ПРИМЕРЫ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ ПО ЭНЗИМОЛОГИИ Задача 1. Проанализируйте данные экспериментов по определению скорости ферментативной реакции при различных концентрациях субстрата, а также в присутствии ингибитора. По имеющимся данным постройте график Лайнуивера–Берка, определите Кm фермента и тип ингибирования. Таблица Концентрация субстрата, М 610-6 110-5 210-5 610-5 1,810-4 Скорость реакции, мкмоль/мин 20,8 29 45 67,6 87 Скорость в присутствии ингибитора, мкмоль/мин 4,2 5,8 9 13,6 16,2 Ответ 1 1 V График Лайнуивера-Берка – график двойных обратных величин ( против S ). 250 200 1 v 150 100 50 50 100 150 1 S Отрезок на горизонтальной оси = 200 250 103 1 Km 1 Отрезок на вертикальной оси = Vmax Тип ингибирования неконкурентный, т.к. в присутствии ингибитора Кm (т.е сродство фермента к субстрату ) не изменилось. Задача 2. Фермент (10мкг) с молекулярной массой 500000 г/моль превращает 9,6 мкмоль субстрата в минуту при t 25С. Подсчитайте число оборотов. Ответ. Число оборотов – количество молекул субстрата, превращаемого одной молекулой фермента за единицу времени. 9,6/60:10/50000=800сек-1 Задача 3. Сколько граммов субстрата с молекулярной массой 672 г/моль может преобразовать фермент, если его активность составляет 5нКат, а время инкубации – 20 сек. Ответ. 6721011 г. Задача 4. Проанализируте график Лайнувивера-Берка. Определите Кm, Vmax, и тип ингибирования. 1 Km Ответ. Отрезок на оси абсцисс = 1 Отрезок на оси ординат = Vmax 1 = -2 => Km = 0.5 Km ммоль/л 1 = 1 => Vmax = 1 Vmax ммоль/л В присутствии ингибитора значение Кm не изменилось. Следовательно, тип ингибирования неконкурентный. Задача 5. Используя график Лайнувивера-Берка, проанализируйте, как изменились кинетические характеристики фермента в присутствии ингибитора. Определите тип ингибирования. 1/V 2,5 i 2,0 1,5 1,0 0,5 -1,0 · -0,5 1/[S] 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Ответ. В присутствии ингибитора прямая прошла через ту же точку на оси ординат, тогда как отрезок на оси абсцисс, с помощью которого можно рассчитать Km уменьшился. Исходное значение Km=-1/-1 =1 ммоль/л, в присутствии ингибитора- Km=1/-0,5=2 ммоль/л. Увеличение значения Km отражает уменьшение сродства к ферменту, что наблюдается при конкурентном ингибировании. Задача 6. Зависимость V от [S] для реакции, катализируемой транскарбамоилазой, выражается сигмоидной (S-образной) кривой. После воздействия на фермент солями ртути (II) каталитическая активность фермента резко возрастает, а кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата становится гиперболической. Какие выводы о механизме активации фермента ионами ртути можно сделать? Приведите примеры других ферментов, активируемых подобным образом. Ответ. Сигмоидный характер кривой зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата характерен для аллостерических ферментов, являющихся, как правило, олигомерными белками. S-образная форма кривой отражает кооперативное взаимодействие субъединиц при связывании субстарата. При воздействии солей ртути происходит диссоциация олигомера и высвобождается каталитически более активная субъединица, имеющая характеристики, подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен. Подобным образом активируется и фермент протеинкиназа А, в данном случае диссоциация неактивного олигомера инициируется циклическим АМФ. Задача 7. При добавлении в среду 0,002 мкмоль кристаллического фермента лактатдегидрогеназы наблюдается превращение субстрата со скоростью 9,6 мкмоль в минуту. Подсчитайте молярную активность (число оборотов) фермента. Ответ. Молярная активность (число оборотов) – это количество молекул субстрата, превращаемое одной молекулой фермента за единицу времени. Молярная активность выражается в единицах Кат/г-моль фермента, либо Е/мкмоль фермента. Таким образом, молярная активность лактатдегидрогеназы составляет 9,6:0,002=4,8∙103 мин-1. Задача 8. Сколько граммов субстрата с молекулярной массой 672 г/моль может преобразовать фермент, если его активность составляет 5нКат, а время инкубации – 20 сек. Ответ. Катал – количество фермента, преобразующее моль субстрата в секунду (моль/сек). Активность фермента составляет 5 нКат, т.