Загрузил verle_olga

otsenka-tsitotoksichnosti-substantsii-poviargol-in-vitro

реклама
Научные исследования
ЛИТЕРАТУРА
1. Ариэль Б.М. Саркоидоз: от морфологии к этиологии и патогенезу // Актуальные вопросы диагностики
и лечения туберкулеза: Труды Всероссийской науч.практич. конфер. – СПб., 2005. – С.239–243.
2. Бакенова Р.А., Тусупбекова М.М. // Морфология и доказательная медицина. – 2011. – №3–4. –
С.68–70.
3. Тусупбекова М.М. и др. // Клинич. медицина Казахстана. – 2011. – №3, 4 (22, 23). – С.17.
4. Двораковская И.В. Диагностика саркоидоза /
И.В. Двораковская, Б.М. Ариэль. – СПб., 2005. – 44 с.
5. Коган Е.А., Корнев Б.М., Попова Е.Н. Интерстициальные болезни легких: Практич. рук-во / Н.А. Мухин. – М., 2007. – 432 с.
6. Мухин Н.А. Интерстициальные болезни легких. –
М., 2007. – С.120–155.
7. Терпигорев С.А. и др. // Вестник РАМН. – 2012. –
№5. – С.30–37.
8. Тусупбекова М.М., Бакенова Р.А., Досмагамбетова Р.С. // Медицина и экология. – 2011. – №4 (61).
– С.75–80.
9. Тусупбекова М.М. Основы гистологической техники и методы гистологического исследования
аутопсийного, операционно-биопсийного и экспе-
м
н
риментального материала. Метод. реком. – 2005.
– С.4–44.
10. Goknar N., Cakir Er., Cakir F.B., et al. // Hematology
reports. – 2015. – Vol.7, Issue 2. – P.5644.
11. Шмелев Е.И. // Consilium medicum. – 2003. – Т.5,
№4. – С.176–181.
12. Черняев А.Л., Самсонова М.В. Патологическая
анатомия легких: Атлас / Под ред. А.Г. Чучалина. –
М., 2011. – 112 с.
Поступила 27.05.2016 г.
Статья размещена
на сайте www.mednovosti.by (Архив МН)
и может быть скопирована в формате Word.
Оценка цитотоксичности субстанции
повиаргол in vitro
Довнар А.Г.1, Свирчевская Е.Ю.2, Ржеусский С.Э.3, Самойлович Е.О.2
Белорусский государственный медицинский университет, Минск
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь
3
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Беларусь
1
2
Dounar H.G.1, Svircheuskaya E.Y.2, Rzheussky S.E.3, Samailovich E.O.2
2
1
Belarussian State Medical University, Minsk
Republican Scientific and Practical Centre of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus
3
Vitebsk State Order of Peoples’ Friendship Medical University, Belarus
Cytotoxicity assessment of poviargol substance in vitro
Резюме. Одним из этапов фармацевтической разработки новых лекарственных средств является их токсическая оценка, к которой относится
изучение цитотоксичности. В статье представлены результаты исследования in vitro цитотоксичности фармацевтической субстанции повиаргол,
представляющей собой металлическое высокодисперсное серебро. Оценку цитотоксичности повиаргола проводили на клетках эпидермоидной
карциномы гортани человека HEp-2C с использованием световой микроскопии и МТТ-теста. Установлено, что IC50 для субстанции повиаргол
равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл.
Ключевые слова: цитотоксичность, повиаргол, протаргол, наночастицы серебра.
Медицинские знания. – 2016. – №9. – С. 62–64.
Summary. One of the stages of the development of new pharmaceutical drugs is their toxicological assessment, and cytotoxicity study is a part of it.
The article presents the results of in vitro cytotoxicity study of pharmaceutical substance poviargol, which is a highly dispersed metallic silver. Poviargol
assessment of cytotoxicity was performed on HEp-2C cells of human epidermoid larynx carcinoma using light microscopy and MTT assay. It was found
that the half maximum inhibitory concentration of poviargol substance was 0,0044±0,00096%, or 2.9 mg / ml calculated for silver content.
Keywords: сytotoxicity, poviargol, protargol, silver nanoparticles.
В
Meditsinskie novosti. – 2016. – N9. – P. 62–64.
настоящее время для лечения инфекционных заболеваний и поражений
используются различные противомикробные препараты. В связи с развитием
микробной резистентности к антибактериальным препаратам, токсическим
действием антибиотиков на внутренние
органы, подавлением иммунитета, дисбиотическими состояниями после их
длительного применения становится
актуальной разработка альтернативных
антибактериальных и противогрибковых
агентов. Вследствие этого большой интерес вызывают наночастицы серебра,
обладающие широким спектром антимикробной активности [5, 8].
