Фармакогностическое изучение чернушки дамасской выращенной в условиях Ставропольского края

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЛИАЛ
ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
04201362202
На правах рукописи,
Маширова Светлана Юрьевна
«ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
СЕМЯН ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ {NIGELLA DAMASCENA L.),
ВЫРАЩЕННОЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ»
14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Научный руководитель:
Орловская Т.В.,
доктор фармацевтических наук,
доцент
Пятигорск -2013
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
6
ГЛАВА 1. БОТАНИЧЕСКАЯ, ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ И
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ
13
1.1 Характеристика рода Чернушка (Nigella)
1.2 Химический состав
1.3 Применение чернушки в традиционной и научной медицине
1.4 Культивирование и агротехника чернушки дамасской
13
21
22
24
ЗАКЛЮЧЕНИЕ по ГЛАВЕ 1
26
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
27
2.1 Объекты исследования
2.2 Методы исследования углеводов
27
27
2.2.1 Свободные моносахариды
2.2.2 Олиго- и полисахариды
2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья
2.2.4 Кислотный гидролиз
2.2.5 Хроматографический анализ углеводов
2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области
2.2.8 Количественное определение галактуронидов
2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов
27
28
28
29
29
30
30
30
31
2.3 Методы исследования липидов
31
2.3.1 Выделение липидов из растительного сырья
2.3.2 Определение физико-химических показателей жирного масла
2.3.3 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
2.3.4 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС)
31
31
32
32
2.4 Методы исследования белков, пептидов, аминокислот
33
2.4.1 Качественное обнаружение аминокислот
2.4.2 Выделение и очистка пептидного комплекса
2.4.3 Выделение аминокислот и определение
аминокислотного состава
2.4.4 Исследование пептидов методом электрофореза
2.4.5 Исследование пептидов методом ВЭЖХ
33
33
2.5 Методы исследования эфирных масел
35
34
34
35
3
2.5.1 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
35
2.6 Методы исследования ферментной активности
36
2.6.1 Определение липолитической активности
2.6.2 Определение протеолитической активности
36
36
2.7 Методы исследования макро- и микроэлементного состава
2.8 Общие методики стандартизации сырья
37
38
2.8.1 Методы отбора проб для анализа
2.8.2 Морфолого-анатомические исследования
2.8.3 Определение числовых показателей качества сырья
2.8.4 Определение микробиологической чистоты сырья
2.8.5 Определение содержания радионуклидов
2.8.6 Определение сроков хранения сырья
2.8.7 Статистическая обработка данных
2.8.8 Валидация методик количественного определения
38
38
38
38
38
39
39
39
2.9 Методы токсико-фармакологических исследований
40
2.9.1
2.9.2
2.9.3
2.9.4
40
41
42
42
Исследование «острой» токсичности
Изучение антибактериальной активности
Изучение ранозаживляющей активности
Изучение гиполипидемической активности
2.9.5 Изучение гепатозащитной активности
43
2.9.6 Изучение желчегонной активности
44
2.9.7 Изучение диуретической активности
2.9.8 Оценка биохимического профиля сыворотки крови
лабораторных животных
2.9.9 Определение биохимических показателей в гомогенате печени
лабораторных животных
44
44
47
ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕМЯН ЧЕРНУШКИ
ДАМАССКОЙ
48
3.1 Морфологическая характеристика семян чернушки дамасской
3.2 Анатомическая характеристика семян чернушки дамасской
48
49
выводы по ГЛАВЕ 3
56
ГЛАВА 4. ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
57
4.1 Исследование углеводов
57
4.1.1 Выделение полисахаридов
57
4
4.1.2 Изучение химического состава углеводных фракций
58
4.1.2.1 Групповые качественные реакции на углеводы
4.1.2.2 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом
хроматографии на бумаге
4.1.2.3 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом
газожидкостной хроматографии (ГЖХ)
4.1.2.4 Изучение углеводных фракций методом ИК-спектроскопии
4.1.2.5 Изучение физико-химических характеристик пектинов
58
59
61
61
64
4.2 Исследование липидов
65
4.2.1 Выделение липидов
4.2.2 Определение физико-химических показателей эюирного масла
4.2.3 Определение жирнокислотного состава
4.2.4 Определение компонентного состава жирного масла
4.2.5 Хроматографическое изучение липидов
65
67
68
70
72
4.3 Белки, пептиды, аминокислоты
73
4.3.1 Качественное обнаружение аминокислот
4.3.2 Количественное определение белка и пептидов
4.3.3 Определение аминокислот методом жидкостной
хроматографии на аминокислотном анализаторе
4.3.4 Электрофоретический анализ пептидов
4.3.5 Изучение пептидов методом ВЭЖХ
73
74
4.4. Эфирные масла
77
4.4.1 Определение содержания эфирного масла
4.4.2 Определение подлинности эфирного масла
4.4.3 Изучение эфирного масла методом ГЖХ
4.4.4 Изучение эфирного масла методом ВЭЖХ
78
78
80
82
4.5 Ферменты
89
4.5.1 Определение липолитической активности
4.5.2 Определение протеолитической активности
4.5.3 Выделение фермента липазы
89
90
90
4.6 Разработка методики подлинности семян чернушки дамасской
4.7 Макро- и микроэлементный состав, тяжелые металлы,
радионуклиды
91
4.7.1 Определение макро- и микроэлементного состава
4.7.2 Определение содержания тяжелых металлов
95
97
74
75
76
95
5
4.7.3 Определение содержания радионуклидов
98
4.8 Определение числовых показателей
4.9 Определение микробиологической чистоты
4.10 Обоснование норм качества «Чернушки дамасской семена»
100
100
101
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4
104
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
107
5.1 Изучение «острой» токсичности
5.2 Изучение антибактериальной активности
5.3 Изучение ранозаживляющей активности
5.4 Изучение гиполипидемической активности
5.5 Изучение гепатозащитной активности
5.6 Изучение желчегонной активности
5.7 Изучение диуретической активности
107
113
114
116
118
122
124
выводы по ГЛАВЕ 5
125
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
127
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
130
ПРИЛОЖЕНИЯ
146
6
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Несмотря на достаточно высокие тем­
пы развития мировой фармацевтической индустрии, для России остается острым
вопрос внедрения в медицинскую практику отечественных препаратов. Одним из
путей решения
данной проблемы является развитие фитохимических произ­
водств, для которых необходимо наращивать научный потенциал в сфере получе­
ния и расширения сведений о химическом составе лекарственного растительного
сырья (ЛРС), фармакологической активности и развития сырьевой базы.
Пищеварительные ферменты - одна из наиболее часто используемых в га­
строэнтерологии групп лекарственных средств. Нарушения процессов пищеваре­
ния различной степени выраженности выявляются практически при всех заболе­
ваниях пищеварительного тракта [82].
Применение препаратов, содержащих панкреатин, на первый взгляд, кажет­
ся более физиологичным. Но по некоторым данным преимуществом лекарствен­
ных препаратов растительного происхождения является отсутствие в их составе
животного белка и компонентов желчи, что делает возможным назначение дан­
ных ферментных препаратов при аллергиях, а также в тех случаях, когда присут­
ствие желчных кислот крайне нежелательно [114].
Нигедаза - ферментный препарат липолитического действия, полученный
из семян чернушки дамасской {Nigella damascena L.), используется как в отечест­
венной, так и в зарубежной медицинской практике. Однако после распада СССР
сырьевая база чернушки дамасской осталась в Украине, и в настоящее время про­
изводство данного препарата в России затруднено из-за дефицита сырья. Пер­
спективным направлением увеличения заготовок отечественного сырья является
расширение его сырьевой базы. Поэтому Ставропольским НИИ сельского хозяй­
ства проведены интродукционные исследования по введению чернушки дамас­
ской в промышленную культуру в регионе Ставропольского края.
Для фармацевтического производства необходимо предусматривать вне­
дрение малоотходных технологий, что будет способствовать повышению рента-
7
бельности и снижению себестоимости фитопрепаратов. Это возможно за счет вы­
явления дополнительных групп биологически активных соединений
(БАС) и
расширения возможности медицинского применения [79].
В мировой литературе есть достаточно сведений о фармакологической ак­
тивности различных групп БАС, в частности, жирного масла, углеводов, компо­
нента эфирного масла - тимохинона, но химические исследования данных групп
БАС носят фрагментарный характер, так как в большей мере проводились только
в отношении ферментов.
В то же время с учетом возможности получения из данного сырья различ­
ных комплексов биологических веществ, необходимо разработать нормативную
документацию, учитывающую различные пути их использования и современные
требования, предъявляемые к стандартизации ЛРС.
Таким образом, углубленное
фитохимическое изучение семян Nigella
damascena является актуальным и позволит расширить рамки их медицинского
использования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось ком­
плексное фитохимическое исследование и установление фармакологической ак­
тивности различных фармацевтических субстанций, полученных из семян Nigella
damascena.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Проанализировать современное состояние исследований по химическому со­
ставу, биологическим и фармакологическим свойствам Nigella damascena.
2. Изучить химический состав семян Nigella damascena, выращенной в Ставро­
польском крае, по группам биологически активных соединений: углеводы, липиды, пептиды, эфирные масла, ферменты, а также макро- и микроэлементы.
3. Определить критерии оценки подлинности и качества семян Nigella damascena
для включения их в нормативную документацию.
4. Провести фармакологический скрининг фракций, полученных из семян Nigella
damascena.
8
5. Разработать нормативную документацию на лекарственное сырье «Чернушки
дамасской семена».
Научная новизна. В результате проведенных исследований эксперимен­
тально подтверждена возможность использования семян Nigella damascena в ка­
честве источника трех целевых групп БАС: ферментов, жирного и эфирного ма­
сел, что доказывает перспективу расширения ее использования в медицинской
практике.
Впервые с помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ,
ГЖХ, ГХ-МС, электрофореза и др.) проведено систематическое фитохимическое
изучение семян Nigella damascena, выращенных в Ставропольском крае. Данные
исследования показали возможность комплексного использования сырья при его
промышленной переработке.
Впервые определен качественный и количественный состав углеводов (вы­
ход углеводов составил около 3,55%). Проведен анализ физико-химических ха­
рактеристик пектинов.
Изучен липидный комплекс семян Nigella damascena (содержание составля­
ет до 30 %), выращенной в Ставропольском крае методами ГЖХ, спектрофотометрии и ГХ-МС и определены физико-химические показатели жирного масла.
В результате анализа пептидных фракций (содержание составило от 0,84%
до 1,94%) методом эксклюзионной ВЭЖХ идентифицированы пептиды и опреде­
лено их количество.
Методом ГЖХ и физико-химическими методами установлены показатели
подлинности эфирного масла (содержание составляет до 3%). Разработана мето­
дика определения тимохинона в эфирном масле методом ВЭЖХ.
Подтверждена липолитическая активность (~9,5 ЛЕ/мг) и впервые установ­
лена протеолитическая активность белков семян Nigella damascena (~17,6 ЕД/мг).
Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор макро- и
микроэлементов в семенах Nigella damascena (27 элементов).
9
На основании морфолого-анатомического исследования определены анато­
мические признаки, позволяющие проводить диагностику
семян
Nigella
damascena (цельное сырье, порошок).
Разработаны числовые показатели, регламентирующие качество сырья.
Проведены фармакологические скрининговые исследования различных суб­
станций на основе исследуемого сырья, результаты которых могут быть исполь­
зованы при получении новых фитопрепаратов, обладающих антибактериальным,
ранозаживляющим, гиполипидемическим, гепатозащитным, желчегонным и диу­
ретическим действиями.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость
исследования вытекает из новизны полученных результатов и заключается в по­
лучении новых сведений о химическом составе и фармакологической активности
различных групп БАС, выделенных из семян Nigella damascena. В результате про­
веденной работы показана возможность использования исследуемого вида расти­
тельного сырья в комплексных малоотходных технологиях получения современ­
ных лекарственных фитопрепаратов. Данные, полученные в ходе фармакологиче­
ских исследований, являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего
углубленного изучения различных фармацевтических субстанций.
Практическая значимость исследования заключается в том, что в результа­
те фитохимического и фармакологического исследования доказана возможность
использования отечественного сырья Nigella damascena для производства фер­
ментного препарата «Нигедаза», а также в качестве источников эфирного и жир­
ного масел, обладающих антибактериальной, ранозаживляющей, гиполипидемической, гепатозащитной и желчегонной активностями.
Предложен новый вид ЛРС для включения в Государственную фармакопею
России XII издания.
Разработаны нормы качества и методики стандартизации семян Nigella
damascena в соответствии с современными требованиями и пути использования,
которые включены в проект фармакопейной статьи (ФС).
10
Для определения подлинности и качества семян Nigella damascena разрабо­
таны и предложены методики ТСХ-анализа, ГЖХ и спектрометрии.
Разработана методика ВЭЖХ для количественного определения тимохинона в эфирном масле семян Nigella damascena и проведена валидационная оценка
по параметрам: специфичность, линейность, прецизионность.
Результаты
комплексного
фитохимического
исследования
Nigella
damascena, выращенной на базе Ставропольского НИИ сельского хозяйства, по­
зволили подготовить для передачи в Государственную комиссию по испытанию и
охране селекционных достижений РФ новый сорт этой культуры.
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
> Фармакопейная статья (ФС) «Чернушки семена» (проект для включения в Го­
сударственную фармакопею России XII издания);
> Инструкция по сбору и сушке «Чернушки семена» (утверждена ГНУ ВИЛАР
Россельхозакадемии 27.07.2012 г.).
Результаты диссертационных исследований используются в учебных про­
цессах на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ
ВПО СамГМУ Минздрава России и кафедрах фармакогнозии и ботаники ГБОУ
ВПО КГМУ Минздрава России и ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России.
Методологическая основа, объекты и методы исследования. Методоло­
гической основой настоящей диссертационной работы послужили научные под­
ходы к расширению номенклатуры отечественного официального ЛРС с исполь­
зованием ресурсосберегающих технологий на основе комплексного фитохимиче­
ского изучения.
Объектом исследования служили высушенные измельченные семена чер­
нушки дамасской {Nigella damascena L.) семейства лютиковых - Ranunculaceae,
заготовленные в период их полного созревания (2006-2010 гг.) от растений, вы­
ращенных на территории Ставропольского края (ГНУ «Ставропольский НИИСХ»
РАСХН, г. Михайловск).
Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса
различных физико-химических методов: хроматография колоночная (КХ), тон-
11
кослойная (ТСХ), бумажная (БХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС), высокоэффективная жидкостная хроматография
(ВЭЖХ), электрофорез, спектрометрия в УФ, видимой и ИК- областях, атомноабсорбционная спектроскопия (ААС) и др.
Скрининговые микробиологические и фармакологические исследования
включали изучение антибактериальной, ранозаживляющей,
гиполипидемиче-
ской, гепатозащитной, желчегонной и диуретической активностей.
Положения, выносимые на защиту: на защиту выносятся следующие по­
ложения, характеризующиеся научной новизной:
1. Результаты фитохимического исследования семян Nigella damascena, выра­
щенной в Ставропольском крае, по группам биологически активных соедине­
ний: липиды, эфирные масла, углеводы, пептиды, ферменты, а также макро- и
микроэлементы.
2. Результаты по разработке критериев подлинности и показателей качества рас­
тительного сырья.
3. Результаты скринингового фармакологического исследования биологически
активных комплексов семян чернушки дамасской.
Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени досто­
верности научных результатов определяется большим объемом проанализирован­
ной информационной базы, комплексностью и детальностью исследования, ис­
пользованием большого количества современных физико-химических методов
анализа, математико-статистической обработкой полученных результатов.
Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конфе­
ренциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической про­
дукции» (г. Пятигорск, 2011 г., 2012 г.).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 10 научных
работах, в том числе 5 статьях в журналах, входящих в перечень рецензируемых
научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов
диссертаций, рекомендованных ВАК РФ.
12
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических
наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научноисследовательских работ ПМФИ - филиала ВолгГМУ Минздрава России по заре­
гистрированной
теме: «Фармакогностическое исследование дикорастущих и
культивируемых растений с целью расширения сырьевой базы и внедрения в ме­
дицинскую практику» (№ Гос. регистрации 01201354514).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
145 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,
главы «Объекты и методы исследования», трех глав экспериментальной части,
общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 32 табли­
цы, 35 рисунков. Список цитируемой литературы включает 188 источников, из
них - 39 на иностранных языках.
В первой главе рассмотрены ботаническая, фармакогностическая и медикобиологическая характеристика рода Nigella. Во второй главе приведены основные
материалы и методы исследований, используемые в экспериментальной работе. В
третьей главе приведены результаты морфолого-анатомического исследования
исследуемого сырья. В четвертой главе отражены результаты фитохимического
анализа семян Nigella damascena. Пятая глава посвящена изучению фармакологи­
ческой активности некоторых фитосубстанций, полученных из семян Nigella
damascena. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключитель­
ные результаты и выводы по проделанной работе. Приложение включает проект
ФС на сырье «Чернушки дамасской семена», Инструкцию по сбору и сушке
«Чернушки семена», акты о внедрении результатов диссертационной работы и
материалы изучения «острой» токсичности.
13
ГЛАВА 1. БОТАНИЧЕСКАЯ, ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ И
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ
1.1 Характеристика рода Чернушка (Nigella)
Род Чернушка - Nigella принадлежит к отделу Magnoliophyta, классу Magnoliopsida, подклассу Ranunculidae, надпорядку Ranunculanae, порядку Ranunculales, подпорядку Ranunculineae, семейству Ranunculaceae, подсемейству Deiphnioideae, трибе Nigelleae [127]. Род Чернушка {Nigella) состоит из 14-20 видов,
произрастающих в Средиземноморье, Южной и Юго-Восточной Европе, на Кав­
казе, в Малой и Средней Азии, Северной Африке, в СНГ - 11 видов [87].
Название чернушка происходит от латинского nigellus, что означает «чер­
новатый» [147].
В мировой практике используются как пищевые и лекарственные растения
только четыре вида: Nigella damascena L. (чернушка дамасская) - растет в Евро­
пейской части и на Кавказе, N. sativa L. (ч. посевная), N. indica (ч. индийская) произрастают в Индии, Афганистане, Пакистане и N. grandulifera (ч. железистая)
- встречается в Туркмении и в западных районах Китая [87, 147].
Чернушка дамасская {Nigella damascena L.) — травянистое однолетнее рас­
тение высотой 20-60 см, стебель прямостоячий, ребристый, с жесткими дваждытрижды перисто-рассеченными на линейно-щетинистые сегменты, края листо­
вой пластинки завернуты вниз, длиной 6-10 см и шириной 4-5см. Листья покрыты
мелкими трихомами. Верхушечные листья приближены к основанию плодов.
Цветки верхушечные, одиночные, в диаметре 4 см, окружены ажурным зе­
леным покрывалом из верхних перисто-рассеченных листьев, в несколько раз
превышающий цветок, простые или махровые, чашечка пятичленная, листочки
имеют, белую, голубую или синюю окраску (Рисунок 1).
Лепестки - двугубые нектарники, по длине меньше чашечки, округленные,
переходящие в короткий и узкий ноготок. Цветет в июне - августе. Плоды созре­
вают в августе — сентябре [55].
14
Рисунок 1 - Внешний вид чернушки дамасской
Плод состоит из пяти сильно вздутых, гладких, с ровным носиком, срос­
шихся почти до верха листовок, окруженных тонко-рассеченной, красивой оберт­
кой из верхушечных листьев, длиной 1-1,5 см. Семена черные, мелкие (2,2-3 мм
длиной и
1,5-2
мм шириной), клиновидные, трехгранные,
с поперечно-
морщинистой поверхностью с приятным земляничным запахом [149].
Естественно произрастает в Крыму, на Кавказе, Средиземноморье, Балканах
и Малой Азии. Встречается как сорное растение в ряде южных районов европей­
ской части России, в Центральной Азии. Растет по степным склонам, сорным мес­
там. Изредка дичает. В России культивируется как декоративное и лекарственное
растение [9]. В качестве лекарственного сырья используют собранные в период
полной зрелости и высушенные семена [67, 99].
Чернушка посевная (Nigella sativa L.) - однолетнее травянистое светлозеленое растение с прямым ветвистым стеблем высотой 15-80 см. Листья череш-
15
ковые, дважды и трижды
перисто-рассеченные на узколинейные доли. Цветки
одиночные, относительно крупные, горизонтально расположенные, с голубыми
чашелистиками продолговато-притуплённые, суженные при основании в ноготок,
и с зелеными лепестками, лепестки короче чашелистиков. Верхняя губа лепестков
с длинными линейными окончаниями, нижняя - длиннее верхней, рассеченная на
две доли. Белесые цветки на верхушках ветвей довольно крупные, выделяются зе­
леноватым или голубоватым рисунком на концах лепестков, голубые чашелисти­
ки продолговатые, притуплённые, суженные при основании в ноготок. Цветет в
июле-августе (Рисунок 2).
Рисунок 2 - Внешний вид чернушки посевной
Плод - коробочка с клиновидными, трехгранными черными семенами. Цве­
тет с начала июля по август, плоды созревают в августе - сентябре [67].
Плодов - листовок обычно 5. Каждая листовка вздутая, с длинным, закру­
ченным вдоль носиком.
16
Характерная особенность чернушки посевной заключается в том, что ее
листовки при созревании растрескиваются только при механическом воздействии,
и это значительно сокращает потери урожая семян. Семена с сильным пряноперечным ароматом.
К настоящему времени чернушку посевную культивируют в Европе, Малой
Азии и Индии, на Украине, в Средней Азии. В России выращивают как декора­
тивное растение [10, 87].
Встречается в южных областях европейской части России, в Украине, на
Кавказе, в Средней Азии. В Южной России чернушку посевную можно встретить
и в культуре, и как одичавшее растение. Дикорастущая чернушка посевная чаще
всего встречается в посевах, по сорным местам, на степных склонах.
Чернушка полевая (Nigella arvensis L.) - однолетнее травянистое растение
высотой 20-50 см. Листья перисто-рассеченные на линейные или копьевиднолинейные доли. Стебель прямостоячий, ветвистый, ребристый, по ребрам ино­
гда мелко-бугристо-шершавый, прямой, ветвистый. Листья 2-4 см длиной, пери­
сто-рассеченные на немногочисленные узколинейные доли, иногда с заворочен­
ными вниз и мелко-бугорчато-шершавыми краями [67, 99].
Чашелистики 1,5-2 см длиной, округло обратнояйцевидные, с резко высту­
пающими жилками, по верхнему краю слегка волнисто выемчатые и на вершине
сразу коротко заостренные, в нижней части также внезапно суженные в ноготок.
Лепестки-нектарники на коротких ножках мелкие, верхняя губа при основании
округло-расширенная и затем сразу вытянутая в длинное остроконечие, значи­
тельно короче яйцевидной, слегка опушенной нижней губы, которая часто окра­
шена в зеленый цвет, с синими поперечными полосками и рассечена на две сверху
мозолисто утолщенные дольки. Пыльники длиннозаостренные на вершине. Лис­
товки продолговатые, сильно шершавые от мелких бугорков, при основании до
половины сросшиеся, на спинке сильно ребристые, с ребрами, переходящими на
длинный бугристый вдоль закругленный носик, почти равный листовкам [119]
(Рисунок 3).
17
Рисунок 3 - Внешний вид чернушки полевой
Произрастает в Европейской части России (Крым, Средний Днепр, Верхний
Днепр, Нижний Дон), на Кавказе (Дагестан, Восточное, Западное и Южное Закав­
казье), в Средней Азии [8, 58, 136].
Чернушка восточная (Nigella orientalis L.) — однолетнее растение высотой
30-40 см с маленькими цветами и декоративными соплодиями. Стебель голый,
резко гранистый. Листья дважды перисто-рассеченные с узколинейными немно­
гочисленными дольками, по краям вниз завернутыми и усаженными густо корот­
кими щетинками, проходящими иногда и на среднюю жилку (Рисунок 4).
Чашелистики желтые, до 1,5 см длиной, продолговатые, к основанию су­
женные в короткую ножку, на верхушке переходящие в короткое, иногда окра­
шенное остроконечие, снизу по жилкам снабженные короткими щетинками, по
отцветении поникающие [136]. Произрастает на Кавказе.
18
Рисунок 4 - Внешний вид чернушки восточной
Чернушка реснитчатая (Nigella ciliaris DC.) чем-то напоминает ч. восточ­
ную, но в отличие от нее имеет распластанную крону, прижимающуюся к земле.
Желтовато-зеленый цветок сильно опушен ресничками-волосками (Рисунок 5).
Декоративная листовка расположена горизонтально, у ч. восточной верти­
кально. Произрастает в Украине, Израиле [148].
Чернушка железистая (Nigella grandulifera L.) — стебель 20-40 см высотой,
маловетвистый, прямой, ребристый. Листья перисто-рассеченные на ланцетнолинейные дольки. Чашелистики мелкие, 8-9 мм длиной, бледно-синие, продолго­
вато-треугольные или обратнояйцевидно-треугольные, наверху заостренные, вни­
зу суженные в короткую ножку. Нектарники очень мелкие, опушенные, верхняя
губа ланцетная, короче нижней губы, разделенной на 2 маленькие обратнояйцевидные синие дольки, тупо оканчивающиеся утолщением. Пыльники наверху
притуплённые, листовки в числе 5-9, вздутые, на спинке округлые, слегка килевидные, почти до вершины, сросшиеся с ровным или закрученным носиком.
19
Рисунок 5 - Внешний вид чернушки реснитчатой
Семена яйцевидно-трехгранные, почти гладкие, только под лупой тонко­
бугристые [136].
Чернушка чернушковая (Nigella nigellastrum L.) достаточно сильно отлича­
ется от других видов длинными нитевидными листиками, очень мелкими голу­
быми цветками с заостренными лепестками (Рисунок 6). Встречается в Украине,
Израиле [141].
Чернушка испанская (Nigella hispanica L.) (Рисунок 7). Родина - юг Испа­
нии, Северная Африка. Растение однолетнее, быстро разрастающееся. Стебли
прямостоячие около 60 см высотой. Листья темно-зеленые, глубокораздельные.
Цветки темно-голубые до 6 см в диаметре со слабым ароматом. Плодолистики
крупные, темно-красные. Цветет с июня по сентябрь. Плоды похожи на плоды
чернушки дамасской, но не окружены оберткой [15].
20
Рисунок 6 - Внешний вид чернушки
чернушковой
тли
Рисунок 7 - Внешний вид чернушки испанской
21
1.2 Химический состав
Наиболее полно изучен химический состав чернушки посевной [79]. Мето­
дом ГЖХ изучен состав различных углеводных фракций. Установлены наиболее
важные характеристики пектинов: рН 1 % водных растворов, содержание свобод­
ных и этерифицированных карбоксильных групп, полигалактуроновой кислоты. В
результате изучения хлороформно-метанольной фракции методом ГХ-МС иден­
тифицировано 36 компонентов, помимо жирных кислот, присутствуют ретинолы,
токоферолы, ситостерины [61]. Методом гель-электрофореза определены молеку­
лярные массы пептидов, в результате чего зафиксированы низкомолекулярные
пептиды от 250 кДа до 11 кДа [63]. Семена ее содержат тимохинон [151], макрои микроэлементы: кальций, железо, медь, фосфор, калий, магний, марганец, цинк,
молибден, хром, селен, стронций, бор и йод, стероиды: кампестерин, ситостерин,
стигмастерин, альфа-спинастерин [78, 79]. В семенах содержится липаза [16].
Выделены и охарактеризованы биоактивные пептиды семян чернушки по­
севной, относящиеся к классу дефензинов и липидпереносящим белкам [41].
Семена чернушки дамасской содержат 40-44 % жирного масла, в состав ко­
торого входят ненасыщенные жирные кислоты [53, 187]; до 1,5 % эфирного масла
[160, 161, 163, 178, 180], витамин Е, тритерпеновые сапонины [166], кумарины
[165], хиноны: тимохинон [184, 185, 186], клетчатку, калий, кальций, марганец,
цинк и медь, стероиды: кампестерин, ситостерин, стигмастерин, холестерин, аль­
фа-спинастерин. В стеблях, листьях, цветках и семенах содержится алкалоид дамасценин до 0,3 % [99]. В семенах идентифицировано фенольное соединение — 10-(2,4-дигидрокси)фенилацетилглицерол [150].
В семенах чернушки накапливается очень важный фермент липолитического действия - липаза [42, 84]. В кристаллическом нигеллоне, выделенном из рас­
тения, содержатся 15 аминокислот, протеины [159]. Фосфолипиды представлены
фосфатидилхолином и фосфатидилинозитолом. Семена содержат жирное масло,
фермент - липазу, тритерпеновые сапонины, кумарины, тимохинон и следы алка­
лоидов [99].
22
Из гидролизата надземной части чернушки полевой выделено три вещества
флавоноидной природы и идентифицированы как кемпферол, кверцетян и рамноцитрин [150].
Химический состав надземной части представлен кумаринами, флавоноидами: кверцетином, рамноцином и кемпферолом, витамином С.
В траве чернушки посевной и дамасской методом ВЭЖХ идентифицирова­
ны пигменты: лютеин, зеаксантин, (3-криптоксантин, а-каротин, [3-каротин, неоксантин и каротиноиды [177].
Чернушка железистая, как и другие виды, содержит флавоноиды, эфирное
масло, сесквитерпеновые углеводороды, стероиды, алкалоиды, витамины, жирное
масло и ферменты [87].
1.3 Применение чернушки в традиционной и научной медицине
В народной медицине семена чернушки применяются достаточно разнооб­
разно. Растертая чернушка с виноградным уксусом помогает при болях в суставах
[28]. Настой семян чернушки дамасской обладает мочегонным, желчегонным,
общеукрепляющим и глистогонным действием [67], способствует увеличению
лактации у кормящих матерей, нормализует менструальный цикл, уменьшает ме­
теоризм и нормализует стул при наличии запоров [7]. Отвар семян эффективен
при бронхиальной астме, бессоннице, связанной с тревогой, женских заболевани­
ях, почечнокаменной болезни, гепатите, некоторых кожных заболеваниях [181].
При местном наружном применении масло чернушки используют для косметиче­
ских масок, компрессов, массажа [14, 112, 158].
Из семян чернушки дамасской получен препарат «Нигедаза», содержащий
фермент липолитического действия. «Нигедаза» - препарат, рекомендованный в
качестве средства, возмещающего недостающую или полностью отсутствующую
липолитическую активность дуоденального сока, обусловленную патологией ор­
ганов пищеварения (панкреатиты, холецистопанкреатиты, хронические гепатиты,
хронические гастриты, энтероколиты и т. д.), а также при возрастном снижении
липолитической активности [100, 102, 103]. Следует отметить, что «Нигедаза» яв-
23
ляется препаратом растительной липазы, используемым как в отечественной, так
и в зарубежной медицинской практике [48, 59, 121].
В эксперименте бутанольный экстракт надземной части и семян, эфирное
масло проявляют антибактериальную активность [154], спиртовой экстракт семян
- эстрогенподобную [152, 157, 164], что связано с наличием фенольных соедине­
ний [165]. Мазь на основе жирного масла обладает ранозаживляющим действием
[38].
Жирное масло чернушки имеет множество показаний для применения, как
высокоэффективное мочегонное, желчегонное, мягкое слабительное, как иммуно­
стимулирующее средство, к тому же оно дает результаты в лечении различных
дерматологических заболеваний, связанных с нейрогуморальными и гистаминными нарушениями в организме [30, 158, 170].
Благодаря наличию ряда медиаторных веществ, масло чернушки стимули­
рует секрецию гистаминазы (антагониста биогенных аминов) и выработку противогистаминных антител. К тому же поставка в ткани циклооксигеназы обеспечи­
вает высокий коэффициент антисеротонинной активности. При клинических ис­
пытаниях на пациентах с аллергическими заболеваниями (аллергический ринит,
бронхиальная астма, атопическая экзема) после лечения, проведенного маслом
чернушки в капсулах в дозе 40-80 мг/кг/сут, было выявлено, что субъективные
аллергические ощущения уменьшались у всех пациентов [170]. Отмечено сниже­
ние содержания триацилглициридов в плазме и повышение уровня липопротеидов
высокой плотности, в то время как количество эозинофилов, кортизола и адренокортикотропинов не изменилось [166].
Препараты чернушки стимулируют синтез иммуномодуляторов, что позво­
ляет быстро нейтрализовать инфекционную агрессию, и оказывают противовос­
палительное действие на местном и системном уровне, устраняя симптомы про­
студы [158].
Эфирное масло, введенное непосредственно в твердые опухоли, ингибировало их развитие, и даже уменьшило их объем после 30 дней лечения; ацетатные и
24
этиловые фракции эфирного масла обладают сильным цитотоксическим эффек­
том против опухолевых клеток [153, 158].
Компонент эфирного масла чернушки - тимохинон имеет антиастматиче­
ское, антигистаминное [162], бактерицидное [183], противоопухолевое [156, 173,
179], противосудорожное [171], антиоксидантное, желчегонное действие [184].
Другими не менее важными компонентами эфирного масла чернушки яв­
ляются тимол и карвакрол, для которых
характерны антиоксидантная, антибак­
териальная и противогрибковая активности благодаря их фенольной структуре.
Наряду с другими результатами, антиоксидантная активность тимола полезна для
выработки новых препаратов вместо антибиотиков или микостатиков, так как
проявление одной молекулой всех трех видов активности - антибактериальной,
противогрибковой и антиоксидантной - может дать и синергетические эффекты
[5].
Согласно заключениям американских онкологов, тимохинон блокирует ак­
тивность воспалительных цитокинов [182].
Дихлорэтановый экстракт обладает противолейшманиозной активностью,
что может служить амфоторицину Б альтернативой [155]. Обнаружена и под­
тверждена антимикробная активность по отношению к грамположительным бак­
териям, синегнойной палочке и золотистому стафилококку [157].
