Загрузил Oleg Balenkov

Летисия Листе-Каллеха и др. Исследование сред для культивирования клеток HEK293 с целью оптимизации биопроцессов: платформы, не содержащие компонентов животного происхождения, и платформы, содержащие компоненты животного происхождения

Журнал биологии и биоинженерии
VOL. 117 №4, 471 е 477, 2014
www.elsevier.com/locate/jbiosc
Исследование сред для культивирования клеток HEK293 с целью оптимизации биопроцессов: платформы, не содержащие
компонентов животного происхождения, и платформы, содержащие компоненты животного происхождения
Летисия Листе-Каллеха * , Марти Лецина и Хорди Хоан Кайро
Департамент химической инженерии, Автономный университет Барселоны, Кампус Беллатерра, Серданьола-дель-Валлес, 08193 Барселона, Испания
Поступило 27 мая 2013 г .; принята 25 сентября 2013 г.
Доступно онлайн 30 октября 2013 г.
Растущий спрос на биофармацевтические препараты, производимые в клетках млекопитающих, побудил отрасли повысить объемную производительность биотехнологий
с помощью различных стратегий. Среди этих стратегий большой интерес представляет разработка сред для культивирования клеток. В настоящей работе несколько
коммерчески доступных питательных сред для клеток эмбриональной почки человека (HEK293) были оценены с точки зрения максимальной специфичности. ф c
поддерживаются скорость роста и максимальная концентрация жизнеспособных клеток. Основная цель заключалась в предоставлении различных платформ для
культивирования клеток, которые подходят для широкого спектра применений в зависимости от типа и ф окончательное использование полученного продукта. Выполнение
простых добавок среды с компонентами животного происхождения и без них, увеличение концентрации клеток с 2 3 10 6 кл / мл до 17 3 10 6 клеток / мл было достигнуто в
периодическом режиме. Кроме того, среда была оценена на предмет продуцирования аденовируса как специфического ф c Случай применения ячеек HEK293. Ни одна из
добавок не помешала существенно ф с аденовирусной инфекцией, хотя были обнаружены некоторые различия в вирусной продуктивности. Насколько нам известно, о высокой
плотности клеток, достигнутой в представленной работе, никогда ранее не сообщалось в пакетных культурах клеток HEK293, и, таким образом, наши результаты являются
многообещающими для дальнейшего изучения стратегий культивирования клеток в биореакторе с целью оптимизации биопроцессов.
2013, Общество биотехнологий, Япония. Все права защищены.
[ Ключевые слова: HEK293; Суспензионная культура клеток; Среды для культивирования клеток; Культура с высокой плотностью клеток; Рекомбинантный аденовирус]
Клетки млекопитающих часто являются предпочтительной системой экспрессии для
центральный углеродный метаболизм или чтобы избежать апоптоза (9 е 11) ; (ii) оптимизация
производства биофармацевтических препаратов, поскольку они могут выполнять критические
состава клеточной среды (12) ; (iii) применение различных стратегий культивирования клеток
посттранскрипционные модификации. ф катионы, которые важны для стабильности белка, связывания
(например, партия, партия с подпиткой, перфузия) и (iv) улучшение стратегий мониторинга и
лиганда и иммуногенных ответов (1,2) . Некоторые всесторонние обзоры рынка
контроля. (13,14) . Работа, представленная в этой статье, сосредоточена на оценке сред для
биофармацевтических препаратов показывают, что более половины биофармацевтических
культивирования клеток линии клеток HEK293. В последние годы исследования в области
препаратов, утвержденных с 2003 по 2010 годы, были произведены на культурах клеток
дизайна сред для клеточных культур изменились в двух основных аспектах. С одной стороны, де ф
млекопитающих. (3,4) . Хотя мышиные миеломы (NS0 и SP2), клетки яичников китайского хомячка
Выбор средств массовой информации для широкого диапазона ячеек и приложений перешел на ф
(CHO) и клетки почек детенышей (BHK-21) составляют почти все коммерческие рекомбинантные
специфика ф c составы для специальных ф c клеточный штамм, клон или процесс (15) . С другой
терапевтические препараты, эмбриональные клетки почек человека (HEK293) в последнее время
стороны, из соображений безопасности и воспроизводимости добавки животного
стали более актуальными.
происхождения, такие как сыворотка, были заменены добавками, не содержащими компонентов
животного происхождения (добавки ADCF). Несмотря на то, что более высокая специфичность
Растущий спрос на биомолекулы (не только как биофармацевтические препараты, но и
клеточного штамма ф Использование сред привело к улучшению роста и продуктивности клеток,
для исследовательских целей) и развивающийся рынок биоподобных препаратов. (5) подтолкнула
замена сыворотки во многих составах привела к снижению роста и продуктивности клеток по
промышленность к увеличению производительности биопроцессов. Объемная
сравнению с теми, которые были достигнуты с добавлением сыворотки (16) . Таким образом,
производительность ( П) данного биопроцесса можно улучшить либо за счет увеличения
большое количество промышленных процессов получения рекомбинантных белков в настоящее
удельной ф c про-
время выполняется с использованием сред с добавлением сыворотки. (17,18) . Также сыворотка
скорость продуцирования организма-продуцента ( q п) или путем увеличения плотности
регулярно используется в исследованиях.
жизнеспособных клеток (Xv). Несколько подходов касались
приращение q п путем генной инженерии штаммов клеток-продуцентов
(6,7) и путем внедрения инструментов высокопроизводительного скрининга (HTS)
для отбора клонов высокого производителя (8) . Для увеличения Xv в культурах с высокой
плотностью клеток (HCDC) следует выделить различные стратегии: (i) генетические
манипуляции для улучшения эффективности ф умение
(16,19) .
