Загрузил Драуде Воцвелк

Документ 6314638

Реклама
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
образования «Тихоокеанский Государственный Медицинский Университет»
Министерства Здравоохранения Российской Федерации
ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕСТВЕННОГО ЗДОРОВЬЯ
Кафедра клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии
КУРСОВАЯ РАБОТА
По дисциплине Клиническая лабораторная диагностика. Лабораторная аналитика.
Менеджмент качества. Клиническая диагностика
:
Исследование функционального состояния митохондрий лейкоцитов у
пациентов с острым коронарным синдромом на фоне сахарного диабета
2 типа
Работу выполнила:
студентка 601 группы МБХ
Колбина Екатерина Витальевна
Преподаватель:
Долгополов Максим Сергеевич,
ассистент кафедры клинической
лабораторной диагностики, общей и
клинической иммунологии
Владивосток, 2021
Оглавление
Введение......................................................................................................... 3
2.Материалы и методы ................................................................................. 5
2.1. Материалы исследования .................................................................. 5
2.2. Методы исследования: ...................................................................... 5
2.2.1. Исследование ферментативной активности митохондрий при
помощи метода спектрофотометрии. ............................................................ 5
2.2.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий .......... 7
2.3. Методы статистического анализа .................................................... 7
3.
Результаты исследования .................................................................... 8
3.1 Оценка состояния мембранного митохондриального потенциала 8
3.2. Оценка ферментативной активности митохондрий лейкоцитов .. 8
Сукцинатдегидрогеназа ........................................................................ 8
Глутатионредуктаза .............................................................................. 9
Заключение .................................................................................................. 11
2
Введение
В 2019 г. диабет стал непосредственной причиной 1,5 миллиона
случаев смерти. Однако для получения более точного представления о
смертности от диабета к этому следует добавить случаи смерти от сердечнососудистых заболеваний, хронических заболеваний почек и туберкулеза,
вызванных повышенным по сравнению с оптимальным уровнем глюкозы в
крови. В 2012 г. (за который имеются последние данные) произошло еще 2,2
миллиона случаев смерти, обусловленных высоким уровнем глюкозы в
крови.
С 2000 по 2016 г. преждевременная смертность от диабета увеличилась
на 5%. В странах с высоким уровнем дохода уровень преждевременной
смертности от диабета снижался с 2000 по 2010 г. но затем вновь увеличился
в 2010–2016 гг. В странах с уровнем дохода ниже среднего прирост
преждевременной смертности от диабета имел место в оба этих периода.
По данным ВОЗ и Международной федерации диабета от этой болезни
и ее осложнений каждый год погибают миллионы людей. Число больных
диабетом в возрасте 20—79 лет на 2019 год составляет примерно 463 млн
человек.. Среди людей старше 65 лет диабет у 136 млн человек. Людей 20—
79 лет с нарушением толерантности к глюкозе в мире около 374 млн.
Несмотря на снижение скорости прироста заболевания в некоторых
европейских странах, ежегодный прирост остается на уровне 3,4%.
В России с 2010 по 2019 год впервые выявленные случаи сахарного
диабета увеличились на 23%. И уже по сравнению с началом 2019 года
численность пациентов с диагнозом «сахарный диабет» выросла среди
взрослых на 4,7%, среди детей — на 5,3%. Так, на начало 2020 года среди
взрослых зарегистрировано 5,1 млн заболеваний сахарного диабета.
Помимо того, что сахарный диабет сам по себе является серьезным
хроническим заболеванием, которое снижает качество жизни пациента и
может привести к развитию состояний, угрожающих жизни, он также
3
является фактором риска для развития многих других заболеваний, в том
числе заболеваний сердечно-сосудистой системы.
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются одной из ведущих
причин смертности и выхода на инвалидность в трудоспособном возрасте.
Ежегодно от ССЗ умирает 16,7 млн. человек, из них 7,4 млн. – от
ишемической болезни сердца (ИБС). Основной причиной в структуре
смертности от ИБС является острый коронарный синдром (ОКС). В России
ежегодно регистрируется, в среднем, 520 тыс. случаев ОКС, из них 36,4%
составляет инфаркт миокарда (ИМ) и 63,6% нестабильная стенокардия (НС).
В 2014 г. в России от ИМ скончалось 63,9 тыс. человек.