В России качество сырья чернушки дамасской регламентирует ВФС 421691-87, а Фармакопея Китая - сырье чернушки железистой [22].
1.4 Культивирование и агротехника чернушки дамасской
Чернушка дамасская довольно неприхотливое растение, к почвам нетребо­
вательна, может произрастать на засоленных почвах. Молодые всходы переносят
весенние заморозки. Размножается семенами, посев проводят ранней весной ши­
рокорядным способом. Норма высева семян 12-15 кг/га, глубина заделки 1,5-2 см.
Прорастают они при температуре 5-6° С. Всходы появляются через 14-15 дней.
Почву готовят основной вспашкой, ранневесенним боронованием, культивацией и
25
предпосевным прикатыванием. Уход заключается в прополке сорняков и рыхле­
нии междурядий [97].
Согласно агрорекомендациям при заготовке сырья используют следующую
технологию. Надземную часть растения срезают на высоте 5 см от поверхности
почвы, когда большинство нижних листьев пожелтело, а листовки
приобрели
светло-коричневый цвет. Плоды со зрелыми семенами обмолачивают, очищают
от посторонних частей и высушивают на чердаках, раскладывая на чистых под­
стилках тонким слоем, в хорошую погоду - на открытом воздухе под навесом, в
тени. Можно сушить в сушилках при температуре не выше 30-35 С. Иногда до­
пустимо листовки оставлять в чистых помещениях для досушивания, после чего
сухие плоды обмолачивают и мелкие семена чернушки отделяют на решетках [43,
142].
Установлен кариотип чернушки дамасской, что позволяет проводить гене­
тический контроль различных сортов этого вида [167, 168, 169].
26
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 1
1. В России в дикорастущем виде встречаются только 3 вида: чернушка дамас­
ская, ч. посевная и ч. полевая.
2. В полной мере изучен химический состав только чернушки посевной, хи­
мический состав других видов изучен недостаточно.
3. Чернушка дамасская и посевная используются в народной и научной меди­
цине в качестве лекарственного сырья с широким спектром фармакологиче­
ской активности, в том числе для лечения социально значимых заболева­
ний.
4. Обеспечение сырьевой базы возможно за счет введения чернушки дамас­
ской и чернушки посевной в промышленную культуру.
5. Существующая нормативная документация регламентирует только липолитическую активность семян чернушки дамасской
и не предусматривает
оценку по содержанию других действующих веществ.
27
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты исследования
Объектом исследования служили высушенные цельные и измельченные се­
мена чернушки дамасской (Nigella damascena L.) семейства лютиковых — Ranunculaceae, заготовленные в период их полного созревания (2006-2010 гг.) от куль­
тивируемых растений на территории Ставропольского края (ГНУ Ставропольский
НИИ РАСХН, г. Михайловск).
Площадь посадки ежегодно составляла 1 га. Урожайность с 1 га - 5 ц.
Условия агротехники: культивируется в 3 декаде апреля, высаживается на
глубину 2 см. Если на семеноводство, семена высаживаются на расстоянии 70 см
широкорядным способом. Для культивирования в качестве лекарственного сырья
высадка семян осуществляется сплошным посевом через каждые 15 см. Перед
посевом тщательно подготавливают почву, до и после посева осуществляется
прикатывание почвы. В последующем обрабатывают участок, удаляя сорняки.
Растение светолюбиво, положительно реагирует на обильный полив водой. Почву
удобряют в основном перед осенью.
2.2 Методы исследования углеводов
2.2.1 Свободные моносахариды
Наличие свободных Сахаров определяли с помощью реакции Бертрана при
нагревании смеси равных объемов водных экстрактов исследуемого сырья и реак­
тива Фелинга [124].
Моносахариды идентифицировали по стандартным образцам с помощью
хроматографии на бумаге («Filtrak FN-15», «FN-12», «FN-7», «FN-1») нисходя­
щим способом в системах: н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) и н-бутанол-кислота
уксусная-вода (2:7:1) в течение 17-18 ч. Детектирование зон адсорбции на хроматограммах проводили раствором анилингидрофталата и нагреванием
105° С в течение 10-15 мин [140].
при 100-
28
2.2.2 Олиго- и полисахариды
Качественное определение Сахаров после гидролиза проводили реакциями с
реактивом Фелинга и 20 % раствором а-нафтола [26], с пикриновой кислотой в
щелочной среде [85], с карбазолом в сернокислой среде [33].
Количественное содержание полисахаридов определяли методом осаждения
путем прибавления к концентрированным водным извлечениям трехкратных объ­
емов спирта этилового 96 % [123].
2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья
Полисахариды из ЛРС выделяли по методу Н.К. Кочеткова и М. Sinner по­
следовательно в виде четырех фракций: 1) водорастворимые полисахариды
(ВРПС), состоящие главным образом из нейтральных моносахаридов; 2) пектино­
вые вещества (ПВ) представлены остатками уроновых кислот; 3) гемицеллюлозы
-растительные волокна [49].
Сырье предварительно обезжиривали, шрот высушивали до удаления запаха
растворителей и экстрагировали водой трижды (соотношение гидромодуля 1:10;
1:5; 1:2 соответственно) при комнатной температуре и постоянном перемешива­
нии. Объединенное и отфильтрованное извлечение упаривали под вакуумом с по­
мощью роторного испарителя до 1/5 первоначального объема при температуре 4550 С, осаждали спиртом этиловым 96 % (соотношение сырья и экстрагента 1:3).
Осадок отделяли центрифугированием, промывали спиртом этиловым, обезво­
живали ацетоном, высушивали при комнатной температуре до достижения посто­
янной массы. Таким образом, получили первую фракцию водорастворимых по­
лисахаридов (ВРПС-Х).
Затем остаток сырья дважды экстрагировали водой на водяной бане при
температуре 80° С. С объединенным извлечением поступали, как указано выше.
При этом получали вторую фракцию водорастворимых полисахаридов (ВРПС-Г).
Сумму пектиновых веществ (ПВ) выделяли следующим образом: остаток
сырья, полученный после выделения ВРПС,
трижды экстрагировали смесью
0,5 % растворов щавелевой кислоты и аммония оксалата (1:1) (соотношение гид-
29
ромодуля 1:5, 1:4 и 1:2 соответственно) на водяной бане при 85-90° С в течение 3
часов. Экстракты объединяли, центрифугировали, диализовали. Полученное из­
влечение упаривали до 1/20 первоначального объема и осаждали шестикратным
объемом спирта этилового 96 %. Осадок отделяли, центрифугировали, отфильт­
ровывали, промывали спиртом этиловым, высушивали и взвешивали.
Остаток сырья после выделения ПВ экстрагировали дважды четырех- и
трехкратным объемом 10 %-ного раствора натрия гидроксида при комнатной тем­
пературе. Экстракты объединяли, нейтрализовали уксусной кислотой, диализова­
ли, упаривали диализат до 1/10 первоначального объема и осаждали спиртом
этиловым 96 % в соотношении 1:3. Осадок (ГЦ) очищали и высушивали, как опи­
сано выше, затем взвешивали.
2.2.4 Кислотный гидролиз
Для определения мономерного состава полисахаридов проводили кислот­
ный гидролиз [123, 124]. Для исследования состава полисахаридов предваритель­
но проводили кислотный гидролиз (10 % H2SO4; 1:4,9; 100° С; 10 часов - для
ВРПС; 24 ч - ПВ; 72 ч - для ГЦ) в запаянных ампулах. Содержимое ампул пере­
носили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды, нейтрализовали бария карбо­
натом по универсальному индикатору до нейтральной среды. Растворы фильтро­
вали, фильтры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. К полученным
растворам прибавляли 3 объема спирта этилового 96 %, тщательно перемешива­
ли и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 1-2 часа. Фильтраты упари­
вали на кипящей водяной бане до получения объема около 1 мл (раствор А).
Осадки бариевых солей уроновых кислот деионизировали катионитом КУ-2 (Н )
до рН 3-4. Растворы фильтровали, упаривали до получения около 1 мл раствора
(раствор Б).
2.2.5 Хроматографический анализ углеводов
Анализ проводили в соответствии с ОФС «Хроматография на бумаге» ГФ
XII издания [24], нисходящим способом в системе: н-бутанол-пиридин-вода
30
(6:4:3) в течение 17-18 часов со стандартными образцами нейтральных моносаха­
ридов, и восходящим способом в системе: этилацетат-кислота уксусная—кислота
муравьиная-вода (18:3:1:4) в течение 5-6 ч с образцами гексуроновых кислот на
бумаге «FN-1». Хроматограммы высушивали на воздухе 1 ч, обрабатывали рас­
твором анилингидрофталата (для гексоз) и 5 % спиртовым раствором мочевины
(для кетоз), затем нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105° С [123,
124]. Идентификацию углеводов проводили в сравнении со стандартными образ­
цами и по величине R/.
2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
Анализ проводили в соответствии с ОФС «Газовая хроматография» ГФ XII
издания [24].
Моносахаридный состав определяли методом ГЖХ в виде альдонитрилов
ацетатов [172]. Исследование проводили на хроматографе Chrom-5 с пламенноионизационным детектором, колонка стеклянная (150x0,3 см), 5 % Silicone ХЕ-60
на хроматоне А^Ж-0,200-0,250 мм, температура термостата - 210° С, температура
детектора - 280° С газ-носитель - азот. Скорость газа 60 мл/мин. Проба 1 мкл.
А также при условиях: температура детектора - 290° С, газ-носитель - ге­
лий, скорость подачи газа - 30 мл/мин.
2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области
Анализ проводили в соответствии с требованиями ОФС «Спектрометрия в
инфракрасной области» [23]
на ИК- спектрофотометре
фирмы «Perkim-Elmer
1
model 2000» в интервале волновых чисел 4000-500 см" в таблетках
с калия
бромидом [32].
2.2.8 Количественное определение галактуронидов
Количественное определение галактуронидов методом спектрофотометрии
по реакции взаимодействия с карбазолом при 530 нм проведено в сравнении с
ГСО галактуроновой кислоты [33].
31
2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов
Значение рН 1 % водных растворов анализируемых углеводных образцов
при температуре 20 С определено методом потенциометрии с помощью рН-метра
марки «рН-340» при использовании стеклянного в качестве индикаторного элек­
трода и электрода сравнения - хлоридсеребряного [24].
Количественное определение свободных (Кс) и этерифицированных (Кэ)
карбоксильных групп пектиновых веществ проводили титриметрическим мето­
дом с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности на рН-метре марки
«рН-340» [6] с последующим вычислением степени этерификации.
2.3 Методы исследования липидов
2.3.1 Выделение липидов из растительного сырья
Для получения жирного масла использован метод исчерпывающей экстрак­
ции хлороформом в аппарате Сокслета, с последующим отгоном растворителя на
роторно-испарительной установке при вакууме 0,8 атм. и температуре 60 С (т.е.
в условиях, исключающих окисление липидов) [131].
2.3.2 Определение физико-химических показателей жирного масла
Органолептический анализ полученных образцов жирного масла осуществ­
ляли в соответствии с ОФС «Масла жирные» [25, 129].
Растворимость жирных масел в воде, эфире, хлороформе, спирте этиловом
определяли по методике, изложенной в статье «Растворимость» ГФ XII [23]. На­
личие парафина, воска, смоляных масел, перекисей, альдегидов, мыла в жирных
маслах анализировали по соответствующим методикам ГФ X [25]. Физические
показатели: плотность и показатель преломления изучали по методике ГФ XII
[23]. Химические показатели: кислотное число, число омыления, эфирное, перекисное и йодное числа определяли по методикам ГФ XII ч. 2 [24], неомыляемые
вещества по ГОСТ 5479-64 [20].
32
2.3.3 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
Разделение жирных кислот осуществляли методом ГЖХ в виде метиловых
эфиров в соответствии с ОФС «Газовая хроматография» ГФ XII изд. [24].
Предварительно липиды гидролизовали 10 %-ным раствором калия гидроксида в метаноле (1:5; 30 мин., 40° С). После охлаждения в реакционную смесь
добавляли дистиллированную воду и 10 % раствор кислоты серной до кислой
среды смеси. Выделившиеся жирные кислоты трижды экстрагировали диэтиловым эфиром. Эфирные вытяжки промывали водой до нейтральной реакции про­
мывных вод и сушили над сульфатом натрия, затем эфир отгоняли и жирные ки­
слоты переводили в метиловые эфиры свежеприготовленным диазометаном [36].
Состав жирных кислот определяли методом ГЖХ на приборе «Chrom 5» с
пламенно-ионизационным детектором. При этом использовали стальную колонку
длиной 2,5 м с внутренним диаметром - 4 мм, заполненную 15 % Reoplex-400 на
Inerton N-AW, при температуре колонки - 194° С и испарителя - 260 С. Расход
газа носителя азота - 30 мл/мин., водорода - 30 мл/мин.
Идентификацию жирных кислот проводили сравнением показаний времени
удерживания исследуемых кислот и смеси стандартных образцов.
2.3.4 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия
(ГХ-МС)
После гидролиза липидов (1,2 моль/л НС1; 1:5; 80° С; 1 час) проводили экс­
тракцию
гексаном,
высушивали
и
силировали
в
БСТФА
(N,0-6HC-
(триметилсилил)-трифторацетамид) для получения летучих производных спиртов,
оксикислот и стеролов.
Смесь эфиров вводили в инжектор ГХ-МС системы HP 5973 Agilent Tech­
nologies (USA). Для управления и обработки данных использовали штатные про­
граммы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капил­
лярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms. Длина колонки 25
м, внутренний диаметр 0,25 мм. Режим анализа - программированный, скорость
нагрева термостата колонки - 5 град/мин в диапазоне 130-320° С. Массспектрометр - квадрупольный, с ионизацией электронами (70 эВ).
л
33
Идентификацию веществ в пробе проводили с использованием базы д а н н ы х
библиотеки спектров Wiley 275 и штатных программ.
2.4 Методы исследования белков, пептидов, аминокислот
2.4.1 Качественное обнаружение аминокислот
Качественное обнаружение аминокислот проводили в водных извлечениях с
помощью нингидриновой реакции и с биуретовым реактивом [23, 40], а
также
анализировали их состав с помощью бумажной хроматографии [140].
Хроматографический анализ проводили в соответствии с ОФС « Х р о м а т о ­
графия на бумаге» [24] на хроматографической бумаге «Filtrak» FN-12, в с и с т е м е
растворителей w-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:2) в сравнении со с т а н д а р т ­
ными образцами аминокислот в концентрации 0,1 % (ТУ 6-09-3147-83). Х р о м а т о граммы высушивали на воздухе, обрабатывали их 0,2 % спиртовым р а с т в о р о м
нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при 100-105° С в течение н е с к о л ь к и х
минут [63].
2.4.2 Выделение и очистка пептидного комплекса
Путем исчерпывающей экстракции гексаном (72 ч) в аппарате С о к с л е т а
обезжиривали сырье, после чего проводили экстракцию пептидов и б е л к о в (0,05
моль/л СНзСООЩ 1:4; 30° С; 3 часа). После удаления нерастворимой ч а с т и семян
путем центрифугирования при 6000 об/мин, супернатант нейтрализовали 1 моль/л
натрия гидроксидом и выдерживали при 5° С в течение 11 часов до полного осаж­
дения глобулинов, которые отделяли центрифугированием. Супернатант д и а л и з о вали и лиофильно высушивали.
Диализ проводили следующим образом: в целлофановый мешочек н а л и в а л и
50 мл супернатанта, помещали в диализатор, наполненный водой, и в т е ч е н и е 24
часов пропускали через диализатор медленный ток воды. К концу д и а л и з а в ме­
шочке выпадают солерастворимые белки, а в растворе остаются только в о д о р а с ­
творимые альбумины. Небелковые вещества удаляются во время диализа.
34
Сублимационную сушку проводили в лиофильной сушилке «ИНЕЙ-6» при
температуре -35° С в течение 3 часов. Метод высушивания водных растворов
биологических препаратов в замороженном состоянии под вакуумом позволяет
сохранить нативность белковых веществ, так как влага удаляется из заморожен­
ных препаратов путем сублимации льда, т.е. образованием пара, минуя жидкую
фазу, лишнее постоянно откачивается из колбы вакуумным насосом. Охлаждение
испарителя осуществляли жидким азотом.
2.4.3 Выделение аминокислот и определение
аминокислотного состава
Предварительно проводили кислотный гидролиз белков и пептидов (1:1000
и 1:4000 соответственно; 5,7 моль/л НС1; 105-110° С; 24 часа) до образования
аминокислот.
Гидролизат упаривали досуха, после чего растворяли в натриево-цитратном
буфере (рН 2,2).
Для определения аминокислот использовали аминокислотный анализатор
марки ААА-339 (Чехия), согласно ГОСТ 13496.21-87.
Качественный состав аминокислот определяли по времени удерживания. В
качестве внутреннего стандарта использовали стандартную смесь, состоящую из
18 аминокислот. Для количественной оценки определяли площади пиков иден­
тифицированных кислот.
2.4.4 Исследование пептидов методом электрофореза
Анализ проводили в соответствии с ОФС «Электрофорез» ГФ XII изд. [24]
на пластинках 15 % полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии 0,1 %
на­
трия додецил сульфата в системе Леммли [174]. Перед нанесением исследуемый
образец (0,5 мл) упаривали до сухого остатка и растворяли в 0,2 мл буфера. В од­
ну лунку наносили от 100 до 3000 мкг пептида. Процесс электрофореза начинали
при напряжении 200 В на гель до вхождения полосы бромфенолового синего в
разделяющий гель, после чего напряжение повышали до 350 В. Процесс электро­
фореза заканчивали, когда линия лидирующего красителя бромфенолого синего
& ч
I
35
достигала уровня 10 мм до конца геля. По окончании электрофореза пептиды в
геле фиксировали в течение 30 минут в 0,01 моль/л растворе натрия гидроксида,
содержащем 4 % формальдегида, либо в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты.
Фиксированные белки в геле окрашивали Кумасси R-250. Избыток красителя с
геля удаляли многократной промывкой 7 % раствором уксусной кислоты, содер­
жащей 2 % формалина.
2.4.5 Исследование пептидов методом ВЭЖХ
Анализ проводили в соответствии с ОФС «Высокоэффективная жидкостная
хроматография» (ВЭЖХ) ГФ XII изд. [24].
Эксклюзионная хроматография: проводилась на приборе Agilent Technolo­
gist 1100 серии с использованием дегазатора G 1322А, насоса для подачи раство­
рителей 13 ПА, автосамплера G 1313А, термостата колонки G1316A и диодноматричного детектора DAD G1315B, стальной колонки Zorbax GF-250 4,6x250 мм
с размером частиц сорбента 4 мкм; предколонки Zorbax diol 4,6x12,5 мм с разме­
ром частиц сорбента 5 мкм. Подвижная фаза: 0,1 моль/л натрий фосфатный буфер
рН 7, содержащий 0,1 моль/л раствор натрия хлорида. Образцы глиадина и глютенина перед анализом также разводили в рабочем буфере. Использовали ско­
рость потока 0,25 мл/мин, термостатирование при температуре 28° С и детектиро­
вание пиков при длине волны 210 нм.
2.5 Методы исследования эфирных масел
2.5.1 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)
Компонентный состав эфирного масла чернушки дамасской исследовали
методом газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе «Цвет-500» с
пламенно-ионизационным детектором. Пробу эфирного масла объёмом 0,1 мкл с
помощью микрошприца вводили в испаритель хроматографа и хроматографировали при следующих условиях: колонка длиной 2,0 м с внутренним диаметром 0,3
см, заполненная сорбентом 10 % Реоплекс 400 на инертоне Super, температурное
программирование колонки: от 60 (5 минут) до 190°С (10 минут) со скоростью на-
36
грева 5 град/мин, температура испарителя и детектора была 220° С, скорость газаносителя (азота) - 30 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, воздуха - ЗООмл/мин.
Идентификацию компонентов эфирного масла проводили путём сопостав­
ления времён удерживания компонентов пробы исследуемого эфирного масла с
временами удерживания стандартных образцов (Sigma). Хроматографирование
стандартных образцов проводили в аналогичных условиях. Количественное со­
держание компонентов определяли методом внутренней нормализации, для рас­
чета использовали площадь пиков.
2.6 Методы исследования ферментной активности
2.6.1 Определение липолитической
активности
Липолитическую активность определяли по методике предприятия [55].
Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, об­
разовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата
оливкового масла.
2.6.2 Определение протеолитической
активности
Для определения протеолитической активности предварительно получали
белковый экстракт. Навеску 50,0 г каждого образца измельчали и обезжиривали
гексаном в течение 72 часов в аппарате Сокслета. Белки экстрагировали из обез­
жиренных семян 200 мл 0,05 М раствором уксусной кислоты в течение 3 часов
при температуре 30° С. После удаления нерастворимой части семян путем цен­
трифугирования при 6000 об/мин, супернатант нейтрализовали 1 н натрия гидроксидом и выдерживали при 5° С в течение 11 часов до полного осаждения глобу­
линов, которые отделяли центрифугированием. Супернатант диализовали и лиофильно высушивали. Сублимационную сушку проводили в лиофильной сушилке
«ИНЕЙ-6» при температуре -35° С в течение 3 часов.
Определение протеолитической активности сырья проводили по модифици­
рованной методике [18]. Использовали 3 пробирки (одна контрольная, две опыт­
ные). В опытные пробирки наливали по 2 мл субстрата (казеин по Гамместену - 2
37
% раствор на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4) и помещали в термостат при тем­
пературе 37° С. Через 10 мин в каждую пробирку приливали по 2 мл раствора ис­
следуемых белков (4 мг/мл), пробирки встряхивали и оставляли в термостате на
10 мин (37 С). Затем в обе пробирки прибавляли по 4 мл трихлоруксусной кисло­
ты (ТХУ 10 %), чтобы прервать ферментативную реакцию, осадить белок и высо­
комолекулярные продукты гидролиза, быстро перемешивали смесь и выдержива­
ли в течение 20 мин при 0° С. Смесь фильтровали в сухие пробирки (фильтрат
должен быть прозрачным). К 1 мл фильтрата прибавляли 5 мл раствора натрия
карбоната (концентрация 0,5 моль/л), перемешивали и быстро приливали по 1 мл
рабочего раствора реактива Фолина (разбавляли 1:3). Выдерживали в пробирке 20
мин и измеряли на спектрофотометре СФ-46, при аналитической длине волны 660
нм.
Контрольный опыт готовили, прибавляя реактивы в обратной последова­
тельности. Через 20 мин смесь фильтровали, к 1 мл фильтрата прибавляли 5 мл
натрия карбоната и 1 мл рабочего раствора Фолина, выдерживали 20 мин. Тирозиновый эквивалент определяли по градуировочному графику (1,5 мл/мкмоль).
Расчеты протеолитической активности проводили по известной формуле.
2.7 Методы исследования макро- и микроэлементного состава
Качественное и количественное содержание макро- и микроэлементов в зо­
ле, полученной из растительного сырья, проводили в Центральной испытательной
лаборатории при ФГУП «Кавказгеолсъемка» методом полуколичественного спек­
трального анализа минерального сырья с использованием СО [19]. Образцы сырья
измельчали и подвергали озолению в муфельной печи при температуре 450500° С. Для получения спектра использовали спектрограф ДФС-8-1. Фотометрирование спектрограмм проводили с помощью атласа спектральных линий и спек­
тров-стандартов [137]. Метод основан на полном испарении аналитической на­
вески из кратера угольного электрода в плазме электрической дуги переменного
тока.
38
2.8 Общие методики стандартизации сырья
2.8.1 Методы отбора проб для анализа
Отбор проб для товароведческого анализа сырья исследуемых видов прово­
дили в соответствии с ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного расти­
тельного сырья и методы отбора проб» [81].
2.8.2 Морфолого-анатомические
исследования
Макроскопический анализ образцов сырья проводили по методикам ГФ XI
для морфологической группы «Плоды, семена» [26]. Микроскопический анализ
проводили на свежем, фиксированном (смесь спирта и глицерина) и высушенном
растительном материале.
Препараты для микроскопического исследования готовили согласно статье
ГФ XI изд. [26]. Микропрепараты изучали с помощью микроскопа «Биолам».
Микрофотографии были получены с помощью микроскопа «DM-111» фирмы
«Motic» со встроенной цифровой камерой при увеличениях 40х, 100х, 400х, ЮООх
с разрешением 640x480 пикселей. Фотоснимки обрабатывали на компьютере с
помощью программы «Adobe Photoshop CS» и «CorelDRAWХЗ».
2.8.3 Определение числовых показателей качества сырья
Определение числовых показателей (влажности, золы общей, золы нерас­
творимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, содержания экстрактив­
ных веществ, примесей) проводили по методикам ГФ XI и ГФ XII [23, 24, 75].
2.8.4 Определение микробиологической чистоты сырья
Контроль качества ЛРС на микробиологическую чистоту проводили соглас­
но статье ГФ XII «Методы микробиологического контроля лекарственных
средств» [23].
2.8.5 Определение содержания радионуклидов
Подготовка счетных образцов сырья осуществлялась в соответствии с «Ме­
тодическими рекомендациями по санитарному контролю за содержанием радио-
39
активных веществ в объектах внешней среды» и ОФС 42-0011-03 «Определение
содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье. Стронций-90,
цезий-137. Отбор проб, анализ, оценка результатов».
Выделение стронция-90 проводилось радиохимическим методом с даль­
нейшим измерением активности на установке РУБ-ОШ1. Измерение радионуклидного состава проб проводилось на полупроводниковом гамма-спектрометре на
основе IBM РС-3 86 [80].
2.8.6 Определение сроков хранения сырья
Срок годности сырья определяли на образцах, хранившихся в сухом, хоро­
шо проветриваемом помещении, в защищенном от прямых солнечных лучей мес­
те, в бумажных мешках по ГОСТ 17768-90 в условиях лаборатории.
В образцах каждые полгода определялось содержание БАС. Определение
числовых показателей проводили по методикам ГФ XI [26] и ГФ XII [23, 24] в
высушенном растительном материале в 6 повторениях.
2.8.7 Статистическая обработка данных
Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований
проводилась по методике ГФ XII [24]. Результаты считали достоверно значимыми
при наблюдении эффекта в 95 % случаев (Р<0,05), анатомо-морфологических - по
общепринятым методикам [34]. Расчеты проводили с помощью программы Micro­
soft Office Excel.
2.8.8 Валидация методик количественного
определения
Валидационная оценка разработанных методик количественного определе­
ния БАС в некоторых видах сырья, на которые разрабатывали проекты НД, про­
водилась в соответствии с требованиями ОФС «Валидация аналитических мето­
дик» ГФ XII [24, 104].
40
2.9 Методы токсико-фармакологических исследований
Изучение острой токсичности проведено на белых беспородных мышахсамцах весом 25,0-30,0 г, гепатозащитной, желчегонной, гиполипидемической ак­
тивности, мочегонного и ранозаживляющего действия на белых крысах-самцах
линии «Wistar» весом 210,0-230,0 г. Животные получены из питомника Пятигор­
ской ГФА, прошли двухнедельный карантин и содержались в стандартных усло­
виях вивария при естественном освещении.
Во время эксперимента животные содержались в контролируемых услови­
ях: температура окружающего воздуха 22±2 С, относительная влажность 65±5 %.
Для размещения животных применялись макролоновые клетки Т-2 (для мышей),
Т-3 (для крыс) оборудованные стальными решетчатыми крышками, с кормовым
углублением. В качестве подстилочного материала применяли контактные автоклавированные древесные опилки нехвойных пород древесины. Кормление вы­
полнялось в фиксированное время. Вода водопроводная подавалась в стандарт­
ных питьевых бутылочках (250 мл).
Подстилки, клетки и аксессуары, поилки для питья, менялись еженедельно,
мылись и дезинфицировались. В помещениях содержания животных проводилась
ежедневная влажная уборка с дезсредствами, ежемесячно - полная санобработка
[21,92].
2.9.1 Исследование «острой» токсичности
Опыты по изучению «острой» токсичности проводились по методу Кербера
[106,115].
Острая токсичность была изучена на белых мышах-самцах весом 25-30 г,
прошедших карантин в течение 10 дней. Подопытные группы животных получали
исследуемые субстанции в различных дозах. Контрольные группы животных по­
лучали эквиобъемное количество растворителя.
Наблюдение за опытными животными проводилось в течение 2-х недель, в
первый день непрерывно. Фиксировалось общее состояние животных, особенно­
сти их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и
41
характер судорог, координация движений, реакция на тактильные, болевые, зву­
ковые и световые раздражители, частота и глубина дыхательных движений, со­
стояние волосяного и кожного покрова, консистенция фекальных масс, потребле­
ние корма и воды.
Расчет LD5o производится с использованием пробит-анализа по методу Про­
зоровского.
Для статистической обработки результатов использовали пакет программ
«Stat Plus 2009».
2.9.2 Изучение антибактериальной
активности
Исследование проводили с настоями, отварами и эфирными маслами из
изучаемых растений. Антибактериальную активность устанавливали в отношении
стандартного набора индикаторных штаммов микроорганизмов методом культи­
вирования микробов на среде с добавлением фитосубстанции в сравнении с кон­
тролем в соответствии с ГФ XII издания [23].
Из исследуемых субстанций готовили различные разведения в стерильном
расплавленном и остуженном до 50° С питательном агаре. Содержимое после пе­
ремешивания заливали в стерильные чашки Петри и оставляли при комнатной
температуре, после застывания агара чашки делили на секторы. Каждый сектор
засевали штриховым методом взвесью суточных культур, содержащей 100 млн.
микробных тел в 1 мл, в количестве одной бактериальной петли. Контролем явля­
лись посевы тех же бактерий на питательные среды, не содержащие испытуемых
препаратов. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37 С. Резуль­
таты эксперимента учитывали через 24 и 48 часов (для грибов рода Candida). При
этом регистрировали интенсивность роста колоний микроорганизмов (сильный
рост, слабый рост) или его отсутствие. Антибактериальную активность выражали
в мкг/мл в пересчете на действующие вещества и воздушно-сухое сырье, из кото­
рого приготовлено извлечение.
42
2.9.3 Изучение ранозаживляющей
активности
Ожоги моделировались на крысах-самцах. Шерсть у животных на месте на­
несения ожога (область спины) выстригали, а остатки шерстяного покрова удаля­
ли смачиванием выстриженной области 15 % раствором сернистого натрия. Через
2 минуты после нанесения раствора сернистого натрия, депилированный участок
промывали теплой проточной водой и высушивали марлевой салфеткой. Во время
нанесения ожога животные находились под наркозом, вызванным введением этаминала в дозе 40 мг/кг. Ожог получали при помощи стеклянного цилиндра с пло­
ским дном (диаметр 10 мм), заполненного кипящей водой (100° С). Время экспо­
зиции составляло 15 секунд.
Через 1 час после температурного воздействия на поврежденный участок
кожи наносили раствор исследуемой субстанции. В качестве препарата сравнения
использовалось заводское облепиховое масло с содержанием каротиноидов 50
мг%. В эксперименте также были выделены группы животных, ожоги которых
обрабатывались очищенным подсолнечным маслом, которое использовалось в ка­
честве основы для получения раствора облепихового масла. Также имелась кон­
трольная группа животных, ожоги которой не обрабатывались ничем. Изучаемые
вещества наносились на ожоговую поверхность при помощи ватного тампона без
наложения повязки один раз в день в течение всего срока наблюдения.
О темпах заживления раневых поверхностей судили по динамике изменения
весовых показателей ожогов, которые получали путем снятия выкроек ожога на
плотную пленку с последующим их взвешиванием на весах (мг).
2.9.4 Изучение гиполипидемической
активности
Изучение гиполипидемического действия проводили в соответствии с мето­
дическими указаниями фармакологического комитета по изучению гиполипиде­
мического и антиатеросклеротического действия фармакологических веществ
[105].
С целью скрининга гиполипидемической активности исследуемых субстан­
ций использовали твиновую модель гиперлипидемии: однократное внутрибрю")
4
43
шинное введение твина-80 в дозе 250 мг /100 г массы тела. Исследуемые вещества
вводили опытным группам крыс перорально в течение 10 дней до введения тви­
на-80. Предварительное введение было направлено на насыщение действующими
веществами ряда органов и тканей, связанных с метаболизмом липидов, что ши­
роко используется в случаях однократного применения агента, индуцирующего
развитие гиперлипидемии [105]. На 10-й день животным внутрибрюшинно вводи­
ли твин-80 и через 12 часов осуществляли забой путем декапитации. Контрольной
группе животных вводили в течение такого же срока дистиллированную воду, ко­
торая используется для приготовления суспензии веществ, на 10-й день - внутри­
брюшинно - твин-80 и через 12 часов осуществляли забой. Перед забоем живот­
ные голодали в течение 12 часов.
В сыворотке крови определяли содержание общего холестерина, триглицеридов и Р- и пре-(3-липопротеидов.
2.9.5 Изучение гепатозащитной
активности
Оценка гепатозащитной активности различных субстанций проведена на
модели острого ССЦ-гепатоза при их лечебно-профилактическом введении. Суб­
станции начинали вводить перорально за 7 дней до введения CCI4, а затем совме­
стно с CCI4. Животные получали вещества утром в одно и то же время, до корм­
ления. В случае совместного введения веществ и ССЦ их вводили за 1 час до вве­
дения гепатотоксина. Контролем служили животные, получавшие такой же объем
растворителя. Забой животных проводили путем декапитации через сутки после
последнего введения ССЦ. Одновременно проводили забой интактных животных,
голодавших в течение 12-14 часов. Модель острого ССЦ-гепатоза воспроизводи­
ли путем введения per os с помощью зонда 3 раза через день 50% масляного рас­
твора ССЦ в вазелиновом масле в дозе 0,15 мл/100 г массы тела [17].
