Дисс. Аленькина. МЕССБАУЭРОВСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ С ВЫСОКИМ СКОРОСТНЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ НАНОРАЗМЕРНЫХ «ЖЕЛЕЗНЫХ ЯДЕР» В МАКРОМОЛЕКУЛАХ ФЕРРИТИНА И ЕГО АНАЛОГОВ (2)

1
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования
«Уральский федеральный университет
имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»
На правах рукописи
АЛЕНЬКИНА Ирина Владимировна
МЕССБАУЭРОВСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ С ВЫСОКИМ
СКОРОСТНЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ НАНОРАЗМЕРНЫХ
«ЖЕЛЕЗНЫХ ЯДЕР» В МАКРОМОЛЕКУЛАХ ФЕРРИТИНА И
ЕГО АНАЛОГОВ
01.04.07 – Физика конденсированного состояния
03.01.02 – Биофизика
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата
физико-математических наук
Научный руководитель
доктор физико-математических наук
Оштрах М.И.
Екатеринбург – 2016
2
Работа выполнена на кафедрах экспериментальной
физики и физических методов и приборов контроля
качества
Физико-технологического
института
Федерального
государственного
автономного
образовательного учреждения высшего образования
«Уральский федеральный университет имени первого
Президента России Б.Н. Ельцина».
3
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………...................................... ….6
Глава 1 ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И НЕКОТОРЫХ ФИЗИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ
НАНОРАЗМЕРНЫХ «ЖЕЛЕЗНЫХ ЯДЕР» МАКРОМОЛЕКУЛ ФЕРРИТИНА И ИХ
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ………………………………………………………… ...12
1.1 Структура и функции макромолекул ферритина и их фармацевтических аналогов…. ...12
1.2 Мессбауэровская спектроскопия наноразмерных «железных ядер» макромолекул
ферритина и его аналогов.……………………………………….............................................. ...31
1.2.1 Суперпарамагнитная релаксация (поведение) и другие особенности
мессбауэровских спектров ферритина и его аналогов…............................................................32
1.2.2 Параметры сверхтонкой структуры ядер 57Fe выделенных макромолекул
железодепонирующих белков…………………………............................................................ ...41
1.2.3 Параметры сверхтонкой структуры ядер 57Fe фармацевтических аналогов
ферритина………………………………………………………………………………………....46
1.3 Особенности структуры и параметров мессбауэровских спектров макромолекул
железодепонирующих белков в различных тканях в норме и при молекулярных
болезнях…………………………………………………………………………………………...53
1.3.1 Мессбауэровская спектроскопия тканей, содержащих железодепонирующие
белки…......................................................................................................................................... ...53
1.3.2 Параметры мессбауэровских спектров наноразмерных «железных ядер»
макромолекул ферритина в норме и при молекулярных болезнях…………….................... ...58
1.4 Постановка задачи исследования……………………………………………........................68
Глава 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………….. ...71
2.1 Приготовление образцов……………………………………………......................................71
2.1.1 Выделенный ферритин печени человека………………………………….........................71
2.1.2 Фармацевтические аналоги ферритина…….……………………......................................71
2.1.3 Ткани, содержащие железодепонирующие белки, в норме и при некоторых
патологиях...…………………………………………………………………………………... ...71
2.1.4 Бактерии, содержащие ферритин……………………………………………………… ...72
2.2 Методы исследования образцов……………………………………......................................73
2.2.1 Рентгеновский фазовый анализ………………………………………………………… ...73
2.2.2 Сканирующая электронная и трансмиссионная микроскопия……………………… ...73
2.2.3 Гистохимический анализ тканей……………………………………………......................73
2.2.4 Термогравиметрия………………………………………………………………………. ...74
4
2.2.5 Электронный парамагнитный резонанс……………………………………................... ...74
2.2.6 Измерение магнитных свойств…………………………………………………………. ...74
2.2.7 Мессбауэровская спектроскопия ………………………………..................................... ...75
2.3 Выводы……………………………………………………………………………………... ...82
Глава 3 МЕССБАУЭРОВСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ НАНОРАЗМЕРНЫХ «ЖЕЛЕЗНЫХ
ЯДЕР» МАКРОМОЛЕКУЛ ФЕРРИТИНА И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ… ...83
3.1 TEM, SEM, XRD и термогравиметрия наноразмерных «железных ядер»
макромолекул ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер®
и Феррум Лек………………………………………………………………………………….. ...83
3.2 ЭПР и магнитометрия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и
его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер® и Феррум Лек……………… ...87
3.3 Особенности структуры наноразмерных «железных ядер» ферритина и его аналогов
по данным мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением при
295 и 90 К………………………………………………………………………………………. ...91
3.3.1 Аппроксимация мессбауэровских спектров на основе гомогенной модели
«железного ядра»………………………………………………………………………………....91
3.3.2 Аппроксимация мессбауэровских спектров на основе модели гетерогенного
«железного ядра»…………………………………………………..…………………………. ...95
3.4 Отличие в величине барьера энергии магнитной анизотропии для наноразмерных
«железных ядер» ферритина и его аналогов.............................................................................100
3.5 Выводы……………………………………………………………………………………... 106
Глава 4 АНОМАЛЬНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ МЕССБАУЭРОВСКИХ
СПЕКТРОВ МАКРОМОЛЕКУЛ ФЕРРИТИНА И ЕГО АНАЛОГОВ В
ТЕМПЕРАТУРНОМ ДИАПАЗОНЕ 295–90 К И ОСОБЕННОСТИ ГЕТЕРОГЕННОЙ
СТРУКТУРЫ «ЖЕЛЕЗНЫХ ЯДЕР»…...…………………………………………………… 107
4.1 Мессбауэровские спектры ферритина и его аналогов в диапазоне температур
295–90 К…………………………………………………………………………………………107
4.2 Оценка температуры Дебая для «железных ядер» выделенного ферритна печени
человека и препарата Феррум Лек.……………………………………………………………108
4.3 Аномальные температурные зависимости параметров мессбауэровских спектров
ферритина и его аналогов в диапазоне температур 295–90 К.………………………………110
4.3.1 Модель гомогенного «железного ядра»……………………………………………….. 110
4.3.2 Модель гетерогенного «железного ядра»……………………………………………… 114
4.4 Применение нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина
в бактериях A. brasilense (штамм Sp245) при 295 К в рамках модели гетерогенного
5
«железного ядра»………………………………………………………………………………122
4.5 Выводы…………………………………………………………………………………..…. 124
Глава 5 МЕССБАУЭРОВСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ТКАНЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ
ЖЕЛЕЗОДЕПОНИРУЮЩИЕ БЕЛКИ, В НОРМЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ
ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СИСТЕМЫ КРОВИ............................................ 126
5.1 Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров тканей куриной
печени и селезенки в норме и при лимфоидном лейкозе…………………………………… 126
5.2 Особенности наноразмерных «железных ядер» в железодепонирующих белках
тканей селезенки и печени здорового человека и больных злокачественными
заболеваниями системы крови………………………………………………………………... 131
5.3 Выводы…………………………………………………………………………………….. 146
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………………… 148
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ…………................................... 151
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………................................... 153
6
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
Особенности структуры наноразмерных частиц представляют большой интерес для
понимания их физических и функциональных свойств. В частности одним из важных и
перспективных направлений является изучение наночастиц, синтезированных в живых
организмах, а также их искусственных аналогов. Примером таких наночастиц служат
наноразмерные
«железные
ядра» в
макромолекулах
железодепонирующих
белков
–
ферритинов. Эти белки обеспечивают живые организмы железом, необходимым для биосинтеза
жизненно важных железосодержащих белков. При этом структура «железных ядер» в
ферритинах, как синтезированных в разных органах одного организма, так и в различных
организмах, отличается. С другой стороны, в случае недостатка железа в организме и
возникающей в результате этого железодефицитной анемии для лечения последней
применяются различные железосодержащие препараты, включая железо-полисахаридные
комплексы, являющиеся синтетическими аналогами макромолекулы ферритина. В этом случае
особенности структуры «железных ядер» аналогов ферритина могут определять эффективность
этих препаратов.
Одним из наиболее чувствительных методов диагностики состояния ионов железа в
различных объектах является мессбауэровская спектроскопия на ядрах
57
Fe. В частности, с
помощью мессбауэровской спектроскопии можно исследовать связь структуры локального
окружения и параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe. Возможности этого метода
существенно возрастают при использовании мессбауэровской спектроскопии с высоким
скоростным разрешением, т.е. с дискретизацией опорного сигнала скорости допплеровской
модуляции на 4096 шагов (см. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. // Spectrochimica Acta, Part A. –
2013. – V. 100. – P. 78–87). Поэтому данный метод впервые применен для более детального
изучения особенностей структуры наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах
ферритина и его аналогов.
Степень разработанности
Физические свойства макромолекул ферритина и его аналогов изучаются более сорока
лет во многих лабораториях мира. Тем не менее, эти макромолекулы все еще остаются
объектами различных исследований. В частности, это связано с тем, что структура
наноразмерных «железных ядер» и особенности их формирования в различных макромолекулах
ферритинов, а также их аналогов до сих пор недостаточно изучены ввиду чрезвычайной
сложности этих объектов. До настоящего времени ведутся научные дискуссии по поводу
особенностей формирования «железных ядер», в результате чего отсутствует общепринятое
7
представление о модели структуры «железного ядра» как в различных ферритинах, так и в их
аналогах. Поэтому дальнейшее изучение «железных ядер» в макромолекулах ферритина и его
аналогов различными физическими методами с целью разработки новых подходов к
формированию представлений о структуре наноразмерного «железного ядра» остается
актуальным.
Цель работы
Изучение особенностей структуры наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах
ферритина и его фармацевтически важных аналогов, а также в железодепонирующих белках в
тканях печени и селезенки в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови
методом мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением.
Задачи работы
1. Характеризация исследуемых объектов (ферритина печени человека, тканей печени и
селезенки
и
фармацевтических
трансмиссионной
спектроскопией,
и
препаратов
сканирующей
рентгеновской
Мальтофер®
электронной
дифракции,
и
микроскопии
электронного
Феррум
с
Лек)
методами
энергодисперсионной
парамагнитного
резонанса,
термогравиметрии и магнитных измерений.
2. Измерение в температурном диапазоне 295–90 К мессбауэровских спектров с высоким
скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в выделенном ферритине печени
человека и его фармацевтически важных аналогах – препаратах Имферон, Мальтофер® и
Феррум Лек.
3. Измерение при 295 К мессбауэровских спектров с высоким скоростным разрешением
наноразмерных «железных ядер» в ферритине бактерий Azospirillum brasilense (штамм Sp245) и
в железодепонирующих белках в тканях печени и селезенки человека и куриц в норме и при
злокачественных заболеваниях системы крови.
4. Измерение в температурном диапазоне 80–20 К мессбауэровских спектров с низким
скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в выделенном ферритине печени
человека и его фармацевтически важных аналогах – препаратах Мальтофер® и Феррум Лек.
5. Измерение при 40 и 20 К мессбауэровских спектров с низким скоростным
разрешением наноразмерных «железных ядер» в железодепонирующих белках в тканях печени
и селезенки человека в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови.
6. Аппроксимация измеренных мессбауэровских спектров с использованием моделей
гомогенного и гетерогенного «железного ядра» и получение оценок мессбауэровских
параметров.
7. Анализ и интерпретация полученных мессбауэровских параметров во взаимосвязи со
структурными особенностями наноразмерных «железных ядер» в исследуемых объектах.
8
Методология и методы
Основным
методом
диссертационного
исследования
является
мессбауэровская
спектроскопия с высоким скоростным разрешением. В качестве дополнительных методов
использовались
мессбауэровская
спектроскопия
с
низким
скоростным
разрешением,
сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия, рентгеновская дифракция,
термогравиметрия, магнитометрия, электронный парамагнитный резонанс и гистохимический
анализ. Методология и мтеоды исследования подробно описаны в главе 2.
Научная новизна
Выявлены структурные отличия «железных ядер» выделенного ферритина печени
человека, ферритина бактерий Azospirillum brasilense (штамм Sp245), фармацевтических
препаратов Имферон, Мальтофер® и Феррум Лек в результате оценки параметров сверхтонкой
структуры ядер
57
Fe мессбауэровских спектров этих объектов, измеренных с высоким
скоростным разрешением с высоким скоростным разрешением.
Показано, что барьер энергии магнитной анизотропии наноразмерных «железных ядер»
в макромолекулах ферритина печени человека ниже, чем в его аналогах – препаратах
Мальтофер® и Феррум Лек.
Впервые
обнаружены
аномальные
температурные
зависимости
некоторых
мессбауэровских параметров спектров макромолекул ферритина печени человека и его аналога
– препарата Феррум Лек, которые могут быть связаны с низкотемпературными структурными
перестройками в соответствующих слоях/областях/нанодоменах «железных ядер».
Предложена новая модель гетерогенного «железного ядра» для аппроксимации
мессбауэровских спектров ферритина печени человека, ферритина бактерий Azospirillum
brasilense (штамм Sp245), фармацевтических препаратов Мальтофер® и Феррум Лек,
позволяющая
связать
выявленные
компоненты
спектров
с
соответствующими
слоями/областями/нанодоменами «железных ядер» и оценить их структурные особенности.
Выявлены отличия в содержании ферритиноподобного железа, а также в долях более и
менее плотно упакованных областей наноразмерных «железных ядер», характеризующихся
соответственно меньшим или большим значением градиента электрического поля на ядрах 57Fe,
в
нескольких
образцах
тканей
печени
и
селезенки
здоровых
людей
и
больных
злокачественными заболеваниями системы крови.
Защищаемые положения
1. Величина барьера энергии магнитной анизотропии для наноразмерных «железных
ядер» в ферритине печени человека ниже, чем в его аналогах – препаратах Феррум Лек и
Мальтофер®.
9
2. Температура Дебая для атомов железа, оцененная в модели гомогенного «железного
ядра», составляет 46116 К для ферритина печени человека и 50224 К для его аналога –
препарата Феррум Лек.
3. Аномальное поведение мессбауэровских параметров спектров наноразмерных
«железных ядер» ферритина печени человека и его аналога – препарата Феррум Лек,
обнаруженное
в
температурном
диапазоне
295–90
К,
может
быть
обусловлено
низкотемпературными структурными перестройками.
4. Соотношение более плотно упакованных и менее плотно упакованных областей
наноразмерных «железных ядер», характеризующихся соответственно меньшим и большим
значением градиента электрического поля на ядрах
57
Fe, различно в ферритине исследованных
образцов тканей селезенки и печени здоровых людей и больных злокачественными
заболеваниями системы крови.
Научная и практическая значимость работы
Показаны
преимущества
применения
прецизионного
высокостабильного
мессбауэровского спектрометрического комплекса с высоким скоростным разрешением для
получения новой более детальной информации об особенностях структуры наноразмерных
«железных ядер» в различных макромолекулах ферритина и его аналогов – препаратов Феррум
Лек и Мальтофер®.
Разработан новый подход к аппроксимации мессбауэровских спектров различных
ферритинов и их аналогов на основе гетерогенной модели «железного ядра», который может
быть использован в дальнейших исследованиях методом мессбауэровской спектроскопии
аналогичных объектов, а также других железосодержащих наночастиц в парамагнитном
состоянии.
Полученные данные об особенностях структуры и подходы к исследованию
наноразмерных
«железных
ядер» в
аналогах
макромолекул
ферритина
могут
быть
использованы для разработки и контроля новых, более эффективных фармацевтических
препаратов для лечения железодефицитной анемии.
Результаты проведенных исследований могут быть использованы в учебных курсах для
бакалавров и магистров специальностей «Нанотехнологии» и «Биомедицинская инженерия».
Данная работа выполнена в рамках проекта РФФИ 09-02-00055-а «Диагностические
тесты для молекулярных болезней на основе данных мессбауэровской спектроскопии с
высоким скоростным разрешением» (2009–2011 гг.), госбюджетных тем «Мессбауэровская
спектроскопия
с
высоким
скоростным
разрешением
микро-
и
наноразмерных
железосодержащих структур в объектах живой и неживой природы» (2009–2011 гг.),
«Сверхтонкие взаимодействия ядер
57
Fe в микро- и наноразмерных железосодержащих
10
объектах живой и неживой природы по данным мессбауэровской спектроскопии с высоким
скоростным разрешением» (2012–2013 гг.), «Спектроскопия микро- и наноразмерных
материалов и биообъектов» (2014–2015 гг.).
Достоверность полученных в работе результатов
Достоверность результатов обеспечена использованием современного аттестованного
оборудования
и
соответствующих
методов
исследований,
включая
прецизионный
высокостабильный мессбауэровский спектрометрический комплекс с высоким скоростным
разрешением и малой инструментальной ошибкой по шкале скоростей, приходящейся на одну
точку спектра, а также азотный криостат с движущимся поглотителем с ошибкой поддержания
температуры менее 1 К.
Личный вклад автора
Формулирование цели и задач исследования, выбор изучаемых объектов и методов
исследования проведены автором совместно с научным руководителем д.ф.-м.н. М.И.
Оштрахом. Автором подготовлены различные образцы для исследований, проведено
планирование и проведение экспериментов. Автором проведена аппроксимация измеренных
мессбауэровских спектров, анализ и интерпретация результатов проведены совместно с
научным руководителем. Обобщение результатов, формулирование выводов и защищаемых
положений выполнены автором. В получении ряда результатов, их анализе и интерпретации
помимо автора также участвовали E. Kuzmann, Z. Klencsár, S. Dubiel и I. Felner.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных
конференциях: The XIII European Conference on Spectroscopy of Biological Molecules (Italy,
Palermo, 2009), Colloquium Spectroscopicum Internationale (Hungary, Budapest, 2009; Brazil,
Buzios, 2011; Portugal, Coimbra, 2015), International Conference on Molecular Spectroscopy
(Poland, Kraków – Białka Tatrzańska, 2009; Poland, Wroclaw – Kudowa Zdroj, 2011; Poland,
Kraków – Bialka Tatrzańska, 2013), The 21st International Symposium on Pharmaceutical and
Biomedical Analysis (USA, Orlando, 2009), European Congress on Molecular Spectroscopy (Italy,
Florence, 2010; Romania, Cluj-Napoca, 2012; Germany, Düsseldorf, 2014), International Biometals
Symposium (USA, Tucson, 2010; Belgium, Brussels, 2012), The 5th Central European Conference
“Chemistry towards Biology”(Croatia, Primošten, 2010), The 7th Seeheim Workshop on Mössbauer
Spectroscopy (Germany, Frankfurt, 2011), European Biophysics Congress (Hungary, Budapest, 2011,
Germany, Dresden, 2015), The Joint Meeting of the International Conference on Hyperfine
Interactions and the International Symposium on Nuclear Quadrupole Interactions (China, Beijing,
2012;
Australia,
Canberra,
2014),
Международной
конференции
«Мессбауэровская
спектроскопия и ее применения» (Россия, Суздаль, 2012; Россия, Суздаль, 2014), The 3rd
11
International Conference on Analytical Proteomics (Brazil, San Pedro, 2013), International Conference
on the Applications of the Mössbauer Effect (Croatia, Opatija, 2013), International Turkish Congress
on Molecular Spectroscopy (Turkey, Istanbul, 2013; Turkey, Antalya, 2015), Mössbauer Spectroscopy
in Materials Science (Hlochovec u Břeclavi, 2014), The 14th International Conference on Modern
Trends in Activation Analysis and The 11th international Conference on Nuclear Analytical Methods in
the Life Sciences (The Netherlands, Delft, 2015).
Публикации
Основные результаты опубликованы в 45 работах, в том числе 14 статей в
рецензируемых журналах из перечня ВАК, 29 тезисов докладов на международных
конференциях,
1
книжная
глава
в
коллективной
монографии
по
мессбауэровской
спектроскопии, вышедшей в издательстве Wiley, 1 статья в межвузовском сборнике.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и списка цитируемой
литературы из 272 наименований. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного
текста и содержит 26 таблиц, 111 рисунков.
12
1 ОСОБЕННОСТИ
СТРУКТУРЫ
И
НЕКОТОРЫХ
ФИЗИЧЕСКИХ
ПАРАМЕТРОВ НАНОРАЗМЕРНЫХ «ЖЕЛЕЗНЫХ ЯДЕР» МАКРОМОЛЕКУЛ
ФЕРРИТИНА И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ
Железодепонирующие белки играю важную роль в живых организмах, поэтому они
являются объектом многолетних исследований специалистами различных областей науки. К
настоящему времени накоплен большой опыт в исследовании макромолекул этих белков, а
также их фармацевтических аналогов различными физическими методами. Несмотря на
существенный прогресс визучении структуры и свойств этих макромолекул, остается еще
много нерешенных вопросов в понимании структурно-функциональной взаимосвязи в этих
белках. Некоторые результаты изучения макромолекул железодепонирующих белков и их
аналогов рассматриваются в данной главе.
1.1.Структура и функции макромолекул ферритина и их фармацевтических
аналогов
Железо является металлом жизни: оно играет ключевую роль для всех живых
организмов и входит в состав многих макромолеул, выполняющих дыхательные (гемоглобин),
транспортные (трансферрин), ферментативные (цитохромы, каталазы) и другие функции.
Запасание железа в нетоксичной и биодоступной форме в основном происходит в растворимых
макромолекулах ферритина [1], а также в его производных – макромолекулах гемосидерина,
которые, вероятнее всего, представляет собой агломераты денатурированного ферритина [2, 3].
Структура макромолекул ферритина подробно описана в ряде обзорных работ (см., например,
[2–21]), на основании которых можно выделить следующие особенности этой макромолекулы.
Ферритин состоит из белковой оболочки (апоферритина) и наноразмерного «железного
ядра (см. рисунок 1.1). Термин «железное ядро» происходит от английского термина «iron
core». «Железное ядро» состоит из оксигидроокиси железа в форме ферригидрита
(5Fe2O3×9H2O), в котором случайным образом распределены неорганические фосфаты [22], с
усредненной формулой всего комплекса (FeOOH)8(FeO:ОРО3Н2). Количество ионов железа в
ферритине может достигать 4500 с максимальным размером «ядра» до 8 нм. Обычно
макромолекула ферритина в норме содержит ~2500 ионов железа. Белковая оболочка
ферритина млекопитающих состоит из 24 белковых субъединиц L и H типа в различной
пропорции, отличающихся по размеру (19 и 21 кДа, соответственно), аминокислотной
последовательности, подвижности и поверхностному заряду [15]. Показано, что ферритины из
13
разных органов и разных живых систем могут отличаться не только по количеству Н и L
субъединиц, но и по аминокислотной последовательности белковых субъединиц. Причем Н–
субъединицы преобладают в ферритинах тканей миокарда и мозга человека, а L–субъединицы –
в ферритинах тканей печени и селезенки [3]. В этом проявляется гетерогенность ферритина,
обусловленная эволюцией белка. Белковые субъединицы объединяются в 4 спиралевидные
последовательности, из которых образуется полая сфера (см. рисунок 1.2). Внешний и
внутренний диаметр белковой сферы – 12,5 и 8 нм, соответственно. В бактериях обнаружено
три типа ферритинов: бактериальный ферритин, аналогичный ферритину млекопитающих,
бактериоферритин с белковой оболочкой из 24 субъединиц, с которыми связано до 12 гемовых
групп, и ферритин с белковой оболочкой из 12 субъединиц [22, 23]. Механизм, по которому
белковые субъединицы собираются в полые сферы, до конца не изучен. В белковой оболочке
имеется 6 каналов (трехмерные – на стыке трех субъединиц и четырехмерные – на стыке
четырех субъединиц). Ионы железа способны проходить через один из шести каналов белковой
оболочки и аккумулироваться внутри белковой полости. Однако, окончательный механизм
формирования «железного ядра» до сих пор не известен. Первоначально было предложено
несколько
моделей
упаковки
«железного
ядра»,
предполагающие,
что
оно
может
формироваться в форме:1) слоев атомов железа и кислорода, которые по краям окружены
фосфатными группами, 2) монокристаллов и 3) различных поликристаллических структур (см.
рисунок 1.3).
Рисунок 1.1 – Структура макромолекулы ферритина по данным рентгеноструктурного анализа с
увеличенным видом «железного ядра» справа; данные рентгеноструктурного анализа молекулы
ферритина взяты из Protein Data Bank (PDB), PDB код 1MFR.
14
Рисунок 1.2 – Структура организации белковых субъединиц оболочки молекулы ферритина. N
означает N–конец белковой цепи, E – указывает на положение спирали, – трехмерные каналы,
 – четырехмерные каналы [2].
а
б
в
Рисунок 1.3 – Первоначальные представления о вариантах упаковки «железного ядра»
ферритина; а – «лента» из атомов железа и кислорода, ограниченная фосфатными группами, б –
укладка полос FeO(OH) в «ядре», в – варианты структуры «железного ядра» из одного или
нескольких кристаллитов [6].
Гемосидерин менее изучен – до сих пор остается вопрос: является ли он белком,
запасающим железо, или продуктом распада ферритина. Этот белок нерастворим в воде, богат
железом и обнаруживается, главным образом, в местах кровоизлияний, либо при некоторых
заболеваниях (например, гемохроматоз, β-талассемия). Было показано, что «железное ядро»
гемосидерина имеет меньший диаметр по сравнению с ядром ферритина, а оксигидроокись
15
железа имеет модификацию, близкую по структуре к гетиту (α-FeOOH) [13]. Также как и
ферритин, гемосидерин, содержащийся в тканях, обладает гетерогенностью [9, 24], и
морфологически отличается от ферритина [25]. Электронная микроскопия показала, что
средний размер «железных ядер» в ферритине в норме больше, чем в гемосидерине [9, 24, 26].
Сравнение микрофотографий ферритина и гемосидерина приведено на рисунке 1.5.
а
б
20 нм
20 нм
Рисунок 1.5 – микрофотографии ферритина (а) и гемосидерина (б) полученные с помощью
трансмиссионной электронной микроскопии [25].
Роль железа в организме настолько велика, что нарушение его нормального метаболизма
может привести к серьезным последствиям. С одной стороны, при ряде заболеваний
происходит избыточное накопление железа в организме [27–31]. Например, повышенное
содержание железа было обнаружено в тканях головного мозга при нейродегенеративных
заболеваниях:
болезни
Альцгеймера,
Хантингтона,
Паркинсона,
параличи,
нейроферритинопатии (например, [32–37]). При таких молекулярных болезнях, как талассемия,
лимфоидный лейкоз, гемохроматозы и др. в различных тканях был выявлен избыток ферритина,
который как минимум в 2 раза превышал его содержание в норме [38–43]. Для предотвращения
токсичного воздействия свободных ионов железа организм дополнительно синтезирует
молекулы апоферритина, аккумулирующие избыток железа. В этом случае возможна
максимально плотная упаковка «железного ядра» и пересыщение тканей молекулами
ферритина и гемосидерина, что дополнительно приводит к функциональным нарушениям.
Поэтому изучение микроструктурных особенностей «железных ядер» макромолекул ферритина
при различных патологиях представляет особый интерес.
С другой стороны, недостаток железа приводит к железодефицитной анемии. Для
лечения болезней, связанных с дефицитом железа, используются различные железосодержащие
фармацевтические
препараты,
в
частности,
комплексы
железа
с
полисахаридами.
Полисахариды препятствуют гидролизу и растворению железа при нейтральных pH,
16
обеспечивают высокую концентрацию железа в нетоксичной форме. Эффективность
применения таких комплексов, вероятно, связана со схожестью с биологическим аналогом –
макромолекулой ферритина [44, 45]. Комплексы железо-полисахарид также состоят из
«железного ядра», но содержащего оксигидроокись железа в модификации акагенита (βFeOOH), окруженного оболочкой из различных полисахаридов (декстраны, декстрины,
полимальтоза и др.). Поэтому железо-полисахаридные комплексы рассматриваются как
синтетические аналоги белка ферритина.
Первый железо-декстрановый комплекс, синтезированный в 1954 г., был создан по
аналогии с молекулой ферритина, в которой белковая оболочка была заменена декстраном.
Модель структуры такого комплекса была предложена в [46]. В работе [47] была представлена
молекулярная формула железо-декстранового комплекса – фармацевтического препарата
Имферон, и предложена схема макромолекулы из «железного ядра» в форме полиядерного
комплекса оксигидроокиси железадиаметром 3,5 нм, идентичного по структуре акагениту,
окруженного растворимой оболочкой из декстрана толщиной 1 нм (рисунок 1.6). В
дальнейшем,
с
помощью
электронной
микроскопии
было
показано,
что
частицы
оксигидроокиси железа «ядра» железо-декстранового комплекса по внешнему виду и форме
отличаются от ферритина и гемосидерина (см. рисунок 1.7).
Структура и физические свойства «железных ядер» ферритина и его аналогов
исследовалась различными методами, такими как трансмиссионная электронная микроскопия
(TEM),
рентгеноструктурный
анализ,
рентгеновская
дифракция
(XRD),
электронный
парамагнитный резонанс (ЭПР), электронная дифракция и нанодифракция (ED и END),
магнитометрия, EXAFS и мессбауэровская спектроскопия и др.
Рисунок 1.6 – Предполагаемая структура «железного ядра» (а) и схема молекулы железодекстранового комплекса препарата Имферон (б), DхCOOH – декстрановая кислота [47].
17
а
б
в
Рисунок 1.7 – Микрофотографии суспензий железо-декстранового комплекса (а, б), и
железо-полимальтозного комплекса (в) полученные с помощью TEM. Наночастицы вытянутой
формы соответствуют оксигидроокиси железа [48].
В работах [22, 49–56] с помощью рентгеноструктурного анализа была определена
пространственная структура ферритина. Внешний диаметр макромолекулы ферритина весом
~500 кДа составляет ~125 Å, а диаметр внутренней полости составляет ~70 Å. Было показано,
что ферритины из печени и селезенки человека, лошади, собаки, мышей, крыс, хорьков и т.д. –
формируют изоморфные октаэдрические кристаллы белков c кубической симметрией решетки.
Также было показано, что субъединицы, формирующие белковую оболочку, расположены в
симметрии 4 3 2 и состоят из четырех спиралей А, B, C, D, Е, включающих определенные
аминокислотные остатки, а пример пространственной организации белковых субъединиц в
макромолекуле ферритина лягушки, полученной по данным рентгеноструктурного анализа
(PDB код 1MFR), приведен на рисунке 1.1. Симметрия элементарной ячейки оксигидроокиси
железа «железных ядер» зависит как от способа укладки слоев из атомов кислорода, так и от
положения иона металла в промежутках между ними. Как показано на рисунке 1.8, атомы
кислорода могут занимать положения А, В или С. При расположении типа АВАВ образуется
гексагональная плотная упаковка, а АВСАВС... – кубическая решетка. Возможно и более
сложное расположение, например АВАСАВАС..., как в TiO2. Для ферритина Харрисон
предложила простую гексагональную элементарную ячейку оксигидроокиси железа с
параметрами решетки а=2,94 Å и с=9,40 Å [57], в то время как другие исследователи считали,
что эта ячейка имеет параметры решетки а=11,79 Å и с=9,90 Å [58]. Позже похожую ячейку
предложили для продукта гидролиза нитрата железа(III) с параметрами решетки а=5,08 Å и
с=9,40 Å [59], в то же время существовало мнение, что оксигидроокись железа имеет
кубическую решетку с параметром а=4,43 Å [60]. Различные варианты симметрии
элементарной ячейки оксигидроокиси железа обусловлены разной плотностью упаковки слоев
атомов кислорода и расположением железа. Было предложено два вида упаковки «железного
ядра». Согласно первому варианту, «железное ядро» состоит из четырех слоев атомов
кислорода, а железо находится в октаэдрическом и тетраэдрическом окружении [57, 61]. Во
18
втором варианте железо находится только в октаэдрическом окружении (см. рисунок 1.9) [59].
Рисунок 1.8. Изображение одного слоя плотно упакованных атомов кислорода (а) и очертания
двух возможных элементарных ячеек: гексагональной (б) и кубической (в), предложенных для
ядер ферритина. A-C – атомы кислорода [6].
Рисунок 1.9 – модель ферригидрита из четырех слоев атомов кислорода  и атомов железа в
октаэдрических позициях  [59].
Методом рентгеновской дифракции было показано, что рентгенограммы «железных
ядер» многих ферритинов, независимо от того, выделены они из белка или нет, имеют
одинаковую структуру и схожи с ферригидритом [8, 57, 61, 62]. При использовании XRD
высокого разрешения было обнаружено 5 характеристических линий с максимумами для
межплоскостных расстояний d, равных 1,48, 1,72, 1,97, 2,25 и 2,52 Å (см. рисунок 1.10 а, б).
Уширение пиков на рентгенограмме ткани селезенки, приведенной на рисунке 1.10 в,
характерно для аморфной структуры «железных ядер».
19
а
б
в
Рисунок 1.10 – Спектры рентгеновской дифракции «железных ядер» ферритина лошади (а) и
гемосидерина человека (б) [8] и ткани селезенки человека [63]. Максимумы пиков, указанные
вертикальными чертами на шкале, соответствуют ферригидриту.
Впервые кристаллическая структура синтетического акагенита была определена методом
рентгеновской дифракции в [64], и предложена тетрагональная элементарная ячейка
(параметры
кристаллической
решетки
а=10,480 Å
и
с=3,023 Å),
содержащая
8
кристаллографически эквивалентных комплексов FeOOH. Модель элементарной ячейки
аналога макромолекулы ферритина – железо-декстранового комплекса препарата Имферон,
была предложена в работе [65] по данным рентгеновской дифракции (рисунок 1.11 а).
Параметры кристаллической решетки а=10,452(2) Å и с=3,019(1) Å оказались идентичными
обнаруженным ранее для синтетического β-FeOOH. В элементарной ячейке «железного ядра»
препарата Имферон предположено наличие двенадцати связей Fe–O и двух видов Fe–O
октаэдров. Самыми длинными являются связи между следующими атомами: Fe1–O1и Fe2–O3
(см. рисунок 1.11 б). Атомы железа расположены не строго в центре октаэдра, а смещены в
сторону границ элементарной ячейки, что может быть связано скатионным отталкиванием и
водородными связями. Расстояние между атомами О, связанными с Fe1, варьируется от 2,57 до
3,11 Å, а между атомами О, связанными с Fe2, варьируется от 2,63 до 3,37 Å. Таким образом, в
модели элементарной ячейки «железных ядер» препарата Имферон по Kilcoyne [65]
предполагается существование двух кристаллографически неэквивалентных позиций ионов
трехвалентного железа, находящихся в октаэдрическом окружении атомов кислорода (см.
рисунок 1.11 б). Поскольку в природе полиморфная структура β-FeOOH формируется только в
присутствии небольших ионов, например, Cl– или F– [66], то при синтезе фармацевтических
аналогов ферритина из FeCl2 наличие ионов Cl– обуславливает формирование структуры
акагенита. Именно этот факт учитывают некоторые авторы, рассматривая расположение ионов
Cl– в элементарной ячейке, которые, например, могут замещать атомы O3 (см. рисунок 1.12) [47,
67, 68]. Однако, в работе Kilcoyne [65] наличие ионов Cl– в решетке не учитывалось.
20
а
б
2θ (degrees)
Рисунок 1.11 – Рентгенограмма лиофильно высушенного образца препарата Имферон (а) и
модель элементарной ячейки «железного ядра» в железо-декстрановом комплексе (б) [65].
Рисунок 1.12 – Предполагаемая модель кристаллической решетки β-FeOOH в «железных
ядрах» синтетических аналогов ферритина с учетом ионов Cl–;  – атомы железа,  –
кислорода и  – хлора [47].
Исследования других синтетических аналогов макромолекулы ферритина методом
рентгеновской дифракции различными авторами не выявили одинаковой полиморфной
модификации оксигидроокиси железа в этих аналогах. Например, было показано, что
«железное ядро» может находиться в форме, близкой к акагениту в некоторых железополисахаридных комплексах (см. рисунок 1.13) [48, 65, 69–71]. В то же время была получена
оценка значения межатомного расстояния d=2,52 Å для самого интенсивного пика
рентгенограммы комплекса железо-полисахарид, характерная для ферригидрита [72, 73].
Другие авторы рассматривают промежуточную структуру между ферригидритом и акагенитом
[74]. Сравнение значений параметров кристаллической решетки акагенита и синтетических
аналогов ферритина: препаратов Мальтофер® (железо-полимальтоза), Амилофер® (железо-
21
декстрин) и Дексфер® (железо-декстран), приведенное на рисунке 1.14 а и б не обнаружило
существенных отличий, тогда как сравнение расположения атомов кислорода (см. рисунок 1.14
г) показало значимые расхождения, особенно для позиций атомов кислорода О1. Последнее
подтверждает малый размер кристаллитов, формирующих «железное ядро», так как в больших
кристаллах такие искажения происходят реже. Следует отметить, что наблюдаемое уширение
линий рентгенограмм связано с малыми размерами «железных ядер» в ферритине и его
аналогах (см., например, [72]).
акагенит
Железо-сахароза
Железо-полимальтоза
Железо-декстран (Sigma)
Железо-декстран
Рисунок 1.13 – Рентгенограммы оксигидроокисей железа с различными полисахаридами в виде
суспензии, производимых промышленно или фирмой Sigma. Вертикальные черточки-маркеры
указывают положения дифракционных пиков для акагенита [48].
Исследование структуры «железных ядер» методом EXAFS проводилось в работах [76–
81]. При сравнении спектра ферритина со спектром стандартной модели Fe-глицин, было
обнаружено, что при комнатной температуре атом железа находятся в искаженном
октаэдрическом окружении с координационным числом N=6,4±0,6 атомов кислорода на
расстоянии R=1,95±0,02 Å. У каждого атома железа имеется 7 соседних атомов железа, среднее
расстояние между которыми 3,29±0,05 Å [76]. Одинаковые в пределах ошибки данные были
получены в других работах: для атома кислорода N=5,6±0,5, для железа N=6,0±0,05, оценка
расстояния от атома железа до ближайших атомов кислорода составила R=1,95±0,02 Å, а до
ближайших атомов железа – R=3,34±0,02 Å [78, 82]. Оценки значений параметров, полученные
для других значений температур, приведены в таблице 1.1. На основании полученных данных
был сделан вывод, о том, что «железное ядро» состоит из компактных слоев O–Fe–O из
22
близкорасположенных атомов кислорода, между которыми находятся атомы железа.
Взаимодействие между такими слоями является очень слабым. В «железных ядрах»
бактериоферритина было обнаружено 3–4 атома фосфора во второй координационной сфере
атома железа (координационное число 3,4±0,04) на расстоянии 3,17±0,03 Å [80], оценки
значений для кислорода совпадали с полученными ранее в работах [76, 78, 82]. При оценке
значений параметров, полученных для спектров железо-декстранового комплекса Имферон,
также не было выявлено значимых отличий: N=6, R=1,95 для атомов кислорода и N=6, R=3,34
для атомов железа [83].
б
1
2
3
4
5
Номер образца
в
Дробные координаты
Параметр решетки, нм
а
6
г
1
2
3
4
5
6
Номер образца
Рисунок 1.14 – Сравнение параметров кристаллической решетки а (а) и с (б), дробных
координат для позиций железа (в) и двух позиций кислорода (г) для «железных ядер»
препаратов Мальтофер® (1), Дексфер® (2), Амилофер® (3) и акагенита (4) [70], β-FeOOH из
[64] (5) и [75] (6).
Таблица 1.1 – результаты EXAFS для ферритина при различных температурах [76]
R2, Å
N1
R2, Å
σ3,Å2
σ3,Å2
Первая сфера, Кислород
Вторая сфера, Железо
6,4±0,6
1,95±0,02
0,0057±0,0005
7±1
3,29±0,05
0,015±0,003
293
7,4±2,0
1,97±0,03
0,0150±0,0030
10±3
3,35±0,10
0,020±0,008
210
7,4±1,0
1,92±0,02
0,0112±0,0005
11±3
3,36±0,10
0,015±0,005
160
7,1±0,8
1,95±0,02
0,0107±0,0005
7±1
3,38±0,10
0,011±0,003
115
5,8±1,3
1,94±0,03
0,0060±0,0030
10±3
3,35±0,10
0,012±0,005
80
Примечания 1 – координационное число, 2 – среднее значение длины связи, 3 –
среднеквадратичное смещение R относительно среднего значения.
Т, К
N1
23
Несмотря на то, что данные EXAFS для ферритина и препарата Имферон, полученные в
работах [82, 83], оказались близкими, данные электронной дифракции [84] показали
существенные кристаллографические отличия в этих образцах (см. таблицу 1.2). В работе [84]
было показано, что ферригидрит и «железные ядра» ферритина имеют одинаковую структуру,
которая отличается от структуры β-FeOOH и «железного ядра» препарата Имферон, структуры
которых между собой не отличаются. При анализе электронных дифрактограмм различных
ферритинов
было
обнаружено,
что
положение
дифракционных
колец
соответствует
ферригидриту [25, 38]. В макромолекулах гемосидерина c помощью электронной дифракции
было обнаружено три типа «железных ядер»: 1) ферригидрит подобные «железные ядра» в
образцах тканей животных с избыточным содержанием железа и в образцах тканей селезенки
пожилых людей, 2) α-FeOOH-подобные «железные ядра» в тканях печени и селезенки больных
вторичным гемохроматозом и 3) «железные ядра в виде аморфной оксигидроокиси железа в
тканях больных первичным гемохроматозом [24]. В одном из первых обзоров результатов
изучения структуры «железного ядра» в ферритине [10] было показано, что представления о
структуре «ядра» менялись от монокристаллической до поликристаллической.
Таблица 1.2 – Значения межплоскостных расстояний d для ферритина, ферригидрита, βFeOOH, и препарата Имферон по данным электронной дифракции [84].
Имферон
Ферритин
Ферригидрит
β-FeOOH
d
I1
d
I
D
I
d
I
7,46
S
5,25
M
3,30
S
3,30
M
2,61
W
2,54
VS
2,54
VS
2,54
S
2,54
S
2,28
S
2,28
S
2,24
S
2,24
S
2,10
W
1,94
M
1,95
M
1,98
M
1,98
M
1,74
W
1,72
W
1,73
W
1,64
M–S
1,64
M
1,51
S
1,51
S
1,51
W
1,52
M–W
1,49
W
1,47
M
1,47
S
1,47
S
1,45
W
1,45
M
1,38
M–W
1,37
M–W
Примечание – наблюдаемая интенсивность, VS – очень сильная, S – сильная, M –
средняя, W – слабая.
Применение электронной нанодифракции с пучком электронов с энергией 100 кэВ и
диаметром менее 1 нм позволило получить дифрактограммы отдельных «железных ядер». В
работах [37, 85, 86] было предположено, что «железное ядро» ферритина представляет собой
полифазную структуру. На основании полученных результатов авторы сделали вывод, что в
24
большинстве «железных ядер» находятся нанокристаллиты со структурой, близкой к
ферригидриту с двойной гексагональной кристаллической решеткой (см. рисунок 1.15 а, б), а
также
присутствует
небольшое
количество
нанокристаллитов
со
структурой
магнетита/маггемита (Fe3O4/γ-Fe2O3) и гематита (α-Fe2O3) (в количестве не более 1/5) (см.
рисунок 1.15 в, г) и нанокристаллиты с сильно разупорядоченной структурой (в количестве не
более 1/10) (рисунок 1.15 д). Следует отметить, что при применении методов электронной
дифракции и электронной микроскопии с высоким разрешением воздействие пучка электронов
с высоким значением энергии может приводить к изменению структуры образца [87].
Например, может происходить переход от более кристаллического состояния к более
аморфному [88], переход от одной кристаллической фазы к другой [89], термическая
деградация кристалла ферригидрита с образованием окислов железа [90, 91]. Поэтому сложно
установить, относятся ли малые количества Fe3O4/γ-Fe2O3 и α-Fe2O3 к структуре «железного
ядра» или являются следствием воздействия электронного пучка на макромолекулы ферритина.
а
е
б
в
г
ж
з
д
Рисунок 1.15 – Дифрактограммы полученные для плоскости [110] двойной гексагональной
кристаллической решетки «железного ядра» ферритина (а) и кристаллита ферригидрита (б) [92],
для плоскости [2 2 1] (в) и [120] (г) кристаллической решетки «железного ядра» ферритина в форме
гематита [85], «размытая» дифрактограмма «железного ядра» ферритина с высокой степенью
разупорядочения «ядра» (д) и соответствующие расчетные дифрактограммы (е, ж, з) [85].
Исследование ферритина методом ЭПР проводилось в ряде работ (см. например, [5, 62,
93–97]). Типичный ЭПР спектр ферритина, измеренный в Х-диапазоне частот (9,45 ГГц),
состоит из двух основных сигналов от ионов железа ферригидрит-подобного «ядра» (первый
сигнал с эффективным фактором расщепления geff=2, второй сигнал проявляется при
понижении температуры в виде уширенной слабо разрешенной линии спектра) (см. рисунок
25
1.16) [5]. При понижении температуры наблюдается сигнал с geff=4,3, обусловленный ионами
Fe(III), находящимися в ромбоэдрических позициях [95]. Полученные значения geff и
наблюдаемые особенности спектров макромолекул ферритина согласуются с другими
работами, например, [5, 62, 93]. В ЭПР-спектре ферритина селезенки лошади, измеренном в Qдиапазоне частот (34,1 ГГц), наблюдается острый пик сигнала вблизи g=2 (рисунок 1.17).
g=2
а
б
g=2
4К
295К
243К
203К
20К
183К
153К
100К
77К
120К
133К
77К
фон
157К
295К
g=4,3 g=2,1
Рисунок 1.16 – ЭПР спектры ферритина селезенки лошади, измеренные в Х-диапазоне (9,5 ГГц)
в работах [5] (а) и [95] (б).