Что касается применений клеток HEK293, производства рекомбинантных аденовирусов
для их использования в качестве вакцин. (20,21) или для генетической терапии (22,23) , и
временная трансфекция для экспрессии белка (24,25) или производство вирусоподобных
частиц (VLP) (26,27)
*
Корреспондент. Тел .: þ 34 93 581 4794; факс: þ 34 93581 2013.
Адрес электронной почты: Leticia.Liste@uab.cat (Л. Листе-Кальеха).
1389-1723 / $ е см. предварительную информацию
http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2013.09.014
два основных. Кроме того, новые исследования были сосредоточены на установлении
экспрессии рекомбинантного белка HEK293.
2013, Общество биотехнологий, Япония. Все права защищены.
472
LISTE-CALLEJA ET AL.
J. B IOSCI. B IOENG.,
системы за счет стабильной интеграции трансгенов (28) . В зависимости от интересующего
процесс следует за распределением яда (ур. 2 ), в MOI ¼ Икс вероятность того, что одна клетка заразилась, может
продукта (вирусы, белки, VLP) последующая обработка и ф окончательное применение продукта
быть выражена, как указано ниже (Ур. 3 )
(например, терапия для человека, ветеринарная терапия, диагностика, исследования),
е млн $ м k
требования к среде и, следовательно, состав среды может отличаться.
пðkÞ¼
(2)
к!
где P (k) вероятность заражения любой клетки k частицы; м это MOI и k - количество вирусных частиц в данной
Учитывая все эти обстоятельства, данная работа обеспечивает простую и эффективную ф подходы
к добавлению эффективных сред коммерческой среды для культивирования клеток HEK293
клетке.
для двух возможных сценариев; Требуется ADCF и разрешены биопроцессы ADC.
е х$ 10
п ð п> 0 Þ ¼ 1 п ð 0 Þ ¼ 1
Выдающиеся результаты были достигнуты в обеих стратегиях добавления питательных
веществ, которые позволили удлинить фазу роста клеток и позволили значительно увеличить
(3)
0!
Приблизительно 40 культур клеток hpi были собраны и лизированы тремя циклами теплового шока следующим образом:
максимальную концентрацию клеток по сравнению с исходной средой в периодических
клетки замораживали в течение 20 минут при 80 ° C с последующим быстрым оттаиванием в течение 5 минут при 37 ° C. Затем
культурах.
клетки центрифугировали при 13 300 ° C. грамм и супернатант собирали для титрования вируса.
Клетки HEK293 с экспоненциальным ростом, культивируемые при встряхивании fl спросите, как описано в разделе
«Клеточная линия и обслуживание клеточной линии», разбавляли свежей средой до ф конечная концентрация 0,5 · 10 6 клеток /
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
мл и высевали в 12-луночный планшет (Orange Scienti ф c) непосредственно перед титрованием образца. Было протестировано
не менее шести разведений каждого образца. Клетки 24 hpi были собраны с планшетов и проанализированы fl текущая
Клеточная линия и обслуживание клеточной линии
цитометрия на FACS Canto (BD Bioscience). Окончательный титр рассчитывали следующим образом (Ур. 4 ):
Три раза в неделю пассирование клеток производилось
обычно выполняется в пластиковом коктейле 125 мл fl спрашивает (Corning Inc.), засевая 15 мл культуры при
плотности клеток 0,25 · 10 6 ячейка / мл. Культуры выращивали до 1 10 6 клеток / мл, а затем был выполнен новый
(4)
$ TCN $ DF
½ IPU = мл ¼ ð% положительный GFP% положительный GFP Отрицательный Ctrl Þ = 100
пассаж. Колбы встряхивали при 110 об / мин на
вирусный объем
орбитальный шейкер (SSL1, Stuart) при 37 C во влажной среде. ф атмосферная среда с 5% CO 2
где Neg Ctrl представляет собой неинфицированную клеточную культуру в тех же условиях (клеточная среда, концентрация и
инкубатор (инкубатор Steri-cult 2000, Forma Scienti ф в).
Питательные среды и пищевые добавки
жизнеспособность клеток), что и инфицированная клеточная культура; TCN - общее количество клеток на лунку, а DF - коэффициент
Были оценены пять клеточных сред:
в данной работе: HyQ SFMTransFx-293, HyQ SFM4HEK293, HyQ CDM4HEK293 (HyClone, Thermo Scienti ф c),
CD293 (Gibco, Invitrogen) и DMEM с высоким содержанием глюкозы (Gibco, Invitrogen). Во все среды, кроме HyQ
SFM4HEK293, добавляли 4 мМ GlutaMax (Gibco, Invitrogen).
разведения образца.
Только проценты от 3% до 25% считались действительными для титрования. (30) .
Валидацию анализа обычно выполняли путем включения в анализ образца с известной концентрацией вируса в
качестве положительного контроля.
Клеточные среды при желании дополняли инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой
Статистика
Значения плотности и жизнеспособности клеток даны как среднее двух
(FBS) (Invitrogen, Lot 07F6605K). Зная, что состав FBS может отличаться от партии к партии, другие сыворотки
количество каждого образца, по крайней мере, из трех биологических экспериментов ( п
также были протестированы для повышения значимости. ф отмена результатов (Sigma е Aldrich Inc., лот 058K3396;
Планки погрешностей представляют стандартную ошибку биологических реплик.
Сигма е Aldrich Inc., лот 039K3396; Omicron, лот 5067 и Invitrogen, лот 462115F). Нет знака ф не было обнаружено
3). В
Значения инфекции ef ф Эффективность дается как среднее трехкратное заражение, а планки погрешностей
представляют собой стандартное отклонение рассчитанных процентов.