44
2.9.6 Изучение желчегонной активности
Оценку желчевыделительной функций печени проводили через сутки после
10-дневного введения субстанций здоровым животным. В качестве контроля ис­
пользовали животных, получавших 10 дней растворитель. Определение скорости
секреции желчи проводили по методу М.Д. Литвинчук и З.И. Новосилец [56].
Подопытных крыс наркотизировали при помощи этаминала (40 мг/кг). После ее
фиксации на операционном столике проводили вскрытие брюшной полости раз­
резом в эпигастральной области длиной 1,5- 2,0 см. Находили двенадцатиперст­
ную кишку и место вхождения в нее желчного протока. Выше этого места 12типерстную кишку перевязывали, а вторую перевязку делали ниже впадения
желчного протока в кишечник. В образовавшийся замкнутый мешочек, куда впа­
дал желчный проток, вставляли трубку-канюлю и собирали желчь в мерную про­
бирку в течение 3-х часов. Регистрировали объем выделившейся желчи в целом за
3 часа. Для сохранения эвакуаторной функции желудочно-кишечного тракта с
помощью эластичной трубки между проксимальной и дистальной частью кишеч­
ника накладывали анастомоз. Желчевыделительную функцию оценивали по объ­
ему желчи в мл за 3 часа.
2.9.7Изучение диуретической активности
Изучение влияния на мочеобразовательную функцию проводили на здоро­
вых животных в условиях 2,5 % водной нагрузки. Исследуемые субстанции вво­
дили перорально один раз в сутки в течение 6 дней. Через 1 час после последнего
введения животные получали водную нагрузку и помещались в пеналы для сбора
мочи. Оценивали количество мочи, собранной от одного животного за 2 часа в
мл/200 грамм массы тела.
2.9.8 Оценка биохимического профиля сыворотки крови
лабораторных животных
Определение вторичных продуктов перекисного окисления липидов прово­
дили по реакции с тиобарбитуровой кислотой с использованием диагностического
набора «Агат-Мед».
45
Принцип метода основан на том, что продукты перекисного окисления липидов в присутствии ортофосфосфата образуют с тиобарбитуровой кислотой ок­
рашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом, интенсивность которого, изме­
ряемая на СФ-2000 при длинах волн 535 и 570 нм, пропорциональна концентра­
ции МДА [188]. Для расчета использовали коэффициент молярной экстинции
МДА - 1,56х105М' см"'. Результаты выражали в мкмоль МДА /л.
Определение /?- и пре- /? липопротеидое сыворотки крови проводили турбидиметрически по Бурштейну и Самай [126], остальные показатели сыворотки кро­
ви определяли на автоматическом биохимическом анализаторе BS-120 (Mindray) с
использованием стандартных жидких реактивов фирмы Diasis (Германия).
Для определения содержания общего и прямого билирубина в сыворотке
крови использовали фотометрический тест с использованием стандартного набора
реактивов «DiaSys».
Принцип определения: в кислой среде в присутствии диазотированного 2,4дихлоранилина билирубин образует азосоединение красного цвета. Специфиче­
ская смесь детергентов делает возможным надежное и точное определение обще­
го и прямого билирубина. Содержание общего и прямого билирубина выражали в
мкмолях на 1 л сыворотки. Содержание непрямого билирубина определяли рас­
чётным методом.
Количество холестерина в сыворотке крови (ммоль/л) измеряли фермента­
тивным фотометрическим тестом CHODPAP с использованием стандартного на­
бора реактивов «DiaSys».
При гидролизе эфиров холестерина холестеринэстеразой образуется сво­
бодный холестерин. Образовавшийся в результате гидролиза и имеющийся в про­
бе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксидазы с образованием эквимолярных количеств перекиси водорода. Под действием
пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием
окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорцио­
нальна концентрации холестерина в пробе и измеряется фотометрически.
46
Содержание триглщеридов (ТРГ) определяли
ферментативным колори­
метрическим методом с использованием стандартного набора реактивов «DiaSys»
и выражали в ммоль/л.
Принцип метода основан на катализе липазой реакции гидролиза ТРГ с об­
разованием жирных кислот и эквимолярного количества глицерина. Глицерин при
наличии АТФ, гексокиназы и глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом
воздуха с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в при­
сутствии хлорфенола с образованием окрашенного продукта, интенсивность ок­
раски которого прямо пропорциональна концентрации ТРГ в пробе и измеряется
фотометрически.
Активность АлАт в сыворотке крови определяли методом оптимизирован­
ного УФ теста в соответствии с реакциями IFCC (Международная Федерация
Клинической Химии и Лабораторной Медицины). Использовали стандартный на­
бор реактивов «DiaSys».
Принцип определения:
L-Алании +2 Оксоглутарат ^ А Л Т L- Глутамат+Пируват
Пируват+ НАДН+Н+ ^АЛТ°-Лактат+ НАД*
По убыли НАДН в среде инкубации судили об активности АлАт. Актив­
ность фермента выражали в Е/л.
Активность ЩФ в сыворотке крови определяли кинетическим, оптимизи­
рованным, стандартным методом в соответствии с рекомендациями DGKC (Гер­
манское Общество Клинической Химии). Использовался стандартный набор реак­
тивов «DiaSys». Мерой каталитической концентрации фермента являлось количе­
ство освобождённого 4-нитрофенола, который определяли фотометрически мето­
дом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором
ЩФ. Активность фермента выражали в Е/л.
47
2.9.9 Определение биохимических показателей е гомогенате печени
лабораторных животных
Определение содержания ТБК-активных продуктов в гомогенате печени.
Для определения ТБК-активных продуктов в печени крыс за основу был взят ме­
тод Ohkawa и соавт. [176], разработанный для гомогенатов ткани и других биоло­
гических образцов. Гомогенат печени готовили на 0,85 % растворе NaCl в соот­
ношении 1:8 или на 100 мМ трис-HCl буфере в соотношении 1:7. Метод основан
на превращении гидроперекисей ПОЛ в малоновый диальдегид и окрашивании
последнего с тиобарбитуровой кислотой. Спектры окрашенных бутанольных экс­
трактов измеряли на СФ-46. Расчет производили по разности экстинкций при 535
нм и 520 нм, используя коэффициент молярной экстинции МДА -1,56х105М"1см"1.
Результаты выражали в нмоль на 1 мг белка в реакционной смеси. Белок опреде­
ляли по методу Лоури в модификации Миллера [175].
Определение содержания ТРГ в печени. Количество триглицеридов в гомо­
генате печени (мкмоль/г) измеряли по Gottfrieds S.P., Rosenberg В. в модификации
Сентебовой [113]. Стандартный раствор триолеина для определения содержания
ТРГ содержал 80% воды для устранения ошибки экстрагирования [113]. Гомоге­
нат печени готовили на 0,85 % растворе NaCl в соотношении 1:8 или на 100 мМ
трис-HCl буфере, рН 7,4 в соотношении 1:7.
48
ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКИЕ И С С Л Е Д О В А Н И Я
СЕМЯН ЧЕРНУШКИ ДАМАССКОЙ
Важным этапом определения подлинности растительного сырья я в л я е т с я
установление морфолого-анатомических признаков с использованием
метода
микроскопии и включением в НД микрофотографий диагностически з н а ч и м ы х
признаков [89, 90, 91, 108].
Ввиду того, что в медицинской практике используются семена д в у х видов
чернушки: посевной и дамасской, целью данного фрагмента работы я в и л о с ь срав­
нительное морфолого-анатомическое изучение образцов семян обоих в и д о в , соб­
ранных от культивируемых растений в различных регионах страны и з а р у б е ж ь я ,
для установления диагностических признаков.
Имеющиеся в научной литературе данные по этому вопросу, в ч а с т н о с т и
строение семян чернушки дамасской имеют фрагментарный, подчас в з а и м о и с ­
ключающий характер, поэтому требуют уточнений.
Анализ проводили в соответствии с методиками, указанными в
разделе
2.8.2.
Объектами исследования явились образцы: семена чернушки п о с е в н о й Semina Nigellae sativae (страна произрастания: Россия (Дагестан), Украина, Узбе­
кистан, Индия, Турция, Марокко в период с 2004 по 2010 гг.); семена ч е р н у ш к и
дамасской - Semina Nigellae damascenae (Украина, Россия (Ставропольский край),
Марокко в период с 2006 по 2010 гг.).
3.1 Морфологическая характеристика семян чернушки д а м а с с к о й
Цельное сырье. Семена яйцевидной формы, сплюснутые, трех- р е ж е четы­
рехгранные, заостренные с одной стороны. Поверхность семян голая, с л е г к а по­
перечно-морщинистая, между гранями зернистая, матовая. Семенной р у б ч и к сла­
бо заметен. Кожура семени твердая, плотно прилегающая к зародышу, э н д о с п е р м
плохо развит, зародыш состоит из двух семядолей и занимает почти в с е семя.
Длина - 2-3 мм, ширина до 1 мм, толщина в средней части 1,5-2 мм ( Р и с у н о к 8).
49
Цвет черный, запах своеобразный, вкус семени, очищенной от деревянистой час­
ти кожуры, слизистый, вкус водного извлечения - пряный, жгучий. Вес 100 семян
- 0,26±0,02 г.
Порошок. Черного цвета, проходящий сквозь сито с отверстиями диаметром
0,5 мм. Запах сильный, ароматный. Вкус горьковато-пряный.
Следует отметить, что перечисленные выше морфологические признаки ха­
рактерны для образцов семян чернушки обоих видов.
Рисунок 8 — Внешний вид семян чернушки дамасской
3.2 Анатомическая характеристика семян чернушки дамасской
Цельное сырье. На поперечном срезе семян видна трехслойная семенная
кожура в виде темно-бурой полосы, эндосперм и зародыш (Рисунок 9).
При большом увеличении различаются слои семенной кожуры (Рисунок
10). Первый слой - однослойный эпидермис. Эпидермис состоит из крупных,
плотно сомкнутых, радиально вытянутых клеток с
стенками. Клетки эпидермиса слабоизвилистые,
равномерно-утолщенными
прямоугольные клетки череду­
ются с клетками треугольной формы. В местах расположения морщинок клетки
эпидермиса имеют коническую форму к вершине оттянутые в сосочек (Рисунок
11).
Второй слой - бесструктурный, расположенный под эпидермисом, состоит
из тонкостенных паренхимных бесцветных палисадоподобных спавшихся клеток.
50
Рисунок 9 - Схема анатомо-гистологического строения
семени чернушки дамасской на поперечном срезе:
1 - семенная кожура, 2 - эндосперм, 3 - зародыш
Рисунок 10 - Микрофотография фрагмента
поперечного среза семени (увел. х250):
А — чернушки дамасской, Б — чернушки посевной;
1 — эпидермис, 2 - бесструктурный слой, 3 - пигментный слой,
4 - внутренний эпидермис кожуры семени, 5 - клетки паренхимы
51
Рисунок 11 — Микрофотография фрагмента поперечного среза семенной
кожуры в местах расположения морщинок (увел. хЮО):
1 - клетки эпидермиса конической формы
Третий слой - пигментный, состоит из тангентально вытянутых клеток,
имеющих неравномерные утолщения и содержащих коричневый пигмент. Тол­
щина слоя составляет 2-4 ряда по периметру семян, в области морщинок расши­
ряется до 6 рядов (Рисунок 12).
В молодых семенах между семенной кожурой и зародышем имеется хорошо
выраженный эндосперм. В процессе развития семени эндосперм уменьшается и
уже представлен в виде одного слоя из небольших тангентально вытянутых кле­
ток.
Клетки эндосперма многоугольные, тонкостенные, содержат алейроновые
зерна и капли жирного и эфирного масел (Рисунок 13). Реакция с раствором Су­
дан III положительная, с раствором Люголя отрицательная.
Зародыш состоит из двух семядолей с корешком (Рисунок 14).
Микроскопических отличий семян чернушки дамасской и посевной не вы­
явлено.
52
Рисунок 12 - Микрофотография поперечного среза семени (увел. х40):
А - чернушки дамасской, Б - чернушки посевной, 1 - пигментный слой
53
Рисунок 13 - Микрофотография фрагмента поперечного среза семени
(увел, х 100):
1 — эпидермис, 2 - пигментный слой,
3 - клетки паренхимы, окрашенные реактивом Судан III
Рисунок 14 - Микрофотографии поперечного среза семян через зародыш
(увел. х40):
1 - в районе почечки, 2 - в районе корешка
54
Порошок. При рассмотрении препаратов порошка под микроскопом видны:
обрывки семенной кожуры, эпидермис, которой состоит из тонкостенных полиго­
нальных клеток, светло-коричневые клетки пигментного слоя,
паренхимные
клетки с каплями жирного масла (Рисунок 15).
В ходе исследовательской работы было выявлено, что диагностика сырья не
вызывает затруднений во фракциях 0,5-1,0 и 0,31-0,5 мм. С увеличением измельченности сырья в порошке становится больше диагностически малозначимых
частиц (фрагментов семенной кожуры в продольном и поперечном сечениях, не­
больших групп и отдельных паренхимных клеток). Поэтому диагностика в более
мелких фракциях затрудняется.
Рисунок 15 — Микрофотография порошка семени чернушки (увел. х 4 0 ) :
1,2- обрывки семенной кожуры; 3 - клетки эндосперма;
4 - крахмальные зерна, 5 - капли жирного масла,
6 - клетки паренхимы с крахмальными зернами и жирным маслом
55
Гистохимические реакции. Поперечный срез
семени чернушки помеща­
ют в раствор Судана III, накрывают покровным стеклом и нагревают. Капли жир­
ного и эфирного масла окрашиваются в оранжево-желтый цвет (жирные и эфир­
ные масла).
Для отличия эфирных масел от жирных временные препараты окрашивали
водным раствором метиленового синего. Через несколько минут их рассматрива­
ли в воде или глицерине. Эфирное масло окрашивалось в синий цвет.
При микровозгонке порошка наблюдается образование красного налета на
стенках пробирки, который при прибавлении 5 % раствора натрия гидроксида
приобретал синее окрашивание (хиноны).
Таким образом, в результате проведенных исследований в качестве диагно­
стических элементов можно выделить трехслойное строение семенной кожуры,
строение эпидермиса, наличие пигментного слоя, а также клеток эндосперма с
жирным, эфирным маслом и алейроновыми зернами.
Выявленные морфолого-анатомические признаки сырья «Чернушки семе­
на» позволяют подтвердить его подлинность независимо от региона заготовки для
включения в разделы фармакопейной статьи «Чернушки семена» («Внешние при­
знаки», «Микроскопия») ГФ XII издания [77].
56
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3
1. В результате исследований уточнены микроскопические диагностические
признаки семян чернушки дамасской и впервые определены для семян чер­
нушки посевной.
2. Диагностическими признаками семян чернушки посевной и дамасской яв­
ляются трехслойное строение семенной кожуры, строение эпидермиса, пиг­
ментный слой, а также клетки эндосперма с жирным, эфирным маслом и
алейроновыми зернами.
3. Выявленные морфолого-анатомические признаки сырья «Чернушки семе­
на» позволяют подтвердить его подлинность независимо от региона заго­
товки и могут быть включены в разделы фармакопейной статьи «Чернушки
семена» («Внешние признаки», «Микроскопия») для ГФ XII издания.
57
ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
4.1 Исследование углеводов
Углеводы являются одним из наиболее распространенных классов химиче­
ских соединений, встречающихся практически во всех растениях. Представления
о биологической роли углеводов претерпели в последние годы значительную
трансформацию от положения о том, что основная роль углеводов связана с их
использованием в качестве энергетического субстрата («клеточного топлива»), до
современной точки зрения на существенно более широкие физиологические
функции углеводов.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что лекарственные
растения, содержащие углеводы, могут использоваться как в качестве лекарст­
венных средств, так и биологически активных добавок к пище [66]. При этом сле­
дует отметить низкую токсичность как лекарственных растений, содержащих уг­
леводы, так и выделенных из них полисахаридных комплексов, и широкий спектр
фармакологической активности. В частности, многочисленными исследованиями
было установлено наличие у полисахаридов выраженных антигипоксического,
отхаркивающего, противовоспалительного, иммунотропного, энтеросорбирующего, гепатопротекторного, гиполипидемического, противоопухолевого, общеукре­
пляющего эффектов [46, 52, 71, 86, 122].
В связи с этим задачей нашего исследования явилось изучение состава и со­
держания углеводов.
Анализ проводили в соответствии с методиками, указанными в разделе 2.2.
4.1.1 Выделение полисахаридов
Углеводы разделяли по методике, описанной в разделе 2.2.3, в результате
чего выделены углеводные фракции:
> растворимые в холодной воде углеводы (ВРПС-Х);
> растворимые в горячей воде углеводы (ВРПС-Г);
> кислые углеводы (ПВ);
58
> щелочные углеводы (ГЦ).
Результаты количественного определения различных фракций полисахари­
дов представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Физические свойства и технологические выходы углеводных
фракций, выделенных из семян чернушки дамасской
Фракции
Технологические
выходы,
% к сырью
ВРПС-Х
0,37-0,57
ВРПС-Г
0,37-0,55
пв
0,38-0,52
ГЦ
2,97-3,37
Физические свойства фракций
Порошок серого цвета. Растворим в воде,
образуя коллоидный раствор, минеральных
кислотах, щелочах, нерастворим в органи­
ческих растворителях
Порошок серого цвета. Растворим в воде,
образуя коллоидный раствор, минеральных
кислотах, щелочах, нерастворим в органи­
ческих растворителях
Аморфный порошок светло-серого цвета.
Растворим в горячей воде, образуя вязкий
раствор, нерастворим в органических рас­
творителях
Порошок коричневого цвета. Растворим в
щелочах, нерастворим в воде.
Водный раствор полисахаридов с йодом дает положительную реакцию, это
позволяет предположить присутствие полисахаридов глюканового типа. Грави­
метрический анализ свидетельствует о преобладании гемицеллюлоз.
4.1.2 Изучение химического состава углеводных фракций
4.1.2.1 Групповые качественные реакции на углеводы
Для установления наличия отдельных групп углеводов использованы уни­
версальные реакции, подтверждающие присутствие углеводов, в том числе крах­
мала, полиуронидов, а также восстанавливающих Сахаров. Для обнаружения по­
лисахаридов применены реакции осаждения спиртом этиловым 96 % [123], ацето­
ном [70]; восстанавливающих Сахаров (после предварительного кислотного гид­
ролиза полисахаридов) - с реактивом Фелинга [26], кислотой пикриновой в ще-
59
лочной среде [85]; крахмала - с раствором йода [139]; галактуронидов — со спир­
товым раствором карбазола в сернокислой среде [33].
Результаты качественного анализа углеводов в выделенных из различных
растительных объектов фракциях приведены в таблице 2.
Во всех углеводных фракциях, выделенных из семян чернушки дамасской,
идентифицированы полисахариды и восстанавливающие сахара. Во всех фракци­
ях обнаружены галактурониды, за исключением гемицеллюлозной, крахмал - в
водорастворимых и кислых фракциях.
4.1.2.2 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом хро­
матографии на бумаге
Углеводные фракции после кислотного гидролиза, проведенного, как опи­
сано в разделе 2.2.4, были подвергнуты хроматографированию на бумаге {раздел
2.2.5).
По появлению на хроматограммах красных и красно-коричневых пятен с
соответствующими величинами подвижности веществ (Rf) оценивали углеводный
состав фракций. Во всех фракциях полисахаридов идентифицированы: галактоза,
глюкоза, арабиноза, ксилоза.
Основным углеводом в водорастворимых фракциях является глюкоза, ара­
биноза, галактоза, в кислых фракциях - арабиноза и глюкоза, в гемицеллюлозных
фракциях - ксилоза.
60
Таблица 2-Результаты качественного анализа углеводных фракций с помощью групповых реакций
Группа
углеводов
Поли­
сахариды
Восста­
навли­
вающие
сахара
Методы анализа
реакция осаждения
спиртом этиловым 96 %
реакция осаждения
ацетоном
окислительновосстановительная реакция
с реактивом Фелинга
окислительновосстановительная реакция
окрашивания с кислотой
пикриновой в щелочной
среде, метод спектрофотометрии
Ожидаемый
результат
осадок
белого цвета
осадок
белого цвета
осадок
красно-коричневого
цвета
раствор
оранжевого цвета,
максимум светопоглощения
при 460 нм
Углеводные фракции
ВРПС-Х
ВРПС-Г
ПВ
ГЦ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Крахмал
реакция окрашивания
с йодом
раствор
синего цвета
+
+
+
—
Урониды
реакция взаимодействия с
карбазолом в сернокислой
среде, метод спектрофотометрии
раствор краснофиолетового цвета,
максимум светопоглощения
при 530 нм
+
+
+
—
Заключение
во всех фракциях
установлено наличие
полисахаридов
во всех фракциях
установлено наличие
восстанавливающих
Сахаров
в водорастворимых и
кислых фракциях уста­
новлено наличие
крахмала
в водорастворимых и
кислой фракциях уста­
новлено наличие
галактуронидов
Примечание: «+» - положительный результат реакции; «—» - отрицательный результат реакции; ВРПС-Х - растворимые в холодной
воде углеводы; ВРПС-Г - растворимые в горячей воде углеводы; ПВ - пектиновые вещества; ГЦ - гемицеллюлозы
4.1.2.3 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом
газожидкостной хроматографии (ГЖХ)
Затем моносахариды были подвергнуты анализу методом ГЖХ в виде
альдонитрилов {раздел 2.2.6).
Результаты хроматографического анализа моносахаридного состава
углеводных фракций приведены в таблице 3.
Таблица 3 - Содержание и моносахаридный состав полисахаридов
Фракции
углеводов
ВРПС-Х
ВРПС-Г
пв
ГЦ
Rha
ел.
ел.
ел.
6,14
Соотношение моносахаридных
Man
Ага
Xyl
—
3,56
17,48
—
6,14
43,87
—
10,5
21,87
43,87
31,1
2,45
остатков
Glc
Gal
34,8
32,5
6,11
31,0
ел.
25,82
+
ел.
В семенах Nigella damascena преобладает гемицеллюлоза, преимущест­
венно состоящая из ксилозы и маннозы, в водорастворимых фракциях преоб­
ладающими являются арабиноза, глюкоза и галактоза, при этом ВРПС-Х
представляют собой глюкогалактаны, а ВРПС-Г - арабиногалактаны (Табли­
ца 3).
В гидролизате ПВ наряду с нейтральными моносахаридами, БХ была
идентифицирована уроновая кислота.
Накопление указанных компонентов, особенно глюкозы, галактозы,
арабинозы, предопределяет перспективность фармацевтического использо­
вания соответствующих фракций углеводов.
4.1.2.4 Изучение углеводных фракций методом ИК-спектроскопии
ИК-спектры представляют важную информацию о составе и структуре
веществ. ИК-спектроскопию применяют, прежде всего, для функционального
анализа соединений: характеристики функциональных групп и их взаимного
расположения [139].
Из предварительных исследований установлено, что фракция раство­
римых в горячей воде углеводов содержит уроновые кислоты, сохранность
62
которых необходимо было подтвердить методом ИК-спектроскопии (раздел
2.2.7). В связи с этим, объектом ИК-спектроскопического анализа явилась
данная фракция наряду с кислыми и щелочными углеводами.
ИК-спектры различных углеводных фракций, выделенных из иссле­
дуемых растительных объектов, приведены на рисунке 16.
Выявленные в ИК-спектрах характеристические полосы поглощения
приведены в таблице 4.
Таблица 4 - Характеристические полосы поглощения (см1) в ИКспектрах углеводных фракций семян чернушки дамасской
ВРПС-Г
3351
1606
1408
пв
3374
1651
1430
1326
1080
1100
ГЦ
3288
2963
1651
1532
1449
1399;
1328
1237
1074
Вероятностное
отнесение полос поглощения [132, 133, 134, 135]
v(OH, ассоциированные внутримолекуляр­
ными водородными связями)
v(CH)
Vas(COCr)
v(OCH3)
vs(COCr)
5(CCH) + 5(COH)
v(COO')
v(CO пиранозного цикла) + v(CO гликозидной связи) + v(CC связи)
В ИК-спектрах анализируемых углеводных фракций установлено нали­
чие остатков галактуроновых кислот в пиранозной форме в составе полиса­
харидов, находящихся в 4 С г а-конформации. Выявлено, что уроновые кисло­
ты, благодаря первичным и вторичным спиртовым гидроксилам, ассоцииро­
ваны внутримолекулярными водородными связями. Карбоксильные группы
преимущественно находятся в ионизированной форме и частично этерифицированы метанолом.
63
5.0
4000.0
3000
2000
1500
1000
500 см"
74
72
70
68
66
64
62
58
56
54
52
50
48
3374.21
46
44
42
40.0
4000.0
3000
^Р
4000.0
3000
533.66
2000
2000
1500
1500
1000
500 см"
1000
500 cm"1
Рисунок 16 - ИК-спектры полисахаридов семян чернушки дамасской:
1-ВРПС-Г;2-ПВ;3-Щ
64
4.1.2.5 Изучение физико-химических характеристик пектинов
Анализ проводили по методикам, указанным в разделе 2.2.9. Значимых
различий в физико-химических характеристиках пектинов в растворимой в
горячей воде и кислотной фракциях не установлено.
Пектины имеют кислую реакцию среды в пределахрНот 3,1 до 3,6, что
исключает раздражающее влияние на слизистую оболочку желудка при их
пероральном применении.
Титрометрическим методом определено содержание в ПВ чернушки
дамасской свободных (Кс) 10,2% и этерифицированных (Кэ) 3,4% карбок­
сильных групп соответственно. Степень этерификации (К) при этом состав­
ляет 25,0%. Следовательно, ПВ относятся к низкоэтерифицированным пек­
тиновым веществам.
Количественное содержание
галактуронидов
определяли
методом
спектрофотометрии по реакции взаимодействия с карбазолом в сернокислой
среде (раздел 2.2.8).
Реакция основана на кислотном гидролизе и дегидратации пектинов с
образованием оксиметилфурфурола, который, реагируя с карбазолом, обра­
зует продукт красно-фиолетового цвета, имеющий максимум светопоглощения при 530 нм.
Характер спектра, а именно: положение максимума светопоглощения
при 530 ± 2 нм, отсутствие других максимумов (характерных для восстанав­
ливающих Сахаров), выраженный пик, доказывают наличие галактуроновой
кислоты в анализируемом объекте (Рисунок 17).
Используя известную расчетную формулу [33], в сравнении со стан­
дартным образцом галактуроновой кислоты, содержание полигалактуроновой кислоты составило 34,6±1,5 %.
65
A 0,7 0,6 0,5 0,4
0,3
0,2
0,1 -
0 -0,1
4t
ft
500
5!Ю
600 нм
-0,2 -
Рисунок 1 7 - Спектр светопоглощения продукта взаимодействия
углеводов семян чернушки дамасской с карбазолом
Таким образом, учитывая достаточно высокий выход углеводов в семе­
нах чернушки дамасской (3,55%), полисахариды можно считать перспектив­
ными в отношении фармакологических исследований и учитывать их в каче­
стве целевого продукта при комплексной переработке сырья [62].
4.2 Исследование липидов
В мировой литературе есть много сведений о биологической активно­
сти жирного масла чернушки посевной, для которого установлено антискле­
ротическое, сосудорасширяющее, антибактериальное и желчегонное дейст­
вие [78].
Вопрос об идентичности фармакотерапевтических свойств сырья раз­
личных видов чернушки в сравнительном аспекте пока остается открытым.
Поэтому представляло интерес изучение жирного масла чернушки дамас­
ской.
4.2.1 Выделение липидов
Количественное определение липидов проводили по методике, указан­
ной в разделе 2.3.1.
66
Время
экстракции составляло
4,5-5
часов, соотношение экстра-
гентхырье - 1:15, степень измельченности - до размеров частиц, проходя­
щих сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм [79].
Эфирное масло из хлороформных экстрактов удаляли гидродистилляционным методом. Сумму веществ, оставшуюся после удаления эфирного
масла, экстрагировали из водного слоя диэтиловым эфиром [44]. Выход жир­
ного масла указан в таблице 5.
Таблица 5 - Технологический выход жирного масла из семян
дамасской
Образец
сырья*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Навеска сырья,
г
20,0142
20,0366
> 19,9921 ,
19,9913
20,0608
19,9700
19,9589
19,9633
,20,5679-s
чернушки
Выход жирного масла, Выход жирного масла,
г
% к сырью
11,3483
56,70
54,30
10,8791 4
*,», 8,8888 У„А%.А г** *<•} **.; 44,46» •' i
32,62
6,5217
5,3763
26,80
6,5217
32,66
3,1915
к н 15,99
10,77
2,1505
5", **2,3158 «*1Ц.и*£»i» л ЧТ? >/»»,* 11,26
Примечание. * образцы 1-3 первого года хранения, 4-6 второго года хранения,
7-9 третьего года хранения
Жирное масло семян чернушки дамасской представляет собой вязкую
опалесцирующую жидкость желто-коричневого цвета с характерным запахом
и пряно-острым вкусом.
Средний выход жирного масла из семян первого года хранения соста­
вил 51,82 %, второго года хранения - 30,69 %, а третьего - 12,67 %. Таким
образом, сырье чернушки дамасской для получения жирного масла можно
рекомендовать со сроком годности 2 года и содержанием жирного масла не
менее 30 %.
По Международной классификации, как промышленное масличное сы­
рье могут рассматриваться растительные объекты, содержание липидного
комплекса в которых составляет не менее 18 %, извлекаемого органическим
67
растворителем. Учитывая эти требования, семена чернушки дамасской могут
быть отнесены к «масличному» сырью, что в свою очередь, позволит для
данного объекта использовать не только экстракционные методы выделения,
но и метод прессования.
4.2.2 Определение физико-химических показателей жирного масла
Определение констант жирного масла проводили по методикам, ука­
занным в разделе 2.3.2. Проведенные исследования показали, что в анализи­
руемых образцах жирных масел примеси парафина, воска, смоляного масла,
перекиси, альдегидов и мыла отсутствуют.
Значение рН исследованных масел определяли потенциометрически в
водной вытяжке после разделения слоев [57].
Значение рН находилось в
пределах 6,0-7,0. Физико-химические показатели изучаемых образцов жир­
ных масел указаны в таблице 6.
Таблица 6 - Физико-химические показатели жирного масла чернушки
дамасской
Показатель Кислотное
Число
Плотность,
преломления
число
омыления
г/см3
20
(1а)
(Is)
0,92±0,03
1,10-1,12
189-197
1,473±0,003
Эфирное
число
Йодное
число
(1Е)
(/0
187,9-195,88
94-97
Наряду с установлением констант жирного масла изучили его спек­
тральную характеристику.
Для измерения спектра поглощения масла семян чернушки дамасской
готовили раствор: 1,0 г масла растворяли в 20 мл хлороформа, затем 1 мл по­
лученного раствора в мерной колбе доводили до объема 10 мл тем же рас­
творителем. Раствор помещали в кювету с толщиной слоя 10 мм спектрофо­
тометра СФ-2000 и измеряли оптическую плотность в диапазоне длин волн
150-550 нм. В качестве раствора сравнения использовали хлороформ.
68
190
240
290
340
390
440
490
540
Рисунок 18 - Спектр поглощения жирного масла
семян чернушки дамасской
Раствор изучаемого масла в хлороформе имеет два максимума погло­
щения при длинах волн 215 и 249 нм, что может быть использовано д л я его
идентификации (Рисунок 18).
4.2.3 Определение жирнокислотного состава
Для идентификации состава жирных кислот масел и контроля отсутст­
вия в нем посторонних примесей использовали метод ГЖХ [129], как наибо­
лее часто применяемый в анализе липидов лекарственных растений и позво­
ляющий получить достоверные и сопоставимые результаты [101]
(раздел
2.3.3).
Хроматограмма метиловых эфиров высших жирных кислот м а с л а се­
мян чернушки дамасской представлена на рисунке 19.
Характеристика хроматограмм с указанием последовательности выхо­
да пиков, идентификацией и показателями содержания жирных кислот масел
представлена в таблице 7.
69
39
36
33
30
27
24
& 21
о
te 18
I 15
* 12
6
3
0
-3
-6
-9
-12
*
9
12
Ц
15
h
18
21
24
H
30
A
27
33
36
Время, мин
Рисунок 19 - Хроматограмма смеси метиловых эфиров
жирных кислот семян чернушки дамасской
Таблица 7 - Жирнокислотный
№
пика
1
2
3
4
5
6
7
Время
удерживания
метилового эфи­
ра, мин
7,725
8,761
14,593
16,503
20,037
28,524
34,274
состав липидов
%
Числовой
символ
Результаты
идентификации
кислоты
14,65
0,15
1,75
25,66
47,44
5,97
4,38
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
20:0
20:2
пальмитиновая
пальмитолеиновая
стеариновая
олеиновая
линолевая
арахиновая
эйкозадиеновая
Содержание,
Из полученных данных видно, что жирнокислотный состав семян чер­
нушки дамасской характеризуется высоким содержанием линолевои кислоты
(47,44 %), олеиновой 25,66 (%) и пальмитиновой (14,65 %).
70
4.2.4 Определение компонентного состава жирного масла
методом ГХ-МС
Далее для изучения в жирном масле не только нейтральных липидов,
но и других липофильных соединений использовали метод газожидкостной
хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) {раздел 2.3.4).
В жирном масле семян чернушки дамасской идентифицировали 30
компонентов, среди которых ретинол, токоферол и ситостерин (Таблица 8,
рисунок 20). Эти соединения обладают высокой биологической активностью
[61, 128].