Рисунок 1.17 – Производная ЭПР-спектра ферритина селезенки лошади, измеренного в Qдиапазоне (34,1 ГГц) при 77 К [5].
В работе [96] были измерены ЭПР-спектры ферритина селезенки лошади при
температурах от 290 до 9 К и получено два характерных пика около g=2 и g=4. Отличие в
интенсивности пиков по сравнению с ЭПР-спектрами, измеренными в работах других авторов
[5, 62, 95, 98], было связано с изменением распределения ионов железа в «железных ядрах»
26
ферритина, присутствием кислорода, содержанием фосфатов, старением. В области температур
около 80 К был обнаружен новый сигнал при g=9, интенсивность которого увеличивалась при
повышении температуры, а расположение смещалось к g=4. Так как форма линии ЭПРспектров зависит от времени релаксации магнитного момента частиц, то можно оценить
суперпарамагнитные свойства этих частиц. Поэтому по зависимости расстояния между двумя
экстремумами ЭПР-линии оттемпературы была проведена оценка суперпарамагнитных свойств
«железных ядер» ферритина. Для расчета магнитных параметров авторами [96] были
использованы две теоретические модели: 1) система состоит из малых невзаимодействующих
частиц, внедренных в диамагнитную матрицу, при этом все частицы обладают одинаковыми
магнитным моментом, константой анизотропии и объемом (модель [99, 100]) и 2) произвольно
ориентированная одноосная система ферромагнитных частиц (модель авторов [101]). Оценки
магнитных параметров, полученные в первой модели составили 2K/M = 2,7×103 Э и
MV = 1,9×10–17 эме, во второй модели – K/M = 1,3×103 Э и MV = 2,0×10–17 эме, где K –
константа магнитной анизотропии, M – намагниченность, V – объем суперпарамагнитного
«железного ядра». Рассмотрение ЭПР-спектра ферритина в упрощенном виде как композиции
из двух компонент: изотропной, возникающей благодаря неблокированным малым частицам
(температура выше блокирующей TB), и анизотропной, возникающей из-за блокированной
магнитной фазы (температура ниже TB), позволило оценить TB по температурной зависимости
относительных долей этих компонент. При этом TB оценивалась как температура, при которой
доля магнитной компоненты F составляет 0,5 согласно [102, 103]. Согласно этому подходу
авторы работы [96] получили значение TB=116±9 К, а также по температуре исчезновения
сигнала ЭПР оценили температуру магнитного упорядочения для поверхностного более
аморфного слоя «железных ядер» Tord=14±5 K (это происходит вследствие нулевого
суммарного магнитного момента, обусловленного антиферромагнитным упорядочением при
данной температуре). Следует отметить, что по спектрам ЭПР не удалось отличить между
собой макромолекулы различных ферритинов и гемосидеринов [62], а также ферритины
селезенки лошади с различным содержанием железа [95].
Pan и соавторы по результатам изображений кольцевого темного поля при больших
углах, полученных с помощью сканирующей трансмиссионной электронной микроскопии
(HAADF
STEM),
и
результатам
спектроскопии
потерь
энергии
электронов
(EEL)
модифицировали модель макромолекулы ферритина [104], предложенную ранее Levin и
соавторами по данным EXAFS, рентгеноструктурного анализа, ЭПР и рамановской
спектроскопии
в работе [16],
которая
учитывала процессы
накопления железа.
В
модифицированной модели [104] предполагается, что «железное ядро» ферритина имеет
поликристаллическую структуру и состоит из 8 субъединиц из ферригидрита размером ~2 нм с
27
разупорядоченной поверхностью, которые находятся вблизи каналов накопления и отдачи
ионов железа в белковой оболочке (см. рисунок 1.18). Однако, авторам не удалось установить
взаимосвязь кристаллографической ориентации ферригидритных субъединиц между собой.
Также данная модель не учитывает магнитных свойств «железных ядер» макромолекул
ферритина.
а
б
– Fe(III), связанные с О или ОН
– Fe(III) в структуре ферригидрита
– субъединицы белковой оболочки
Рисунок 1.18 – Пример изображения «железного ядра» макромолекулы ферритина,
полученного методом HAADF (а) и модель структуры «железного ядра» из восьми
ферригидритных субъединиц (показано только четыре субъединицы) (б) [104].
При исследовании магнитных свойств макромолекул ферритина были определены
значения температуры блокирования по температурной зависимости намагниченности при
охлаждении в нулевом поле (ZFC) и в поле (FC) (см., например, рисунок 1.19). Так как
«железные ядра» ферритина обладают разным размером, имеется разброс по энергии
анизотропии и, как следствие, диапазон значений TB. Поэтому максимум кривой ZFC
соответствует среднему значению TB=12 К, а точка бифуркации кривых ZFC и FC
соответствует максимальной величине ТB=20 К, характерной для самых крупных частиц [105].
Данные, полученные для среднего значения ТB в работе [105] согласуются с данными,
полученными другими авторами для ферритина селезенки лошади, где среднее значение
температуры блокирования, определенное по температурным зависимостям ZFC и FC,
варьируется от 11 до 15 К [97, 103, 106].
Особенностью
«железных
ядер» макромолекул
ферритина является
отсутствие
магнитного момента насыщения при изотермическом измерении магнитной восприимчивости,
что объясняется вкладом дополнительной компоненты, имеющей характер линейной
зависимости магнитного момента от поля (см., например, рисунок 1.20 а) [107–114].
28
Рисунок 1.19 – Температурные зависимости намагниченности ZFC и FC в поле Н=50 Э [105].
а
б
Рисунок 1.20 – Зависимость намагниченности «железных ядер» ферритина от значения
магнитного поля при различных температурах (а) и параметры, полученные при аппроксимации
этой зависимости (б).  – µs – суперпарамагнитный момент в магнетонах Бора,  – Np/N – доля
парамагнитных ионов железа, подчиняющихся закону Кюри [110].
В работе [115] авторы предположили, что дополнительная линейная компонента
появляется из-за того, что в «железном ядре» доминирует антиферромагнитное упорядочение с
неполной компенсацией спинов двух подрешеток, вследствие которой возникает остаточный
магнитный момент. В работах [105, 109] было предположено суперантиферромагнитное
упорядочение «железного ядра», для которого собственная магнитная восприимчивость χ
значительно больше, вследствие чего возникает дополнительная линейная компонента χН,
незначительно меняющаяся при изменении температуры. Согласно этому подходу, описание
29
зависимости магнитного момента от поля для «железного ядра» являлась модифицированная
модель Ланжевена:
M ( M S , µ, χ) = M s [coth(µΗ k BT ) − k BT µΗ ] + χΗ ,
(1)
где МS – намагниченность насыщения, µ – среднее значение магнитного момента наночастицы
и χ – линейная магнитная восприимчивость. Gilles и соавторы [116] предположили модель
случайной ориентации магнитных моментов «железного ядра», которая учитывает флуктуации
спинов между антипараллельными направлениями вдоль антиферромагнитной оси:
 π

M ( M S , µ(T ), χ) = M S  0,5∫ sin θ cos θ tanh{[µ(T )Η k BT ]cos θ}dθ  + χΗ
,
 0

(2)
где µ(Т) – магнитный момент от нескомпенсированных спинов в каждом ядре, θ – угол между
случайной ориентацией антиферромагнитной оси и направлением поля. Следует отметить, что
оба подхода предполагают, что «железное ядро» ферритина состоит из одной фазы.
В другой модели авторами [117] была учтена кристаллическая анизотропия путем
добавления компоненты второго порядка χН2 в уравнение модифицированной модели
Ланжевена (1). Компонента χН2 была введена для учета предполагаемого авторами присутствия
наночастиц γ-Fe2O3 в «железных ядрах» ферритина. В работе [118] была предложена модель на
основании суммирования простых функций Ланжевена для антиферромагнитных частиц
«железного ядра» и для ферримагнитных наночастиц магнетита/маггемита:
M ( M S 1 , µ1 , χ) = M S 1 [coth (µ1Η k BT ) − k BT µ1Η ] + χΗ + M S 2 [coth (µ 2 Η k BT ) − k BT µ 2 Η ] ,
(3)
где µ1 – среднее значение магнитного момента «железного ядра» из ферригидрита
5Fe2O3×9H2O, МS1 – намагниченность насыщения ферригидрита, µ2 – среднее значение
магнитного момента «железного ядра», содержащего магнитные фазы Fe3O4/γ-Fe2O3и МS2 –
намагниченность насыщения Fe3O4/γ-Fe2O3.
В работе [110] авторы предположили, что появление линейной компоненты и отсутствие
насыщения на кривых намагниченности являются следствием наличия парамагнитной
компоненты (см. рисунок 1.20 б). Согласно этой гипотезе была предложена двухфазная модель
магнитной структуры «железного ядра», названная «core-shell». В этой модели предполагается,
что «железное ядро» состоит из двух областей: внутреннее антиферромагнитное «ядро» с
30
высокой степенью кристалличности и температурой Нееля TN > 310 К и поверхностная
аморфная оболочка с более низким значением TN, в которой силы обменного взаимодействия
недостаточно сильны для поддержания антиферромагнитного упорядочения (рисунок 1.21 а).
Таким образом, предполагается, что внешняя и внутренняя области «железного ядра» имеют
разные значения магнитного момента, а само «железное ядро» представляет собой двухфазную
систему спинов. Последняя может быть наглядно представлена при малом содержании железа в
молекуле ферритине, так как в этом случае увеличивается соотношение поверхность/объем для
«железного ядра». В работе [119] на основании новой модели аппроксимации кривых
намагниченности «железных ядер» ферритина селезенки лошади авторы предположили
трехфазную модель «железного ядра», которое состоит из 60–80 % ферригидрита, 15–25 %
маггемита, 1–10 % гематита. Ранее трехфазная модель была предположена авторами работы
[120] (см. рисунок 1.21 б).
Белковая
оболочка
Магнетит
Аморфный
поверхностный слой
Белковая
оболочка
a
б
в
µs
Ферригидрит
Магнитоупорядоченное ядро
Гематит
Области сильной анизотропии
Рисунок 1.21 – Модели структуры «железного ядра», предполагаемые по результатам
магнитных измерений: «core-shell» модель [110] (а), модель трехфазного «железного ядра»
[120] (б) и мультидоменная модель [124] (в).
При исследовании кривых намагниченности для комплекса железо-полисахарид был
обнаружен тот же характер зависимости магнитного момента от поля, что и для ферритина, как
показано на рисунке 1.22 (см., например, [121–123]). В этой зависимости авторы [121]
выделили четыре области: 1) H ≤ 5 кЭ, Т < ТВ – вклад в общую намагниченность определяется
суперантиферромагнитной (обусловлена большими частицами, которые вносят самый большой
вклад при низких значениях поля), суперпарамагнитной и антиферромагнитной компонентами
намагниченности;
антиферромагнитной
2)
H ≤ 5 кЭ,
компонент
Т > ТB – суперпозиция
намагниченности;
3)
суперпарамагнитной
H > 20 кЭ,
Т < ТВ –
вклад
и
в
31
намагниченность вносят те же компоненты, что и в первой области, однако, доминирует
суперпарамагнитная компонента намагниченности; 4) H > 20 кЭ, Т > ТВ – аналогична второй
области, отличие в том, что при повышении температуры магнитный момент достигает
насыщения при более низких значениях поля. На основании полученных данных авторы [121]
сделали предположение о гетерогенной структуре «железных ядер», в которой степень
кристалличности меняется от более высокой к более низкой при переходе от внутренних
областей «железного ядра» к внешним, а также о существовании доменов, отличающихся
размерами и плотностью, и дефектов, которые, вероятно, расположены ближе к поверхностным
слоям «ядра». Модель структуры «железного ядра» ферритина, которое состоит из различных
МОМЕНТ, эме/г
нанокристаллических доменов была предположена в работе [124] (рисунок 1.21 в).
ПОЛЕ, кЭ
Рисунок 1.22 – Зависимость магнитного момента от поля для железо-полисахаридного
косплекса [121].
1.2 Мессбауэровская спектроскопия наноразмерных «железных ядер» макромолекул
ферритина и его аналогов
Мессбауэровская
спектроскопия
является
уникальным
физическим
методом
исследования вещества, основанном на явлении ядерного γ-резонанса (эффект Мессбауэра).
Описание этого явления и основанного на нем метода спектроскопии подробно описано в
32
целом ряде работ (см., например, [125–130]). Мессбауэровская спектроскопия на ядрах
57
Fe с
успехом применяется в различных областях науки, например, в физике конденсированного
состояния, химии, биофизике, физике металлов и многих других [130–145]. Исследования
макромолекул ферритина и его аналогов методом месбауэровской спектроскопии проводятся
уже около пятидесяти лет. За это время накоплен большой экспериментальный опыт изучения
как выделенных железодепонирующих белков, так и тканей их содержащих, а также
макромолекул
различных
железо-полисахаридных
комплексов,
являющихся
аналогами
ферритина (см., например, [137, 145–149]). Поэтому далее будут рассмотрены основные
результаты изучения ферритина и его моделей методом мессбауэровской спектроскопии,
которые имеют наиболее близкое отношение к исследованиям, проведенным в данной работе.
1.2.1 Суперпарамагнитная релаксация (поведение) и другие особенности мессбауэровских
спектров ферритина и его аналогов
«Железные ядра» ферритина, как и любые полиморфные модификации оксигидроокиси
железа, являются антиферромагнетиками. Температура Нееля для ферригидрита и ферритина
составляет около 295 К [66, 150]. Однако, для ферритина, как и для других наночастиц оксидов
и оксигидроксидов железа, характерно явление суперпарамагнетизма (см., например, [151–
159]), которое заключается в следующем. При уменьшении размеров однодоменных
наночастиц и при сохранении спонтанной намагниченности тепловые флуктуации направления
магнитного момента частицы сохраняются при более низких температурах. Такой тип
броуновского вращения магнитного момента был обнаружен Неелем [151], а поведение частиц
с флуктуациями магнитного момента ниже температуры фазового перехода было названо
суперпарамагнитным [152]. Намагниченность однодоменных частиц меняется с изменением
температуры. При низких температурах магнитный момент стремится ориентироваться вдоль
оси легкого намагничивания, определяемой магнитной анизотропией частицы. Такое
положение, когда направление магнитного момента фиксировано вдоль оси легкого
намагничивания, является наиболее энергетически выгодным (блокированное состояние).
Повышение температуры вызывает флуктуации направления магнитного момента относительно
его энергетически выгодной ориентации. Если тепловая энергия kT (где k – постоянная
Больцмана, Т – температура), позволяет флуктуирующему магнитному моменту преодолеть
энергетический барьер KV (где K – константа магнитной анизотропии, V – объем частицы)
между противоположными ориентациями магнитного момента, то система переходит в
парамагнитное состояние. Экспериментальное наблюдение суперпарамагнитного поведения
частиц возможно в том случае, если характеристическое время измерения будет меньше, чем
33
время релаксации (прецессии) магнитного момента частиц при данной температуре. В
мессбауэровской
спектроскопии
на
определяется временем жизни ядра
57
ядрах
57
Fe
характеристическое
время
измерения
Fe в возбужденном состоянии, которое равно 1,4×10–7 с.
Поэтому, если ниже температуры магнитного фазового перехода время релаксации магнитного
момента частицы больше времени жизни ядра
57
Fe в возбужденном состоянии, то в
мессбауэровской спектроскопии наблюдается явление суперпарамагнетизма. Оно проявляется в
виде парамагнитного спектра в форме синглета или дублета вместо магнитного секстета. Если
при более низкой температуре время релаксации магнитного момента становится меньше
времени жизни ядра
57
Fe в возбужденном состоянии, то в спектре наблюдается магнитный
секстет. При низких температурах, когда магнитные моменты блокированы, в мессбауэровском
спектре наблюдается только магнитная компонента (секстет). В случае, если имеется
распределение частиц или магнитных доменов по размерам/объемам, то существует
промежуточная область температур ниже температуры фазового перехода, при которой в
мессбауэровском спектре наблюдается суперпозиция магнитной и парамагнитной компонент
(см. рисунок 1.23). Чем меньше размер частицы, тем ниже температура, при которой
наблюдается суперпозиция магнитной и парамагнитной компонент в спектре. Если определить
температуру,
при
которой
площади
магнитной
и
парамагнитной
компонент
равны
(блокирующую температуру), можно оценить объем частицы по формуле:
τ = τ0 exp( KV / kTB ) ,
(4)
где ТB – блокирующая температура, τ – время суперпарамагнитной релаксации, τ0 –
характеристическое время суперпарамагнитной релаксации данного материала (~10–10–10–12 c).
На основании вышеизложенного было показано, что «железные ядра» макромолекул
ферритина в норме из различных тканей, а также из различных живых систем обладают
различной температурой блокирования и, соответственно, разным объемом «железных ядер».
По результатам измерения мессбауэровских спектров различных ферритинов оценки
температуры блокирования для наноразмерных «железных ядер» составили: для ферритина
селезенки человека от 16 до 40 К [98, 160–162], для ферритина селезенки лошади – ~32 К [24,
162], для ферритина улитки – 25–30 К [160], для бактериоферритина – 3–8 К [80, 160], для
гемосидерина селезенки человека в норме средняя температура блокирования составила ~80 К
[160]. При пересыщении организма железом в результате многократных переливаний крови для
гемосидерина печени и селезенки человека были получены величины TB = 60–70 К (авторы
предположили
гетит-подобные
«железные
ядра»)
и
при
первичном
идиопатическом
гемохроматозе – TB = 1–10 К (авторы предположили, что «железные ядра» представляют собой
34
аморфную оксигидроокись железа) [24]. Эти результаты свидетельствуют о том, что в
различных макромолекулах ферритинов и гемосидеринов, а также в макромолекулах
железодепонирующих белков в норме и при молекулярных болезнях может содержаться разное
число атомов железа, что будет влиять на структуру «железного ядра».
а
д
в
б
е
ж
г
з
Рисунок 1.23 – Мессбауэровские спектры гемосидерина (а) и ферритина (б) печени мышей [9];
гемосидерина из почек (в) и ферритина из печени миноги (г) [163]; ферритина, выделенного из
селезенки человека (д) и ферритина улитки (е) [160]; ферритина, выделенного из селезенки
человека (ж) и лошади (з) [63].
Мессбауэровские спектры синтетических аналогов макромолекулы ферритина (см.,
например, рисунок 1.24) также демонстрируют проявление суперпарамагнитного поведения
наноразмерных «железных ядер» [65, 68–70, 72, 83, 122, 157, 164–171]. Для «железных ядер»
35
некоторых синтетических аналогов ферритина были получены следующие оценки температуры
блокирования: TB ~ 60 К для железо-декстранового комплекса [122], TB ~ 55 для комплекса
железо-сахароза и TB ~ 65 К для железо-полимальтозного комплекса [70]. Также были
выявлены отличия в суперпарамагнитном поведении «железных ядер» промышленно
производимых фармацевтических аналогов ферритина одного типа, изготовленных разными
производителями (см., например, рисунок 1.25) [69]. Полученные результаты свидетельствуют
о том, что структура «железных ядер» синтетических аналогов ферритина одного типа может
зависеть от способа их приготовления. Также можно сделать вывод о том, что «железные ядра»
синтетических аналогов имеют больший объем по сравнению с «железными ядрами»
ПРОПУСКАНИЕ, %
ферритина.
в
б
СКОРОСТЬ, мм/с
СКОРОСТЬ, мм/с
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 1.24 – Мессбауэровские спектры фармацевтических препаратов – аналогов ферритина,
измеренные при различных температурах и аппроксимированные различным числом
компонент: Мальтофер®, железо-полимальтозный комплекс (a), Дексфер®, железодекстрановый комплекс (б), и Амилофер®, железо-декстриновый комплекс (в) [70].
36
№1
100 К
№2
100 К
№3
100 К
№1
77 К
№2
77 К
№3
77 К
Рисунок 1.25 – Мессбауэровские спектры железо-декстрановых комплексов, произведенных
разными производителями № 1, № 2 и № 3 [69].
Другой особенностью мессбауэровских спектров наночастиц оксидов и оксигидроксидов
железа, как для парамагнитного (дублет), так и для магнитного (секстет) состояния, является
нелоренцевая форма линии [150, 172]. Поэтому наилучшая аппроксимация спектров этих
объектов в парамагнитном состоянии достигалась суперпозицией двух-трех квадрупольных
дублетов либо распределением квадрупольного расщепления, а в магнитном состоянии –
соответственно суперпозицией магнитных секстетов либо распределением магнитного
сверхтонкого поля. Например, при исследовании ферритина как выделенного из плацентарной
мембраны, так и в ней для аппроксимации мессбауэровских спектров, измеренных при 77 К (см.
рисунок 1.26), была использована суперпозиция двух квадрупольных дублетов [173]. Авторы не
соотносили эти компоненты с двумя кардинально различающимися положениями атомов
железа, но предположили, что различие между индивидуальными позициями атомов железа
таково, что мессбауэровский спектр не может быть удовлетворительно аппроксимирован одной
компонентой.
В работах Bauminger и соавторов [11, 174] были исследованы ферритин человека с
повышенным содержанием H-субъединиц в белковой оболочке и ферритин бактерий. Авторы
аппроксимировали измеренные при 90 К мессбауэровские спектры ферритина человека
суперпозицией трех квадрупольных дублетов и суперпозицией двух квадрупольных дублетов –
спектры ферритина бактерий (см. рисунок 1.27). Авторы связали разное число компонент в
37
спектрах с возможным наличием кластеров и димеров Fe(III) в «железном ядре» ферритина
человека и только димеров Fe(III) в «железном ядре» ферритина бактерий. В работе [175]
мессбауэровские спектры лиофильно высушенного ферритина селезенки лошади были
аппроксимированы на основе «core-shell» модели суперпозицией двух компонент: при 80 К –
двумя квадрупольными дублетами, при 4,2 К – двумя магнитными секстетами (рисунок 1.28 а).
Одна из компонент в такой аппроксимации соотносилась авторами с внутренней областью
«железного ядра», имеющей структуру с большей степенью кристалличности, а вторая
компонента – с внешней более аморфной поверхностью «железного ядра». Такая же
интерпретация результатов аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина селезенки
человека (см. рисунок 1.28 б) была предположена авторами в работе [176].
Мембрана
Ферритин
Рисунок 1.26 – Мессбауэровские спектры плацентарной плазматической мембраны и
выделенного из нее ферритина, измеренные при 77 К [173].
Мессбауэровские
спектры
синтетических
аналогов
ферритина
в
ряде
работ
аппроксимировались суперпозицией двух компонент (двух дублетов при высоких температурах
и двух секстетов при низких), как показано, например, на рисунке 1.29 [72, 65, 167, 170]. В
работе [65] эти компоненты были связаны с двумя неэквивалентными позициями ионов железа
в элементарной ячейке «железного ядра», наличие которых было предположено на основании
данных рентгеновской дифракции.
38
Рисунок 1.27 – Мессбауэровские спектры H-ферритина человека (a) [11] и ферритина бактерий
Escherichia coli (б) [174]. Компонента 1 соответствует кластерам Fe(III), компоненты 2 и 3 –
димерам Fe(III).
а
VELOCITY, mm/s
б
VELOCITY, mm/s
Рисунок 1.28 – Мессбауэровские спектры лиофильно высушенных образцов ферритина
селезенки лошади [158] (а) и человека [175] (б), аппроксимированные суперпозицией двух
компонент на основании «core-shell» модели.
300 K
ABSORPTION
ABSORPTION
39
5K
VELOCITY, mm/s
VELOCITY, mm/s
Рисунок 1.29 – Мессбауэровские спектры лиофильно высушенного железо-декстранового
комплекса, измеренные при разных температурах и аппроксимированные суперпозицией двух
компонент [65].
Несмотря
на
то,
что
аппроксимация
мессбауэровских
спектров
двумя-тремя
компонентами дает лучшие результаты по сравнению с аппроксимацией одной компонентой,
многие авторы используют или указывают на возможность использования большего числа
компонент при описании нелоренцевой формы линии спектров ферритинов и их аналогов (см.,
например, [63, 70, 72, 170]). Например, аппроксимация спектров синтетических аналогов
ферритина в работе [70] была проведена с использованием суперпозиции двух квадрупольных
дублетов при 295 К, трех магнитных секстетов при 4,2 К и нескольких магнитных секстетов
(>3) и квадрупольных дублетов в промежуточном диапазоне температур (см. рисунок 1.24).
Авторы
указывали
на
возможность
использования
большего
числа
компонент
при
аппроксимации спектров, однако такой подход не соответствовал ранее существовавшим
моделям «железного ядра», и, кроме этого, по собственной оценке авторов, качество
измеренных ими спектров не позволило использовать большее количество компонент. Oshtrakh
и соавторы для аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина печени человека и его
аналога – препарата Имферон, измеренных при 295 К с высоким скоростным разрешением,
использовали суперпозицию четырех и трех квадрупольных дублетов, соответственно (рисунок
1.30) [177–179]. На основании полученных результатов авторы предположили, что «железное
ядро» ферритина состоит как минимум из четырех, а «ядро» препарата Имферон – из трех
различных областей, которые могут быть представлены различными внутренними и внешними
слоями и/или кристаллитами с небольшими структурными отличиями. В работе [63] авторы
аппроксимировали мессбауэровские спектры селезенки человека и селезенки лошади тремя
квадрупольными дублетами при 300 К. При 5 К мессбауэровский спектр селезенки человека
был аппроксимирован суперпозицией трех секстетов и одного дублета, а мессбауэровский
спектр селезенки лошади – суперпозицией четырех секстетов и одного дублета (см. рисунок
40
1.31). Полученные компоненты авторы связали с полифазностью «железных ядер» ферритина и
наличием в них ферригидрита, гематита и маггемита/магнетита, которые представляют собой
небольшие зерна (размером 4–5 нм) с сильно разупорядоченной структурой.
а
б
Рисунок 1.30 – Мессбауэровские спектры препарата Имферон (а) и ферритина печени
человека (б), измеренные при 295 К [178].
1
2
3
4
1
2
2
3
Человек
300 K
1
2
1
3
Человек
5K
Лошадь
300 K
3
5
4
Лошадь
5K
Рисунок 1.31 – Мессбауэровские спектры селезенки человека и селезенки, измеренные при
различных температурах и аппроксимированные суперпозицией нескольких компонент: 1 –
гематит, 2 – ферригидритное «ядро», 3 – мелкие частицы Fe(III), 4 – ферригидрит
(поверхностная область «ядра»), 5 – маггемит/магнетит (поверхностная область «ядра») [63].
Таким образом, можно отметить два подхода к аппроксимации мессбауэровских
спектров наночастиц оксигидроокиси железа. Первый, грубый подход, заключается в
аппроксимации одним квадрупольным дублетом при высоких температурах либо одним
магнитным секстетом при низких температурах и предполагает гомогенность структуры этих
наночастиц. Второй подход заключается в аппроксимации спектров суперпозицией двух и
41
более компонент либо с использованием функции распределения и учитывает гетерогенность
структуры наночастиц (наличие кластеров, различных областей или неэквивалентных позиций
ионов Fe+3). Вторая модель позволяет существенно лучше учитывать особенности формы линии
мессбауэровских спектров ферритинов и их аналогов. Тем не менее, в целом ряде работ
допускается использование обоих подходов для грубой и более точной аппроксимации
мессбауэровских
спектров,
что
может
позволить
проводить
сравнение
результатов
аппроксимации по схожим моделям.
1.2.2
Параметры
сверхтонкой
структуры
57
ядер
Fe
выделенных
макромолекул
железодепонирующих белков
Мессбауэровская спектроскопия является одним из наиболее чувствительных методов к
изменению параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe (~10–9 эВ). Поэтому с помощью
мессбауэровской спектроскопии можно выявлять отличия в изменении плотности s-электронов,
градиента электрического поля и эффективного магнитного поля на ядре
57
Fe. Например, по
изменению величины квадрупольного расщепления (градиента электрического поля) можно
судить об изменении электронной структуры иона железа, определяемого изменением энергии
основного
и
низколежащих
возбужденных
электронных
термов.
В
свою
очередь,
энергетический спектр электронных термов определяется структурой локального окружения
иона железа, а его изменение может быть связано с малыми изменениями в структуре
локального окружения. Поэтому сравнение параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe для
различных макромолекул ферритина и его аналогов позволяет получить информацию о
возможных микроструктурных отличиях локального окружения ионов железа в «железных
ядрах».
В сравнительном исследовании ферритинов селезенки человека, моллюсков и бактерий
мессбауэровские спектры этих образцов были аппроксимированы одним квадрупольным
дублетом при 78 К со значениями изомерного сдвига (δ) и квадрупольного расщепления (∆ЕQ),
характерными для оксигидроокиси железа [160]. Полученные значения параметров при 78 К
для ферритина селезенки лошади составили δ=0,47±0,02 мм/с и ∆ЕQ=0,69±0,02 мм/с, для
ферритина моллюска – δ=0,48±0,02 мм/с и ∆ЕQ=0,75±0,02 мм/с, для бактериального ферритина
– δ=0,51±0,02 мм/с и ∆ЕQ=0,70±0,02 мм/с. Небольшие отличия в значениях сверхтонких
параметров (см. рисунок 1.32), а также различия в значения Тord авторы связывали с разной
плотностью упаковки атомов Fe и разным составом «железных ядер» макромолекул ферритина.
Различия в значениях ТВ были связаны с разным количеством атомов Fe в «железных ядрах», а
также с более высокой степенью кристалличности «железных ядер» ферритина селезенки
42
человека. При Т=1,3 К спектры всех образцов были аппроксимированы одним магнитным
секстетом, причем значение магнитного поля в мессбауэровском спектре бактериального
ферритина было существенно меньше, чем в двух других образцах. Авторы предположили
отличие в значениях магнитного момента «железных ядер» этих образцов. При повышении
температуры от 10 К мессбауэровский спектр ферритина селезенки человека представлял собой
суперпозицию секстета и дублета, и интенсивность последнего возрастала с увеличением
температуры, а интенсивность секстета наоборот уменьшалась. При этом, значения магнитного
сверхтонкого поля в промежуточном диапазоне температур менялось незначительно: от Н=49,4
Т при Т=1,3 К до Н=47,2 Т при Т=50 К (см. рисунок 1.33). Также было обнаружено увеличение
ширины линии магнитной компоненты при повышении температуры. В случае бактериального
ферритина значения магнитного сверхтонкого поля начинают уменьшаться, а ширина линии
магнитной компоненты существенно возрастать при Т > 2,6 К. При Т=4,2 К магнитная
компонента полностью исчезает, а спектр представляет собой уширенный квадрупольный
дублет. В мессбауэровском спектре моллюска доля магнитной компоненты начинает
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
уменьшаться при Т=4,2 К с 94 % до 82 % при Т=15 К.
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 1.32 – Отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
ферритина, полученных в работе [160] для печени человека (), моллюска (), бактериального
ферритина () [179]).
Исследование ферритина, приготовленного из апоферритина селезенки лошади при
различной температуре и содержащего от 20 до 1100 атомов железа на молекулу, было
проведено в работе [180]. Поскольку мессбауэровские спектры образцов, измеренные при 295
К,
представляли
собой
уширенный
квадрупольный
дублет,
авторам
не
удалось
аппроксимировать их одной компонентой с лоренцевой формой линии, поэтому они
использовали аппроксимацию линий поглощения гауссовым распределением линий лоренцевой
43
формы. Авторы заявили, что обнаружили отличия значений квадрупольного расщепления
мессбауэровских спектров образцов, приготовленных при 25 °С и 50 °С, а также небольшое
увеличение значений центрального сдвига мессбауэровских спектров при увеличении размера
«железных ядер» (см. рисунок 1.34). На основании полученных данных авторы предположили,
что
«железные
ядра»
восстановленного
ферритина
обладают
высокой
степенью
неупорядоченности и низкой степенью плотности упаковки атомов по сравнению с «железными
ядрами» нативного ферритина селезенки лошади. Однако, если принять во внимание значение
инструментальной ошибки для оценки параметров сверхтонкой структуры, то все эти значения
Человек
Моллюск
Бактерии
ШИРИНА ЛИНИИ, мм/с
МАГНИТНОЕ
СВЕРХТОНКОЕ ПОЛЕ, Т
будут одинаковы в пределах ошибки.
Бактерии
Моллюск
Человек
ТЕМПЕРАТУРА, К
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 1.33 – Температурные зависимости значений магнитного сверхтонкого поля и ширин
линий компонент мессбауэровских спектров ферритина, выделенного из селезенки человека,
 – 25 °С
 – 50 °С
КВАДРУПОЛЬНОЕ
РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
ЦЕНТРАЛЬНЫЙ СДВИГ, мм/с
моллюска и бактерий [160].
 – 25 °С
 – 50 °С
КОЛИЧЕСТВО АТОМОВ Fe
КОЛИЧЕСТВО АТОМОВ Fe
Рисунок 1.34 – Оценки средних значений центрального сдвига и квадрупольного расщепления
для различного количества атомов Fe в молекуле ферритина, приготовленного при 25 °С и
50 °С [180].
44
В
сравнительном
мессбауэровские
спектры,
исследовании
измеренные
ферритина
при
селезенки
300 К,
были
человека
и
лошади
аппроксимированы
двумя
квадрупольными дублетами [162]. Один из квадрупольных дублетов площадью 84 % в спектре
ферритина человека и 74 % в спектре ферритина лошади авторы сопоставили с ферригидритподобными «железными ядрами» ферритина и гемосидерина. Средневзвешенные оценки
параметров сверхтонкой структуры и относительных площадей компонент мессбауэровских
спектров этих образцов, полученные с помощью функции распределения, оказались
различными
(см.
рисунок
1.35).
На
основании
полученных
данных
об
отличиях
средневзвешенныхзначений квадрупольного расщепления авторы предположили структурные
отличия «железных ядер» ферритина селезенки человека и лошади. Однако, маловероятно, что
средние
значения
мессбауэровских
параметров,
получаемых
с
помощью
функции
распределения, могут характеризовать реальную гетерогенную структуру «железного ядра».
а
б
в
Рисунок 1.35 – Температурные зависимости средневзвешенных значений квадрупольного
расщепления (а), магнитного сверхтонкого поля (б) и относительной площади магнитной
компоненты (в) мессбауэровских спектров ферритина селезенки человека () и лошади () [162].
Значения сверхтонких параметров выделенных ферритинов и гемосидеринов в норме,
полученные различными авторами, приведены в таблице 1.3. Следует отметить, что, к
сожалению, большинство авторов приводит лишь значения расчетной ошибки для параметров
спектров, в то время как инструментальная ошибка для этих параметров может оказаться
существенно больше.
45
Таблица 1.3 – Значения параметров мессбауэровских спектров выделенных ферритинов
(Ф) и гемосидеринов (Г) в норме.
Образец
Т, К N1
S, %
δ, мм/c
∆EQ/ε2, мм/с B, Т
Γ, мм/с
Человек
3
Ф плацентарный
293 1
0,32±0,02
0,32±0,02
2
0,37±0,02
0,77±0,02
77 1
0,46±0,02
0,41±0,02
2
0,48±0,02
0,90±0,02
4
Ф селезенки
78 1
0,47±0,02
0,69±0,02
Ф печени5
78 1
0,46
0,73
6
Ф селезенки
295 1
0,36±0,01
0,68±0,01
Ф печени7
295 1
0,373±0,010
0,446±0,010
0,319±0,020
36
2
0,366±0,010
0,682±0,010
0,300±0,020
34
3
0,365±0,010
0,972±0,010
0,308±0,020
22
4
0,370±0,010
1,317±0,010
0,331±0,020
8
Другие животные
Ф моллюска4
78 1
0,48±0,02
0,75±0,02
8
Fe(III)-апоферритин
90 1
0,48
0,78
Ф селезенка лошади8 90 1
0,46
0,70
Фселезенки лошади
90 1
0,49±0,01
0,70±0,02
0,44±0,02
480 Fe в молекуле9
«железные ядра» из
90
0,48±0,01
0,66±0,01
0,32±0,01
Ф селезенки
лошади9
Ф взрослого
78 1
0,42
0,72
0,63
100
10
моллюска
15 1
0,10
0,57
0,43
13
2
0,47
0,09
46,9
1,53
87
Г взрослого
78 1
0,24
0,42
0,72
100
моллюска10
12 1
0,14
0,47
0,48
59
2
0,38
–0,19
48,4
0,78
41
Ф печени дюгоня5 1
78
0,44
0,77
Ф печени дюгоня5 2
0,44
0,74
Ф печени дюгоня5 3
0,45
0,76
Бактерии
Ф4 Бактериальный
78
0,51±0,02
0,70±0,02
11
Бактерио-Ф
4,2
0,52±0,01
0,61
12
Бактерио-Ф
80 1
0,48±0,05
0,78±0,05
4,2 1
0,45±0,05
49,0
13
Бактерио-Ф
5,5 1
0,49
0,80
0,70
13
2
23
74
3,7 1
0,49
–0,08
42,4
2,22
85
14
Ф бактериальный
80 1
0,46±0,02
0,82±0,03
0,59±0,05
97
5
1
0,44±0,01
0,94±0,02
0,77±0,04
23
2
0,48±0,01
48,2 1,53 1,42 0,9
73
0,70±0,03
18
2
1
0,46±0,01
0,90±0,02
47,9 1,48 1,29 0,9
80
2
0,50±0,01
Примечания 1 – номер компоненты мессбауэровского спектра; 2 – приводится значение
квадрупольного расщепления для квадрупольных дублетов или значение квадрупольного
сдвига для магнитных секстетов; 3 – данные из работы [173]; 4 – [160]; 5 – [26]; 6 – [11]; 7 – [176];
8
– [78]; 9 – [181]; 10 – [163]; 11 – [182]; 12 – [22]; 13 – [184]; 14 – [185].
46
1.2.3 Параметры сверхтонкой структуры ядер
57
Fe фармацевтических аналогов
ферритина
Результаты исследований некоторых моделей ферритина методом мессбауэровской
спектроскопии приведены в работах [69, 70, 72, 74, 83, 122, 164–171, 176, 185–188].
Мессбауэровские спектры комплекса железо-полисахарид были измерены в диапазоне
температур от 295 до 12,8 К в работе [72]. При низких температурах мессбауэровские спектры
представляли собой комбинацию нескольких секстетов и дублета. Авторы предположили, что
наблюдаемое изменение значений квадрупольного расщепления дублета при изменении
температуры связано с релаксационными процессами (см. таблицу 1.4). Для аппроксимации
полученных спектров была использована функция распределения магнитного сверхтонкого
поля, при этом из спектра вычиталась парамагнитная компонента. Аппроксимация спектров,
измеренных при 295 К, была проведена суперпозицией трех дублетов со значениями
квадрупольного расщепления: 1,18, 0,74 и 0,36 мм/с. Авторы предположили, что три дублета
характеризуют «железные ядра» малого размера, в которых внутренние и внешние атомы
железа оказываются под действием разных электрических полей.
Таблица 1.4 – Мессбауэровские параметрыспектров комплекса железо-полисахарид,
измеренных при различных температурах [72].
Т, К
295
77
60
50
40
N1
1
2
3
1
2
3
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
5
∆EQ/ε2, мм/с
0,36
0,71
1,18
0,82
0,07
0,07
0,84
0,01
0,01
0,01
0,84
0,02
0,02
0,02
0,89
–0,09
–0,09
–0,09
–0,09
Heff3, кЭ
–
–
–
–
222
429
–
174
379
449
–
187
386
452
–
214
385
437
469
S, %
25
19
26
68
15
17
39
20
20
21
30
18
25
27
23
16
34
12
15
47
Таблица 1.4 – Продолжение.
N1
Heff3, кЭ
S, %
∆EQ/ε2, мм/с
1
0,91
–
16
2
–0,08
205
10
3
–0,08
384
27
4
–0,08
438
21
5
–0,08
473
25
20
1
0,91
–
7
2
–0,08
244
7
3
–0,08
402
26
4
–0,08
451
27
5
–0,08
481
33
12,8
1
0,90
–
2
2
–0,06
256
5
3
–0,06
391
11
4
–0,06
439
22
5
–0,06
469
37
6
–0,06
492
24
1
Примечания: – количество компонент в аппроксимации мессбауэровского спектра; 2 –
приведено значение ∆EQ для квадрупольных дублетов и ε для магнитных секстетов; 3 – значение
эффективного магнитного поля в кЭ.
Т, К
30
Сравнительное исследование ферритина селезенки лошади и его аналога – железодекстранового комплекса было проведено в работе [83]. Авторам не удалось аппроксимировать
измеренные спектры одной компонентой, поэтому они использовали распределение полей.
Результаты аппроксимации, приведенные в таблице 1.5, демонстрируют близкие значения
изомерного сдвига для спектров обоих образцов, но отличающиеся значения квадрупольного
расщепления и значения магнитного поля Hmax. На основании полученных данных авторы
предположили большее влияние поверхностных эффектов в «железных ядрах» железодекстранового комплекса и существование большего количества различных положений ионов
железа по сравнению с «железными ядрами» ферритина. Также был сделан вывод о схожести
«железных ядер» ферритина и железо-декстранового комплекса, отличия между которыми
могут быть связаны лишь с размерами «железных ядер». Авторы предположили, что разброс по
размерам «железных ядер» в железо-декстрановом комплексе меньше, чем для макромолекул
ферритина.
В работе [65] были измерены мессбауэровские спектры железо-декстранового комплекса
при Т=300 К и Т=5 К. Мессбауэровский спектр при 300 К представлял собой парамагнитный
дублет, аналогичный ранее измеренным спектрам различных железо-декстрановых комплексов,
измеренным в работе [68, 74]. Сое и соавторы аппроксимировали мессбауэровские спектры
различных железо-декстрановых комплексов распределением квадрупольно-расщепленных
дублетов со значениями δ в диапазоне от 0,36 до 0,37 мм/с и значениями ∆ЕQ в диапазоне от 0,2
48
до 1,6 мм/с. Однако, Kilcoyne и соавторы [65] аппроксимировали спектр железо-декстранового
комплекса наилучшим образом суперпозицией двух квадрупольных дублетов со значениями
параметров сверхтонкой структуры: δ1=0,359±0,001 мм/с и ∆ЕQ1=0,903±0,008 мм/с для первой
компоненты и δ2=0,360±0,001 мм/с и ∆ЕQ1=0,545±0,005 мм/с для второй компоненты.
Полученные компоненты авторы связали с двумя неэквивалентными позициями атомов железав
октаэдрическом окружении, причем один из октаэдров больше искажен, чем другой.
Наилучшая аппроксимация спектров, измеренных при 5 К, была проведена при использовании
суперпозиции трех магнитных секстетов со значениями параметров сверхтонкой структуры:
δ1=0,559±0,008 мм/с, ε1=0,165±0,007 мм/с и Н=48,28±0,05 Т для первой компоненты,
δ2=0,448±0,002 мм/с, ε2=–0,087±0,003 мм/с и Н=47,52±0,02 Т для второй компоненты и
δ3=0,448±0,004 мм/с, ε3=–0,033±0,004 мм/с и Н=44,66±0,05 Т для третьей компоненты.
Таблица 1.5 – Параметры мессбауэровских спектров образцов ферритина селезенки
лошади и препарата Имферон [83].
Образец
Т,К
δ,
мм/с
Ферритин
mean1
∆ЕQ,
мм/с
0,64
max2
∆ЕQ,
мм/с
0,62
σ3
∆ЕQ,
мм/с
0,22
ε4 ,
мм/с
mean1
H,
кЭ
max2
σ3
H, кЭ H, кЭ
295
0,36
20
0,49
0,00
409
479
111
12
0,50
–0,08
434
489
100
Имферон
295
0,36
0,72
0,61
0,26
20
0,48
–0,08
373
466
116
12
0,48
–0,07
428
475
88
1
2
3
Примечания
– среднее значение;
– максимально вероятное значение;
–
стандартное отклонение; 4 – квадрупольный сдвиг.
Отличия
параметров
сверхтонкой
структуры
мессбауэровских
спектров
были
обнаружены для железо-декстрановых комплексов, полученных различными способами [69,
167, 170]. В работе [167] Мессбауэровский спектр замороженного раствора препарата
Имферона (Benger, USA), измеренный при 87 К, был аппроксимирован суперпозицией
квадрупольного дублета и магнитного секстета. Доля парамагнитной компоненты в
замороженном растворе и в лиофильно высушенном образце составила 71 и 78 %,
соответственно, а для магнитной компоненты – 29 и 22 %, соответственно. Мессбауэровский
спектр препарата Декстрафер (СССР), измеренный при 87 К, представлял собой уширенный
асимметричный
предположено
секстет,
наличие
который
трех
авторам
магнитных
не
удалось
компонент
и
аппроксимировать,
одной
но
было
парамагнитной.
Было
предположено, что значения Heff для мессбауэровского спектра препарата Декстрафер (СССР)
меньше, чем для спектра препарата Имферона (Benger, USA). На основании этого авторы
49
предположили, что «железные ядра» препарата Декстрафер (СССР) могут состоять из трех
кластеров β-FeOOH, отличающихся по структуре и размерам, а также могут содержать αFeOOH. Спектры других железо-декстрановых комплексов при 87 К имели вид дублета.