Нарушения углеводного обмена и нарушения кровообращения могут
привести к нарушению нормальной жизнедеятельности клетки вследствие
недостатка глюкозы и кислорода. Изучение изменений жизнедеятельности
клетки при указанных состояниях может помочь глубже понять их влияние
на организм в целом. Эти факты обосновывают актуальность данной
работы.
Цель
данной
работы
–
изучить
функциональное
состояние
митохондрий пациентов с острым коронарным синдромом и сахарным
диабетом 2 типа.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы
следующие задачи:
1. Изучить активность ферментов митохондрий пациентов с ОКС и
сахарным диабетом второго типа.
2. Исследовать изменения мембранного потенциала клеток пациентов
с ОКС и сахарным диабетом второго типа.
3. Провести статистический анализ полученных результатов.
4
2.Материалы и методы
2.1. Материалы исследования
Для проведения исследования использовалась периферическая кровь 30
человек, 10 из которых принадлежали к контрольной группе, т.е. являлись
относительно здоровыми, 10 пациентов с острым коронарным синдромом и
10 пациентов с ОКС и сахарным диабетом 2 типа. Исследование проводилось
на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Тихоокеанского
государственного медицинского университета.
Забор биологического материала для исследования производился путем
венепункции. Кровь собирали в вакуумные пробирки с ЭДТА для выделения
лейкоцитов и пробирки с активатором свертывания
для получения
сыворотки.
2.2. Методы исследования:
2.2.1. Исследование ферментативной активности митохондрий при
помощи метода спектрофотометрии.
При помощи спектрофотометра Экохим ПЭ-5300ВИ проводились
следующие исследования:
2.2.1.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы:
Исследование активности сукцинатдегидрогеназы проводится при
помощи
набора
реагентов
Abcam
(ab228560).
В
этом
анализе,
сукцинатдегидрогеназа превращает сукцинат в фумарат, и переводит
электрон на искусственный акцептор электронов (зонд), который меняет цвет
с синего на бесцветный. Этот набор для анализа может обнаруживать менее
0,1 мЕ активности сукцинатдегидрогеназы в разнообразных образцах.
Измерение результатов реакции проводится колориметрически при длине
волны 600нм.
2.2.1.2. Определение активности глутатионредуктазы
Глутатионредуктаза катализирует НАДФН-зависимое восстановление
окисленного глутатиона (GSSG) до восстановленного глутатиона (GSH).
5
Высокое соотношение GSH / GSSG необходимо для защиты клетки от
окислительного стресса. Исследование активности глутатионредуктазы
проводится с использованием набора для анализа Abcam. В этом анализе
глутатионредуктаза восстанавливает GSSG до GSH, который реагирует с 5,5'дитиобис(2-нитробензойной кислотой) с образованием соединения желтого
цвета, содержание которого может быть измерено при длине волны 405 нм.
Анализ может обнаруживать 0,1-40 мЕд / мл глутатионредуктазы в
различных образцах.
2.2.1.3. Определение концентрации сукцината
Измерение уровня сукцината или янтарной кислоты является важным
ключом к анализу цикла Кребса. Для исследования используется набор для
анализа Abcam (ab204718). В этом анализе сукцинат используется сукцинилКоА-синтетазой для образования промежуточного продукта, который
претерпевает
ряд
реакций
и
восстанавливает
бесцветный
зонд
до
окрашенного продукта с сильным поглощением при 450 нм. Этот набор для
анализа может обнаруживать менее 40 мкМ сукцината или янтарной кислоты
в различных типах образцов.
2.2.1.4. Определение активности супероксиддисмутазы
Для определения активности суперокиддисмутазы используется набор
для анализа Abcam (ab65354). Супероксиддисмутаза относится к группе
антиоксидантных
ферментов.
Вместе
с
каталазой
и
другими
антиоксидантными ферментами она защищает организм человека от
постоянно
образующихся
высокотоксичных
кислородных
радикалов.
Супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксида в кислород и
пероксид
водорода.
Измерение
результатов
колориметрически при длине волны 450нм.
6
реакции
проводится
2.2.1.5. Анализ перекисного окисления липидов
Набор для анализа перекисного окисления липидов Abcam (ab233471)
предлагает метод измерения малонового диальдегида (MDA), при котором
реагент реагирует с MDA с образованием продукта синего цвета, который
может быть измерен при 695 нм с помощью считывающих устройств для
микропланшетов. Этот анализ очень быстрый и специфичный для MDA с
небольшой интерференцией со стороны других альдегидов.