а Лш^*<ш&«^^«А<а$Ш$Шм^^*^
* W W » w i «»•* т—>
TIC CH-DAM D
1446 11707 1 Q 0
1 1е-Ю8;
1е-Ю8
0
22 82
18 98
9е-Ю7
7.84
8е-Ю7
21 02
7е-Ю7
11
6е-Ю7
5е07
4е-Ю7
Зе-Ю7
3 82
3 69
5 42
R 7R
B
|'|S0' s
*7 52
2е-Ю7
1е-Ю7
I '**
28 89
22 43
4 20
6 4
23 01
24 68
1 1 S9
11 08
14.14
28 33
27 48
29 7 3
•I ЛМ'Д^ч М( ^VrfiWrtlh*i
I ' f'r| f'l4'l"|'i"fTTf i T i ' f f I t T T f l i ' I [ i I"iTj i I ГГртч i i I'TT"! ' | f i"T~| I i l I | I i I I |
4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 18 00 18.00 20 00 22 00 24 00 26 00 2 8 00
V"R»
«» "S
#i
i?» •*
*
i
'•*/*
••-til*
'*
•**» V-л*
ч<*
•*
*-\»
1
**
•»
j»
«**
v
»
Рисунок 20 - Хроматограмма жирного масла семян
чернушки дамасской
Основными по содержанию являются жирные кислоты: линолевая (ки­
слота семейства со-6), олеиновая (ю-9), пальмитиновая, эйкозадиеновая и
стеариновая примерно в одинаковых количествах. Содержание эссенциальных кислот (ЭЖК) в семенах чернушки дамасской составляет 24,26 %.
71
Таблица 8 — Компонентный состав липидных фракций семян чернушки
дамасской
Содержание,
Время
№
Наименование
удерживания,
%
пика
компонента
мин
в масле
1
Бензойная кислота
2,45
3,69
2
Глицерин
3,82
5,00
3
Фенилуксусная кислота
0,55
4,20
4
3,14
Не идентифицирован
5,42
5
6,54
0,27
Не идентифицирован
6
1,28
6-Эудесмен-4-а-ол
6,76
7
1,22
Не идентифицирован
6,86
8
0,71
Метокси-амино-бензойная кислота
7,52
9
7,84
5,09
Не идентифицрован
10 Не идентифицрован
0,69
8,65
11 Азелаиновая кислота
11,02
0,25
12 Гексадеценол
11,08
0,35
11,69
13 Миристиновая кислота
0,51
14
14,14
0,50
Гексадеценовая кислота
12,04
14,46
15 Пальмитиновая кислота
s
n
16 Линолеваякислота ** , ; ^ - * *'i <f**u 16,63 4 * ' - •',, 24,264 '
7,44
17 Олеиновая кислота 4
'"
' ' '"*'•Г il6,98
5,27
* 17,08
18 Стеариновая кислота
8,08
19,00
19
Эйкозадиеновая кислота
0,54
19,26
20
Эйкозановая кислота
20,65
0,50
21
Пальмитиновый моноглицерид
2,24
21,02
22
Пальмитиновый диглицерид
2,97
22,43
23
Олеиновый моноглицерид
8,05
22,82
24
Олеиновый диглицерид
0,65
23,01
25
Не идентифицрован
24,68
0,52
Не идентифицрован
26
2,83
26,89
Токоферол ацетат
27
0,86
27,47
28
Не идентифицирован
1,09
28,33
Р-ситостерол
29
0,68
29,73
9, 19-Циклоланостенол-ацетат
30
87,59
Всего идентифицировано
Таким образом, установленный компонентный состав образцов жир­
ного масла чернушки дамасской методом ГХ-МС, позволил идентифициро­
вать не только жирнокислотный состав, но и сопутствующие высокоэффек­
тивные биологически активные соединения: стерины, ретинолы, токоферолы
72
и др., что предопределяет перспективность фармакологического исследова­
ния [61,125, 145].
4.2.5 Хроматографическое изучение липидов
Из оставшегося шрота после выделения нейтральных липидов смесью
растворителей хлороформ-метанол (2:1) выделяли сумму глико- и фосфолипидов. Экстракт очищали от углеводов промывкой 0,5 % раствором кальция
хлорида (водным) с последующим хроматографированием на колонке. Липиды вымывали смесью растворителей хлороформ-метанол-вода (90:10:1).
Разделение фосфолипидов и гликолипидов осуществляли колоночной
хроматографией на силикагеле L 100/250. Остатки
нейтральных липидов
элюировали хлороформом, гликолипидов - ацетоном, фосфолипидов - мета­
нолом.
Сумму нейтральных липидов разделили на отдельные классы колоноч­
ной хроматографией также на силикагеле. Элюирование классов нейтраль­
ных липидов осуществляли гексаном с постепенно увеличивающейся кон­
центрацией диэтилового эфира (0, 10, 20, 30, 40, 50, 100 % ) .
Содержание каждой группы устанавливали гравиметрически после
удаления растворителя [79].
Качественный состав нейтральных липидов устанавливали методом
ТСХ на пластинках «Silufol» и силикагеля (с 10 % кальция сульфата)
в различных системах растворителей: для нейтральных липидов: гексанэфир диэтиловый (4:1; 1:1); для гликолипидов: хлороформ-ацетон-метанолкислота уксусная-вода (65:20:10:10:3).
Фосфолипиды анализировали двумерной ТСХ на силикагеле в систе­
мах растворителей: 1) хлороформ-метанол-25 % аммиак (13:7:1) и 2) хлоро­
форм-метанол-кислота уксусная-вода (14:5:1:1). Для детектирования зон ад­
сорбции на хроматограммах нейтральных липидов использовали 50 % вод­
ный раствор кислоты серной с последующим нагреванием пластинок, для
73
гликолипидов - растворы а-нафтола и кислоты хлорной, для фосфолипидов реактивы Васьковского, Драгендорфа и раствор нингидрина [79].
Идентификацию различных групп липидов проводили в сравнении со
стандартными образцами и по величине Rf.
Выявлены следующие классы липидов, % от массы: углеводороды 1,2 %, сложные эфиры стеролов и тритерпенолов с жирными кислотами 0,5 %, триацилглицериды - 28 %, свободные жирные кислоты - 0,6 %, сво­
бодные стеролы и тритерпенолы - 0,7 %.
4.3 Белки, пептиды, аминокислоты
4.3.1 Качественное обнаружение аминокислот
Качественные реакции на наличие белков и аминокислот {раздел 2.4.1)
дали положительные результаты, как с биуретовым реактивом, так и с нингидрином (сине-фиолетовое окрашивание), что свидетельствует о наличии
свободной аминогруппы, принадлежащей предположительно белкам, пепти­
дам, аминокислотам.
Качественный состав свободных аминокислот в исследуемом сырье
определяли методом БХ (раздел 2.4.1).
Для идентификации аминокислот использовали стандартные образцы
(СО) аминокислот, которые хроматографировали одновременно с исследуе­
мым извлечением. По характерной окраске и Rf аминокислот, сравнением с
СО, нами обнаружены во всех исследованных образцах не менее 10 амино­
кислот, из которых идентифицировали аргинин (7?/-0,20), гистидин ( i ^ O ^ O ) ,
лизин (i?/-0,12), глутаминовую кислоту (Я/-0,30), аланин (Я/-0,45), триптофан
(i?/-0,55), аспарагиновую кислоту (0,24), валин (0,60), глицин (0,26), лейцин
(0,75), изолейцин (0,72), тирозин (0,45), треонин (0,35), серии (0,27), фенилаланин (0,68). Среди обнаруженных аминокислот особый интерес представ­
ляют незаменимые аминокислоты: треонин, валин, метионин, изолейцин,
лейцин, фенилаланин, лизин.
74
Свободные, или несвязанные, аминокислоты представляют собой наи­
более удобную форму. Они обладают более высокой биологической доступ­
ностью, абсорбируясь непосредственно в кровоток. После приема внутрь
всасываются очень быстро и, как правило, не вызывают аллергических реак­
ций.
4.3.2 Количественное определение белка и пептидов
Характеристику образцов начинали с определения количественного со­
держания суммарного белка по содержанию азота, используя метод Кьельдаля [23]. Выход белка составил 20,03±0,02 %.
Выделение пептидных экстрактов проводили по разработанной мето­
дике, указанной в литературе [79, 120] {раздел 2.4.2).
Количественное определение пептидов в полученных экстрактах про­
водили спектрофотометрическим методом (метод Каар-Каля), который осно­
ван на способности ароматических аминокислот (триптофана и тирозина) по­
глощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм [63].
Содержание пептидного комплекса в семенах чернушки дамасской со­
ставляет в среднем от 0,84 до 1,94 %.
4.3.3 Определение аминокислот методом жидкостной
хроматографии на аминокислотном анализаторе
Все пептидные экстракты охарактеризованы методом аминокислотного
анализа. Данная методика позволяет получать пептидные экстракты с вос­
производимым компонентным составом.
Результаты представлены в таблице 9.
В семенах чернушки дамасской идентифицированы по 6 незаменимых
аминокислот, что в сумме составляет 14,23 % (34,50 % от общей суммы).
Основными по содержанию в семенах чернушки дамасской являются
глутамин, аспарагин и лейцин (в порядке убывания). Как следует из резуль­
татов исследования, аминокислотный состав пептидных экстрактов пред­
ставлен всеми незаменимыми аминокислотами, в различном количественном
75
соотношении; отличается сбалансированностью по заменимым аминокисло­
там, одинаков по сумме доминирующих компонентов.
Содержание триптофана определить не удалось в связи с его разруше­
нием при кислотном гидролизе [23], отсутствие цистеина свидетельствует о
том, что в сумме пептидов отсутствуют дисульфидные связи, т.е сумма не
содержит в своем составе цистеинсодержащие пептиды.
Таблица 9 —Аминокислотный состав пептидных гидролизатое
Название
Содержание,
аминокислоты
г%
Аспарагин
6,01
Серии
1,54
Глутамин
7,63
Глицин
0,44
Алании
ЗД4
2,13
Валии *
0,12
Метионин *
0,41
Изолейцин *
5,24
Лейцин *
1,42
Тирозин
2,12
Фенилаланин *
Гистидин
1,23
4,21
Лизин *
2,04
Аргинин
Пролин
1Д4
2,43
Треонин
41,25
Сумма аминокислот
* - незаменимые аминокислоты
4.3.4 Электрофоретический анализ пептидов
Далее для исследования экстрактов пептидов применяли метод элек­
трофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (раздел 2.4.4).
Электрофореграмма полученных пептидов приведена на рисунке 21.
В семенах чернушки дамасской зафиксированы низкомолекулярные
пептиды с молярными массами от 10 до 28 кДа. Масса других пептидов
варьировала от 67 кДа до 25 кДа.
76
Бычий сывороточный
альбумин
67000 Да
Ь.
%
Овальбумин
45000 Да
•'
>*' ,,
Хемотрипсиноген
25000 Да
:
: ",d$i'ii~:
Ингибитор трипсина
20000 Да
'•Л
••'в
Лактоальбумин
14000 Да
Рисунок 21 - Электрофореграмма пептидов семян чернушки дамасской:
мар - белки-маркеры, 1 - фотография, 2 - схема
Пептиды с М.м. около 10 кДа - относятся к так называемым липидпереносящим белкам и соответствуют данным для известных антимикробных
пептидов [41].
Ввиду высокой биологической активности пептидов данный класс
можно рассматривать как перспективный для создания на их основе новых
отечественных высокоэффективных лекарственных средств [98, 130, 146].
4.3.5 Изучение пептидов методом ВЭЖХ
Следующим этапом исследования явилось изучение пептидов методом
эксклюзионной ВЭЖХ (раздел 2.4.5), который был разработан сотрудниками
лаборатории пептидов Института химии растительных веществ (г. Ташкент,
Республика Узбекистан) [79, 93].
Результаты анализа представлены в таблице 10 и на рисунке 22.
77
Таблица 10 -Результаты
анализа пептидов методом ВЭЖХ
Время удерживания, мин
6,75
9,39
13,06
15,73
16,88
18,69
24,27
Содержание, %
5,30
0,65
68,32
7,39
10,99
5,78
1,56
Молярная масса, Да
67811
52179
36215
27753
24756
20678
11872
В результате изучения пептидов методами электрофореза (Рисунок 21)
и ВЭЖХ (Рисунок 22) видно, что разделение пептидного экстракта проходит
идентично, но при анализе пептидных фракций методом ВЭЖХ не только
уточнена молярная масса каждого пептида, но и определено их количествен­
ное содержание, что позволяет решать вопросы, связанные с идентификаци­
ей, контролем чистоты и количественным определением.
Norm.
ю
о
со
80
60
•
*
:
1 v^.
40
J
0
Uп
1 \*
"^
V
1
20 :
:
i .«£.. да
; со
'. Лч
со
сг>
см;
A Y со :
Y \ со :
1
10
:
см ,
;
1 \г • *=*" •
T ^ i ^
5
:•
(С :
см, ;
15
20
25
min
Рисунок 22 -Хроматограмма ВЭЖХ пептидов семян чернушки
дамасской
4.4. Эфирные масла
Эфирные масла оказывают бактериостатическую, антисептическую,
дезинфицирующую, фунгистатическую, отхаркивающую, седативную, диу­
ретическую, антиоксидантную, иммуностимулирующую, спазмолитическую,
78
и другие виды активности. Поэтому представляло интерес изучение данного
класса соединений.
4.4.1 Определение содержания эфирного масла
Эфирное масло
получали методом гидродистилляции из воздушно-
сухого сырья (метод 2 - Клевенджера) [72]. Время перегонки составляло 3
часа. Эфирное масло отделяли от воды гексаном и в течение 12 часов высу­
шивали в присутствии фосфора (V) оксида в эксикаторе. Содержание эфир­
ного масла в исследуемых образцах сырья составило 2-3 %.
Эфирное масло представляло собой легкоподвижную жидкость светложелтого цвета, с характерным запахом и приятным вкусом.
4.4.2 Определение подлинности эфирного масла
Полученные образцы эфирного масла анализировали согласно требо­
ваниям ОФС ГФ XI «Масла эфирные» и соответствующих методик ГФ XI и
XII изданий [23, 24, 26, 69].
Физико-химические
показатели исследуемых эфирных масел пред­
ставлены в таблице 11.
Таблица 11 - Физико-химические показатели эфирного масла
Показатели
угол
показатель
плотность
вращения преломления
nl°
0,6190,659
-21-23
1,4711,475
раствори­
мость
температура кислотное
(концентра­ затвердевания,
число
ция
°С
(1А)
спирта)
1:3
(96 %)
-6±0,1
0,820,86
эфирное
число
(1в)
10,0010,30
В настоящее время метод УФ-спектрофотометрии широко использует­
ся в пищевой промышленности для идентификации эфирных масел в составе
ароматных спиртов. Установлено, что различные виды эфирных масел имеют
характерные для каждого из них спектры поглощения [94].
ъ
-*
79
Для измерения спектра поглощения эфирного масла семян ч е р н у ш к и
дамасской готовили раствор: 0,1 мл масла растворяли в 50 мл спирта э т и л о ­
вого 96 %, затем 1 мл полученного раствора в мерной колбе доводили
до
объема 10 мл тем же растворителем. Раствор помещали в кювету с т о л щ и н о й
слоя 10 мм спектрофотометра СФ-2000 и измеряли оптическую плотность
в
диапазоне длин волн 200-600 нм. В качестве раствора сравнения использова­
ли спирт.
Как следует из рисунка 23, спектр поглощения спиртового р а с т в о р а
эфирного масла
имеет характерную полосу поглощения с максимумами
216±2 нм (А=2,84), 254±2 нм (А=1,33) и 296±2 нм (А=1,68), что соответству­
ет спектру СО тимохинона (Рисунок 24).
Рисунок 23 - Спектр поглощения эфирного масла
семян чернушки дамасской
80
200
300
400
500
600
Рисунок 24 - Спектр поглощения стандартного образца тимохинона
Спектры поглощения исследуемого раствора и раствора СО тимохино­
на имеют общий максимум поглощения при длинах волн 264+2 нм (А=2,64),
254±2 нм (А=0,66) и 297±2 нм (А=0,47).
4.4.3 Изучение эфирного масла методом ГЖХ
Работа по идентификации компонентов эфирного масла исследуемых
образцов была проведена методом газожидкостной хроматографии (раздел
2.5.1). Анализ пробы проводили 6 раз.
В эфирном масле чернушки дамасской обнаружен 21 компонент, 10 из
которых идентифицированы, что составляет 90,64 % от суммы эфирного
масла. Доминирующими компонентами являются ароматический углеводо­
род - р-цимол (61,83 %) и моноциклический монотерпен - терпинолен
(13,94 %) (Таблица 12, рисунок 25).
81
Таблица 12 - Компонентный
Наименование
компонента
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
а-пинен
камфен
3-пинен
лимонен
не идентифицирован
не идентифицирован
не идентифицирован
не идентифицирован
не идентифицирован
у-терпинен
р-цимол
не идентифицирован
терпинолен
терпинеол-4
не идентифицирован
не идентифицирован
не идентифицирован
тимол
карвакрол
не идентифицирован
не идентифицирован
состав эфирного масла чернушки
Время
удерживания, мин
3,025
3,911
5,425
6,722
9,824
12,172
13,701
15,247
16,327
17,237
18,804
21,118
• 22,462
24,531
26,451
27,864
28,734
30,594
31,818
34,831
37,352
дамасской
Содержание,
%
0,06
1,44
0,28
1,86
0,43
0,31
0,29
0,15
0,37
2,31
61,83
1,25
13,94
5,56
0,32
3,53
0,13
2,83
1,06
0,31
1,73
36
39
Время, мин
Рисунок 25 —Хроматограмма эфирного масла семян чернушки дамасской
82
4.4.4 Изучение эфирного масла методом ВЭЖХ
Целью дальнейшего исследования была разработка методики количе­
ственного определения тимохинона в семенах чернушки дамасской, так как
тимохинон обладает высокой биологической активностью (раздел 1.3) и мо­
жет выступать в роли аналитического маркера.
Изучение эфирного масла проводили в соответствии с ОФС «Высоко­
эффективная жидкостная хроматография» (ВЭЖХ) ГФ XII изд. [24] на высо­
коэффективном жидкостном хроматографе модель «Стайер» фирмы Акви­
лон.
В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка
Luna С-18 4,6x150 мм с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: ацетонитрил и 2 % раствор муравьиной кислоты. Анализ проводили при комнатной
температуре. Скорость подачи элюента 1 мл/мин при продолжительности по­
дачи от 20 до 60 мин. Объем пробы 20 мкл. Детектирование осуществляли с
помощью УФ-детектора, при длине волны 254 нм.
Использовался градиентный режим элюирования:
Время,
мин
0
100
Элюент А (ацетонитрил),
%
0
100
Элюент В
(2% водный р-р муравьиной кислоты), %
100
0
В данных условиях СО тимохинона удерживается на 50 минуте (Рису­
нок 26), при этом эффективность пика составляет порядка 170 000 т.т., а его
асимметрия равна 1,06.
Необходимым критерием применения любой аналитической методики
служит доказательство ее валидности
[104, 144]. Для этого изучили ком­
плекс валидационных характеристик разработанной методики определения
тимохинона в семенах чернушки дамасской.
Под специфичностью методики следует понимать способность досто­
верно определять анализируемое соединение в присутствии других компо­
нентов образца. В случае сепарационных методов (ВЭЖХ) избирательность
83
методики идентификации может быть подтверждена получением положи­
тельных результатов (путем сравнения с известным стандартным образцом)
для образцов, содержащих определяемый компонент. При количественном
определении вещества критерием специфичности может являться параметр
разрешения определяемого вещества с ближайшим пиком.
При определении специфичности ВЭЖХ методики идентификации ти­
мохинона необходимо было сопоставить время удерживания тимохинона на
хроматограмме стандартного образца и на хроматограмме эфирного масла,
полученного из семян чернушки дамасской (Рисунок 26, 27).
mV
400
300
200
100
ЧгЫ
28
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
мин
Рисунок 26 - Хроматограмма раствора СО тимохинона
В результате установлено, что на хроматограмме опытного образца
имеется пик, совпадающий по времени удерживания с пиком на хромато­
грамме раствора стандартного образца тимохинона. При этом добавка стан­
дартного образца к эфирному маслу (Рисунок 28) способствует увеличению
пика анализируемого вещества пропорционально количеству добавленного
84
стандарта с сохранением его асимметрии (1,06) и эффективности (170 000
т.т.).
raV
400
300-
§
200-
100
_JUw_—и
Ch
l8
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
мин
Рисунок 27 - Хроматограмма спиртового раствора эфирного масла
чернушки дамасской (1:1)
mV
х
о
в
600-
S
§
S
500
400
300200100
_/J
chi8
30
32
34
36
38
40
42
J^^s^r
44
46
48
50
52
Рисунок 28 - Хроматограмма спиртового раствора эфирного
масла чернушки дамасской (1:1) с добавкой раствора
стандартного образца
мин
85
Следует отметить, что разрешение пика тимохинона с ближайшим со­
путствующим пиком на хроматограмме эфирного масла составило 1,5, что
свидетельствует о полном разделении компонентов.
Полученные данные позволяют считать разработанную ВЭЖХ методи­
ку качественного и количественного анализа тимохинона специфичной.
Следующим этапом исследования было установление зависимости
площади пика от концентрации стандартного образца тимохинона в растворе
стандартного образца.
Линейность методики - наличие прямой пропорциональной зависимо­
сти оптической плотности от концентрации определяемого вещества (тимо­
хинона) в анализируемой пробе.
Линейность выражается уравнением у = ах + Ь. Это уравнение называ­
ют линейной регрессией. Параметр «Ь» градуировочной функции характери­
зует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холо­
стого опыта, а коэффициент «а» характеризует наклон градуировочной кри­
вой и является отражением чувствительности методики.
Для проверки линейности готовили серию растворов стандартного об­
разца тимохинона в диапазоне концентраций от 0,0005 до 0,008 г/100мл. По­
лученные растворы анализировали по разработанной методике. Градуировочный график зависимости площади пика тимохинона от его концентрации
в растворе представлен на рисунке 29.
Как следует из графика, все экспериментальные точки находятся вбли­
зи линии тренда, а величина коэффициента (Ь) незначительна. Рассчитанный
коэффициент корреляции (г) составил 0,9988, что свидетельствует о наличии
жесткой линейной зависимости.
86
Градуировочный график тимохинона
14000
(Л
(О
X
о
X
X
о
S
12000
10000
8000
и
га
* 6000
•?
с
л
Ч
4000
?
О
Сс;
2000
0
Н
1
!
1
1
1
1
1
1
1
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0,009
Концентрация тимохинона в растворе, г/100мл
Рисунок 29 - Зависимость площади пика от концентрации
стандартного раствора тимохинона
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что разрабо­
танная методика линейна в изучаемом диапазоне концентраций, что позволя­
ет использовать данный градуировочный график для количественной оценки
тимохинона в образцах.
Прецизионность (воспроизводимость) - это характеристика случайного
рассеяния или характеристика случайных ошибок. При установлении преци­
зионности следует учитывать, что данная характеристика бывает трех уров­
ней:
> повторяемость (сходимость);
>
промежуточная прецизионность (внутрилабораторная воспроизводимость);
> межлабораторная воспроизводимость.
Однако для целей фармацевтического анализа бывает достаточно толь­
ко первого уровня.
При установлении повторяемости существует два способа её оценки.
1. Проводят не менее трех определений на трех уровнях концентраций опре­
деляемого вещества.
87
2. Проводят не менее шести параллельных определений на одном уровне
концентраций.
Затем вычисляют величину стандартного отклонения (SD) и относи­
тельного стандартного отклонения (RSD) по формулам:
SD
= Ш^££;
RSD =™xlOO%.
V ("-i)
x
Для определения прецизионности методики количественного опреде­
ления использовали второй способ расчета. Для этого готовили серию из
шести параллельных извлечений эфирного масла из сырья по методике {раз­
дел 4.4.1).
Каждую из шести полученных проб анализировали согласно разрабо­
танной ВЭЖХ-методике.
Расчет содержания тимохинона проводили по уравнению градуировочного графика. Полученные результаты представлены в таблице 13.
Таблица 13 — Результаты определения прецизионности методики
чественного определения тимохинона
№ п/п
X, г/100мл
1
0,0029
2
0,0028
3
0,0033
4
0,0031
0,0033
5
6
0,0033
Х ср
0,003116667
Xj-Xcp
-0,000216667
-0,000316667
0,000183333
-1,66667Е-05
0,000183333
0,000183333
(Х г Х с р ) 2
4,69444Е-08
1,00278Е-07
3,36111Е-08
2/77778Е-10
3,36111Е-08
3,36111Е-08
коли­
SD
RSD, %
0,00022286
7,15
ВД-Хср)2
2,48333Е-07
Согласно полученным данным, относительное стандартное отклонение
(RSD) разработанной методики составило 7,15 %, что с учетом сравнительно
низкого содержания вещества говорит о достаточно низких значениях слу­
чайной погрешности изучаемой методики.
Таким образом, при анализе эфирного масла семян чернушки дамас­
ской разрешение с ближайшим пиком составляет 1,5 (должно быть не менее
88
1,2). Площадь пика тимохинона в эфирном масле равна 838,24 (п=3). При
расчетах по уравнению градуировочного графика содержание тимохинона в
эфирном масле составляет 0,003 %.
В сравнительном аспекте представляло интерес определение количест­
венного содержания тимохинона в извлечениях, приготовленных с помощью
спирта метилового и гексана (Рисунок 30, 31).
mV
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
мин
Рисунок 30 - Хроматограмма извлечения гексаном из семян
чернушки дамасской
mV
34
36
38
40
42
44
46
48
50
52
54
56
Рисунок 31 - Хроматограмма извлечения метанолом
из семян чернушки дамасской
мин
89
Площадь пика тимохинона в метанольном извлечении составила 40,93.
Концентрация в извлечении (расчет по стандарту): 0,000025% (раздел 4.4.3).
Площадь пика тимохинона в извлечении, полученном с помощью гексана, составила 43,97. Концентрация в извлечении (расчет по стандарту):
0,000027 %. В спиртовом извлечении в тех же условиях тимохинон иденти­
фицировать не удалось.
Низкое содержание тимохинона объясняется его деструкцией в услови­
ях пробоподготовки извлечений, что следует в дальнейшем учитывать при
разработке оптимальной технологической схемы получения экстрактов.
4.5 Ферменты
Семена чернушки дамасской уже давно применяются для получения
препарата липолитического действия, поэтому для нас представляло интерес
выявление данной активности в сырье чернушки дамасской, культивируемой
в условиях Ставропольского края, что необходимо для обоснования исполь­
зования этого сорта в промышленности.
В настоящее время, согласно рекомендации комиссии по ферментам
Международного биохимического союза, за единицу любого фермента (ME)
принимают то его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль
субстрата за 1 мин при заданных условиях определения [50].
4.5.1 Определение липолитической
активности
Липолитическую активность определяли по методике предприятия
(раздел 2.6.1) [55].
В результате проведенного анализа были получены следующие резуль­
таты: липолитическая активность семян чернушки
дамасской составила
9,5±2,03 ЛЕ на 1 мг сырья. Требования к сырью по существующей норматив­
ной документации регламентируют липолитическую активность не менее 8,0
ЛЕ на 1 мг сырья [55].
90
4.5.2 Определение протеолитической
активности
Определение протеолитической активности сырья проводили по моди­
фицированной методике (раздел 2.6.2).
Полученные результаты по определению протеолитической активности
белков, выделенных из исследуемых образцов, показали, что высокой актив­
ностью обладают белки из семян чернушки дамасской (17,6 ±1,35 ЕД/мг).
Необходимо отметить, что препарат растительного происхождения
«Карипазин», который близок по действию к трипсину и химотрипсину, со­
держит не менее 3,5 ПЕ, а «Лизоамидаза» бактериального происхождения не менее 0,7 ПЕ. Таким образом, установленная протеолитическая актив­
ность семян чернушки дамасской открывает возможности использовать дан­
ное сырье для промышленной переработки в качестве средств, улучшающих
метаболические процессы.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что чер­
нушка дамасская, введенная в культуру на территории Ставропольского края,
соответствует требованиям к сырью для производства препарата «Нигедаза»,
а установленная протеолитическая активность позволяет использовать дан­
ное сырье в качестве источника новых комбинированных препаратов, улуч­
шающих пищеварение [39].
4.5.3 Выделение фермента липазы
Выделение фермента липазы проводили по описанной в литературе
технологической схеме [16], которая состоит из следующих этапов:
> проращивание увлажненных семян;
> удаление избыточной влаги;
> измельчение семян;
> обезжиривание семян ацетоном;
> удаление ацетона (фильтрация);
> сушка ацетонового порошка;
91
> получение извлечения путем экстракции 0,025 М аммиачным раство­
ром в соотношении 1:10 в течение 30 минут;
> центрифугирование;
> лиофильная сушка готового продукта;
> измельчение.
Для определения липазной активности, температурного оптимума, ста­
бильности и скорости ферментативной реакции был использован титриметрический метод.
В
результате
установлено,
что активность
липазы
составляет
210 300 ЕА. Температурный оптимум отмечен около 60° С. Активность липа­
зы достигала наибольшей величины при выдерживании в течение 1,5 часов.
Наибольшая скорость ферментативной реакции была отмечена после 30 ми­
нут при температуре 37° С. Выход липазы составлял до 3 %.
4.6 Разработка методики подлинности семян чернушки дамасской
Для экспресс-анализа природных соединений в ЛРС и определения его
подлинности использовали метод ТСХ, который имеет ряд преимуществ та­
кие, как селективность и высокая чувствительность [24].
Анализ проводили на пластинках «Sorbfil» (ПТСХ-П-В-УФ) в различ­
ных системах растворителей:
I. Гексан-диэтиловый эфир (2:1);
II. Гексан-диэтиловый эфир (3:1);
III. Толуол-этилацетат (93:7);
IV. Бензол-изопропиловый эфир (1:1);
V. Бензол-хлороформ (9:1)
В колбу вместимостью 50 мл помещали 1,0 г измельченного сырья с
размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм
(ГОСТ 214-83), прибавляли 25 мл соответствующего экстрагента (спирта
этилового 70 %, спирта метилового, хлороформа) и нагревали с обратным
92
холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Извлечения
фильтровали через бумажный фильтр с красной полосой.
Для анализа использовали также спиртовой раствор эфирного масла
(1:1).
На пластинку наносили микрошприцем по 1,0 мкл полученных извле­
чений. Пластинку с нанесенными пробами помещали в камеру, предвари­
тельно насыщенную системой растворителей, и хроматографировали восхо­
дящим способом. После того как фронт растворителей проходил около 10 см,
пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе и просматривали в УФ
свете при длине волны 254 нм. ТСХ-анализ проводили в сравнении со стан­
дартным образцом тимохинона (Sigma-Aldrich).
На рисунке 32 изображена хроматограмма, полученная с использова­
нием системы растворителей гексан-диэтиловый эфир (3:1) и (2:1).
I
II
Rf
0.9
0
0.7
0
О
0.8
CD
0.6
0
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
А
и
1
и
А
2
А
0
3
А
0
1
Л
А
2
4
(J
и
Рисунок 32 - ТСХ в системе: гексан-диэтиловый эфир
I— соотношение 3:1, II'— 2:1 X 254 нм:
1 - спиртовой раствор эфирного масла, 2 - СО тимохинона,
3 - спиртовое извлечение, 4 - хлороформное извлечение
93
Наилучшее разделение было достигнуто в системе П. На рисунке вид­
но (Рисунок 32), что в извлечении, приготовленном с помощью хлороформа,
присутствует одно пятно (зеленое пятно с Rf около 0,87, X 254 нм), эфирное
масло разделилось на два пятна (зеленое с /?/около 0,71 и голубое с Rf около
0,8), но тимохинон идентифицировать не удалось. Извлечение, полученное
при помощи спирта этилового, видимых пятен не давало.
Далее продолжили изучение хроматографической подвижности в сис­
теме толуол - этилацетат (93:7) (Рисунок 33).
На хроматограмме при детектировании в УФ свете X 254 нм в эфирном
масле и спиртовом извлечении обнаружены три пятна с голубой, зелёной и
темной флуоресценцией и соответствующими значениями Rf ~ 0,6; 0,75 и
0,83. Зона адсорбции темного пятна с Rf около 0,83 совпала с зоной адсорб­
ции СО тимохинона.
УФ-свет Л,254нм
о
Rf
0.9
сз CD
сз О
О
<о О
CD
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
п
и
ил
1
2
и
А
3
9?
и
0.1
4
Рисунок 33 - ТСХв системе топуол-этилацетат (93:7):
1 - СО тимохинона, 2 - спиртовой раствор эфирного масла,
3 — спиртовое извлечение, 4 — метанольное извлечение
94
В системе бензол-изопропиловый эфир (1:1) исследуемые извлечения
на хроматограмме не проявлялись.
При проведении ТСХ-анализа в системе бензол-хлороформ (9:1) полу­
чили наиболее идентификационные результаты (Рисунок 34).
УФ-свет Я.254НМ
о
g
сэ
Rf
1.0
О
О
о
о
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
#2
А
3
ш
4
Рисунок 34 - ТСХ в системе бензол-хлороформ (9:1):
1 - СО тимохинона, 2 — спиртовой раствор эфирного масла,
3 — гексановое извлечение, 4 — метанольное извлечение
На хроматограмме исследуемых извлечений фиксировали по два пятна
(Rf= 0,83 и 0,88). Пятно с Я/* 0,88 совпадало с Rf СО тимохинона (Рисунок
34).
Таким образом, в результате проведенных исследований удалось раз­
работать методику определения подлинности эфирного масла и семян чер­
нушки дамасской с помощью метода ТСХ: на пластинках «Sorbfil» в системе
растворителей бензол-хлороформ
волны 254 нм.