Значения квадрупольного расщепления мессбауэровских спектров замороженных растворов
ферритина и железо-декстрановых комплексов составляли от 0,639 до 0,744 мм/с, а
лиофиллизованных образцов – от 0,714 до 0,788 мм/с [170]. Мессбауэровские параметры
спектров некоторых железо-декстрановых комплексов, полученные при аппроксимации одной
компонентой мессбауэровских спектров, измеренных при 87 К, приведены в таблице 1.6, а
отличия сверхтонких параметров приведены на рисунке 1.36 а и б. Значения ∆EQ для Имферона
(Benger, USA) оказались меньше, чем для других препаратов, авторы предположили, что
«железные ядра» в препарате Имферон (Benger, USA) имеют более симметричную
конфигурацию. При 295 К значения квадрупольного расщепления мессбауэровских спектров
лиофильно высушенных образцов ферритина и железо-декстрановых комплексов составляли от
0,687 до 0,741 мм/с. Отличия сверхтонких параметров приведены на рисунке 1.36 в. Результаты
аппроксимации спектров лиофильно высушенных образцов несколькими компонентами
приведены в таблице 1.7. Отличия в значении магнитного сверхтонкого поля на ядре
57
Fe для
некоторых железо-декстрановых комплексов при 87 К составили от 231 до 485 кЭ. Авторы
предположили, что наличие нескольких компонент может быть связано со структурными
отличиями «железных ядер», например, присутствие различных модификаций β-FeOOH,
различных внутренних и поверхностных областей. Малые отличия в значениях δ и ∆EQ первого
и второго квадрупольного дублета мессбауэровских спектров железо-декстрановых комплексов
приведены на рисунке 1.37. Полученные малые отличия сверхтонких параметров связывались с
различиями в микроструктуре «железных ядер», а также с отличиями размеров последних.
Таблица 1.6 – Мессбауэровские параметры спектров различных железо-декстрановых
комплексов, измеренных при 87 К [167].
Комплекс
Имферон
Форма1
Р
Heff, кЭ
δ, мм/c
∆EQ/ε, мм/c
–
0,42±0,05
0,72±0,05
485,7±1,6
0,50±0,05
–0,15±0,05
Л
–
0,41±0,05
0,68±0,05
484,0±1,6
0,50±0,05
–0,14±0,05
IDC1
Р
–
0,42±0,05
0,74±0,05
IDC2
Р
–
0,48±0,05
0,74±0,05
IDC3
Р
–
0,48±0,02
0,77±0,02
Л
–
0,45±0,02
0,77±0,02
IDC4
Л
–
0,40±0,05
0,76±0,05
Примечание Р – замороженный раствор, Л – лиофильно высушенный образец.
50
а
б
в
Рисунок 1.36 – Отличия параметров мессбауэровских спектров ферритина и железодекстрановых комплексов в лиофильно высушенной форме при 87 К (а) и 295 (в) и виде
замороженных растворов при 87 К (б), аппроксимация одним квадрупольным дублетом:  –
IDC3P;  – IDC4P;  – IDC6P;  – IDC8P;  – IDC87;  – Ферридекстран;  – Имферон
(Fisons, UK); – ферритин,  – IDC81;  – Декстрафер (СССР);  – IDC26;  – Имферон
(Benger, USA) [170].
Таблица 1.7 – Мессбауэровские параметры спектров различных железо-декстрановых
комплексов, измеренных при 295 и 87 К и аппроксимированных несколькими компонентами
[167, 170].
Образец
(форма1)
Декстрафер2
(Л)
Т, К
N
δ, мм/c
∆EQ, мм/c
295
Имферон2
(Л)
295
IDC32
(Л)
295
(Р)
87
IDC42
(Л)
IDC263
(Р)
295
Имферон3
(Р)
87
1
2
3
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
0,44±0,01
0,29±0,01
0,33±0,01
0,35±0,01
0,35±0,01
0,33±0,01
0,35±0,02
0,34±0,02
0,44±0,02
0,46±0,02
0,48±0,02
0,46±0,02
0,36±0,01
0,36±0,01
0,492±0,042
0,384±0,042
0,385±0,042
0,495±0,042
0,477±0,042
0,501±0,042
0,68±0,01
0,68±0,01
1,22±0,01
0,49±0,01
0,75±0,01
1,04±0,01
0,63±0,02
1,05±0,02
0,63±0,02
1,07±0,02
0,66±0,02
1,11±0,02
0,59±0,01
0,93±0,01
0,726±0,042
–0,038±0,042
–0,301±0,042
0,723±0,042
–0,286±0,042
–0,316±0,042
87
87
Heff, кЭ
–
275,0±1,5
387,5±1,5
–
484,6±1,5
456,3±1,5
Γ, мм/c
0,495±0,084
0,543±0,084
S, %
41
46
13
51
25
24
67
33
60
40
70
30
48
52
50
27
18
71
12
13
51
Таблица 1.7 – Продолжение.
Образец
(форма1)
Декстрафер3
(Р)
Т, К
N
δ, мм/c
Heff, кЭ
∆EQ, мм/c
S, %
Γ, мм/c
87
–
1
5
0,469±0,042
0,639±0,042
0,555±0,084
454,9±1,5
2
27
0,429±0,042
–0,089±0,042
414,8±1,5
3
20
0,479±0,042
–0,265±0,042
364,2±1,5
4
22
0,449±0,042
–0,216±0,042
303,3±1,5
5
13
0,301±0,042
–0,269±0,042
–0,3004
231,1±1,5
6
13
0,332±0,042
1
Примечания – Р – замороженный раствор, Л – лиофильно высушенный образец; 2 –
данные работы [167], 3 – данные работы [170]; 4 – фиксированный параметр.
Квадрупольный дублет 1
а
б
в
Квадрупольный дублет 2
а
б
в
Рисунок 1.37 – Отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
образцов ферритина и железо-декстрановых комплексов в лиофильно высушенной форме при
295 (а) и 87 К (б) и виде замороженных растворов при 87 К (в) при аппроксимации двумя
квадрупольными дублетами;  – IDC3P,  – IDC4P,  – IDC6P,  – IDC8P,  – IDC87,  –
Ферридекстран,  – Имферон (Fisons, UK),  – ферритин,  – IDC81,  – Декстрафер
(СССР),  – IDC26,  – Имферон (Benger, USA) [170].
52
Таблица 1.8 Значения мессбауэровских параметров спектров некоторых моделей
ферритина, аппроксимированных одной компонентой [70].
Т, К
295
85
50
Железополимальтоза
4,2
295
78
45
Железодекстран
4,2
295
78
Железодекстрин
45
4,2
295
78
60
30
4,2
<Н>, кЭ
0
0
0
346
490
0
0
297
0
330
463
0
0
278
366
474
0
0
356
381
427
470
<δ>, мм/c
0,36
0,45
0,46
0,46
0,46
0,36
0,44
0,44
0,45
0,45
0,48
0,36
0,47
0,47
0,47
0,48
0,37
0,44
0,44
0,45
0,46
0,48
ДОЛЯ МАГНИТНОЙ
КОМПОЕНТЫ, %
а
ТЕМПЕРАТУРА, К
S, %
100
100
40
60
100
100
71
29
21
79
100
100
13
87
100
100
100
1
99
100
100
100
<∆EQ>, мм/c
0,72
0,75
0,71
–
–
0,74
0,76
–
0,77
–
–
0,74
0,94
–
–
–
0,73
0,79
–
–
–
–
б
МАГНИТНОЕ СВЕРХТОНКОЕ
ПОЛЕ, кЭ
Образец
Железосахароза
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 1.38 – Температурные зависимости доли магнитной компоненты (а) и средних
значений магнитного поля (б) мессбауэровских спектров  – железо-сахарозы,  – железополимальтозы,  – железо-декстрана и  – железо-декстрина [70].
53
1.3 Особенности структуры и параметров мессбауэровских спектров макромолекул
железодепонирующих белков в различных тканях в норме и при молекулярных
болезнях
В организмах человека и животных ферритин содержится в большом количестве в
тканях печени и селезенки. Кроме этого, макромолекулы ферритина находятся во многих
других тканях, например, сердечной мышцы, легких, почек, щитовидной железы, тонкого
кишечника, поджелудочной железы, а также в сыворотке крови [189, 190]. Поэтому ткани,
содержащие молекулы ферритина, также могут быть исследованы методом мессбауэровской
спектроскопии, как и выделенный ферритин. Однако, в тканях содержание железа во много раз
меньше, чем в образце выделенного белка. Этот факт существенно осложняет использование
мессбауэровской спектроскопии ввиду очень малого резонансного эффекта и существенного
увеличения времени измерения спектров для достижения приемлемого соотношения
сигнал/шум. Однако, выделение белка в достаточном количестве не всегда представляется
возможным. Поэтому есть задачи изучения молекул ферритина в тканях методом
мессбауэровской спектроскопии (особенно при сравнении нормы и патологии), несмотря на
возникающие сложности эксперимента.
Проведение исследований молекул ферритина при патологии в основном связано с
изучением так называемых молекулярных болезней. Термин «молекулярные болезни» появился
около 30 лет назад. В основе таких болезней лежат молекулярные механизмы, связанные,
например, с синтезом аномальных биомолекул, приводящие к развитию патологических
процессов [191]. К молекулярным болезням относятся различные наследственные заболевания,
связанные
с
мутациями
и
повреждением
ДНК,
лучевая
болезнь,
злокачественные
новообразования и др. Число болезней, относящихся к молекулярным, растет, потому что
современные методы исследования выявляют молекулярную природу все большего числа
патологий. Поэтому изучение механизмов развития молекулярных болезней, например, по
исследованию структуры макромолекул белков в норме и при развитии патологии,
представляет особый интерес.
1.3.1 Мессбауэровская спектроскопия тканей, содержащих железодепонирующие
белки
В работе [192] были измерены мессбауэровские спектры образцов нормальных тканей
печени и селезенки лошади и коровы (рисунок 1.39). При Т=295 К мессбауэровский спектр
селезенки лошади был аппроксимирован одним квадрупольным дублетом с параметрами
54
сверхтонкого расщепления δ=0,32±0,05 мм/с и ∆EQ=0,72±0,05 мм/с. При 4,2 К спектр этого
образца представлял собой асимметричный магнитный секстет с большой шириной линии и
δ=0,51±0,05 мм/с. Мессбауэровский спектр печени лошади также был аппроксимирован одним
дублетом с параметрами δ=0,35±0,05 мм/с и ∆EQ=0,63±0,05 мм/с при Т=295 К. Однако при 4,2 К
в спектре печени лошади помимо магнитной компоненты с параметрами, характерными для
ферритина, была обнаружена парамагнитная компонента с параметрами δ=0,50±0,05 мм/с и
∆EQ=0,63±0,05 мм/с. Полученный результат авторы связали с меньшими размерами «железных
ядер» ферритина в ткани печени. В сравнительном исследовании ферритина, выделенного из
плацентарной ткани человека, и самой ткани в работе [173] было показано, что выделенный
белок и ткань имеют близкие значения мессбауэровских параметров (см. таблицу 1.9), а значит,
основной формой запасания железа в плацентарной ткани являются макромолекулы ферритина.
Мессбауэровские спектры выделенного ферритина и плацентарной ткани были приведены
ранее на рисунке 1.26.
Т=295 К
Печень
Velocity, mm/s
Velocity, mm/s
Печень
Т=4,2 К
Relative
absorption, %
Velocity, mm/s
Т=4,2 К
Relative
transmission, %
Селезенка
Т=295 К
Relative transmission, %
Relative transmission, %
Селезенка
Velocity, mm/s
Рисунок 1.39 – Мессбауэровские спектры ткани селезенки и печени лошади, измеренные при
различных температурах [192].
Мессбауэровские спектры нормальной куриной печени и селезенки, измеренные при
комнатной температуре и аппроксимированные суперпозицией двух квадрупольных дублетов,
показаны на рисунке 1.40 в сравнении с мессбауэровским спектром ферритина печени человека,
аппроксимированным суперпозицией двух квадрупольных дублетов (по аналогии с тканями
кур) и четырех квадрупольных дублетов (наилучшая аппроксимация) [177]. Можно отметить,
что, так как ткани куриной печени и селезенки содержат значительно меньшее количество
55
железа по сравнению с выделенным ферритином печени человека, значение эффекта для
спектров куриных тканей существенно меньше (более, чем в 10 раз).
Таблица
1.9
–
Параметры
сверхтонкой
структуры
мессбауэровских
спектров
плацентарной мембраны человека и ферритина, выделенного из нее, аппроксимированные
одним квадрупольным дублетом и суперпозицией двух квадрупольных дублетов [173].
Образец
Плацентарная мембрана
Т, К
293
77
Плацентарный ферритин
293
77
N
1
1
2
1
1
2
1
1
2
1
1
2
δ, мм/c
0,34±0,02
0,32±0,02
0,37±0,02
0,47±0,02
0,46±0,02
0,48±0,02
0,32±0,02
0,28±0,02
0,35±0,02
0,46±0,02
0,45±0,02
0,46±0,02
∆EQ, мм/c
0,60±0,02
0,32±0,02
0,77±0,02
0,70±0,02
0,41±0,02
0,90±0,02
0,58±0,02
0,31±0,02
0,77±0,02
0,65±0,02
0,38±0,02
0,84±0,02
а
б
в
г
Рисунок 1.40 – Мессбауэровские спектры выделенного ферритина человека,
аппроксимированного суперпозицией двух (а) и четырех (б) квадрупольных дублетов и
куриной печени (в) и селезенки (г), аппроксимированные суперпозицией двух квадрупольных
дублетов при Т=295 К [177].
При сравнении оценок параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров,
56
полученных при аппроксимации грубой моделью и гетерогенной моделью (два квадрупольным
дублета) были обнаружены отличия (см. рисунок 1.41), на основании которых авторы работы
[177] предположили наличие структурных различий «железных ядер» как для модели
гомогенного, так и гетерогенного «железного ядра». Также было показано, что по оценкам
сверхтонких параметров возможно отличить ткани человека от тканей кур, а также ткани
куриной печени и селезенки между собой. Поэтому авторы предположили существование
0.67
0.65
0.63
0.61
0.59
0.57
а
0.55
0.53
0.35
0.38
0.41
ISOMER SHIFT, mm/s
0.56
QUADRUPOLE SPLITTING, mm/s
QUADRUPOLE SPLITTING, mm/s
QUADRUPOLE SPLITTING, mm/s
структурных отличий «железных ядер» в разных тканях и в разных живых системах.
0.54
0.52
0.50
0.48
б
0.46
0.44
0.35
0.37
0.39
0.41
ISOMER SHIFT, mm/s
0.94
0.92
0.90
0.88
0.86
0.84
в
0.82
0.80
0.78
0.35
0.38
0.41
ISOMER SHIFT, mm/s
Рисунок 1.41 – Отличия оценок параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
тканей печени человека (), куриной печени () и куриной селезенки () в предположении
гомогенного (а) и гетерогенного (б, в) «железного ядра» при Т=295 К (б – первый дублет, в –
второй дублет) [177].
Значения параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров некоторых тканей в
норме, полученных разными авторами, приведены в таблице 1.10. Сравнительное исследование
тканей селезенки лошади и селезенки человека было проведено Miglierini и соавторами в работе
[63]. Наилучшая аппроксимация спектров, измеренных при 295 К, была получена с использованием
трех квадрупольных дублетов, параметры которых приведены в таблице 1.10. Авторы
предположили, что компоненты аппроксимации характеризуют фазы «железного ядра»: первая
компонента – ультрамалые частицы магнетита/маггемита, вторая – ферригидрит, а третья –
гематит. Мессбауэровские спектры, измеренные при 5 К были аппроксимированы разным числом
компонет. Было предположено, что в аппроксимации мессбауэровского спектра селезенки человека
при 5 К первая компонента (квадрупольный дублет) характеризует ультрамалые частицы
57
ферригидрита или магнетита/маггемита в парамагнитном состоянии, вторая и третья (магнитные
секстеты) – внутренняя и внешняя области ферригидритного «железного ядра», соответственно,
четвертая компонента (магнитный секстет) – гематит. Мессбауэровский спектр селезенки лошади
был аппроксимирован суперпозицией одного квадрупольного дублета, также сопоставленного с
ультрамалыми частицами ферригидрита или магнетита/маггемита в парамагнитном состоянии,
и четырех магнитных секстетов. Первый магнитный секстет авторы сопоставили с частицами
маггемита на поверхности «железного ядра», другие три секстета – аналогично трем секстетам
спектра селезенки человека. Авторы предположили, что компоненты аппроксимации с
большими значениями ширины линии характеризуют внешние, более аморфные области
«железного ядра», а компоненты с маленькими значениями ширины линии – внутренние, более
упорядоченные области.
Таблица 1.10 – Параметры мессбауэровских спектров некоторых тканей в норме,
измеренных при разных температурах.
Т, К N1
B, Т
S, %
δ, мм/c
∆EQ/ε, мм/c
Γ, мм/c
295
1
0,32±0,05
0,72±0,05
4,2 1
0,50±0,05
0,63±0,05
293
1
0,32±0,02
0,32±0,02
2
0,37±0,02
0,77±0,02
77
1
0,46±0,02
0,41±0,02
2
0,48±0,02
0,90±0,02
4
Печень
80
0,58±0,09
0,76±0,05
1
0,66±0,01
Мозг4
80
0,51±0,05
0,70±0,04
0,54±0,04
1
5
Печень кур
295
0,360±0,005
0,559±0,005
0,390±0,010
1
84
0,396±0,005
0,939±0,005
0,303±0,010
2
16
Селезенка
295
0,404±0,005
0,452±0,005
0,353±0,010
1
64
кур5
0,374±0,005
0,786±0,005
0,453±0,010
2
36
Селезенка
300
1
0,45
0,53
–
0,28
26
6
человека
2
0,34
0,55
–
0,32
46
3
0,37
0,96
–
0,40
28
5
1
0,45
0,58
–
0,52
34
2
0,45
–0,14
46,6
0,76
20
3
0,47
–0,12
49,2
0,43
20
4
0,48
–0,13
51,0
0,50
26
Селезенка
300
1
0,45
0,59
–
0,28
31
лошади6
2
0,31
0,60
–
0,31
44
3
0,36
1,06
–
0,36
25
5
1
0,45
0,54
–
0,45
2
2
0,41
–0,04
44,2
0,80
14
3
0,47
–0,09
47,6
0,55
27
4
0,49
–0,07
49,7
0,53
44
5
0,51
–0,04
51,7
0,39
13
Примечания 1 – номер компоненты аппроксимации мессбауэровского спектра; 2 –
данные из работы [192], 3 – [173], 4 – [193], 5 – [177], 6 – [63].
Образец
Селезенка
лошади2
Плацентарная
мембрана
человека3
58
1.3.2 Параметры мессбауэровских спектров наноразмерных «железных ядер»
макромолекул ферритина в норме и при молекулярных болезнях
Пересыщение организма железом является опасным также как и его дефицит.
Пересыщение железом может возникать в силу ряда причин: изменение рациона питания с
избыточным содержанием железа, многократные переливания крови и молекулярные болезни,
при которых нарушается обмен железа в организме или происходит синтез аномальных быстро
разрушающихся гемоглобинов. В целом ряде работ методом мессбауэровский спектроскопии
были исследованы ткани животных, у которых происходит естественное пересыщение железом
вследствие сезонных изменений рациона питания [24, 194] или из-за постоянно высокого
содержания железа в пище [26, 195, 196] либо искусственное пересыщение железом организма
животных в лабораторных условиях [9]. В исследовании образцов ткани печени оленя,
полученных в разное время года, было показано, что независимо от содержания железа в
рационе, основной формой запасания железа в организме являются ферритин и гемосидерин
[194]. На основании полученных параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
(см.
таблицу
1.11)
авторы
предположили,
что
структура
«железных
ядер»
этих
железодепонирующих белков не меняется при изменении содержания железа, а изменяется
лишь их размер.
Таблица 1.11 – Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров образцов
печени северных оленей Шпицбергена, полученных в разное время года [194].
m1,
Т=4,2 К (секстет)
мг Fe/100 мг ткани
B, Т
δ, мм/с
Январь
57±14
0,48±0,01
49,0±0,5
Апрель
165±94
0,49±0,01
49,1±0,5
Июль
34±12
0,49±0,01
49,1±0,5
Октябрь
32±14
0,48±0,01
49,1±0,5
Примечание – среднее содержание железа в образце ткани
абсорбционной спектроскопии.
Месяц
Т=78 К (дублет)
δ, мм/с
∆EQ, мм/с
0,48±0,01
0,68±0,01
0,46±0,01
0,70±0,01
0,46±0,01
0,68±0,01
0,47±0,01
0,71±0,01
печени по данным атомной
Исследование «железных ядер» выделенных железодепонирующих белков тканей
печени мышей после однократного внутрибрюшного введения железодекстранового комплекса
Имферон в количестве 1,2 мл (60 мг Fe) в сравнении с «железными ядрами» Имферона было
проведено в работе [9]. Авторами были выявлены отличия в температуре появления магнитной
компоненты в спектрах исследуемых образцов (рисунок 1.42). Авторы предположили, что
«железные ядра» ферритина имеют больший размер, по сравнению с «железными ядрами»
гемосидерина и препарата Имферон. На основании отличий мессбауэровских спектров
гемосидерина и препарата Имферон в диапазоне температур от до авторы предположили, что в
59
организме «железные ядра» препарата Имферон преобразуются в ферригидрит-подобные
«ядра». Параметры сверхтонкой структурымессбауэровских спектров всех образцов оказались
одинаковыми в пределах ошибки (см. таблицу 1.12), на основании чего авторы предположили,
что окружение железа во всех образцах является похожим.
Таблица 1.12 – Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров препарата
Имферон, ферритина и гемосидерина, выделенных из печени мышей после внутрибрюшной
инъекции препарата Имферон [9].
Т, К
300
14
300
14
300
5
Гемосидерин
Имферон
δ, мм/с
0,41±0,01
∆EQ, мм/с
0,70±0,02
0,39±0,01
0,65±0,02
0,39±0,01
0,67±0,02
26 К
37 К
42.5 К
54 К
295 К
Velocity, мм/с
а
14 К
Relative transmission
Relative transmission
14 К
26 К
37 К
42.5 К
53 К
295 К
Velocity, мм/с
б
B, Т
49,1±0,5
48,9±0,5
48,8±0,5
5К
Relative transmission
Образец
Ферритин
20 К
26 К
30 К
40 К
295 К
Velocity, мм/с
в
Рисунок 1.42 – Мессбауэровские спектры гемосидерина (а) и ферритина (б), выделенныхиз
ткани печени мышей после внутрибрюшного введения препарата Имферон, и препарата
Имферон (в), измеренные при различных температурах [9].
Данные этих исследований могут быть использованы для сравнения с результатами
изучения тканей организмов с пересыщением железом в результате патологических процессов.
При сравнении «железных ядер» гемосидеринов печени и селезенки человека, лошади, оленя и
печени больных первичным и вторичным гемохроматозом (заболеванием, связанным с
нарушением обмена железа в организме) в работе [24] авторами было обнаружено, что
60
мессбауэровские спектры гемосидеринов образцов тканей в норме при 77 К и 4,2 К не
отличаются от спектров нормальных ферритинов. Однако, в температурном диапазоне ~60–20
К были выявлены существенные отличия в температуре появления магнитной компоненты и
интенсивности ее линий. При сравнении мессбауэровских спектров нормального гемосидерина
селезенки человека и гемосидеринов печени больных первичным и вторичным гемохроматозом
(см. рисунок 1.43) было выявлено отличие в TB исследуемых образцов. На основании данных,
полученных методом мессбауэровской спектроскопии, а также с учетом данных электронной
дифракции, авторы предположили, что «железные ядра» нормального гемосидерина печени
человека и гемосидерина печени оленя с рационом, богатым железом, имеют схожую
ферригидрит-подобную структуру и меньший размер по сравнению с «железными ядрами»
нормального ферритина. В то же время, авторы предположили, что «железные ядра»
гемосидерина печени больных вторичным гемохроматозом ближе по структуре к α-FeOOH, а
больных первичным гемохроматозом – к аморфной оксигидроокиси железа. Однако, параметры
сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров нормальной селезенки человека и лошади и
образцов селезенки при рассматриваемых патологиях не отличались (см. таблицу 1.13).
4.2 К
77 К
77 К
60 К
15 К
40 К
20 К
4.2 К
Absorption, mm/c
20 К
Absorption, mm/c
Absorption, mm/c
77 К
5К
3К
1.8 К
1.4 К
а
Velocity, mm/s
1.4 К
1.4 К
в
б
Velocity, mm/s
Velocity, mm/s
Рисунок 1.43 – Мессбауэровские спектры гемосидерина, выделенного из селезенки человека в
норме (а) и из печени больных вторичным (б) и первичным (в) гемохроматозом [194].
61
Таблица 1.13 – Мессбауэровские параметры спектров различных гемосидеринов в норме
и при гемохроматозе [194].
Образец
Нормальная селезенка лошади
Нормальная селезенка человека
Печень больного вторичным гемохроматозом
Печень больного первичным гемохроматозом
Т, К
77
4,2
77
4,2
77
4,2
77
4,2
δ, мм/с
0,48±0,01
∆EQ, мм/с
0,71±0,01
0,48±0,01
0,72±0,01
0,48±0,01
0,71±0,01
0,50±0,01
0,67±0,01
B, Т
49,5±0,5
48,9±0,5
49,7±0,5
–
Влияние пролонгированного воздействия избыточного количества железа на организм
было исследовано St. Pierre и соавторами на примере дюгоней (морских коров), в основном
питающихся морскими водорослями с повышенным содержанием железа [26], и мышей,
регулярно получавших железосодержащие добавки перорально или в виде инъекций [197].
Авторами было выявлено, что при 78 К мессбауэровский спектр выделенного ферритина
печени дюгоня имеет вид парамагнитного дублета, тогда как спектр ткани печени при этой же
температуре представляет собой асимметричный секстет, аппроксимированный суперпозицией
трех магнитных секстетов (рисунок 1.44). Параметры сверхтонкой структуры для магнитных
секстетов, приведенные в таблице 1.14, согласуются с ранее полученными данными для тканей
дюгоней в работе [195]. Поэтому авторы предположили, что железо в печени дюгоня
преимущественно накапливается в гемосидерине, «железные ядра» которого ближе по
структуре к гетиту. Аналогичное предположение было выдвинуто авторами работы [196],
впервые обнаружившими гетит-подобные «железные ядра» в тканях млекопитающих,
содержащих избыточное количество железа из-за рациона питания, а не вследствие
многократных переливаний крови при талассемии (молекулярная болезнь, при которой
синтезируются аномальные гемоглобины). Пример мессбауэровских спектров печени и
селезенки мышей с пересыщением железом из работы [197], аппроксимированных одним
магнитным секстетом и одним квадрупольным дублетом при 78 К, приведен на рисунке 1.45.
Средние значения параметров сверхтонкой структуры спектров образцов тканей печени и
селезенки мышей с пересыщением железом вследствие перорального или внутривенного
введения железосодержащих препаратов сравнивались в работе [197] со значениями параметров
сверхтонкой структуры спектров для образцов ткани селезенки больного талассемией из работ
[196, 197] в таблице 1.15. На основании полученных данных авторами [197] было предположено,
что избыток железа в случае пролонгированного использования железосодержащих добавок
запасается в виде гемосидерина с гетит-подобными «железными ядрами», так же, как это
происходит в случае молекулярных болезней (β-талассемии/гемоглобина Е и β-талассемии).
62
Также было обнаружено, что ткани больных талассемией содержат большее количество железа
по сравнению с тканями здоровых людей [198].
а
б
Рисунок 1.44 – Мессбауэровские спектры выделенного ферритина печени дюгоня (а) и ткани
печени дюгоня (б), измеренные при 78 К [26].
Таблица 1.14 – Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров образцов
ферритина, выделенного из тканей печени и селезенки, и образцов тканей печени трех дюгоней
при Т=78 К [26].
Образец
δ, мм/с
∆EQ, мм/с
Выделенный ферритин из тканей печени и селезенки
Дюгонь (печень) 1
0,44
0,77
Дюгонь (печень) 2
0,44
0,74
Дюгонь (печень) 3
0,45
0,76
Здоровый человека (печень)
0,46
0,73
Больной талассемией (печень)
0,44
0,76
Больной талассемией (селезенка)
0,45
0,72
Ткани печени дюгоней
Дюгонь 1
0,47
0,66
0,42
–0,41
Дюгонь 2
0,45
–0,22
0,45
0,70
Дюгонь 3
0,48
0,59
0,51
–0,18
B, Т
S, %
100
100
100
100
100
100
46,8
48,3
47,2
75
22
51
49
80
20
В исследовании тканей сердца больных талассемией, которым регулярно делали
переливание крови или хелатную терапию, было выявлено, что ткань содержит макромолекулы
гемосидерина (~ 40 %), ферритина (~35 %) и других соединений трехвалентного железа,
которые авторам не удалось идентифицировать с помощью мессбауэровской спектроскопии,
т.к. при 78 К спектр представлял собой плохоразрешенный дублет [199]. При дальнейшем
исследовании тканейселезенки больных β-талассемией/гемоглобином Е и β-талассемий было
63
предположено, что компоненты мессбауэровских спектров могут быть сопоставлены с
«железными ядрами» ферритина, аморфными «железными ядрами» гемосидерина, «железными
ядрами» гемосидерина со структурой, близкой к ферригидриту либо к гетиту [200]. Сравнение
параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров различных тканей больных
Transmission, mm/s
Transmission, mm/s
талассемией (а) и здоровых людей (б) из работ [9, 196, 198] приведены на рисунке 1.46.
а
б
Velocity, mm/s
Velocity, mm/s
Рисунок 1.45 – Мессбауэровские спектры ткани печени (а) и селезенки (б) мышей, получавших
а
Isomer shift, mm/s
Quadrupole splitting, mm/s
Quadrupole splitting, mm/s
железосодержащие добавки в течение 10 месяцев; Т=78 К [197].
б
Isomer shift, mm/s
Рисунок 1.46 – Сравнение оценок средних значений параметров сверхтонкой структуры
мессбауэровских спектров нормальной селезенки человека (), поджелудочной железы (),
печени () и селезенки () тайских больных β-талассемией/гемогобином Е и селезенки
австралийских больных β-талассемией () при 78 К по данным работы [198] (a) и сравнение
оценок значений параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров нормальной
селезенки () и печени () человека из Тайланда, селезенки () и печени () человека из
Австралии, печени дюгоня () по данным работ [9, 196], приведенное в работе [179].
64
Таблица 1.15 – Средние значения параметров компонент мессбауэровских спектров и
диапазон их изменения для различного числа образцов ткани печени мышей с пересыщением
железом и некоторых тканей больных гемоглобинопатиями при 78 К.
Образец
n1
δ, мм/с
Печень мышей2
Селезенка больного
талассемией3
11
4
0,53
0,47
от 0,42 до 0,51
Печень больного
талассемией3
4
0,51
от 0,48 до 0,56
Поджелудочная железа
больного талассемией3
3
0,43
от 0,35 до 0,49
B, Т
∆EQ/ε, мм/с
Магнитный секстет
–0,31
46,2
–0,21
47,0
от –0,28 до –0,13 от 46,5 до
47,4
–0,30
46,7
от –0,34 до –0,27 от 46,5 до
47,0
–0,10
46,7
от –0,29 до 0,24 от 46,6 до
46,8
Квадрупольный дублет
0,711±0,009
0,681±0,035
0,683±0,035
0,715±0,008
0,66±0,03
Γ, мм/с
1,25
0,86
от 0,73 до 0,99
0,81
от 0,60 до 1,09
0,86
от 0,74 до 1,10
Печень мышей2,5
17
0,442±0,004
0,603±0,037
2,5
Селезенка мышей
16
0,447±0,008
0,578±0,051
Печень мышей2,6
8
0,438±0,006
0,572±0,044
2,6
Селезенка мышей
8
0,438±0,008
0,622±0,029
12
0,46±0,02
0,61±0,06
Селезенка больного β3
талассемией/HbE
0,46±0,03
0,68±0,03
0,67±0,08
Селезенка больного β- 7
талассемией3
Нормальная селезенка 12
0,39±0,09
0,51±0,10
0,56±0,14
человека4
4
0,48
0,66
0,58
Печень больного βот 0,47 до 0,49
от 0,64 до 0,70
от 0,53 до 0,68
талассемей/HbE3
12
0,45±0,06
0,60±0,10
0,64±0,16
Печень больного β3
талассемией
Нормальная печень
3
0,47
0,64
0,58
3
человека
от 0,47 до 0,48
от 0,60 до 0,66
от 0,52 до 0,62
Примечания 1 –количество образцов; 2 – данные из работы [197], 3 – [198], 4 – [196]; 5 –
пересыщение железом с помощью пероральных препаратов, 6 – с помощью внутримышечных
инъекций.
Другим
заболеванием,
мессбауэровской
при
спектроскопии,
котором
является
ткани
больных
амилоидоз
исследовались
(системное
методом
заболевание,
характеризующееся нарушением белкового обмена и функционирования иммунной системы). В
работе [201] мессбауэровские спектры тканей печени здорового человека и больного
амилоидозом были измерены в широком температурном диапазоне. Авторы обнаружили, что
при 4 К все спектры представляют собой магнитный секстет, а еще при 10 К присутствует
остаточная парамагнитная компонента, интенсивность которой увеличивается с повышением
температуры,
а интенсивность
магнитной компоненты
уменьшается
до
полного
ее
исчезновения. При 110 К все спектры были аппроксимированы одним квадрупольным
65
дублетом, параметры сверхтонкой структуры которого приведены в таблице 1.16. Меньшие
значения относительного поглощения в спектре ткани печени больного амилоидозом по
сравнению со спектрами ткани печени здорового человека (при одинаковом весе всех образцов)
авторы связывали с меньшим содержанием железа в ткани печени больного. По значениям δ и
∆EQ авторы предположили, что в печени здорового человека железо запасено в ферритине, а в
печени больного, вероятно, в гемосидерине. Однако, значения δ и ∆EQ, полученные авторами не
различались бы в пределах инструментальной ошибки, если бы авторы ее определили.
Таблица 1.16 – Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров тканей
печени, измеренных при Т=110 К [201].
Образец
Ткань печени здорового человека, полученная при операции
Ткань печени здорового человека, полученная при вскрытии
Ткань печени больного амилоидозом, полученная при вскрытии
δ, мм/с
0,43±0,01
0,44±0,01
0,40±0,01
∆EQ, мм/с
0,73±0,01
0,73±0,02
0,71±0,02
Уменьшение резонансного эффекта (поглощения) в спектре патологической ткани, а
значит и снижение количества железа в ней, было выявлено авторами в работе по
исследованию тканей печени и селезенки кур, больных лимфоидным лейкозом [202]. Однако,
все образцы имели разный вес (от 1200 до 1600 мг), что не было учтено авторами. Поэтому,
несмотря на то, что величина резонансного эффекта в норме превосходила величину эффекта
при патологии примерно в 3–4 раза, для более корректной оценки уменьшения содержания
железа при лимфоидном лейкозе необходимо учитывать отличия в весе образцов тканей.
Мессбауэровские
спектры
исследованных
образцов
(см.
рисунок
1.47 а, б)
были
аппроксимированы при 295 К одним квадрупольным дублетом, относящимся к «железным
ядрам» ферритина. При сравнении параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских
спектров тканей кур больных лейкозом и тканей здоровых кур (см. таблицу 1. 17 и рисунок 1.47
в) были обнаружены отличия в значениях квадрупольного расщепления для тканей в норме и
при лейкозе, которые авторы связывали с различиями электронной структуры 57Fe и структуры
«железных ядер» в железодепонирующих белках в норме и при патологии.
Таблица 1.17 – Мессбауэровские параметры спектров тканей селезенки и печени
здоровых и больных лимфоидным лейкозом кур при 295 К [202].
Образец
Селезенка здоровой курицы
Селезенка курицы с лейкозом
Печень здоровой курицы
Печень курицы с лейкозом
δ, мм/с
0,399±0,010
0,382±0,010
0,361±0,010
0,363±0,010
∆EQ, мм/с
0,537±0,010
0,587±0,010
0,618±0,010
0,639±0,010
Γ, мм/с
0,446±0,020
0,506±0,020
0,436±0,020
0,536±0,020
66
а
б
в
Рисунок 1.47 – Мессбауэровские спектры печени (а) и селезенки (б) кур, больных лимфоидным
лейкозом при Т=295 К и отличия сверхтонких параметров мессбауэровских спектров (в). На
спектрах компонента 1 относится к макромолекулам ферритина, 2 – к остаточному
метгемоглобину [202].
Сравнительное исследование тканей селезенки здорового человека и больных
гемосидерозом (избыточное накопление железа, вероятно, в форме гемосидерина с его
локальным или системным отложением в тканях) и наследственным сфероцитозом
(заболеванием, которое вызывает аномалию мембран эритроцитов, что приводит к сферической
форме эритроцитов и их преждевременному гемолизу с высвобождением гемоглобина) было
проведено в работе [203]. Спектры всех образцов были аппроксимированы суперпозицией трех
квадрупольных дублетов при 295 К и 77 К (см. рисунок 1.48), параметры которых приведены в
таблице 1.18. Авторы предположили, что первый дублет может быть сопоставлен с
ферригидрит-подобными «железными ядрами» ферритина или гемосидерина, второй – с
ионами железа в тертаэдрическом окружении и, возможно, с мелкими суперпарамгнитными
частицами маггемита, а третий – с β-FeOOH. При Т=5 К все спектры были аппроксимированы
суперпозицией одного квадрупольного дублета и трех магнитных секстетов. Авторы
предположили, что первый магнитный секстет соответствует ферригидриту (в селезенке
здорового человека) и маггемиту (в селезенке больных), второй и третий магнитный секстеты –
с β-FeOOH, а квадрупольный дублет, возможно, может быть связан с остаточным количеством
67
ионов железа, находящихся в суперпарамагнитном состоянии. Авторы предположили, что
содержание таких мелких суперпарамагнитных частиц в образцах ткани нормальной селезенки
и селезенки больного сфероцитозом одинаковое, тогда как в ткани селезенки больного
гемосидерозом их количество существенно больше. На основании полученных данных авторы
сделали вывод, что «железные ядра» в исследуемых образцах отличаются по размеру, причем,
ферритин больных гемосидерозом обладает наибольшими по размеру «железными ядрами»,
которые содержат большее количество атомов железа. Следует также отметить, что и в этой
работе авторы не рассматривали инструментальные ошибки, которые для параметров
сверхтонкой структуры могут быть существенно больше расчетных ошибок.
Relative transmission
300 K
–3 –2 –1
300 K
0
1
2
3
77 K
0
1
2
3
77 K
–3 –2 –1
0
1
2
3
а
5K
–10
–3 –2 –1
300 K
–5
0
5
Velocity, mm/s
–3 –2 –1
–10
0
1
2
3
0
1
2
3
77 K
0
1
2
3
б
5K
10
–3 –2 –1
–5
0
5
Velocity, mm/s
10
–3 –2
–1
5K
–10
в
–5
0
5
Velocity, mm/s
Рисунок 1.48 – Мессбауэровские спектры тканей селезенки больного наследственным
сфероцитозом (а), здорового человека (б) и больного гемосидерозом (в) [203].
10
68
Таблица 1.18 – Параметры мессбауэровских спектров тканей селезенки здорового
человека и больных гемосидерозом и наследственным сфероцитозом [203].
Образец
Здоровый
человек
Т, К
300
77
5
Больной
300
Наследственным
сфероцитозом
77
5
Больной
гемосидерозом
300
77
5
N δ±0,01, мм/с ∆EQ/ε±0,01, мм/с
1
0,34
0,55
2
0,45
0,53
3
0,37
0,96
1
0,40
0,60
2
0,55
0,59
3
0,44
1,18
1
0,37
0,47
2
0,48
–0,13
3
0,48
–0,12
4
0,45
–0,14
1
0,35
0,54
2
0,47
0,53
3
0,37
0,96
1
0,39
0,59
2
0,53
0,60
3
0,42
1,14
1
0,42
0,50
2
0,48
–0,07
3
0,49
–0,16
4
0,44
–0,12
1
0,35
0,51
2
0,47
0,46
3
0,38
0,91
1
0,41
0,51
2
0,55
0,50
3
0,44
1,05
1
0,50
0,50
2
0,45
–0,13
3
0,47
–0,10
4
0,42
–0,21
В±0,1, Т Γ±0,01, мм/с S±1, %
0,32
46
0,28
26
0,40
28
0,42
76
0,29
18
0,28
6
0,39
42
51,0
0,50
22
49,2
0,43
17
46,7
0,78
19
0,30
57
0,22
15
0,37
28
0,42
81
0,26
13
0,26
6
0,54
40
51,3
0,55
19
49,4
0,47
18
46,5
0,87
23
0,29
44
0,28
30
0,38
26
0,33
57
0,27
32
0,29
11
0,45
60
51,3
0,61
15
49,4
0,39
10
46,7
0,73
15
1.4 Постановка задачи исследования
К настоящему времени накоплен большой экспериментальный опыт в изучении
ферритина и его аналогов. Однако, большинство исследований ферритина, его аналогов, а
также
тканей,
содержащих
железодепонирующие
белки,
методом
мессбауэровской
спектроскопии проводились с низким скоростным разрешением с последующим фолдингом,
результатом чего является большая инструментальная (систематическая) ошибка, которая
может существенно превосходить расчетную ошибку для мессбауэровских параметров. Также
при таких измерениях форма линии спектра может искажаться из-за различия нелинейности и
интегральных ошибок скорости на прямом и обратном ходе движения в обычных
69
спектрометрах, использующих опорный сигнал скорости треугольной или синусоидальной
формы. Эти факты не позволяли с высокой точностью выявлять реальные малые отличия
параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe и проводить корректную аппроксимацию
сложных многокомпонентных мессбауэровских спектров.
Кроме того, во многих работах аппроксимация мессбауэровских спектров проводилась с
использованием функций распределения квадрупольного расщепления или магнитного
сверхтонкого поля. Такой способ аппроксимации является безмодельным, т.е. не связанным с
конкретной физической моделью описания формы линии. Этот метод предполагает
непрерывное или квазинепрерывное изменение структуры вещества. Однако структура
реального вещества дискретна, поэтому использование функций распределения не позволяет
получить физические параметры, которые можно оценить при аппроксимации спектров
индивидуальными компонентами. Более того, аппроксимация мессбауэровских спектров,
измеренных на спектрометрах с низким скоростным разрешением, далеко не всегда возможна
линиями лоренцевой формы из-за искажения спектральной линии после фолдинга в результате
различной нелинейности и интегральной ошибки скорости на прямом и обратном ходе
движения обычных спектрометров, использующих опорный сигнал скорости треугольной или
синусоидальной формы. В этом случае используются либо функции распределения, либо линии
типа Фойгт или псевдо-Фойгт (свертка или сумма линий лоренцевой и гауссовой формы), что
не является корректным с точки зрения физики эффекта Мессбауэра.
Создание мессбауэровских спектрометров с высоким скоростным разрешением,
обладающих
высокой
мессбауэровских
стабильностью
спектров
с
и
точностью,
существенно
более
позволило
высоким
проводить
качеством
и
измерения
меньшей
инструментальной (систематической) ошибкой для параметров сверхтонкой структуры (см.,
например, [204]). Применение мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным
разрешением в различных областях, таких как изучение внеземного вещества, наноразмерных
материалов,
биофизические
и
биомедицинские
исследования,
демонстрирует
новые
возможности данного метода в изучении взаимосвязи малых изменений параметров
сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров, электронной структуры железа и структуры
его ближайшего окружения [204–211].
Поэтому
целью
данной
работы
является
изучение
особенностей
структуры
наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах ферритина и его фармацевтически важных
аналогов, а также в железодепонирующих белках в тканях печени и селезенки в норме и при
злокачественных заболеваниях системы крови методом мессбауэровской спектроскопии с
высоким скоростным разрешением. Задачами исследования являются:
1) характеризация исследуемых объектов (ферритина печени человека, тканей печени и
70
селезенки
и
фармацевтических
трансмиссионной
спектроскопией,
и
препаратов
сканирующей
рентгеновской
Мальтофер®
электронной
дифракции,
и
микроскопии
электронного
Феррум
с
Лек)
методами
энергодисперсионной
парамагнитного
резонанса,
термогравиметрии и магнитных измерений;
2) измерение в температурном диапазоне 295–90 К мессбауэровских спектров с высоким
скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в выделенном ферритине печени
человека и его фармацевтически важных аналогах – препаратах Имферон, Мальтофер® и
Феррум Лек;
3) измерение при 295 К мессбауэровских спектров с высоким скоростным разрешением
наноразмерных «железных ядер» в ферритине бактерий Azospirillum brasilense (штамм Sp245) и
в железодепонирующих белках в тканях печени и селезенки человека и куриц в норме и при
злокачественных заболеваниях системы крови;
4) измерение в температурном диапазоне 80–20 К мессбауэровских спектров с низким
скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в выделенном ферритине печени
человека и его фармацевтически важных аналогах – препаратах Мальтофер® и Феррум Лек;
5) измерение при 40 и 20 К мессбауэровских спектров с низким скоростным
разрешением наноразмерных «железных ядер» в железодепонирующих белках в тканях печени
и селезенки человека в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови;
6) аппроксимация измеренных мессбауэровских спектров с использованием моделей
гомогенного и гетерогенного «железного ядра» и получение оценок мессбауэровских
параметров;
7) анализ и интерпретация полученных мессбауэровских параметров во взаимосвязи со
структурными особенностями наноразмерных «железных ядер» в исследуемых объектах.
71
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Приготовление образцов
2.1.1 Выделенный ферритин печени человека
Ферритин из печени здорового человека был выделен профессором П.Г. Прокопенко на
кафедре биохимии Московского государственного медицинского университета и приготовлен в
лиофильно высушенной форме в виде мелкодисперсного порошка. Методика приготовления
ферритина была описана в работе [170]). Очищенный ферритин (95 %) содержал 20 %
связанного железа. Для проведения измерений мессбауэровских спектров использовалось 100 мг
белка. Ферритин помещался в оправку из оргстекла диаметром 20 мм и плотно утрамбовывался.
