака.
Затем исследуется полиморфизм этих генов и продуктивные особенности животных,
несущих в своем генотипе разные аллели этого гена. Следовательно, гены-кандидаты - это
гены, кодирующие ключевые белки, принимающие участие в формировании признака.
Особенностью таких генов является то, что изначально неизвестно наличие аллельных
вариантов гена и их влияние на величину признака.
Существуют различные механизмы влияния аллельных генов на признаки. В то же
время, по мнению многих авторов, маркерная селекция оказывается эффективной даже при
отсутствии некоторых из них (например, плейотропии и сцепления). В любом случае, даже
временные связи маркерных генов с хозяйственно полезными признаками могут быть
использованы в племенной работе с конкретными популяциями животных и получен
экономический эффект. ДНК маркеры селекционных признаков - это молекулярно-генетические маркеры, тесно сцепленные с целевыми генами, являются инструментами для
предсказания фенотипического проявления хозяйственно-ценных признаков с.-х. животных.
Целевые гены (гены-маркеры) представлены генами, белковый продукт которых играет
значительную роль в формировании и регуляции физиологических процессов. Сам ген при
этом должен обладать полиморфизмом (различными аллельными вариантами), связанным с
вариативностью уровня продуктивности. «Считывание» этих вариантов и выявление
желательных позволяет проводить селекцию животных по генотипам.
На сегодняшний день определено множество целевых генов с.-х. животных,
связанных с различными признаками продуктивности. Некоторые из них получили широкое
распространение в практической селекции, другие находятся в стадии исследования и
апробации.
Диагностика аллельных вариантов целевых генов основана на определении различий
нуклеотидных последовательностей в определенных локусах этих генов. Как правило, длина
этих локусов составляет от 100 до 2000 п.н., расположенных как в экзонах (кодирующей
части гена), так и в интронах (некодирующей части гена). Нуклеотидные последовательности
в локусе могут различаться по длине, за счет наличия инсерций или делеций, либо по одному
нуклеотиду (точковая мутация). Основным методом «считывания» этих вариантов является
20
полимеразная цепная реакция
с последующей визуализацией фрагментов методом
электрофореза. В случае различий по одному нуклеотиду, после ПЦР необходимо
дополнительно провести рестрикцию
амплифицированных фрагментов. Этот метод
получил название ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин
рестрикционных фрагментов)21.
21
Широкова Н.В., Колосов Ю.А., Гетманцева Л.В., Радюк А.В., Бакоев Н.Ф. Оптимизация техники проведения
ПЦР-ПДРФ для генотипирования 160 овец // Научный журнал КубГАУ. 2015. №113(09). Режим доступа:
http://ej.kubagro. ru/2015/09/pdf/102.pdf
21
Заключение
В настоящее время всё большее внимание уделяется генетике в ветеринарии.
Решаются иммуногенетические проблемы, важные для борьбы с инфекционными и
инвазионными заболеваниями животных.
Молекулярно-генетические исследования предназначаются для выявления
вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы).
В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. Это сложные методы
диагностики,
требуют
определённых
лабораторных
условий
и
подготовки
квалифицированного персонала. Молекулярно-генетические методы проводят в
несколько этапов. Первый этап всех методов – получение образцов ДНК или РНК. Для
этого используют каплю крови, лейкоциты, культуры фибробластов, соскоб эпителия
со слизистой оболочки, волосяные луковицы. Выделенная ДНК одинаково пригодна
для проведения различных вариантов и может долго сохраняться в замороженном
состоянии.
Таким образом, молекулярно-генетическая диагностика в ветеринарии используется
в следующих целях:
1. При создании животных, устойчивых к болезням;
2. Для уточнения происхождения животных;
3. При оценке производителей по качеству потомства;
4. В пушном звероводстве;
5. Для изучения вредных веществ на наследственный аппарат животных;
6. Для изучения наследования аномалий;
7. Для выявления носителей вредных генов;
8. Для изучения иммунитета животных;
9. Для изучения генетики патогенности и вирулентности микроорганизмов;
10. Для разработки методов выделения устойчивости животных к болезням.