(9:1) с детекцией в УФ свете с длиной
95
4.7 Макро- и микроэлементный состав, тяжелые металлы,
радионуклиды
4.7.1 Определение макро- и микроэлементного состава
До настоящего времени лекарственные растения не рассматривались в
качестве источника легкоусвояемой формы макро- и микроэлементов в ком­
плексе с другими фармакологически активными веществами с целью их и с ­
пользования при лечении ряда патологий, поэтому для большинства исполь­
зуемых в традиционной медицине видов лекарственных растений качествен­
ный минеральный состав не установлен [2, 73, 76].
Учитывая, что изучаемый вид может использоваться для получения
экстемпоральных лекарственных форм, определение микроэлементов в с ы ­
рье имеет и практическое значение.
Анализ проводили по методике, указанной в разделе 2.7. Результаты
исследования минерального состава семян чернушки дамасской представле­
ны в таблице 14. Сырье исследуемого вида богато биологически активными
макро- , микро- и ультрамикроэлементами, из которых 11 являются эссенциальными и 2 - условно эссенциальными. Использованная методика позволи­
ла определить в сырье 27 биоэлементов. Выявлена следующая закономер­
ность уменьшения содержания эссенциальных и условно эссенциальных
элементов-металлов:
K>P>Mg>Ca>Na>Ti>Ba>Mn>Sr>Zn>V=Cu>Cr>Pb>Zr-Ni>Ga>Sc>Ag>Y.
Таблица 14 - Содержание макро- и микроэлементов в золе семян
чернушки дамасской
Химический
элемент
1
Калий*
Кальций*
Магний*
Натрий*
Фосфор*
Содержание в
Содержание в
почве, %
семенах, %
2
3
Макроэлементы, %
2,5
1,2
0,5
1,0
0,9
1,0
0,5
1,1
2,0
1,0
КБП
4
0,5
0,5
0,9
0,5
0,5
96
1
Алюминий
Бор**
Железо*
Кадмий
Кремний**
Марганец*
Медь*
Молибден*
Мышьяк
Олово
Свинец
Сурьма
Стронций
Ртуть
Цинк*
Барий
Бериллий
Ванадий**
Вольфрам
Галлий
Гафний
Германий
Индий
Иттербий
Иттрий
Кобальт*
Лантан
Литий*
Никель**
Ниобий
Серебро
Скандий
Тантал
Таллий
Титан**
Хром*
Цирконий
2
3
Микроэлементы, %
—
0,7
<0,0003
0,3
<0,0003
0,4
—
0,002
—
0,004
<0,0003
0,5
0,005
од
<0,0003
<0,0003
—
0,0001
<0,0003
<0,0003
0,04
<0,0003
—
4
0,05
—
0,03
—
0,005
0,03
1,0
Ультрамикроэлементы, %
—
0,05
—
—
<0,0002.
0,03
—
-
<0,0015
—
—
0,05
0,005
<0,0003
0,06
0,01
<0,0003
—
—
<0,0003
—
<0,0003
0,01
—
—
0,04
<0,0002
<0,0001
од
.
0,8
0,5
0,4
<0,0002
<0,0001
—
—
<0,0003
<0,0003
0,001
<0,0003
—
—
<0,001
0,01
0,005
0,003
<0,001
0,4
0,15
0,1
Примечание: «*» отмечены эссенциальные элементы;
«**» отмечены условноэссенциальные элементы;
«<» меньше порога обнаружения; «-» отсутствует
0,025
0,03
0,03
97
Полученные данные свидетельствуют об активном накоплении в сы­
рье таких важнейших биогенных элементов как калий, фосфор, магний,
кальций, натрий, барий, марганец, цинк, медь и хром, которые исполняют
роль каталитических центров ферментов [116], и участвуют в синтезе белков,
что подтвердилось результатами.
Расчет коэффициентов биологического поглощения показал, что нако­
пление семенами из почвы меди, цинка, хрома, стронция, свинца, марганца и
циркония достаточно низкое (КПБ<0,1). Наиболее активно поглощаются, но
не концентрируются - макроэлементы и гафний.
Содержание токсичных и потенциально-токсичных элементов не пре­
вышало разрешенных норм их наличия в препаратах растительного проис­
хождения [ПО].
В результате проведенных исследований установлено, что семена чер­
нушки дамасской, выращенные в условиях Ставропольского края, являются
экологически чистыми [65].
4.7.2 Определение содержания тяжелых металлов
Содержание тяжелых металлов и железа определяли по методике ГФ
XII издания в зольном остатке после сжигания сырья.
Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не превышала окраски
эталонного раствора, что свидетельствует о соответствии всех образцов сы­
рья по содержанию тяжелых металлов требованиям ГФ XII.
К приоритетным загрязнителям биосферы относятся кадмий, свинец и
ртуть, поэтому в ЛРС необходимо определять данные элементы, которые
для многих территорий России являются экологически значимыми [29, 74,
118].
Тяжелые металлы из ЛРС могут переходить в лекарственные формы, а
затем поступать в организм человека [27, 45]. Поэтому проблема экологиче­
ский чистоты лекарственных растений становится особенно актуальной, а
многообразие сырьевых источников побуждает повысить уровень требова-
98
ний к качеству ЛРС и фитопрепаратов на его основе с учетом содержания
тяжелых металлов [96].
Таким образом, нормирование содержания тяжелых металлов в сырье и
фитопрепаратах - одна из важнейших задач современной науки, решение ко­
торой позволит гарантировать безопасность ЛРС и фитопрепаратов для насе­
ления [82].
Значения пределов допустимого содержания тяжелых металлов не
должны превышать уровня их допустимого содержания в БАД растительного
происхождения, согласно действующему СанПин [29, 96, 109].
Концентрации тяжелых металлов (свинца, кадмия и ртути) в сырье оп­
ределяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии по методике ГОСТ
30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод опре­
деления токсичных элементов». Результаты исследования представлены в
таблице 15.
Анализ показал, что все образцы сырья удовлетворяют требованиям
СанПиН 2.3.2 1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2 1280-03 по содержанию кад­
мия, свинца и ртути.
Таблица 15 - Содержание тяжелых металлов в семенах
чернушки дамасской
Концентра­
ция РЬ, мг/кг
1,50
Содержа­
ние от до­
пустимого
уровня, %
25,00
Содержа­
Концентра­
ние от до­
ция CU, мг/кг пустимого
уровня, %
70,00
0,700
Концентра­
ция Hg, мг/кг
0,005
Содержа­
ние от до­
пустимого
уровня, %
5
Примечание: допустимые пределы не более свинец - 6,0 мг/кг; кадмий - 1,0 мг/кг;
ртуть -0,1 мг/кг
4.7.3 Определение содержания радионуклидов
Интенсивность накопления растениями радионуклидов из почвы видоспецифична и существенно зависит от ряда почвенных параметров экоси­
стемы, обуславливающих определенную мобильность радионуклидов в сис­
теме «почва-растение» [95]. Как отмечено в [1, 88], поведение радионукли­
дов в экосистемах стало зависеть от их физико-химического состояния в поч-
99
ве. На сегодняшний день накопление радионуклидов в растениях осуществ­
ляется, в основном, через корневую систему, но не более 1 % содержащихся
в почве [3]. Почвенная доступность определяется преобладанием той или
иной формы радионуклидов, соотношением гуминовых и фульвокислот, ти­
пом почвы и ее кислотностью, наличием элементов-антагонистов, составом
биогеоценозов, окислительно-восстановительным потенциалом загрязненно­
го слоя почвы, сезонными фазами развития растения, проведением защитных
мер. Вертикальная миграция в почве, вероятно, незначительна, в ряде работ
показано, что до сих пор 90-95 % радионуклидов остается в верхнем слое
почвы (0-5 см) [143]. Отмечено, что растения, произрастающие в нескольких
сантиметрах друг от друга, могут значительно отличаться по содержанию ра­
дионуклидов. Таким образом, можно предположить наличие загрязненных
образцов во всех группах ЛРС, заготовленных как от одно-, так и от много­
летних растений.
Результаты изучения накопления радионуклидов представлены в таб­
лице 18.
Согласно ОФС 42-0011-03, в растительном сырье нормируется содер­
жание радионуклидов техногенного происхождения, в первую очередь Sr-90
и Cs-137 [65, 80].
С точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы
растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1 %
Cs-137 и 0,15-0,30 % Sr-90 от допустимого нормативной документацией
уровня (Таблица 16).
Таблица 16 — Содержание радионуклидов в исследуемых видах ЛРС
Радионуклид
н
и
ел
Общая
сумма
радионук­
лидов
-
-
<0,3
218,552
СЧ
о
•
CQ
12,462
205,79
—
i
о
ON
•
Содержа­
Сумма ние Cs-137 в
сырье в %
Cs137+
от
Sr-90 допустимо­
го уровня
о,з
-
Содержа­
ние Sr-90 в
сырье в %
от
допустимо­
го уровня
0,15
Примечание: допустимый уровень в лекарственных растениях (по ОФС 42-001-03) Cs137 не более 400 Бк/кг, Sr-90 не более 200 Бк/кг
100
4.8 Определение числовых показателей
Определение числовых показателей (влажности; золы общей; золы, не­
растворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной; содержания экс­
трактивных веществ; примесей) проводили по методикам ГФ XI и ГФ XII
[23, 24, 75]. Результаты представлены в таблице 17.
Из полученных данных (Таблица 34) видно, что наибольшее содержа­
ние экстрактивных веществ достигается экстракцией водой и 40 % спиртом
этиловым [64].
Таблица 17 - Товароведческие показатели семян чернушки дамасской
Показатель
Влажность
Зола общая
Зола, нерастворимая в 10% НС1
Экстрактивные вещества (экстрагент): вода
спирт этиловый 40%
спирт этиловый 70%
спирт этиловый 96%
Содержание, %
5,48-7,59
8,06-10,12
1,05-1,45
12,18-15,84
8,04-8,93
5,32-5,96
1,00-1,35
4.9 Определение микробиологической чистоты
Контроль качества лекарственного растительного сырья на микробио­
логическую чистоту проводили согласно статье ГФ XII «Методы микробио­
логического контроля лекарственных средств» [24].
Таблица 18 - Содержание микроорганизмов в семенах чернушки
дамасской
Грибы (в 1 г)
Escherichia coli
Бактерии (в 1 г)
норма - не более 10
норма - не более
норма - не более
дрожжевых и плесневых
5
102 в 1 г
10 аэробных бактерий
грибов
2
Не обнаружено
4x10
Не обнаружено
Исходя из приведенных в таблице 18 данных, образцы исследуемого
сырья по показателю микробиологической чистоты соответствовали требо­
ваниям ГФ XII (категория 4Б).
101
4.10 Обоснование норм качества «Чернушки дамасской семена»
В результате проведенного комплексного фитохимического исследова­
ния семян чернушки дамасской, выращенной в условиях Ставропольского
края, в качестве целевых продуктов выделили ферменты, эфирные и жирные
масла.
Существующая ВФС 42-1691-87 «Чернушки дамасской семена» не
удовлетворяет современным требованиям, предъявляемым к нормативной
документации (НД) на растительное сырье [68, 107]. Данный НД преду­
сматривает стандартизацию сырья лишь по общим числовых показателям,
таким как влага, зола, содержание примесей и определение липолитической
активности. Для объективной оценки качества сырья необходимо внести ряд
показателей, позволяющих учитывать различные пути использования.
Для этого нами проведены исследования по разработке методик
качественного и количественного определения основных групп БАВ,
морфолого-анатомические
исследования.
При
разработке
НД
на
лекарственное растительное сырье проводили исследования по изучению
сроков хранения сырья и их влияние на его качество.
исследований представлены в разработанном проекте
Результаты
фармакопейной
статьи (ФС) и Инструкции по заготовке и сушке (см. приложение).
Нормативная документация оформлена в соответствии с требованиями
ОСТ 91500.05.001-00.
Хранение сырья семена чернушки дамасской необходимо проводить в
сухом, хорошо проветриваемом помещении, при температуре 18-20 С в
течение 2 лет, предназначенном для получения эфирного и жирного масел и
в течение 4 лет - для получения препарата «Нигедаза» (см. приложение).
На основании проведенных исследований по изучению содержания
основных
групп
БАВ,
сроков
годности
сырья,
товароведческих
исследований разработаны показатели и нормы качества для сырья
102
исследуемого вида, которые положены в основу современной нормативной
документации (Таблица 19).
Таблица 19 —Показатели норм качества «Чернушки дамасской семена»
Показатели
1
Внешние признаки
Микроскопия
Качественные реакции
Методы
2
Визуальный, органолептический
Микроскопический
1. Поперечный срез
семени чернушки поме­
щают в раствор Судана
III, накрывают покров­
ным стеклом и нагрева­
ют.
2. Микровозгонка по­
рошка
Нормы
3
В соответствии с ФС 42В соответствии с ФС 42Капли жирного и эфир­
ного масла окрашива­
ются в оранжевожелтый цвет (жирные и
эфирные масла).
Наблюдается образова­
ние красного налета на
стенках пробирки, кото­
рый при прибавлении
5% раствора натрия
гидроксида приобретет
синее окрашивание (хиноны).
Зона адсорбции желтоХроматография
ТСХ-анализ
коричневого цвета с Rf
около 0,88 (тимохинон)
УФ-спектры
1. УФ-спектр поглоще­ Максимумы в области
ния спиртового раствора 216±2нм, 254±2нми
296±2 нм.
эфирного масла (1:200)
2. УФ-спектр поглоще­ Максимумы в области
ния
жирного
масла 215±2нм и249нм.
(1:200)
ГФХ1,вып. 1, С. 285-286 Не более 7 %
Влажность
Не более 12 %
ГФХ1,вып. 1,С. 24
Зола общая
Не более 2 %
Зола нерастворимая в ГФХ1,вып. 1,С. 25
10%р-реНС1
Не более 3 %
Органические примеси ГФХ1,вып. 1,С. 276
Не более 1 %
Минеральные примеси ГФХ1,вып. 1,С276
Не менее 8,0 ЛЕ
Титриметрический
Количественное
Не менее 30 %
определение
ГФХ1
Не менее 1,5 %
ГФ XII (метод 2)
103
1
Микробиологическая
чистота
Упаковка
2
ГФ XII ОФС 42-0016-07
3
Категория 4 Б
ГФ XI, вып. 2, С. 381
ГОСТ 6077-80
Маркировка
ГФХ1,вып. 12, С. 384
ГОСТ 14192-96
Транспортировка
ГФ XI, вып. 2, С. 385
В мешки тканевые или
льно-джуто-кенафные
не более 40 кг нетто
На этикетке указывает­
ся наименование пред­
приятия-изготовителя,
его товарный знак, юри­
дический адрес, назва­
ние
лекарственного
средства на русском и
латинском языках, мас­
са 40 кг при влажности
не более 12 %, регист­
рационный номер, но­
мер серии, срок годно­
сти, условия хранения,
«Продукция прошла ра­
диационный контроль»
ГОСТ 14192-77 и ГОСТ
17768-80
4 года для сырья,
предназначенного
для
получения
препарата
«Нигедаза»,
2 года - для получения
эфирного и жирного ма­
сел
Сок годности
104
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4
1. Гравиметрически установлен состав углеводных фракций и методом
ГЖХ моносахаридный состав фракций в семенах чернушки дамасской,
среди которых преобладает гемицеллюлоза (~ 3,3 %), преимуществен­
но состоящая из ксилозы и маннозы, в водорастворимых фракциях
преобладающими являются: арабиноза, глюкоза и галактоза, при этом
ВРПС-Х (-0,5 %) представляют собой глюкогалактаны, а ВРПС-Г
(-0,6) - арабиногалактаны.
Титрометрическим методом определено содержание в ПВ (~0,5) чер­
нушки дамасской свободных (Кс) 10,2% и этерифицированных (Кэ)
3,4% карбоксильных групп соответственно. Степень этерификации (X)
при этом составляет 25,0%. Следовательно, ПВ относятся к низкоэтерифицированным пектиновым веществам. Содержание полигалактуроновой кислоты в пектиновых веществах составило 34,6±1,5 %.
2. На основании результатов оценки масличности предложены
нормы
количественного содержания липидов в семенах чернушки дамасской
(не менее 30 % ) .
Установлены
физико-химические характеристики
жирного
масла:
плотность - 0,92 г/см ; показатель преломления - 1,473; кислотное чис­
ло - 1,1; число омыления 189-197; эфирное число 187,9-195,8; йодное
число 94-97.
При изучении спектральной характеристики жирного масла максиму­
мы поглощения наблюдались при 215 и 249 нм.
Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав: основными по со­
держанию являются: линолевая (кислота семейства со-6), олеиновая (со9), пальмитиновая, эйкозадиеновая и стеариновая примерно в одинако­
вых количествах. Содержание эссенциальных кислот (ЭЖК) в семенах
чернушки дамасской составляет 24,26 %.
105
Методом ГХ-МС идентифицированы 30 компонентов, среди которых
производные ретинола, непредельных алифатических спиртов, токофе­
рола и ситостерина.
3. Содержание
пептидного комплекса составляет в среднем от 0,84 до
1,94 % , в котором идентифицированы по 6 незаменимых аминокислот,
что в сумме составляет 14,23 % (34,49 % от общей суммы). Основными
по содержанию являются глутамин, аспарагин и лейцин.
Методом гель-электрофореза определены молекулярные массы пепти­
дов от 10 до 28 кДа.
При анализе пептидных фракций методом ВЭЖХ не только уточнена
молярная масса каждого пептида, но и определено их количественное
содержание, что позволяет решать вопросы, связанные с идентифика­
цией, контролем чистоты и количественным определением.
4. В эфирном масле чернушки дамасской методом ГЖХ идентифициро­
вано 10 компонентов, что составляет 90,64 % от суммы эфирного мас­
ла. Доминирующим компонентом является р-цимол (61,83 %).
5. В результате установления ферментной активности
были получены
следующие результаты: липолитическая активность семян чернушки
дамасской составила 9,5±2,03 ЛЕ на 1 мг сырья, протеолитическая ак­
тивность белков - 17,6 ±1,35 ЕД/мг.
6. Сырье исследуемого вида богато биологически активными макро- ,
микро- и ультрамикроэлементами (27 биоэлементов), из которых 11
являются эссенциальными и 2 - условно эссенциальными.
Полученные данные свидетельствуют об активном накоплении в сы­
рье таких важнейших биогенных элементов как калий, фосфор, магний,
кальций, натрий, барий, марганец, цинк, медь и хром.
Расчет коэффициентов биологического поглощения показал, что нако­
пление семенами из почвы меди, цинка, хрома, стронция, свинца, мар­
ганца и циркония достаточно низкое (КПБ<0,1). Наиболее активно по­
глощаются, но не концентрируются - макроэлементы и гафний.
106
Содержание токсичных и потенциально-токсичных элементов не пре­
вышало разрешенных норм их наличия в препаратах растительного
происхождения.
Анализ показал, что все образцы сырья удовлетворяют требованиям
СанПиН 2.3.2 1078-01 в редакции СанПиН 2.3.2 1280-03 по содержа­
нию кадмия, свинца и ртути.
С точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы
растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают
до 1 % Cs-137 и 0,15-0,30 % Sr-90 от допустимого нормативной доку­
ментацией уровня.
7. Разработаны методики ТСХ-анализа тимохинона в эфирном масле и
его количественного определения методом ВЭЖХ с установлением валидационных характеристик.
8. Учитывая достаточно высокий выход в семенах чернушки дамасской
углеводов (до 4 %), жирного масла (до 30 %), эфирного масла (до 3 %)
данные группы
можно считать перспективными в отношении фарма­
кологических исследований и можно учитывать их в качестве целевого
продукта при комплексной переработке сырья.
9. Установлены нормы качества семян чернушки посевной: липолитическая активность не менее 8 ЛЕ; содержание жирного масла не менее
30 %; эфирного масла не менее 1,5 %; влажности не более 7 %; золы
общей не более 12 %; золы, нерастворимой в 10 % кислоте хлористо­
водородной не более 2 %; органических примесей не более 3 %; мине­
ральных примесей не более 1 %; других частей чернушки не более
0,5 %.
107
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Целью данного этапа работы явилось изучение возможности негатив­
ного влияния исследуемых субстанций на организм экспериментальных жи­
вотных и предварительный скрининг на наличие некоторых видов фармако­
логической активности. Для многокомпонентных извлечений из раститель­
ных объектов свойственно поливалентное действие на организм, что связано
с многообразием химического состава, воздействие как на этиологию патоло­
гического процесса, так и влияние на симптомокомплекс, сопровождающий
патологии, что является неоспоримым преимуществом растительных препа­
ратов, ввиду низкой токсичности, по сравнению с синтетическими лекарст­
венными средствами. Изучение возможных токсических эффектов является
обязательным этапом доклинического изучения новых композиций биологи­
чески активных веществ, в том числе и растительного происхождения, по­
зволяющим в дальнейшем сократить возможные риски на следующих стади­
ях исследовательской работы и определить возможные границы использова­
ния новых субстанций. Так иногда применение очень эффективных веществ
ограничивается их токсичностью.
Проведенные исследования позволили получить информацию о воз­
можности разработки на основе биологически активных веществ семян чер­
нушки дамасской лекарственных препаратов.
На данном этапе работы в качестве объектов исследования использова­
ли порошок семян, жирное масло, эфирное масло, сухие экстракты, получен­
ные из семян экстрагированием 40 % спиртом этиловым и водой, с после­
дующим удалением растворителя и сушкой.
5.1 Изучение «острой» токсичности
С целью определения безопасности и выбора доз для дальнейшего
фармакологического скрининга провели серию опытов по изучению «ост-
108
рой» токсичности исследуемого сырья и продуктов его переработки методом
Кербера (раздел 2.9.1).
Введение жирного масла во всех дозах не сопровождалось изменения­
ми в поведении, объемах потребляемой пищи и воды. Оценка общего состоя­
ния при осмотре животных в руках, в клетке и на открытой площадке показа­
ло отсутствие отличий от группы интактных животных по внешнему виду,
состоянию волосяного покрова, интенсивности дыхания, тонусу мускулату­
ры, двигательной активности, координации движения, а также отсутствие
любых других отклонений. Изменений в вышеуказанных характеристиках не
было как в первые сутки, так и во время всего остального периода наблюде­
ния. К концу эксперимента (14 сутки) не было отмечено летальных случаев
во всех группах животных.
Оценка макроскопического состояния внутренних органов проводилась
после окончания наблюдения аутопсированных подопытных животных. Ус­
тановлено, что у животных всех групп брюшина и плевра гладкие и блестя­
щие. Свободной жидкости и спаек в брюшной полости не обнаружено. Нет
следов раздражения, инфильтратов, изменения цвета тканей.
Содержание жира в большом сальнике и околопочечной клетчатке
крыс опытных групп значительно меньше по сравнению с контролем. У всех
аутопсированных животных легкие розового цвета, ткань легких эластична,
без очаговых изменений. Поверхность миокарда гладкая, блестящая, без оча­
говых изменений. У всех животных сердечная мышца эластичная.
Желудок вскрывался по большой кривизне, слизистая оболочка в сек­
реторном отделе после промывки складчатая; язв, геморрагии и эрозий не
обнаружено. Печень буровато-красного цвета, полнокровная. Поджелудочная
железа многодольчатого строения.
Почки обычных конфигураций и цвета. На разрезе хорошо видны кор­
ковый и мозговой слои. Чашечки, лоханка серого цвета, гладкие, блестящие.
Лоханки свободны. Надпочечники хорошо контурируются и находятся в
109
толщине жировой клетчатки. Данная картина наблюдалась и у контрольных
крыс.
Таблица 20 — Результаты определения «острой» токсичности
масла чернушки дамасской, п=6
Доза мг/кг
Выжило
Погибло
Z
D
D«Z
500
6
0
1000
6
0
0
500
0
0
1000
0
2000
6
0
0
1000
0
3000
6
0
0
1000
0
4000
6
0
0
1000
0
жирного
5000
6
0
Как видно из данных, представленных в таблице 20, введение дозы
5000 мг/кг не привело к гибели ни одного животного в течение двух недель,
следовательно, LD5o > 5000 мг/кг, т.е. жирное масло по классификации ток­
сичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner относится к 5 классу соединений - прак­
тически нетоксичным [4].
Введение эфирного масла в дозах 6000 мг/кг и выше сопровождалось
угнетением двигательной активности через 40 минут после его введения.
Животные сбивались в группы, слабо реагировали на внешние раздражители,
не принимали воду и пищу. У некоторых животных (10000-12000 мг/кг) от­
мечали нарушение координации движения, нетипичная осанка, утрата позы,
кратковременные тонические судороги. Через 3 часа выраженность данных
изменений начинала уменьшаться, и к концу первых суток и во все после­
дующие дни все исследуемые характеристики не отличались от интактных
животных. Гибель животных в опытных группах отмечалась в первые 12-20
часов после введения. Слизистые оболочки погибших животных имеют слег­
ка синюшный оттенок. При макроскопическом исследовании погибших жи­
вотных выявлена резкая гиперемия слизистой оболочки желудка и кишечни­
ка, небольшие петехиальные очаги в слизистой желудка. Сердце останови­
лось в систоле. Предположительно гибель наступила от сердечно-легочной
i
по
недостаточности вследствие паралича дыхательной и сердечной мускулату­
ры.
Рисунок 3 5 - График зависимости выживаемости животных
от введенной дозы эфирного масла семян чернушки дамасской
Макроскопическая оценка состояния внутренних органов выживших
животных через 14 суток после введения эфирного масла показала отсутст­
вие патологических изменений (картина аналогична группе животных, полу­
чавших жирное масло). LD 5 0 эфирного масла составило более 5000 мг/кг,
т.е. эфирное масло по классификации токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner
относится к 5 классу соединений - практически нетоксичным (Таблица 21).
Таблица 21 - Результаты определения «острой» токсичности
масла чернушки дамасской, п=6
Выжило
Погибло
ЛД5о с доверитель­
ным интервалом
ЛД 10
ЛД16
лд 8 4
Уровень значимости
,
1000
6
0
Исследуемые дозы, мг/кг
10000
6000
8000
3000
3
5
4
3
3
1
2
3
8149±1319
2293
3580
12718
0,05
эфирного
12000
0
6
Ill
Введение расчетных доз суспензии
измельченных семян чернушки
осуществляли дробно с интервалом в 2 часа. У животных всех опытных
групп на протяжении всего эксперимента не отмечали изменений в поведе­
нии, объемах потребляемой пищи и воды, во внешнем виде, состояние воло­
сяного покрова, интенсивности дыхания, тонусе мускулатуры, двигательной
активности, координации движения. Гибели животных не выявлено. Макро­
скопическая характеристика внутренних органов не отличается от интактных
животных. Введение возрастающих доз в диапазоне от 500 мг/кг до 5000
мг/кг не привело к гибели ни одного животного в течение двух недель, LD5o
> 5000 мг/кг, т.е. порошок семян чернушки дамасской по классификации
токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner относится к 5 классу соединений практически нетоксичным (Таблица 22).
Таблица 22 - Результаты определения «острой» токсичности
семян, п=6
Доза мг/кг
Выжило
Погибло
Z
D
D«Z
1000
6
0
500
6
0
0
500
0
1500
6
0
0
500
0
0
500
0
2000
6
0
0
2000
0
4000
6
0
0
1000
0
суспензии
5000
6
0
Введение водной суспензии сухого экстракта осуществляли дробно с
интервалом в 2 часа. У животных всех опытных групп на протяжении всего
эксперимента не отмечали изменений в поведении, объемах потребляемой
пищи и воды, во внешнем виде, состоянии волосяного покрова, интенсивно­
сти дыхания, тонусе мускулатуры, двигательной активности, координации
движения. Макроскопическая характеристика внутренних органов по истече­
нию 2-х недель после введения не отличается от интактных животных.
112
Таблица 23 — Результаты определения «острой» токсичности сухого
экстракта, п=6
Доза мг/кг
9000
500
1500
3000
4500
6500
Выжило
6
6
6
6
6
6
0
Погибло
0
0
0
0
0
Z
0
0
0
0
0
D
2500
1000
1500
1500
2000
D«Z
0
0
0
0
0
Введение дозы 9000 мг/кг не привело к гибели ни одного животного в
течение двух недель, LD5o > 5000 мг/кг, т.е. сухой экстракт по классифика­
ции токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner относится к 5 классу соединений практически нетоксичным (Таблица 23).
Введение экстрактивных веществ осуществляли дробно с интервалом в
2 часа. У животных всех опытных групп на протяжении всего эксперимента
не отмечали изменений в поведении, объемах потребляемой пищи и воды, во
внешнем виде, состояние волосяного покрова, интенсивности дыхания, тону­
се мускулатуры, двигательной активности, координации движения.
Таблица 24 - Результаты определения «острой» токсичности
экстрактивных веществ, извлеченных водой, п=6
Доза мг/кг
Выжило
Погибло
Z
D
D-Z
1500
6
0
500
6
0
0
1000
0
0
1500
0
3000
6
0
0
1500
0
4500
6
0
0
1500
0
6000
6
0
7000
6
0
0
2500
0
Макроскопическая характеристика внутренних органов по истечению
2-х недель после введения не отличается от интактных животных. Введение
максимально технически возможной дозы 7000 мг/кг не привело к гибели ни
одного животного в течение двух недель, LD5o > 5000 мг/кг, т.е. сухой экс­
тракт по классификации токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner относится к 5
классу соединений - практически нетоксичным (Таблица 24).
из
5.2 Изучение антибактериальной активности
Антибактериальную активность определяли по отношению к 10 тесткультурам методом диффузии в агар, измеряя диаметр зон угнетения роста
вокруг «колодцев» с испытуемыми образцами (см. раздел 2.9.3). Контролем
являлся спирт этиловый 40 %, который вследствие быстрого испарения и от­
сутствия в среде не давал задержки роста. Учет и интерпретацию результатов
проводили в соответствии с ГФ XII изд. [24].
Результаты исследований представлены в таблице 25.
Изучение антибактериального действия выявило преимущественно ак­
тивность спиртового извлечения и эфирного масла. Максимальную актив­
ность проявляло эфирное масло.
Абсолютным лидером по частоте включения в состав лекарственных
средств является эвкалипт [79]. Поэтому нашей задачей становилось сравне­
ние эфирного масла чернушки дамасской с эфирным маслом эвкалипта (пре­
парата сравнения).
Таблица 25 - Уровень антибактериального действия исследуемых
субстанций чернушки дамасской
Исследуемые
объекты
Извлечения
водное
Семена
чернушки
дамасской
спиртовое
эфирное
масло
жирное
масло
Диаметр зоны зеадержки роста
тест-культур миюроорганизмов, мм
2
4
9
10
6
8
1
3
5
7
±
+ + + ±
+
+ + + ±
—
—
+
—
+
+
+
—
—
—
—
—
+
+
+
—
+
+
±
+
+
+
+
±
±
—
+
+
—
+
Примечание: «—» - отсутствие роста (>12 мм); «±» - слабый рост (-10-12 мм); «+» такой оке рост как в контроле; используемые тест-культуры: 1. Staphylo­
coccus aureus (209); 2. Staphylococcus aureus (Макаров); 3. Staphylococcus au­
reus (Type); 4. Staphylococcus epidermides Wood-46; 5. Escherichia coli 675; 6.
Salmonella typhimurium; 7. Shigellaflexneri266; 8. Shigella sonnei; 9. Bacillus
subtilis L2; 10. Bacillus antracoides-96.
Оценку результатов проводили по диаметру зон задержки роста вокруг
«колодца», включая диаметр самого «колодца»: отсутствие зоны задержки
114
роста - испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации пре­
парата; диаметр зоны задержки роста 10 мм - умеренная чувствительность
культуры к данной концентрации препарата; диаметр зоны задержки роста
более 10 мм - высокая чувствительность испытуемой культуры к данной
концентрации препарата.
В качестве растворителя использовали спирт этиловый 96 % в соотно­
шении 1:5. В качестве контроля растворителя использовали спирт этиловый
96 %, который не давал задержки роста микроорганизмов вследствие быстро­
го испарения и последующего отсутствия в питательных средах.
Результаты исследований представлены в таблице 26.
Таблица 26 - Уровень антибактериального действия эфирного масла
чернушки дамасской
Эфирное масло
чернушки дамасской
эвкалипта
1
2
11
Диаметр зоны задержки роста
тест-культур микроорганизмов, мм
2
3
8
10
4
5
6
7
9
22 25 12 15 18 18 42 22 27
12 14 18 15 12 10 20 22 22
11
26
10
Примечание: используемые тест-культуры: 1. Staphylococcus aureus (209); 2. Staphylo­
coccus aureus (Макаров); 3. Staphylococcus aureus (Type); 4. Staphylococcus
epidermidis Wood-46; 5. Escherichia coli 675; 6. Escherichia coli 055; 7. Salmo­
nella galenarum; 8. Bacillus subtilis L2; 9. Bacillus anthracoides - 1; 10. Bacillus
anthracoides — 96; 11. Proteus vulgaris.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельству­
ют о наличии у чернушки дамасской широкого спектра антибактериальной
активности, что дает основание для ее дальнейшего углубленного изучения в
качестве потенциального противомикробного средства для лечения заболе­
ваний кожи и слизистых, вызванных патогенными стафилококками, энтеробактериями и бациллами.