Толщина образца составляла 5–6 мг Fe/см2. Данный образец использовался в качестве
своеобразного стандарта при сравнении с другими образцами ферритина и его аналогов.
2.1.2 Фармацевтические аналоги ферритина
В
качестве
аналогов
ферритина
использовались
промышленно
производимые
фармацевтические препараты Имферон (Fisons, UK), Мальтофер® (Vifor International Inc.,
Switzerland) и Феррум Лек (Lek, Slovenia). Имферон представляет собой раствор железо–
декстранового комплекса, содержащий 50 мг Fe/мл. Раствор Имферона лиофильно
высушивался, измельчался до порошкообразного состояния и помещался в оправку из
оргстекла для эксперимента при 295 К. Раствор Имферона, хранившегося 10 лет при комнатной
температуре в ампуле производителя замораживался для эксперимента при 90 К. Мальтофер® и
Феррум Лек представляют собой комплекс железа с полимальтозой и содержатся в таблетках
по 100 мг Fe в каждой. Для проведения измерений использовали по 1/3 таблетки, которую
измельчали до порошкообразного состояния и помещали в аналогичные оправки из оргстекла.
Толщина всех образцов составляла ~10 мг Fe/см2.
2.1.3 Ткани, содержащие железодепонирующие белки, в норме и при некоторых
патологиях
Образцы тканей куриной печени и селезенки были получены на двух разных
птицефабриках, обозначаемых в работе 1 и 2, сотрудниками кафедры физиологии и
72
биотехнологии Уральского Аграрного Университета: Л.И. Малахеевой, Ю.В. Клеповой и
профессором Н.В. Садовниковым. На птицефабрике 2 было получено два вида образцов: куры
возрастом 148 и 200 дней, на птицефабрике 1 – один вид. Образцы тканей были отмыты от
крови, лиофильно высушены в Гематологическом научном центре Минздравсоцразвития в
Москве и измельчены до порошкообразного состояния. Вес порошкообразных образцов тканей
составлял от 1200 до 1600 мг. Эти образцы помещались в оправки из оргстекла диаметром 20
мм и плотно утрамбовывались.
Образцы тканей печени и селезенки человека были получены в Свердловской областной
клинической больнице (ОКБ) № 1 с соблюдением этических норм и прав человека к.м.н. А.В.
Виноградовым (Министерство здравоохранения Свердловской области) при содействии
заведующего гематологическим отделением ОКБ № 1 к.м.н. Т.С. Константиновой. Образцы
ткани нормальной селезенки были получены после ее удаления из-за травматического
повреждения, а ткани нормальной печени были получены от здорового человека, погибшего в
результате несчастного случая. Образцы тканей печени и селезенки больных злокачественными
заболеваниями системы крови были получены для случаев: первичный миелофиброз с
миелоидной метаплазией (селезенка), лимфома мантийной зоны, стадия IVB (печень и
селезенка) и острый миелолейкоз (печень и селезенка). Ткань селезенки больного первичным
миелофиброзом была получена после хирургического удаления селезенки (спленэктомия).
Ткани печени и селезенки больных лимфомой мантийной зоны и острым миелолейкозом были
получены post mortem. Образцы тканей были отмыты от крови с помощью физиологического
раствора и лиофильно высушены в Гематологическом научном центре Минздравсоцразвития в
Москве. Высушенные образцы измельчались до порошкообразного состояния и помещались в
оправки из оргстекла диаметром 20 мм. Вес образцов составил 900–1400 мг.
2.1.4 Бактерии, содержащие ферритин
Бактерии вида Azospirillum brasilense (штамм Sp245) были выращены в стандартной
питательной среде с железом, обогащенным изотопом
57
Fe, в виде соли
57
FeIII-NTA
профессором, д.х.н. А.А. Камневым и к.х.н. А.В. Тугаровой в Институте биохимии и
физиологии растений и микроорганизмов РАН (далее по тексту ИБФРМ РАН), г. Саратов. Было
приготовлено два образца. Первый образец был приготовлен из бактерий, которые
выращивались в питательной среде с железом в течение 18 часов. Второй образец был
приготовлен из аналогичных бактерий, которые после выращивания в течение 18 часов в
питательной среде с железом на трое суток помещались в водно-солевой раствор без железа.
Затем
каждый
образец
бактерий
был
лиофильно
высушен.
Образцы
бактерий
в
73
порошкообразном состоянии помещались в оправки из оргстекла диаметром 20 мм. Вес
образцов бактерий составлял 50 мг (образец 1) и 70 мг (образец 2).
2.2 Методы исследования образцов
2.2.1 Рентгеновский фазовый анализ
Рентгеновский фазовый анализ образцов выделенного ферритина печени человека и
препаратов Феррум Лек и Мальтофер® был проведен совместно с к.ф.-м.н. А.В. Чукиным
(Физико-технологический
институт,
Уральский
федеральный
университет)
методом
рентгеновской порошковой дифракции на дифрактометре PANalytical X’pert PRO. В данном
случае использовалась геометрия на пропускание, линия излучения CuKα с энергией 8,03 кэВ и
угловой диапазон 2Θ от 10° до 80°.
2.2.2 Сканирующая электронная и трансмиссионная микроскопия
Микрофотографии и элементный состав образцов Феррум Лек и Мальтофер® были
получены с помощью сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 со встроенной
энергодисперсионной
приставкой
EDS
для
химического
анализа
по
спектрам
характеристического рентгеновского излучения совместно с профессором И. Фелнером (I.
Felner) в the Hebrew University, Jerusalem, Israel. Микрофотографии образца выделенного
ферритина печени человека были получены с помощью трансмиссионной электронной
микроскопии на установке MORGAGNI 268D совместно с д-ром П. Немет (Dr. P. Németh) в
Research Center for Natural Sciences, Hungarian Academy of Science, Budapest, Hungary.
Микрофотографии образцов бактерий Azospirillum brasilense (штамм Sp245) были
получены А.А. Камневым в ИБФРМ РАН на трансмиссионном электронном микроскопе Libra
120 (Carl Zeiss, Germany) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
2.2.3 Гистохимический анализ тканей
Гистохимический анализ тканей проводился к.м.н. С.Е. Иощенко в Свердловском
областном патологоанатомическом бюро. Для визуализации содержания негемового железа в
ткани при гистохимическом анализе использовался метод Перлса [212]. В данном методе
используется «берлинская лазурь» (смесь 1 % ферроцианида калия и 1 % соляной кислоты),
которая окрашивает оксид железа в ярко-синий цвет. Метод Перлса чувствителен только к
74
одному состоянию окисления железа и позволяет определить распределение значительной
части негемового железа [213].
2.2.4 Термогравиметрия
Термогравиметрические измерения были проведены для образцов выделенного ферритина
печени человека и его фармацевтических аналогов Мальтофер® и Феррум Лек на
оборудовании SETSYS Evolution (Setaram) совместно с Р.Ф. Самигуллиной в Институте химии
твердого тела УрО РАН, Екатеринбург. Измерения проводились в диапазоне температур от 300
до 1900 К в тиглях из корунда с шагом 10 К/мин, точность весов 10–9 кг.
2.2.5 Электронный парамагнитный резонанс
Спектры электронного парамагнитного резонанса были измерены на порошках образцов
выделенного ферритина печени человека и его фармацевтических аналогов Мальтофер® и
Феррум Лек при комнатной температуре и частоте модуляции 100 кГц на спектрометре Bruker
ElexSys E500 X-band EPR совместно с д-ром З. Кленчаром (Z. Klencsár) в Research Centre for
Natural Sciences, Hungarian Academy of Science, Budapest, Hungary. Аппроксимация измеренных
спектров была проведена д-ром З. Кленчаром. Для образца выделенного ферритина амплитуда
модуляции составила 10 Г, микроволновая мощность составила ∼20 мВт. Для образцов Феррум
Лек и Мальтофер® значения этих величины составили 5 Г и ∼ 10 мВт. Также было проведено
измерение без образца в тех же самых условиях для определения фонового уровня
интенсивностей как функции постоянного магнитного поля. Далее этот фоновый уровень
вычитался из спектров измеренных образцов до проведения аппроксимации. Для определения
сигнала от неагрегированных парамагнитных частиц железа ферритина были проведены
измерения при температурах 150–290 K с амплитудой модуляции 10 Г и микроволновой
мощностью ∼10 мВт. Для того, чтобы исключить влияние текстуры на вид ЭПР спектра,
порошок образца препарата Мальтофер® был смешан с порошком оксида MgO. Значения
частоты измерения составили 9,8604 ГГц для образца ферритина, 9,3235 ГГц для образца
препарата Мальтофер® и 9,8658 ГГц для образца препарата Феррум Лек.
2.2.6 Измерение магнитных свойств
Измерение магнитных свойств образцов выделенного ферритина печени человека и его
фармацевтических аналогов Мальтофер® и Феррум Лек, а также образцов тканей печени и
75
селезенки в норме и при некоторых злокачественных заболеваниях системы крови было
проведено на SQUID-магнетометре MPMS-5S (Quantum Design) совместно с профессором И.
Фелнером (Prof. I. Felner) в the Hebrew University, Jerusalem, Israel. Дифференциальная
чувствительность магнетометра составила 10–7 эме. До измерения каждой кривой ZFC
магнетометр настраивался таким образом, чтобы значение поля действительно было нулевым.
Образцы весом 6–14 мг помещались в желатиновые капсулы и измерялись в диапазоне
температур от 5 до 300 К при различных значениях магнитного поля. После охлаждения
образцов до необходимой температуры включалось магнитное поле для измерения различных
кривых ZFC. Кривые FC измерялись при нагревании. Также проводились измерения при
постоянной температуре в переменном магнитном поле в диапазоне от 0 до 16 кЭ.
2.2.7 Мессбауэровская спектроскопия
Мессбауэровские спектры исследуемых образцов были измерены с высоким и низким
скоростным разрешением в зависимости от поставленных задач. Мессбауэровские спектры с
низким скоростным разрешением измерялись на мессбауэровском спектрометре типа KFKI с
APD криостатом замкнутого цикла при 40 и 20 К, а также на спектрометре Wissel MDU-1200 с
наливным азотным криостатом при 83 К совместно с профессором Э. Кузманном (E. Kuzmann)
в Eötvös Loránd University, Budapest. В обоих спектрометрах использовался опорный сигнал
скорости треугольной формы, сформированный цифроаналоговым преобразователем (ЦАП) с
дискретизацией на 1024 шага (по 512 шагов на прямой и обратный ход движения). Измерения
проводились в геометрии пропускания с движущимся источником. Каждый спектр
регистрировался многоканальным анализатором с увеличенным в 2 раза временным окном по
сравнению с временем, приходящимся на 1 шаг скорости, формируемым ЦАП. В результате
происходило накопление спектра в 256 каналов памяти анализатора, как для прямого, так и для
обратного хода движения. Для исключения искажения линии поглощения в результате
процедуры фолдинга (сложения с инверсией двух частей спектра, измеренных на прямом и
обратном ходе) аппроксимация проводилась только на спектрах, измеренных на прямом ходе
движения (учитывалось только 250 каналов). Источник излучения –
57
Со мощностью ~1,8×109
Бк в родиевой матрице (Ritverc GmbH, Санкт-Петербург) – находился при комнатной
температуре.
Статистический
набор
в
спектрах
выделенного
ферритина
и
его
фармацевтических аналогов, измеренных на спектрометре KFKI составил 1,6×105 – 1,6×106
импульсов в канале, соотношение сигнал-шум составило от 31 до 55. Статистический набор в
спектрах, измеренных на спектрометре Wissel MDU-1200, составил 9,3×106 импульсов в канале,
соотношение сигнал-шум – 93 для выделенного ферритина и 8,8×105 импульсов в канале,
76
соотношение сигнал-шум – 300 для препарата Феррум Лек.
Измерения
спектров
с
высоким
скоростным
разрешением
проводились
на
автоматизированном прецизионном мессбауэровском спектрометрическом комплексе с
высоким скоростным разрешением, созданном на базе высокоточного мессбауэровского
спектрометра СМ–2201 (совместная разработка сотрудников УрФУ, Екатеринбург и Института
аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург) и модернизированного криостата с
движущимся поглотителем с диапазоном температур 295–90 К (криостат – разработка НИИ
физики Южного федерального университета, Ростов-на-Дону). В спектрометре СМ-2201
реализована принципиально новая система доплеровской модуляции с опорным сигналом
скорости
пилообразной
формы,
который
формируется
двенадцатиразрядным
ЦАП
(дискретизация скоростной шкалы на 4096 шагов, т.е. с рекордно высоким скоростным
разрешением) путем 11-кратного интегрирования функций Уолша на периодическом
временном интервале в 64 мс. Также отличительной особенностью такой системы
доплеровской модуляции является использование цифро-аналоговой системы автоматического
регулирования скорости движения комбинированного типа. В результате были достигнуты
следующие характеристики системы доплеровской модуляции при измерении спектров
стандартного поглотителя α-Fe на 4096 каналов: шум сигнала скорости спектрометра составлял
1,5×10–3 мм/с, дрейф положения нулевой скорости был ±2,6×10–3 мм/с, нелинейность сигнала
скорости
составляла
0,01 %,
систематическая
ошибка
установки
скорости
0,025 %,
температурный дрейф сигнала скорости 2,5×10–6 мм/с/ºС (при измерении спектров в меньшем
скоростном диапазоне значения этих ошибок существенно меньше). Наилучший контроль
изменения температуры в криостате составил ±0,2 К (см. рисунок 2.1).
Рисунок 2.1 – Наилучший контроль изменения температуры в криостате при 90 К.
77
Новая система доплеровской модуляции позволяет делать меньший шаг приращения
скорости (V в мм/с на канал) по сравнению с большинством известных спектрометров с низким
скоростным разрешением, позволяющим регистрировать спектры в 256 и 512 каналов, что
позволяет производить более точную настройку в резонанс и проводить более корректную
аппроксимацию многокомпонентных спектров. Более детальное описание мессбауэровского
спектрометрического комплекса приведено в [209, 210, 214]. Спектры измерялись в режиме
постоянного ускорения с движущимся поглотителем в криостате. Данная геометрия
эксперимента исключала параболическое искажение базовой линии спектра и вклад в спектр от
ядер 57Fe в бериллиевом окне сцинтилляционного детектора при пилообразной форме опорного
сигнала скорости. В качестве источников мессбауэровского излучения использовались
источники фирмы Ritverc Gmbh (Санкт-Петербург) 57Со в матрицах хрома или родия начальной
активностью 1,8×109 Бк, которые находились при комнатной температуре. Амплитудные
спектры источника
57
Со(Rh) без поглотителя, с поглотителем – препаратом Мальтофер®, с
криостатом и образцом ферритина в криостате приведены на рисунке 2.2. Видно, что как
ферритин, так и его аналоги являются естественным фильтром рентгеновского излучения с
энергией 6,4 кэВ, что улучшает качество регистрации резонансного γ-излучения с энергией 14,4
кэВ.
НОМЕР КАНАЛА
НОМЕР КАНАЛА
6.4
кэВ
14.4
кэВ
бб
ЧИСЛО ИМПУЛЬСОВ
ЧИСЛО ИМПУЛЬСОВ
аа
вв
6.4
кэВ
14.4
кэВ
6.4
кэВ
14.4
кэВ
Рисунок 2.2 – Амплитудные спектры источника 57Со(Rh): а – без поглотителя, б – с
поглотителем – препаратом Мальтофер® и в – с криостатом () и образцом ферритина в
криостате ().
Длительность измерений составила до двух недель для образцов выделенного ферритина
и его фармацевтических аналогов и от двух до четырех недель для тканей. Статистический
набор в спектрах ферритина, измеренных в 4096 каналов в диапазоне температур 295–90 К
составил от ~8,3×105 до ~2,0×106 импульсов в канале, соотношение сигнал-шум составило от 51
78
до 100. Статистический набор в спектрах аналогов ферритина: препаратов Феррум Лек,
Мальтофер® и Имферон, измеренных в 4096 каналов диапазоне температур 295–90 К и
представленных на 4096 (Феррум Лек, Мальтофер®) и 2048 каналов (Имферон), составил от
~1,7×105 до ~6,3×105 импульсов в канале, соотношение сигнал-шум составило от 20 до 141.
Мессбауэровские спектры ферритина бактерий 1 и 2 были измерены при 295 К в 4096 каналов и
представлены на 2048 каналов для получения статистики от ~5,2×106 до ~6,4×106 импульсов в
канале и соотношения сигнал шум от 21 до 27. В мессбауэровских спектрах тканей селезенки и
печени человека, измеренных при 295 К и представленных на 2048 каналов, статистический
набор составил от ~2,5×106 до ~14,0×106, а соотношение сигнал-шум от 8 до 22.
Мессбауэровские спектры тканей селезенки и печени кур, были измерены при 295 К и
представлены на 2048 каналов, статистический набор составил от ~1,7×106 до ~4,0×106, а
соотношение сигнал шум – от 10 до 13.
Аппроксимация измеренных спектров осуществлялась с использованием программы
Univem-MS (разработка НИИ физики Южного федерального университета, Ростов-на-Дону) по
методу наименьших квадратов с использованием линий лоренцевой формы. В результате
аппроксимации проводилась оценка следующих мессбауэровских параметров: ширины линий
(Γ), изомерного сдвига (δ), квадрупольного расщепления (∆ЕQ), квадрупольного сдвига (ε) для
магнитно расщепленных спектров, сверхтонкого магнитного поля (Heff), интенсивности линий,
величины эффекта, относительной площади компонент спектров (S) и нормализованного
статистического критерия (χ2). Качество аппроксимации спектров оценивалось по виду
дифференциальных спектров, величин χ2 и по оценке физического смысла параметров. На всех
мессбауэровских спектрах дифференциальные спектры приводятся снизу. Чтобы оценить
статистически достоверное изменение величины χ2 при переходе от одной модели
аппроксимации к другой используется величина стандартного отклонения χ2 (σ), определяемая
по формуле:
σ=
2( N − m − 1)
,
N − m −1
(5)
где N – число точек в спектре, m – число варьируемых параметров. Если, например, величины
χ2 для двух последовательных моделей аппроксимации спектра с разным числом компонент
отличаются больше, чем на величину σ, то введение в модель новой компоненты считается
статистически обоснованным и т.д. В конечном итоге принимается модель с наименьшим
значением χ2 при условии, что предыдущее значение χ2 отличалось не меньше, чем на величину
79
σ. Для спектров, измеренных в 4096 каналов, σ=0,022, для спектров, измеренных в 2048
каналов, σ=0,031.
Для
калибровки
скоростной
шкалы
спектрометра
использовались
следующие
стандартные поглотители: фольга α-Fe толщиной 10 мкм для скоростного диапазона V>±8 мм/с
и нитропруссид натрия (SNP) с толщиной (поверхностной плотностью) 5 и 10 мг Fe/см2 для
скоростного диапазона V~±2,5 мм/с. Мессбауэровские спектры стандартных поглотителей,
измеренные на разных спектрометрах и аппроксимированные одной компонентой с лоренцевой
формой линии, приведены на рисунке 2.3, а ширины линий этих спектров – в таблице 2.1. Все
изомерные сдвиги приводятся относительно α–Fe при 295 К.
а
б
в
г
д
е
Рисунок 2.3 – Мессбауэровские спектры стандартных поглотителей: SNP 5 мг Fe/см2 (а, в), SNP
10 мг Fe/см2 (б, г) и α-Fe (д, е), измеренные при комнатной температуре с высоким скоростным
разрешением на спектрометре СМ-2201 (а, б, д) и низким скоростным разрешением на
спектрометре KFKI (в, е) и Wissel (г).
80
Необходимо отметить, что для мессбауэровских спектров одних и тех же стандартных
образцов, измеренных на разных спектрометрах, величина резонансного эффекта оказалась
различной (см. рисунок 2.3 и таблицу 2.1). Поскольку используемые источники имели
примерно одинаковую активность и были изготовлены одним производителем, это связано с
отличиями в системе регистрации γ-квантов. Прежде всего,
играет роль толщина
сцинтилляционного кристалла NaI(Tl), которая в детекторе спектрометра СМ-2201 составляет
0,1 мм, в то время как для спектрометра KFKI его толщина примерно в пять раз больше. Кроме
того у разных спектрометров качественно отличаются системы регистрации. Поэтому величина
резонансного эффекта в мессбауэровских спектрах исследуемых образцов, измеренных на
спектрометре СМ-2201, больше, чем на других использованных спектрометрах. Ранее в работе
[177] было показано с помощью стандартных поглотителей SNP с толщинами от 1 до 10 мг
Fe/см2, что уширение линии с увеличением толщины поглотителя носит линейный характер, а
сами линии имеют лоренцевую форму. Это свидетельствовало о том, что исследуемые образцы
с толщинами до 10 мг Fe/см2 включительно могут аппроксимироваться линиями лоренцевой
формы. Оценки ширин линий мессбауэровских спектров стандартных поглотителей SNP
толщиной 5 и 10 мг Fe/см2, измеренных на спектрометре СМ-2201, имеют небольшое отличие,
обусловленное разной толщиной образца (см. таблицу 2.1), и линии лоренцевой формы (см.
рисунок 2.3 а, б), что также свидетельствует о допустимости аппроксимации мессбауэровских
спектров исследуемых образцов толщиной 10 мг Fe/см2 линиями лоренцевой формы и
отсутствии необходимости использования интеграла пропускания.
Таблица 2.1 – Параметры аппроксимации мессбауэровских спектров стандартных
поглотителей, измеренных на трех спектрометрах, используемых в работе.
Характеристики стандартного
поглотителя
SNP 5 мг Fe/см2
V, мм/с на канал
Γ, мм/с
Эффект, %
SNP 10 мг Fe/см2
V, мм/с на канал
Γ, мм/с
Эффект, %
α-Fe
V, мм/с на канал
Γ1,6, мм/с
Γ2,5, мм/с
Γ3,4, мм/с
Эффект, %
СМ-2201
4096 каналов
Спектрометр
KFKI
250 каналов
0,001
0,231±0,002
12,3±0,3
0,03
0,23±0,05
3,8±0,3
0,001
0,247±0,002
17,840
0,02
0,36±0,05
7,8±0,3
0,004
0,250±0,008
0,243±0,008
0,233±0,008
16,1±0,5
0,11
0,29±0,22
0,27±0,22
0,27±0,22
13,7±0,2
Wissel
256 каналов
0,02
0,28±0,04
7,7±0,4
81
Поскольку известно, что левый пик мессбауэровских спектров ферритина и его аналогов
в парамагнитном состоянии находится в области нулевой скорости, была проведена оценка
скоростного участка вблизи ноля скоростей для спектрометра СМ-2201 с использованием
феррицианида калия толщиной 5 мг Fe/см2. Мессбауэровский спектр феррицианида калия,
измеренный при 295 К в 4096 каналов, приведен на рисунке 2.4. Этот спектр наилучшим
образом аппроксимируется квадрупольным дублетом с линией лоренцевой формы шириной
0,244±0,003 мм/с, что свидетельствует о нелинейности сигнала скорости вблизи ноля в
пределах указанных выше характеристик спектрометра.
Рисунок 2.4 – Мессбауэровский спектр феррицианида калия, измеренный на спектрометре СМ2201 в 4096 каналов при Т=295 К.
В соответствии с работой [214] инструментальная (систематическая) ошибка для каждой
точки спектра составляет ±0,5 канала, при определении параметров сверхтонкой структуры – ±1
канал, при определении ширины линии – ±2 канала. Скоростное разрешение для спектрометра
KFKI для скоростного диапазона V=±12 мм/с составило ~0,11 мм/с на канал, для скоростного
диапазона V=±3 мм/с составило ~0,03 мм/с на канал, для спектрометра Wissel ~0,02 мм/с в
скоростном диапазоне V=±2,5 мм/с. Для спектрометра СМ-2201 скоростное разрешение для
V=±2,5 мм/с составило ~0,005 мм/c при представлении на 1024 канала, ~0,003 мм/c при
представлении на 2048 каналов и ~0,002 мм/c при представлении на 4096 каналов, а для V=±8
мм/с составило ~0,004 мм/с на канал при представлении на 4096 каналов.
В данной работе при аппроксимации мессбауэровских спектров вышеуказанным
методом используется два подхода. Первый подход – аппроксимация спектров одной
(парамагнитной или магнитной) компонентой. В этом случае не учитываются особенности
структуры «железных ядер» и предполагается гомогенное «железное ядро». Данный подход
82
является грубым, но он необходим для визуализации результатов в первом приближении, а
также для сравнения результатов с данными, полученными другими авторами. Второй подход –
аппроксимация суперпозицией нескольких парамагнитных и/или магнитных компонент,
предполагающая сложное строение «железного ядра» с наличием нескольких областей,
отличающихся между собой по каким-либо характеристикам.
2.3 Выводы
1. Методы подготовки выделенного ферритина печени человека, фармацевтических
препаратов, являющихся аналогами ферритина, бактерий, содержащих ферритин, и тканей
селезенки и печени человека и кур в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови
позволяют
получать
требуемые
образцы
для
проведения
достоверных
измерений
мессбауэровских спектров.
2. Выбранные методы: TEM, SEM, EDS, XRD, ЭПР, термогравиметрия, магнитные
измерения – позволяют провести дополнительный анализ исследуемых образцов.
3. С помощью стандартных поглотителей проведена оценка качества мессбауэровских
спектрометров СМ-2201, KFKI и Wissel, использованных в исследовании, приведены их
некоторые характеристики.
4. Используемые мессбауэровские спектрометры позволяют проводить измерения
исследуемых объектов в пределах точности измерений спектрометров с высоким и низким
скоростным
разрешением,
соответственно.
Использование
мессбауэровского
спектрометрического комплекса с высоким скоростным разрешением позволяет проводить
измерения с наилучшим качеством и точностью.
83
3 МЕССБАУЭРОВСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ НАНОРАЗМЕРНЫХ «ЖЕЛЕЗНЫХ
ЯДЕР» МАКРОМОЛЕКУЛ ФЕРРИТИНА И ИХ АНАЛОГОВ
В данной главе рассмотрены результаты изучения макромолекул ферритина и его
аналогов методом мессбауэровской спектроскопии при температурах 295, 90, 40 и 20 К, а также
методами TEM, SEM, EDS, XRD, ЭПР, термогравиметрии и магнитометрии.
3.1 TEM, SEM, XRD и термогравиметрия наноразмерных «железных ядер»
макромолекул ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов
Мальтофер® и Феррум Лек.
Образцы аналогов ферритина – фармацевтических препаратов Мальтофер® и Феррум
Лек,
были
исследованы
методом
сканирующей
электронной
микроскопии
с
энергодисперсионной спектроскопией, с помощью которой был оценен их химический состав
[215]. На примере SEM изображения образца препарата Мальтофер® при увеличении ×600
(рисунок. 3.1) хорошо видны агломераты макромолекул. Наличие полимальтозной оболочки,
обладающей достаточной толщиной, исключает взаимодействия между «железными ядрами» из
разных молекул Мальтофера®, несмотря на агломерацию макромолекул.
Рисунок 3.1 – Изображение препарата Мальтофер®, полученное методом SEM [215].
Энергодисперсионные спектры образцов препаратов Мальтофер® и Феррум Лек
показаны на рисунке 3.2, а результаты химического анализа приведены в таблице 3.1.
Относительный вес химических элементов оказался различным для этих препаратов, хотя
содержание железа в каждой таблетке было одинаковым по данным изготовителя.
84
Рисунок 3.2 – Энергодисперсионные спектры препаратов Феррум Лек (а) и Мальтофер® (б)
[215].
Таблица 3.1– Химический состав препаратов Феррум Лек и Мальтофер® по данным EDS
[217].
Элемент
C
O
Na
Mg
Si
Cl
Fe
Итого
Феррум Лек
Вес %
σ (уд.вес%)
27.86
0.38
40.94
0.37
1.57
0.06
0.61
0.04
0.80
0.05
3.22
0.09
24.99
0.53
100
Элемент
C
O
–
–
Na
Cl
Fe
Итого
Мальтофер®
Вес %
σ (уд.вес%)
22.13
0.50
36.16
0.45
–
–
–
–
2.55
0.09
5.24
0.15
33.92
0.66
100
На рисунке 3.3 а показано изображение «железных ядер» ферритина, полученное с
помощью трансмиссионной электронной микроскопии. На этом изображении «железные ядра»
сферической формы видны в виде более темных пятен. Для пятидесяти «железных ядер»
макромолекул ферритина был определен диаметр, распределение значений которого показано
на рисунке 3.3 б. На основании этого распределения был оценен средний диаметр «железных
ядер» ферритина, который составил ~4,8 нм. На рисунке 3.4 приведены TEM-изображения
препаратов Феррум Лек и Мальтофер®. Наличие различных ингредиентов в фармацевтических
препаратах затруднило более четкую идентификацию «железных ядер» в этих образцах.
85
Однако, форма предполагаемых «железных ядер» данного препарата Феррум Лек (рисунок 3.4
б) согласуется с овальной формой «железных ядер» (средний диаметр ~6 нм) препарата Феррум
Лек в водном растворе, показанной в работе [48]. Следует отметить, что морфология «железных
ядер» макромолекул ферритина и его аналогов отличается. Изображение бактерий, содержащих
КОЛИЧЕСТВО ЧАСТИЦ
макромолекулы ферритина, полученное с помощью TEM, приведено на рисунке 3.5.
а
ДИАМЕТР, нм
б
Рисунок 3.3 – Изображение ферритина, полученное методом TEM (а) и распределение по
размерам (диаметрам), полученное для 50 «железных ядер» ферритина (б) [215].
а
б
Рисунок 3.4 – Изображения препаратов Мальтофер® (а) и Феррум Лек (б), полученные с
помощью TEM [215].
86
Рисунок 3.5 – Изображение бактерий вида Azospirillum brasilense (штамм Sp245), полученное
методом ТЕМ [216].
При
исследовании
образца
выделенного
ферритина
печени
человека
методом
рентгеновской дифракции была получена сложная фазовая композиция из-за наличия большого
количества кристаллизованных солей в образце ферритина (рисунок 3.6 а). Отмеченные
рефлексы ферригидрида, совпадающие с некоторыми пиками малой интенсивности в спектре
рентгеновской дифракции ферритина, указывают на то, что «железные ядра» содержат железо в
форме ферригидрита. Рентгенограммы образцов препаратов Феррум Лек и Мальтофер® также
демонстрируют сложную фазовую композицию из-за состава фармацевтических препаратов
(рисунок 3.6 б, в). Указанные рефлексы акагенита соответствуют некоторым пикам в спектрах
рентгеновской дифракции данных образцов, что свидетельствует о том, что их «железные ядра»
находятся в форме акагенита. Можно отметить некоторые отличия между рентгенограммами
двух железо-полимальтозных комплексов, которые могут быть обусловлены различиями в
Ф
Ф
Ф
2 Θ, °
Ф
2 Θ,
б
AA
A
A
A
ИНТЕНСИВНОСТЬ, имп.
а
ИНТЕНСИВНОСТЬ,
ИНТЕНСИВНОСТЬ,имп.
имп.
ИНТЕНСИВНОСТЬ, имп.
составе этих препаратов.
2 Θ, °
A
2 Θ,
A
в
A
A
2 Θ, °
Рисунок 3.6 – Рентгенограммы образцов ферритна печени человека (а) и его аналогов –
препаратов Феррум Лек (б) и Мальтофер® (в). Рефлексы, отмеченные стрелками,
соответствуют ферригидриту (Ф) и акагениту (А) [215].
При исследовании образцов методом термогравиметрии были получены кривые теплового
потока и потери массы, которые визуально отличаются для исследуемых образцов (см. рисунок
87
3.7). Далее была определена остаточная масса вещества, которая составила ~35 % для образца
выделенного ферритина печени человека и ~25 % и ~23 % для его аналогов – препаратов
Феррум Лек и Мальтофер®, соответственно. Результаты термогравиметрии в дальнейшем
будут использованы для магнитных измерений.
в
Мальтофер®
МАССА, %
Ферум Лек
ТЕПЛОВОЙ ПОТОК, Вт/г
Ферритин
ТЕМПЕРАТУРА, °С
Рисунок 3.7 – Кривые теплового потока и потери массы вещества образцов ферритна печени
человека (а) и препаратов Феррум Лек (б) и Мальтофер® (в) [215].
3.2 ЭПР и магнитометрия наноразмерных «железных ядер» макромолекул
ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер® и Феррум
Лек.
ЭПР спектры выделенного ферритина печени человека и его аналогов – препаратов
Мальтофер® и Феррум Лек приведены на рисунке 3.8. ЭПР спектр выделенного ферритина
печени человека демонстрирует уширенный пик поглощения вблизи g≈2, что согласуется с
ранее полученными данными для ферритина селезенки лошади [96] и человека [93]. Уширение
спектра может происходить в результате суперпарамагнитной релаксации наноразмерных
«железных ядер», которая приводит к значительному уменьшению анизотропии поля и зависит
от размера частиц, энергии анизотропии и температуры. Тогда при одной и той же температуре
частиц одного вида («железные ядра»), но разного объема энергия их магнитной анизотропии
будет отличаться, что приведет к разбросу значений g-фактора и величины анизотропного
уширения сигнала ЭПР.
При аппроксимации ЭПР спектра выделенного ферритина печени человека одной
производной функции Лоренца были получены значения эффективного g-фактора geff≈2,04 и
полной ширины линии на половине высоты (FWHM) ∼2,3 кГ. Наилучшая аппроксимация ЭПРспектра ферритина печени человека была достигнута при использовании трех компонент.
Компонента Fa с наибольшей долей относительной площади 76,5 % имеет самое большое
расстояние между пиками экстремумов Γpp(Fa)≈2,61 кГ и соответствует теоретической модели
для порошкового образца, содержащего частицы, обладающие одноосной магнитной
88
анизотропией. Значения параметров, полученные для компоненты Fa, g0(Fa)≈2,1 и Γpp(Fa)≈2,61
кГ согласуются с данными, полученными для природного неорганического гетита (g0≈2,09 и
Γpp(Fa)≈2,79 кГ [217]). Для компоненты Fb с относительной долей площади ∼23,3 % были
получены следующие параметры: g0(Fb)=2,019(1) и Γpp(Fb)≈0,92 кГ, которые согласуются с
данными для биогенного магнетита (g0≈2,02 и Γpp≈0,84 кГ [217]). Появление магнетита в
«железных ядрах» ферритина согласуется с концепцией, изложенной в работе [20], согласно
которой разрушение ферригидрита приводит к образованию кристаллов магнетита в
человеческих тканях. Компонента Fc может быть сопоставлена с отдельными ионами Fe3+,
сигнал поглощения которых вблизи g ≈ 4,2 становится заметен при понижении температуры
(см. рисунок 3.9) [218].
g=2
2
Fb
Intensity / a.u.отн. ед.
ИНТЕНСИВНОСТЬ,
1
Ферритин
Ferritin
0
-1
6
4
2
0
-2
-4
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
Fc
Fa
Mb
Maltofer
Мальтофер®
Mc
Ma
FerrumЛек
Lek
Феррум
1000
2000
3000
4000
5000
6000
B /ГG
B,
7000
8000
9000 10000
Рисунок 3.8 – ЭПР спектры выделенного ферритина печени человека и его аналогов –
препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, измеренные в X-диапазоне при T ≈ 293(2) K. Синяя
линия – компоненты наилучшей аппроксимации, красная линия – результирующая кривая
аппроксимации. Вертикальной чертой обозначено значение магнитного поля, при котором g = 2
[215].
Наилучшая аппроксимация ЭПР спектра образца Мальтофер® была достигнута при
использовании трех компонент. Значения параметров для компоненты Ма, обладающей
89
наибольшей относительной площадью (~94 %), составили g0(Ma)≈2,67 и Γpp(Ma)≈2,89 кГ, что
согласуются со значениями, характерными для синтетического магнетита (g0≈2,67, Γpp≈2,74 кГ
[217]). Для компонент Мb (4 %) и Мс (2 %) были получены следующие значения параметров:
g0(Mb)≈2,32, Γpp(Mb)≈0,52 кГ и g0(Mc)≈2,90, Γpp(Mc)≈0,41 кГ.
Intensity / a.u. отн. ед.
ИНТЕНСИВНОСТЬ,
g = 4.212
270K
251K
231K
211K
190K
171K
150K
500
1000
1500
2000
2500
BB,/ GГ
Рисунок 3.9 – ЭПР спектры образца выделенного ферритина печени человека, измеренные в Xдиапазоне частот при различных температурах [215].
ЭПР спектр образца препарата Феррум Лек существенно отличается по внешнему виду
от спектров ферритина и препарата Мальтофер®. Учитывая предположение, что образец
препарата Феррум Лек представляет собой порошок из частиц, близких по размерам, спектр
был аппроксимирован наилучшим образом моделью кубической магнитной анизотропии, а не
одноосной. Значения параметров, полученных при аппроксимации ЭПР спектра препарата
Феррум Лек, составили Γpp≈2,78 кГ и g0=2,145(6) и согласуются с данным для природного
неорганического гетита [219]. Теоретическая линия аппроксимации (показана красной линией
90
на рисунке 3.8 в) обладает следующими значениями параметров: geff≈1,945, Ba,eff≈–2,16 кГ и
FWHM ∼2,45 кГ.
Кривые намагниченности ZFC и FC ферритина печени человека и его аналогов,
показанные на рисунке 3.10, согласуются с ранее полученными данными (например, в работе
[114, 122]). Изотермические кривые намагниченности были измерены для двух железополимальтозных комплексов и имеют схожий вид (рисунок 3.11). Значения коэрцитивной силы
при 5 К составили минус 400 Э для препарата Феррум Лек и минус 440 Э для препарата
Мальтофер®. Эти значения и вид кривых также согласуются с данными, полученными ранее
для других ферритинов [110, 114]. Изотермические кривые намагниченности демонстрируют
плавный наклон кривых без выхода на насыщение магнитного момента (рисунок 3.11). Такой
вид кривых намагниченности обусловлен суперпозицией суперпарамагнитной компоненты и
дополнительной линейной (парамагнитной или суперантиферромагнитной) компоненты,
характерной для «железных ядер» ферритина и его аналогов. Присутствие линейной
компоненты ранее объяснялось на основе нескольких моделей [109, 110, 115–118] (см. Глава 1,
п. 1.1).
Ферритинa
H=240 Oe
Н=240
Э
b
Мальтофер®
FC
H=95Oe
Н=95 Э
ZFC
ZFC
ТЕМПЕРАТУРА, К
ТЕМПЕРАТУРА, К
Феррум Лек
c
FC
МОМЕНТ, эме/г
FC
МОМЕНТ, эме/г
МОМЕНТ, эме/г
,
H=100Oe Э
Н=100
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 3.10 – Кривые ZFC и FC для выделенного ферритна печени человека и его аналогов –
препаратов Мальтофер® и Феррум Лек [215].
Мальтофер®
T=150 K
T=300 К
Мальтофер®
T=150
T=300
PM
M =0.793 emu/g
M
S=0,793
s
e
d
ПОЛЕ, Э
T=5
T=5 K
МОМЕНТ, эме/г
T=5 K
МОМЕНТ, эме/г
МОМЕНТ, эме/г
Феррум Лек
ПОЛЕ, Э
f
ПОЛЕ, Э
Рисунок 3.11 – Зависимость удельного магнитного момента от значений поля для препаратов
Феррум Лек (а) и Мальтофер® (б, в). PM – парамагнитная линейная компонента, Ms –
магнитный момент насыщения [215].
91
3.3 Особенности структуры наноразмерных «железных ядер» ферритина и его
аналогов по данным мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным
разрешением при 295 и 90 K
Месбауэровские спектры выделенного ферритина печени человека и его аналогов –
препаратов Имферон, Мальтофер® и Феррум Лек, а также бактерий, содержащих ферритин,
измеренные с высоким скоростным разрешением при 295 и 90 К имеют вид парамагнитного
дублета, характерный для «железных ядер» этих образцов при указанных температурах.
Спектры были аппроксимированы двумя способами в рамках моделей гомогенного и
гетерогенного «железного ядра», соответственно.
3.3.1 Аппроксимация мессбауэровских спектров на основе гомогенной модели
«железного ядра»
Аппроксимация мессбауэровских спектров ферритина печени человека и его аналогов, а
также бактерий, содержащих ферритин, измеренных при 295 и 90 К, на основе грубой модели
гомогенного «железного ядра» была проведена одним квадрупольным дублетом (рисунки 3.12
и 3.13). Оценки мессбауэровских параметров приведены в таблице 3.2, а отличия значений
параметров сверхтонкой структуры – на рисунке 3.14. Полученные отличия в параметрах
сверхтонкой структуры свидетельствуют о том, что даже в грубом приближении можно
выявить различия в структуре «железных ядер» при сравнении, например, ферритинов человека
и бактерий, ферритинов бактерий образцов 1 и 2 [216, 219], а также ферритинов и их
фармацевтических аналогов [220–229]. Большие значения ∆EQ (большее значение градиента
электрического поля (ГЭП) на ядре 57Fe) и Г для бактериального ферритина свидетельствуют о
менее плотной упаковке атомов Fe и O «железных ядер» по сравнению с ферритином печени
человека. Известно, что «железные ядра» бактериального ферритина содержат больше
неорганических фосфатов, чем «железные ядра» ферритина млекопитающих [3, 13, 22], что
приводит к уменьшению степени кристалличности «железного ядра». Меньшие значения δ для
ферритина печени человека по сравнению с бактериальным ферритином могут указывать на
менее плотную упаковку атомов Fe и O в «железном ядре» последнего. Также малые отличия
параметров сверхтонкой структуры для мессбауэровских спектров образцов ферритинов
бактерий 1 и 2 могут быть связаны с отличиями в условиях выращивания, которые могли
повлиять на формирование структуры «железных ядер».
92
Ферритин
4096
каналов
Феррум Лек
4096
каналов
Бактерии 1
2048
каналов
2048
каналов
Имферон
Мальтофер®
Бактерии 2
4096
каналов
2048
каналов
Рисунок 3.12 – Мессбауэровские спектры выделенного ферритина печени человека, препаратов
Имферон, Феррум Лек и Мальтофер® [211], бактерий A. brasilense (штамм Sp245) образец 1 и
образец 2 [216], измеренные с высоким скоростным разрешением при 295 К.
Ферритин
4096
каналов
Феррум Лек
4096
каналов
Мальтофер®
4096
каналов
Рисунок 3.13 – Мессбауэровские спектры выделенного ферритина печени человека и его
аналогов – препаратов Феррум Лек и Мальтофер®, измеренные с высоким скоростным
разрешением при 90 К [230].
93
Таблица 3.2 – Параметры мессбауэровских спектров ферритинов и их аналогов,
полученные при аппроксимации в рамках модели гомогенного «железного ядра» [216, 230].
Образец
Т, К
δ, мм/с
∆EQ, мм/с
Г, мм/с
Ферритин печени человека
295
90
295
295
295
295
90
295
90
0,371±0,002
0,481±0,001
0,385±0,004
0,388±0,003
0,354±0,002
0,368±0,001
0,470±0,001
0,367±0,001
0,470±0,001
0,679±0,002
0,703±0,001
0,751±0,004
0,730±0,002
0,704±0,002
0,720±0,001
0,756±0,001
0,718±0,001
0,752±0,001
0,436±0,003
0,509±0,002
0,523±0,008
0,529±0,008
0,522±0,004
0,428±0,002
0,531±0,002
0,423±0,002
0,506±0,002
Ферритин бактерий 1
Ферритин бактерий 2
Имферон
Мальтофер®
Феррум Лек
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
0,746
Бактерии 1
0,736
295 К
Бактерии 2
0,726
Мальтофер®
Феррум Лек
0,716
Имферон
0,706
9090КК
295 К
0,696
0,686
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
295 К
Мальтофер®
Феррум Лек
0,750
0,740
0,730
0,720
0,710
Ферритин
Ферритин
0,676
0,350
0,360
0,370
0,380
0,390
0,700
0,467
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
0,472
0,477
0,482
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 3.14 – Отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
ферритина печени человека, ферритина бактерий и препаратов Имферон, Мальтофер®, Феррум
Лек [216, 230–232].
Выявленные отличия в параметрах сверхтонкой структуры «железных ядер» для
железо-декстранового комплекса Имферон и двух железо-полимальтозных комплексов Феррум
Лек и Мальтофер® могут быть связаны с небольшими различиями в структуре «железных
ядер», обусловленными разными условиями их приготовления. Значения параметров
94
сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров исследуемых в настоящей работе образцов,
полученные в рамках модели гомогенного «железного ядра», оказались сравнимы с
результатами, ранее полученными другими авторами (см. таблицу 1.3 и указанные в ней ссылки
на соответствующие работы).
Следует отметить, что при аппроксимации мессбауэровских спектров исследованных
образцов одним квадрупольным дублетом в рамках грубой модели гомогенного «железного
ядра» вид дифференциальных спектров (показаны на рисунках 3.12 и 3.13 под каждым
спектром) указывает на недостаточное качество аппроксимации спектров. Изменение качества
аппроксимации мессбауэровских спектров ферритинов и их аналогов при увеличении числа
компонент в спектре можно продемонстрировать на примере аппроксимации мессбауэровского
спектра препарата Феррум Лек (рисунок 3.15) [232].
Рисунок 3.15 – Оценка наилучшей аппроксимации мессбауэровского спектра образца Феррум
Лек, измеренного в 4096 каналов при Т=295 К [232].