различий в росте или жизнеспособности клеток (данные не показаны).
Значения вирусного титрования даны как среднее значение по меньшей мере трех допустимых разведений титрования трех
Cell Boosts 1, 5 и 6 (HyClone) оценивали как добавки ADCF. Все усилители клеток растворяли в MilliQ-воде
повторностей инфекции. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение рассчитанного титра вируса.
до желаемой концентрации и стерилизовали
ф фильтрация через 0,22 м м ф фильтры (Millipore, Биллерика, Массачусетс, США). За исключением случаев, когда ф Таким
образом, желаемая концентрация была пределом растворимости добавки (80 г / л) после того, как было исключено возможное
Знак ф Отмена результатов заражения оценивалась с помощью программы Student ' s т- контрольная работа ( п значение
установлено на 0,05).
ингибирование или нарушение роста клеток (данные не показаны).
Условия культивирования клеток и оценка роста клеток
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Для всех экспериментов
инокуляты готовили центрифугированием аликвот клеток при 300
грамм на 5 мин.
После этого клетки осторожно ресуспендировали в свежей среде при начальной плотности клеток
0,25 е 0,3
Скрининг среды для культивирования клеток на HEK293
10 6 в начальном объеме 20 е 25 мл. Культуры проводились в
В ф первая часть
125 мл вентилируемого коктейля fl спрашивает при тех же условиях культивирования, что и проходы для обслуживания. Число
эта работа была сосредоточена на оценке различных клеточных сред, рекомендованных для
клеток определяли путем ручного подсчета с использованием гемоцитометра Neubauer и фазово-контрастного микроскопа
клеток HEK293 в качестве ф Первый шаг для оптимизации биопроцессов. От ф изначально были
(Nikon Eclipse, TS100). Жизнеспособность оценивали с использованием метода исключения красителя трипанового синего.
выбраны различные коммерческие клеточные среды (HyQ CDM4HEK293, HyQ SFM4HEK293,
Аденовирус и клеточная инфекция
HyQ SFMTransFx-
Репликация 5 типа ф cient ( D E 1 / E 3)
аденовирус кодирует зеленый fl уоресцентный белок (GFP) под контролем промотора цитомегаловируса (CMV)
был приобретен в Центре биотехнологии животных и генной терапии (CBATEG, UAB, Barcelona). Аликвоты
293, CD293 и DMEM), последние два были отброшены из-за плохого роста клеток, достигнутого
после нескольких адаптационных пассажей (данные не показаны). Рис. 1A показывает
плотность жизнеспособных клеток (Xv) и жизнеспособность pro ф файлы для трех выбранных
вирусного запаса, соответствующие 3,45
носителей. Культуры, проведенные в HyQ SFM4HEK293 и HyQ SFMTransFx-293, показали
10 11 Инфекционные частицы / мл (IPU / мл) хранились в хранилище.
буфер (PBS1; 10% глицерин; 0,5 мМ MgCl 2; 0,9 мМ CaCl 2) при 80 С.
лучший рост клеток, чем HyQ CDM4HEK293, достигая максимума клеток.
Инициирование клеточных культур для заражения осуществляли, как описано в предыдущем разделе. В
Инокуляцию разведения вируса в желаемое время инфицирования (TOI) проводили без замены среды до или после
инфицирования. Аликвоты запаса вируса разводили 1: 1000 в клеточной среде без добавок для получения рабочего
плотности (Xv Максимум) около 3,5
10 6 кл / мл, 2
10 6 кл. / мл и
запаса вируса при 3,45 · 10 8 ( IPU / мл), который использовался для культивирования клеток. ' инфекция. Был
менее 1
рассчитан объем рабочего вирусного запаса, необходимого для каждой культуры (уравнение. 1 ), чтобы достичь
концентрации, основное различие между тестируемыми средами заключалось в том, что при
желаемой множественности заражения (MOI). Этот объем никогда не был выше 100 м L обеспечивает минимальное
разбавление питательных веществ в средах для культивирования клеток.
10 6 клеток / мл соответственно. Помимо клетки
использовании среды HyQ SFM4HEK293 жизнеспособность сохранялась более 85%.
Максимальные характеристики ф c темпы роста (
(1)
V wvs ¼ V c $ Икс v $ MOI
½ WVS
м Максимум) были оценены и
составлено в Таблица 1 . В м Максимум значение, полученное для сред HyQ SFM4HEK293 и HyQ
SFMTransFx-293, составило около 0,024 ч. 1
где V WVS необходимый объем рабочего вирусного запаса; V c - объем клеточной культуры; Xv - плотность
(что соответствует времени удвоения 29 часов), как и ожидалось
клеток; MOI - это множественность заражения (MOI ¼ 1 для всех
(31) , и он выдерживался примерно 74 ч после инокуляции
случаев) и [WVS] - концентрация рабочего вирусного запаса ([WVS] ¼ 3,45
(этот м Максимум период здесь выражается как т м). Однако, м Максимум значение для среды HyQ
10 8 IPU / мл).
Вирусная инфекция ef ф определение эффективности и титрование вирусов
24
часов после заражения (24 часа на дюйм) собирали 1 мл культуры инфицированных клеток и fl флуоресцентные
CDM4HEK293 составляло только около половины (0,011 ч. 1)
Это означает, что среда не подходит для штамма HEK293, использованного в этой работе.