5.3 Изучение ранозаживляющей активности
На первые сутки после нанесения ожоговой травмы (Таблица 27) у всех
животных образуется струп серо-бурого цвета, плотно соединенный с краями
раны. Измерение весовых характеристик раны, которые производилось уже
Л*
I
к
115
на первые сутки после нанесения ожога, показало, что размеры ожогов у жи­
вотных, обрабатываемых жирным маслом чернушки дамасской достоверно
меньше (на 27 %) по сравнению с животными из контрольной группы. Исхо­
дя из этого, можно говорить о том, что жирное масло чернушки дамасской
уменьшает развитие воспалительного процесса при нанесении ее сразу после
термического воздействия. На четвертые сутки эксперимента весовые пока­
затели ран сократились в группе животных, леченных жирным маслом чер­
нушки дамасской на 53 % по отношению к контролю. В группе с облепихо­
вым маслом также происходило уменьшение размеров ожогов, но эти изме­
нения достоверно не отличались от контрольных значений. На 7-е сутки, по­
сле снятия струпа, у животных, получавших жирное масло чернушки, дно
раны было чистым, розового цвета и находилось на уровне кожных краев. К
этому времени у животных, леченных облепиховым маслом, струп отошел
частично лишь у нескольких особей, а у контроля этого и вовсе не наблюда­
лось. При изучении весовых характеристик размеров ран на седьмые сутки
после нанесения ожога, у животных, для лечения которых использовали
жирное масло чернушки дамасской, наблюдалось снижение размеров повре­
ждения на 73 %, а при использовании облепихового масла этот показатель
уменьшился на 58 % соответственно. В контрольной группе животных раз­
меры ожоговых поверхностей за этот период значительно не изменились.
Следует отметить, что эффективность действия исследуемого жирного масла
была достоверно выше эффективности действия масла облепихового.
Дальнейшие измерения размеров ран не производились, так как уже на
10 сутки
в группе животных, лечение которых проводилось при помощи
жирного масла чернушки дамасской, наступило полное заживление пора­
женных участков и началось восстановление волосяного покрова. В то же
время у животных, леченных облепиховым маслом, поврежденные участки
кожи восстановились примерно на 13-14 сутки с начала эксперимента.
116
Таблица 27 - Влияние жирного масла чернушки дамасской на размеры
ожогов в весовых показателях, мг
Период
1сутки
Контроль,
11=8
175,5±11,86
4суток
170,6±9,60
7суток
146,3±11,28
Жирное масло чернушки,
п=8
130,4±8,03
* - 27 %
80,3±4,56
* -53 %
39,4±4,21
* -73 %
Облепиховое
масло, п=8
162,6±12,79
-7%
138,5±19,08
-19%
60,8±5,43
*-58 %
Примечание: * — достоверно (Р<0,05 ) по отношению к контрольной группе животных;
п - количество животных в группе
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показа­
ли, что жирное масло чернушки дамасской стимулирует репаративную реге­
нерацию кожи при ее термическом повреждении и по эффективности дейст­
вия превосходит облепиховое масло, которое довольно широко используется
для лечения термических ожогов, и может быть рекомендовано в качестве
эффективного средства для лечения термических ожогов.
5.4 Изучение гиполипидемической активности
Учитывая особенности химического состава и данные по использова­
нию извлечений из чернушки дамасской, представилось интересным провес­
ти изучение влияния курсового введения жирного масла и сухого экстракта
на некоторые показатели сыворотки крови, характеризующие состояние липидного обмена, в условиях экспериментальной гиперлипидемии. В скрининговых исследованиях, проведенных на кафедре биологической химии и
микробиологии ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития уста­
новлено, что наиболее эффективно исследуемые объекты снижают концен­
трацию холестерина на фоне экспериментальной алиментарной гиперхолестеренемии в дозе 200 мг/кг для экстракта и в дозе 100 мг/кг для жирного
масла. Дальнейшее увеличение доз не сопровождалось усилением фармако-
117
логической активности. В связи, с чем данные дозы вышеуказанных объектов
были изучены в данном исследовании.
Как видно из данных, представленных в таблице 28, однократное внутрибрюшинное введение твина-80 сопровождалось развитием выраженной
гиперлипидемии. Так, у животных контрольной группы отмечали достовер­
ное, по отношению к интакным значениям, увеличение содержания в крови р
и пре-р-ЛП на 305 %, а так же ТРГ и общего холестерина на 72 % и 54 % со­
ответственно. Данные изменения липидного спектра сыворотки крови соот­
ветствуют картине гиперлипопротеидемии 2-го типа А подтипа по классифи­
кации Фредриксона, принятой Всемирной организацией здравоохранения и
основанной на фенотипических характеристиках сыворотки при нарушениях
липидного обмена [54].
Лечебно-профилактическое введение жирного масла в дозе 100 мг/кг
привело к достоверному, по сравнению с контролем, снижению содержания
холестерина в сыворотке крови на 29 %. Отмечали некоторую тенденцию к
снижению содержания в крови Р и пре-Р-ЛП, но эти изменения были не дос­
товерны, и их уровень, как и уровеньТРГ, был выше аналогичных значений у
интактных животных.
В группе животных, получавших сухой экстракт в дозе 200 мг/кг, от­
мечали восстановление до нормального уровня содержания холестерина в
крови, а также достоверное уменьшение концентрации р и пре-Р-ЛП и ТРГ на
39 % и 31 % соответственно.
Таким образом, в условиях твиновой гиперлипидемии жирное масло
проявило гипохолестеренемическое действие, а сухой экстракт дополнитель­
но нивелировал патологические сдвиги и других липидных показателей кро­
ви.
118
Таблица 28 - Влияние жирного масла и сухого экстракта чернушки
дамасской на состояние показателей липидного обмена
в крови на фоне твиноеой гиперлипидемии
Группы
животных
Интактные, п=6
Контроль, п=13
Р и пре-р-ЛП
крови, г/л
0,81+0,120
3,28+0,315
Ри<0,001
+305 %
Показатели
ТРГ крови,
ммоль/л
1,35+0,064
2,32+0,186
Ри<0,05
+72 %
Жирное масло,
100 мг/кг, п=6
2,48+0,210
Рк>0,05
2,08+0,112
Рк>0,05
Сухой экстракт,
200 мг/кг, п=6
2,00+0,180
Рк<0,01
-39 %
1,72+0,0,103
Рк<0,01
-26 %
Холестерин крови,
ммоль/л
1,45+0,126
2,23+0,174
Ри<0,05
+54 %
1,58+0,091
Рк<0,01
-29 %
1,52+0,114
Рк<0,01
|
-31%
Примечание: Ри -уровень достоверной разницы по отношению к интактным
значениям; Рк -уровень достоверной разницы по отношению к
контрольным значениям; п - количество животных в группе
5.5 Изучение гепатозащитной активности
На основании изученных данных литературы, очевидно, что в послед­
ние годы значительно вырос удельный вес гастроэнтерологических заболе­
ваний, до 50% которых приходятся на болезни печени. В РФ заболеваемость
гепатитами различных форм только за истекший год выросла на 15%, а среди
детей - на 50%. При лечении патологии печени в медицине применяют раз­
личные препараты, разнонаправлено действующие на гепатоциты [11]. В на­
стоящее время в соответствии с современной классификацией лекарственных
средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний печени, вы­
деляют группу препаратов, называемых гепатопротекторами, обладающих
избирательным терапевтическим действием на печень. К ним относятся легалон, силибор, катерген, эссенциале и некоторые другие препараты [66]. На
сегодняшний день на фармацевтическом рынке России доминируют зару­
бежные лекарственные средства, а доля отечественных гепатопротекторов
составляет примерно 1/5 часть [121, 138].
I:
119
Таким образом, в связи с распространением наркомании и алкоголизма
среди населения, неблагоприятных химических воздействий на организм, на­
рушения принципов сбалансированного питания, бесконтрольным примене­
нием медикаментов, недостаточной эффективностью существующих гепатопротекторов, поиск новых препаратов, повышающих устойчивость печени к
действию физико-химических агентов и нормализующих ее метаболизм,
имеет особое социальное значение.
При этом в первую очередь предпочтение отдается препаратам расти­
тельного происхождения, сочетающим достаточно высокую эффективность,
широту терапевтического действия и относительную безвредность, часто
оказывающим положительное влияние на течение сопутствующей патологии.
В предварительных скрининговых исследованиях фитосубстанций чер­
нушки дамасской при введении на фоне острой тетрахлорметановой инток­
сикации у мышей установлено максимальное снижение летальности при ис­
пользовании сухого экстракта в дозе 450 мг/кг и жирного масла в дозе
220 мг/кг. Остальные субстанции не повлияли на изменение процента выжи­
ваемости животных. В пересчете на крыс с учетом коэффициента межвидо­
вого переноса доз это составило 200 мг/кг для экстракта и 100 мг/кг жирного
масла, аналогично эффективным дозам, использованным при эксперимен­
тальной гиперлипидемии. Данные дозы были использованы при дальнейшем
изучении гепатозащитной активности.
В результате проведённого исследования было установлено (Таблица
29): у нелеченных (контроль) животных под влиянием СС14 развивался ост­
рый гепатоз, с характерными изменениями биохимического профиля крови и
печени: рост в крови активности АлАт по сравнению с интактным уровнем
на 128%, трехкратное повышение активности такого фермента ЩФ, а также
повышение содержания в крови общего и прямого билирубина на 87% и
268% соответственно. На фоне острого СС14-гепатоза отмечали сдвиг липидных показателей: увеличение уровня ТРГ в крови и в печени на 58% и 168%
120
соответственно, развитие гиперхолестеринемии (двукратный рост уровня хо­
лестерина в крови).
Таблица 29 - Изменение биохимических показателей сыворотки крови и
печени на фоне введения фитосубстанций чернушки дамас­
ской при острой тетрахлорметановой
интоксикации
Показатели
Интактные,
п=6
Группы животных
СС14-гепатоз CCU-гепатоз +
(контроль),
сухой экстракт,
п=6
200 мг/кг,
п=5
124,3±9,46
82,3+5,46
** +128 %
*-51 %
586,4±19,74
511,2+24,36
**+218%
СС14-гепатоз+
жирное масло,
100 мг/кг,
п—5
91,2+7,63
*-27 %
341,5+21,14
*-42 %
АлАт сыворотки
54,6±2,48
крови, Е/л
ЩФ сыворотки
184,3±11,24
крови, Е/л
Общий билирубин
13,2+0,09
10,2±1,21
19,1+1,10
13,4+0,09
сыворотки крови,
**+87 %
*-31 %
*-30 %
мкмоль/л
Прямой билирубин
3,20+0,18
1,70+0,117
сыворотки крови,
0,87±0,040
2,87+0,265
**+268 %
*-47 %
мкмоль/л
Холестерин сыво­
3,20+0,280
2,04+0,232
1,82+0,147
ротки крови,
1,60±0,53
**+100 %
*-36 %
*-43 %
ммоль/л
Триглицериды
1,17+0,104
1,90+0,155
1,20±0,014
1,78+0,21
сыворотки крови,
**+58 %
*-38 %
ммоль/л
Триглицериды пе­
28,4+1,38
21,2+1,19
39,4+3,25
14,7±2,50
чени, мкмоль/г
**+168%
*-28%
*-46%
0,45+0,039
ТБК- активные
0,24+0,0202
0,38+0,028
продукты печени,
0,21±0,021
**+114%
*-47%
нмоль/мг белка
Примечание: * - достоверно (Р<0,05 ) по отношению к контрольной группе животных;
** - достоверно (Р<0,05) по отношению к интактной группе животных;
п - количество животных в группе
Дополнительно в контрольной группе отмечали интенсификацию ПОЛ,
о чем свидетельствовало увеличение на 114% по отношению к интактным
значениям количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой
(ТБК-продукты). Усиление процессов пероксидации на фоне введения гепатотоксина (ССЦ) имеет основополагающее значение в патогенезе острого
токсического поражения печени [35, 37, 111]. Срыв компенсаторных меха­
низмов эндогенной антиоксидантной системы, которая не в состоянии спра-
121
виться с накоплением перекисных продуктов, является ключевым механиз­
мом, вызывающим повреждение мембран [12, 13] и, как следствие, развитие
цитолитического процесса.
Таким образом, вышеописанные изменения биохимического статуса на
фоне введения СС1 4 свидетельствуют о серьезных нарушениях в работе пе­
чени, сопровождающихся цитолизом, холестатическими явлениями (рост
уровня ЩФ, общего билирубина и его фракций), серьезными изменениями со
стороны показателей липидного обмена. Оценка уровня летальности показа­
ла, что в контрольной группе ее значения достигли 30%, а в опытных - всего
лишь 17%.
Использование сухого экстракта в дозе 200 мг/кг не повлияло на актив­
ность ЩФ и содержание прямого билирубина. В данной группе животных
отмечали снижение активности АлАт в крови на 51% и ТБК-активных про­
дуктов в печени на 47%. Изменения коснулись и показателей липидного об­
мена, так уровень ТРГ в крови и в печени уменьшился на 38% и 28%) соот­
ветственно, а интенсивности гиперхолестеринемии уменьшилась на 36%.
Таким образом, применение сухого экстракта на фоне воспроизведения
модели острого СС14-поражения печени сдерживало развитие цитолиза и холестаза, т.к. привело к сдвигу большинства изученных биохимических пока­
зателей в сторону нормализации: отмечали снижение интенсивности ПОЛ в
печени, уменьшение выраженности цитолитических процессов и гипербилирубинемии в первую очередь за счет снижения концентрации фракции сво­
бодного билирубина, без значительного влияния на выраженность холестатических процессов (отсутствие достоверных отличий от контрольных зна­
чений активности ЩФ и содержания прямого билирубина).
Применение жирного масла чернушки дамасской на фоне острого тетрахлорметанового гепатоза сопровождалось достоверным уменьшением гиперферментемии (снижение активности АлАт и ЩФ на 27% и 42% соответ­
ственно), интенсивности билирубинемии (снижение концентрации общего и
122
прямого билирубина на 31% и 47% соответственно), уменьшением количест­
ва холестерина в крови (на 43%) и ТРГ в печени (на 46%). Показатель, харак­
теризующий выраженность свободно-радикальных процессов (ТБК-активные
продукты) в печени, достоверно не отличался от контрольных значений.
Таким образом, оба исследуемых объекта в условиях тетрахлорметановой интоксикации оказывают защитное влияние на печень, отличающееся по
направленности воздействия на различные звенья патогенеза данного пора­
жения, что, по-видимому, связано с особенностями их химического состава.
Если сухой экстракт более эффективно подавляет развитие ПОЛ, уменьшая
повреждения мембран гепатоцитов и препятствуя их цитолизу, то жирное
масло в меньшей степени оказывает антиоксидантное действие (сохраняю­
щийся высокий уровень ТБК-активных продуктов в печени) и, скорее всего,
уменьшает интенсивность цитолитических процессов за счет репарации по­
врежденных фрагментов мембраны гепатоцитов благодаря своему жирнокислотному составу, а также в большей степени, по сравнению с экстрактом,
уменьшает выраженность холестаза.
5.6 Изучение желчегонной активности
Желчегонную активность экстракта и жирного масла изучали в дозах, в
которых они проявили максимальную гепатопротекторную активность соот­
ветственно 200 мг/кг и 100 мг/кг. Эфирное масло также было подвергнуто
исследованиям на наличие желчегонной активности, так как для одного из
компонентов - тимохинона - показан данный вид активности. Эфирное мас­
ло было исследовано в серии возрастающих доз: 20 мг/кг, 50 мг/кг, 100
мг/кг, 200 мг/кг, 400 мг/кг, 800 мг/кг.
Введение сухого экстракта здоровым животным не сопровождалось
увеличением объемов выделяемой желчи. В группе животных, получавших
жирное масло, отмечали достоверное увеличения количества желчи на 27%
(Таблица 30).
123
Таблица 30 — Влияние субстанций чернушки дамасской на желчевыделительную функцию печени в норме
Интактные + жирное
Показатель
масло, 60 мг/кг,
п=6
620,8±37,20
Общее количество
490,4
458,1±88,50
Ри<0,05
желчи за 3 ч. мг/100 г
Ри>0,05
±35,81
+27%
Примечание: Рц- уровень достоверной разницы по отношению к интактным
значениям; п - количество животных в группе.
Интактные,
п=6
Интактные + сухой
экстракт, 200 мг/кг,
п=6
Введение возрастающих доз эфирного масла привело к достоверному
увеличению желчной секреции при использовании доз 200 мг/кг и 400 мг/кг.
При дальнейшем увеличении количества вводимого эфирного масла желче­
гонная активность не проявляется (Таблица 31).
Таблица 31 — Влияние эфирного масла чернушки дамасской на желчевыделителъную функцию печени в норме
Показа­
тель
Общее ко­
личество
желчи за 3 ч
мг/100 г
Интакт­ Интакт­ Интакт­ Интакт­ Интакт­ Интакт­
ные +
ные +
ные +
ные +
ные +
ные +
Интакт­
эфирное эфирное эфирное эфирное эфирное эфирное
ные,
масло, 20 масло, 50 масло, 100 иасло, 200 иасло, 400 масло,800
п=6
мг/кг,
мг/кг,
мг/кг,
мг/кг,
мг/кг,
мг/кг,
п=6
п=6
п=6
п=6
п=6
п=6
490,4
±35,81
430,4
±41,32
510,6
±80,65
465,7
±38,50
640,2
±45,62
Ри<0,0
5
+31%
660,7
±70,24
Ри<0,0
5
+35 %
540,6
±30,87
Примечание: Ри -уровень достоверной разницы по отношению к интактным
значениям; п - количество животных в группе.
Таким образом, в данной экспериментальной серии установлено, что
жирное и эфирное масло проявляют желчегонную активность.
124
5.7 Изучение диуретической активности
Лекарственные препараты диуретического действия широко использу­
ются для лечения отеков, сердечной недостаточности, гипертонической бо­
лезни, нарушений вводно-солевого гомеостаза и др. Данные об использова­
нии водных извлечений из различных видов чернушки побудили нас провес­
ти изучение мочегонной активности (Таблица 32).
Таблица 32 - Влияние водного извлечения из семян чернушки дамасской на
выделение мочи в норме, п=6
Показате­
ли
интактные
водное
извлече­
ние,
1 мл/кг
Исследиремые группы, (доза)
водное
водное
водное
водное
извле­
извле­
извле­
извле­
чение,
чение,
чение,
чение,
2 мл/кг 3 мл/кг 4 мл/кг 5 мл/кг
водное
извле­
чение,
6 мл/кг
водное
извле­
чение,
8 мл/кг
Объем мочи
7,4
3,9
5,8
4,4
7,2
6,3
7,0
4,1
за 2 часа,
±1,06*
±0,98
±0,42
±1,12
±0,67*
±0,44*
±0,56*
±1,25
мл/200 г
Примечание: * — достоверно (Р<0,05) по отношению к интактной группе животных;
п - количество животных в группе
Установлено, что введение водного извлечения в дозах, превышающих
4 мл/кг, привело к увеличению выделяемой мочи у здоровых животных.
125
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5
1.
Все исследуемые фитосубстанции чернушки дамасской относятся по
классификации токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner к 5 классу со­
единений - практически нетоксичным (значения LD 5 0 во всех случаях
более 5000 мг/кг).
2.
Изучение антибактериального действия выявило преимущественно
активность спиртового извлечения и эфирного масла. Максимальную
активность проявляло эфирное масло.
3.
Проведенные экспериментальные исследования показали, что жирное
масло чернушки дамасской стимулирует репаративную регенерацию
кожи при ее термическом повреждении и по эффективности действия
превосходит облепиховое масло.
4.
Лечебно-профилактическое введение жирного масла в дозе 100 мг/кг
привело к достоверному, по сравнению с контролем, снижению со­
держания холестерина в сыворотке крови на 29 %.
5.
В группе животных, получавших сухой экстракт в дозе 200 мг/кг, от­
мечали восстановление до нормального уровня содержания холесте­
рина в крови, а также достоверное уменьшение концентрации р и преР-ЛП и ТРГ н а 3 9 % и 3 1 % соответственно.
6.
Применение жирного масла чернушки дамасской на фоне острого
тетрахлорметанового гепатоза сопровождалось достоверным умень­
шением гиперферментемии (снижение активности АлАт и ЩФ на
27 % и 42 % соответственно), интенсивности билирубинемии (сниже­
ние концентрации общего и прямого билирубина на 31 % и 47 % со­
ответственно), уменьшением количества холестерина в крови (на 43
%) и ТРГ в печени (на 46 %). Показатель, характеризующий выражен­
ность свободно-радикальных процессов (ТБК-активные продукты) в
печени, достоверно не отличался от контрольных значений.
126
7.
При лечебно-профилактическом введении крысам сухого экстракта в
дозе 200 мг/кг такие показатели как активность ЩФ, содержание пря­
мого билирубина в сыворотке крови остались на уровне значений
контрольной группы животных, поскольку достоверно от них не от­
личались, активность же АлАт даже была достоверно ниже на 51 %
уровня контроля. У крыс данной опытной группы, также отмечалось
достоверное снижение ТБК-активных продуктов и ТРГ в печени на 47
% и 28 % соответственно, снижение холестерина и ТРГ в крови соот­
ветственно на 36 % и 38 %.
8.
В группе животных, получавших жирное масло, отмечали достовер­
ное увеличения количества желчи на 27 %.
9.
Введение возрастающих доз эфирного масла привело к достоверному
увеличению желчной секреции при использовании доз 200 мг/кг и 400
мг/кг.
10. Установлено, что введение водного извлечения в дозах, превышаю­
щих 4 мл/кг, привело к увеличению выделяемой мочи у здоровых жи­
вотных.
127
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
Химические исследования чернушки дамасской в большей мере прово­
дились только в отношении ферментов. Хорошо изучены приемы возде­
лывания, интродукции, агротехники, что позволяет ввести чернушку да­
масскую в промышленную культуру. Установленная фармакологическая
активность позволяет рекомендовать ее для использования в терапии за­
болеваний, в том числе социально значимых. Поэтому чернушка дамас­
ская является перспективным лекарственным растением для введения в
отечественную медицинскую практику и включения в ГФ РФ XII изда­
ния.
Проведено комплексное фитохимическое изучение с использованием раз­
личных физико-химических методов, в результате которых выделены и
изучены углеводы, липиды, эфирное масло, пептиды, установлена фер­
ментная активность и макро- и микроэлементный состав.
- Выделены и изучены различные фракции полисахаридных комплексов
семян Nigella damascena: ВРПС-Х (выход составил от 0,37% до 0,57%),
ВРПС-Г (от 0,37% до 0,55%), ПВ (0,38-0,52%) и ГЦ (2,97-3,37%).
Изучен их качественный и количественный моносахаридный состав
методом ГЖХ. Определены физико-химические характеристики пек­
тинов.
- Изучен липидный комплекс семян Nigella damascena, выращенной в
Ставропольском крае, с определением физико-химических показателей
жирного масла. Установлен компонентный состав нейтральных липидов методом ГЖХ (основными по содержанию являются жирные ки­
слоты: линолевая (47,44 %), олеиновая (25,66 %) и пальмитиновая
(14,65 %). Методом ГХ-МС идентифицированы 30 компонентов, среди
которых производные ретинола, токоферола и ситостерина.
128
- Разработана
методика
экстракции
пептидов
из
семян
Nigella
damascena, на основе которой получены пептидные экстракты и уста­
новлен их аминокислотный состав (содержание пептидного комплекса
составило от 0,84 до 1,94%). Методами гель-электрофореза и ВЭЖХ
определены молекулярные массы пептидов и их количество.
- Изучен химический состав эфирного масла семян Nigella damascena,
выращенной в Ставропольском крае, методом ГЖХ (содержание со­
ставляет до 3 %). Установлены показатели подлинности эфирного мас­
ла. Разработана методика определения тимохинона в эфирном масле
методом ВЭЖХ с валидационной оценкой.
- Подтверждена липолитическая активность (9,5 ЛЕ/мг) и впервые уста­
новлена протеолитическая активность белков семян Nigella damascena
(17,6ЕД/мг).
- Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор мак­
ро- и микроэлементов в семенах Nigella damascena (27 элементов).
3. По итогам проведенных фитохимических и фармакологических исследо­
ваний в качестве приоритетных групп биологически активных комплек­
сов и перспективных в отношении создания на их основе фармацевтиче­
ских субстанций, обладающих фармакологической активностью, опреде­
лили: ферменты, эфирные и жирные масла.
-
Разработаны числовые показатели, определены микробиологическая
чистота, содержание тяжелых металлов и радионуклидов, регламен­
тирующие качество сырья «Чернушки дамасской семена».
-
На основании морфолого-анатомического исследования уточнены
морфологические и выявлены диагностически значимые анатомиче­
ские признаки, позволяющие проводить диагностику семян Nigella
damascena цельного сырья и в виде порошка.
129
4. Проведены фармакологические скрининговые исследования различных
субстанций на основе исследуемого сырья, что может являться рекомен­
дацией для получения новых фитопрепаратов, обладающих антибактери­
альным,
ранозаживляющим,
гиполипидемическим,
гепатозащитным,
желчегонным и диуретическим действием. Исследование острой токсич­
ности показало, что данные субстанции относятся к классу практически
нетоксичных.
5. На основании проведенных исследований разработаны проекты норма­
тивной документации: ФС «Чернушки дамасской семена», Инструкция по
сбору и сушке сырья «Чернушки дамасской семена».
130
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Экспериментально обоснована возможность использования семян Nigella damascena, выращенной в Ставропольском крае, в качестве источников
БАС, относящихся к различным классам соединений и обладающих фарма­
кологической активностью. Полученные данные могут быть рекомендованы
для использования в деятельности фармацевтических производств в РФ.
Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования
включают в себя научно-исследовательские направления, заключающиеся в
разработке и внедрении новых отечественных препаратов.
131
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Анализ факторов, определяющих снижение доступности Cs-137 для
включения в сельскохозяйственные пищевые цепочки / СВ. Фесенко [и
др.]//ДАН РФ. - М , 1995.-Т. 343, № 5 . - С . 715-718.
2.
Антропогенные воздействия на лекарственные растения / С.А. Листов [и
др.] - М : МЗ СССР, 1990.-106 с.
3.
Бадяев, В.В. Охрана окружающей среды при эксплуатации АЭС /В.В.
Бадяев, Ю.А. Егоров, С В . Казаков. - М . : Энергоатомиздат, 1990-224 с.
4.
Березовская, И.В. Классификация химических веществ по параметрам
острой токсичности при парентеральных способах введения / И.В. Бере­
зовская // Хим.-фармац. журн. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 32-34.
5.
Брага, П.К. Тимол: антибактериальная, противогрибковая и антиоксидантная активность / П.К. Брага // 12-й Всемирный конгресс
по репродукции человека 10-13 марта 2005 г. - Венеция, Италия, 2005. С. 115-117.
6.
Бузина, Г.В. Титрометрический метод количественной и качественной
характеристики пектиновых веществ / Г.В. Бузина, О.Ф. Иванова, Л.Б.
Сосновский // Хлебопекарная и кондитерская пром-сть. - 1965. — № 4. —
С 15-18.
7.
Вайс, Р.Д. Фитотерапия. Руководство: пер. с нем. / Р.Д. Вайс, Ф.М. Финтельман. - М.: Медицина, 2004. - 552 с.
8.
Васюков, В. М. Растения Пензенской области (конспект флоры): Моно­
графия / В.М. Васюков. - Пенза: Изд-во Пенз. гос. ун-тета, 2004. - С
138.
9.
Васюков, В.М. Конспект культивируемых растений Пензенской области
/ В.М. Васюков // Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной
экологии. - 2010. - Т. 19, № 2. - С. 44-82.
10. Васюков, В.М. Культивируемые растения Пензенской области / В.М.
Васюков, P.P. Канеев // Изучение флоры Восточной Европы: достижения
и перспективы: тез. докл. Междунар. конф. 23-28 мая 2005 г. - М., СПб.:
Товарищество научных изданий КМК, 2005. - С. 16-17.
11. Венгеровский, А.И. Механизм действия гепатопротекторов при токсиче­
ских поражениях печени / А.И. Венгеровский, А.С Саратиков // Фармакол. и токсикол. - 1988. - Т. 51, № 1. - С. 89-92.
12. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
13. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Вла­
димиров // Вестник Российской академии медицинских наук. - М: Ме­
дицина, 1998.-Вып. 7 . - С 43-51.
132
14. Войткевич, С.А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии / С.А.
Войткевич. - М.: Пищ. пром-сть, 2001. - 283 с.
15. Вульф, Е.В. Мировые ресурсы полезных растений (Пищевые, кормовые,
технические, лекарственные и др.): справочник / Е.В. Вульф, О.Ф. Ма­
леева. - Л.: Наука, 1969. - 569 с.
16. Выделение и изучение фермента липазы из семян чернушки посевной /
Т.В. Орловская [и др.] // Регион, конф. по фармации, фармакологии и
подготовке кадров (57; 2002; Пятигорск): материалы... - Пятигорск,
2002.-С. 18-19.
17. Гепатозащитное действие гранул сухого экстракта горечавника борода­
того / С М . Николаев [и др.] // Эксперим. и клин, фармакол. - 2001. - Т.
64, № 1 . - С. 49-52.
18. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. - Введ. 1988-02-08. - М.: Стандартинформ,
1988.-15 с.
19. ГОСТ 30178-96. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный
метод определения токсичных элементов. - Введ. 1998-01-01. - М.:
Стандартинформ, 2010. - 10 с.
20. ГОСТ 5479-64. Масла растительные и натуральные жирные кислоты.
Метод определения неомыляемых веществ. - Введ. 1965-07-01. - Минск:
Межгос. совет по стандартизации, метрологии и сертификации, 1966. С. 42-44.
21. ГОСТ Р 53434-2009. Принципы надлежащей лабораторной практики. Введ. 2010-03-01. - М . : Стандартинформ, 2010. - 16 с.
22. Государственная Фармакопея КНР (на английском
2005.-668 с.
языке) - Пекин,
23. Государственная фармакопея Российской Федерации. - 12-е изд. - М.:
Науч. центр экспертизы средств мед. применения, 2007. - Ч. 1. - 704 с.
24. Государственная фармакопея Российской Федерации. - 12-е изд. - М.:
Науч. центр экспертизы средств мед. применения, 2010. - Ч. 2. - 678 с.
25. Государственная фармакопея СССР. - 10-е изд. - М.: Медгиз, 1968. 1081 с.
26. Государственная фармакопея СССР: в 2 вып. - 11-е изд. - М.: Медици­
на, 1987-1989.-2 вып.
27. Гравель, И.В. Региональные проблемы экологической оценки лекарст­
венного растительного сырья и фитопрепаратов на примере Алтайского
края: дис. ... докт. фармац. наук: 15.00.02 / Гравель И. В. - Москва, 2005.
-395 с.
i
4
133
28. Дикорастущие полезные растения России / отв. ред. А.Л. Буданцев, Е.Е.
Лесиовская. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2001. - 663 с.
29. Дополнения и изменения № 5 к санитарно-эпидемическим правилам
СанПин 2.3.3 1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пище­
вой ценности пищевых продуктов» СанПин 2.3.2.2227-07. - М., 2007. 261с.
30. Ефремова, М.П. Изучение влияния жирных масел чернушки дамасской и
посевной на ЦНС и актопротекторный эффект в эксперименте / М.П. Еф­
ремова, СЮ. Маширова, А.В. Сергеенко // Разработка, исследование и
маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск,
2012. - Вып. 67. - С. 328-329.
31. Ефремова, М.П. Экспериментальные исследования общетоксических
свойств жирных масел чернушки дамасской и посевной / Ефремова М.П.,
Сергиенко А.В., Маширова С Ю . // Экология и здоровье: сб. науч. тр. D
Ессентуки.-2010.-Вып. 1 4 . - С 127-131.
32. Жбанков, Р.Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов / Р.Г.
Жбанков. - Минск: Наука и техника, 1972. - 456 с.
33. Зависимость колориметрической реакции галактуроновой кислоты и
нейтральных моносахаридов с карбазолом от условий ее проведения /
М.П. Филиппов [и др.] // Изв. АН МССР: Сер. биол. и хим. наук. - 1976.
- № 1 . - С 75-86.
34. Зайцев, Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике
/ Г.Н. Зайцев. - М.: Наука, 1984. - 424 с.
35. Защитное действие комбинации эссенциале диэтилникотинамидом на
монооксигеназы и глюкуранил-, глутатионтрансферазы печени крыс при
тетрахлорметановом поражении / М.И. Бушма [и др.] // Эксперим. и
клин, фармакол. - 1994. - Т. 57, № 4. - С. 62-63.
36. Зенкевич, И.Г. Способ получения метиловых эфиров для газохроматографического определения жирных кислот в составе триглицеридов ма­
сел растений / И.Г. Зенкевич, А.И. Пименов, Н.М. Станкевич // Актуаль­
ные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного
происхождения: материалы 7 Междунар. съезда 3-5 июля 2003 г. - Спб.,
2003.-С. 339-344.
37. Изменения морфофункционального состояния печени крыс при острой
интоксикации тетрохлорметаном и их коррекция антигипоксантами, ан­
тиоксид антами и ангиопротекторами / А.Ю. Дубовая [и др.] // Эксперим.
и клин, фармакол. - 1996. - Т. 59, № 4. - С. 51-54.
38. Изучение антибактериального и ранозаживляющего действия чернушки
посевной / Б.А. Узденова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг
134
новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2006. —
Вып. 6 1 . - С . 392-394.
39. Изучение химического состава некоторых пищевых растений, культиви­
руемых в Ставропольском крае / В.А. Челомбитько [и др.] // Вопросы
биол., мед. и фармац. химии. - 2012. - № 4. - С. 44-47.
40. Использование нингидриновой реакции для количественного определе­
ния а-аминокислот в различных объектах: метод, рекомендации / А.В.
Симонян [и др.]. - Волгоград, 2007. - 106 с.
41. Исследование биоактивных пептидов из некоторых видов растений /
Т.В. Орловская [и др.] // Химия природ, соединений. - 2010. - № 2. - С.