95
При последовательном увеличении числа квадрупольных дублетов от одного до пяти
происходит заметное уменьшение критерия χ2 на величину больше σ=0,022 и улучшение вида
дифференциального спектра. Однако, при добавлении шестого квадрупольного дублета не
происходит изменение значения χ2 больше, чем σ, а также не наблюдается изменение
дифференциального спектра. Поэтому в данном случае можно принять в качестве наилучшей
аппроксимации данного мессбауэровского спектра суперпозицию пяти квадрупольных
дублетов. Мессбауэровские спектры всех исследуемых образцов в дальнейшем были
аппроксимированы аналогичным способом в рамках гетерогенной модели «железного ядра» с
достижением наилучшей аппроксимации при использовании суперпозиции различного числа
компонент.
3.3.2 Аппроксимация мессбауэровских спектров на основе модели гетерогенного
«железного ядра».
Аппроксимация
гетерогенной
использовалась
модели
мессбауэровских
«железного
суперпозиция
спектров
ядра»
нескольких
исследуемых
проводилась
образцов
следующим
квадрупольных
на
образом.
дублетов
со
основе
Сначала
свободным
варьированием параметров до достижения наилучшей аппроксимации (значения параметров см.
в таблице 3.3) [230–234]. При данной аппроксимации каждый квадрупольный дублет можно
было бы связать с определенной областью или слоем в наноразмерном «железном ядре».
Однако при анализе этих результатов возникают вопросы, связанные с объяснением причин
существенного изменения значений относительных площадей и ширин линий, а также
разнонаправленного изменения величины ∆EQ для одинаковых компонент спектра при
понижении температуры от 295 до 90 К. Поэтому для аппроксимации спектров в рамках модели
«гетерогенного железного» ядра была рассмотрена согласованная модель, в которой задавалось
условие близости значений площадей соответствующих компонент спектров, измеренных при
разных
температурах.
Данное
условие
достигалось
фиксацией
ширин
линий
или
интенсивностей для некоторых компонент. При 295 К наилучшая аппроксимация спектра
образца выделенного ферритина печени человека была достигнута при суперпозиции четырех
квадрупольных дублетов, препарата Имферон – при суперпозиции трех квадрупольных
дублетов, препаратов Мальтофер® и Феррум Лек – при суперпозиции пяти квадрупольных
дублетов. При 90 К наилучшая аппроксимация спектров этих образцов была проведена таким
же числом компонент (см. рисунок 3.16) за исключением мессбауэровского спектра препарата
Имферон, в котором при 90 К наблюдалась магнитная компонента (этот результат будет
обсуждаться далее в п.п 3.4).
96
Таблица 3.3 – Мессбауэровские параметры, полученные в результате наилучшей
аппроксимации спектров исследуемых образцов моделью гетерогенного «железного ядра» при
свободном варьировании мессбауэровских параметров [234].
N1
δ, мм/с
Г, мм/с
∆ЕQ, мм/с
1
0,370±0,002
0,470±0,002
0,340±0,005
2
0,365±0,002
0,702±0,002
0,270±0,005
3
0,361±0,002
0,957±0,002
0,281±0,005
4
0,359±0,002
1,274±0,002
0,338±0,005
Ферритин
90
1
0,485±0,003
0,393±0,051
0,365±0,036
2
0,479±0,002
0,638±0,033
0,353±0,069
3
0,468±0,003
0,941±0,031
0,391±0,061
4
0,457±0,006
1,302±0,077
0,444±0,059
295
1
0,359±0,002
0,469±0,002
0,294±0,005
2
0,363±0,002
0,666±0,002
0,272±0,005
3
0,355±0,002
0,857±0,002
0,272±0,005
4
0,350±0,002
1,073±0,002
0,272±0,005
5
0,331±0,002
1,338±0,002
0,240±0,005
Мальтофер®
90
1
0,452±0,003
0,329±0,011
0,294±0,012
2
0,477±0,003
0,519±0,003
0,306±0,005
3
0,463±0,003
0,751±0,003
0,366±0,005
4
0,457±0,003
1,017±0,005
0,478±0,005
5
0,400±0,003
1,450±0,008
0,338±0,011
295
1
0,354±0,002
0,428±0,002
0,287±0,003
2
0,358±0,002
0,635±0,002
0,305±0,003
3
0,352±0,002
0,862±0,002
0,252±0,003
4
0,336±0,002
1,116±0,002
0,277±0,003
5
0,338±0,002
1,443±0,004
0,305±0,005
Феррум Лек
90
1
0,488±0,002
0,363±0,008
0,304±0,009
2
0,472±0,002
0,582±0,002
0,301±0,004
3
0,467±0,002
0,831±0,002
0,311±0,004
4
0,462±0,002
1,095±0,005
0,325±0,009
5
0,432±0,002
1,378±0,012
0,515±0,012
Имферон
295
1
0,350±0,003
0,406±0,003
0,307±0,006
2
0,360±0,003
0,652±0,003
0,371±0,006
3
0,344±0,003
0,977±0,003
0,498±0,006
Примечание – Номер компоненты аппроксимации мессбауэровских спектров.
Образец
Т,К
295
S, %
45
24
21
10
23
35
31
11
30
27
18
14
11
6
20
33
36
5
26
27
26
14
7
10
33
28
15
14
17
40
43
Мессбауэровские параметры, полученные в результате наилучшей аппроксимации
спектров исследуемых образцов при 295 и 90 К согласованной моделью, приведены в таблице
3.4. Результаты сравнения относительных площадей компонент мессбауэровскизх спектров
ферритина и его аналогов – препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, приведены на рисунке 3.17.
97
Феррум Лек
Т=295 К
Ферритин
Т=90 К
Феррум Лек
Т=90 К
ЭФФЕКТ, %
Т=295 К
ЭФФЕКТ, %
Ферритин
СКОРОСТЬ, мм/с
Мальтофер®
Имферон
СКОРОСТЬ, мм/с
Т=295 К
Мальтофер®
Т=90 К
Т=295 К
Рисунок 3.16 – Наилучшая аппроксимация мессбауэровских спектров выделенного ферритина
печени человека, препаратов Феррум Лек, Мальтофер® и Имферон, измеренных с высоким
скоростным разрешением при 295 К и 90 К [230–232, 234].
98
Таблица 3.4 – Мессбауэровские параметры, полученные при наилучшей аппроксимации
мессбауэровских спектров исследуемых образцов согласованной моделью [215].
Образец
Ферритин
печени
человека
Феррум Лек
Т, К
295
N1
1
2
3
4
δ, мм/с
0,374±0,001
0,372±0,001
0,366±0,001
0,360±0,001
∆EQ, мм/с
0,407±0,002
0,618±0,001
0,859±0,001
1,156±0,003
Г, мм/с
0,276±0,003
0,258±0,003
0,283±0,003
0,343±0,004
S, %
26,31
31,16
26,62
15,91
90
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
0,490±0,002
0,480±0,001
0,475±0,002
0,460±0,003
0,366±0,001
0,368±0,001
0,363±0,001
0,358±0,001
0,344±0,001
0,479±0,001
0,477±0,001
0,465±0,001
0,450±0,001
0,421±0,002
0,368±0,001
0,370±0,001
0,366±0,001
0,359±0,001
0,344±0,002
0,479±0,001
0,472±0,001
0,465±0,001
0,448±0,001
0,410±0,002
0,351±0,004
0,361±0,003
0,344±0,003
0,416±0,012
0,657±0,018
0,918±0,027
1,215±0,027
0,429±0,001
0,628±0,001
0,877±0,001
1,137±0,002
1,424±0,005
0,475±0,003
0,683±0,002
0,902±0,002
1,150±0,006
1,442±0,009
0,409±0,002
0,605±0,001
0,856±0,001
1,130±0,002
1,430±0,006
0,452±0,001
0,647±0,002
0,867±0,002
1,171±0,002
1,525±0,005
0,406±0,008
0,652±0,008
0,964±0,009
0,340±0,012
0,345±0,037
0,353±0,042
0,433±0,017
0,245±0,003
0,249±0,003
0,278±0,003
0,233±0,004
0,312±0,006
0,311±0,003
0,358±0,004
0,3962
0,3312
0,4062
0,233±0,003
0,254±0,003
0,304±0,003
0,261±0,004
0,320±0,008
0,303±0,003
0,372±0,003
0,4152
0,3392
0,4212
0,312±0,016
0,346±0,009
0,450±0,014
26,66
34,89
23,18
15,26
20,28
33,84
30,34
9,15
6,39
20,59
33,46
30,16
9,00
6,80
15,07
33,41
35,70
10,52
5,30
15,77
32,87
35,33
10,74
5,29
19,56
33,36
47,07
295
90
Мальтофер®
295
90
Имферон
295
Примечания 1 – Номер компоненты наилучшей аппроксимации мессбауэровских
спектров, приведенных на рисунке 3.16; 2 – фиксированный параметр.
Результаты аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина и его аналогов –
препаратов Мальтофер® и Феррум Лек суперпозицией нескольких квадрупольных дублетов по
согласованной
модели
соответствующего
числа
можно
интерпретировать
различных
слоев
и/или
как
наличие
областей,
в
«железных
отличающихся
ядрах»
степенью
кристалличности и плотностью упаковки оксигидроокисей железа. Например, квадрупольный
дублет с наибольшим значением ∆EQ и Г можно связать с поверхностным слоем «железных
ядер», который будет иметь наименьшую плотность упаковки. Напротив, квадрупольный
дублет с наименьшим значением ∆EQ можно связать с внутренней областью «железного ядра»,
99
имеющей наибольшую степень кристалличности и плотности упаковки. В этом случае отличия
относительных площадей соответствующих компонент спектров может быть связано с
отличием доли ассоциируемых с ними слоев и/или областей «железных ядер». Например, для
«железных ядер» препаратов Мальтофер® и Феррум Лек можно предположить отличия в доле
или размерах внутренней области с наибольшей степенью кристалличности и/или плотности
упаковки и поверхностных менее плотно упакованных слоев. Подобные отличия для этих
препаратов могут быть следствием различий в технологических процессах их приготовления
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ
RELATIVE ПЛОЩАДЬ,
AREA, % %
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ
ПЛОЩАДЬ,
RELATIVE AREA,
%%
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ
RELATIVEПЛОЩАДЬ,
AREA, % %
разными изготовителями.
40
Ферритин
30
20
10
0
1
2
3
НОМЕР КОМПОНЕНТЫ
COMPONENT
NUMBER
40
4
Мальтофер®
30
20
10
0
1
3
2
4
COMPONENT NUMBER
НОМЕР КОМПОНЕНТЫ
40
5
Феррум Лек
30
20
10
0
1
2
3
4
НОМЕР КОМПОНЕНТЫ
COMPONENT
NUMBER
5
Рисунок 3.17 – Сравнение относительных площадей компонент мессбауэровских спектров
ферритина и препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, полученных в результате наилучшей
аппроксимации спектров согласованной моделью при 295 К () и 90 К () [215].
100
3.4
Отличие
в
величине
барьера
энергии
магнитной
анизотропии
для
наноразмерных «железных ядер» ферритина и его аналогов.
Мессбауэровские спектры всех исследованных образцов были аппроксимированы
суперпозицией парамагнитных компонент при Т=295 К и Т=90 К. Однако, при исследовании
препарата Мальтофер® (приготовлен производителем в виде раствора) в работе [70] было
обнаружено, что при 87 К в мессбауэровском спектре этого препарата помимо парамагнитной
компоненты присутствует магнитная компонента (см. рисунок 3.18 в) [70], характеризующая
суперпарамагнитное поведение наноразмерных «железных ядер» в этом препарате. Поэтому
дополнительно было проведено измерение спектров железо-полимальтозных комплексов с
высоким скоростным разрешением при 90 К в скоростном диапазоне ±12 мм/с для проверки
наличия магнитной компоненты [215, 230]. Результаты показали, что «железное ядро»
находится в парамагнитном состоянии при этой температуре (см. рисунок 3.18 а, б). Несмотря
на то, что «железные ядра» содержат ферригидрит, для которого температура Нееля близка к
комнатной, в мессбауэровских спектрах при 295 и 90 К не наблюдается магнитных компонент.
Поэтому
появление
магнитной
компоненты
в
мессбауэровском
спектре
железо-
полимальтозного комплекса, измеренном ранее в работе [70] при Т=87 К, может
свидетельствовать о более высоком барьере энергии магнитной анизотропии «железных ядер» в
этом образце препарата Мальтофер® вследствие большего объема «железного ядра» (см.
формулу (4) в главе 1) из-за различия технологии приготовления препаратов Мальтофер® в
таблетках или в растворе, либо старения препарата, приводящего к агломерации «железных
ядер» в исходном растворе. Возможность влияния старения раствора железо-полисахаридного
комплекса на энергию магнитной анизотропии была проверена на примере препарата Имферон
(промышленное приготовление в форме раствора для инъекций) с истекшим сроком годности.
На рисунке 3.19 приведены мессбауэровские спектры замороженного раствора препарата
Имферон до истечения срока годности из работы [170] и после хранения в течение десяти лет в
ампуле производителя при комнатной температуре, полученный в настоящей работе [231].
Появление интенсивных магнитных компонент во втором спектре свидетельствует об
увеличении энергии магнитной анизотропии для «железных ядер» в препарате Имферон в
результате агломерации «железных ядер» в растворе после десяти лет хранения. Наилучшая
аппроксимация мессбауэровского спектра замороженного раствора препарата Имферон была
достигнута при использовании суперпозиции трех дублетов (1–3), трех секстетов (4–6) и
дублета (7), соответствующего примеси соединения Fe(II) (см. рисунок 3.19 б). Можно
предположить, что в спектре препарата Имферон, измеренном при 90 К через десять лет,
наличие трех магнитных секстетов может быть связано с по меньшей мере тремя разными
101
ЭФФЕКТ, %
объемами агломератов «железных ядер».
Мальтофер®
Т=90 К
ЭФФЕКТ, %
СКОРОСТЬ, мм/с
Феррум Лек
Т=90 К
ЭФФЕКТ, %
СКОРОСТЬ, мм/с
Мальтофер®
Т=78 К
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 3.18 – Мессбауэровские спектры препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, измеренные с
высоким скоростным разрешением при 90 K [215] и препарата Мальтофер®, измеренный с
низким скоростным разрешение при 78 K [70].
102
512 каналов
Т=87 К
4096 каналов
Т=90 К
Рисунок 3.19 – Мессбауэровские спектры замороженного препарата Имферон, измеренные при
87 К (512 каналов) в 2001 г. [170] и при 90 К (4096 каналов) в 2010 г. [231].
Для сравнения барьера энергии магнитной анизотропии «железных ядер» ферритина
печени человека и препаратов Мальтофер® и Феррум Лек были измерены мессбауэровские
спектры с низким скоростным разрешением при 20 и 40 К [215, 234]. На рисунке 3.20 показаны
мессбауэровские спектры этих образцов, измеренные при 20 К на прямом ходе движения. Ясно
видно отличие формы спектра ферритина (преобладание парамагнитного дублета) от спектров
его аналогов (преобладание магнитных секстетов). Необходимо отметить, что, поскольку
измерение мессбауэровских спектров с низким скоростным разрешением проводилось в
геометрии с движущимся источником, из-за разности телесного угла источник-детектор
возникает параболическое искажение базовой линии спектра. Обычно с помощью фолдинга
(сложение с инверсией спектров, измеренных на прямом и обратном ходе движения) это
искажение частично устраняется. Однако, было показано, что процедура фолдинга не позволяет
устранить такое искажение, более того характер искажения базовой линии изменяется [214,
235]. Поэтому были использованы только спектры, измеренные на прямом ходе движения с
параболическим
искажением
базовой
линии
спектра,
которое
учитывалось
при
их
аппроксимации. Результаты наилучшей аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина и
его аналогов приведены в таблице 3.5. Оказалось, что относительная площадь магнитной
компоненты в мессбауэровском спектре ферритина при 20 К составляет ~10 %, в то время как в
мессбауэровских спектрах препаратов Феррум Лек и Мальтофер® при 20 К суммарная
относительная площадь магнитных компонент составила ~86 %. Этот факт указывает на то, что
барьер энергии магнитной анизотропии (KV из формулы (4) главы 1) для «железных ядер»
препаратов Феррум Лек и Мальтофер® выше, чем для «железных ядер» ферритина. Поэтому
вероятность переориентации магнитного момента ядер
57
Fe при 20 К существенно выше для
103
ферритина, чем для его аналогов. Возможно, это отличие связано с тем, что для ферритина и
его аналогов могут быть разные объемы «железных ядер» и/или различные значения константы
магнитной анизотропии для ферригидрита и акагенита.
Ферритин
Мальтофер®
Феррум Лек
Рисунок 3.20 – Мессбауэровские спектры ферритина печени человека и препаратов Мальтофер
и Феррум Лек, измеренные при 20 К с низким скоростным разрешением (250 каналов) на
прямом ходе [215].
104
Таблица 3.5 – Значения мессбауэровских параметров, полученные в результате
наилучшей аппроксимации спектров ферритина, препаратов Мальтофер® и Феррум Лек,
измеренных при 20 и 40 К [215].
№1
Heff, кЭ
S, %
δ, мм/с
∆EQ, мм/с
Γ, мм/с
1
0,38±0,12
–0,69±0,22
344,6±8,0
0,96±0,39
10
2
0,42±0,12
0,48±0,12
–
0,51±0,24
72
3
0,43±0,12
0,94±0,12
–
0,41±0,24
18
Мальтофер®
20
1
0,45±0,12
–0,12±0,12
417,9±3,5
0,60±0,24
28
2
0,46±0,12
–0,15±0,12
393,1±3,5
0,66±0,24
20
3
0,43±0,12
–0,03±0,12
366,1±3,5
0,60±0,24
11
4
0,50±0,12
–0,06±0,12
332,6±3,5
0,54±0,24
7
5
0,55±0,12
0,03±0,12
296,8±3,8
0,77±0,24
8
6
0,69±0,12
–0,12±0,12
220,2±4,8
0,78±0,26
6
7
0,73±0,12
–0,28±0,12
157,7±5,2
0,78±0,24
6
8
0,43±0,12
0,75±0,12
–
0,78±0,24
14
Феррум Лек
20
1
0,44±0,12
–0,13±0,12
416,8±3,5
0,61±0,24
30
2
0,45±0,12
–0,20±0,12
393,3±3,5
0,56±0,24
17
3
0,45±0,12
–0,16±0,12
369,0±3,5
0,57±0,24
10
4
0,47±0,12
–0,09±0,12
340,3±3,5
0,69±0,24
10
5
0,46±0,12
–0,03±0,12
303,7±3,5
0,70±0,24
8
6
0,45±0,12
–0,29±0,12
215,7±5,4
0,78±0,24
6
7
0,66±0,12
–0,25±0,12
155,7±4,4
0,80±0,24
6
8
0,42±0,12
0,79±0,12
–
0,78±0,24
13
Мальтофер®
40
1
0,43±0,12
–0,12±0,12
411,8±3,6
0,61±0,24
16
2
0,33±0,12
–0,01±0,12
381,3±6,1
0,77±0,26
16
3
0,70±0,12
–0,79±0,16
327,4±6,5
0,75±0,39
8
4
0,36±0,12
–0,33±0,12
286,0±4,3
0,77±0,26
8
5
0,17±0,12
–0,15±0,12
174,1±3,5
0,78±0,24
15
6
0,42±0,12
0,66±0,12
–
0,58±0,24
31
7
0,50±0,12
1,64±0,22
–
0,51±0,24
6
Феррум Лек
40
1
0,43±0,12
–0,08±0,12
411,3±3,5
0,44±0,24
8
2
0,40±0,12
–0,12±0,12
387,2±3,5
0,78±0,24
20
3
0,57±0,12
–0,34±0,12
342,8±3,5
0,78±0,24
10
4
0,50±0,12
–0,48±0,12
288,9±3,5
0,78±0,24
12
5
0,17±0,12
–0,43±0,12
172,9±3,5
0,78±0,24
13
6
0,44±0,12
0,65±0,12
–
0,60±0,24
28
7
0,37±0,12
1,28±0,12
–
0,64±0,24
9
Примечание – номера компонент соответствуют компонентам мессбауэровских спектров
на рисунках 3.20 и 3.21.
Образец
Ферритин
T, K
20
Несмотря на измерение этих мессбауэровских спектров с низким скоростным
разрешением, парамагнитную компоненту в спектре ферритина удалось аппроксимировать
суперпозицией двух квадрупольных дублетов, согласующихся с гетерогенной моделью
«железного ядра». Мессбауэровские спектры препаратов Феррум Лек и Мальтофер® при 20 К
были аппроксимированы суперпозицией семи магнитных секстетов и одного квадрупольного
дублета. Параметры этих компонент оказались одинаковыми в пределах ошибки. Наличие семи
магнитных секстетов может быть связано с некоторым разбросом по объему «железных ядер» в
105
этих препаратах. Поскольку в мессбауэровских спектрах двух железо-полимальтозных
комплексов, измеренных при 20 К, и в их параметрах не выявилось значимых отличий, были
дополнительно измерены спектры этих образцов при 40 К. Эти спектры приведены на рисунке
3.21 в сравнении с мессбауэровским спектром железо-полимальтозного комплекса из работы
[70], измеренным при 45 К. В последнем спектре доля магнитной компоненты явно больше, чем
в спектрах наших образцов. Это согласуется с тем, что в мессбауэровском спектре препарата
ЭФФЕКТ, %
Мальтофер из работы [70] уже при 87 К наблюдалась магнитная компонента.
Мальтофер®
Т=40 К
Феррум Лек
Т=40 К
Мальтофер®
Т=45 К с
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 3.21 – Мессбауэровские спектры препаратов Мальтофер® и Феррум Лек, измеренные
при 40 К с низким скоростным разрешением (250 каналов) на прямом ходе [217] и препаратов
Мальтофер®, измеренный с низким скоростным разрешением при 45 К [70].
106
При 40 К мессбауэровские спектры препаратов Феррум Лек и Мальтофер® были
аппроксимированы суперпозицией пяти магнитных секстетов и двух квадрупольных дублетов,
параметры которых приведены в таблице 3.5. Доля парамагнитной компоненты в обоих
спектрах составила ~37 %. Оценки параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских
спектров препаратов Феррум Лек и Мальтофер® оказались одинаковыми в пределах ошибки.
Однако значения относительных площадей соответствующих компонент спектров оказались
несколько различающимися для двух препаратов. Поэтому на основании полученных
результатов можно рассматривать разброс по объемам «железных ядер» в исследованных
препаратах Феррум Лек и Мальтофер® как схожий, что согласуется с результатами анализа
мессбауэровских спектров, измеренных при 20 К.
3.5 Выводы
1. Средний диаметр «железных ядер» в образце ферритина печени человека по данным
трансмиссионной электронной микроскопии составил ~4,8 нм.
2. В соответствии с данными рентгено-дифракционного анализа ферритин печени
человека содержит ферригидрит, а препараты Мальтофер® и Феррум Лек – акагенит.
3. ЭПР-спектроскопия выявила присутствие очень малых количеств ферро- и
ферримагнитных фаз в «железных ядрах» ферритина печени человека и его фармацевтических
аналогов
Мальтофер®
и
Феррум
Лек,
которые
невозможно
выявить
с
помощью
мессбауэровской спектроскопии.
4. Магнитные измерения показали схожесть магнитных свойств препаратов Феррум Лек
и Мальтофер® (например, коэрцетивной силы) и отсутствие выхода на насыщение магнитного
момента из-за присутствия парамагнитной компоненты.
5. Обнаружены отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
ферритина печени человека, его фармацевтических аналогов – препаратов Имферон,
Мальтофер® и Феррум Лек, а также ферритина бактерий при 295 и 90 К, аппроксимированных
в предположении гомогенной структуры «железного ядра».
6. В предположении гетерогенной структуры «железного ядра» наилучшая аппроксимация
мессбауэровских спектров ферртина печени человека и препаратов Мальтофер® и Феррум Лек,
измеренных при 295 и 90 К, была достигнута при использовании согласованной модели
аппроксимации, включающей 4 квадрупольных дублета для ферритина и 5 для его аналогов.
7. Показано, что величина барьера энергии магнитной анизотропии для наноразмерных
«железных ядер» в ферритине печени человека ниже, чем в его аналогах – препаратах Феррум
Лек и Мальтофер®, в то время как для самих аналогов величина барьера фактически одинаковая.
107
4 АНОМАЛЬНОЕ
ПОВЕДЕНИЕ
ПАРАМЕТРОВ
МЕССБАУЭРОВСКИХ СПЕКТРОВ МАКРОМОЛЕКУЛ ФЕРРИТИНА
И ЕГО АНАЛОГОВ В ТЕМПЕРАТУРНОМ ДИАПАЗОНЕ 295–90 К И
ОСОБЕННОСТИ
ГЕТЕРОГЕННОЙ
СТРУКТУРЫ
«ЖЕЛЕЗНЫХ
ЯДЕР»
4.1 Мессбауэровские спектры ферритина и его аналогов в диапазоне температур
295–90 К
Исследование ферритина печени человека и его аналогов – препаратов Феррум Лек и
Мальтофер®, методом мессбауэровской спектроскопии при 295 и 90 К выявило отличия
значений ширин линий компонент мессбауэровских спектров как при использовании модели
гомогенного, так и гетерогенного «железного ядра» [218, 236–241]. Оказалось, что при 90 К
ширины линий компонент спектров в основном больше, чем при 295 К (см. таблицы 3.2 и 3.3).
Поскольку уширение линий мессбауэровских спектров с понижением температуры может быть
вызвано разными факторами, дополнительно были проведены измерения мессбауэровских
спектров в температурном диапазоне 295–90 К. Кроме того, получение температурных
зависимостей мессбауэровских параметров позволит получить новую информацию о
«железных ядрах», например, провести оценку температуры Дебая ΘD для ядер 57Fe.
Мессбауэровские спектры ферритина печени человека и его фармацевтического аналога
Феррум Лек были измерены в температурном диапазоне от 295 до 90 К с высоким скоростным
разрешением (см. рисунок 4.1) и при 83 К с низким скоростным разрешением. Спектры были
аппроксимированы в предположении гомогенного (грубая модель) и гетерогенного «железного
ядра».
T=98 K
T=98 K
T=115 K
T=140 K
Эффект, %
Эффект, %
T=115 K
T=220 K
Ферритин
Скорость, мм/с
T=140 K
T=220 K
Феррум Лек
Скорость, мм/с
Рисунок 4.1 – Мессбауэровские спектры ферритина и его аналога – препарата Феррум Лек,
измеренные с высоким скоростным разрешением при различных температурах [239].
108
4.2 Оценка температуры Дебая для «железных ядер» выделенного ферритна печени
человека и препарата Феррум Лек
Изомерный сдвиг, как величина, связанная с плотностью электронов на ядре
57
Fe,
фактически не зависит от температуры. Однако при измерении мессбауэровских спектров в
условиях, когда образец находится при переменной температуре, а источник – при постоянной,
например, комнатной температуре, наблюдается увеличение изомерного сдвига при понижении
температуры образца. Это является следствием квадратичного эффекта Доплера, как результат
изменения динамических свойств ядра
57
Fe, а именно его среднеквадратичной скорости, в
поглотителе по сравнению с динамическими свойствами ядер
57
Fe в источнике. В этом случае
температурная зависимость изомерного сдвига определяется по формуле:
δ(T) = δ(0) + δSOD(T),
(6)
где δ(0) – изомерный сдвиг при T=0 K, δSOD(T) – доплеровский сдвиг второго порядка при
температуре Т, определяемый по зависимости соответствующего энергетического сдвига
∆ESOD(T):
< v2 >
∆ESO∆ (T ) = −
Eγ ,
2c 2
< v2 >
δ SOD (T ) = −
,
2c
где <v2> – среднеквадратичная скорость осцилляций ядер
57
(7)
Fe при температуре T, c – скорость
света, Eγ – энергия резонансного излучения γ-квантов. Тогда δSOD будет связан с ΘD следующим
выражением:
 T 
3kT  3Θ D

δSOD (T ) = −
+ 3
Θ D 
2mc  8T


3
∫
ΘD
0
T

x3
,
dx
ex −1 

(8)
где m – это масса атома Fe, k – постоянная Больцмана, x=ћω/kT (ω – частота вибраций, ћ –
постоянная Планка h/2π).
Для
определения
значений
изомерного
сдвига
при
различных
температурах
мессбауэровские спектры ферритина и препарата Феррум Лек были аппроксимированы одним
квадрупольным
дублетом
в
рамках
грубой
модели
гомогенного
«железного
ядра».
Дополнительно оценка этого параметра была проведена с помощью безмодельных методов
109
оценки первого центрального момента спектров [239] и с помощью функции распределения
квадрупольного расщепления [242, 243]. Оказалось, что результаты безмодельных расчетов
дают те же оценки δ, что и аппроксимация спектров одним квадрупольным дублетом. Поэтому
в
дальнейших
расчетах
использовались
результаты
аппроксимации
спектров
одним
квадрупольным дублетом. Температурная зависимость полученных значений δ(T) приведена на
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
рисунке 4.2.
Феррум Лек
Ферритин
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 4.2 – Температурные зависимости значений изомерного сдвига мессбауэровских
спектров ферритина печени человека и препарата Феррум Лек и результат их аппроксимации
по формуле (8) для оценки температуры Дебая [240, 243].
Значение температуры Дебая, полученное для значений δ при аппроксимации
мессбауэровских спектров одним квадрупольным дублетом, составило ΘD=502±24 K для
препарата Феррум Лек и ΘD=461±16 K для выделенного ферритина печени человека. Отличие
значений ΘD для двух образцов превышает пределы расчетных ошибок всего на 1 К. Столь
малое отличие значений ΘD, полученных для «железных ядер» ферритина печени человека и
препарата Феррум Лек в рамках модели гомогенного «железного ядра», может быть связано с
тем, что среднеквадратичные скорости атомов железа в «железных ядрах» препарата Феррум
Лек лишь не на много больше, чем в ферритине. Это может быть обусловлено тем, что в
препарате Феррум Лек «железные ядра» состоят из акагенита, а в ферритине – из ферригидрита.
Ранее в работе [187] было получено значение ΘD=270±20 K для фармацевтического аналога
ферритна – железо-декстранового комплекса Ниферекс, путем оценки ΘD из определения
110
температурной зависимости вероятности эффекта Мессбауэра (из температурной зависимости
площади мессбауэровских спектров). Поэтому значение ΘD, полученное для железополимальтозного комплекса Феррум Лек в данной работе, оказалось существенно выше не
только из-за различий в технологии производства фармацевтических препаратов, но и из-за
отличия в методе оценки ΘD.
4.3
Аномальные
температурные
зависимости
параметров
мессбауэровских
спектров ферритина и его аналогов в диапазоне температур 295–90 К
4.3.1 Модель гомогенного «железного ядра»
В отличие от обычной температурной зависимости δ для мессбауэровских спектров
ферритина печени человека и препарата Феррум Лек, измеренных в диапазоне температур 295 –
90 К, температурные зависимости Γ и площади спектров, оцененные в рамках гомогенной
модели «железного ядра», демонстрируют аномальное поведение, показанное на рисунках 4.4 и
Ферритин
Ферритин
а
T0 ~150 K
ТЕМПЕРАТУРА, К
ШИРИНА ЛИНИИ, мм/с
ШИРИНА ЛИНИИ, мм/с
4.5 [236, 238, 239].
Феррум Лек
Феррум Лек
б
T0 ~130 K
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 4.4 – Температурные зависимости значений ширин линий мессбауэровских спектров
ферритина и препарата Феррум Лек, аппроксимированных в рамках модели гомогенного
«железного ядра». Стрелками обозначены значения критической температуры Т0, ниже которой
наблюдается аномальное уширение линий. Пунктирными линиями разного цвета обозначены
линии тренда для значений ширин линий выше () и ниже () критической температуры [239].
Оказалось, что ниже некоторой критической температуры (Т0) начинается аномальное
уширение линии мессбауэровского спектра как для ферритина, так и для препарата Феррум
Лек. При этом величина Т0 для ферритина составила ~150 К, а для препарата Феррум Лек –
111
~130 К (см. рисунок 4.4). Для температурной зависимости площади спектров оказалось, что
после достижения максимума при температурах ~115 К для ферритина и ~105 К для препарата
Феррум Лек значение площади спектров несколько уменьшается с понижением температуры
ПЛОЩАДЬ СПЕКТРА, отн. ед.
(см. рисунок 4.5).
T=115 K
Ферритин
T=105 K
Феррум Лек
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 4.5 – Изменение нормированных площадей мессбауэровских спектров ферритина и
препарата Феррум Лек в температурном диапазоне 295–90 К (модель гомогенного «железного
ядра»). Стрелками указаны температуры, ниже которых наблюдается аномальное уменьшение
площади спектра [239].
Уширение линии мессбауэровского спектра при понижении температуры может быть
связано с целым рядом факторов. Например, линии могут уширяться в результате усиления
вибраций в криостате, вибраций частиц порошковых образцов при условии движущегося
поглотителя в криостате, увеличения эффективной толщины поглотителя из-за роста
вероятности эффекта Мессбауэра при понижении температуры, а также в результате
замедления релаксации магнитного момента ядра
57
Fe для суперпарамагнитных частиц.
Поэтому для оценки влияния вкладов различных вибраций и увеличения эффективной толщины
образцов на уширение линии спектра, а также для оценки температурной зависимости площади
спектра в диапазоне 295–90 К были измерены спектры стандартных поглотителей
нитропруссида натрия (SNP) и ферроцианида калия К4[Fe(CN)6] (PFC), все – толщиной 5 мг
Fe/см2. Причем было приготовлено 2 вида образцов ферроцианида калия: плотно
утрамбованный порошок (как и исследуемые образцы ферритина и его аналогов) и наклеенный
на алюминиевую фольгу порошок – для оценки вклада вибраций частиц образца. В результате
112
аппроксимации
измеренных
мессбауэровских
спектров
SNP
и
К4[Fe(CN)6]
одним
квадрупольным дублетом и одним синглетом, соответственно (см. рисунок 4.6), были получены
оценки параметров спектров.
160 К
SNP
295 К
PFC
наклеенный
295 К
PFC
порошок
90 К
PFC
порошок
90 К
SNP
90 К
PFC
наклеенный
160 К
PFC
порошок
Рисунок 4.6 – Мессбауэровские спектры стандартных поглотителей нитропруссида натрия
(SNP) и ферроцианида калия (PFC), измеренные при различных температурах [239].
113
На рисунке 4.7 приведены температурные зависимости ширин линий и нормированных
на значение при 295 К площадей мессбауэровских спектров. Как видно из рисунка 4.7,
возрастание ширины линии и площади мессбауэровских спектров трех стандартных
поглотителей имеет монотонный характер, соответствующий изменению этих параметров из-за
роста вероятности эффекта Мессбауэра с понижением температуры. Более того, для двух
образцов ферроцианида калия температурные зависимости ширины линии и площади спектров
совпадают в пределах инструментальной ошибки. Таким образом, усиление вибраций в
криостате и вибраций частиц порошковых образцов при условии движущегося поглотителя, а
также увеличение эффективной толщины поглотителя из-за роста вероятности эффекта
Мессбауэра при понижении температуры не являются факторами, определяющими аномальное
уширение линии и уменьшение площади мессбауэровских спектров ферритина и препарата
ШИРИНА ЛИНИИ, мм/с
а
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОЩАДЬ, отн. ед
Феррум Лек ниже Т0.
б
ТЕМПЕРАТУРА, КК
ТЕМПЕРАТУРА,
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 4.7 – Температурные зависимости значений ширин линий (а) и нормированных
площадей (б) мессбауэровских спектров:  – нитропруссид натрия,  – порошок и  –
наклеенный образец ферроцианида калия [239].
Приведенные в п 3.4 главы 3 результаты исследования ферритина и препарата Феррум
Лек при 20 К свидетельствуют о более высоком барьере энергии магнитной анизотропии для
«железных ядер» препарата Феррум Лек, в результате чего в этом образце замедление
релаксации магнитного момента ядер
57
Fe начинается при более высокой температуре, чем в
ферритине (см. рисунок 3.20 главы 3). Следовательно, если бы замедление магнитной
релаксации вносило существенный вклад в аномальное уширение линии мессбауэровских
спектров ферритина и препарата Феррум Лек, то значение критической температуры для
препарата Феррум Лек было бы больше, чем для ферритина. Однако, как видно из рисунка 4.4,
значение Т0 для ферритина выше, чем для препарата Феррум Лек. Таким образом, аномальное
уширение линии мессбауэровских спектров ферритина и препарата Феррум Лек ниже
114
критической температуры не связано с замедлением магнитной релаксации.
Аномальная температурная зависимость площадей мессбауэровских спектров ферритина
и препарата Феррум Лек может быть связана с уменьшением вероятности эффекта Мессбауэра
при температурах ниже 115 К для ферритина и 105 К для препарата Феррум Лек из-за
увеличения среднеквадратичных смещений ядер 57Fe. Интересно отметить, что в рамках модели
гомогенного «железного ядра» максимальные среднеквадратичные смещения ядер
57
Fe для
ферритина и препарата Феррум Лек наблюдаются при очень близких температурах: 115 и 105
К, соответственно. Это, в свою очередь, коррелирует с близкими значениями ΘD для «железных
ядер» этих образцов, указывающими на схожие значения среднеквадратичной скорости
осцилляций ядер
57
Fe. Наблюдаемое отличие в значениях площадей спектров ферритина и
препарата Феррум Лек может быть связано с отличиями в числе резонансных ядер в этих
поглотителях и отличиями динамических свойств ядер 57Fe в ферригидрите и акагените.
4.3.2 Модель гетерогенного «железного ядра»
В рамках модели гетерогенного «железного ядра» аппроксимация мессбауэровских
спектров ферритина печени человека и препарата Феррум Лек, измеренных в диапазоне 295–83
К, а также спектров препарата Мальтофер®, измеренных при 295 и 90 К, была проведена по
новой модели [236, 241]. Если предположить, что каждая компонента спектра связана с
конкретной областью/слоем/нанодоменом «железного ядра» с гомогенной структурой, в
пределах которой локальное окружение ядер
57
Fe одинаково, то значения ширин линий этих
компонент должны быть одинаковы. При этом структуры разных областей/слоев/нанодоменов
«железного ядра» отличаются. Поэтому в новой модели аппроксимации значение ширин линий
для всех компонент было одинаковым и свободно варьировалось в процессе аппроксимации.
Все спектры ферритина и препаратов Феррум Лек и Мальтофер® были аппроксимированы
наилучшим образом суперпозицией пяти квадрупольных дублетов (см. рисунки 4.8–4.10). При
этом результаты аппроксимации спектров, измеренных с низким скоростным разрешением при
83 К, отличаются от результатов аппроксимации спектров измеренных с высоким скоростным
разрешением из-за разного числа точек в спектре (см. рисунки 4.8 и 4.9). Поэтому для
дальнейшего анализа были использованы результаты аппроксимации спектров, измеренных с
высоким скоростным разрешением.
115
4096
каналов
T=295 K
4096
каналов
T=220 K
4096
каналов
T=140 K
4096
каналов
T=115 K
4096
каналов
T=98 K
4096
каналов
T=90 K
256
каналов
T=83 K
Рисунок 4.8 – Мессбауэровские спектры ферритина печени человека, измеренные с высоким и
низким скоростным разрешением при различных температурах. Компоненты 1–5 – результат
наилучшей аппроксимации спектров в рамках модели гетерогенного «железного ядра» с
одинаковой шириной линий компонент спектров [239].
Температурная зависимость значений ширин линий компонент мессбауэровских
спектров ферритина и препаратов Феррум Лек и Мальтофер® показана на рисунке 4.11. Для
спектров ферритина и препарата Феррум Лек наблюдается аномальное уширение линий при
температурах ниже Т0, совпадающих с аналогичными значениями Т0, полученными в рамках
модели гомогенного «железного ядра» (см. рисунок 4.4), хотя в рамках новой аппроксимации
значения ширин линий уменьшились. Для спектров препарата Мальтофер®, измеренных лишь
при 295 и 90 К, значения ширин линий фактически соответствуют изменению ширины линии
для крайних значений температурной зависимости ширины линий для препарата Феррум Лек.
Поэтому можно ожидать схожего аномального уширения линии при понижении температуры
для препарата Мальтофер®.
116
4096
каналов
T=295 K
4096
каналов
T=220 K
4096
каналов
T=170 K
4096
каналов
T=140 K
4096
каналов
T=125 K
4096
каналов
T=115 K
4096
каналов
T=105 K
4096
каналов
T=98 K
4096
каналов
T=90 K
256
каналов
T=83 K
Рисунок 4.9 – Мессбауэровские спектры препарата Феррум Лек, измеренные с высоким и
низким скоростным разрешением при различных температурах. Компоненты 1–5 – результат
наилучшей аппроксимации спектров в рамках модели гетерогенного «железного ядра» с
одинаковой шириной линий компонент спектров [239].
117
4096
каналов
4096
каналов
Рисунок 4.10 – Мессбауэровские спектры препарата Мальтофер®, измеренные с высоким
скоростным разрешением при различных температурах. Компоненты 1–5 – результат
наилучшей аппроксимации спектров в рамках модели гетерогенного «железного ядра» с
одинаковой шириной линий компонент спектров [239].
 – Феррум
Лек
 – Ferrum
Lek

–
Maltofer®
 – Мальтофер®
ШИРИНА ЛИНИИ, мм/с
ШИРИНА ЛИНИИ, мм/с
– Ferritin
 –Ферритин
Т
~150 K
TC0=~150
K
ТЕМПЕРАТУРА, К
TТC0=~130
~130 K
K
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 4.11 – Температурные зависимости значений ширин линий мессбауэровских спектров
ферритина и препарата Феррум Лек, аппроксимированных в рамках модели гетерогенного
«железного ядра». Стрелками обозначены значения критической температуры Т0, ниже которой
наблюдается аномальное уширение линий. Пунктирными линиями обозначены линии тренда
для значений ширин линий выше и ниже критической температуры [239].
Температурные зависимости общих площадей мессбауэровских спектров ферритина и
препарата Феррум Лек, нормированных на значения площадей при 295 К, приведены на
рисунке 4.12. Они также демонстрируют аномальное изменение площади спектров при
температуре ниже ~100 К. Следует также отметить, что величина резонансного эффекта в
118
мессбауэровских спектрах начинает уменьшаться при температурах ниже 140 К (см. рисунки
1.430
 – Ферритин
1.380
1.330
1.280
1.230
1.180
1.130
1.080
1.030
0.980
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, K
НОРМИРОВАННАЯ ОБЩАЯ ПЛОЩАДЬ,
отн. ед.
НОРМИРОВАННАЯ ОБЩАЯ ПЛОЩАДЬ,
отн. ед.
4.8 и 4.9).
 – Феррум Лек
 – Мальтофер®
1.380
1.330
1.280
1.230
1.180
1.130
1.080
1.030
0.980
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, K
Рисунок 4.12 – Температурные зависимости нормированных значений общей площади
мессбауэровских спектров ферритина печени человека и препаратов Феррум Лек и
Мальтофер® [237, 239].
На рисунке 4.13 приведено сравнение температурных зависимостей площадей
компонент мессбауэровских спектров ферритина и препарата Феррум Лек, нормированных на
значение площади при 295 К. Оказалось, что изменение нормированных площадей при
понижении температуры отличается для разных компонент в спектрах. Например, для
препарата Феррум Лек значения площадей первого и второго дублетов увеличиваются при
понижении температуры, в то время, как значения площадей остальных компонент спектра
начинают уменьшаться при температурах ниже ~140 К. Для компонент мессбауэровских
спектров ферритина также наблюдается отличие в температурных зависимостях площадей
отдельных компонент, при этом уменьшение площадей компонент спектров начинается также
при температурах ниже ~140 К. Температурные зависимости значений относительной площади,
изомерного сдвига и квадрупольного расщепления компонент спектров приведены на рисунке
4.14. Интересно отметить, что температурные зависимости относительных площадей и
изомерных сдвигов некоторых компонент увеличиваются, а некоторых – уменьшаются при
понижении температуры ниже ~140 К, в то время как значения ∆EQ монотонно увеличиваются
при понижении температуры.
119
Ферритин
1.60
1.80
1.40
1.40
1.20
1.00
1.40
1.30
1.20
1.10
1.00
1.40
1.30
1.20
1.10
1.00
1.35
1.15
0.95
0.75
1.15
0.95
Феррум Лек
1.80
НОРМИРОВАННАЯ ОБЩАЯ ПЛОЩАДЬ, ОТН. ЕД.
НОРМИРОВАННАЯ ОБЩАЯ ПЛОЩАДЬ, ОТН. ЕД.
2.20
1.00
1.40
1.30
1.20
1.10
1.00
1.40
1.30
1.20
1.10
1.00
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
1.20
0.80
0.75
0.40
0.55
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, К
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, К
Рисунок 4.13 – Температурные зависимости нормированных значений площадей компонент
мессбауэровских спектров ферритина печени человека и препарата Феррум Лек:  – дублет 1,
 – дублет 2,  – дублет 3,  – дублет 4 и  – дублет 5 [239].
Полученные результаты демонстрируют аномальные температурные зависимости ширин
линий, изомерных сдвигов и нормированных и относительных площадей компонент
мессбауэровских спектров ферритина и его аналога Феррум Лек. Выше (в п.п 4.3.1) было
показано, что вклад от различных факторов (увеличение толщины поглотителя, возникновение
вибраций в криостате и образце, релаксационные процессы) не является определяющим для
наблюдаемых
аномальных
температурных
зависимостей
параметров.