е. фермент преобразует 5•10 -9 моль субстрата в сек, следовательно, за 20 секунд - 5•20•10 -9 = 1•10 -7моль субстрата. Для перевода в граммы умножим эту величину на молярную массу субстрата (исходя из формулы ν=m/Mr): 1 •10 -7•672=672•10 -7грамм субстрата. Задача 9. Фермент сахараза может катализировать следующие реакции гидролиза: 1) Глюкозо-фруктоза (сахароза) + Н2О → глюкоза + фруктоза 2) Фруктозо-глюкозо-галактоза + Н2О → фруктоза + глюкоза + галактоза. Если субстратом является сахароза, то Км=0,05 мМ, если раффиноза, то Км=2,0 мМ. Изобразить в виде графиков зависимость скорости реакции, катализируемой сахарозой, от концентрации субстратов и обьяснить: 1. что показывает Км, 2. в каком случае при одинаковой концентрации субстратов скорость реакции будет больше, 3.какой вид специфичности фермента к субстрату иллюстрирует этот фермент Ответ. График зависимости скорости реакции от конци субстрата, если он подчиняется Михаэлису-Ментену, выглядит как гипербола 1. Км - константа Михаэлиса-Ментена показывает, какая конц-я субстрата нужна, чтобы скорость реакции была равна половине максимальной: [S]=Км → V=½Vmax. Отсюда понятно, что чем меньше Км, т.е. чем меньше конц-я субстрата, требуемая для достижения нужной скорости, и тем больше субстрат и энзим подходят др. др., т.е. тем больше их сродство. Км сахарозы намного меньше (в 4 раза), поэтому сахароза является лучшим субстратом для данного энзима, чем рафиноза. 2. Из п.1 следует, что при одинаковой конц-и субстратов выше скорость там, где Км меньше. 3. обе реакции - гидролиз олигосахаридов, мономерами которых являются Dмоносахариды. Поэтому сахараза может проявлять несколько видов специфичности: а) относительную субстратную специфичность - способность фермента катализировать превращения нескольких, сходных по строению, субстратов. б) стереоспецифичность - способность фермента катализировать превращения определенных стереоизомеров (в данном сл. D). в) специфичность действия - способность катализировать только определенный тип химической реакции. В описанном опыте доказана относительная субстратная специфичность, остальные требуют доп. проверки. Задача 10. Определите класс ферментов, катализирующих следующие реакции: Ответ а) класс оксидоредуктаз; б) класс лиаз; в) класс гидролаз; г) класс трансфераз. Задача №11. Выберите и составьте последовательность событий, происходящих при аллостерическом ингибировании фермента: а) уменьшается скорость превращения субстрата в активном центре; б) изменяется конформация фермента; в) эффектор присоединяется в активном центре; г) изменяется конформация аллостерического центра; д) нарушается комплементарность активного центра субстрату; е) эффектор присоединяется в аллостерическом центре; ж) изменяется конформация активного центра. Ответ е г б ж д а Задача 12 Активный центр фермента обычно представляет собой "карман" на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связывания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляющей С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков (АО)). Три главные каталитические группы в активном центре – это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в цепи). а) Если бы карбоксипептидаза представляла собой идеальную -спираль, то на каком расстоянии (в нм) друг от друга находились бы аргинин 145 и тирозин 248, аргинин 145 и глутаминовая кислота 270? б) Объясните, каким образом эти три аминокислоты, расположенные так далеко друг от друга в полипептидной цепи, могут катализировать реакцию, участники которой занимают пространство размером в несколько десятых долей нанометра. в) Если в процессе гидролиза участвуют только эти три каталитические группы, для чего ферменту необходимо иметь так много аминокислотных остатков? Решение. а) Сначала найдём расстояние между аргинином 145 и тирозином 248 в АО: 248 – 145 = 103 АО. Затем выразим найденное расстояние из АО в нм, учитывая то, что шаг -спирали соответствует периоду 0,54 нм или 3,6 АО. Для этого составим пропорцию: 0,54 нм --- 3,6АО X нм --- 103АО Откуда X = 0,54*103/3,6=15,5нм (расстояние между аргинином 145 и тирозином 248). Аналогично найдём расстояние