Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тихоокеанский Государственный Медицинский Университет» Министерства Здравоохранения Российской Федерации ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕСТВЕННОГО ЗДОРОВЬЯ Кафедра клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии КУРСОВАЯ РАБОТА По дисциплине Клиническая лабораторная диагностика. Лабораторная аналитика. Менеджмент качества. Клиническая диагностика : Исследование функционального состояния митохондрий лейкоцитов у пациентов с острым коронарным синдромом на фоне сахарного диабета 2 типа Работу выполнила: студентка 601 группы МБХ Колбина Екатерина Витальевна Преподаватель: Долгополов Максим Сергеевич, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии Владивосток, 2021 Оглавление Введение......................................................................................................... 3 2.Материалы и методы ................................................................................. 5 2.1. Материалы исследования .................................................................. 5 2.2. Методы исследования: ...................................................................... 5 2.2.1. Исследование ферментативной активности митохондрий при помощи метода спектрофотометрии. ............................................................ 5 2.2.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий .......... 7 2.3. Методы статистического анализа .................................................... 7 3. Результаты исследования .................................................................... 8 3.1 Оценка состояния мембранного митохондриального потенциала 8 3.2. Оценка ферментативной активности митохондрий лейкоцитов .. 8 Сукцинатдегидрогеназа ........................................................................ 8 Глутатионредуктаза .............................................................................. 9 Заключение .................................................................................................. 11 2 Введение В 2019 г. диабет стал непосредственной причиной 1,5 миллиона случаев смерти. Однако для получения более точного представления о смертности от диабета к этому следует добавить случаи смерти от сердечнососудистых заболеваний, хронических заболеваний почек и туберкулеза, вызванных повышенным по сравнению с оптимальным уровнем глюкозы в крови. В 2012 г. (за который имеются последние данные) произошло еще 2,2 миллиона случаев смерти, обусловленных высоким уровнем глюкозы в крови. С 2000 по 2016 г. преждевременная смертность от диабета увеличилась на 5%. В странах с высоким уровнем дохода уровень преждевременной смертности от диабета снижался с 2000 по 2010 г. но затем вновь увеличился в 2010–2016 гг. В странах с уровнем дохода ниже среднего прирост преждевременной смертности от диабета имел место в оба этих периода. По данным ВОЗ и Международной федерации диабета от этой болезни и ее осложнений каждый год погибают миллионы людей. Число больных диабетом в возрасте 20—79 лет на 2019 год составляет примерно 463 млн человек.. Среди людей старше 65 лет диабет у 136 млн человек. Людей 20— 79 лет с нарушением толерантности к глюкозе в мире около 374 млн. Несмотря на снижение скорости прироста заболевания в некоторых европейских странах, ежегодный прирост остается на уровне 3,4%. В России с 2010 по 2019 год впервые выявленные случаи сахарного диабета увеличились на 23%. И уже по сравнению с началом 2019 года численность пациентов с диагнозом «сахарный диабет» выросла среди взрослых на 4,7%, среди детей — на 5,3%. Так, на начало 2020 года среди взрослых зарегистрировано 5,1 млн заболеваний сахарного диабета. Помимо того, что сахарный диабет сам по себе является серьезным хроническим заболеванием, которое снижает качество жизни пациента и может привести к развитию состояний, угрожающих жизни, он также 3 является фактором риска для развития многих других заболеваний, в том числе заболеваний сердечно-сосудистой системы. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются одной из ведущих причин смертности и выхода на инвалидность в трудоспособном возрасте. Ежегодно от ССЗ умирает 16,7 млн. человек, из них 7,4 млн. – от ишемической болезни сердца (ИБС). Основной причиной в структуре смертности от ИБС является острый коронарный синдром (ОКС). В России ежегодно регистрируется, в среднем, 520 тыс. случаев ОКС, из них 36,4% составляет инфаркт миокарда (ИМ) и 63,6% нестабильная стенокардия (НС). В 2014 г. в России от ИМ скончалось 63,9 тыс. человек. Нарушения углеводного обмена и нарушения кровообращения могут привести к нарушению нормальной жизнедеятельности клетки вследствие недостатка глюкозы и кислорода. Изучение изменений жизнедеятельности клетки при указанных состояниях может помочь глубже понять их влияние на организм в целом. Эти факты обосновывают актуальность данной работы. Цель данной работы – изучить функциональное состояние митохондрий пациентов с острым коронарным синдромом и сахарным диабетом 2 типа. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: 1. Изучить активность ферментов митохондрий пациентов с ОКС и сахарным диабетом второго типа. 2. Исследовать изменения мембранного потенциала клеток пациентов с ОКС и сахарным диабетом второго типа. 3. Провести статистический анализ полученных результатов. 4 2.Материалы и методы 2.1. Материалы исследования Для проведения исследования использовалась периферическая кровь 30 человек, 10 из которых принадлежали к контрольной группе, т.е. являлись относительно здоровыми, 10 пациентов с острым коронарным синдромом и 10 пациентов с ОКС и сахарным диабетом 2 типа. Исследование проводилось на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Тихоокеанского государственного медицинского университета. Забор биологического материала для исследования производился путем венепункции. Кровь собирали в вакуумные пробирки с ЭДТА для выделения лейкоцитов и пробирки с активатором свертывания для получения сыворотки. 2.2. Методы исследования: 2.2.1. Исследование ферментативной активности митохондрий при помощи метода спектрофотометрии. При помощи спектрофотометра Экохим ПЭ-5300ВИ проводились следующие исследования: 2.2.1.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы: Исследование активности сукцинатдегидрогеназы проводится при помощи набора реагентов Abcam (ab228560). В этом анализе, сукцинатдегидрогеназа превращает сукцинат в фумарат, и переводит электрон на искусственный акцептор электронов (зонд), который меняет цвет с синего на бесцветный. Этот набор для анализа может обнаруживать менее 0,1 мЕ активности сукцинатдегидрогеназы в разнообразных образцах. Измерение результатов реакции проводится колориметрически при длине волны 600нм. 2.2.1.2. Определение активности глутатионредуктазы Глутатионредуктаза катализирует НАДФН-зависимое восстановление окисленного глутатиона (GSSG) до восстановленного глутатиона (GSH). 5 Высокое соотношение GSH / GSSG необходимо для защиты клетки от окислительного стресса. Исследование активности глутатионредуктазы проводится с использованием набора для анализа Abcam. В этом анализе глутатионредуктаза восстанавливает GSSG до GSH, который реагирует с 5,5'дитиобис(2-нитробензойной кислотой) с образованием соединения желтого цвета, содержание которого может быть измерено при длине волны 405 нм. Анализ может обнаруживать 0,1-40 мЕд / мл глутатионредуктазы в различных образцах. 2.2.1.3. Определение концентрации сукцината Измерение уровня сукцината или янтарной кислоты является важным ключом к анализу цикла Кребса. Для исследования используется набор для анализа Abcam (ab204718). В этом анализе сукцинат используется сукцинилКоА-синтетазой для образования промежуточного продукта, который претерпевает ряд реакций и восстанавливает бесцветный зонд до окрашенного продукта с сильным поглощением при 450 нм. Этот набор для анализа может обнаруживать менее 40 мкМ сукцината или янтарной кислоты в различных типах образцов. 2.2.1.4. Определение активности супероксиддисмутазы Для определения активности суперокиддисмутазы используется набор для анализа Abcam (ab65354). Супероксиддисмутаза относится к группе антиоксидантных ферментов. Вместе с каталазой и другими антиоксидантными ферментами она защищает организм человека от постоянно образующихся высокотоксичных кислородных радикалов. Супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода. Измерение результатов колориметрически при длине волны 450нм. 6 реакции проводится 2.2.1.5. Анализ перекисного окисления липидов Набор для анализа перекисного окисления липидов Abcam (ab233471) предлагает метод измерения малонового диальдегида (MDA), при котором реагент реагирует с MDA с образованием продукта синего цвета, который может быть измерен при 695 нм с помощью считывающих устройств для микропланшетов. Этот анализ очень быстрый и специфичный для MDA с небольшой интерференцией со стороны других альдегидов. 