Поэтому
было
предположено, что аномальное поведение мессбауэровских параметров может быть связано со
структурными изменениями в ферригидрит- и акагенит-содержащих «железных ядрах» при
понижении температуры. В работе [76] при исследовании замороженного раствора ферритина
методом EXAFS в температурном диапазоне 293–80 К авторы обнаружили, что при понижении
температуры возникают значительные структурные изменения в «железных ядрах» ферритина,
вероятно, из-за низкотемпературного фазового перехода. На основе полученных результатов
можно предложить следующую модель.
120
35
35
30
25
20
15
10
Ферритин
5
0
80
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОЩАДЬ, %
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОЩАДЬ, %
40
30
25
20
15
10
0
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
ТЕМПЕРАТУРА, K
Феррум Лек
0.458
0.450
0.430
0.410
0.390
0.438
0.418
0.398
0.378
0.358
0.370
80
ТЕМПЕРАТУРА, K
Ферритин
1.540
1.340
1.140
0.940
0.740
0.540
80
0.338
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, K
80
1.800
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
0.478
Ферритин
0.470
0.340
80
ТЕМПЕРАТУРА, K
0.490
0.350
Феррум Лек
5
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, K
Феррум Лек
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
ТЕМПЕРАТУРА, K
Рисунок 4.14 – Температурные зависимости значений относительных площадей, изомерных
сдвигов и квадрупольных расщеплений компонент мессбауэровских спектров ферритина и
препарата Феррум Лек, полученных в рамках модели гетерогенного «железного ядра»:  –
компонента 1,  – компонента 2,  – компонента 3,  – компонента 4 и  – компонента 5
(номера компонент соответствуют компонентам на рисунках 4.7 и 4.8 [239].
121
Компоненты мессбауэровских спектров, полученные при наилучшей аппроксимации в
рамках модели гетерогенного «железного ядра», могут быть сопоставлены с различными
внутренними и внешними гомогенными слоями/областями/нанодоменами «железных ядер».
Например, квадрупольный дублет 1 с наименьшим значением ∆EQ (наименьшим значением
ГЭП на ядрах
57
Fe) может быть сопоставлен с внутренней областью «железного ядра»,
обладающей наибольшей степенью кристалличности/плотностью упаковки. И, наоборот,
квадрупольный дублет 5 с наибольшим значением ∆EQ (наибольшим значением ГЭП на ядрах
57
Fe) может характеризовать слои с наименьшей степенью плотностью упаковки. Остальные
компоненты в зависимости от величины ∆EQ могут быть связаны с промежуточными по
степени
кристалличности/плотности
упаковки
областями/слоями/нанодоменами.
При
понижении температуры структурные перестройки в пределах области/слоя/нанодомена могут
вызывать увеличение среднеквадратичных смещений ядер
57
Fe и уменьшение вероятности
эффекта Мессбауэра, а, следовательно, и резонансного эффекта в спектре (см. рисунок 4.15). В
результате происходит уменьшение, как общей нормированной площади спектра, так и
площадей
некоторых
компонент.
Различный
характер
температурных
зависимостей
относительных площадей компонент спектров при температуре ниже ~140 К может быть
следствием не только изменения вероятности эффекта Мессбауэра в соответствующих
областях/слоях/ нанодоменах «железных ядер», но и с возможным изменением их размеров,
вызванным
структурными
перестройками.
На
основании
корреляции
уменьшения
нормированных площадей и изомерных сдвигов для компонент 3–5 можно предположить, что
при таких структурных перестройках среднеквадратичная скорость <v2> тоже может
увеличиваться, приводя к уменьшению значений δ вследствие эффекта Допплера второго
порядка. Также можно принять во внимание изменение ближнего порядка в локальной области
ядер 57Fe как следствие изменения плотности упаковки атомов Fe и O в результате структурных
перестроек. Это может приводить к уменьшению изомерного сдвига и более быстрому
увеличению квадрупольного расщепления для соответствующих компонент в спектре
(наиболее наглядно это видно на температурных зависимостях мессбауэровских параметров для
препарата Феррум Лек на рисунке 4.12). Поэтому уширение линий компонент спектров в
данном
случае
может
быть
обусловлено
структурными
перестройками
слоях/областях/нанодоменах «железного ядра» при понижении температуры.
в
122
Ферритин
21
ЭФФЕКТ, %
ЭФФЕКТ, %
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
Феррум Лек
22
20
19
18
17
80
110
140
170
200
230
ТЕМПЕРАТУРА, К
260
290
16
80
110
140
170
200
230
ТЕМПЕРАТУРА, К
260
290
Рисунок 4.15 – Температурные зависимости резонансного эффекта мессбауэровских спектров
ферритина печени человека и препарата Феррум Лек.
4.4 Применение нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров
ферритина в бактериях A. brasilense (штамм Sp245) при 295 К в рамках модели
гетерогенного «железного ядра».
На основе разработанного нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров
ферритина печени человека и его аналогов в рамках модели гетерогенного «железного ядра»
проведена аппроксимация спектров ферритина в образцах бактерий A. brasilense (штамм
Sp245), результаты которой показаны на рисунке 4.16.
Образец 1
Образец 2
Рисунок 4.16 – Наилучшая аппроксимация мессбауэровских спектров ферритина в образцах
бактерий A. brasilense (штамм Sp245) согласованной моделью с одинаковыми ширинами линий
компонент. Т=295 К. Компоненты 1–5 – результат наилучшей аппроксимации спектров [216].
В отличие от мессбауэровских спектров ферритина печени человека наилучшая
123
аппроксимация спектров ферритина бактерий A. brasilense (штамм Sp245) была достигнута при
суперпозиции лишь четырех квадрупольных дублетов, мессбауэровские параметры которых
приведены в таблице 4.1. Вероятно, это отличие связано, с одной стороны, с худшим
соотношением сигнал-шум в спектрах бактерий из-за меньшего содержания ядер 57Fe, с другой
стороны – с возможными отличиями в структуре «железных ядер» ферритина бактерий и
печени человека.
Таблица 4.1 – Параметры мессбауэровских спектров ферритина в двух образцах
бактерий A. brasilense (штамм Sp245) и выделенного ферритина печени человека, полученные
при аппроксимации с одинаковой шириной линий компонент спектров в модели гетерогенного
«железного ядра». Т=295 К [216].
Образец
Бактерии,
образец 1
N1
1
2
3
4
5
δ, мм/с
0,393±0,004
0,387±0,004
0,389±0,004
0,405±0,008
0,825±0,019
∆EQ, мм/с
0,433±0,014
0,731±0,017
1,068±0,019
1,454±0,028
3,067±0,039
Г, мм/с
0,311±0,008
0,311±0,008
0,311±0,008
0,311±0,008
0,311±0,008
S, %
29,46
33,41
23,82
7,51
2,81
Бактерии,
образец 2
1
2
3
4
0,394±0,004
0,385±0,004
0,399±0,006
0,385±0,021
0,490±0,011
0,816±0,014
1,159±0,052
1,501±0,102
0,343±0,010
0,343±0,010
0,343±0,010
0,343±0,010
43,29
35,19
17,03
4,49
Ферритин
печени
человека
1
2
3
4
5
0,373±0,002
0,373±0,002
0,367±0,002
0,362±0,002
0,360±0,002
0,377±0,002
0,580±0,002
0,810±0,002
1,071±0,005
1,385±0,008
0,269±0,003
0,269±0,003
0,269±0,003
0,269±0,003
0,269±0,003
19,45
35,33
26,53
14,45
4,25
Примечание – номера компонент соответствуют компонентам наилучшей
аппроксимации, приведенным на рисунках 4.8 и 4.14 для ферритина печени человека и
ферритина в бактериях A. brasilense (штамм Sp245), соответственно.
Необходимо отметить, что компонента 5 в мессбауэровском спектре ферритина в
образце бактерий 1 относится к соединению двухвалентного железа. Вероятно, это соединение
является результатом трансформации бактериями соли
57
FeIII-NTA, которая содержалась в их
питательной среде. Большая часть железа была накоплена в ферритине бактерий образца 1 с
остаточным содержанием соединения Fe(II). Во втором образце бактерии продолжали расти в
отсутствии питательной среды, обогащенной железом, поэтому, очевидно, остатки соединения
Fe(II) были использованы бактериями. Следует отметить, что компоненты, относящиеся к
двухвалентному железу, с похожими мессбауэровскими параметрами также наблюдались и в
других работах (например, [80, 182, 244–248]). Однако количество двухвалентного железа в
124
образце 1 оказалось существенно меньшим, чем в упомянутых работах, где оно было отнесено к
ионам Fe(II), связанным с белком, либо к другим соединениям Fe(II). Несмотря на то, что
количество компонент в модели аппроксимации мессбауэровских спектров образцов
бактериального
ферритина
было
одинаковым,
были
выявлены
отличия
некоторых
мессбауэровских параметров за пределами ошибки. Обнаружено небольшое отличие значений
∆EQ для компонент 1–3, что свидетельствует о различиях в степени кристалличности/плотности
упаковки соответствующих слоев/областей «железного ядра». На рисунке 4.17 показано
сравнение относительных площадей компонент мессбауэровских спектров ферритина бактерий
A. brasilense (штамм Sp245). Для образца 1 значение площадей компонент спектров было
пересчитано для исключения вклада площади компоненты 5, относящейся к соединению Fe(II).
Из приведенного сравнения видно, что размер менее плотно упакованных областей «железного
ядра», связываемых с компонентами 4 и 3, больше в ферритине образца 1, тогда как размер
внутренней области с более высокой степенью кристалличности/плотностью упаковки,
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОЩАДЬ, %
связываемой с компонентой 1, больше в ферритине образца 2.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
НОМЕР КОМПОНЕНТЫ В СПЕКТРЕ
Рисунок 4.17 – Сравнение относительных площадей компонент мессбауэровских спектров
бактерий A. brasilense (штамм Sp245), полученных в результате наилучшей аппроксимации
гетерогенной моделью:  – образец 1,  – образец 2 [216].
4.4 Выводы
1. Температура Дебая для атомов железа, оцененная в рамках модели гомогенного
«железного ядра», составляет ΘD=461±16 К для ферритина печени человека и ΘD=502±24 К для
его аналога – препарата Феррум Лек.
125
2. В температурном диапазоне 295–90 К обнаружено аномальное изменение параметров
мессбауэровских спектров наноразмерных «железных ядер» ферритина печени человека и его
аналогов – препаратов Феррум Лек и Мальтофер®, оцененных в рамках гомогенной модели
«железного ядра».
3. Разработан новый подход к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина и
его аналогов в рамках гетерогенной модели «железного ядра», предполагающий однородность
структуры в пределах соответствующего слоя/области/нанодомена.
4. Применение нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина и
его аналогов в рамках модели гетерогенного «железного ядра» позволило получить
температурные зависимости мессбауэровских параметров для отдельных компонент спектров,
которые были связанны с различными слоями/областями/нанодоменами «железных ядер».
5. Обнаруженные аномалии температурных зависимостей ширины линии, абсолютной и
относительной площадей и изомерных сдвигов отдельных компонент спектров ферритина и
препарата Феррум Лек могут быть связаны с низкотемпературными структурными
перестройками в соответствующих слоях/областях/нанодоменах «железных ядер».
6. Новый подход к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина был применен
для анализа мессбауэровских спектров ферритина двух образцов бактерий A. brasilense (штамм
Sp245), который позволил выявить отличия в гетерогенной структуре «железных ядер»
ферритина этих образцов.
126
5 МЕССБАУЭРОВСКАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ
ЖЕЛЕЗОДЕПОНИРУЮЩИЕ
БЕЛКИ,
В
ТКАНЕЙ,
НОРМЕ
И
СОДЕРЖАЩИХ
ПРИ
НЕКОТОРЫХ
ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СИСТЕМЫ КРОВИ
В данной главе рассмотрены результаты исследования тканей печени и селезенки,
содержащих железодепонирующие белки, в норме и при злокачественных заболеваниях
системы крови методом мессбауэровской спектроскопии. Поскольку в мессбауэровских
спектрах тканей невозможно различить вклады ферритина и гемосидерина, а основным
железодепонирующим белком является ферритин, то ферритиноподобное железо в тканях
будет в дальнейшем ассоциироваться с макромолекулами ферритина.
5.1 Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров тканей куриной
печени и селезенки в норме и при лимфоидном лейкозе
Мессбауэровские спектры тканей печени и селезенки здоровых куриц разного возраста и
выращенных на двух разных птицефабриках, измеренные при 295 К показаны на рисунке 5.1.
a
ЭФФЕКТ, %
ЭФФЕКТ, %
Спектры имеют схожий внешний вид, но отличаются по величине резонансного эффекта.
СКОРОСТЬ, мм/с
в
СКОРОСТЬ, мм/с
ЭФФЕКТ, %
ЭФФЕКТ, %
СКОРОСТЬ, мм/с
б
г
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 5.1 – Мессбауэровские спектры нормальной печени (а) и селезенки (б) курицы,
птицефабрика 1 и нормальной печени куриц в возрасте 148 дней (в) и 200 дней (г),
птицефабрика 2. Спектры представлены на 1024 канала, Т=295 К [232].
127
В результате аппроксимации измеренных спектров одним квадрупольным дублетом в
рамках модели гомогенного «железного ядра» были выявлены малые отличия значений
параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe [211, 224, 228, 232]. Эти параметры, а также
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
параметры ферритина печени человека показаны на рисунке 5.2.
0.670
0.650
0.630
0.610
0.590
0.570
0.550
0.530
0.345
0.365
0.385
0.405
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 5.2 – Отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров (см.
рисунок 5.1) аппроксимированных одним квадрупольным дублетом в рамках модели
гомогенного «железного ядра»: ферритин печени человека (), печень () и селезенка ()
курицы, птицефабрика 1 и печень куриц в возрасте 148 () и 200 дней (), птицефабрика 2 [232].
Интересно отметить, что оценки величины ∆EQ для ферритина печени человека и
ферритина в тканях куриной печени имеют небольшие отличия, которые могут быть
обусловлены различиями в структуре «железных ядер» ферритинов печени человека и курицы.
Более того оценки параметров δ и ∆EQ для ферритина куриной селезенки отличаются от оценок
этих параметров для ферритинов печени как человека, так и курицы. Это может быть также
связано с отличиями макромолекул ферритина, синтезированных в разных тканях. Небольшие
128
отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров тканей куриц,
выращенных на разных птицефабриках, может свидетельствовать о влиянии отличий в
рационах их питания на формирование «железных ядер». Отличия параметров, полученные для
спектров тканей печени куриц в возрасте 148 и 200 дней, также свидетельствуют о том, что
структура «железных ядер» может отличаться в зависимости от возраста. Более того было
отмечено, что значение величины резонансного эффекта возрастает с увеличением возраста.
Эти результаты показывают, что формирование «железных ядер» зависит от множества
факторов, следовательно, для получения достоверных корреляций между параметрами
сверхтонкой структуры ядер
57
Fe и различными факторами, требуется проведение большего
количества экспериментов.
В рамках упрощенной модели гетерогенного «железного ядра» была проведена
аппроксимация спектров куриных тканей печени и селезенки с использованием суперпозиции
двух квадрупольных дублетов. В отличие от выделенного ферритина печени человека в тканях
куриц содержание железа почти в десять раз меньше. Поэтому соотношение сигнал/шум в
мессбауэровских спектрах тканей существенно хуже, чем в спектрах выделенного ферритина.
Это влияет на качество аппроксимации мессбауэровских спектров тканей и не позволяет
статистически обоснованно использовать суперпозицию более двух квадрупольных дублетов.
Параметры мессбауэровских спектров ферритина тканей куриной печени и селезенки
приведены в таблице 5.1, а отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских
спектров тканей печени куриц с разных птицефабрик, полученные для двух компонент
показаны на рисунке 5.3.
Таблица 5.1 – Параметры мессбауэровских спектров ферритина нормальных тканей
куриной печени и селезенки, аппроксимированных двумя квадрупольными дублетами в рамках
модели гетерогенного «железного ядра» [232].
Образец
Печень,
птицефабрика 1
N1
1
2
δ, мм/с
0,360±0,005
0,396±0,012
∆EQ, мм/с
0,560±0,018
0,943±0,047
Г, мм/с
0,389±0,016
0,303±0,064
S, %
84,36
15,64
Селезенка,
птицефабрика 1
1
2
0,404±0,006
0,374±0,014
0,451±0,030
0,783±0,106
0,352±0,035
0,454±0,061
63,44
36,56
Печень 148 дней,
птицефабрика 1
1
2
0,373±0,009
0,382±0,010
0,507±0,033
0,786±0,065
0,342±0,010
0,566±0,051
34,25
65,75
Печень 200 дней,
птицефабрика 1
1
2
0,356±0,006
0,382±0,012
0,426±0,030
0,743±0,040
0,248±0,029
0,440±0,075
19,15
80,85
Примечание – номера компонент
аппроксимации, показанным на рисунке 5.1.
соответствуют
компонентам
наилучшей
0.575
0.555
0.535
0.515
0.495
Квадрупольный
дублет 1
0.475
0.354
0.364
0.374
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
КВАДР УПОЛЬНОЕ Р АСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
129
0.960
0.910
0.860
0.810
0.760
Квадрупольный
дублет 2
0.710
0.340
0.360
0.380
0.400
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 5.3 – Отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров,
представленных на рисунке 5.1 и аппроксимированных суперпозицией двух квадрупольных
дублетов в рамках модели гетерогенного «железного ядра»: печень курицы, птицефабрика 1
() и печень курицы, птицефабрика 2, в возрасте 148 () и 200 дней () [232].
Как видно из таблицы 5.1, имеется небольшое отличие величины ∆EQ для компоненты 1
спектров тканей печени куриц из двух разных птицефабрик, хотя для тканей печени куриц
разного возраста из птицефабрики 2 отличий в параметрах сверхтонкой структуры компоненты
1 не выявлено. Однако, оценки параметров δ и ∆EQ для компоненты 2 оказались отличны как
для мессбауэровских спектров тканей печени куриц с разных птицефабрик, так и для печени
куриц разного возраста из одной птицефабрики. Если связать компоненту 1 с меньшим
значением ∆EQ с областью «железного ядра», обладающей большей плотностью упаковки, а
компоненту 2 с большим значением ∆EQ с менее плотно упакованной областью «железного
ядра», то по значениям относительных площадей этих компонент можно оценить доли областей
«железных ядер» с различной плотностью упаковки для макромолекул ферритина в различных
тканях. Как видно из таблицы 5.1, в «железных ядрах» ферритина печени и селезенки куриц с
птицефабрики 1 доля менее плотно упакованной области меньше, а в «железных ядрах»
ферритина печени куриц с птицефабрики 2, наоборот – больше. Полученные результаты могут
отражать структурные отличия «железных ядер» ферритинов куриной печени и селезенки,
обусловленные различиями в процессах их формирования, которые могут быть связаны с
условиями содержания, пищевым рационом и возрастом куриц.
Мессбауэровские спектры тканей печени и селезенки курицы с лимфоидным лейкозом,
измеренные при 295 К и представленные на 1024 канала, показаны на рисунке 5.4. Вследствие
130
очень малого значения резонансного эффекта и большого соотношения сигнал/шум спектры
тканей курицы с лимфоидным лейкозом были аппроксимированы только одним квадрупольным
дублетом [231, 249, 250]. Нужно отметить, что в мессбауэровском спектре ткани печени курицы
с лимфоидным лейкозом выявлена компонента 2, соответствующая остаточному содержанию
гемоглобина в ткани. Отличия параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe в макромолекулах
ферритина в тканях куриной печени и селезенки в норме и при патологии показаны на рисунке
5.5. Несмотря на большие значения расчетных ошибок в определении параметров сверхтонкой
структуры из-за плохого качества спектров, можно сделать вывод о том, что величины ∆EQ
отличаются для куриных тканей как селезенки, так и печени в норме и при лимфоидном
лейкозе. На основании этих данных можно предположить, что «железные ядра» ферритина
печени и селезенки курицы с лимфоидным лейкозом имеют несколько большую степень
кристалличности по сравнению с «железными ядрами» ферритина в куриной печени и
a
ЭФФЕКТ, %
ЭФФЕКТ, %
селезенке в норме.
б
СКОРОСТЬ, мм/с
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 5.4 – Мессбауэровские спектры куриной печени (а) и селезенки (б) куриц больных
0.655
0.650
а
Лейкоз
0.645
0.640
0.635
0.630
0.625
0.620
Норма
0.615
0.610
0.340
0.350
0.360
0.370
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
лимфоидным лейкозом; Т=295 К [231].
б
0,600
0,590
0,580
Лейкоз
0,570
0,560
Норма
0,550
0,540
0,530
0,368
0,378
0,388
0,398
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 5.5 – Отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров тканей
печени (а) и селезенки (б) здоровой курицы и больной лимфоидным лейкозом [231].
131
5.2 Особенности наноразмерных «железных ядер» в железодепонирующих белках
тканей селезенки и печени здорового человека и больных злокачественными
заболеваниями системы крови
Для предварительной оценки содержания железа в тканях селезенки здорового человека
и больных злокачественными заболеваниями системы крови был проведен гистохимический
анализ (см. рисунок 5.6), в результате которого было обнаружено отличие в содержании железа
в тканях исследуемых образцов [235, 251–253]. В ткани селезенки в норме было обнаружено
малое количество сидерофагов (клетки, поглощающие и накапливающие железо) с
положительной реакцией на окрашивание по методу Перлса. На тонких срезах тканей селезенки
больных первичным миелофиброзом, острым миелолейкозом и лимфомой мантийной зоны
было обнаружено множество сидерофагов и железосодержащих областей, окрашенных синим
цветом.
a
б
в
г
Рисунок 5.6 – Результаты гистохимического анализа паренхимы нормальной селезенки (×400)
(a) и селезенки больных первичным миелофиброзом (×400) (б), острым миелолейкозом (×20) (в)
и лимфомой мантийной зоны (×20) (г). Ярко-синяя окраска и пунктирные области указывают на
клетки, содержащие Fe(III) [235].
132
Мессбауэровские спектры тканей селезенки и печени человека в норме и при
рассматриваемых злокачественных заболеваниях системы крови, измеренные при 295 К,
Норма
a
ЭФФЕКТ, %
ЭФФЕКТ, %
показаны на рисунках 5.7 и 5.8, соответственно.
Лимфома
СКОРОСТЬ, мм/с
c
Миелолейкоз
ЭФФЕКТ, %
СКОРОСТЬ, мм/с
ЭФФЕКТ, %
b
d
Миелофиброз
СКОРОСТЬ, мм/с
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 5.7 – Мессбауэровские спектры тканей селезенки человека в норме и при
злокачественных заболеваниях системы крови. Компоненты 1–3 являются результатом
наилучшей аппроксимации, компонента 3 относится к остаточному гемоглобину в тканях.
T=295 K [254].
Спектры
имеют
внешний
вид
парамагнитного
дублета,
соответствующего
железодепонирующим белкам. В ряде спектров наблюдалась дополнительная компонента 3,
обусловленная остаточным содержанием гемоглобина в тканях. Оказалось, что величина
резонансного эффекта в спектрах существенно отличается для нормальных тканей и тканей
больных, за исключением ткани селезенки больного лимфомой мантийной зоны. Это означает,
что в тканях селезенки больных первичным миелофиброзом и острым миелолейкозом и печени
больных лимфомой мантийной зоны и острым миелолейкозом содержание железа существенно
выше, чем в нормальных тканях и селезенке больного лимфомой мантийной зоны. В
предыдущем параграфе было отмечено, что при плохом соотношении сигнал/шум практически
невозможно аппроксимировать мессбауэровские спектры тканей, содержащих макромолекулы
133
ферритина, суперпозицией более, чем двух квадрупольных дублетов. Поэтому для сравнения
мессбауэровских параметров измеренных спектров тканей селезенки и печени человека в норме
и патологии при аппроксимации всех спектров использовалась упрощенная модель
гетерогенного «железного ядра», включающая суперпозицию только двух квадрупольных
a
Норма
ЭФФЕКТ, %
ЭФФЕКТ, %
дублетов.
СКОРОСТЬ, мм/с
СКОРОСТЬ, мм/с
ЭФФЕКТ, %
b
Лимфома
Миелолейкоз
c
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 5.8 – Мессбауэровские спектры тканей печени человека в норме и при злокачественных
заболеваниях системы крови. Компоненты 1–3 являются результатом наилучшей аппроксимации,
компонента 3 относится к остаточному гемоглобину в ткани. T=295 K [254].
Анализ результатов аппроксимации этих спектров суперпозицией двух квадрупольных
дублетов для описания ферритиноподобных компонент (модель гетерогенного «железного
ядра») показал следующее. Значения площадей спектров компонент, относящихся к
макромолекулам ферритина в тканях, нормированные на единицу веса соответствующего
образца (навески для образцов разных тканей были различны, см. главу 2, п. 2.1.3), приведены
на рисунке 5.9. Предполагая равенство вероятности эффекта Мессбауэра для «железных ядер»
исследуемых образцов, можно оценить отличия в содержании железа в этих образцах по
отличиям нормированных площадей спектров. Содержание ферритиноподобного железа в
образцах нормальной селезенки и селезенки больного лимфомой оказалось одинаковым, тогда
134
как для ткани селезенки больного острым миелолейкозом обнаружено увеличение содержания
ферритиноподобного железа чуть более, чем в 2 раза, а в ткани селезенки больного первичным
миелофиброзом – в 8 раз. Для тканей печени больных было обнаружено увеличение
содержания ферритиноподобного железа в 5–6 раз по сравнению с нормой. Для объяснения
различия в содержании железа в тканях печени и селезенки в норме и при патологии
необходимо учесть тот факт, что больным первичным миелофиброзом и острым миелолейкозом
проводилась гемотрансфузия (переливание крови), в то время как больному лимфомой
мантийной зоны переливание крови не проводилось. Известно, что при переливании крови
донорские эритроциты живут не более одного месяца, а затем разрушаются в селезенке с
высвобождением железа из гемоглобина [255]. Поэтому у больного лимфомой мантийной зоны
содержание железа в селезенке не отличается от нормы, в то время как увеличение содержания
железа в селезенке больных первичным миелофиброзом и острым миелолейкозом может быть
обусловлено переливанием крови. При этом содержание железа в печени больных острым
миелолейкозом и лимфомой мантийной зоны оказалось существенно выше, чем для печени в
норме, хотя для случая острого миелолейкоза содержание железа в печени несколько больше,
чем для случая лимфомы мантийной зоны. Это может свидетельствовать о том, что на
увеличение содержания железа в печени данных больных переливание крови оказывало
меньшее влияние, чем иные факторы, обусловленные патологическими процессами в
организме. Интересно отметить, что в селезенке больного первичным миелофиброзом
содержание железа превосходило не только содержание железа в селезенке в норме и при
лимфоме мантийной зоны (без переливания крови), но и при остром миелолейкозе (с
переливанием крови). Обсуждение причины этого факта будет дано ниже.
СЕЛЕЗЕНКА
20
15
10
5
Н
0
Л
О
ПЕЧЕНЬ
10
М
ОБЩАЯ ПЛОЩАДЬ/ВЕС,
отн. ед./мг ×10–5
ОБЩАЯ ПЛОЩАДЬ/ВЕС,
отн. ед./мг×10–5
25
8
6
4
2
Н
Л
О
0
Рисунок 5.9 – Сравнение нормированных площадей спектров в образцах тканей селезенки и
печени в норме (Н), при лимфоме мантийной зоны (Л), остром миелолейкозе (О) и первичном
миелофиброзе (М).
135
Сравнение параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров, полученных
для двух компонент, соответствующих ферритину, показано в координатах δ и ∆EQ на рисунках
5.10 и 5.11. Для обеих компонент мессбауэровских спектров тканей селезенки в норме и при
остром миелолейкозе были выявлены малые отличия параметров сверхтонкой структуры этих
спектров от параметров мессбауэровских спектров тканей селезенки при первичном
миелофиброзе и лимфоме мантийной зоны [235, 253, 256–258]. Для тканей печени в норме и
при патологиях были обнаружены небольшие отличия значений параметров сверхтонкой
структуры первого квадрупольного дублета мессбауэровских спектров, а также отличия
значений этих параметров для второго квадрупольного дублета в спектрах ткани печени при
остром миелолейкозе и в тканях в норме и при лимфоме [259–263]. В рамках гетерогенной
модели «железного ядра», использовавшейся для аппроксимации спектров исследуемых
образцов, можно предположить, что наименьшие значения ∆EQ, полученные для первой
компоненты, могут быть соотнесены с внутренними областями «железного ядра» с большей
плотностью упаковки и, наоборот, наибольшие значения ∆EQ, полученные для второй
компоненты, соответствуют внешним менее плотно упакованным областям/слоям «железных
Компонента 1
Лимфома
0.600
Миелофиброз
0.550
0.500
Миелолейкоз
Лимфома
1.010
0.910
Миелофиброз
Миелолейкоз
0.810
0.450
Норма
0.400
0.350
Компонента 2
1.110
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/с
ядер».
0.360
0.370
0.380
0.390
0.710
0.316
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Норма
0.336
0.356
0.376
0.396
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 5.10 – Малые отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
тканей селезенки в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови, полученные при
аппроксимации суперпозицией двух квадрупольных дублетов в рамках гетерогенной модели
«железного ядра» [254].
Компонента 1
Миелолейкоз
Лимфома
Норма
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/c
КВАДРУПОЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ, мм/c
136
Компонента 2
Миелолейкоз
Лимфома
Норма
ИЗОМЕРНЫЙ СДВИГ, мм/с
Рисунок 5.11 – Малые отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
тканей печени в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови, полученные при
аппроксимации суперпозицией двух квадрупольных дублетов в рамках гетерогенной модели [254].
Сравнение относительных площадей компонент мессбауэровских спектров, относящихся
к макромолекулам ферритина в тканях селезенки и печени, приведено на рисунке 5.12. Можно
предположить, что в «железном ядре» ферритина селезенки в норме менее плотно упакованные
области/слои составляют ~83 % в то время, как более плотно упакованные области составляют
~17 %. Для «железных ядер» ферритина в ткани селезенки больного острым миелолейкозом
менее плотно упакованные области/слои составляют ~71%, а более плотно упакованные – ~29
%. Для «железных ядер» ферритина в тканях селезенки больных первичным миелофиброзом и
лимфомой мантийной зоны наблюдается обратная ситуация: значительная часть «железного
ядра» имеет большую плотность упаковки (~77 % и ~71 %, соответственно), а менее плотно
упакованная часть составляет ~23 % и ~29 %, соответственно. Аналогичная тенденция отличий
областей «железных ядер» ферритина с разной плотностью упаковки наблюдается и для тканей
печени. Для нормы и острого миелолейкоза менее плотно упакованные области/слои
составляют большую часть «железного ядра»: ~81 % и ~65 %, соответственно, тогда как
области с большей плотностью упаковки составляют ~19 % и ~35 %, соответственно. Для ткани
печени больного лимфомой мантийной зоны в «железных ядрах» ферритина менее плотно
упакованные составляют ~46 %, а более плотно упакованные области – ~54 %.
137
СЕЛЕЗЕНКА
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Н
Л
О
М
БОЛЕЕ ПЛОТНО
УПАКОВАННЫЕ
ОБЛАСТИ
Н
ПЕЧЕНЬ
90
Л
О
М
МЕНЕЕ ПЛОТНО
УПАКОВАННЫЕ
ОБЛАСТИ
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ДОЛЯ, %
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ДОЛЯ, %
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Н
Л
О
БОЛЕЕ ПЛОТНО
УПАКОВАННЫЕ
ОБЛАСТИ
Н
Л
О
МЕНЕЕ ПЛОТНО
УПАКОВАННЫЕ
ОБЛАСТИ
Рисунок 5.12 – Сравнение относительных площадей компонент мессбауэровских спектров
тканей селезенки и печени, полученных при аппроксимации суперпозицией двух
квадрупольных дублетов: норма (Н), лимфома мантийной зоны (Л), острый миелолейкоз (О) и
первичный миелофиброз (М) [254].
Следует отметить, что повышение содержание ферритиноподобного железа в ткани
может быть следствием как увеличения количества ионов железа в «железном ядре» с ростом
размеров последнего вплоть до 8 нм, так и увеличения количества макромолекул ферритина без
изменения, либо с изменением размеров «железного ядра». Чтобы выяснить причину
повышения содержания ферритиноподобного железа в ткани селезенки с первичным
миелофиброзом (максимальное увеличение содержания железа) было проведено сравнение
мессбауэровского спектра этого образца, измеренного в скоростном диапазоне V=~±10 мм/с
при Т=90 К, со спектром селезенки больного β-талассемией из работы [198] при Т=78 К (см.
рисунок 5.13). Мессбауэровский спектр ткани селезенки больного β-талассемией представляет
собой суперпозицию магнитного секстета и парамагнитного дублета при 78 К, в то время как
для тканей селезенки в норме в мессбауэровском спектре при данной температуре наблюдается
только один квадрупольный дублет (см. глава 1, таблица 1.15). В мессбауэровском спектре
ткани селезенки больного первичным миелофиброзом при Т=90 К наблюдается только
суперпозиция парамагнитных дублетов. Следовательно, в случае β-талассемии для «железных
ядер» ферритина селезенки больного увеличивается барьер энергии магнитной анизотропии
(см. главу 1, п. 1.2.1 и формулу (4)) из-за увеличения размера «железных ядер», числа ионов
железа в них, а также степени кристалличности «железных ядер» с потерей способности
нормального функционирования белка.
ЭФФЕКТ, %
138
Т=78 К
β-талассемия/
гемоглобин Е
Т=78 К
β-талассемия
ЭФФЕКТ, %
СКОРОСТЬ, мм/с
Т=90 К
Миелофиброз
СКОРОСТЬ, мм/с
Рисунок 5.13 – Мессбауэровские спектры селезенки больных β-талассемией/гемоглобином Е, βталассемией [198] и первичным миелофиброзом [235].
Аналогичное увеличение барьера энергии магнитной анизотропии «железных ядер»
было выявлено при старении препарата Имферон (см. главу 3, п. 3.4). Поэтому для дальнейшей
оценки возможных отличий в размерах «железных ядер» были измерены мессбауэровские
спектры тканей селезенки в норме и при первичном миелофиброзе при Т=20 К с низким
скоростным разрешением (см. рисунок 5.14). Видно, что процедура фолдинга не позволяет
полностью устранить искажение базовой линии спектра (см. рисунок 5.14 б, г). Поэтому при
аппроксимации этих спектров приходилось дополнительно учитывать искажение базовой
линии спектра. Оказалось, что спектр ткани селезенки в норме может быть аппроксимирован
лишь одной парамагнитной компонентой, поскольку возможное присутствие небольшого по
интенсивности магнитного секстета может маскироваться искажением базовой линии спектра.
В то же время мессбауэровский спектр ткани селезенки больного первичным миелофиброзом
был аппроксимирован суперпозицией небольшого по интенсивности магнитного секстета и
139
основного парамагнитного дублета с учетом искажения базовой линии спектра. Следует
отметить, что в мессбауэровском спектре выделенного ферритина печени человека,
измеренного при 20 К также выявляется небольшой по интенсивности магнитный секстет (см.
глава 3, рисунок 3.20). Оценки магнитного сверхтонкого поля для ферритина нормальной
печени человека и селезенки больного первичным миелофиброзом составили 378±8 кЭ и 426±7
кЭ, соответственно. Для магнитных компонент мессбауэровских спектров селезенки больного
β-талассемией при Т=78 К и препарата Имферон при Т=90 К были получены значения Heff=470
кЭ [198] и Heff=472,0±0,6 кЭ и 485,2±0,3 кЭ [231], соответственно. Большие значения
магнитного сверхтонкого поля указывают на то, что «железные ядра» в препарате Имферон и
селезенке больного β-талассемией могут иметь большую степень кристалличности и большие
размеры «железного ядра», чем в ферритине печени человека и селезенки в норме и при
первичном миелофиброзе. Относительная площадь магнитной компоненты в мессбауэровском
спектре ферритина печени человека при 20 К составляет ~10 % (см. глава 3, таблица 3.5), в то
время как в спектре селезенки больного первичным миелофиброзом относительная площадь
магнитной компоненты составила ~19 %. Поэтому можно заключить, что барьер энергии
магнитной анизотропии для «железных ядер» ферритина ткани селезенки больного первичным
миелофиброзом несколько выше, чем для «железных ядер» ферритина печени человека и ткани
селезенки в норме в результате некоторого увеличения размера «железного ядра» при
патологии. Как было указано в главе 1, п. 1.1, обычное содержание ионов железа в ферритине
составляет ~2500, а максимальное заполнение белковой полости ионами железа достигается
при ~4000 ионов железа. Поэтому, если предположить, что при патологии происходит полное
насыщение
макромолекул
ферритина
ионами
железа,
то
общее
содержание
«ферритиноподобного железа» в ткани при сохранении того же количества макромолекул
ферритина увеличится почти в 2 раза. Однако, полученные результаты (см. рисунок 5.12)
свидетельствуют о возрастании содержания «ферритиноподобного железа» в селезенке
больного первичным миелофиброзом в 8 раз. Следовательно, на основании полученных
результатов можно сделать вывод о том, что в селезенке данного больного первичным
миелофиброзом существенно увеличено число макромолекул ферритина по сравнению с
нормой с небольшим возрастанием размеров «железного ядра».
Увеличение числа макромолекул ферритина в ткани селезенки больного первичным
миелофиброзом, обусловившее существенное возрастание «ферритиноподобного железа» в
ткани, можно объяснить следующим образом. Первичный миелофиброз – это злокачественное
заболевание
системы
крови,
при
котором
происходит
замещение
костного
мозга
соединительной тканью. В результате нарушается гемопоэз (кроветворение) в организме. Для
компенсации организм переносит функцию кроветворения из поврежденного фиброзом
140
костного мозга в другие органы, например, в селезенку, печень, лимфатические узлы. В случае
данного больного функции кроветворения начали осуществляться селезенкой, что привело к
существенному увеличению ее размеров (спленомегалии). Для реализации компенсаторного
кроветворения в селезенке должен быть накоплен необходимый уровень содержания железа.
Поэтому в селезенке усилился синтез макромолекул апоферритина, в которых начало
накапливаться избыточное железо, необходимое для гемопоэза, а также появившееся в
результате разрушение гемоглобина донорских эритроцитов. Поскольку в данном случае
избыток железа был необходим для синтеза гемоглобина в ткани селезенки, он не представлял
для организма такой же токсической опасности, как избыток железа, например, при βталассемии. Поэтому «железные ядра» ферритина должны были по своей структуре быть
близки к нормальному ферритину, обеспечивая близкий к физиологическому доступ к ионам
Норма
b
ЭФФЕКТ, %
СКОРОСТЬ, мм/с
Т=20 К
Миелофиброз
c
СКОРОСТЬ, мм/с
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ИНТЕНСИВНОСТЬ
Т=20 К
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ИНТЕНСИВНОСТЬ
ЭФФЕКТ, %
железа, необходимым для синтеза гемоглобина и других железосодержащих ферментов.
e
КАНАЛЫ
f
КАНАЛЫ
Рисунок 5.14 – Мессбауэровские спектры нормальной селезенки человека и селезенки больного
первичным миелофиброзом, измеренные в 250 каналов с последующим фолдингом, и
соответствующие разности между спектрами, измеренными на прямом и обратном ходе
(показаны справа) [235].
141
Для оценки присутствия других соединений Fe(III) в тканях дополнительно были
проведены измерения магнитных свойств тканей печени здоровых людей и больных
злокачественными заболеваниями системы крови [264, 265]. Аналогичные исследования тканей
селезенки в данном случае не являются значимыми в связи с тем, что, как показали измерения
мессбауэровских спектров, повышенное содержание железа в селезенке в гораздо большей
степени, чем в печени, зависят от переливания крови больному. Поэтому для анализа
дополнительных
соединений
Fe(III),
определяемых
преимущественно
патологическим
процессом, далее приводятся результаты магнитных измерений только тканей печени.
Кривые намагниченности ZFC и FC, измеренные для образца нормальной печени при
Н=100 Э, приведены на рисунке 5.15. Бифуркации ниже 60 К являются типичными для случая
FC>ZFC. На кривых намагниченности, измеренных при Н=1 кЭ, имеются две особые точки при
Т=36 К и Т=123 К. Возможно, появление перегиба при 123 К можно объяснить переходом
Вервея, который обычно наблюдается для наночастиц Fe3O4. Следовательно, можно
предположить, что в образце печени здорового человека может присутствовать небольшое
количество магнетита.
б
Н=1 кЭ
ТЕМПЕРАТУРА, К
МОМЕНТ,
МОМЕНТ, эме/г
эме/г
МОМЕНТ, эме/г
МОМЕНТ, эме/г
а
Н=100 Э
Н=1 кЭ
ТЕМПЕРАТУРА, К
ТЕМПЕРАТУРА,
ТЕМПЕРАТУРА, К
К
Рисунок 5.15 – Кривые намагниченности ZFC нормальной печени человека в температурном
диапазоне 5–250 К в поле Н=1 кЭ, на вставке в увеличенном масштабе показан перегиб ZFC
при 123 К (а) и кривые намагниченности ZFC и FC в поле Н=100 Э (б) [265].
При низких температурах кривые намагниченности следуют закону Кюри-Вейсса для
парамагнетиков:
χ(T) =χ0 +C/(T–Θ),
(9)
где χ=M/H, χ0 – не зависит от температуры, С – постоянная Кюри, Θ – температура Кюри. Для
142
кривой намагниченности, измеренной при 1 кЭ были получены следующие парамагнитные
параметры: χ0=4,5×10–6 эме/(г×Э), C=1,45(1)×10–5 эме К/г Э и Θ=1,3(3) K. Поскольку
молекулярный вес ткани печени не известен, невозможно определить значение эффективного
магнитного момента. Так как ткань печени человека является диамагнитной [266], то
возникновение парамагнитного участка на кривой намагниченности, а также точки бифуркации
при 36 К можно рассматривать как результат внутренних особенностей ткани печени и
присутствием различных клеточных компонент.
Кривые намагниченности ZFC и FC для ткани печени больного лимфомой мантийной
зоны, измеренные в поле Н=1 кЭ, показаны на рисунке 5.16. На кривой ZFC наблюдается
отчетливый пик при Т=53 K. Интересно отметить факт пересечения кривых FC и ZFC при Т=48
К и Т=68 K, что оказалось неожиданным, поскольку в обычных условиях ZFC<FC. Таким
образом, в температурном диапазоне 48–68 К наблюдалось весьма редкое уникальное явление,
когда ZFC>FC. Для того, чтобы проверить воспроизводимость этого результата, на следующий
день были проведены повторные измерения (2) при Н=1 кЭ от температуры 20 К, чтобы
исключить вклад парамагнитной компоненты. В этом случае было обнаружено, что при 48 К
наблюдается небольшой подъем вместо четкого пика. Также следует отметить, что ZFC(2) не
пересекает кривую FC(2). Однако, обе кривые FC совпадают в пределах ошибки, из чего
следует, что образец за это время не был поврежден и в нем нет остаточной намагниченности.
Бифуркации кривых ZFC и FC вблизи 120 K для обоих измерений подтверждают
существование очень малого количества магнетита в этом образце. При измерении кривых
намагниченности при Н=2,5 кЭ оказалось, что небольшой подъем на кривой ZFC полностью
исчезает. Таким образом, можно отметить две особенности: ZFC>FC в определенном
температурном диапазоне (очень редкое явление) и исчезновение пика при Т=53 К на кривой
ZFC(2). Подобные особенности наблюдались ранее лишь в нескольких случаях для
легированных (серой или бором) промышленных и синтетических аморфных углеродных
материалов [267, 268], для пучков двуслойных нанотрубок [269]. Также появление области
ZFC>FC наблюдалось и в отсутствии углерода для мульти слоев Ni/Al на подложке SiO2 [270].
Выявленные особенности не наблюдаются при повторном измерении одного и того же образца.
Появление пика при Т=53 К на кривой ZFC может быть связано с присутствием связанного
кислорода на поверхности образца. Однако, пик, обусловленный влиянием кислорода, должен
появляться на обеих кривых ZFC и FC [268]. Если предположить, что появление этого пика
обусловлено присутствием Fe3O4, то этот пик также должен присутствовать и на кривой FC.
Можно предположить, что данный пик является артефактом, вызванным неполадками SQUID
магнетометра или нарушением оптимальных условий эксперимента. Однако все образцы
измерялись в одинаковых условиях и, как видно из рисунков 5.15 и 5.17, подобный пик
143
отсутствует. Вероятно, выявленные особенности взаимосвязаны. Если образец ткани печени
больного лимфомой мантийной зоны можно представить в виде системы двух состояний,
которые могут быть описаны двумя потенциальными ямами, разделенными энергетическим
барьером, то существует конечная вероятность обнаружить систему в одном из состояний.
Поскольку образец ткани печени больного лимфомой является негомогенным, то при первом
измерении ZFC он может находиться в одном из двух магнитных состояний, приводящем к
возникновению на кривой ZFC отчетливого пика при 53 К. При последующих измерениях
система переходит в другое магнитное состояние, и пик не наблюдается при измерении FC и
последующих повторных измерениях ZFC и FC. Однако, данные особенности требуют
специального исследования, выходящего за рамки данной работы.
б
а
H = 1 кЭ
H = 1 кЭ
Рисунок 5.16 – Кривые намагниченности ZFC и FC ткани печени больного лимфомой мантийной
зоны, измеренные в поле Н=1 кЭ, первое измерение, отмечен явный пик при Т=53 К на кривой
ZFC (а) и кривые намагниченности ZFC и FC ткани печени больного лимфомой мантийной зоны,
измеренные в поле Н=1 кЭ, второе измерение через сутки после первого (б) [265].