Одним из этапов фармацевтической
разработки новых соединений является
их токсическая оценка, к которой в рамках
системы GLP относится изучение цитотоксичности [2]. Использование клеточных
культур для оценки цитотоксичности
in vitro обладает рядом преимуществ, таких
как дешевизна, простота применения,
62
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
неограниченный запас материала,
возможность решить этические проблемы,
связанные с исследованиями на животных
и сократить их число в последующих
доклинических испытаниях in vivo. Кроме
того, исследования цитотоксичности
фармацевтических субстанций in vivo
осложняются наличием структурной
и функциональной гетерогенности
клеток, что затрудняет изучение точных
молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов [2].
При изучении цитотоксичности следует
учитывать, что различные клетки организма человека и животных проявляют разную
чувствительность к воздействию химических соединений. Клеточная модель
в условиях in vitro более чувствительна
к действию раздражающих веществ в
виду отсутствия факторов защиты (слизь,
тканевая жидкость, слюна), барьера
слизистых оболочек, разбавления и ингибирования препаратов слюной, что имеет
значение in vivo.
№ 9 · 2016
В литературе описаны исследования
цитотоксичности препаратов, содержащих
наночастицы серебра, при воздействии на
различные клеточные культуры. Д.С. Савченко определил появление цитотоксичности высокодисперсного кремнезема
с наночастицами серебра после обработки им клеток HEp2-C при концентрации
0,007% [6]. F. Taleghani и др. установили отсутствие токсических эффектов на клетки
эпителия десны у наночастиц со средним
размером 10 нм при внесении их в концентрациях меньше 10 мкг/мл [10]. Авторы
также отмечают увеличение токсического
эффекта с течением времени. В доступной
нам литературе данных по цитотоксичности
повиаргола in vitro не обнаружено.
Цель настоящего исследования – оценка цитотоксического действия субстанции
повиаргол на клетках эпидермоидной
карциномы гортани человека HEp-2C.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования
использовали фармацевтическую
м Научные исследования
н
субстанцию повиаргол (НД №1781/13),
представляющую собой металлическое
высокодисперсное серебро, стабилизированное поливинилпирролидоном
низкомолекулярным медицинским
(произведено ФГУП «Специальное
конструкторско-технологическое бюро «Технолог», Санкт-Петербург). Для
анализа токсичности изучаемой субстанции
повиаргол проводилось сравнение его
воздействия на клетки с протарголом
(производство Германия) – подобной
по химическому составу лекарственной
субстанцией с уже известными фармакологическими эффектами и длительным
сроком существования на фармацевтическом рынке.
Цитотоксичность изучали на перевиваемой культуре клеток эпидермоидной
карциномы человека HEp-2C. Оценку цитотоксичности проводили с использованием
двух методов:
– по влиянию на морфологию клеток
с визуальной оценкой с помощью световой
микроскопии;
– МТТ-теста – теста, позволяющего
определить жизнеспособность клеток по
функциональной активности митохондрий.
Для постановки эксперимента готовили
ряд последовательных разведений обеих
субстанций на дистиллированной воде
до конечных концентраций 0,5%; 0,1%;
0,05%; 0,01%; 0,005%, 0,001%, 0,0005%,
0,0001%. Клетки HEp-2C культивировали
на культуральных флаконах (Sarstedt,
Германия) со средой роста: питательная
среда ДМЕМ (Sigma, Германия) c добавлением 200 мМ L-глютамина (Sigma,
Германия), 10%-й эмбриональной телячьей
сыворотки (Hy Clone, Индия), 100 мг/мл гентамицина (Белмедпрепараты, РУП). Для
постановки эксперимента по оценке цитотоксичности клетки готовили за 24 часа
до тестирования. Клеточную суспензию с посевной дозой 250–300 тыс./мл по 100 мкл
на лунку рассевали в плоскодонные
культуральные 96-луночные планшеты (Corning, США) и инкубировали
в термостате при 37°С в атмосфере
с 5% СО 2.
На следующие сутки после посева
клеток проводили их микроскопию с использованием светового инвертированного микроскопа (Olympus, Япония,
увеличение ×100) для оценки качества
сформировавшегося монослоя. Когда
монослой сформировался полностью,
из всех лунок удаляли среду роста и
вносили по 100 мкл поддерживающей
среды: питательная среда ДМЕМ c добавлением 200 мМ L-глютамина, 2%-й
эмбриональной телячьей сыворотки (Hy
Clone, Индия), 100 мг/мл гентамицина.
Рисунок 1 Оценка влияния субстанции повиаргол на морфологию клеток HEp-2C
через 72 часа наблюдения с использованием световой микроскопии (ув. 10×10).