клетки анализировали fl цитометрия потока на FACS Canto (Becton and Dickinson, Bioscience) для определения
эф ф заражение. Ef ф Степень инфицирования определяли по проценту HEK293, экспрессирующего репортер
гена (GFP), независимо от интенсивности сигнала, и оценивали путем сравнения со значением, указанным для
эффективной инфекции. (29) . Учитывая, что вирусная инфекция
Оценка добавок для клеточной среды HEK293
Все СМИ
выбранные описаны как бессывороточные среды. Чтобы оценить, имеет ли замена критических
компонентов сыворотки
V OL. 117, 2014
473
HEK293 ИЗУЧЕНИЕ В СМИ НА ПУТИ ОПТИМИЗАЦИИ БИОПРОЦЕССОВ
удовлетворительно выполнялось без влияния на рост клеток, оценивалось добавление
CB5) повышенное значение ф неуклонный рост клеток ( Рис. 1C ). В частности, CB5
добавление привело к 4-кратному увеличению Xv Максимум на HyQ CDM4HEK293 (4,11 0,58 10 6 клеток
фетальной телячьей сыворотки (FBS).
После выбора партии FBS (см. материалы и методы ),
/ мл), 2-кратное увеличение на HyQ
был изучен эффект его добавления (5% v / v) в клеточную среду. Концентрация FBS была
SFM4HEK293 (7,29
выбрана в качестве начальной промежуточной точки на основе предыдущей работы группы с
HyQ SFMTransFx-293 (9,75 руб.)
0,32
10 6 клеток / мл) и 5-кратное увеличение
0,44
10 6 кл / мл).
клеточными линиями млекопитающих. (32) . Как показано в Рис. 1B , FBS дополнение signi ф неуклонно
увеличивалась максимальная концентрация клеток в двух случаях: 7-кратное увеличение для
Пример применения: получение рекомбинантного аденовируса с клетками HEK293 (I)
HyQ CDM4HEK293 (6
Из диапазона приложений, в которых
10 6 клеток / мл) и 3-кратное увеличение для HyQ
SFMTransFx-293 (7.02
0,13
культур, положительное влияние FBS на "
10 6 кл / мл). В HyQ CDM4HEK293
м max ». Это значение увеличилось более чем вдвое
(с 0,011 ч. 1 до 0,026 ч 1)
HEK293 можно использовать, работа, проведенная в этой работе, была направлена на
получение рекомбинантного аденовируса. Следовательно, в fl влияние клеточной среды на
вирусную инфекцию и продуктивность было изучено до проведения дальнейших исследований
по добавлению сред. Культуры в середине фазы регистрации (TOI z 0,5
10 6 кл / мл)
становится сопоставимым с другими клеточными средами (значения, собранные в
Таблица 1 ). Напротив, добавление 5% (об. / Об.) FBS не оказало заметного влияния на
растущие в трех испытанных средах были инфицированы в MOI z 1 с репортерным
культуры клеток HyQ SFM4HEK293 с точки зрения
аденовирусом (rAdV-GFP).
м Максимум ( 0,028 ч 1), XV Максимум ( 4,67
0,82
10 6 клеток / мл) или жизнеспособность
профи ф ле
Параллельно с экспериментами по добавлению FBS, добавление питательных добавок
ЭФ ф степень заражения представлена на левой гистограмме
Рис. 2 . Процент заражения для всех трех сред хорошо коррелировал с процентом,
предсказанным распределением Пуассона для эффективного заражения (см. материалы и
ADCF, рекомендованных для культуры клеток HEK293, проводилось для того, чтобы ф Не
методы ) который в MOI ¼ 1 составляет 63%. Этот процент аналогичен процентному
является платформой для культивирования клеток для тех приложений, в которых
соотношению, полученному для всех различных оцениваемых сред ( Рис. 2 ), что указывает на
предпочтительно отсутствие сыворотки. Были оценены три разные добавки, Cell Boosts 1, 5 и 6.
отсутствие отрицательного влияния среды на инфекционный эффект. ф умение.
Добавление Cell Boosts 1 и 6 не дало значительных результатов. fС точки зрения продукции инфекционного аденовируса ф не было обнаружено различий
не может отличаться по сравнению с базальной средой (данные не показаны), тогда как
между клеточными средами HyQ SFM4HEK293 и HyQ SFMTransFx-293 (9,23
добавление 5% (об. / об.) раствора Cell Boost 5 (и далее
0,80
10 7
а также
РИС. 1. Плотность жизнеспособных клеток ( Икс v) ( сплошные символы) и жизнеспособность pro ф файлы (открытые символы) культур клеток HEK293. (A) Pro ф файлы, полученные с помощью базальных коммерческих сред. (B) Pro ф файлы с коммерческой
средой с добавлением 5% (об. / об.) FBS. (C) Pro ф меньше при добавлении 5% (об. / об.) CB5. (А е C) Изображены коммерческие носители: HyQ CDM4HEK293,
HyQ SFM4HEK293 и HyQ SFMTransFx-293 (слева направо). Среднее из двух клеток в трех биологических повторностях ( п ¼ 3) показаны. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку реплик.
474
LISTE-CALLEJA ET AL.
J. B IOSCI. B IOENG.,
ТАБЛИЦА 1. Кинетические параметры культур клеток HEK293, соответствующие про ф les изображены в рисунок 1 .
HyQ CDM4HEK293
1.06
м Максимум ( 10 2 час 1)
Без добавления
0,01
2.1
2,46
0,14
2,43
4,67
2,61
2.1
м Максимум ( 10 2 час 1)
0,05
9,75
2,06
0,03
2,17
72
69
7,58 2,12 10 7) тогда как использование HyQ CDM4HEK293 привело к снижению ф конечный титр
таким образом, максимальная достигнутая плотность клеток была ограничена только 8 10 6 ячейка /
мл.
Полученные к настоящему времени результаты показали, что для получения культур с более
высокой плотностью клеток рекомендуется добавление всех протестированных клеточных сред.