Тем не менее, проблема иммунитета и селекции животных на устойчивость к
заболеваниям в условиях крупных промышленных комплексов является одной из
первоочередных в ветеринарии.
22
Список использованной литературы
1.
Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Городов B.C. Перспективы использования
методов генодиагностики в ветеринарной практике // БИО журнал для специалистов
птицеводческих и животноводческих хозяйств. 2003. № 12. С. 31-32.
2.
Будулов Н.Р. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота в
Республике Дагестан: особенности распространения, клинические проявления и
организация ветеринарно-профилактических мероприятий // Сибирский вестник
сельскохозяйственной науки. 2008. № 3. С. 78-83.
3.
Взаимосвязь полиморфизма гена LIF/DRAIII с продуктивными качествами
свиней / Л.В. Гетманцева [и др.] //
4.
Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. -2014. - № 3.
- С. 36-39.
5.
Глазко В.И., Белопухов С.Л. Нанотехнологии и нано- материалы в сельском
хозяйстве. /Под ред. акад.
6.
Глазко В. И. ISSR-PCR маркеры и мобильные генетические элементы в
геномах сельскохозяйственных видов млекопитающих / В. И. Глазко, Е. А. Гладырь А. В.
Феофилов Н. В. Бардуков др.// Сельскохозяйственная биология — 2013. — № 2. — С. 71–
76.
7.
Гетманцева Л. В. Использование ДНК-маркеров в селекции свиней / Л. В.
Гетманцева, Е. А. Карпенко, Д. В. Чекотин// Перспективное свиноводство: теория и
практика. 2012. № 1. С. 4.
8.
Дейкин А.В., Селионова М.И., Криворучко А.Ю., Коваленко Д.В., Трухачев
В.И. Генетические маркеры в мясном овцеводстве // Вавиловский журнал генетики и
селекции, 2016. Т. 20. № 5. С. 576–583.
9.
Донник И.М. Молекулярно-генетические и иммуно-биохимические маркеры
оценки здоровья сель скохозяйственных животных // Вестник РАН. 2017.№ 4. С. 362-366.
10.
Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика : учебное пособие / И.Ф.
Жимулев ; под ред. Е.С. Беляева, А.П. Акифьева. - 4- е изд., стер. - Новосибирск : Сиб.
унив., 2007. - 479 с.
11.
Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации
на период до 2020 года" (утв. Правительством РФ 24.04.2012 N 1853п-П8) URL:
http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_130043/
12.
Красиков А.П., Алексеева И.Г. Комплексная диагностика инфекционных
болезней крупного рогатого скота // Электронный научно-методический журнал Омского
ГАУ. 2015. № 1. С. 9.
23
13.
Методика формирования лаборатории молекулярно-генетических
исследований сельскохозяйственных животных :научно-методическое пособие / Л.В.
Гетманцева [и др.] ; Донской ГАУ. – Персиановский : Донской ГАУ, 2015. - 32 с.
14.
Оценка силы статистического влияния полиморфизма гена ESR1 на
воспроизводительные признаки свиней / А.Ю. Колосов [и др.] // Аграрный вестник Урала.
- 2016. - № 2 (144). - С. 17-19.
15.
Разработка современных методов селекции свиней в ЗАО «Племзавод-
Юбилейный» / С.Н. Мамонтов [и др.] // Свиноводство. - 2015. - № 5. - С. 35-37.
16.
РАСХН В.М. Баутина. – М: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. -
2008. – 228 с.
17.
Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров,
их свойства и области применения // Успехи современной биологии, 2004. Т. 3. С. 260–
271.
18.
Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров,
их свойства и области применения // Успехи современной биологии, 2004. Т. 3. С. 260–
271.
19.
Широкова Н.В., Колосов Ю.А., Гетманцева Л.В., Радюк А.В., Бакоев Н.Ф.
Оптимизация техники проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования 160 овец // Научный
журнал КубГАУ. 2015. №113(09). Режим доступа: http://ej.kubagro. ru/2015/09/pdf/102.pdf
20.
Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия : учеб.-справ. издво / С. Н.
Щелкунов. - 3-е изд., испр. и доп. - Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2008. - 514 с
24