А. – контроль монослоя культуры клеток HEp-2C. Б. – сплошной монослой клеток
при обработке 0,0005% раствором субстанции повиаргол. В. – деструкция 50%
клеточного монослоя при обработке 0,005% раствором повиаргола. Г. – 100%
деструкция монослоя клеток при обработке 0,5% раствором повиаргола
А
Б
В
Г
Далее в лунки планшета вносили по
100 мкл соответствующего разведения
субстанции (четыре лунки для каждого
разведения). Контрольными являлись
лунки, где к 100 мкл поддерживающей
среды было добавлено 100 мкл растворителя (дистиллированной воды).
Планшет инкубировали в термостате при
37°С в атмосфере с 5% СО2.
Влияние субстанции на морфологию
клеток оценивали по степени изменения
монослоя с использованием инвертированного микроскопа, через 24, 48 и
72 часа. Цитодеструктивное действие
препарата оценивали по 4-крестовой
системе по методу Финтера: «+» – поражение до 25% монослоя, «2+» – до
50%, «3+» – до 75% и «4+» – до 100%
монослоя [1].
Для оценки жизнеспособности
клеток в культуре и напряженности
окислительных процессов с помощью
МТТ-теста через 72 часа наблюдения
за клетками во все лунки планшета
(опытные и контрольные) вносили
по 20 мкл МТТ (Sigma, Германия).
Планшет инкубировали в термостате
при 37°С 4 часа. После инкубации из
всех лунок планшета аккуратно удаляли
надосадочную среду. Образовавшийся
на дне лунок нерастворимый осадок
формазана растворяли в 150 мкл
DMSO. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 550 нм
с отсекающей длиной волны 630 нм на
спектрофотометре (Thermo Scientific
Multiskan EX, Финляндия).
Исходя из 4 повторных значений
оптической плотности, для каждой испытуемой концентрации повиаргола
определялась средняя ингибирующая
концентрация, т.е. концентрация вещества,
которая подавляет на 50% данную
клеточную функцию (IC50).
Для построения кривой зависимости
между дозой (концентрацией) повиаргола
и производимым эффектом (изменение
оптической плотности вследствие токсичности) использовалась модель логистической регрессии с тремя переменными:
𝑌=𝑑/(𝑡+(𝑋/𝑐)𝑏)+𝑑
где Y – оптическая плотность, Х –
концентрация, d – верхняя асимптота
(максимальное значение) соответственно.
Крутизна линейной части кривой описывается коэффициентом наклона b, параметр
с отражает значение IC50. Для проведения
статистического анализа использовались
пакеты Microsoft Excel 2007 и «drc» для
языка программирования R.
Результаты и обсуждение
Оценка цитотоксичности по влиянию
на морфологию клеток HEp-2C
Анализ данных световой микроскопии
выявил сходную цитологическую картину
воздействия повиаргол и протаргола.
Через 24 часа наблюдения в контроле
сформировался плотный монослой клеток
№ 9 · 2016
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
63
Научные исследования
ем МТТ-теста подтвердили результаты
пр е д в а р и т е ль н о й
оценки этой субстанции по влиянию на
морфологию клеток.
Влияние различных
концентраций повиаргола на жизнедеятельность клеток
с использованием
МТТ-теста представлено на рис. 2. Было
установлено, что при
воздействии субстанции в концентрации
0,0001% влияния на
жизнеспособность
клеток практически
не отмечалось. Субстанция в концентрациях 0,0005% и
0,001% вызывала незначительное ингибирование жизнеспособности клеток,
на 10% и 20% соответственно. Под
влиянием повиаргола в концентрациях,
превышающих 0,05%, жизнеспособность
клеток снижалась на 80% и более. По
расчетным данным, полученным с использованием пакета «drc» для языка
программирования R, средняя ингибирующая концентрация повиаргола,
определяющая индекс цитотоксичности
IC50, равнялась 0,0044±0,00096%, что
в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл. Таким образом, IC50,
рассчитанная визуально по влиянию на
морфологию клеток и с использованием
МТТ теста, практически совпадали.
Изучению цитотоксичности серебросодержащих препаратов и ее механизмов посвящены многие исследования.
Доказано, что наночастицы серебра не
накапливаются в значительном количестве во внутренних органах и тканях ни
при многократном, ни при однократном
применении [7]. Показано, что, несмотря на определенную токсичность
наночастиц серебра, его токсические
дозы отличаются от терапевтических на
5–6 порядков [3].