Чтобы проверить наличие двух обсуждаемых аномалий в образце ткани печени больного
острым миелолейкозом, были проведены измерения кривых ZFC и FC, показанные на рисунке
5.17. На кривой ZFC наблюдается отчетливый пик при Т=54 К. Кривые ZFC и FC фактически
сливаются при Т=120 К и выше. Однако, для образца ткани печени при остром миелолейкозе
наблюдалось обычное расположение кривых намагниченности, при котором всегда FC>ZFC.
Оказалось, что для ткани печени при остром миелолейкозе пик на кривой ZFC при Т=54 К
является воспроизводимым, в отличие от образца ткани печени больного лимфомой мантийной
зоны. Очевидно, что причины появления данного пика для исследованных тканей печени
больных острым миелолейкозом и лимфомой мантийной зоны имеют различную природу,
которая требует дополнительных исследований.
144
H = 1 кЭ
Рисунок 5.17 – Кривые намагниченности ZFC и FC ткани печени больного острым
миелолейкозом, измеренные в поле Н=1 кЭ [265].
Изотермические кривые намагниченности M(H) образца нормальной печени человека,
измеренные при 25 и 255 К, приведены на рисунке 5.18 и могут быть описаны по формуле:
M(H) = MS + χdH,
(10)
где MS – магнитный момент насыщения, обусловленный спонтанной ферромагнитной
намагниченностью, χdH=–2,5×10–6 эме/г – линейная диамагнитная восприимчивость. При 25 К
значение MS=0,017±0,001, а при 255 К MS=0,012±0,001 эме/г. Полученные значения MS можно
связать с присутствием очень малого количества ферримагнитной фазы с температурой
магнитного упорядочения выше комнатной. Если предположить, что такой фазой является
магнетит Fe3O4, для которого TC=853 К, MS=96 эме/г [271], то доля этой фазы в образце
нормальной ткани печени составит ~1,5×10–2 %, что ниже пределов чувствительности
мессбауэровской спектроскопии.
Изотермические кривые намагниченности M(H), измеренные при 25 K, для ткани печени
больного лимфомой мантийной зоны схожи с кривой намагниченности для образца ткани
печени в норме и отличаются от кривой намагниченности М(Н) для образца ткани печени
больного острым миелолейкозом (рисунок 5.19). Используя формулы (9) для зависимости M(T)
и (10) для M(H) образца ткани печени больного лимфомой мантийной зоны, можно получить
следующие значения: χ0=3,3×10–6 эме/(г×Э), C=4,44(1)×10–5 эме×K/(г×Э) и Θ=–6,7(3) K,
MS=0,033(1) эме/г при Т=25 К и MS=0,021(1) эме/г при Т=255 K (что соответствует доле
предполагаемого магнетита 3×10–2 %). Полученные величины C и MS для образца ткани печени
больного лимфомой мантийной зоны оказались больше, чем для ткани печени в норме, что
145
может быть связано с большим содержанием ионов железа в парамагнитной фазе/фазах, а также
с более высокой концентрацией магнетита.
МОМЕНТ, эме/г
emu/gпри
at 25
S=0.017эме/г
25KК
МM
S=0,017
M(H) при
at 2525
KК
–χdH при
at 25 25
K К
M(H) at 255
255 K
М(Н)при
К
N-L
ПОЛЕ, кЭ
Рисунок 5.18 – Кривые изотермической намагниченности, измеренные при 25 и 255 К для
нормальной печени человека. Также показаны линейная диамагнитная восприимчивость (χdH) и
зависимость магнитного момента насыщения MS [265].
МОМЕНТ, эме/г
Т=25 К
Лимфома
мантийной зоны
Острый
миелолейкоз
Норма
ПОЛЕ, Э
Рисунок 5.19 – Кривые изотермической намагниченности для тканей печени здорового человека
и больных лимфомой мантийной зоны и острым миелолейкозом, измеренные при 25 К [265].
Для образца ткани больного острым миелолейкозом были получены следующие
значения параметров: χ0=1,25×10–5 эме/(г×Э), C=5,3(1)×10–5 эме×K/(г×Э) и Θ=–6,9(3) K. Видно,
146
что для образцов ткани печени при двух патологиях температура Кюри имеет близкие значения,
что может быть связано со схожестью парамагнитных фаз в этих образцах. Значение
магнитного момента насыщения можно получить, используя формулу (10). Таким образом, для
образца ткани печени при остром миелолейкозе при 25 К было получено значение MS=0,106
эме/г (что соответствует ~0,1 % предполагаемого магнетита), которое оказалось в 3 раза
больше, чем MS для ткани печени больного лимфомой мантийной зоны. Также следует
отметить, что для ткани печени больного острым миелолейкозом M(H) принимает только
положительные значения, а для ткани печени здорового человека и больного лимфомой
мантийной зоны – в основном отрицательные (см. рисунок 5.19).
Следует отметить, что ранее в работах [63, 272] в мессбауэровских спектрах тканей
селезенки и базальных ядер тканей мозга человека было предположено присутствие компонент
спектров, соответствующих магнетиту/маггемиту. В последующей работе этих авторов [203] в
мессбауэровских спектрах тканей селезенки больных наследственным сфероцитозом и
гемосидерозом было предположено присутствие компонент спектров, соответствующих
маггемиту. Однако, в результате проведенных нами магнитных измерений образцов тканей
печени здорового человека и двух больных злокачественными заболеваниями системы крови
была оценена возможная доля магнетита в этих тканях, которая составила от 1,5×10–2 до 0,1 %.
В этом случае присутствие даже 0,1 % магнетита в образце ткани печени невозможно
достоверно выявить в мессбауэровском спектре (см. рисунок 5.8) при данном соотношении
сигнал/шум. Поэтому полученные результаты анализа мессбауэровских спектров тканей
селезенки и печени, очевидно, имеют отношение только к ферригидриту в «железных ядрах»
железодепонирующих белков.
5.3 Выводы
1. Обнаружены отличия в содержании ферритиноподобного железа в тканях печени и
селезенки здорового человека и трех больных злокачественными заболеваниях системы крови.
Показано, что переливание крови могло повлиять на увеличение содержания железа в селезенке
больного острым миелолейкозом, в то время как существенное возрастание содержания железа
в селезенке больного первичным миелофиброзом обусловлено в основном молекулярной
природой патологии. Переливание крови не оказало существенного влияния на увеличение
содержания железа в печени больного острым миелолейкозом.
2. В рамках упрощенной модели гетерогенного «железного ядра» проведена
аппроксимация мессбауэровских спектров образцов тканей печени и селезенки здорового
человека и трех больных злокачественными заболеваниях системы крови суперпозицией двух
147
квадрупольных дублетов. Эти дублеты по величине квадрупольного расщепления были
соотнесены с более аморфной и более кристаллической областями наноразмерных «железных
ядер» в железодепонирующих белках.
3. Выявлены небольшие отличия параметров сверхтонкой структуры компонент
мессбауэровских спектров образцов тканей печени и селезенки здорового человека и трех
больных злокачественными заболеваниях системы крови.
4. Обнаружены отличия в соотношении областей наноразмерных «железных ядер» с
различной плотностью упаковки и, соответственно, различным значением градиента
электрического поля на ядрах
57
Fe, для железодепонирующих белков в тканях селезенки и
печени здоровых людей и больных злокачественными заболеваниями системы крови.
5. В результате магнитных измерений было показано, что все образцы тканей печени
являются негомогенными и состоят из двух фаз: диамагнитной матрицы и магнитной фазы/фаз,
которые проявляются в виде пика при Т=53 К для образцов ткани печени при патологии и в
виде плато при Т=36 К для образца ткани печени в норме. Предположено возможное
присутствие магнетита в тканях печени, содержание которого существенно больше при
патологии, однако недостаточно для его выявления методом мессбауэровской спектроскопии.
6. Для образца ткани печени больного лимфомой мантийной зоны выявлено аномальное
поведение кривой ZFC, которая имеет пик при Т=53 К, пересекает кривую FC при Т=48 К и
Т=68 К и в этом температурном диапазоне ZFC>FC. При повторном измерении данного образца
пик при Т=53 К на кривой ZFC исчезает. Возможно, это связано с наличием двух магнитных
состояний в данной системе.
148
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая работа посвящена изучению особенностей наноразмерных «железных ядер» в
макромолекулах
ферритина
и
его
фармацевтически
важных
аналогах,
а
также
в
железодепонирующих белках тканей печени и селезенки в норме и при злокачественных
заболеваниях системы крови методом мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным
разрешением. Дополнительно исследуемые образцы были охарактеризованы методами TEM,
SEM с EDS, ЭПР, рентгеновской дифракции, термогравиметрии, магнитных измерений.
Применение прецизионного высоко стабильного мессбауэровского спектрометрического
комплекса с высоким скоростным разрешением позволило измерять спектры с более высоким
качеством и получать меньшие значения инструментальной ошибки при определении
параметров сверхтонкой структуры ядер 57Fe, чем при измерении на обычных мессбауэровских
спектрометрах. В результате проведенных исследований были сделаны следующие основные
выводы.
1. Обнаружены отличия параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров
ферритина печени человека, его фармацевтических аналогов – препаратов Имферон,
Мальтофер® и Феррум Лек, а также ферритина бактерий при 295 и 90 К, аппроксимированных в
предположении гомогенной структуры «железного ядра».
2. Показано, что величина барьера энергии магнитной анизотропии для наноразмерных
«железных ядер» в ферритине печени человека ниже, чем в его аналогах – препаратах Феррум
Лек и Мальтофер®, в то время как для самих аналогов величина барьера фактически
одинаковая.
3. Температура Дебая для атомов железа, оцененная в рамках модели гомогенного
«железного ядра», составляет ΘD=461±16 К для ферритина печени человека и ΘD=502±24 К для
его аналога – препарата Феррум Лек.
4. Разработан новый подход к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина и
его аналогов в рамках гетерогенной модели «железного ядра», предполагающий однородность
структуры в пределах соответствующего слоя/области/нанодомена и позволяющий адекватно
аппроксимировать мессбауэровские спектры ферритина печени человека и бактерий, а также
препаратов Феррум Лек и Мальтофер® при различных температурах в диапазоне 295–90 К. Это
позволило получить температурные зависимости мессбауэровских параметров для отдельных
компонент спектров, которые были связанны с различными слоями/областями/нанодоменами
«железных ядер».
5. В температурном диапазоне 295–90 К обнаружено аномальное изменение некоторых
параметров мессбауэровских спектров наноразмерных «железных ядер» ферритина печени
149
человека и его аналога – препарата Феррум Лек, которые могут быть связаны с
низкотемпературными
структурными
перестройками
в
соответствующих
слоях/областях/нанодоменах «железных ядер».
6. Обнаружены отличия в содержании ферритиноподобного железа в тканях печени и
селезенки здорового человека и трех больных злокачественными заболеваниях системы крови.
Показано, что переливание крови могло повлиять на увеличение содержания железа в селезенке
больного острым миелолейкозом, в то время как существенное возрастание содержания железа
в селезенке больного первичным миелофиброзом обусловлено в основном молекулярной
природой патологии. Переливание крови не оказало существенного влияния на увеличение
содержания железа в печени больного острым миелолейкозом.
7. В рамках упрощенной модели гетерогенного «железного ядра» проведена аппроксимация
мессбауэровских спектров образцов тканей печени и селезенки здорового человека и трех больных
злокачественными заболеваниях системы крови суперпозицией двух квадрупольных дублетов,
которые по величине квадрупольного расщепления были соотнесены с более плотно упакованными
и
менее
плотно
упакованными
областями
наноразмерных
«железных
ядер»
в
железодепонирующих белках, характеризующихся соответственно меньшим или большим
значением градиента электрического поля на ядрах 57Fe.
8. Выявлены небольшие отличия параметров сверхтонкой структуры ядер 57Fe и отличия
в соотношении областей наноразмерных «железных ядер» с различной плотностью упаковки
для образцов тканей печени и селезенки здорового человека и трех больных злокачественными
заболеваниях системы крови.
Дальнейшее развитие исследований по теме диссертационной работы будет связано с
применением новой модели при аппроксимации мессбауэровских спектров различных
«железных ядер» ферритинов и их аналогов, с изучением особенностей низкотемпературных
структурных переходов в «железных ядрах», с исследованием новых аналогов ферритина, а
также тканей селезенки и печени при злокачественных заболеваниях системы крови.
В заключение автор выражает благодарность проф., д.м.н. П.Г. Прокопенко, к.м.н. А.В.
Виноградову, к.м.н. Т.С. Константиновой, к.х.н. А.Л. Берковскому, проф., д.х.н. А.А. Камневу,
к.х.н. А.В. Тугаровой, к.б.н. Л.И. Малахеевой, Ю.В. Клеповой, проф., д.б.н. Н.В. Садовникову и
Prof., Dr. S. Dubiel за содействие в получении образцов для исследования; к.ф.-м.н. В.А.
Семѐнкину, д.ф.-м.н. М.И. Оштраху, Е.Г. Новикову, М.В. Горюнову, к.ф.-м.н. М.В. Ушакову,
к.ф.-м.н. М.Ю. Ларионову за помощь в проведении непрерывных долговременных измерений
мессбауэровских спектров с высоким скоростным разрешением; Prof., Dr.Sc. E. Kuzmann за
помощь в проведении измерений мессбауэровских спектров с низким скоростным разрешением
150
при температурах ниже 90 К; Prof., Dr. I. Felner за помощь в проведении магнитных измерений;
к.ф.-м.н. А.В. Чукину, Р.Ф. Самигуллиной, Prof., Dr. I. Felner, Dr. P. Németh, Dr. Z. Klencsár,
к.м.н. С.Е. Иощенко за содействие в проведении дополнительных исследований изучаемых
образцов; Prof., Dr.Sc. E. Kuzmann, Dr. Z. Klencsár, Prof., Dr. I. Felner, Dr. S. Dubiel за полезное
участие в анализе и обсуждении полученных результатов.
151
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
TEM – transmission electron microscopy (трансмиссионная электронная микроскопия);
XRD – X-ray diffraction (рентгеновская дифракция);
ЭПР – электронный парамагнитный резонанс;
ED – electron diffraction (электронная дифракция);
EXAFS – extended X-ray absorbtion fine structure (тонкая структура расширенного края
рентгеновского спектра поглощения);
а – параметр решетки;
с – параметр решетки;
d – межплоскостное расстояние;
N – координационное число;
R – расстояние;
g – фактор расщепления;
geff – эффективный фактор расщепления;
ZFC – zero cooled field (охлаждение в нулевом поле);
FC – cooled field (охлаждение в поле);
K – константа магнитной анизотропии;
V – объем;
KV – энергетический барьер;
kT – тепловая энергия;
k – постоянная Больцмана
Т – температура;
TB – блокирующая температура;
Tord – температура магнитного упорядочения;
TN – температура Нееля;
Н – магнитное поле;
 – магнитная восприимчивость;
МS – магнитный момент насыщения;
 – время суперпарамагнитной релаксации;
 – изомерный сдвиг;
ЕQ – квадрупольного расщепления;
 – квадрупольный сдвиг;
Г – ширина линии мессбауэровского спектра на половине высоты;
152
S – относительная площадь
Heff – сверхтонкое магнитное поле;
 – стандартное отклонение;
2 – статистический критерий;
ГЭП – градиент электрического поля.
153
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Граник, С. Обмен железа у животных и растений / С. Граник. – в сб.: Микроэлементы, пер.
с англ. – М., 1962.
2. Theil, E.C. Ferritin: structure, gene regulation, and cellular function in animals, plants, and
microorganisms / E.C. Theil // Annual Reviews Biochemistry. – 1987. – V. 56. – P. 289–315.
3. Harrison, P.M. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation /
P.M. Harrison, P. Arosio // Biochimica et Biophysica Acta. – 1996. – V. 1275. – P. 161–203.
4. Boas, J.F. Mössbauer Effect in Ferritin / J.F. Boas, B. Window // Australian Journal of Physics. –
1966. – V. 19. – P. 573–576.
5. Boas, J.F. Electron spin resonance and Mössbauer effect studies of ferritin / J.F. Boas, G.J. Troup
// Biochimica et Biophysica Acta. – 1971. – V. 229. – P. 68–74.
6. Харрисон, П.М. Ферритин: в кн.: Неорганическая биохимия / П.М. Харрисон, Т.Г. Хой;
под общ. ред. Г. Эйхгорна. – М.: Мир, 1978. – Т. 1. – C. 300–330.
7. Aisen, P. Iron transport and storage proteins / P. Aisen, I. Listowsky // Annual Reviews
Biochemistry.– 1980. – V. 49. – P. 357–393.
8. Ford, G.C. Ferritin – Design and formation of an iron-storage molecule / G.C. Ford, P.M.
Harrison, D.W. Rice, J.M.A. Smith, A. Treffry, J.L. White, J. Yariv // Philosophical Transactions of
the Royal Society of London Series B – Biological Sciences – 1984. – V. 304. – P. 551–565.
9. Andrews, S.C. Studies on haemosiderin and ferritin from iron-loaded rat liver / S.C. Andrews,
M.C. Brady, A. Treffry, J.M. Williams, S. Mann, M.I. Cleton, W. de Bruijh, P.M. Harrison // Biology
of Metals. – 1988. – V. 1. – P. 33–42.
10. Massover, W.H. Ultrastructure of ferritin and apoferritin: a review / W.H. Massover // Micron.
– 1993. – V. 24. – №4. – P. 389–437.
11. Bauminger, E.R. How does the ferritin core form / E.R. Bauminger, P.M. Harrison, D. Hechel,
I. Nowik, A. Treffry // Hyperfine Interactions – 1994. – V. 91. – P. 835–839.
12. Proulx-Curry, P.M. Molecular Aspects of Iron Uptake and Storage in Ferritin / P.M. ProulxCurry, N.D Chasteen // Coordination Chemistry Reviews. – 1995. – V. 144. – P. 347–68.
13. Chasteen, N.D. Mineralisation of ferritin: an efficient means of iron storage / N.D. Chasteen,
P.M. Harrison // Journal of Structural Biology. – 1999. – V. 126. – P. 182–194.
14. Webb, J. Iron biominerals in medicine and environment / J. Webb, D.J. Macey, W. Chua–
anusorn, T.G. St. Pierre, L.R. Brooker, I. Rahman, B. Noller // Australia Coordination Chemistry
reviews. – 1999. – P. 1199–1213.
15. Theil, E.C. Iron, ferritin, and nutrition / E.C. Theil // Annual Reviews Nutrition. – 2004. – V.
24. – P. 327–43.
154
16. Lewin, A. Formation of protein coated iron minerals / A. Lewin, G.R. Moore, N.E. le Brun //
Dalton Transactions – 2005. – P. 3597–3610.
17. Hintze, K.J. Cellular regulation and molecular interactions of the ferritins / K.J. Hintze, E.C.
Theil // Cellular and Molecular Life Scinces. – 2006. – V. 63. – P. 591–600.
18. Arosio, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more / P. Arosio,
R. Ingrassia, P. Cavadini // Biochimica et Biophysica Acta. – 2009. – V. 1790. – P. 589–599.
19. Andrews, S.C. The ferritin-like superfamily: evolution of the biological iron storeman from a
rubrerythrin-like ancestor / S.C. Andrews // Biochimica et Biophysica Acta. – 2010. – V. 1800. P.
691–705.
20. Michel, F.M. Reactivity of ferritin and the structure of ferritin-derived ferrihydrite / F.M.
Michel, H-A. Hosein, D.B. Hausner, S. Debnath, J.B. Parise, D.R. Strongin // Biochimica et
Biophysica Acta. – 2010. – V. 1800. – P. 871–885.
21. Ceci, Р. Biomimetic materials synthesis from ferritin-related, cage-shaped Proteins,book chapter
in: Advanced Topics in Biomineralization / Р. Ceci, V. Morea, M Fornara, G. Bellapadrona, E. Falvo,
A. Ilari; Ed.: Dr. Jong Seto – InTech, 2012. – Р. 113–137.
22. Andrews, S.C. Iron storage in bacteria / S.C. Andrews // Advances in Microbial Physiology –
1998. – V.40. – P. 281–351.
23. Le Brun, N.E. Iron core mineralisation in prokaryotic ferritins / N.E. Le Brun, A. Crow, M.E.P.
Murphy, A.G. Mauk, G.R. Moore // Biochimica et Biophysica Acta. – 2010. – V. 1800. – P. 732–744.
24. Dickson, D.P.E. Mössbauer spectroscopy, electron microscopy and electron diffraction studies
of the iron cores in various human and animal haemosiderins / D.P.E. Dickson, N.M.K. Reid, S. Mann,
V.J. Wade, R.J. Ward, T.J. Peters // Biochimica et Biophysica Acta. – 1988. – V. 957. – P. 81–90.
25. Webb J. Iron biominerals in medicine and the Environment / J. Webb, D.J. Macey, W. Chuaanusorn, T.G. St. Pierre, L.R. Brooker, I. Rahman, B. Noller // Coordination Chemistry Reviews. –
1999. – V. 190 – 192. –P. 1199–1215.
26. Rahman, I.H.A. Characterization of dugong liver ferritin / I.H.A Rahman, W. Chua-anusorn, J.
Webb, D.J. Macey, T.G. St. Pierre // Analytica Chimica Acta. – 1999. –V. 393. – P. 235–243.
27. Dobson, J. Nanoscale biogenic iron oxides and neurodegenerative diseases / J. Dobson // FEBS
Letters. – 2001. – V. 496. – P. 1–5.
28. Ke, Y. Iron misregulation in the brain: a primary cause of neurodegenerative disorders / Y.Ke,
Z.Qian // Lancet Neurology. – 2003. – V. 2. – P. 246–253.
29. Beutler, E. Iron deficiency and overload / E. Beutler, A. V. Hoffbrand, J D. Cook //
Hematology. – 2003. – P. 40–61.
30. Pietrangelo, A. Haemochromatosis / A. Pietrangelo // Gut. – 2003. – V. 52. – Suppl II. – P. 23–30.
31. Dobson, J. Magnetic iron compounds in neurological disorders /J. Dobson // Ann. New York
155
Academy of Science. – 2004. – V. 1012. – P. 183–192.
32. Kirschvink, J.L. Magnetic biomineralization in the human brain / J.L. Kirschvink, A.
Kobayashi- Kirschvink, B.J. Woodford // Proceedings of the National Academy of Science of the
USA. –1992. – V. 89. – P. 7683–7687.
33. Schultheiss-Grassi, P.P. TEM observation of biogenic magnetite extracted from human
hippocampus / P.P. Schultheiss-Grassi, R. Wessiken, J. Dobson // Biochimica et Biophysica Acta. –
1999. – V. 1426. – P. 212–216.
34. Quintana, C. Initial studies with high resolution TEM and electron energy loss spectroscopy
studies of ferritin cores extracted from brains of patients with progressive supranuclear Palsy and
Alzheimer disease / C. Quintana, M. Lancin, C. Marhic, M. Perez, J. Martin-Benito, J. Avila, J.L.
Carrascosa // Cellular and Molecular Biology. – 2000. – V. 46. P. 807–220.
35. Curtis, A.R.J. Mutations in the gene encoding ferritin light polypeptide causes dominant adultonset basal ganglia disease / A.R.J. Curtis, C. Fey, C.M. Morris, L.A. Bindoff, P.G. Ince, P.F.
Chinnery, A. Coulthard, M.J. Jackson, A.P. Jackson, D.P. McHale, D. Hay, W.A. Barker, A.F.
Markham, D. Bates, A. Curtis, J. Burn // National Genetics. – 2001. – V. 28. – P. 350–354.
36. Crompton, D.E. Neuroferritinopathy: a window on the role of iron in neuro-degeneration / D.E.
Crompton, P.F. Chinnery, C. Fey, A.R.J. Curtis, C.M. Morris, J. Kierstan, A. Burt, F. Young, A.
Coulthard, A. Curtis, P.G. Ince, D. Bates, M.J. Jackson, J. Burn, // Blood Cells Molecular Diseases. –
2002. – V. 29. – P. 522–531.
37. Quintana, C. Electron diffraction and high-resolution electron microscopy studies of the
structure and composition of physiological and pathological ferritin / C. Quintana, J.M. Cowley, C.
Marhic // Journal of Structural Biology. – 2004. – V. 147. – P. 166–178.
38. St. Pierre, T.G. Synthesis, structure and magnetic properties of ferritin cores with varying
composition and degrees of structural order: models for iron oxide deposits in iron-overload diseases /
T.G. St. Pierre, P. Chan, K.R. Bauchspiess, J. Webb, S. Betteridge, S. Walton, D.P.E. Dickson //
Coordination Chemistry Review. – 1996. – V. 151. – P. 125–143.
39. Chua-anusorn, W. Reductive changes to polynuclear iron(III) clusters in iron-loaded human
spleen tissue / W. Chua-anusorn, T.G. St. Pierre, D.J. Macey, J. Webb // Inorganica Chimica Acta. –
1998. – V. 267. – P. 7–10.
40. St. Pierre, T.G. Iron overload diseases: the chemical speciation of non-heme iron deposits in
iron loaded mammalian tissues / T.G. St. Pierre, W. Chua-anusorn, J. Webb, D.J. Macey // Hyperfine
Interactions. – 2000. – V. 126. – P. 75–81.
41. Hash, R.B. Hereditary hemochromatosis / R.B. Hash // The Journal of the American Board of
Family Practice. – 2001. – Vol. 14. – No. 4. – P. 266–273.
42. Powell, L.W. Hereditary hemochromatosis and iron overload diseases / L.W. Powell // Journal
156
of Gastroenterology and Hepatology. – 2002. – V. 17. – Suppl. – P. 191–195.
43. Zandman-Goddard, G. Ferritin in autoimmune diseases / G. Zandman-Goddard, Y. Shoenfeld //
Autoimmunity Reviews. – 2007. – V. 6. – P. 457–463.
44. Allen, L.H. Iron supplements: scientific issues concerning efficacy and implications for research
and programs / L.H. Allen // Journal of Nutrition. – 2002. – V. 132. – P. 813–819.
45. Liu, T.-C. Comparison of a combination ferrous fumarate product and a polysaccharide iron
complex as oral treatments of iron deficiency anemia: a Taiwanese study / T.-C. Liu, S.-F. Lin, C.-S.
Chang, W.-C. Yang, T.-P Chen // International Journal of Hematology. – 2004. – V. 80. – P. 416–420.
46. Cox, J.S.G. Structure of an iron–dextran complex (Imferon) / J.S.G. Cox, C.R. Kennedy, J.
King, P.R. Marshall, D.J. Rutherford // Journal of Pharmaceutics and Pharmacology. – 1972. – V. 24.
– P. 513–517.
47. London, E. The molecular formula and proposed structure of the iron–dextran complex, Imferon
/ E. London // Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2004. – Vol. 93. – №7. – P. 1838–1846.
48. Koralewski, M. Magnetic properties of ferritin and akaganeite nanoparticles in aqueous
suspension // M. Koralewski, M. Pochylski, J. Gierszewski // Journal of Nanoparticle Research. –
2013. – V. 15. – P. 1902–1922.
49. Hoare, R.J. Structure of horse-spleen apoferritin at 6-A resolution / R.J. Hoare, P.M. Harrison,
T.G. Hoy // Nature. – V. 255. – Suppl. 5510. – P. 653–654.
50. Banyard, S.H. Electron density map of apoferritin at 2.8 A resolution /S.H. Banyard, D.K.
Stammers, P.M. Harrison // Nature. – 1978. – V. 271. – P. 282–284.
51. Trikha, J. Crystallization and structural analysis of bullfrog red cell L-subunit ferritins / J.
Trikha, G.S. Waldo, F.A. Lewandowski, Y. Ha, E.C. Theil, P.C. Weber, N.M. Allewell // Proteins. –
1994. – V. 18. – P. 107–118.
52. Trikha, J. High resolution crystal structures of amphibian red-cell L ferritin: potential roles for
structural plasticity and solvation in function /J. Trikha, E.C. Theil, N.M. Allewell // Journal of
Molecular Biology.–1995. – V. 248. – P. 949–967.
53. Gallois, B. X-ray structure of recombinant horse L-chain apoferritin at 2.0 A resolution:
implications for stability and function / B. Gallois, B. Langlois d’Estaintot, M.-A. Michaux, A.
Dautant, T. Granier, G. Precigoux, J. Soruco, F. Roland, O. Chavas-Alba, A. Herbas, R.R. Srichton //
Journal of Biological Inorganic Chemistry – 1997. –V. 2. – P. 360–367.
54. Hempstead, P.D. Comparison of the three-dimensional structures of recombinant human H and
horse L-ferritins at high resolution / P.D. Hempstead, S.J. Yewdall, A.R. Fernie, D.M. Lawson, P.J.
Artymiuk, D.W. Rice, G.C. Ford, P.M. Harrison // Journal of Molecular Biology. –1997. – V. 268. – P.
424–448.
55. Grant, R.A. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA / R.A.
157
Grant, D.J. Filman, S.E. Finkel, R. Kolter, J.M. Hogle // Nature Structural Biology. – 1998. – V. 5. –
P. 294–303.
56. Crichton, R.R. X-ray structures of ferritins and related proteins / R.R. Crichton, J-P Declercq //
Biochimica et Biophysica Acta. – 2010. – V. 1800. – P. 706–718.
57. Harrison, P.M. Ferric oxyhydroxide core of ferritin / P.M. Harrison, F.A. Fischbac, T.G. Hoy,
G.H. Haggis // Nature. – 1967. – V. 216. – P. 1188–1190.
58. Girardet, J.L. Magnetic and crystallographic properties of ferritin / J.L. Girardet, A. Blaise, J.
Chappert, J. J. Lawrence, J. Feron, and J. C. Picoche // Journal of Applied Physics. – 1970. – V. 11. –
P. 1002.
59. Towe, K.M. Mineralogical Constitution of Colloidal Hydrous Ferric Oxides / K.M. Towe, W.F.
Bradley // Journal of Colloid and Interface Science. – 1967. – V. 24. – P. 384–392.
60. Haggis, G.H. The iron oxide core of the ferritin molecule / G.H. Haggis // Journal of Molecular
Biology. – 1965. – V. 14. P. 598–602.
61. Fishbach, F.A. The structural relationship between ferritin protein and its mineral core / F.A.
Fishbach, P.M. Harrison, T.G. Hoy // Journal of Molecular Biology. – 1969. – V. 39. –P. 235–238.
62. Deighton, N. Electron paramagnetic resonance studies of a range of ferritins and haemosiderins
/ N. Deighton,A. Abu-Raqabah, I. J. Rowland, M. C. R. Symon, T. J. Peters, R. J. Ward // Journal of
the Chemical Society-Faraday Transactions. – 1991. – V. 87. – №19. – P. 3193–3197
63. Miglierini, M. Iron in spleen tissues / M. Miglierini, J. Dekan, M. Kopani, A. Lancok, J.
Kohout, M. Cieslar //AIP Conference Proceedings. – 2012. – V. 1489. – P. 107–114.
64. Dasgupta, D.R. -Ferric oxyhydroxide and green rust/ D.R. Dasgupta, A.L. Mackay // Journal
of the Physical Society of Japan – 1959. – V. 14. – P. 932–935.
65. Kilcoyne S.H. The structure of iron dextran cores / S.H. Kilcoyne, J.L. Lawrence // Zeitschrift
fur Kristallographie. – 1999. – V. 214. – P. 666–669.
66. Murad, E. Mössbauer and X-ray data on -FeOOH (akaganéite) / E. Murad // Clay Minerals. –
1979. – V. 14. – P. 273–283.
67. Post, J.E. Crystal structure refinement of akaganeite / J.E. Post, V. E Buchwald // American
Mineralogist. – 1991. – V. 76. – P. 272–277.
68. Coe, E.M. Study of an iron dextran complex by Mössbauer spectroscopy and X-ray diffraction /
E.M. Coe, L.H. Bowen, R.D. Bereman, J.A. Speer, W.T. Monte, L. Scaggs // Journal of Inorganic
Biochemistry – 1995. – Vol. 57. – PP. 63–71.
69. Knight, B. Comparison of the core size distribution in iron dextran complexes using Mössbauer
spectroscopy and X-ray diffraction / B. Knight, L.H. Bowen, R.D. Bereman, S. Huang, E. De Grave //
Journal of Inorganic Biochemistry. – 1999. – V. 73. – P. 227–233.
70. Funk, F. Physical and chemical characterization of therapeutic iron containing materials: a study of
158
several superparamagnetic drug formulations with the β-FeOOH or ferrihydrite structure / F. Funk, G.J.
Long, D. Hautot, R. Büchi, I. Christl, P.G. Weidler // Hyperfine Interactions – 2001. – V. 136. – P. 73–95.
71. Kudasheva, D.S. Structure of carbohydrate-bound polynuclear iron oxyhydroxide nanoparticles
in parenteral formulations /D.S. Kudasheva, J. Lai, A. Ulman, M.K. Cowman // Journal of Inorganic
Biochemistry. –2004. V. 98. – P. 1757–1769.
72. Berg, K.A. Identification of ferrihydrite in polysaccharide iron complex by Mössbauer
spectroscopy and X-ray diffraction / K.A. Berg, L.H. Bowen, S.W. Hedges, R.D. Bereman, C.T.
Vance // Journal of Inorganic Biochemistry – 1984. – V. 22. – P. 125–135.
73. Gutierrez, L. Magnetostructural study of iron sucrose / L. Gutierrez, M. del Puerto Morales, F.J.
Lazaro // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. – 2005. – V. 293. – V. 69–74.
74. Coe, E.M. An investigation into the size of an iron dextran complex / E.M. Coe, R.D. Bereman,
W.T. Monte // Journal of Inorganic Biochemistry. – 1995. – V. 60. – P. 149–153.
75. Szytula, A. Neutron diffraction studies of beta-FeOOH / A. Szytula, M. Balanda, Z. Dimitrijevic //
Physica Status Solidi A – Applications and Materials Science. – 1970. – V. 3. – P. 1033–1037.
76. Heald, S.M. Structure of the iron-containing core in ferritin by the extended X-ray absorption
fine structure technique / S.M. Heald, E.A. Stern, B. Bunker, E.M. Holt, S.L. Holt // Journal of the
American Chemical Society. – 1979. – V. 101. – P.67–73.
77. Sayers, D.E. A distinct environment for iron(III) in the complex with horse spleen apoferritin
observed by X-ray absorption spectroscopy / D.E. Sayers., E.C. Theil, F.J. Rennick // Journal of
Biological Chemistry. – 1983. – V. 258. – № 23. – P. 14076–14079.
78. Yang, C.-Y. Iron(III) clusters bound to horse spleen apoferritin: an X-ray absorption and
Mössbauer spectroscopy study that shows that iron nuclei can form on the protein / C.-Y. Yang, A.
Meagher, B.H. Huynh, D.E. Sayers, E.C. Theil // Biochemistry. – 1987. – V. 26. – P. 497–503.
79. Mackle, P. Iron K-edge absorption spectroscopic investigations of the cores of ferritin and
hemosiderins / P. Mackle, C.D. Garner, R.J. Ward, T.J. Peters // Biochimica et Biophysica Acta. –
1991. – V. 1115. – P. 145–150.
80. Winkler, H. Mössbauer and EXAFS studies of bacterioferritin from Streptomyces olivaceus / H.
Winkler, W. Meyer, A.X. Trautwein, B.F. Matzanke // Hyperfine interactions. – 1994. – V. 91. – P.
841–846.
81. St. Pierre,T.G. Synthesis, structure and magnetic properties of ferritin cores with varying
composition and degrees of structural order: models for iron oxide deposits in iron-overload diseases
/T.G. St. Pierre, P. Chan, K.R. Bauchspiess, J. Webb, S. Betteridge, S. Walton, D.P.E. Dickson //
Coordination Chemistry Reviews. – 1996. – V. 151. P. 125–143.
82. Theil, E.C. Similarity of the structure of ferritin and iron dextran (Imferon) determined by
extended X-ray absorption fine structure analysis / E.C. Theil // The Journal of Biological Chemistry. –
159
1979. – V. 254. –№ 17.– P. 8132–8134.
83. Yang, C. Structural variations in soluble iron complexes of models for ferritin: an X-ray
absorption and Mössbauer Spectroscopy comparison of horse spleen ferritin to Blutal (iron-chondroitin
sulfate) and Imferon (iron-dextran) / C. Yang, A.M. Bryan, E.C. Theil, D.E. Sayers, L.H. Bowen //
Journal of Inorganic Biochemistry. – 1986. – V. 28. – P. 393–405.
84. Towe, K.M. Structural distinction between ferritin and iron-dextran (Imferon) / K.M. Towe //
Journal of Biological Chemistry. – 1981. – V. 256. – № 18. – P 9377–9378.
85. Cowley, J.M. The structure of ferritin cores determined by electron nanodiffraction / J.M. Cowley,
D.E. Janney, R.C. Gerkin, P.R. Buseck // Journal of Structural Biology. – 2000. – V. 13. – P. 210–216.
86. Cowley, J.M. Applications of electron nanodiffraction / J.M. Cowley // Micron. – 2004. – V. 35.
P. 345–360.
87. Hobbs, L.W. Radiation effects in analysis of inorganic specimens by TEM, in: Introduction to
Analytical Electron Microscopy / L.W. Hobbs; Eds: J.J. Hren, J.L. Goldstein, D.C. Joy. – Plenum,
New York,1979. – P. 437–480.
88. Cowley, J.M. Electron nanodiffraction / J.M. Cowley // Microscopy Research and Technique.–
1999. – V. 46. – P. 75-97.
89. Eyring, L. Solid state chemistry, in: High Resolution Transmission Electron Microscopy / L. Eyring;
Eds.: P.R. Buseck, J.M. Cowley, L. Eyring. – New York: Oxford University Press, 1988. – P. 378–476.
90. Pan, Y-H. Electron beam damage studies of synthetic 6-line ferrihydrite and ferritin molecule
cores within a human liver biopsy / Y-H. Pan, A. Brown, R. Brydson, A. Warley, A. Li, J. Powell //
Micron. – 2006. – V. 37. –P. 403–441.
91. Pan, Y-H. Electron-beam-induced reduction of Fe3+ in iron phosphate dihydrate, ferrihydrite,
haemosiderin and ferritin as revealed by electron energy-loss spectroscopy / Y-H. Pan, G. Vaughan, R.
Brydson, A. Bleloch, M. Gass, K. Sader, A. Brown // Ultramicroscopy. – 2010. – V. 110. P. 1020–1032.
92. Janney, D.E. Structure of synthetic 2-line ferrihydrite by electron nanodiffraction / D.E. Janney,
J.M. Cowley, P.R. Buseck // American Mineralogist. – 2000 – V. 85. – P. 1180–1187.
93. Weir M.P. Electron-spin resonance studies of splenic ferritin and hemosiderin / M.P. Weir, T.J.
Peters, J.F. Gibson // Biochimica et Biophysica Acta. – 1985. – V. 828. – P. 298–305.
94. Lee, M. Identification of the EPR-active iron-nitrosyl Complexes in Mammalian Ferritins / M.
Lee, P. Arosio, A. Cozzi, N.D. Chasteen // Biochemistry. – 1994. – V. 33. – P. 3679–3687.
95. Aime, S. EPR investigations of the iron domain in neuromelanin / S. Aime, B. Bergamasco, D.
Biglino, G. Digilio, M. Fasano, E. Giamello, L. Lopiano // Biochimica et Biophysica Acta. – 1997. –
V. 1361. – P. 49–58.
96. Wajnberg, E. Ferromagnetic resonance of horse spleen ferritin: core blocking and surface
ordering temperature / E.Wajnberg, L.J. El-Jaick, M.P. Linhares, D.M.S. Esquivel // Journal of
160
Magnetic Resonance. – 2001. – V. 153. – P. 69–74.
97. Slawska-Waniewska, A. Magnetic studies of iron-entities in human tissues / A. SlawskaWaniewska, E. Mosiniewicz-Szablewska, N. Nedelko, J. Galazka-Friedman, A. Friedman // Journal of
Magnetism and Magnetic Materials. – 2004. – V. 272–276. – P. 2417–2419.
98. Weir, M.P. An electron-paramagnetic-resonance study of ferritin and haemosiderin / M.P. Weir,
J.F. Gibson, T.J. Peters // Biochemical Society Transactions. – 1984. – V. 12. – P. 316–317.
99. De Biasi, R.S. Anisotropy field of small magnetic particles as measured by resonance / R.S. de
Biasi, T.C. Devezas // Journal of Applied Physics. – 1978. – V. 49. – P. 2466–2469.
100. De Biasi, R.S. Ferromagnetic resonance evidence for superparamagnetism in a partially
crystallized metallic glass / R.S. de Biasi, A.A.R. Fernandes // Physical Rewiev B. – 1990. – V. 42. –
P. 527–529.
101. Raikher, Y.L. Ferromagnetic resonance in a suspension of single-domain particles/ Y.L.
Raikher, V.I. Stepanov // Physical Review B. – 1994. – V. 50. – P. 6250–6259.
102. Frankel, R.B. Variation of superparamagnetic properties with iron loading in mammalian
ferritin / R.B. Frankel, G. Papaefthymiou, G.D. Watt // Hyperfine Interactions. – 1991. – V. 66. – P.
71–82.
103. Gider, S. Classical and quantum magnetic phenomena in natural and artificial ferritin proteins /
S. Gider, D.D. Awschalom, T. Douglas, S. Mann, M. Chaparala // Science. – 1995. – V. 268. – P. 77–80.
104. Pan Y.-H. 3D morphology of the human hepatic ferritin mineral core: New evidence for a
subunit structure revealed by single particle analysis of HAADF-STEM images / Y.-H. Pan, K. Sader,
J. Powell, A. Bleloch, M. Gass, J. Trinick, A. Warley, A. Li, R. Brydson, A. Brown // Journal of
Structural Biology. – 2009. – V. 166. – P. 22–31.
105. Makhlouf, S.A. Magnetic hysteresis anomalies in ferritin / S.A. Makhlouf, F.T. Parker //
Physical Review B. – 1997. – V. 55. –№ 22. – P. 716–720.
106. Tejada, J. On magnetic-relaxation in antiferromagnetic horse-spleen ferritin proteins / J.
Tejada, X.X. Zhang // Journal of Physics-Condensed Matter. – 1994. – V. 6. – P. 263–266.
107.
Blaise,
A.
Observation
par
measures
magnetiques
et
effect
Mössbauer
dun
antiferromagnetisme de grains fin dans la ferritine / Blaise A.,Chappert J., Giradet J. // Comptes
Rendus Hebdomadaires des Seances de L Academie des Sciences. – 1965. – V. 261. – P. 2310.
108. Blaise, A. Ferritin iron core: high field magnetization and Neel temperature / A. Blaise, J.
Feron, J.L. Giradet, J.J. Lawrence // Proceedings of the International Conference of Magnetism, Nauka
Publishing House, Moscow. – 1974. – P. 280–282.
109. Kilcoyne, S.H. Ferritin: a model superparamagnet / S.H. Kilcoyne, R. Cywinski // Journal of
Magnetism and Magnetic Materials. – 1995. – V. 140–144. – P. 1466–1467.
110. Brooks, R.A. Relaxometry and magnetometry of ferritin / R.A. Brooks, J. Vymazal, R.B.
161
Goldfarb, J.W. Bulte, P. Aisen // Magnetic Resonance in Medicine. – 1998. – V. 40. – P. 227–235.
111. Bonville, P. Search for incoherent tunnel fluctuations of the magnetization in nanoparticles of
artificial ferritin / P. Bonville, C. Gilles // Physica B. – 2001. V. 304. – P. 237–245.
112. Gilles, C. Magnetic hysteresis and superantiferromagnetism in ferritin nanoparticles / C.
Gilles, P. Bonville, H. Rakoto, J.M. Broto, K.K.W. Wong, S. Mann // Journal of Magnetism and
Magnetic Materials. – 2002. – V. 241. – P. 430–440.
113. Silva, N.J.O. Temperature dependence of antiferromagnetic susceptibility in ferritin / N.J.O.
Silva, A. Millán, F. Palacio // Physical Review B. – 2005. – V. 79. – No. 104405.
114. Papaefthymiou, G.C. The Mössbauer and magnetic properties of ferritin cores / G.C.
Papaefthymiou // Biochimica et Biophysica Acta. – 2010. – V. 1800. – P. 886–897.
115. Blaise, A. Contribution to study of magnetic properties of ferritine / A. Blaise, J. Feron, J.L.
Girardet, J.J. Lawrence // Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de l Academie des Sciences
Serie B. – 1967. – V. 265. – P. 1077.
116. Gilles, C. Non-Langevin behaviour of the uncompensated magnetization in nanoparticles of
artificial ferritin / C. Gilles, P. Bonville, K.K.W. Wong, S. Mann // European Physics Journal. – 2000.
V. B17. – P. 417–427.
117. Resnick, D. Modeling of the magnetic behavior of gamma-Fe2O3 nanoparticles mineralized in
ferritin / D. Resnick, K. Gilmore, Y.U. Idzerda, M. Klem, E. Smith, T. Douglas // Journal of Applied
Physics – 2004. – V. 95. – Part 2. – P. 7127–7129.
118. Brem, F. Modeling the magnetic behavior of horse spleen ferritin with a two-phase core
structure / F. Brem, G. Stamm, A.M. Hirt // Journal of Applied Physics. – 2006. – V. 99. – No 123906.
119. Jung, J.H. Magnetic model for a horse-spleen ferritin with a three-phase core structure / J.H.
Jung, T.W. Eom, Y.P. Lee, J.Y. Rhee, E.H. Choi // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. –
2011. – V. 323. – P. 3077–3080.
120. Galvez, N. Comparative structural and chemical studies of ferritin cores with gradual removal
of their iron contents / N. Galvez, B. Fernandez, P. Sanchez, R. Cuesta, M. Ceolin, M. Clemente-Leon,
S. Trasobares, M. Lopez-Haro, J.J. Calvino, O. Stephan, J.M. Dominguez-Vera // Journal of American
Chemistry Society. – 2008. – V. 130. – P. 8062–8068.