между аргинином 145 и глутаминовой кислотой 270 в АО: 270 – 145 = 125 АО. Затем выразим найденное расстояние из АО в нм. Для этого составим пропорцию: 0,54 нм --- 3,6 АО X нм --- 125 АО Откуда X = 0,54*125/3,6=18,8 нм (расстояние между аргинином 145 и глутаминовой кислотой 270). б) При образовании трёхмерной конформации фермента эти аминокислоты оказываются в непосредственной близости друг от друга. в) Белок служит «каркасом», поддерживающим каталитичсекие группы в правильной ориентации. Задача 13. Фермент уреаза повышает скорость гидролиза мочевины при pH 8,0 и 20°С в 1014 раз. Примем, что некоторое количество уреазы может полностью гидролизовать некоторое количество мочевины при указанных условиях за 5 мин. Рассчитайте сколько времени потребовалось бы для полного гидролиза мочевины в тех же условиях без уреазы. Ответ Так как ускорение реакции происходит в 1014 раз, то нужно 5 минут умножить на эту величину, получим количество минут. В году 525600 минут. Поделив (5×1014) : 525600 = 9,5×108 лет. Таким образом, для спонтанного расщепления того количества мочевины, которое фермент расщепляет за 5 минут, потребуется около 1 млрд лет. Задача № 14 5 мг фермента лактатдегидрогеназы за 30 мин катализирует превращение пирувата с образованием 20 мкмоль лактата. Рассчитайте активность фермента. Что произойдет, если в среде уменьшить количество НАД? Активность ферментов рассчитывается по формуле: Подставляя указанные в условии задачи значения в формулу, получаем 0,13 мкмоль продукта/мин×мг. Так как НАД является коферментом лактатдегидрогеназы, то уменьшение его количества приведет к снижению активности фермента. Ответ № 14. Подставляя указанные в условии числа в формулу, отражающую активность фермента получаем 2 мкмоль/мин×мг. При добавлении малоновой кислоты произойдет остановка реакции из-за конкурентного ингибирования сукцинатдегидрогеназы. Задача №15. Укажите направление перемещения (катод, анод или линия старта) при электрофорезе фермента рибонуклеазы при рН 4,2; 9,5 и 11,3, учитывая, что изоэлектрическая точка рибонуклеазы – 9,45. Ответ рибонуклеаза – при рН 4,2 – к катоду, рН 9,5 – на старте, рН 11,3 – к аноду Задача № 16 Оптимальными условиями действия амилазы – фермента, расщепляющего крахмал, являются рН=6,8; температура 37ºС. 1. Как изменится активность фермента при изменении условий реакции? 2. Укажите причину изменений. а) рН инкубационной среды =5; б) температура инкубации 70ºС; в) при добавлении в инкубационную среду СuS04; г) при увеличении концентрации крахмала в присутствии СuS04 в инкубационной среде. Ответ а) активность амилазы снизится, так как ацидоз вызовет изменение конформации фермента; б) активность снизится, так как происходит тепловая денатурация фермента; в) активность снизится, так как СuSО4 является ингибитором фермента (Сu2+ является тяжелым металлом); г)добавление крахмала в присутствии ингибитора не увеличит активность амилазы. Задача № 17 В таблице приведена скорость ферментативной реакции при разных концентрациях субстрата без ингибитора (О) и в присутствии двух ингибиторов (I1 и I2). [S], мМ 1 2 3 5 10 20 30 ν 0 30 55 65 80 110 110 мкг/мин I1 15 28 38 55 80 110 110 I2 27,5 32,5 40 55 55 55 55 Определите, какой из ингибиторов является конкурентным, а какой – аллостерическим? Для обоснования ответа вспомните: 1. Какие типы ингибирования вам известны? 2. Чем они отличаются друг от друга? Ответ Ингибитор 1 – конкурентный, влияние ингибитора уменьшается с ростом концентрации субстрата. Ингибитор 2 – неконкурентный, субстрат не влияет на действие ингибитора. Задача 18. Из экстракта, содержащего 500 мг общего белка и 100 ед. активности фермента, получен препарат, содержащий 2 мг белка и 80 ед. активности. С каким выходом (по активности) получен фермент и какова степень его очистки? Задача 19 Какова минимальная молекулярная масса рибонуклеазы, если массовые концентрации лейцина и изолейцина в ней будут соответственно равны 1,65 и 2,48? Задача 20 Относительная молекулярная масса ДНК-полимеразы равна 109000. Вычислите количество аминокислотных остатков в составе молекулы указанного фермента. Задача 21 Рассчитайте концентрацию меди (в процентах) в медьсодержащем ферменте аскорбатоксидазе (Мr = 150 000), если каждая молекула содержит 6 атомов меди. Задача 22 Фенолоксидаза (полифенолоксидаза) содержит в своем составе 0,20% Сu. Рассчитайте относительную молекулярную массу фермента, если известно, что на одну молекулу фермента приходится один атом меди. Задача 23 Массовая концентрация лейцина и изолейцина в рибонуклеазе составляет 1,65 и 2,48% соответственно. Рассчитайте ее минимальную молекулярную массу. ЗАДАЧИ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО РЕШЕНИЯ №1 Молекулярная масса пируваткарбоксилазы 183 000. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если его удельная активность составляет 1,2∙103 Е. №2 Рассчитайте удельную активность каталазы (Мr = 252 000) и лактатдегидрогеназы (М = 140 000), если молекулярная активность этих ферментов при температуре 25°С, оптимальном рН и полном насыщении субстратом равна 5∙106 и 3,7∙104 соответственно. №3 Рассчитайте удельную активность карбоангидразы (Мr = 30 000), гексокиназы (Мr = 45 000) и альдолазы (Мr = 142 0 00), если их молекулярная активность равна 0,96∙108; 1,7∙104 и 4,2∙108 соответственно. №4 Рассчитайте концентрацию меди (в процентах) в медьсодержащем ферменте аскорбатоксидазе (Мr = 150 000), если каждая молекула содержит 6 атомов меди. №5 Массовая концентрация лейцина и изолейцина в рибонуклеазе составляет 1,65 и 2,48 % соответственно. Рассчитайте ее минимальную молекулярную массу. №6 Рассчитайте молекулярную массу протомера кристаллической каталазы, представляющего протеид с активной группой в виде железопорфиринового комплекса с одним атомом железа, если концентрация железа в кристаллической каталазе равна 0,12 %. №7 Рассчитайте концентрацию меди (в %) в гемоцианине - медьсодержащем белке крови омара, если известно, что Мr = 780 000 и на одну молекулу приходится 20 атомов меди. №8 В реакции второго порядка А + В = С в начальный момент концентрация вещества А была равна 5,0 ммоль/л, В - 4,0 ммоль/л. Спустя 1 с концентрация вещества А стала равной 4,0 ммоль/л, В - 3,0 ммоль/л. Каким будет отношение концентраций веществ А и В через 3 с? №9 Молекулярная масса пируваткарбоксилазы 183000. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если его удельная активность составляет 1,2∙103 Е. №10 Рассчитайте удельную активность каталазы (Мr = 252000) и лактатдегидрогеназы (Мr = 140000), если молекулярная активность этих ферментов при температуре 25 °С, оптимальном рН и полном насыщении субстратом равна 5∙106 и 3,7∙104 соответственно. №11 Рассчитайте удельную активность карбоангидразы (Мr = 30000), гексокиназы (Мr = 45 000) и альдолазы (Мr = 1420 00), если их молекулярная активность равна 0,96∙10 8; 1,7∙104 и 4,2∙108 соответственно. №12 Рассчитайте активность каталитических центров каталазы, лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы (молекулярная активность их соответственно равны 5∙106; 3,7∙103 и 2,7∙102), если число каталитических центров у первых двух ферментов равно четы рем, а у последнего - двум. №13 Определите удельную активность (а) пируваткиназы (Мr = 237000), (б) цитохром-Средуктазы (Мr = 75000) и (в) бутирил-КоА-дегидрогеназы (Мr = 200 000), исходя из значений их молекулярной активности: 6∙108; 1,3∙108 и 2∙108 соответственно. №14 В каком состоянии находится HS-группа цистеина (рК = 8,33) и имидазольный радикал гистидина (рК = 7,12) в молекуле гексокиназы в условиях оптимального рН (8,3—8,6) действия этого фермента? №15 Какой объем НСI (0,1 моль/л) необходимо добавить к 20,0 мл фосфатного буфера (0,04 моль/л) с рН 6,5, содержащего уреазу, чтобы уменьшить активность фермента на 50 % в условиях, когда лимитирующим скорость процесса является рН? Какой будет концентрация водородных ионов в таком растворе? Буферной емкостью самой уреазы можно пренебречь. Максимальная активность уреазы (100 %) при рН 6,5, а 50 % ее активности при рН 5 №16 Массовая концентрация лейцина и изолейцина в рибонуклеазе составляет 1,65 и 2,48 % соответственно. Рассчитайте ее минимальную молекулярную массу. №17 Парциальный удельный объем рибонуклеазы равен 0,707 см 3 г-1, а ее коэффициент диффузии, приведенный к воде при 20 °С, равен 13,1 10-7 