Анализ данных литературы по цитотоксичности широко используемых в настоящее время препаратов с иным механизмом действия (не содержащих серебро),
в частности антисептика хлоргексидина
биглюконата, свидетельствуют о том, что
цитотоксичность данного препарата является сравнимой с цитотоксичностью
повиаргола. Так, по данным Е.В. Багаевой
и соавт., жизнеспособность клеток эпидермоидной карциномы полости рта после
обработки их 0,005% хлоргексидином, по
Рисунок 2 Влияние концентрации субстанции повиаргол
на подавление жизнедеятельности клеток HEp-2C
C o n ce n tra tio n
округлой формы, плотно прилегающих
друг к другу. В результате воздействия на
клетки высоких концентраций (0,1–0,5%)
повиаргола и протаргола полная дегенерация клеток отмечалась уже через
24 часа. В низких концентрациях (0,0001%,
0,0005%, 0,001%) дегенерации монослоя
в течение всего периода наблюдения
(24–72 часа) не отмечалось, морфологическая картина соответствовала контролю. В среднем диапазоне концентраций
(0,005%, 0,01% и 0,05%) наблюдалось
некоторое увеличение цитотоксичности
с течением времени. Средней ингибирующей концентрацией являлась концентрация 0,005%, при воздействии которой
через 24 часа отмечалась деструкция
25% клеточного монослоя, через 72 часа
деструкция монослоя составляла 50%
(рис. 1).
Оценка цитотоксичности с использованием МТТ-теста
Для оценки жизнеспособности клеток
в культуре и напряженности окислительных процессов был использован МТТтест, который показывает изменение
энергетического потенциала клетки.
Метод основывается на способности
митохондриальных дегидрогеназ живых, метаболически активных клеток
конвертировать водорастворимый желтый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ)
в синий формазан, растворимый в среде
культивирования. Таким образом, поглощение клетками формазана, которое
регистрируется значением оптической
плотности, прямо пропорционально
количеству жизнеспособных клеток
в культуре.
Результаты оценки цитотоксичности
субстанции повиаргол с использовани-
64
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
№ 9 · 2016
м
н
данным МТТ-теста, составила 98%, в то
время как более высокие концентрации
угнетали клеточный рост [4]. Другие исследователи определили среднюю ингибирующую концентрацию хлоргексидина
на линию остеобластов человека U2OS,
равную 0,005% [9].
Заключение
В рамках проведенного исследования было впервые изучено цитотоксическое влияние повиаргола с
наночастицами серебра на клетки. Проведенное исследование показало, что
цитотоксичность субстанции повиаргол
является сравнимой с цитотоксичностью
протаргола – лекарственного препарата, который широко используется в
медицинской практике. Обе субстанции
в концентрациях, превышающих 0,05%,
вызывали цитодеструктивный эффект,
в концентрациях менее 0,001% не влияли на морфологию клеток. IC50 для
субстанции повиаргол, рассчитанная
по результатам МТТ-теста, равнялась
0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл.
Эта концентрация может явиться «отправной» концентрацией для изучения
токсичности субстанции повиаргол на
животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Водорастворимое средство, обладающее
противовирусной и иммуномодулирующей активностью, на основе соединения ионного серебра
с метиленовым синим и способ его получения:
пат. 2390343 РФ, МПК51 С1 A61K33/38 (2006.01),
A61K31/5415 (2006.01), A61K31/28 (2006.01),
A61P37/02 (2006.01), A61P31/12 (2006.01) /
В.В. Третьяков, В.Н. Сильников, В.Ф. Кулагин,
В.В. Власов, В.А. Рихтер, О.В. Третьякова, В.Л. Тихонов, Т.И. Глотова; заявка 2008149356/15; опубл.
27.05.2010 / Закрытое акционерное общество
«БиоАргоФарм». – 2010.
2. Данченко Е.О. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2012. – №2. – С.22–231.
3. Ефимочкина Н.Р. // ЖМЭИ. – 2009. – №4. –
С.120–125.
4. Багаева В.В. и др. // Исследования и практика в
медицине. – 2015. – Т.2, №3. – С.35–42.
5. Ржеусский С.Э., Довнар А.Г., Кугач В.В. // Вестник Витебкого гос. мед. ун-та. – 2015. – Т.14, №6. –
С.120–126.
6. Савченко Д.С. // Вестник новых мед. технологий. – 2013 – Т.20, №4. – С.44.
7. Шкиль Н.Н. // Научный журнал КубГАУ. – 2011. –
№68 (04). – С.1–11.
8. Kim J.H. et al. // Nanomedicine. – 2007. – Vol.3,
iss.1. – P.95–101.
9. Lee T.H. et al. // Int. Еndodontic J. – 2010. – Vol.43,
N5. – P.430–435.
10. Taleghani F. et al. // J. Dent. Sch. – 2013. – Vol.31,
N3. – P.220–226.
Поступила 02.05.2016 г.
Скачать