2.2.2. Исследование мембранного потенциала митохондрий
Для
исследования
мембранного
потенциала
митохондрий
использовался краситель JС-10 от производителя Abcam (ab112133). В
нормальных клетках, JC-10 концентрируется в митохондриальном матриксе,
где он образует красные флуоресцентные агрегаты. Однако в апоптотических
и некротических клетках, JC-10 существует в мономерной форме и
окрашивает клетки в зеленый. Производилось окрашивание
лейкоцитов,
после чего образец наносился на предметное стекло. После заключения
препарата под покровное стекло, производилась микроскопия препарата с
помощью
светооптического
микроскопа
ZEISS
Axio
Scope
A1
с
флуоресцентным иллюминатором Zeiss Colibri.2. Изучалась флуоресценция
окрашеных клеток при длине волны 470нм для мономерной формы JС-10 и
590нм для J-агрегатов.
2.3. Методы статистического анализа
Данные, полученные при проведении исследований, обрабатывались
при помощи Microsoft Excel 2010. Определяли среднее значение показателя в
группе, стандартное отклонение, оценивали статистическую значимость
различий по t-критерию Стьюдента.
7
3. Результаты исследования
3.1 Оценка состояния мембранного митохондриального потенциала
В ходе исследования были получены данные, представленные на
рисунке 1.
70,00%
65,80%
61,90%
60,00%
54,70%
50,00%
45,30%
39,10%
40,00%
Неповрежденные
митохондрии
34,20%
30,00%
Поврежденные
митохондрии
20,00%
10,00%
0,00%
Контрольная Пациенты с ОКСПациенты с ОКС
группа
и СД 2 типа
Рис.1 Показатели состояния митохондрий в
периферической крови
Так, у относительно здоровых пациентов контрольной группы
наблюдалось наибольшее количество неповрежденных митохондрий, и
наименьшее поврежденных (54,7%2,26% и 45,3%3,5% соответственно).
Между контрольной группой и группами пациентов с патологиями
наблюдаются статистически значимые различия при p<0,05, в то время как
между группами пациентов с патологиями различия оказались статистически
незначимыми.
3.2. Оценка ферментативной активности митохондрий лейкоцитов
Сукцинатдегидрогеназа
У
здоровых
лиц
наблюдалась
наибольшая
активность
сукцинатдегидрогеназы 63,34,19мкмоль/мл, она статистически значимо
снижается у пациентов двух других групп (у пациентов с ОКС 47,94,15
8
мкмоль/мл и у паациентов с ОКС и СД 2 типа 38,93,84 мкмоль/мл).
Различия между группами пациентов оказались статистически незначимыми.
70
63,3
60
47,9
50
38,9
40
Активность
сукцинатдегидрогеназы
(мкмоль/мл)
30
20
10
0
Контрольная
группа
Пациенты с
ОКС
Пациенты с
ОКС и СД 2
типа
Рис.2 Активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриях
лейкоцитов переферической крови (мкмоль/мл)
Глутатионредуктаза
3
2,7
2,8
2,5
2
1,6
1,5
Активность
глутатиондегидрогеназы
(мкмоль/мл)
1
0,5
0
Контрольная
группа
Пациенты с
ОКС
Пациенты с
ОКС и СД 2
типа
Рис.3 Активность глутатиондегидрогеназы в митохондриях
лейкоцитов переферической крови (мкмоль/мл)
9
Полученные данные демонстрируют (рис.3), что в контрольной группе
активность глутатионредуктазы составила 1,60,5 мкмоль/мл, а в группах
пациентов с ОКС и с ОКС и СД 2 типа 2,71,2 мкмоль/мл и 2,80,9
мкмоль/мл соответственно. Различия
между группами
незначимы.
10
статистически
Заключение
Таким образом, был проведен комплекс исследований функциональной
активности митохондрий лейкоцитов переферической крови. Данные
исследования были основаны на определении активности митохондриальных
ферментов, а также структурной целостности митохондрий. Полученые
данные позволяют сделать следующие выводы:
1.
При
изучении
активности
сукцинатдегидрогеназы
были
обнаружены статистически значимые различия между результатами разных
групп, при измерении активности глутатиондегидрогеназы статистически
значимых различии обнаружено не было.
2.
Определенно, что наличие ОКС и СД 2 типа приводит к
наибольшему повреждению митохондрий.
11
Скачать