121. Mohoe-Eldin, M-E.Y. Comparison of the magnetic properties of polysaccharide iron complex
(PIG) and ferritin / M-E.Y. Mohie-Eldin, R.B. Frankel, L. Gunther // A Journal of Magnetism and
Magnetic Materials. – 1994. – V. 135. – P. 65–81.
122. Kilcoyne, S.H. Magnetic properties of iron dextran / S.H. Kilcoyne, A. Gorisek // Journal of
Magnetism and Magnetic Materials. – 1998 – V. 177–181. – P. 1457–1458.
123. Lázzaro, F.J. Magnetostructural study of iron–dextran / F.J. Lázaro, A. Larrea, A.R. Abadía //
Journal of Magnetism and Magnetic Materials. – 2003. V. 257. – P. 346–354.
162
124. Martínez-Pérez, M.J. Size-dependent properties of magnetoferritin / M.J. Martínez-Pérez , R
de Miguel, C. Carbonera, M. Martínez-Júlvez, A. Lostao, C. Piquer, C. Gómez-Moreno, J. Bartolomé,
F. Luis // Nanotechnology . – 2010. – V. 21. – No. 465707.
125. Гольданский, В.И. Эффект Мессбауэра и его применения в химии: монография / В.И.
Гольданский. – М.: Издательство АН СССР, 1963. – 83 с.
126. Фрауэнфельдер, Г. Эффект Мессбауэра: монография / Г. Фраунфельдер. – М.:
Атомиздат, 1964. – 140 с.
127. Bеpтxейм, Г. Эффект Мессбауэра: монография / Г. Вертхейм. – М.: Мир, 1966. – 172 с.
128. Шпинель, B.C. Резонанс гамма–лучей в кристаллах. – М.: Наука, 1969. – 407 с.
129. Vertes, A. Mössbauer spectroscopy / A. Vertes, L. Korecz, K. Burger. – Budapest: Academia
Kiada, 1979. – P. 352–359.
130. Gutlich, P. Fifty years of Mössbauer spectroscopy in solid state research – Remarkable
Achievements, Future Perspectives / P. Gutlich // Zeitschrift fur Anorganische und Allgemeine
Chemie. – 2012. – V. 638. – P. 15–43.
131. Гольданский, В.И. Химические применения мессбауэровской спектроскопии / В.
Гольданский; под ред. В.И. Гольданский, Р.Г. Гербер. – М.: Мир, 1970. – 502 с.
132. Gütlich, P. Mossbauer spectroscopy and transition metal chemistry / P. Gutlich, R. Link, A.
Trautwein. – Berlin–Heidelberg–New York: Springer–Verlag, 1978. – 277 p.
133. Spartalian, K. Oxygen Transport and Storage Materials / K. Spartalian, G. Lang; in:
Applications of Mössbauer spectroscopy, ed. R.L. Cohen. – Academic Press, 1980. – Vol. 2. – P. 249–
279.
134. Dickson, D.P.E. Physiological and Medical Applications / D.P.E. Dickson, C.E. Johnson; in
Applications of Mössbauer spectroscopy, ed. R.L. Cohen. – Academic Press, 1980. – Vol. 2. – P. 209–
248.
135. Trautwein, A. Mössbauer Studies in Bioinorganic Chemistry / A. Trautwein, E. Bill; in:
Transition metal chemistry: current problems of general, biological and catalytical relevance, eds. A.
Muller, E. Diemann, Verlag Chimie – Weinheim, 1981. – P. 239–263.
136. Huynh, B.H. Mössbauer studies of iron proteins / B.H. Huynh, T.A. Kent // Advances in
inorganic biochemistry – 1984.– V. 6. – P. 163–223.
137. Dickson D.P.E. Mössbauer spectroscopy / D.P.E. Dickson, C.E. Johnson; in: Structural and
Resonance Techniques in Biological Research, ed. D.L. Rousseau. – Academic Press, 1984. – P. 245–
293.
138. Dickson, D.P.E. Applications to Biological Systems / D.P.E. Dickson; in: Mössbauer
spectroscopy applied to inorganic chemistry, ed. G.J. Long. – Plenum Publishing Corporation, 1984. –
V. 1. – P. 339–389.
163
139. May, L. Mössbauer spectroscopy in nutritional research / L. May // ACS Symposium Series. –
1984. – V. 258. – P. 53–60.
140. Cуздалев, И.П. Гамма–резонансная спектроскопия белков и модельных соединений /
И.П. Cуздалев. – М.: Наука, 1988. – 268 с.
141. Oshtrakh, M.I. Mössbauer effect in biomedical research: variations of quadrupole splitting in
relation to the qualitative changes of biomolecules / M.I. Oshtrakh // Zeitschrift fur Naturforschung. –
1996. – V. 51а. – P. 381–388.
142. Семенов, В.Г. Аналитические возможности мѐссбауэровской спектроскопии / В.Г.
Семенов, Л.Н. Москвин, А.А. Ефремов // Успехи химии. – 2006. – Т. 75. – №4. – С. 1–12.
143. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy: Application in biomedical research / M.I. Oshtrakh //
Hyperfine Interactions. – 2005. – V. 165. – P. 313–320.
144. Mössbauer spectroscopy: applications in chemistry, biology, and nanotechnology: First edition
/ Eds. V.K. Sharma, G. Klingelhofer, T. Nishida. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc©, 2013. 631 с.
145. Boas, J.F. Mössbauer effect in ferritin / J.F. Boas, B. Window // Australian Journal of Physics.
– 1966. – V. 19. – P. 573–576.
146. Bauminger, E.R. Mössbauer studies of iron incorporation into ferritin / E.R. Bauminger, P.M.
Harrison, D. Hechel, I. Nowik, A. Treffry // Journal of Radioanalitical and Nuclear Chemistry. – 1995.
– V. 190. – №2. – P. 237–241.
147. Bauminger, E.R. Ferritin, the path of iron into the core, as seen by Mössbauer spectroscopy /
E.R. Bauminger, P.M. Harrison // Hyperfine Interactions. – 2003. – V. 151/152. – P. 3–19.
148. Kamnev, A.A. Mössbauer spectroscopy in biological and biomedical research. In: Mössbauer
spectroscopy: applications in chemistry, biology, and nanotechnology: First edition / A.A. Kamnev, K.
Kovacs, I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh; Eds. V.K. Sharma, G. Klingelhofer, T. Nishida. New Jersey:
John Wiley & Sons, Inc©, 2013. P. 272–291.
149. Oshtrakh, M.I. The
57
Fe hyperfine interactions in the life sciences: application of Mössbauer
spectroscopy with a high velocity resolution in the study of iron-containing biomolecules and
pharmaceutical compounds / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, A. Kumar, A.L.
Berkovsky, A.P. Zakharova, T.S. Konstantinova, E.G. Novikov, V.A. Semionkin // Journal of
Radioanalitical and Nuclear Chemistry. – 2016. DOI: 10.1007/s10967-016-4769-6 (в печати).
150. Murad, E. The Influence of crystallinity on magnetic-ordering in natural ferrihydrites / E.
Murad, L.H. Bowen, G.J. Long, T.G. Quin // Clay Minerals. – 1988. – V. 23. – P. 161–173.
151. Neel, L. 1949. Influence des fluctuations thermiques sur laimantation de grains
ferromagnetiques tres fins / L. Neel // Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L Academie
Des Sciences. – 1949. – V. 228. –664–666.
152. Jacobs, I.S. An approach to elongated fine-particle magnets / I.S. Jakobs, C.P. Bean, //
164
Physical Reviews. – 1955. – V. 100. – P. 1066–1067.
153. Вонсовский, С.В. Магнетизм: монография / C.В. Вонсовский. М: «Наука», 1971. – 1032 с.
154. Aharoni, A. Relaxation time of superparamagnetic particles with cubic anisotropy / A. Aharoni
// Physical Review B. – 1973. – V. 7. – P. 1103–1107.
155. Hawkins, C. Mössbauer studies of the ultrafine antiferromagnetic cores of ferritin / C.
Hawkins, J.M. Williams, A.J. Hudson, S.C. Andrews, A. Treffry // Hyperfine Interactions. – 1994. –
V. 91. – P. 827–833. 156. Pfannes, H.D. Simple theory of superparamagnetism and spin-tunneling in
Mossbauer spectroscopy / H.D. Pfannes // Hyperfine Interactions. – 1997. – V. 110. – P. 127–134.
157. Lierop, J. Muon spin relaxation study of spin dynamics in a polysaccharide iron complex / J.
van Lierop, D. H. Ryan, M. E. Pumarol, M. Roseman // Journal of Applied Physics. – 2001. – V. 89. –
P. 7645–7647.
158. Papaefthymiou, G.C. Nanoparticle magnetism / G.C. Papaefthymiou // Nano Today. – 2009. –
V. 4. – P. 438–447.
159. Papaefthymiou, G.C. Interparticle interactions in magnetic core/shell nanoarchitectures / G.C.
Papaefthymiou, D. Eamonn, A. Simopoulos, D.K. Yi, S.N. Riduan, S.S. Lee, J.Y. Ying // Physical
Review B. – 2009. – V. 80. – № 024406.
160. St. Pierre, T.G. Mössbauer Spectroscopic studies of the cores of human, limpet and bacterial
ferritins / T.G. St. Pierre, S.H. Bell, D.P.E. Dickson, S. Mann, J. Webb, G.R. Moore, R.J.P. Williams //
Biochimica et Biophysica Acta. – 1986. – V. 870. – P. 127–134.
161. Mann, S. Reconstituted and native iron-cores of bacterioferritin and ferritin / S. Mann, J.M.
Williams, A. Treffry, P.M. Harrison // Journal of Molecular Biology. – 1987. – V. 198. – P. 405–416.
162. Miglierini, M. Magnetic behavior of ferritin nanoparticles / M. Miglierini, A. Lancok // Acta
Physica Polonica A. – 2010. – V. 118. – P. 944–945.
163. St. Pierre, T.G. A Mössbauer spectroscopic study of the form of storage iron in the larval and
adult stages of the lamprey / T.G. St. Pierre, L. Harris, J. Webb, D.J. Macey // Hyperfine Interactions –
1992. – V. 71. – P. 1283–1286.
164. Coe, E.M. Mössbauer spectroscopy of iron dextran: comparison of solid and frozen solution / E.M.
Coe, L.H. Bowen, R.D. Bereman, W.T. Monte // Inorganica Chimica Acta. – 1994. – V. 223. – P. 9–11.
165. Oshtrakh, M.I. Positron annihilation and Mössbauer effect studies of iron–dextran complexes /
M.I. Oshtrakh, E.A. Kopelyan, V.A. Semionkin, A.B. Livshits, V.E. Krylova, A.A. Kozlov // Material
Sciences Forum. – 1992. – V. 105–110. – P. 1679–1682.
166. Oshtrakh, M.I. Mössbauer and positron annihilation studies of pharmaceutically important
iron–dextran complexes / M.I. Oshtrakh, E.A. Kopelyan, V.A. Semionkin, A.B. Livshits, V.E.
Krylova, A.A Kozlov // Nuclear Instruments & Methods In Physics Research. – 1993. – V. B76. – P.
405–407.
165
167. Oshtrakh, M.I. An analysis of iron–dextran complexes by Mössbauer spectroscopy and
positron annihilation technique / M.I. Oshtrakh, E.A. Kopelyan, V.A. Semionkin, A.B. Livshits, V.E.
Krylova, T.M. Prostakova, A.A. Kozlov // Journal of Inorganic Biochemistry. – 1994. – V. 54. – P.
285–295.
168. Oshtrakh, M.I. Mössbauer and positron annihilation studies of microstructural peculiarities of
iron–dextran complexes / M.I. Oshtrakh, E.A. Kopelyan, V.A. Semionkin, A.B. Livshits, A.A. Kozlov
// Journal of Radioanalitical and Nuclear Chemistry.– 1995. – V. 190. – P. 449–455.
169. Oshtrakh, M.I. Quadrupole splitting and paramagnetic iron core structure in iron–dextran
complexes: a Mössbauer effect study / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, O.B. Milder, A.B. Livshits,
A.A. Kozlov // Zeitschrift fur Naturforschung. – 2000. – V. 55a. – P. 186–192.
170. Oshtrakh, M.I. Hyperfine interactions in the iron cores from various pharmaceutically
important iron–dextran complexes and human ferritin: a comparative study by Mössbauer
spectroscopy / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, P.G. Prokopenko, O.B. Milder, A.B. Livshits, A.A.
Kozlov // International Journal of Biological Macromolecules – 2001. – V. 29. – P.303–314.
171. Oshtrakh, M.I. An analysis of quadrupole splitting of the Mössbauer spectra of ferritin and
iron–dextran complexes in relation to the iron core microstructural variations / M.I. Oshtrakh, O.B.
Milder, V.A. Semionkin, P.G. Prokopenko, A.B. Livshits, A.A. Kozlov, A.I. Pikulev // Zeitschrift fur
Naturforschung. – 2002. – V. 57a. – P. 566–574.
172. Murad, E. Iron Oxides and Oxyhydroxides / E. Murad, J.H. Johnston; in: Mössbauer
Spectroscopy Applied to Inorganic Chemistry, ed. G.J. Long. New York: Plenum Publishing
Corporation, 1987. – Vol. 2. – P. 507–582.
173. Bell, S.H. A Mössbauer spectroscopic study of iron location in isolated human placental
syncytiotrophoblast microvillous plasma membranes / S.H. Bell, P.J. Brown, D.P.E. Dickson, P.M.
Johnson // Biochimica et Biophvsica Acta. – 1983. – V. 756. – P. 250–252.
174. Bauminger, E.R. Metal binding at the active center of the ferritin of Escherichia coli (EcFtnA).
A Mössbauer spectroscopic study / E.R. Bauminger, A. Treffry, M.A. Quail, Z. Zhao, I. Nowik, P.M.
Harrison // Inorganica Chimica Acta. – 2000. – V. 297. – P.171–180.
175. Bou-Abdallah, F.A. Comparative Mössbauer study of the mineral cores of human H–chain
ferritin employing dioxygen and hydrogen peroxide as iron oxidants / F. Bou-Abdallah, E. Carney,
N.D. Chasteen, P. Arosio, A.J. Viescas, G.C. Papaefthymiou // Biophysical Chemistry. – 2007. – V.
130. – P. 114–121.
176. Оштрах, М.И. Взаимосвязь малых изменений параметров сверхтонкой структуры
мессбауэровских спектров и структуры железосодержащих ядер ферритинов и их моделей /
М.И. Оштрах, О.Б. Мильдер, В.А. Семенкин, П.Г. Прокопенко, Л.И. Малахеева // Известия
РАН, серия Физическая. – 2005. – Т. 69 (№ 10). – С. 1547–1555.
166
177. Oshtrakh, М.I. A study of human liver ferritin and chicken liver and spleen using Mössbauer
spectroscopy with high velocity resolution / М.I. Oshtrakh, O.B. Milder, V.A. Semionkin // Hyperfine
Interactions. – 2008. – V. 181. – P. 45–52.
178. Oshtrakh, M.I. Biomedical application of Mössbauer spectroscopy with high velocity
resolution: preliminary results. In: Proceedings of the International Conference “Mössbauer
Spectroscopy in Materials Science 2008” / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, O.B. Milder,
E.G.Novikov; eds. M. Mashlan, R. Zboril. New York: AIP Conference Proceedings, 2008. – V. 1070.
– P. 122–130.
179. Oshtrakh, M.I. Study of the relationship of small variations of the molecular structure and the
iron state in iron containing proteins by Mossbauer spectroscopy: biomedical approach / M.I. Oshtrakh
// Spectrochimica Acta Part A-Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2004. – V. 60. – P. 217–
234.
180. Chua-Anusorn, W. Effect of precipitation temperature and number of iron atoms per molecule
on the structure of hydrated Iron(III) oxyhydroxide ferritin cores synthesised in vitro / W. ChuaAnusorn, H.R. Mun, J. Webb, N.T. Gorham, T.G. St. Pierre // Hyperfine Interactions – 2002. – V.
144/145. – P. 279–288.
181. Bauminger, E.R. Mössbauer spectroscopic investigation of structure–function relations in
ferritins / E.R. Bauminger, P.M. Harrison, D. Hechel, I. Nowik, A. Treffry // Biochimica et Biophysica
Acta. – 1991. – V. 1118. – P. 48–58.
182. Matzanke, B.F. Main components of iron-metabolism in microbial systems analyzed by in
vivo Mössbauer spectroscopy / B.F. Matzanke, E. Bill, A.X. Trautwein // Hyperfine Interactions. –
1992. – V. 71. – P. 1259–1262.
183. St Pierre, J.L. Iron and activated oxygen species in biology: The basic chemistry / J.L. St.
Pierre, M. Fontecave // Biometals. – 1999. – V. 12. – P. 195–199.
184. Kovacs, K. Evidence for ferritin as dominant iron-bearing species in the rhizobacterium
Azospirillum brasilense Sp7 provided by low-temperature/in-field Mössbauer spectroscopy / K.
Kovacs, A.A. Kamnev, J. Pechousek, A.V. Tugarova, E. Kuzmann, L. Machala, R. Zboril, Z.
Homonnay, K. Lazar // Analytical and Bioanalytical Chemistry. – 2016. – V. 408. – P. 1565–1571.
185. Coe, E.M. Comparison of polysaccharide iron complexes used as iron supplements / E.M. Coe,
L.H. Bowen, J.A. Speer, R.D. Bereman // Journal of Inorganic Biochemistry. – 1995. – V. 57. – P.
287–292.
186 Coe, E.M. The recharacterization of a polysaccharide iron complex (Niferex) / E.M. Coe, L.H.
Bowen, J.A. Speer, Z. Wang, D.E. Sayers, R.D. Bereman // Journal of Inorganic Biochemistry.– 1995.
– V. 58. – P. 269–278.
187. Mohie-Eldin, M.E.Y. The anomalous Mössbauer fraction of ferritin and polysaccharide iron
167
complex (PIC) / M.E.Y. Mohie-Eldin, R.B. Frankel, L. Gunter, G.C. Papaefthymiou // Hyperfine
Interactions. – 1995. – V. 96. – P. 111–138.
188. Knight, B. Mössbauer studies of some polysaccharide–iron complexes used as hematinics / B.
Knight, L.H. Bowen, R.D. Bereman // Journal of Inorganic Biochemistry. – 1996. – V. 64. – P. 225–229.
189. Harrison, P.M. Structural and functional-studies on ferritins / P.M. Harrison, G.C. Ford, D.W.
Rice, J.M.A. Smith, A. Treffry, J.L. White, //Biochemical Society Transactions. – 1987. – V. 15. – P.
744–748.
190. Luzzago, A. Immunochemical characterization of human-liver and heart ferritins with
monoclonal-antibodies / A. Luzzago, P. Arosio, C. Iacobello, G. Ruggeri, L Capucci, E Brocchi, F.
Desimone, D. Gamba, E. Gabri, S. Levi, // Biochimica et Biophysica Acta. – 1986. – V. 872. – P. 61–
71.
191. Хорст, А. Молекулярные основы патогенеза болезней / A. Хорст. М.: Медицина, 1982. –
454 с.
192. Kellershohn, C.A. Mössbauer spectrometry study of iron in hepatic and splenic tissues.
Preliminary results / C. Kellershohn, C. Audebert, D. Fortier, J.N. Rimbert, C. Hubert // Revue de
Physique Appliquee. – 1980. – V. 15. – P. 1175–1178.
193. Dubiel, S.M. Magnetic properties of human liver and brain ferritin / S.M. Dubiel, B. ZablotnaRypien, J.B. Mackey, J.M. Williams // European Biophysics Journal with Biophysics Letters. – 1999.
– V. 28. – P. 263–267.
194. Dickson, D.P.E. Seasonal-variation in the form of iron in the liver of Spitsbergen reindeer – a
Mössbauer spectroscopic study / D.P.E. Dickson, A. Meagher, K.J. Nilssen, B. Borchiohnsen //
Biochimica et Biophysica Acta. – 1987. – V. 924. – P. 442–446.
195. Chua-anusorn, W. Mössbauer spectroscopic study of iron-oxide deposits in liver-tissue from
the marine mammal dugong dugong / W. Chua-anusorn, T.G. St. Pierre, G. Black, J. Webb, D.J.
Macey, D. Parry // Hyperfine Interactions. – 1994. – V. 91. – P. 899–904.
196. Chua-anusorn, W. Mössbauer spectroscopic study of the forms of iron in normal human liver
and spleen tissue / W. Chua-anusorn, T.G. St. Pierre, J. Webb, D.J. Macey, P. Yansukon, P. Pootrakul
// Hyperfine Interactions. – 1994. – V. 91. – P. 905–910.
197. Chua-anusorn, W. The effect of prolonged iron loading on the chemical form of iron oxide
deposits in rat liver and spleen / W. Chua-anusorn, J. Webb, D.J. Macey, P. de la Motte Hall, T.G. St.
Pierre // Biochimica et Biophysica Acta. – 1999. – V. 1454. – P. 191–200.
198. St. Pierre, T.G. The form of iron oxide deposits in thalassemic tissues varies between different
groups of patients: a comparison between Thai -thalassemia/hemoglobin E patients and Australian thalassemia patients / T.G. St. Pierre, W. Chua-anusorn, J. Webbb, D. Macey, P. Pootrakul //
Biochimica et Biophysica Acta. – 1998. – V. 1407. – P. 51–60.
168
199. Chua-anusorn W. Chemical speciation of iron deposits in thalassemic heart tissue / W. Chuaanusorn, K.C. Tran, J. Webb, D.J. Macey, T.G. St Pierre // Inorganica Chimica Acta. – 2000. – V. 300.
– P. 932–936.
200. Hackett, S. The magnetic susceptibilities of iron deposits in thalassaemic spleen tissue / S.
Hackett, W. Chua-anusorn, P. Pootrakul T.G. St. Pierre // Biochimica et Biophysica Acta. – 2007. – V.
1772. – P. 330–337.
201. Chorazy, M. Mössbauer effect study of liver tissues / M. Chorazy, R. Meczynski, T.J. Panek //
Journal of Radioannalitical and Nuclear Chemistry Letters. – 1988. – V. 128 – P. 201–206.
202. Oshtrakh, M.I. Study of chicken liver and spleen by Mössbauer spectroscopy / M.I. Oshtrakh,
O.B. Milder, V.A. Semionkin, L.I. Malakheeva, P.G. Prokopenko // Hyperfine Interactions. – 2006. –
V. 165. P. 321–326.
203. Kopani, M. Iron oxides in human spleen / M. Kopani, M. Miglierini, A. Lancok, J. Dekan, M.
Caplovicova, J. Jakubovsky, R. Boca, H. Mrazova // Biometals. – 2015. – V. 28. – P. 913–928.
204. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with a high velocity resolution: advances in
biomedical, pharmaceutical, cosmochemical and nanotechnological research / M.I. Oshtrakh, V.A.
Semionkin // Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2013. – V.
100. – P. 78–87.
205. Oshtrakh, M.I. Study of meteorites using Mössbauer spectroscopy with high velocity
resolution. In: Proceedings of the International Conference “Mössbauer Spectroscopy in Materials
Science 2008” / M.I. Oshtrakh, V.I. Grokhovsky, E.V. Petrova, M.Yu. Larionov, K.A. Uymina, V.A.
Semionkin, N.V. Abramova; eds. M. Mashlan, R. Zboril. New York: AIP Conference Proceedings,
2008. – V. 1070. – P. 131–139.
206. Grokhovsky, V.I. Mössbauer Spectroscopy with High Velocity Resolution in the Study of
Iron-Bearing Minerals in Meteorites/ V.I. Grokhovsky, M.I. Oshtrakh, E.V. Petrova, M.Yu. Larionov,
K.A. Uymina, V.A. Semionkin // European Journal of. Mineralogy. – 2009. – V. 21. – P. 51–63.
207. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with high velocity resolution: new possibilities of
chemical analysis in material science and biomedical research / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, V.I.
Grokhovsky, O.B. Milder, E.G. Novikov // Journal on Radioanalitical and Nuclear Chemistry. – 2009.
– V. 279. P. 833–846.
208. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with high velocity resolution: new possibilities in
biomedical research / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, O.B. Milder, E.G. Novikov // Journal of
Molecular Structure. – 2009. – V. 924–926. – P. 20–26.
209. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with high velocity resolution: an increase of analytical
possibilities in biomedical research / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, O.B. Milder, E.G Novikov //
Journal on Radioanalitical and Nuclear Chemistry. – 2009. – V. 281. – P. 63–67.
169
210. Оштрах, М.И. Возможности мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным
разрешением в изучении малых изменений параметров сверхтонкой структуры ядер
57
Fe в
железосодержащих белках / М.И. Оштрах, В.А. Семенкин, О.Б. Мильдер, Е.Г. Новиков //
Известия РАН, серия Физическая. – 2010. – Т. 74(№ 3). – С. 466–470.
211. Oshtrakh, M.I. Biomedical application of Mössbauer spectroscopy with a high velocity
resolution: revealing of small variations / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, O.B. Milder, I.V. Alenkina,
E.G. Novikov // Spectroscopy. – 2010. – V. 24. – P. 593–599.
212. Perls, M. Demonstration of iron oxide in certain pigments / M. Perls // Virchows Arch. Pathol.
Anat. Physiol. Klin Med. – 1867. – V. 39. P. 42–48.
213. Morris, C.M., Histochemical distribution of non-haem iron in the human brain / C.M. Morris,
J.M. Candy, A.E. Oakley, C.A. Bloxham, J.A. Edwardson // Acta Anatomica. – 1992. – V. 144. – P.
235–257.
214. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with a high velocity resolution: Advances in
biomedical, pharmaceutical, cosmochemical and nanotechnological research / M.I. Oshtrakh, V.A.
Semionkin // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2013. – V.
100. – P. 78–87.
215. Alenkina, I.V.
57
Fe Mössbauer spectroscopy and electron paramagnetic resonance studies of
human liver ferritin, Ferrum Lek and Maltofer® / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, Z. Klencsár, E.
Kuzmann, A.V. Chukin, V.A. Semionkin // Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy. – 2014. – V. 130. – P. 24–36.
216. Alenkina, I.V. Study of the rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 using Mössbauer
spectroscopy with a high velocity resolution: implication for the analysis of ferritin-like iron cores /
I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, A.V. Tugarova, B. Biró, V.A. Semionkin, A.A. Kamnev // Journal of
Molecular Structure. – 2014. – V. 1073. – P. 181–186.
217. Weiss, B.P. Ferromagnetic resonance and low-temperature magnetic tests for biogenic
magnetite / B.P. Weiss, S.S. Kim, J.L. Kirschvink, R.E. Kopp, M. Sankaran, A. Kobayashi, A. Komeili
// Earth and Planetary Science Letters. – 2004. – V. 224. – P. 73–89.
218. Alenkina, I.V. Temperature variable Mössbauer spectroscopic and electron paramagnetic
resonance studies of human ferritin, Ferrum Lek and Maltofer® / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, Z.
Klencsár, S.M. Dubiel, E. Kuzmann, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of 31st European Congress
on Molecular Spectroscopy. – Cluj-Napoca, 2012. – P. 147.
219. Kamnev, A.A. Study of ferritin iron cores in the rhizobacterium Azospirillum Brasilense
Sp245 using Mössbauer spectroscopy with a high velocity resolution / A.A. Kamnev, I.V. Alenkina,
M.I. Oshtrakh, A.V. Tugarova, B. Biró, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of the 1st International
Turkish Congress on Molecular Spectroscopy. – Istanbul, 2013. – P. 120.
170
220. Oshtrakh, M.I. Biomedical application of Mössbauer spectroscopy with high velocity
resolution: revealing of small variations / M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin, O.B. Milder, I.V. Alenkina,
E.G. Novikov // Book of Abstracts of XIII European Conference Spectroscopy of Biological
Molecules. – Palermo, 2009. – P. 60.
221. Oshtrakh, M.I. Comparative study of the iron core in ferritins and its pharmaceutically
important models using Mössbauer spectroscopy with high velocity resolution / M.I. Oshtrakh, I.V.
Alenkina, O.B. Milder, E.G. Novikov, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of Colloquium
Spectroscopicum Internationale XXXVI. – Budapest, 2009. – P. 92.
222.Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with high velocity resolution in the study of iron–
containing proteins and model compounds. / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, O.B. Milder, V.A.
Semionkin // Book of Abstracts of Xth International Conference on Molecular Spectroscopy. –
Kraków – Białka Tatrzańska, 2009. – P. 26.
223. Oshtrakh, M.I. Analysis of the iron cores in human liver ferritin and its pharmaceutically
important models Imferon and Maltofer® using Mössbauer spectroscopy with high velocity resolution
/ M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, V.A. Semionkin, O.B. Milder, E.G. Novikov // Book of Abstracts of
21st Int. Symp. on Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – Orlando, 2009. – P. 43.
224. Oshtrakh, M.I. Comparative study of the iron cores in human liver ferritin, chicken liver and
spleen, and pharmaceutical products modeling ferritin using Mössbauer Spectroscopy with a high
velocity resolution / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, N.V. Sadovnikov, V.A. Semionkin // Book of
Abstracts of 7th International Biometals Conference. – Tucson, 2010. – P. 106.
225. Oshtrakh, M.I. Structural variations of the iron cores in human liver ferritin and its
pharmaceutically important models: a comparative study using Mössbauer spectroscopy with a high
velocity resolution / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, S.M. Dubiel, V.A. Semionkin // Book of Abstracts
of XXX European Congress on Molecular Spectroscopy. – Florence, 2010. – P. 88.
226. Oshtrakh, M.I. Comparative analysis of human liver ferritin, chicken liver and spleen, and
pharmaceutically important ferritin models using Mössbauer spectroscopy / M.I. Oshtrakh, I.V.
Alenkina, N.V. Sadovnikov, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of The 5th Central European
Conference “Chemistry towards Biology”. Primošten, 2010. – P. 107.
227. Alenkina, I.V. Mössbauer spectroscopy with a high velocity resolution of human liver ferritin
and its pharmaceutically important models / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, S.M. Dubiel, V.A.
Semionkin // Book of Abstracts of 7th Seeheim Workshop on Mössbauer Spectroscopy. – Frankfurt,
2011. – P. 138.
228. Alenkina, I.V. Comparative study of the iron cores in human liver ferritin, its pharmaceutical
models and ferritin in chicken liver and spleen tissues using Mössbauer spectroscopy with a high
velocity resolution / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, Yu.V. Klepova, S.M. Dubiel, N.V. Sadovnikov,
171
V.A. Semionkin // Proceedings of Colloquium Spectroscopicum Internationale XXXVII. – Buzios,
2011. P. 84.
229. Alenkina I.V. Comparative study of nanosized iron cores in human liver ferritin and its
pharmaceutically important models Maltofer® and Ferrum Lek using Mössbauer spectroscopy / I.V.
Alenkina, M.I. Oshtrakh, E. Kuzmann, V.A. Semionkin // Сборник материалов XII Международной
конференции «Мессбауэровская спектроскопия и ее применения». – М: ИМЕТ РАН, 2012. – С.
116.
230. Oshtrakh, M.I. Structural variations of the iron cores in human liver ferritin and its
pharmaceutically important models: a comparative study using Mössbauer spectroscopy with a high
velocity resolution / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, S.M. Dubiel, V.A. Semionkin // Journal of
Molecular Structure. – 2011 – V. 993. – P. 287–291.
231. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy with a high velocity resolution in the study of iron–
containing proteins and model compounds / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, O.B. Milder, V.A.
Semionkin // Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2011. – V.
79. – P. 777–783.
232. Alenkina, I.V., Comparative study of the iron cores in human liver ferritin, its pharmaceutical
models and ferritin in chicken liver and spleen tissues using Mössbauer spectroscopy with a high
velocity resolution / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, Yu.V. Klepova, S.M. Dubiel, N.V. Sadovnikov,
V.A. Semionkin // Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2013. –
V. 100. – P. 88–93.
233. Аленькина. И.В. Проблемы изучения наноразмерных частиц оксигидроокиси железа
методом мессбауэровской спектроскопии на примере исследований ферритина и препарата
Мальтофер® / И.В. Аленькина, М.И. Оштрах, В.А. Семенкин; ред.: Б.В. Шульгин // сборник
статей
«Проблемы
спектроскопии
и
спектрометрии».
Екатеринбург:
Уральский
государственный технический университет – УПИ, 2010. – Вып. 26. – С. 192–200.
234. Аленькина, И.В. Сравнительное исследование наноразмерных «железных ядер» в
ферритине печени человека и его фармацевтически важных моделях – препаратах Мальтофер®
и Феррум Лек, методом мессбауэровской спектроскопии / И.В. Аленькина, М.И. Оштрах, В.А.
Семенкин, Э. Кузманн // Известия РАН., серия физическая. – 2013. – Т. 77 (№ 6). – С. 818–823.
235. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy of the iron cores in human liver ferritin, ferritin in
normal human spleen and ferritin in spleen from patient with primary myelofibrosis: preliminary
results of comparative analysis / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova,
E. Kuzmann, V.A. Semionkin // Biometals. – 2013. – V. 26. – P. 229–239.
236. Oshtrakh, M.I. A possibility to distinguish different microenvironments in the nanosized iron
cores in human liver ferritin and its pharmaceutical model ferrum lek on the basis of temperature
172
dependent unusual line broadening of Mössbauer spectra / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, E. Kuzmann,
Z. Klencsár, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of International Turkish Congress on Molecular
Spectroscopy. – Istanbul, 2013. – P. 59.
237. Alenkina, I.V. Mössbauer spectroscopy of human liver ferritin and its analogue Ferrum Lek in
the temperature range 295–90 K: comparison within the homogeneous iron core model / I.V. Alenkina,
M.I. Oshtrakh, Z. Klencsár, E. Kuzmann, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of the International
Conference “Mössbauer Spectroscopy in Materials Science”. Hlochovec u Břeclavi, 2014. – P. 66.
238. Alenkina, I.V. Anomalous behavior of Mössbauer parameters for human liver ferritin and its
pharmaceutical analogue Ferrum Lek in the temperature range 295–90 K: an analysis within the
homogeneous and heterogeneous iron core models / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, Z. Klencsár, E.
Kuzmann, V.A. Semionkin // Сборник материалов XIII Международной конференции
«Мессбауэровская спектроскопия и ее применения». – М: ИМЕТ РАН, 2014. – С. 91.
239. Oshtrakh, M.I. Anomalous Mössbauer line broadening for nanosized hydrous ferric oxide
cores in ferritin and its pharmaceutical analogue Ferrum Lek in the temperature range 295–90 K / M.I.
Oshtrakh, I.V. Alenkina, E. Kuzmann, Z. Klencsár, V.A. Semionkin // Journal of Nanoparticle
Research. – 2014. – V. 16. – № 2363.
240. Alenkina, I.V. Mössbauer spectroscopy of human liver ferritin and its analogue Ferrum Lek in
the temperature range 295–90 K: Comparison within the homogeneous iron core model / I.V.
Alenkina, M.I. Oshtrakh, Z. Klencsár, E. Kuzmann, V.A. Semionkin // Proceedings of the
International Conference “Mössbauer Spectroscopy in Materials Science 2014”; Eds. J. Tuček, M.
Miglierini. – New York: Melville, 2014. – V. 1622. – P. 142–148.
241. Oshtrakh, M.I. Different microenvironments in the nanosized iron cores in human liver ferritin
and its pharmaceutical analogues on the basis of temperature dependent Mössbauer spectroscopy / M.I.
Oshtrakh, I.V. Alenkina, Z. Klencsár, E. Kuzmann, V.A. Semionkin / Book of abstracts of XXXIX
Colloquium Spectroscopicum Internationale. – Portugal, Coimbra, 2015. – OP 39.
242. Cieślak, J. Evaluation of Debye temperature for nanosized iron core in Ferrum Lek, a
pharmaceutically important model of ferritin, using Mössbauer spectroscopy with a high velocity
resolution / J. Cieślak, S.M. Dubiel, I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin / Book of abstracts
of the International Conference on the Applications of the Mössbauer Effect // Opatija, 2013. – P. 212.
243. Dubiel, S.M. Evaluation of the Debye temperature for iron cores in human liver ferritin and its
pharmaceutical analogue, Ferrum Lek, using Mössbauer spectroscopy / S.M. Dubiel, J. Cieślak, I.V.
Alenkina, M.I. Oshtrakh, V.A. Semionkin // Journal of Inorganic Biocheistry. – 2014. – V. 140. – P.
89–93.
244. Abdul-Tehrani, H. Ferritin mutants of Escherichia coli are iron deficient and growth impaired,
and fur mutants are iron deficient / H. Abdul-Tehrani, A.J. Hudson, Y.-S. Chang, A.R. Timms, C.
173
Hawkins, J.M. Williams, P.M. Harrison, J.R. Guest, S.C. Andrews // Journal of Bacteriology. – 1999.
– V. 181. – P. 1415–1428.
245. Matzanke, B.F. Iron uptake and intracellular metal transfer in mycobacteria mediated by
xenosiderophores / B.F. Matzanke, R. Böhnke, U. Möllmann, R. Reissbrodt, V. Schünemann, A.X.
Trautwein // BioMetals. – 1997. – V. 10. – P. 193–203.
246. Hudson, A.J. Overproduction, purification and characterization of the Escherichia coli ferritin
/ A.J. Hudson, S.C. Andrews, C. Hawkins, J.M. Williams, M. Izuhara, F.C. Meldrum, S. Mann, P.M.
Harrison, J.R. Guest // European Journal of Biochemistry. – 1993. – V. 218. – P. 985–995.
247. Boughammoura A. Differential role of ferritins in iron metabolism and virulence of the plantpathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi 3937 / A. Boughammoura, B.F. Matzanke, L. Böttger, S.
Reverchon, E. Lesuisse, D. Expert, T. Franza1// Journal of Bacteriology. – 2008. – V. 190. – P. 1518–
1530.
248. Kadir, H.A. Mössbauer Spectroscopic Studies of Iron in Pseudomonas Aeruginosa Fahmi /
H.A. Kadir, N.M.K. Read, D.P.E. Dickson, C. Greenwood, A. Thompson, G.R. Moore // Journal of
Inorganic Biochemistry. – 1991. – V. 43. – P. 753–758.
249. Oshtrakh, M.I. Comparative analysis of human liver ferritin, chicken liver and spleen, and
pharmaceutically important ferritin models using Mössbauer spectroscopy / M.I. Oshtrakh, I.V.
Alenkina, N.V. Sadovnikov, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of The 5th Central European
Conference “Chemistry towards Biology”. – Primošten, 2010. P. – 107.
250. Alenkina, I.V. Mössbauer spectroscopy of chicken liver and spleen, human liver ferritin and
pharmaceutical models / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, Yu.V. Klepova, N.V. Sadovnikov, V.A.
Semionkin // European Biophysical Journal. – 2011. – V. 40 (Suppl.). – P. S136.
251. Oshtrakh, M.I. Comparative study of the iron core structure in human liver ferritin, liver and
spleen tissues and pharmaceutically important ferritin models using Mössbauer spectroscopy with a
high velocity resolution / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, Yu.V. Klepova, T.S.
Konstantinova, N.V. Sadovnikov, V.A. Semionkin // Book of abstracts of XI International Conference
on Molecular Spectroscopy, Wroclaw – Kudowa Zdroj, 2011. – P. 145.
252. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy of the iron cores in human liver ferritin, ferritin in
normal human spleen and ferritin in spleen from patient with primary myelofibrosis. Preliminary
results of comparative analysis / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova,
E. Kuzmann, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of 8th International Biometals Symposium. –
Brussels, 2012. – P. 70.
253. Alenkina, I.V. Comparative analysis of the iron cores in human liver ferritin and iron storage
proteins in normal human spleen and spleen from patients with some hematological malignant diseases
using Mössbauer spectroscopy with a high velocity resolution / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, A.V.
174
Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A. Semionkin // Book of abstracts of 3rd International Conference
on Analytical Proteomics. – San Pedro, 2013. – P. 07.
254. Oshtrakh, M.I. The
57
Fe hyperfine interactions in iron storage proteins in liver and spleen
tissues from normal human and two patients with mantle cell lymphoma and acute myeloid leukemia:
a Mössbauer effect study / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A.
Semionkin // Hyperfine Interactions. – 2015. – V. 231. – P. 123–130.
255 Schrijvers, D. Management of anemia in cancer patients: transfusions / D. Schrijvers // The
Oncologist. – 2011. – V. 16 (Suppl 3). – P. 12–18.
256. Oshtrakh, M.I. Differences of the 57Fe hyperfine parameters in both oxyhemoglobin and spleen
from normal human and patient with primary myelofibrosis / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V.
Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of The 4th Joint Meeting of the
International Conference on Hyperfine Interactions and the International Symposium on Nuclear
Quadrupole Interactions. – Beijing, 2012. – P. P11–3.
257. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy of normal human tissues and tissues from patients
with hematological malignances / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova,
V.A. Semionkin // Book of Abstracts of XIIth International Conference on Molecular Spectroscopy. –
Krakow–Bialka Tatrzanska, 2013. – P. 67.
258. Oshtrakh M.I. Differences of the 57Fe hyperfine parameters in both oxyhemoglobin and spleen
from normal human and patient with primary myelofibrosis / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V.
Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A. Semionkin // Hyperfine Interactions. – 2013. – V. 222. – P. 55–
60.
259. Oshtrakh, M.I. Mössbauer spectroscopy of liver and spleen tissues from normal human and
patients with hematological malignancies / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, T.S.
Konstantinova, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of 32th European Congress on Molecular
Spectroscopy. – Düsseldorf, 2014. – P. 88.
260. Oshtrakh, M.I. The
57
Fe hyperfine interactions in iron storage proteins in liver and spleen
tissues from normal human and two patients with mantel cell lymphoma and acute myeloid leukemia:
a Mössbauer effect study / M.I. Oshtrakh, I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A.
Semionkin // Book of abstracts of Joint International Conference on Nuclear Quadrupole Interactions
2014. – Canberra, 2014. – P. 122.
261. Alenkina, I.V. A comparative study of liver and spleen tissues from normal human and
patients with some hematological malignant diseases using Mössbauer spectroscopy / I.V. Alenkina,
M.I. Oshtrakh, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A. Semionkin // Сборник материалов XIII
Международной конференции «Мессбауэровская спектроскопия и ее применения».– М: ИМЕТ
РАН, 2014. – С. 96.
175
262. Alenkina, I.V. Mössbauer spectroscopy of iron deposits in normal and patients’ liver and
spleen / I.V. Alenkina, M.I. Oshtrakh, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A. Semionkin //
European Biophysics Journal. – 2015. – V. 44. – Р. 22
263. Oshtrakh, M.I. The Fe-57 hyperfine interactions in the life sciences: application of Mössbauer
spectroscopy with a high velocity resolution in the study of iron-containing biomolecules and
pharmaceutical compounds / M.I. Oshtrakh I.V. Alenkina, A.V. Vinogradov, A. Kumar , A.
Berkovsky, A. Zakharova, T. Konstantinova, V.A. Semionkin // Book of Abstracts of The 14th
International Conference on Modern Trends in Activation Analysis and The 11th International
Conference on Nuclear Analytical Methods in the Life Sciences – Delft, 2015. – P. MO5C.
264. Alenkina, I.V. Comparative study of liver and spleen tissues from healthy human and patients
with some hematological malignancies using magnetization measurements and Mössbauer
spectroscopy / I.V Alenkina, M.I. Oshtrakh, I. Felner, A.V. Vinogradov, T.S. Konstantinova, V.A
Semionkin // Book of abstracts of the 2nd International Turkish Congress on Molecular Spectroscopy. –
Antalya, 2015. – P. O 21.
265. Felner, I. Peculiar magnetic observations in pathological human liver / I. Felner, I.V. Alenkina,
A.V. Vinogradov, M.I. Oshtrakh // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. – 2016. – V. 399. –
P. 118–122.
266. Senftle, F.E. Magnetic susceptibility of normal liver and transplantable hepatoma tissue / F.E.
Senftle, A. Thorpe // Nature. – 1961. – V. 191. – P. 410–413.
267. Felner, I. Superconductivity and unusual magnetic behavior in amorphous carbon / I. Felner //
Materials Research Express. – 2014. – V. 1. – № 016001.
268. Felner, I. Unusual magnetic properties and superconductivity in sulfur-doped amorphous
carbon powder // I. Felner, E. Prilutskiy // Journal of Superconductivity and Novel Magnetism. – 2012.
– V. 25. – P. 2547–2555.
269. Barzola-Quiquia, J. Magnetic order and superconductivity observed in bundles of double-wall
carbon nanotubes / J. Barzola-Quiquia, P. Esquinazi, M. Lindel, D. Spemann, M. Muallem, G.D.
Nessim // Carbon. – 2015. – V. 88. – P. 16–25.
270. Ben Dor, O. A chiral-based magnetic memory device without a permanent magnet / O. Ben Dor,
S. Yochelis, S.P. Mathew, R. Naaman, Y. Paltiel // Nature Communication. – 2013. – V. 4. – № 2256.
271 Joos, A. Characterisation of iron oxide nanoparticles by Mössbauer spectroscopy at ambient
temperature / A. Joos, C. Rümenapp, F.E. Wagner, B. Gleich // Journal of Magnetism and Magnetic
Materials . – 2016. – V. 399. – P. 123–129.
272 Miglierini, M. Mössbauer and SQUID characterization of iron in human tissue: case of globus
pallidus / M. Miglierini, R. Boca, M. Kopáni, A. Lancok // Acta Physica Polonica A. – 2014. – V. 126.
– P. 240–241.