276-277.
42. Исследование топографии активного центра липазы из Nigella
damascena L. (чернушка дамасская) / И.В. Гмошинский [и др.] // Биоор­
ган, химия. - 1982. - Т. 8, № 6. - С. 822-829.
43. Итоги интродукции культурных растений в Главном ботаническом саду
/ Отв. ред. Б.Н. Головкин. - М.: Наука, 1988. - 304 с.
44. Каухова, И.Е. Новая методика получения растительных препаратов /
И.Е. Каухова // Фармация. - 2006. - № 1. - С. 37-39.
45. Клепцова, И.А. Эколого-гигиеническая оценка техногенного загрязнения
лекарственного растительного сырья (на примере Томского района): дис.
... канд. мед. наук: 14.00.07 / Клепцова И.А. - Томск, 2001. - 118 с.
46. Конь, И.Я. Углеводы: новые взгляды на их физиологические функции и
роль в питании / И.Я. Конь // Вопр. дет. диетол. - 2005. - Т. 3, № 1. - С.
18-20.
47. Копылова, Е. Универсальный солдат. Обзор розничного рынка фермент­
ных препаратов за 9 месяцев 2008 г. / Е. Копылова // Фармацевтический
вестник. - 2009. - № 2. - С. 55.
48. Корчагина, Л.Н. Липолитические ферменты для медицинских целей,
выпускаемые в СССР и за рубежом / Л.Н. Корчагина, В.Ф. Рудюк, В.Т.
Чернобай // Получение и применение ферментов витаминов, аминокис­
лот, премиксов: обзор информ. / ЦБНТИ медбиопром. - 1987. — № 1. —
26 с.
49. Кочетков, Н.К. Химия биологически активных природных соединений /
Н.И. Кочетков. - М.: Химия, 1970. - 378 с.
50. Кочетов, Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов.
- М . , 1980.-С. 57.
51. Криштанова, Н.А. Перспективы использования растительных полисаха­
ридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Н.А.
135
Криштанова // Вестн. ВГУ. Сер.: Химия, Биология, Фармация. - 2005. № 1 . - С . 212-221.
52. Кузьмина, А.А. Разработка фитопрепаратов для профилактики и лечения
заболеваний органов дыхания у детей: автореф. дис. ... канд. фармац.
наук: 15.00.02 и 14.00.25 / Кузьмина А.А. - СПб., 2000. - 29 с.
53. Кулакова, Н. О растительных маслах нового поколения в нашем питании
/ Н. Кулакова, М.М. Гаппаров, Е.В. Викторова // Масложировая промсть.-2005.-№1.-С.4-6.
54. Лабораторная диагностика нарушений обмена липидов. Пособие для
врачей / В.В. Долгов [и др.] - Тверь.: Информационно-издательская
фирма «Губернская медицина», 1999. - 55 с.
55. Лекарственные растения Государственной фармакопеи / Под ред. И.А.
Самылиной, В.А. Северцева. - М . : ООО «АНМИ», 2003. - С. 344-346.
56. Литвинчук, М.Д. Точный и быстрый метод оценки активности желче­
гонных средств на крысах / М.Д. Литвинчук, З.И. Новосилец // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1980. - № 6. - С. 750-752.
57. Лобаева, Т.А. Изучение физико-химических характеристик, состава и
биологической активности фитопрепаратов на основе жирных расти­
тельных масел: дис. ... канд. фармац. наук: 15.00.02 / Лобаева Т.А. М., 2002. - 197 с.
58. Масленников, А.В. Новые и редкие виды для флоры Ульяновской облас­
ти / А.В. Масленников, Н.С Раков // Биологические науки. - 1992. - №
8 . - С . 46-52.
59. Маслова, Н.Ф. Сравнительная оценка специфического действия и ряда
параметров фармакокинетики орнизима-Д, нигедазы и оразы / Н.Ф.
Маслова, Т.В. Бомко // Хим.-фармац. журн. - 1995. - № 1. - С. 8-10.
60. Маширова, С Ю . Изучение гепатозащитной и желчегонной активности
фитосубстанций чернушки дамасской / СЮ. Маширова // Современные
проблемы науки и образования. - 2013. - № 2. - URL: www.scienceeducation.ru/108-8588.
61. Маширова, СЮ. Изучение компонентного состава липидов семян чер­
нушки посевной и чернушки дамасской / С Ю. Маширова, Т.В. Орлов­
ская // Научные ведомости Белгородского гос. ун-та. Сер.: Медицина.
Фармация». - 2012. - № 4 (123). - Вып. 17. - С 223-226.
62. Маширова, С Ю . Изучение углеводов Nigella sativa и Nigella damascena I
С Ю . Маширова, Т.В. Орловская, Р.К. Рахманбердыева // Химия при­
род, соединений. - 2012. - № 3. - С. 414-415.
63. Маширова, С Ю . Исследование пептидов семян чернушки посевной и
чернушки дамасской / С. Ю. Маширова, Т.В. Орловская // Разработка, ис-
136
следование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.
- Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 83-86.
64. Маширова, С Ю . Товароведческие показатели семян чернушки посевной
и чернушки дамасской / С Ю. Маширова // Разработка, исследование и
маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пяти­
горск, 2012. - Вып. 67. - С. 79-81.
65. Маширова, С Ю . Элементный состав семян чернушки посевной и чер­
нушки дамасской / С. Ю. Маширова // Разработка, исследование и мар­
кетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск,
2012.-Вып. 6 7 . - С . 81-83.
66. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - 15-е
изд. перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2005. - 1206 с.
67. Мелик-Гусейнов, В.В. Растения народной медицины флоры России и
сопредельных государств. Атлас: монография /В.В. Мелик-Гусейнов. Пятигорск: ПятГФА, 2005. - 521 с.
68. Методические рекомендации по расширению номенклатуры отечест­
венных официнальных лекарственных растений / под общ. ред. Т.Л. Ки­
селевой. - М.: Изд-во Проф. ассоциации натуротерапевтов, 2009. - 88 с.
69. Методы контроля качества эфирных масел / Н.В. Сегуру [и др.] // Фар­
мация. - 2005. - № 3. - С 3-5.
70. Методы химии углеводов: пер. с англ. / под ред. Н.К. Кочеткова. - М.:
Мир, 1967.-512 с.
71. Моисеева, Г.Ф. Иммуностимулирующие полисахариды высших расте­
ний / Г.Ф. Моисеева, В.Г. Беликов // Фармация. - 1992. - № 3. - С. 79-84.
72. Молчан, Н.В. Определение эфирного масла в лекарственном раститель­
ном сырье / Н.В. Молчан, И.П. Рудакова, И.А. Самылина // Фармация. 2 0 0 9 . - № 5 . - С 3-4.
73. О возможности использования лекарственных растений для лечения и
профилактики микроэлементозов и патологических состояний / М.Я.
Ловкова [и др.] // Микроэлементы в медицине. - 2005. - Т.6, №4. - С.3-9.
74. Определение содержания тяжелых металлов в лекарственном раститель­
ном сырье / И.В. Гравель [и др.] // Фармация. - 2008. - № 7. - С. 3-5.
75. Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном рас­
тительном сырье / А.А. Сорокина [и др.] // Фармация. - 2010. - № 3. - С.
3-4.
76. Орловская, Т.В. Изучение аминокислотного состава семян клоповника
посевного / Т.В. Орловская // Дальневосточный мед. журн. - 2006. - №
2 . - С . 73-74.
137
77. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение семян чернушки
посевной {Nigella sativa L.) и чернушки дамасской (Nigella damascena
L.) I Т.В. Орловская, СЮ. Маширова // Традиционная медицина. - 2012.
- № 3 . - С . 54-57.
78. Орловская, Т.В. Новый взгляд на пищевые растения, как перспективные
источники лекарственных средств / Т.В. Орловская, М.В. Гаврилин, В.А.
Челомбитько. - Пятигорск: РИА «КМВ», 2011. - 240 с.
79. Орловская, Т.В. Фармакогностическое исследование некоторых культи­
вируемых растений с целью расширения их использования в фармации:
дис. ... д-ра фармац. наук / Орловская Т.В. - Пятигорск, 2011. - 374 с.
80. ОФС 42-0011-03 Определение содержания радионуклидов в лекарствен­
ном растительном сырье. Стронций-90, цезий-137. Отбор проб, анализ,
оценка результатов. - М., 2003. - 27 с.
81. ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сы­
рья и методы отбора проб» // Фармация. - 2003. - № 6. - С. 3-8.
82. Охлобыстин, А.В. Применение пищеварительных ферментов при забо­
леваниях поджелудочной железы / А.В. Охлобыстин, Е.А. Каленская //
Русский медицинский журнал. - 2012. - № 12. - С. 615-620.
83. Оценка безопасности лекарственного растительного сырья в БАДах и
фитопрепаратах / В.А. Тутульян [и др.] // Фармация. - 2009. - № 1. — С.
3-5.
84. Пат. 1118673 Российская Федерация, С12 № 9/18 Способ получения
ферментного препарата нигедазы / В.Ф. Рудюк, Л.Н. Корчагина, В.Т.
Чернобай. - № 3526693; заявл. 03.12.82; опубл. 15.10.84 - 6 с.
85. Пат. 2403566 Российская Федерация, С2 Способ количественного опре­
деления восстанавливающих Сахаров / Н.Ш. Кайшева, А.Ш. Кайшев,
Т.В. Орловская (РФ). - № 2008149186/21; заявл. 12.12.08; опубл.
10.11.10,Бюл.№31.-14с.
86. Полисахариды в онкологии / Е.П. Зуева [и др.]. - Томск: Печатная ма­
нуфактура, 2010.-108 с.
87. Попова, Н.В. Лекарственные растения мировой флоры / Н.В. Попова,
В.И. Литвиненко. - Харьков: СПДФЛ Мосякин В.Н., 2008. - 510 с.
88. Поступление Cs-137 и Sr-90 в растения в зависимости от форм выпав­
ших радионуклидов и их поведения в луговых ценозах / А.Н. Архипов [и
др.] // Сб. тез. III съезда по радиационным исследованиям 15-17 окт.
1997 г . - М . , 1997.-С. 430.
89. Потанина, О.Г. Оценка доброкачественности лекарственного раститель­
ного сырья с учетом диагностически значимых признаков / О.Г. Потани­
на, И.А. Самылина // Фармация. - 2003. - № 4. - С. 12-14.
138
90. Потанина, О.Г. Совершенствование стандартизации и контроля качества
лекарственного растительного сырья и лекарственных форм из него на
основе микроскопического метода исследования: дис. ... д-ра фармац.
наук / Потанина О.Г. - М., 2003. - Т. 1. - 432 с.
91. Потанина, О.Г. Совершенствование стандартизации и контроля качества
лекарственного растительного сырья и лекарственных форм из него на
основе микроскопического метода исследования: дис. ... д-ра фармац.
наук / О.Г. Потанина. - М , 2003. - Т. 2. - 217 с.
92. Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.03 «Правила проведения работ с исполь­
зованием экспериментальных животных»
93. Применение метода ВЭЖХ в фармацевтическом анализе лекарственных
средств пептидной природы / Д.М. Каширин [и др.] // Хим.-фармац.
журн. - 2000. - Т. 34, № 3. - С. 45-47.
94. Применение метода УФ-спектрофотометрии для определения объемной
доли эфирного масла в ароматных спиртах / И.М. Абрамова // Пищевая
промышленность: наука и технологии. - 2011. - № 1 (11). - С. 72-75.
95. Пристер, Б.С. Основные факторы, определяющие поведение радионукли­
дов в системе почва-растение / Б.С. Пристер, Л.В. Перепелятникова, В.И.
Дугинов // Пробл. с.-х. радиологии. - Киев, 1992. - Вып. 2. - С. 108-117.
96. Проблемы нормирования тяжелых металлов в лекарственном раститель­
ном сырье / О.И. Терешкина [и др.] // Фармация. - 2010. - № 2. - С. 7-11.
97. Раков, Н.С. Культивируемые растения Ульяновской области / Н.С. Ра­
ков, С В . Саксонов // Фиторазнообразие восточной Европы. - 2007. - №
4 . - С . 64-108.
98. Растительные пептиды - перспективный источник создания лекарствен­
ных средств / А.В. Рогов [и др.] // Фармация. - 2003. - № 6. - С. 41-43.
99. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их
компонентный состав и биологическая активность / Отв. ред. А.Л. Буданцев. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. - Т.1
Семейства Magnoliaceae - Juglandaceae, Ulmaceae, Moraceae, Cannabaceae, Urticaceae. - С 49-50.
100. Регистр лекарственных средств России РЛС. Энциклопедия лекарств. 17-й вып. / под ред. Г.Л. Вышковского. - М.: «РЛС-2009», 2008. - 1234 с.
101. Рудаков, О.Б. Развитие метода интерпретации хроматограмм при иден­
тификации растительных масел / О.Б. Рудаков // Химия раст. сырья. 2 0 0 1 . - № 4 . - С . 79.
102. Рудюк, В.Ф. Влияние секретов пищеварительного аппарата на актив­
ность липазы семян Nigella damascena L. I В.Ф. Рудюк, Л.Н. Корчагин //
Хим.-фармац. журн. - 1981. - Т. 15, № 2. - С. 59-62.
139
103. Рудюк, В.Ф. Изучение некоторых свойств липазы из семян Nigella I В.Ф.
Рудюк, Л.Н. Корчагина // Химия природ, соединений. - 1975. - № 5. - С.
645-648.
104. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и
методология» // Фармация. - 2008. - № 4. - С. 3-10.
105. Руководство по экспериментальному (доклиническому изучению новых
фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.
106. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ / под ред. В.П. Фисенко. - М.: Ремедиум,
2000.-С. 114-119.
107. Самылина, И.А. Пути использования лекарственного растительного сы­
рья и его стандартизация / И.А. Самылина, И.А. Баландина // Фармация.
- 2 0 0 4 . - № 2 . - С . 39-41.
108. Самылина, И.А. Фармакогнозия. Атлас: учеб. пособие: в 3 т. / И.А. Са­
мылина, О.Г. Аносова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - Т. 1. - 192 с/
109. СанПин 2.3.2 1078-01 «Гигиенические требования к качеству и безопас­
ности продовольственного
сырья и пищевых продуктов»
от
14.11.2001/22.03.02. [Электронный ресурс]. - Режим доступа:
http://www.service-holod.ru/SanPiN2/SanPiN_2_3_2_1078_01.htm. - Загл. с
экрана.
ПО. СанПин 2.3.2. 1078-01. Продовольственное сырье и пищевые продукты.
Гигиенические требования безопасности пищевой ценности пищевых
продуктов. - М : ФГУП «ИнтерСЭН», 2002. - 168 с.
111. Саратиков, А.С. Эффективность ферментиндуцирующих средств при
экспериментальном поражении печени тетрахлорметаном / А.С. Сарати­
ков, Т.П. Новоженов, А.И. Венгеровский // Эксперим. и клин, фармакол.
- 2003. - Т. 66, № 4. - С. 47-49.
112. Селлар, В. Энциклопедия эфирных масел / В. Селлар. - М.: ФАИРПРЕСС, 2004. - 400 с.
113. Сентебова, Н.А. Предложения по унификации методов определения
триглицеридов в сыворотке крови / Н.А. Сентебова, Н.В. Салицкая //
Унификация лабораторных методов исследований. - М., 1978. - Вып. 8.
- С . 67-75.
114. Сереброва, СЮ. Перспективы применения ферментных препаратов в га­
строэнтерологии / С Ю . Сереброва // Болезни органов пищеварения. 2066.-Т. 8, № 1 . - С . 23-27.
115. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура. - М.: Медицина, 2000. - 352 с.
140
116. Скальный, А.В. Биоэлементы в медицине / А.В. Скальный, И Л . Руда­
ков. - М : ОНИКС 21 век: Мир, 2004. - 276 с.
117. Смирнова, Ю.А. Новые виды лекарственных растений для отечествен­
ной фармакопеи / Ю.А. Смирнова, Т.Д. Киселева // Фармация. - 2009. № 7 . - С . 6-7.
118. Современные методы анализа и оборудование в санитарногигиенических исследованиях (научно-практическое руководство) / под
ред. Г.Г. Онищенко, Н.В. Шестопалова. - М.: ФГУП Интерсэн, 1999. 496 с.
119. Сорные, лекарственные и ядовитые растения / под ред. В.М. Пенчукова,
А.И. Войковского. - М : МААО; Ставрополь: АГРУС, 2006. - 264 с.
120. Способы выделения кислоторастворимых полипептидов / А.В. Рогов [и
др.] // Фармация. - 2004. - № 2. - С. 46-48.
121. Справочник ВИДАЛЬ «Лекарственные препараты в России». - М.: АстраФармСервис, 2007. - 1632 с.
122. Сравнительная эффективность пектиновых энтерособентов в комплекс­
ной терапии язвенной болезни / Я.Ю. Макаренко [и др.] // Актуальные
проблемы создания новых лекарственных препаратов природного про­
исхождения: материалы V Междунар. съезда. - СПб., 2001. - С. 416-418.
123. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Моносахариды) / Б.Н.
Степаненко. - М.: Высш. шк., 1977. - 222 с.
124. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Полисахариды) / Б.Н.
Степаненко. - М.: Высш. шк., 1978. - 256 с.
125. Степычева, Н.В. Купажированные растительные масла с оптимизиро­
ванным жирно-кислотным составом / Н.В. Степычева, А.А. Фудько //
Химия раст. сырья. - 2011. - № 2. - С. 27-33.
126. Строев, Е.А. Практикум по биологической химии / Строев Е.А., Мака­
рова В.Г. - М.: Высш. шк., 1986. - 127 с.
127. Тахтаджян, А.Л. Система магнолиофитов / А.Л. Тахтаджян. - Л.: Наука,
1987.-439 с.
128. Титов, В.Н. Жирные кислоты. Физическая химия, биология и медицина /
В.Н. Титов, Д.М. Лисицын. - М. - Тверь: Триада, 2006. - 672 с.
129. Требования к фармакопейной статье «Жирные масла» / Н.В. Сегуру [и
др.] // Фармация. - 2007. - № 8. - С. 3-5.
130. Тутельян, В.А. Физиологическая роль коротких пептидов в питании /
В.А. Тутельян, В.Х. Хавинсон, В.В. Малинин // Бюл. эксперим. биологии
и медицины.-2003.-Т. 135, № 1.-С. 4-10.
141
131. Фетисова, А.Н. Особенности современных способов получения жирного
масла из лекарственного растительного сырья и перспективные техноло­
гии / А.Н. Фетисова, В.А. Попков, А.Н. Пихоцкий // Актуальные про­
блемы создания новых лекарственных препаратов природного происхо­
ждения: материалы 7 Междунар. съезда 3-5 июля 2003 г. - Спб., 2003. С. 93-98.
132. Филиппов, М.П. Доступность гидроксильных групп пектиновых ве­
ществ для дейтерирования / М.П. Филиппов, М.С. Комисаренко // Химия
природ, соединений. - 1987. - № 3.-343-348.
133. Филиппов, М.П. ИК-спектроскопическое определение карбоксильных
групп в пектиновых веществах / М.П. Филиппов // Журн. аналит. химии.
- 1973. - Т. 28, вып. 5. - С. 30-31.
134. Филиппов, М.П. Инфракрасные спектры пектиновых веществ / М.П.
Филиппов // Методы анализа пищевых продуктов (Проблемы аналити­
ческой химии). - М . : Наука, 1988. - Т. 8. - С. 198-216.
135. Филиппов, М.П. Природа связи в растительной ткани, строение и ин­
фракрасные спектры как основа классификации пектиновых веществ:
автореф. ... дис. д-ра хим. наук / М.П. Филиппов. - Одесса, 1990. - 38 с.
136. Флора СССР: в 30-ти томах / под ред. В.Л. Комарова. - Л.: Издательство
Академии Наук СССР, 2001. - Т. 7. - С. 62-72.
137. Хавезов, И. Атомно-адсорбционный анализ: пер. с болг. / И. Хавезов, Д.
Палев; под ред. С.З. Яковлевой. - Л.: Химия, 1983. - 144 с.
138. Характеристика гепатопротекторных лекарственных средств, представ­
ленных на фармацевтическом рынке России / В.А. Егоров [и др.] // Фар­
мация. - 1999. - № 6. - С. 23- 25.
139. Химия углеводов / Н.К. Кочетков [и др.]. - М.: Химия, 1967. - 672 с.
140. Хроматография на бумаге / под ред. И.М. Хайца, К. Мацека. - М.: Издво иностран. лит., 1962. - 851 с.
141. Черепанов, С.К. Сосудистые растения России и сопредельных госу­
дарств (в пределах бывшего СССР) / С.К. Черепанов. - СПб.: Мир и се­
мья, 1995.-992 с.
142. Черных, И.В. Интродукция пряно-ароматических и эфиромасличных
растений в условиях лесостепной зоны Южного Предуралья и их ис­
пользование в экопротективной помощи населению: автореф. дис. ...
канд. биол. наук: 03.00.05 / Черных И.В. - Уфа, 2004. - 15 с.
143. Чилимов, А.И. Распределение и динамика Cs-137 в тканях древесных
растений / Чилимов А.И., Богачев А.В. // Радиационная биология. -2000.
- № 4 0 . - С . 231.
142
144. Шемерянкина, Т.Б. Требования к стандартизации лекарственного расти­
тельного сырья и фитопрепаратов на его основе / Т.Б. Шемерянкина,
Т.А. Сокольская, Т.Д. Даргаева // Вопр. биол., мед. и фармац. химии. 2 0 1 0 . - № 3 . - С . 9-12.
145. Шиков, А.Н. Растительные масла и масляные экстракты: технология,
стандартизация, свойства / А.Н. Шиков, В.Г. Макаров, В.Е. Рыженков. М : Рус. врач, 2004. - 264 с.
146. Широкова, И. Пептиды: здоровый взгляд в будущее / И. Широкова //
Ремедиум. - 2008. - № 6. - С. 62-63.
147. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов жи­
вотного происхождения: учеб. пособие / под ред. Т.П. Яковлева, К.Ф.
Блиновой. - 2-е изд., перераб. и доп. - СПб.: Спец. лит., 2010. - 407 с.
148. Энциклопедический словарь лекарственных, эфирномасличных и ядови­
тых растений. - М.: Изд-во сельхоз. лит., 1951. - С. 188.
149. Энциклопедия лекарственных растений. - М.: Ридерс Дайджест, 2004. 351с.
150. A new phenolic compound from Nigella damascena seeds / G. Fico [et al.] //
Fitoterapia. - Vol. 72, № 4. - P . 462-463.
151. Aboul-Enein, Y.H. Simple HPLC method for the determination of thymoquinone in black seed oil / Y.H. Aboul-Enein, I.L. Aboul-Basha // Liquid Chro­
matography. - 1995. - № 5. - P . 895-902.
152. Agradi, E. Estrogenic activity of Nigella damascena extracts, evaluated using
a recombinant yeast screen / E. Agradi [et al.] // Phytotherapy Research. 2002. - Vol. 16, № 5. - P. 414-416.
153. Amr, E. E. Anti-cancer properties of Nigella spp. essential oils and their ma­
jor constituents, thymoquinone and (3-elemene / Amr E. Edris // Current Clin­
ical Pharmacology. - 2009. - Vol. 4. - P . 43-46.
154. Antibacterial Activity Screening of Nigella L. Species Growing in Turkey /
G. Kokdil [et al.] // J. Fac. Pharm. Ankara. - 2005. - Vol. 34, № 3. - P. 183190.
155. Anti-leishmaniasis activity of some extracts isolated from Nigella damascena
I C.C. Toma [et al.] // Planter medical. - 2007. - № 1. - P. 285.
156. Badary,
O.A.
Inhibitory effect
of thymoquinone against
20methylchlolanthrene-induced fibrosarcoma tumorigenesis. / O.A. Badary,
A.M. Gamal El-din // Cancer Detect. Prev. - 2001. - Vol. 25, № 4. - P. 362368.
157. Biological screening of Nigella damascena for antimicrobial and molluscicidal activities / G. Fico [et al.] // Phytother. Res. - 2004. - Vol. 18, № 6. - P.
68-70.
143
158. Blunden, G. Pharmacological and toxicological properties of Nigella damas­
cena IG. Blunden // Phytother res. - 2003. - № 4. - P. 299-305.
159. Brown, R.H. The amino acid sequence of cytochrome С from Nigella damas­
cena L. (Love-in-a-Mist) / R.H. Brown, D. Boulter // Biochem J. - 1973. Vol. 133.-P. 251-254.
160. Characterization of Nigella sativa L. essential oil-loaded solid lipid nanoparticles / Nagi A. ALHaj [et al.] // American Journal of Pharmacology and Tox­
icology. - 2010. - Vol. 5, № 1. - P. 52-57.
161. D'Antuono, L. Seed yield, yield components, oil content and essential oil ontent and composition of Nigella sativa L. and Nigella damascena L. / L.
D'Antuono, F.A. Moretti, A.F.S. Lovato // Indian. Crops Prod. - 2002. Vol. 15.-P. 59-69.
162. Effect of Nigella sativa (black seed) on subjective feeling in patients with al­
lergic diseases / U. Kalus [et al.] // Phytother. Res. - 2003. - Vol. 17, № 10. P. 1209-1214.
163. Essential oils of Nigella sativa L. and Nigella damascena L. seed / A.V. Mo­
retti [et al.] // Journal of essential oil research: Jeor. - 2004. - № 5. - P. 1314.
164. Estrogenic activity of Nigella damascena extracts, evaluated using a recombi­
nant yeast screen / E.Agradi [et al.] // Phytotherapy research. - 2002. - № 5. P. 6.
165. Estrogenic activity of phenolic compounds from Nigella damascena evaluated
using a recombinant yeast screen / E. Agradi [et al.] // Plantamedica. - 2001.
- № 6 . - P . 5.
166. Four new triterpene glycosides from Nigella damascena I H.D. Yoshimitsu
[et al.] // Chemical and pharmaceutical bulleting. - 2007. - № 3. - P.91.
167. Ghosh, A. A report on gamma-rays induced paracentric inversionin Nigella
damascena L. (Love-in-a-mist) involving marker telocentrics / A. Ghosh,
A.K. Datta // Cell and Chrom. Res. - 2004. - Vol. 24. - P. 7-11.
168. Ghosh, A. Cytogenetical studies on the induced viable translocation lines of
Nigella damascena L. (Love-in-a-mist) / A. Ghosh, A.K. Datta // Cell and
Chrom. Res.-2003.-Vol. 2 3 . - P . 5-10.
169. Ghosh, A. Gamma-rays induced reciprocal translocation in Nigella damasce­
na L. (Love-in-a-mist) / A. Ghosh, A.K. Datta // Caryologia. - 2006. - Vol.
59,№l.-P.31-36.
170. Herbal treatment of allergic rhinitis: the use of Nigella damascena I S.K. Nikakhlang [et al.] // Am. J. Otolaryngol. - 2010. - № 10. - P. 23.
144
171. Hosseinzadeh, H. Related Anticonvulsant effects of thymoquinone, the major
constituent of Nigella sativa seeds, in mice / H. Hosseinzadeh, S. Parvardeh //
Phytother. Res. - 2004. - Vol. 11, № 1. - P. 56-64.
172. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components /
W.S. York [et al.] // Meth. Enzymol. - 1985. - Vol. 118. - P. 3-40.
173. Khan, N. Nigella sativa ameliorates potassium bromate induced early events
of carcinogenesis: diminution of oxidative stress / N. Khan, S. Sharma, S.
Sultana // Experimental Toxicology. - 2003. - Vol. 22. - P. 193-203.
174. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. -Vol. 27, № 259. 680 p.
175. Miller, G.L. Protein determination for barge numbers of samples / G.L. Miller
//Anal. Chem. - 1959. -Vol. 35, № 5. - P . 964-966.
176. Ohkawa, H. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thyobarbituric acid
reaction / H. Ohkawa, N. Ochihi, K. Vagi // Anal. Biochem. - 1979. - Vol.
95, № 2 . - P . 351-358.
177. Pigments from the aerial parts of Nigella damascena L. and Nigella sativa L.
species {Ranunculaceae) I Toma Claudia-Crina [et al.] // 4th conference on
medicinal and aromatic plants of south-east European countries: 28th — 31st
of may 2006. - Iasi, Romania, 2006. - P . 80-81.
178. Rchid, H. Volatile components of Nigella damascena L. and Nigella sativa L.
seeds / H. Rchid [et al.] // J. of Essential Oil Research. - 2004. - Vol. 16, №
6 . - P . 585-587.
179. Salim, E. Chemopreventive potential of volatile oil from black cumin (Nigella
sativa L.) seeds against rat colon carcinogenesis / E. Salim, S. Fukushima //
Nutr. Cancer. - 2003. - Vol. 45, № 2. - P. 195-202.
180. Seed yield, yield components, oil content and essential oil content and com­
position of Nigella sativa L. and Nigella damascena L. /ТУ Filippo [et al.] //
Indust Crops Prod. - 2002. - Vol. 15. - P. 59- 69.
181. Tariq, M.J. Nigella damascena L. seeds: folklore treatment in modern day
medicine / M.J. Tariq, J.K. Saudi // Gastroenterol. - 2008. - № 14. - P. 105106.
182. The antitumor activity of thymoquinone and thymohydroquinone in vitro and
in vivo / S. Ivankovicl [et al.] // Exp. Oncol. - 2006. - Vol. 28, № 3. - P.
220-224.
183. The in vivo antifungal activity of the aqueous extract from Nigella sativa
seeds / M.K. Ashfaq [et al.] // Phytother. Res. - 2003. - Vol. 17, № 2. - P.
183-186.
145
184. Thymoquinone protects against carbon tetracholide hepatotoxicity in mice via
an antioxidant / M.N. Nagi [et al.] // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1999. - Vol.
47, № 1 . - P. 153-159.
185. Thymoquinone reduces hepatic glucose production in diabetic hamsters /
K.M. Fararh [et al.] // Research in veterinary science. - 2005. - № 3. - P.
219-223.
186. TLC assay of thymoquinone in black seed oil and identification of dithymoquinone and thymol / L. AbouBasha [et al.] // Journal of liquid chromatogra­
phy & related technologies. - 1995.-Vol. 18, № 1.-P. 105-115.
187. Tulukcu, E. A comparative study on fatty acid composition of black cumin
obtained from different regions of Turkey, Iran and Syria / E. Tulukcu //
African Journal of Agricultural Research. - 2011. - Vol. 6, № 4. - P. 892895.
188. Uchiyama, M. Determination of Malonaldehyde Precursor in Tissues by Thiobarbituric Acid Test / M. Uchiyama, M. Mihara // Anal. Biochem. - 1978. Vol. 94, № 8 6 . - P . 271-278.
146
ПРИЛОЖЕНИЯ
1. Акты внедрения
2. Нормативная документация
3. Материалы изучения «острой» токсичности
"V
V4?
«УТВЕРЖДАЮ»
дир. д. фарм. н.
, Россельхозакадемии
—' Сокольская Т. А.
от«3^» 0¥
2012 г
Инструкция по сбору и сушке семян чернушки дамасской
Чернушка дамасская - Nigella damascena L., однолетнее травянистое
растение семейства лютиковых (Ranunculaceae).
Стебель прямостоячий, ребристый, иногда фиолетовый высотой 2 0 - 6 0
см, с жесткими дважды-, трижды- перисто-рассеченными на узкие линейные
дольки с завернутым вниз краями листовыми пластинками, длиной 6-10 с м и
шириной 4-5см. Дольки листьев шероховатые от наличия на них о ч е н ь
мелких трихом - шипиков. Верхушечные листья тесно приближены к
основанию плодов.
г.
Цветки своеобразные, верхушечные, одиночные, крупные по 4 см в
диаметре, окружены ажурным зеленым покрывалом из верхних перибторассеченных листьев, в 2-3 раза прерывающий цветок, простые и л и
махровые, с венчиковидной, обычно пятичленной чашечкой, листочки
которой имеют бледно-голубую окраску. Лепестки - нектарники двугубые,
короче чашечки, округленные, переходящие в короткий и узкий ноготок.
Плод состоит из пяти сильно вздутых, гладких, с ровным носиком,
сросшихся почти до верха листовок, окруженных тонко-рассеченной,
красивой оберткой из верхушечных листьев, длиной 1-1,5 см.
Семена черные, мелкие (2,2-3 мм длиной и 1,5-2 мм шириной),
клиновидные, трехгранные, с поперечно-морщинистой поверхностью
с
приятным земляничным запахом.
Цветет с конца июня по август. Плоды созревают в августе - сентябре.
Родиной чернушки дамасской является Средиземноморье, Балканы и
Малая Азия. Она встречается преимущественно как сорное растение в р я д е
южных районов европейской части России, на Кавказе, в Крыму, в
Центральной Азии. Растет по степным склонам, сорным местам. Изредка
дичает. Культивируется как декоративное, пищевое и лекарственное
растение. Особенно широко культивируется в промышленных масштабах в
Украине и России (Ставропольский и Краснодарский край).
1k s
Использование
Семена чернушки дамасской служат источником получения ценного
эфирного
и
жирного
масла,
обладающего
антимикробной
и
ранозаживляющей активностью и для получения ферментного препарата
«Нигедаза».
Разработчик:
Аспирант кафедры фармакогнозии
ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА
^
Минздравсоцразвития России
У
^и^^г^-
СЮ. Маширова
Mg
Утверждаю:
Директор ГНУ Ставропольского
научно-исследовательского
"•* t
института сельского хозяйства
Российской академии сельскохозяй­
ственных, наук
^льс^крхозяйств^нных^наук
Кулинцев
,012 г.