см2 с-1. Константа седиментации рибонуклеазы, также приведенная к воде при 20 °С, равна 2,05. Плотность воды при 20 °С составляет 0,998 г/см-3. Используя уравнение Сведберга, вычислите молекулярную массу рибонуклеазы. №18 Имеется раствор NaOH (0,1 моль7л) и такой же концентрации растворы серной кислоты, ацетата (рК1= 4,76), малата (рК2 = 3,86), фосфорной кислоты (рК3 = 7,2) и хлорида аммония (рК4 = 9,25). Как приготовить буфер с рН 5,4 для опытов с ферментами, приводящими к образованию кислоты? №19 Количество распавшегося под действием каталазы пероксида водорода соответствует 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия. Вытяжка каталазы, взятая для опыта в количестве 20 мл, была приготовлена из 0,25 г моркови. Опыт проводили в течение 30 мин. Определите активность фермента, содержащегося в 1 г моркови. №20 Относительная молекулярная масса фосфопируваткарбоксилазы равна 400000. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если известно, что его удельная активность составляет 1,2∙103 Е. №21 Рассчитайте удельную активность карбоангидразы (Мr = 30000), гексокиназы дрожжей (Мr = 102000) и альдолазы (Мr = 160000), зная, что их молекулярная активность равна 0,96∙108, 1,7∙104 и 4,2∙105 соответственно. №22 Рассчитайте активность каталитических центров каталазы, лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы (молекулярная активность их соответственно равна 5∙10 6, 3,7∙104 и 2,7∙104, если известно, что число их у первых двух ферментов равно четырем, а у последнего - двум. №23 Определите удельную активность пируваткиназы (Мr = 237000), цитохрома с - редуктазы (Мr = 75000) и бутирил-КоА-дегидрогеназы (Мr = 200000), исходя из значения их молекулярной активности 6∙105, 1,3∙104 и 2∙105 соответственно. №24 Активность аланинаминотрансферазы определяют колориметрически по количеству динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, образующегося при реакции переамирования -кетоглутаровой кислоты и аланина. Рассчитайте активность аланинаминотрансферазы в исходной вытяжке, если известно, что инкубацию проводили в течение 30 мин с 1 мл разведенной в 50 раз вытяжки фермента, причем получили количество динитрофенилгидразона, соответствующее 44 мг пировиноградной кислоты. №25 Рассчитайте молекулярную массу дигидрооротатдегидрогеназы, в состав которой входит 2 атома железа при содержании последнего 0,18%. №26 В состав сукцинатдегидрогеназы сердца входят 8 атомов железа при содержании последнего 0,22%. Рассчитайте молекулярную массу фермента. №27 Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность аспартатаммиаклиазы на 80% в течение 120 дней. Какова будет к этому сроку примерная суточная производительность реактора, если известно, что вначале она составляла 1915 кг 95% -ной чистоты L-аспарагиновой кислоты? КОФЕРМЕНТЫ №1 Рассчитайте концентрацию меди (в процентах) в медьсодержащем ферменте аскорбатоксидазе (Мr = 150 000), если каждая молекула содержит 6 атомов меди. №2 Рассчитайте концентрацию меди (в процентах) в гемоцианине - медьсодержащем белке крови омара, если известно, что Мr = 780 000 и на одну молекулу приходится 20 атомов меди. №3 Рассчитайте молекулярную массу протомера кристаллической каталазы, представляющего протеид с активной группой в виде железопорфиринового комплекса с одним атомом железа, если концентрация железа в кристаллической каталазе равна 0,12 %. Проведите соответствующие превращения и решите расчетные задачи. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТОВ №1 Покажите, что для ферментативной реакции величина Кm численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции вдвое меньше максимальной. №2 Полупериод реакции первого порядка равен 0,3 с. Чему равна константа скорости? №3 В реакции первого порядка А → В концентрация вещества А в начальный период была равна 0,50 ммоль/л. Спустя 2 с она стала равной 0,25 ммоль/л. Какой она станет спустя 5 с? №4 В реакции второго порядка А + В → С в начальный момент концентрация вещества А была равна 5,0 ммоль/л, В — 4,0 ммоль/л. Спустя 1 с концентрация вещества А стала равной 4,0 ммоль/л, В — 3,0 ммоль/л. Каким будет отношение концентраций веществ А и В спустя 3 с?