2.2.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий Для исследования мембранного потенциала митохондрий использовался краситель JС-10 от производителя Abcam (ab112133). В нормальных клетках, JC-10 концентрируется в митохондриальном матриксе, где он образует красные флуоресцентные агрегаты. Однако в апоптотических и некротических клетках, JC-10 существует в мономерной форме и окрашивает клетки в зеленый. Производилось окрашивание лейкоцитов, после чего образец наносился на предметное стекло. После заключения препарата под покровное стекло, производилась микроскопия препарата с помощью светооптического микроскопа ZEISS Axio Scope A1 с флуоресцентным иллюминатором Zeiss Colibri.2. Изучалась флуоресценция окрашеных клеток при длине волны 470нм для мономерной формы JС-10 и 590нм для J-агрегатов. 2.3. Методы статистического анализа Данные, полученные при проведении исследований, обрабатывались при помощи Microsoft Excel 2010. Определяли среднее значение показателя в группе, стандартное отклонение, оценивали статистическую значимость различий по t-критерию Стьюдента. 7 3. Результаты исследования 3.1 Оценка состояния мембранного митохондриального потенциала В ходе исследования были получены данные, представленные на рисунке 1. 70,00% 65,80% 61,90% 60,00% 54,70% 50,00% 45,30% 39,10% 40,00% Неповрежденные митохондрии 34,20% 30,00% Поврежденные митохондрии 20,00% 10,00% 0,00% Контрольная Пациенты с ОКСПациенты с ОКС группа и СД 2 типа Рис.1 Показатели состояния митохондрий в периферической крови Так, у относительно здоровых пациентов контрольной группы наблюдалось наибольшее количество неповрежденных митохондрий, и наименьшее поврежденных (54,7%2,26% и 45,3%3,5% соответственно). Между контрольной группой и группами пациентов с патологиями наблюдаются статистически значимые различия при p<0,05, в то время как между группами пациентов с патологиями различия оказались статистически незначимыми. 3.2. Оценка ферментативной активности митохондрий лейкоцитов Сукцинатдегидрогеназа У здоровых лиц наблюдалась наибольшая активность сукцинатдегидрогеназы 63,34,19мкмоль/мл, она статистически значимо снижается у пациентов двух других групп (у пациентов с ОКС 47,94,15 8 мкмоль/мл и у паациентов с ОКС и СД 2 типа 38,93,84 мкмоль/мл). Различия между группами пациентов оказались статистически незначимыми. 70 63,3 60 47,9 50 38,9 40 Активность сукцинатдегидрогеназы (мкмоль/мл) 30 20 10 0 Контрольная группа Пациенты с ОКС Пациенты с ОКС и СД 2 типа Рис.2 Активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриях лейкоцитов переферической крови (мкмоль/мл) Глутатионредуктаза 3 2,7 2,8 2,5 2 1,6 1,5 Активность глутатиондегидрогеназы (мкмоль/мл) 1 0,5 0 Контрольная группа Пациенты с ОКС Пациенты с ОКС и СД 2 типа Рис.3 Активность глутатиондегидрогеназы в митохондриях лейкоцитов переферической крови (мкмоль/мл) 9 Полученные данные демонстрируют (рис.3), что в контрольной группе активность глутатионредуктазы составила 1,60,5 мкмоль/мл, а в группах пациентов с ОКС и с ОКС и СД 2 типа 2,71,2 мкмоль/мл и 2,80,9 мкмоль/мл соответственно. Различия между группами незначимы. 10 статистически Заключение Таким образом, был проведен комплекс исследований функциональной активности митохондрий лейкоцитов переферической крови. Данные исследования были основаны на определении активности митохондриальных ферментов, а также структурной целостности митохондрий. Полученые данные позволяют сделать следующие выводы: 1. При изучении активности сукцинатдегидрогеназы были обнаружены статистически значимые различия между результатами разных групп, при измерении активности глутатиондегидрогеназы статистически значимых различии обнаружено не было. 2. Определенно, что наличие ОКС и СД 2 типа приводит к наибольшему повреждению митохондрий. 11