Х^Акт__ _
внедрения результат^^дарсертЪционной работы
Машировой Светланы Юрьевны «Фармакогностическое изучение семян
чернушки дамасской культивируемой в условиях Ставропольского
края»
В Ставропольском НИИ сельского хозяйства ведется селекцион­
ная работа с одним из перспективных видов лекарственных "растений - чер­
нушкой дамасской. Исследования позволили подготовить для передачи в Го­
сударственную комиссию по испытанию и охране селекционных достижений
РФ новый сорт этой культуры.
По итогам комплексного фотохимического изучения нового сорта чер­
нушки, проведенного СЮ. Мапшровой, доказана возможность его введения
в промышленную культуру в Ставропольском крае и расширенного исполь­
зования семян в качестве источника растительного фитосырья для получения
нескольких групп биологически активных соединений, создания фитопрепа­
ратов и пищевых продуктов функционального назначения
На основании исследований, проведенных С Ю . Машировой, новый
сорт нигеллы дамасской в 2013 году будет передан в Госкомиссию по испы­
танию и охране селекционных достижений РФ в качестве лекарственного
растения с присвоением ей авторства 7%.
Руководитель селекционного центра,
зав. лабораторией селекции и первичного
семеноводства лекарственных растений
ГНУ Ставропольского НИИСХ
Россельхозакадемии, к. с.-х. н.
Подпись, ученую степень и должность
Чумаковой В.В. удостоверяю
Ученый секретарь
ГНУ Ставропольского
Россельхозакадемии, к
В.В. Чумакова
С.Н. Шкабарда
450
«Утверждаю»
Ректор государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего профессионального образования
«Самарский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения
РоссийскойФедерации(ГБОУ ВПО СамГМУ
М и ^ ^ ^ ^ и и ) , академик РАМН,
лаулзеа}Щ^уяарЪгвеннои премии РФ,
щщ&г^^щЩш^щ/тш Правительства РФ,
зшф^.^^^ШЩ^щ> науки РФ, профессор
АКТ О ВНЕДРЕНИИ
1. Наименование предложения для внедрения: морфолого-анатомический
анализ семян чернушки дамасской.
2. Кем предложено (адрес исполнителя): Пятигорский филиал ГБОУ ВПО
ВолгГМУ Минздрава России (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).
3. Источник информации: публикация.
Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение семян чернушки посевной
(Nigella sativa L.) и чернушки дамасской {Nigella damascena L.) I Т.В.
Орловская, СЮ. Маширова // Традиционная медицина. - 2012. - № 3. - С. 5457.
4. Где и когда внедрено: кафедра фармакогнозии с ботаникой и основами
фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, ноябрь 2012 г.
5 Форма внедрения: чтение лекций и проведение практических занятий со
студентами 3 курса фармацевтического факультета.
6. Эффективность внедрения: повышение уровня подготовки специалистов
фармацевтического профиля по использованию микроскопического метода
анализа в оценке показателей качества сырья чернушки дамасской.
7. Замечания и предложения: Целесообразно внедрение в фармацевтических
вузах (факультетах) РФ.
Члены комиссии:
Зав. кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии
ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России,
.
д. фармац. н., профессор
^У^^^^——ВТА.ТСуркин
Профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии
ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России,
д. фармац. н.
Е.В. Авдеева
Г~~^^У'
•tfV
«Утверждаю»
Ректор государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего профессионального образования
«Самарский государственный медицинский университет»
Министерства здщво£хщн§ния Российской Федерации
(ГБОУ ВПО ^ам]И^^рй$драва России), академик
РАМН, д|ау^'е&^^ВуШ|||венной премии РФ,
дваждьМ^еат^ШешиЭДравительстваРФ,
за^ж^тът^щ^^щшр.
РФ, профессор
X « ^ М ^ ^ ^ ^
2013 г.
АКТ О ВНЕДРЕНИИ
1. Наименование предложения для внедрения: химический состав и нормы
качества семян чернушки дамасской.
2. Кем предложено (адрес исполнителя): Пятигорский филиал ГБОУ ВПО
ВолгГМУ Минздрава России (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).
3. Источник информации: публикации
1. Маширова, СЮ. Изучение компонентного состава липидов семян чернушки посевной и
чернушки дамасской / С. Ю. Маширова, Т.В. Орловская // Научные ведомости
Белгородского гос. ун-та. Сер.: Медицина. Фармация». - 2012. - № 4 (123). - Вып. 17. С. 223-226.
2. Маширова, СЮ. Изучение углеводов Nigella sativa и Nigella damascene* I СЮ.
Маширова, Т.В. Орловская, Р.К. Рахманбердыева// Химия природ, соединений. - 2012. № 3 . - С . 414-415.
3. Маширова, СЮ. Исследование пептидов семян чернушки посевной и чернушки
дамасской / С. Ю. Маширова, Т.В. Орловская // Разработка, исследование и маркетинг
новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. -Пятигорск, 2012. -Вып. 61.-С. 83-86.
4. Маширова, СЮ. Товароведческие показатели семян чернушки посевной и чернушки
дамасской / С. Ю. Маширова // Разработка, исследование и маркетинг новой
фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. -Вып. 67. - С 79-81.
5. Маширова, СЮ. Элементный состав семян чернушки посевной и чернушки дамасской /
С. Ю. Маширова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической
продукции: сб. науч. тр. -Пятигорск, 2012. -Вып. 67. - С. 81-83.
4. Где и когда внедрено: кафедра фармакогнозии с ботаникой и основами
фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, декабрь 2012 г.
5 Форма внедрения: чтение лекций и проведение практических занятий со
студентами 3 курса фармацевтического факультета.
6. Эффективность внедрения: повышение уровня подготовки специалистов
фармацевтического профиля по использованию сырья чернушки дамасской.
7. Замечания и предложения: Целесообразно внедрение в фармацевтических
вузах (факультетах) РФ.
Члены комиссии:
Зав. кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии
ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России,
^
д. фармац. н., профессор
^/^^^2___.В.А. Куркин
Профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии
ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России,
д. фармац. н.
^~~^У
Е.В. Авдеева
45L
МИНЗДРАВ РОССИИ
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России)
АКТ
о внедрении результатов диссертационной работы
Машировой Светланы Юрьевны
«Фармакогностическое изучение семян чернушки дамасской,
выращенной в Ставропольском крае»
на кафедре фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Дальневосточный
государственный медицинский университет» Минздрава России
Комиссия в составе сотрудников кафедры фармакогнозии и ботаники:
зав. кафедрой, докт. фармац. наук, проф. Т.А.Степанова, доцента, канд.
фармац. наук Г.Я.Мечиковой и доцента, канд. фармац. наук Н.В.Матющенко,
подтверждает использование материалов диссертационного исследования
Машировой С.Ю., посвященного чернушке дамасской (разработанные
методики
анализа,
выявленные
морфолого-анатомические
признаки,
сведения о химической составе), в учебном процессе при проведении
практических занятий со студентами, клиническими интернами и научноисследовательской
работе.
Внедренные
результаты
способствуют
повышению объективности стандартизации семян чернушки дамасской и
расширению использования в медицинской практике.
Основанием для внедрения являются публикации:
1. Маширова, СЮ. Изучение компонентного состава липидов семян
чернушки посевной и чернушки дамасской / С. Ю. Маширова, Т.В.
/я
2.
3.
4.
5.
Орловская // Научные ведомости Белгородского гос. ун-та. Сер.:
Медицина. Фармация». - 2012. - № 4 (123). - Вып. 17. - С. 223-226.
Маширова, СЮ. Изучение углеводов Nigella sativa и Nigella damascena I
СЮ. Маширова, Т.В. Орловская, Р.К. Рахманбердыева // Химия природ,
соединений. - 2012. - № 3. - С. 414-415.
Маширова, СЮ. Исследование пептидов семян чернушки посевной и
чернушки дамасской / С Ю . Маширова, Т.В. Орловская // Разработка,
исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч.
тр. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 83-86.
Маширова, СЮ. Товароведческие показатели семян чернушки посевной и
чернушки дамасской / С Ю. Маширова // Разработка, исследование и
маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск,
2012.-Вып. 6 7 . - С . 79-81.
Маширова, С Ю . Элементный состав семян чернушки посевной и
чернушки дамасской / С. Ю. Маширова // Разработка, исследование и
маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск,
2012.-Вып. 6 7 . - С . 81-83.
6. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение семян чернушки
посевной {Nigella sativa L.) и чернушки дамасской (Nigella damascena L.)
I Т.В. Орловская, С Ю . Маширова // Традиционная медицина. - 2012. № 3 . - С. 54-57.
Члены комиссии:
зав. кафедрой фармакогнозии и ботаники,
докт. фармац. наук, проф.
к
доцент кафедры фармакогнозии и ботаники,
канд. фармац. наук
доцент кафедры фармакогнозии и ботаники,
канд. фармац. наук
~^^
^-с-г-
\Д{ Щ^
/U/
r/l ^""/
Т.А.Степанова
ГЛЯ.Мечикова
Н.В.Матющенко
m
АКТ О ВНЕДРЕНИИ
У/6
Предмет внедрения: Методика количественного определения тимохинона в
семенах чернушки дамасской.
Кем предложен: Аспирантом кафедры фармакогнозии Машировой С Ю .
Источник
информации:
тимохинона
в семенах
Методика
чернушки
количественного
дамасской
(материалы
определения
диссертации
Машировой Светланы Юрьевны «Фармакогностическое изучение
семян
чернушки дамасской, выращенной в Ставропольском крае»).
Где и кем внедрено: с сентября 2012 г. Курск, кафедра фармакогнозии и
ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Цель
внедрения: Включение
методики количественного
определения
тимохинона в семенах чернушки дамасской в учебный и научный процесс
кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской
Федерации.
Результаты и эффективность внедрения: Результаты разработки методики
количественного определения тимохинона в семенах чернушки дамасской
используются в научно-исследовательской и учебной работе студентов и
аспирантов.
Зав. кафедрой фармакогнозии
и ботаники, профессор
/^<-
В.Н. Бубенчикова
№
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА
ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Nigellae damascenae semina
Чернушки дамасской семена
ФС 42Вводится взамен ВФС 42-1691-87
Срок введения установлен
с«
»
20 г.
Срок действия
до «
»
20 г.
Настоящая Фармакопейная статья распространяется на собранные в
период полного созревания осенью (или в конце августа) и высушенные се­
мена однолетнего культивируемого растения чернушки дамасской - Nigella
damascena (L.) семейства лютиковых - Ranunculaceae, цельные, используе­
мые как сырье для получения фермента, жирного и эфирного масла.
ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ
ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА
4fb
ФС 42-
С. 2
Внешние признаки. Цельное сырье. Семена яйцевидной формы,
сплюснутые, трех- реже четырехгранные, заостренные с одной стороны. По­
верхность семян голая, слегка поперечно-морщинистая, между гранями зер­
нистая, матовая. Семенной рубчик слабо заметен. Кожура семени твердая,
плотно прилегающая к зародышу, эндосперм плохо развит, зародыш состоит
из двух семядолей и занимает почти все семя. Длина - 2-3 мм, ширина до 1
мм, толщина в средней части 1,5-2 мм. Цвет черный, запах своеобразный,
вкус семени очищенной от деревянистой части кожуры слизистый, вкус вод­
ного извлечения пряный, жгучий. Вес 100 семян - 0,26±0,02 г.
Микроскопия. Цельное сырье. На поперечном срезе семян видна трех­
слойная семенная кожура в виде темно-бурой полосы, эндосперм и зародыш
(рис. 1). При большом увеличении различаются слои семенной кожуры.
Рисунок 1 — Схема анатомо-гистологического строения
семени чернушки дамасской на поперечном срезе:
1 семенная кожура, 2 - эндосперм, 3 - зародыш
Первый слой - однослойный эпидермис. Эпидермис состоит из круп­
ных, плотно сомкнутых, радиально вытянутых клеток с
равномерно-
утолщенными стенками. Клетки эпидермиса слабоизвилистые,
прямоуголь­
ные клетки чередуются с клетками треугольной формы. В местах расположе-
I
ФС 42-
С. 3
ния морщинок клетки эпидермиса имеют коническую форму к вершине от­
тянутые в сосочек.
Второй слой - бесструктурный, расположенный под эпидермисом со­
стоит из тонкостенных паренхимных бесцветных палисадоподобных спав­
шихся клеток.
Третий слой - пигментный, состоит из тангентально вытянутых клеток
имеющих неравномерные утолщения и содержащих коричневый пигмент.
Толщина слоя составляет 2-4 ряда по периметру семян, в области морщинок
расширяется до 6 рядов.
В молодых семенах между семенной кожурой и зародышем имеется
хорошо выраженный эндосперм.
В процессе развития семени эндосперм
уменьшается и уже представлен в виде одного слоя из небольших танген­
тально вытянутых клеток.
Клетки эндосперма многоугольные, тонкостенные, содержат алейроно­
вые зерна и капли жирного и эфирного масел. Зародыш состоит из двух се­
мядолей с корешком.
Качественные (гистохимические) реакции.
1. Поперечный срез семени чернушки помещают в раствор Судана III,
накрывают покровным стеклом и нагревают. Капли жирного и эфирного
масла окрашиваются в оранжево-желтый цвет (жирные и эфирные масла).
2. При микровозгонке порошка наблюдается образование красного на­
лета на стенках пробирки, который при прибавлении 5 % раствора натрия
гидроксида приобретет синее окрашивание (хиноны).
Хроматография.
УФ-спектр.
1. УФ-спектр поглощения спиртового раствора эфирного масла (1:200)
в интервале длин волн от 200 до 600 нм должен иметь максимумы при дли­
нах волн 216±2 нм, 254±2 нм и 296±2 нм.
ФС 42-
С. 4
2. УФ-спектр поглощения жирного масла (1:200) в интервале длин волн
от 200 до 600 нм должен иметь максимумы при длинах волн 215±2 нм и 249
нм.
Числовые показатели. Цельное сырье. Липолитическая активность не
менее 8,0 ЛЕ на 1 мг сырья, эфирного масла не менее 1,5 %, жирного масла
не менее 30 %, влажности - не более 7 %; золы общей - не более 12 %; золы,
нерастворимой в 10 % кислоте хлористоводородной не более 2 %; органиче­
ских примесей не более 3 %; минеральных примесей не более 1 %; других
частей чернушки - не более 0,5 %.
Примечание. Липолитическую активность определяют в сырье, предна­
значенном для получения препарата «Нигедаза», эфирно­
го масла - для эфирного масла, жирного масла - для
жирного масла.
Микробиологическая чистота. Испытания проводят в соответствии с
требованиями ГФ XII ОФС 42-0016-07. Категория 4 Б.
Количественное определение.
1. Около 1 г (точная навеска) семян помещают в небольшую ступку,
прибавляют 3 мл воды, накрывают часовым стеклом и выдерживают в термо­
стате при температуре 37° С в течение 24 часов. Затем семена тщательно рас­
тирают до однородной массы с 1 г кварцевого песка, прибавляют 5 мл ох­
лажденного (от - 4° С до - 10° С) ацетона и помещают в морозильное отделе­
ние холодильника (температура от -4° С до -10° С) на 10 минут. Ацетон де­
кантируют, остаток оставляют при комнатной температуре до удаления запа­
ха ацетона, затем смесь переносят при помощи 70 мл охлажденного 0,1%
раствора аммиака (+4° до +6° С) в мерную колбу вместимостью 100 мл и вы­
держивают на холоде (от +4 до +6° С) в течение 1 часа. После того, как колба
нагреется до комнатной температуры, доводят объем 0,1% раствором аммиа­
ка до метки, перемешивают и фильтруют (раствор А).
В колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл субстрата, 25 мл фосфатного
буферного раствора рН 9,0, взбалтывают, закрывают пробкой и смесь вы-
/S9
ФС 42-
С. 5
держивают в термостате при 37° С в течение 10 минут, затем прибавляют 1
мл раствора А и взбалтывают. Полученную смесь выдерживают в термостате
при 37 С в течение 1 часа, затем прибавляют 20 мл 95% спирта и количест­
венно переносят с помощью 50 мл 95% спирта в коническую колбу вмести­
мостью 200 мл, прибавляют 0,5 мл раствора фенолфталеина и титруют при
постоянном помешивании 0,1н раствором гидроксида натрия до появления
розовой окраски.
Параллельно проводят контрольный опыт в той же последова­
тельности, только испытуемый раствор прибавляют непосредственно перед
титрованием.
За единицу липолитической активности принимают такое количество
фермента, которое при 37 С в течение 1 часа освобождает 1 мкмоль олеино­
вой кислоты при гидролизе 40% эмульсии оливкового масла.
Липолитическую активность (X) в ЛЕ в пересчете на 1мг абсолютно
сухого сырья вычисляют по формуле:
_ (У± Х
~
• 100 • 100 • 100
т • (100 - W)
'ГД6
VQ)
Vi - объем 0,1н раствора гидроксида натрия, пошедшего на титрование
раствора А в миллилитрах;
Vo - объем 0,1н раствора гидроксида натрия, пошедшего на титрование
контрольного опыта в миллилитрах;
m - навеска семян в миллиграммах;
W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Примечания:
1. Приготовление 0,1% раствора аммиака. 2 мл концентрированного
раствора аммиака помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл и
доводят объем раствора водой до метки. Срок хранения раствора не ог­
раничен.
2. Приготовление фосфатного буферного раствора рН 9,0. 9,46 г на­
трия фосфата двузамещенного растворяют в свежепрокипяченой и ох­
лажденной воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем
раствора водой до метки (раствор А). 0,907 г калия фосфата однозамещенного растворяют в свежепрокипяченой и охлажденной воде в мер­
ной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до
метки, (раствор Б). 0,2 мл раствора Б помещают в мерную колбу вме­
стимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки раствором А.
ФС 42-
С. 6
Полученный буферный раствор хранится в холодильнике в течение 6
месяцев.
3. Приготовление субстрата. Смесь из 16 мл оливкового масла и 24 мл
раствора поливинилового спирта перемешивают в стакане микроразмельчителя тканей РТ-2 при 5000 об/мин в течение 15 минут. Субстрат
должен быть в эмульгированном состоянии.
4. Приготовление раствора поливинилового спирта. В колбу вместимо­
стью 1 л помещают 20 г поливинилового спирта и прибавляют 800 мл
воды, перемешивают и выдерживают в течение 30 минут при комнат­
ной температуре. Затем прибавляют 0,5 л 1 н раствора хлористоводо­
родной кислоты и нагревают на водяной бане при температуре 80-90° С
в течение 1 часа, периодически помешивая раствор. Раствор охлаждают
и доводят до рН 7 0,1н раствором гидроксида натрия. Раствор количе­
ственно переносят в мерную колбу вместимостью 1л, доводят объем
раствора водой до метки и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор
хранят в течение месяца в холодильнике.
2. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, прохо­
дящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Содержание эфирного
масла определяют в 20 г измельченного сырья методом 2. Время перегонки 3
часа («Определение содержания эфирного масла в лекарственном раститель­
ном сырье» ГФ XII).
3. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, прохо­
дящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, экстрагируют хлорофор­
мом в аппарате Сокслета, с последующим отгоном растворителя на роторноиспарительной установке при вакууме 0,8 атм. и температуре 60° С.
Упаковка. В мешки тканевые или льно-джуто-кенафные не более 40 кг
нетто.
Хранение. В соответствии с ОФС.
В сухом, защищенном от света месте.
Срок годности. 4 года для сырья, предназначенного для получения
препарата «Нигедаза», 2 года - для получения эфирного и жирного масла.
/6/
Приложение 3
Таблица 1 - Влияние однократного внутрижелудочного введения жирного
масла на общее состояние и поведенческие реакции мышейсамцов через 1 час после введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
1000 2000 3000
Показатель
Конт 500
Р
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
6
умеренная реакция Moderate
6
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
после перемещения из клетки
2
1
Upon removal
в течение взятия в руки
4
1
6
6
5
During handling
в течение перемещения и взятия в
5
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure) , состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
6
норма (normal)
6
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
норма
6
мидриаз
миоз
Уши (ears)
норма (normal)
6
6
6
6
6
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
норма (normal)
6
6
6
6
6
1
4000
5000
6
6
1
1
3
3
2
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
•/61
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
выпадение зубов (shedding)
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
норма (normal)
6
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
6
6
норма (normal)
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
норма (normal)
6
6
6
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
/62
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
снижена (hypoactive)
утрата позы
(abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
6
6
(просеивание, поднимание, ходьба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная
походка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
6
6
норма (normal)
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
нет (по)
6
6
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
норма (normal)
6
6
изменение цвета
(abnormal color)
наличие крови (blood present)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
3
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
4&*i
Таблица 2 - Влияние однократного внутрижелудочного введения жирно
го масла на общее состояние и поведенческие реакции мы­
шей-самцов через 24 часа после введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
Контр[.500 | 1000 [ 2000 3000
Наблюдения t ? руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
умеренная реакция Moderate
6
6
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
после перемещения из клетки
1
1
3
Upon removal
в течение взятия в руки
2
5
5
3
1
During handling
в течение перемещения и взятия в
4
5
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
6
6
норма (normal)
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
норма (normal)
6
выпадение зубов (shedding)
Показатель
4
4000
5000
6
6
1
1
3
3
2
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
i&b
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
6
норма (normal)
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
6
норма (normal)
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
6
6
норма (normal)
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
6
6
6
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
6
6
норма (normal)
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
снижена (hypoactive)
5
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
/66
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
6
6
(просеивание, поднимание, ходьба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная
походка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
6
6
норма (normal)
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
6
6
нет (по)
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета
(abnormal color)
наличие крови (bloodpresent)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
>
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
S£?
Таблица 3 - Влияние однократного внутрижелудочного введения эфирно­
го масла на общее состояние и поведенческие реакции мы­
шей-самцов через 1 час после введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
3000
6000 8000
Показатель
Контр 1000
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
2
низкая реакция Low
2
6
4
умеренная реакция Moderate
6
4
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
1
1
6
никакая None
после перемещения из клетки
1
1
1
1
Upon removal
в течение взятия в руки
4
4
5
5
During handling
в течение перемещения и взятия
в руки During removal and han­
dling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
2
6
6
6
6
(eyelids wide open)
4
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
6
6
норма (normal)
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
6
норма (normal)
7
70000 12000
6
6
6
6
2
2
4
4
6
6
6
6
6
6
6
6
168
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
выпадение зубов (shedding)
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
6
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
6
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
норма (normal)
6
6
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет (discolora­
tion)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
2
низкий
6
4
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
6
6
6
6
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (Motor activity)
6
4
6
3
норма (normal)
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
8
6
3
3
4
2
6
6
6
6
5
1
4
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
3
Y69
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
снижена (hypoactive)
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
6
6
(просеивание,
поднимание,
ходьба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная
походка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция ftiabitus)
норма (normal)
6
6
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
нет (по)
6
6
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (blood present)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
9
2
3
3
6
6
6
6
2
1
1
4
5
5
6
3
3
3
3
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
s?o
Таблица 4 - Влияние однократного внутрижелудочного введения эфирно­
го масла на общее состояние и поведенческие реакции
мы­
шей-самцов через 24 часа после введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
3000 6000 8000 ТОООО
Показатель
Kownfr ШЬ
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
6
умеренная реакция Moderate
6
5
4
3
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
1
1
после перемещения из клетки
1
1
Upon removal
в течение взятия в руки
2
3
4
2
3
During handling
в течение перемещения и взятия
в руки During removal and han­
1
2
1
2
dling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
3
6
5
4
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
3
6
5
4
норма (normal)
6
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
5
4
3
норма
6
мидриаз
миоз
Уши (ears)
3
6
5
4
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
4
3
норма (normal)
6
5
6
10
3
1
2
3
3
3
3
3
|
12000
Y7/
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
выпадение зубов (shedding)
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
5
4
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdis charge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
5
4
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
5
4
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
5
4
6
норма (normal)
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет (discolora­
tion)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
4
5
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
4
6
6
5
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
4
6
5
6
норма (normal)
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
11
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
41JL
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
снижена (hypoactive)
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание,
поднимание,
6
6
ходьба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия
(заторможенная
походка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
6
6
отсутствует
присутствует
Конституция (habitus)
6
6
норма (normal)
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
6
6
нет (по)
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (bloodpresent)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии (euthanized
in moribund)
12
5
4
3
3
5
4
3
3
5
4
3
3
5
4
3
3
5
4
3
3
5
4
3
3
5
4
3
3
ш
Таблица 5 - Влияние однократного внутрилселудочного введения порошка
семян чернушки дамасской па общее состояние и поведенче­
ские реакции мышей-самцов через 1 час после введения
№
Дозы, мг/кг
1000 2000 3000
Показатель
Контр] 500
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
умеренная реакция Moderate
6
6
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
1
1
1
после перемещения из клетки
1
2
1
Upon removal
в течение взятия в руки
4
3
4
5
3
During handling
в течение перемещения и взятия в
1
1
1
1
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
норма (normal)
6
6
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
6
норма (normal)
выпадение зубов (shedding)
А
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
13
4000
5000
6
6
1
1
3
3
2
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
/74
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
6
6
норма (normal)
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
умеренный
6
6
высокий
Конечности (extremities)
6
6
6
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
6
6
норма (normal)
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
снижена (hypoactive)
14
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
/?r
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание, поднимание, ходь­
6
6
ба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная
походка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
норма (normal)
6
6
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
6
6
нет (по)
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (blood present)
Другое (other)
6
нет (по)
6
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
15
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
на
Таблица 6 - Влияние однократного внутрижелудочного введения порошка
семян чернушки дамасской и поведенческие реакции мышейсамцов через 24 часа после введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
1000 2000 3000
Показатель
Контр 500
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
6
6
умеренная реакция Moderate
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
после перемещения из клетки
3
1
1
Upon removal
в течение взятия в руки
3
1
2
5
5
During handling
в течение перемещения и взятия в
5
4
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
6
норма (normal)
6
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
норма (normal)
6
выпадение зубов (shedding)
X
-/000
5000
6
6
1
1
3
3
2
2
6
6
6
6
6
.6
6
6
6
6
У7?
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
норма (normal)
6
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
6
6
норма (normal)
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
норма (normal)
6
6
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
снижена (hypoactive)
17
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Ш
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание, поднимание, ходь­
6
6
ба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная по­
ходка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
6
6
норма (normal)
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разног
Кровотечение (hemorrhage)
6
6
нет (по)
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (bloodpresent)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
18
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
<Ч9
Таблица 7 -
Влияние однократного внутрижелудочного введения сухого
экстракта на общее состояние и поведенческие
реакции
мышей-самцов через 1 час после введения
№
Показатель
Дозы, мг/кг
1500 3000 4500
Контр] 500
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
6
умеренная реакция Moderate
6
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
1
после перемещения из клетки
1
2
2
1
Upon removal
в течение взятия в руки
4
4
4
3
4
During handling
в течение перемещения и взятия в
1
1
1
1
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
6
6
норма (normal)
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
6
норма (normal)
выпадение зубов (shedding)
1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
19
6500
9000
6
6
1
1
3
3
2
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
4SO
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
6
норма (normal)
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
6
норма (normal)
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
6
6
норма (normal)
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный
цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
умеренный
6
высокий
Конечности (extremities)
6
6
6
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
6
норма (normal)
6
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
снижена (hypoactive)
20
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
y<f/
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание, поднимание, ходь­
6
6
ба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная по­
ходка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
6
6
отсутствует
присутствует
Конституция (habitus)
6
норма (normal)
6
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
6
нет (по)
6
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (bloodpresent)
Другое (other)
6
нет (по)
6
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
21
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
48L
Таблица 8 - Влияние однократного внутрижелудочного введения сухого
экстракта на поведенческие реакции мышей-самцов через 24
часа после введения
№
Дозы, мг/кг
1500 3000 4500
Показатель
КонтА 500
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
6
6
умеренная реакция Moderate
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
1
никакая None
1
после перемещения из клетки
1
3
1
Upon removal
в течение взятия в руки
4
3
5
2
4
During handling
в течение перемещения и взятия в
2
1
1
1
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
норма (normal)
6
6
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge) •
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
6
норма (normal)
выпадение зубов (shedding)
1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
22
6500
9000
6
6
1
1
1
2
3
2
2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
m
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
норма (normal)
6
6
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный
цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
6
6
норма (normal)
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
6
норма (normal)
6
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
снижена (hypoactive)
23
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
ш
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание, поднимание, ходь­
6
6
ба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная по­
ходка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
норма (normal)
6
6
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
нет (по)
6
6
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (blood present)
Другое (other)
6
нет (по)
6
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
24
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
us
Таблица 9 - Влияние однократного внутрижелудочного введения экс­
трактивных веществ, извлеченных водой, на общее состоя­
ние и поведенческие реакции мышей-самцов через 1 час после
введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
1500 3000 \ 4500
Показатель
Контд 500
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
умеренная реакция Moderate
6
6
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
1
1
после перемещения из клетки
1
1
1
2
Upon removal
в течение взятия в руки
3
3
4
3
3
During handling
в течение перемещения и взятия в
2
2
2
1
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure , состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
норма (normal)
6
6
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
норма (normal)
6
6
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
норма (normal)
6
6
6
6
6
25
6000
700О
6
6
1
1
1
3
3
2
1
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7cf£
8.
9.
10.
И.
12.
13.
14.
выпадение зубов (shedding)
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
норма (normal)
6
6
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный
цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
умеренный
6
высокий
Конечности (extremities)
6
6
6
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
6
6
норма (normal)
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
26
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
/J?
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
снижена (hypoactive)
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание, поднимание, ходь­
6
6
ба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная по­
ходка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
норма (normal)
6
6
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
6
6
нет (по)
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (bloodpresent)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
27
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
m
Таблица 10 - Влияние однократного внутрижелудочного введения экс­
трактивных веществ, извлеченных водой, на поведенче­
ские реакции мышей-самцов через 24 часа после введения
№
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Дозы, мг/кг
1500 3000 4500
Показатель
КонтА 500
Наблюдения в руках
Реакция на взятие в руки (reactivity to handling)
никакой реакции None
низкая реакция Low
умеренная реакция Moderate
6
6
6
6
6
высокая реакция High
Вокализация (vocalization)
никакая None
1
после перемещения из клетки
1
2
Upon removal
в течение взятия в руки
4
3
4
5
3
During handling
в течение перемещения и взятия в
1
2
1
2
руки During removal and handling
Палпебральное закрытие (palpebral closure), состояние глазной щели
веки широко открыты
6
6
6
6
6
(eyelids wide open)
птоз (ptosis)
веки полностью закрыты
(eyelids completely closed)
Осмотр животных в клетке
Глаза (eyes)
6
6
6
6
6
норма (normal)
ксерофтальмия (xerophthalmus)
слезотечение (lacrimation)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
отечность (edematization)
Экзофтальм Exophthalmos
Зрачковый статус (относительно условий освещения комнаты).
Лаборант наблюдает состояние зрачков
6
6
6
6
6
норма
мидриаз
миоз
Уши (ears)
6
6
6
6
6
норма (normal)
покраснение (hyperemia)
нагноение (discharge)
воспаление (inflammation)
бледность (paleness)
Зубы (teeth)
6
6
6
6
6
норма (normal)
выпадение зубов (shedding)
28
6000
7000
6
6
1
3
3
2
3
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
№
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
сломанные зубы (broken)
изменение цвета зубов
(altered color)
Hoc (nose)
норма (normal)
6
6
6
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
умеренные выделения
(temperate discharge)
обильные выделения
(abundantdischarge)
Слюнотечение (salivation)
норма (normal)
6
6
6
гиперсаливация (hypersalivation)
ксеростомия (xerostomia)
Дыхание (respiration)
норма (normal)
6
6
6
поверхностное (altered depth)
периодическое (altered rhythm)
одышка (dyspnea)
патологические звуки
(pathologic sounds)
нарушение носового дыхания
(affected nasal passability)
Внешний вид шерсти (hair coat)
норма (normal)
6
6
6
взъерошенность (rumpleness)
выпадение шерсти (shedding)
утрата блеска (loss of luster)
неестественный цвет
(discoloration)
грязная шерсть (dirtiness)
Тонус мускулатуры
никакой
низкий
6
6
6
умеренный
высокий
Конечности (extremities)
6
6
б
норма (normal)
бледность (paleness)
покраснение (hyperemia)
отечность (edematization)
Наблюдение на открытой площадке
Двигательная активность (motor activity)
6
6
6
норма (normal)
повышена (hyperactive)
возбуждение (anxiety)
нарушение реакции
(abnormal response)
снижена (hypoactive)
29
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
утрата позы (abnormal posture)
заторможенность (retardation)
Осанка, положение
типичный диапазон положений
(просеивание, поднимание, ходь­
6
6
ба)
нетипичный (н-р, низкая осанка,
сутулая, обессиленная)
Отклонения походки (gait) - тип и серьезность
норма (normal)
6
6
атаксия (ataxia)
нарушение координации
(altered coordination)
подергивания (twitches)
тремор (tremors)
судороги (convulsions)
ретропульсия (заторможенная по­
ходка) (retropulsion)
ходьба на цыпочках (tiptoe)
Другое необычное поведение
отсутствует
6
6
присутствует
Конституция (habitus)
норма (normal)
6
6
истощение (wasting)
неправильное телосложение
(abnormal constitution)
ожирение (obesity)
Разное
Кровотечение (hemorrhage)
6
нет (по)
6
умеренное (moderate)
тяжелое (severe)
источник (site)
Выделения (excreta)
6
6
норма (normal)
изменение цвета (abnormal color)
наличие крови (bloodpresent)
Другое (other)
6
6
нет (по)
травма (trauma)
пальпируемые образования
(palpable mass)
покусы (bites)
смерть (found dead)
умерщвлено в агонии
(euthanized in moribund)
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6