Среди всех условий HyQ SFMTransFx-293
были СМИ, которые поддержали высший XV Максимум с обеими тестированными добавками (FBS
и CB5). Поэтому его выбрали для
0,25
0,03
116
Синергетический эффект комбинации добавок: CB5 и FBS
Представленные ранее результаты показали, что CB5 и FBS
сложения неодинаково влияют на кинетические параметры роста м Максимум а также
т м. В связи с этим стало интересно оценить эффект сочетания обеих добавок в среде HyQ
SFMTransFx-293.
дальнейшие эксперименты.
Концентрации 5% (об. / Об.) FBS и 10% (об. / Об.) Для CB5 были выбраны в соответствии с
Исследование влияния концентрации FBS и CB5 в среде HyQ SFMTransFx-293
Чтобы настроить ф конечная концентрация
Действие каждой добавки с целью снижения стоимости среды, диапазон от 2,5 до 10% (об. /
об.) для FBS и от 2,5 до 20% (об. / об.) для CB5, оценивали с использованием среды HyQ
SFMTransFx-293.
предыдущими экспериментами. В Рис.5, плотность и жизнеспособность жизнеспособных клеток
pro ф представлены файлы и сравниваются с pro ф файлы, полученные с добавлением
единственной добавки и культур без добавок. Синергетический эффект комбинации обеих
добавок
наблюдалась, достигая наивысшего значения Xv Максимум значение (около
16,77
Как показано в Рис. 3 , максимальная достигнутая плотность жизнеспособных клеток составила
10 6 кл. / мл и м Максимум был в диапазоне, о котором сообщалось
для линии клеток HEK293 (0,024 е 0,027 ч 1) ( 31) для всех концентратов FBSции проверены. С одной стороны, никаких негативных эффектов, связанных с токсичностью, не
наблюдалось ни при какой оцененной концентрации, но добавление более высоких концентраций,
0,70
10 6 кл / мл). Дополнение обоими компо-
Ненты были также повторно fl влияет на кинетические параметры; т м выдерживалась 144 ч и ф c
темп роста увеличился на 15% в сравнении
parison к тем культурам, в которых FBS была лишена.
Пример применения: получение рекомбинантного аденовируса клетками HEK293 (II)
Как это делалось ранее с базальным
чем 5%, не способствовало улучшению клеток.
рост. С другой стороны,
0,06
0,01
0,18
( Рис. 2 ).
примерно 7
7.02
7,29
0,06
0,03
2,67
0,33
92
т м ( час)
0,48
2,8
71
4.11
XV Максимум ( 10 6 ячейка мл 1)
0,12
74
0,04
95
т м ( час)
5% CB5
0,21
74
6
XV Максимум ( 10 6 ячейка мл 1)
м Максимум ( 10 2 час 1)
HyQ SFMTransFx-293
3,53
96
т м ( час)
5% FBS
HyQ SFM4HEK293
0,85
XV Максимум ( 10 6 ячейка мл 1)
м Максимум и XV Максимум были немного ниже при добавлении 2,5% (об. /
media, оценивались возможные воздействия на аденовирусную инфекцию и продукцию из-за
добавления добавок.
об.) FBS, что означает, что, вероятно, этот FBS
концентрация может иметь ограничивающие эффекты. Таким образом, концентрация 5% FBS
была выбрана в качестве предпочтительной концентрации для среды HyQ SFMtransFx-293.
Эксперимент проводился с сохранением параметров заражения предыдущего
эксперимента: TOI z 0,5 10 6 и MOI z 1. Все инфицированные культуры клеток перестали расти
через 24 часа на дюйм, как сообщалось.
В отличие от того, что наблюдалось в эксперименте FBS,
(31) и цитопатический эффект отчетливо наблюдался приблизительно через 36 hpi, прежде
пропорционально положительное влияние на Xv Максимум было замечено при добавлении CB5 до
чем был проведен сбор аденовируса. В Рис. 6 , эф ф Представлены эффективность инфекции и
концентрации 10% (об. / об.) ( Рис. 4 ). При этом
продукция инфекционного аденовируса для каждого тестируемого состояния клеточной
трация м Максимум выдерживался дольше т м ( 144 ч) по сравнению с более низкими
культуры. Как видно на левой гистограмме Рис. 6 , ожидаемый процент заражения (около 63%)
концентрациями (116 ч), и, как следствие,
был достигнут во всех условиях, хотя добавление FBS немного увеличило этот процент до
увеличение плотности жизнеспособных клеток, достигающее примерно 13
10 6 ячейка / мл.
Однако, когда культуры были дополнены 20% (об. / Об.) CB5,
нет смысла ф не могу различий по м Максимум были обнаружены в начале культивирования, но это
67,13 1,01% по сравнению с 58,93 1,13%, полученными при исключении FBS. Положительный
значение существенно снизилось после 96 ч, и
эффект FBS стал более очевидным, когда
РИС. 2. (A) Ef ф Проверена эффективность заражения древесных коммерческих сред. Процент клеток, экспрессирующих репортер гена (GFP), дан как среднее трех повторностей инфекции ( п ¼ 3). Планки погрешностей представляют собой стандартное
отклонение одного измерения в каждой реплике. (B) Титр вируса, полученный в результате инфицирования HEK293, культивированного в трех тестируемых коммерческих средах. Титры рассчитываются по меньшей мере из трех разведений супернатанта,
полученного из каждой повторности. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение полученных титров. Speci ф c средних значений указаны вверху каждой полосы.
V OL. 117, 2014
HEK293 ИЗУЧЕНИЕ В СМИ НА ПУТИ ОПТИМИЗАЦИИ БИОПРОЦЕССОВ
475
РИС. 3. Рост за ф файлы культур клеток HEK293 в среде для клеток HyQ SFMTransFx-293 с добавлением
различных процентных соотношений FBS в диапазоне от 0% до 10% (об. / об.)
ф конечная концентрация. Среднее значение двух клеток в трех биологических повторностях ( п ¼ 3) показаны. Планки
погрешностей представляют стандартную ошибку реплик. Соответствующие параметры роста клеток показаны в
таблице.
РИС. 5. Плотность жизнеспособных клеток (закрашенные ромбики, прямая линия) и жизнеспособность pro ф представлены
файлы (незакрашенные ромбики, прямая линия) культур клеток HEK293 в среде для культивирования клеток HyQ
SFMTransFx-293 с добавлением 5% (об. / об.) FBS и 10% (об. / об.) CB5. Также представлены контрольные культуры клеток
HyQ SFMTransFx-293 с 5% (об. / Об.) FBS (треугольник вниз, пунктирная линия) и HyQ SFMTransFx-293 с 10% (об. / Об.) CB5.
Все графики показывают среднее значение двух клеток в трех биологических повторах ( п ¼ 3). Планки погрешностей
представляют стандартную ошибку реплик. Соответствующие параметры роста клеток показаны в таблице.
концентрируясь на полученном титре вируса. Как показано на правой гистограмме Рис. 6 максимальная
вирусная продукция была достигнута, когда FBS был добавлен только к HyQ SFMTransFx-293
(4,13 10 8 IPU / мл). Этот титр вируса представляет собой увеличение в 5,5 раз титра вируса,
полученного в культурах клеток без добавок. Иными словами, добавление CB5 не имело
существенного значения. ф не имеет эффекта по сравнению с клеточной средой без добавок.
Когда FBS добавляли в сочетании с CB5, продукция вируса почти удваивалась по сравнению с
базовой средой. Тем не менее, титр вируса не достиг значения, полученного в условиях
единственной добавки FBS.
ОБСУЖДЕНИЕ
Когда де ф При разработке биопроцесса производства биофармацевтических препаратов выбор
подходящей среды для культивирования клеток становится ключевым фактором. Из 5 различных
коммерческих сред, первоначально выбранных для культивирования клеток HEK293, две из них
(CD293 и DMEM) были выброшены из-за достигнутого низкого коэффициента размножения клеток.
Кроме того, при использовании среды DMEM клетки в высокой степени агрегировались, что
приводило к снижению средней жизнеспособности и значимости. ф Невозможна вариабельность
подсчета клеток среди образцов. Несмотря на то, что среда DMEM использовалась для культуры
HEK293, обычно сообщалось о прикрепленных зависимых клеточных линиях на основе
биопроцессов. (33) , но не для суспензионных культур. Следовательно, СМИ ф окончательно
отобраны для дальнейших экспериментов HyQ CDM4HEK293, HyQ SFM4HEK293 и HyQ
SFMTransFx-
293.
РИС. 4. Рост pro ф файлы культур клеток HEK293 в среде для клеток HyQ SFMTransFx-293 с добавлением
различных процентных содержаний CB5 в диапазоне от 0% до 20% (об. / об.)
ф конечная концентрация. Среднее из двух подсчетов клеток в трех биологических повторностях ( п ¼ 3) изображены.
Планки погрешностей представляют стандартную ошибку реплик. Соответствующие параметры роста клеток показаны в
таблице.
После выбора различных базальных сред оценивали добавление пищевых добавок. С
одной стороны, добавление FBS оценивали как источник факторов роста и других важных
биомолекул для размножения клеток, а с другой стороны, ADCF
476
LISTE-CALLEJA ET AL.
J. B IOSCI. B IOENG.,
РИС. 6. (A) Ef ф Возможность заражения HyQ SFMTransFx-293 без добавок и с добавлением одной или обеих добавок (FBS и CB5). Процент клеток, экспрессирующих репортер гена (GFP), дан как среднее трех повторностей инфекции
( п ¼ 3). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение одного измерения в каждой реплике. (B) Титр вируса, полученный в результате заражения HEK293, культивированного в тех же условиях, что и панель A.
Титры рассчитываются по меньшей мере из трех разведений супернатанта, полученного из каждого повтора. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение полученных титров. Speci ф c средних значений указаны вверху
столбцов.
добавление осуществляли путем добавления коммерческого питательного состава, Cell Boosts
После изучения и де ф за счет лучшей концентрации пищевых добавок, используемых в
1, 5 и 6. Поскольку добавление Cell Boosts 1 и 6 не показало значительного ф Невозможно
этой работе, ф Был проведен последний эксперимент по заражению и производству
увеличить максимальную плотность клеток по сравнению с базальной средой (данные не
аденовируса, чтобы оценить различные платформы для производства вакцины-кандидата.
показаны), для дальнейшей работы был выбран только Cell Boost 5. Несмотря на то, что
Результаты показали аналогичную инфекцию ' s ef ф эффективность, но выявил различный
грубые компоненты различных Cell Boosts могут быть одинаковыми, точный состав и
выход продукции в зависимости от используемых добавок. В целом добавление FBS было
компоненты ' концентрация неизвестна. Возможные отличия в спецификациях ф c и его
положительным в отношении продукции аденовируса, в то время как CB5 не оказало
концентрация объяснили бы полученные результаты.
значительного ф ласково. Тем не менее, комбинация обеих добавок имела незначительный
негативный эффект и немного уменьшила ф Концентрация конечного аденовируса по
сравнению с добавлением только FBS. Хотя раскрытие основы полученных результатов
Ориентируясь на оценочные м Максимум а также т м значения (составлено в Таблица 1 ),
выходит за рамки данной работы, можно обсудить некоторые гипотезы, основанные на
можно заметить, что особые ф c скорость роста была выше, когда FBS
упомянутой работе. Хорошо известно, что на процесс вирусной инфекции может влиять
используется в качестве добавки независимо от клеточной среды. Тем не менее добавление
множество факторов.
CB5 продлило фазу экспоненциального роста на 44 часа при использовании HyQ
SFMTransFx-293. Этот факт объяснил бы более высокий
Икс Максимум достигается с помощью HyQ SFMTransFx-293 5% (об. / об.) CB5 по сравнению с HyQ
(31,34,35) . Из переменных, непосредственно связанных со средой для культивирования клеток,
SFMTransFx-293 5% (об. / об.) FBS. В случае HyQ
наиболее изученными являются депривация питательных веществ, pH, взаимодействие
Клеточная среда SFM4HEK293, т м значения были сопоставимы для трех испытанных условий. Однако
компонентов клеточной среды с вирусным рецептором и осмолярность. Недостаток питательных
лишь незначительное снижение
м Максимум был обнаружен за пределами т м ( около 70 ч), когда CB5
веществ и pH могут иметь незначительные нарушения fl влияние на представленные эксперименты
использовался в качестве дополнительного
из-за раннего выбора TOI. Возможное вмешательство в рецептор вируса-хозяина со стороны
мент, тогда как резкое падение этого значения было замечено за пределами т м
компонентов добавки также было исключено, учитывая инфекционный эффект. ф эффективность
для отсутствия добавок или добавления FBS. Эти различия будут
определяется при 24 hpi, что ф идеально соответствует распределению Пуассона. Наконец,
объясните ф Концентрация конечных клеток достигается с помощью HyQ SFM4HEK293 5% (об. /
увеличение осмолярности из-за добавления обеих добавок может объяснить небольшое снижение
об.) CB5.
продукции аденовируса по сравнению с добавлением только FBS. (36) .
С целью выбора наилучшей среды для продолжения разработки биопроцессов было
важно убедиться, что выбранная среда не оказывает отрицательного воздействия на
производство вакцины-кандидата. Следовательно, ef ф Степень инфицирования и
В целом, после изучения различных комбинаций клеточных сред и добавок для культур
продуцирования аденовируса оценивалась во всех трех изначально выбранных средах.
клеток HEK293, две платформы для культивирования предлагаются для двух возможных
Результаты показали, что нет никаких ф различий не обнаружено, поэтому
сценариев: HyQ SFMTransFx-293 CB5 с добавкой (10% об. / Об.) Для биопроцессов, требуемых
ADCF, и HyQ SFMTransFx-293 Добавки FBS и CB5 (5% и 10% об. / Об. Соответственно) для
ф Окончательный отбор сред производился по росту клеток.
После скрининговых экспериментов по выбору сред и добавок следующий шаг был
биопроцессов, содержащих ADC. В основе этого выбора лежит (i) высокая плотность клеток,
достигаемая в обоих случаях.
сфокусирован на настройке оптимальных добавок. ' концентрация с целью увеличения
плотности клеток и производства аденовирусов. Результаты показали, что когда HyQ
которые в значительной степени превосходят XV Максимум достигается с базальной средой, (ii)
сохранение или даже улучшение м Максимум ценность относительно базальной среды и (iii)
SFMTransFx-293 дополнен FBS м Максимум значения были выше по сравнению с базальной
относительно низкий прирост стоимости клеточной среды
средой, независимо от концентрации
(Увеличение в 1,3 раза при двойном добавлении) значительно компенсируется достигнутой более
трация используется, con ф Оценивая положительный эффект FBS на этот параметр, мы уже
высокой плотностью клеток.
встречались. Добавление CB5 не имело ф не может повлиять
Текущая работа исследовательской группы сосредоточена на расширении масштабов
м Максимум, но это действительно позволило увеличить т м, при добавлении препарата CB5 до
биопроцессов, а также на системах контроля и мониторинга, которые позволят изучить лучшие
10% (об. / об.). Однако, когда куль-
стратегии для увеличения производительности конкретного биопроцесса, представленного в
были дополнены большим количеством CB5 (20% об. / об.),
этой работе.
м Максимум значение существенно снизилось после 96 часов, ограничивая максимальную плотность
клеток, достигаемую только 8
10 6 ячейка / мл. Этот факт может
БЛАГОДАРНОСТИ
Это объясняется накоплением побочных продуктов в культуральном бульоне, которые вместе с
более высокой концентрацией питательных веществ могут увеличивать осмолярность,
отрицательно влияя на рост клеток.
Более интересными оказались результаты, полученные при комбинировании обеих
добавок. Синергетический эффект наблюдался в культурах с добавлением 5% FBS и 10%
раствора CB5, достигая плотности клеток до 17
10 6 ячейка / мл.
Авторы хотели бы поблагодарить доктора А. Камена (Совет биотехнологических
исследований Канады) за любезно предоставленные клетки HEK293, с которыми была
проведена эта работа.
Это исследование было поддержано Государственным секретарем Испании по
исследованиям, развитию и инновациям (SEIDI).
V OL. 117, 2014
HEK293 ИЗУЧЕНИЕ В СМИ НА ПУТИ ОПТИМИЗАЦИИ БИОПРОЦЕССОВ
Ссылки
477
18.
Чу, Л. и Робинсон, ДК: Промышленный выбор для производства белка крупномасштабной культурой клеток,
19.
Лин, С. и Талбот, П .: Методы культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши и человека, Methods
20.
Ласаро, Миссури, и Эртль, Высшая судебная коллегия: Новые взгляды на аденовирус как вектор вакцины, Mol. Ther., 17, 1333
21.
Феррейра, ТБ, Алвес, П.М., Аунинс, Дж. Дж., И Каррондо, MJT: Использование аденовирусных векторов в
22.
Абеди, MR: Клинические испытания генной терапии во всем мире до 2007 г. е обновление,
Curr. Мнение. Biotechnol., 12, 180 е 187 (2001).
1. Дингерманн, Т .: Рекомбинантные терапевтические белки: производственные платформы и
проблемы, Biotechnol. J., 3, 90 е 97 (2008).
2. Дженкинс, Н., Мерфи, Л. и Тайтер, Р.: Посттрансляционные модификации ф катионы
рекомбинантные белки: значимые ф рак для биофармацевтических препаратов, Мол. Biotechnol.,
39, 113 е 118 (2008).
3. Уолш, Г .: Биофармацевтические ориентиры 2010, Нац. Biotechnol., 28, 917 е 924
(2010).
4. Вурм, FM: Производство терапевтических рекомбинантных белков в культивируемых
клетки млекопитающих, Nat. Biotechnol., 22, 1393 е 1398 (2004).
5. Ланг, Р .: Биосимиляры и последующие биопрепараты: мировой рынок 2012 г. е 2022, в: Low, G. (Ред.),
Биосимиляры и последующие биопрепараты: мировой рынок. Visiongain, Лондон (2012).
6. Лим, Ю., Вонг, NSC, Ли, YY, Ку, SCY, Вонг, DCF, и Яп, MGS:
Mol. Биол., 690, г. 31 год е 56 (2011).
е 1339 (2009).
качестве ветеринарных вакцин, Gene Ther., 12, 73 е 83 (2005).
J. Gene Med., 9, 833 е 842 (2007).
23.
Надо, И. и Камен, А .: Производство аденовирусного вектора для генной терапии, Biotechnol. Adv., 20, 475 е
24.
Гайсе С. и Фукс К. Продукция рекомбинантного белка путем транзиторного переноса гена в клетки
25.
Балди, Л., Хакер, Д.Л., Адам, М., и Вурм, FM: Производство рекомбинантного белка путем крупномасштабной
489 (2003).
млекопитающих, Methods Enzymol., 463, г. 223 е 238 (2009).
временной экспрессии генов в клетках млекопитающих: современное состояние и перспективы на будущее,
Инженерия клеток млекопитающих в биотехнологии е текущие достижения и перспективы на будущее,
Biotechnol. Appl. Биохим., 55, 175 е 189 (2010).
7. Диннис, DM и Джеймс, округ Колумбия: Инженерные фабрики клеток млекопитающих для
Biotechnol. Lett., 29, 677 е 684 (2007).
26.
вирусоподобных частиц е Вакцина против вируса Барра, J. Virol., 85,
улучшенное производство рекомбинантных моноклональных антител: уроки природы? Biotechnol. Bioeng., 91,
180 е 189 (2005).
8. Браун, С.М. и Аль-Рубей, М .: Методы отбора высокопродуктивных
13105 е 13113 (2011).
27.
антител, Biotechnol. Bioeng., 72, 55 е 61 (2001).
10.
клеток животных соответствует геномике 18 заседаний ESACT. Спрингер, Дордрехт (2005).
11.
Дитмэр, С., Нильсен, Л.К., и Тимминс, штат Невада: Разработка супер-продуцента млекопитающих J.
Chem. Technol. Biotechnol., 86, 905 е 914 (2011).
12.
Бока-Ратон (2006).
встроенного зонда для спектроскопии комбинационного рассеяния, Biotechnol. Bioeng., 108, 1215 е 1221 (2011).
14.
Лечина, М., Солей, А., Грасиа, Дж., Эспунья, Э., Ласаро, Б., Кайро, Дж. Дж., И Годиа, Ф .: Применение
онлайн-измерений OUR для определения точек действий по улучшению культур клеток бакуловирусов и
насекомых в биореакторах, J. Biotechnol., 125,
385 е 394 (2006).
15.
Кинан, Дж., Пирсон, Д. и Клайнс, М .: Роль рекомбинантных белков в разработке бессывороточных сред,
Цитотехнология. 50, 49 е 56 (2006).
17.
Грилбергер, Л., Крейл, Т.Р., Наср, С., и Рейтер, М .: Новые тенденции в производстве без плазмы
терапевтических рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетках млекопитающих, Biotechnol. J., 4, 186
е 201 (2009).
Кондит, RC: Принципы вирусологии, стр.25. е 58, в: Knipe, DM andHowley, PM (Eds.), Филдс вирусологии.
Липпинкотт Уильямс и Уилкинс, Филадельфия (2007).
30.
Гальвес, Дж., Лесина, М., Сола, К., Кайро, Дж. Дж., И Годиа, Ф .: Оптимизация культур клеток HEK293S для
производства аденовирусных векторов в биореакторах с использованием онлайн-измерений OUR, J.
Biotechnol., 157, 214 е 222 (2012).
31.
32.
Альтарас, Н. Е., Аунинс, Дж. Г., Эванс, Р. К., Камен, А., Конз, Д. О. и Пойнт, В.:
Производство и составление аденовирусных векторов, Adv. Biochem. Англ. Biotechnol., 99, 193 е 260 (2005).
Лечина, М., Тинто, А., Гальвес, Дж., Годиа, Ф., и Кайро, Дж. Дж .: Непрерывная перфузионная культура
инкапсулированных клеток гибридомы, J. Chem. Technol. Biotechnol., 86,
1555 е 1564 (2011).
33.
Айер П., Острове Дж. М. и Ваканте Д.: Сравнение технологий производства аденовирусов,
Цитотехнология, 30, 169 е 172 (1999).
34.
Дормонд, Э., Перье, М., и Камен, А .: От ф от первого к аденовирусному вектору третьего поколения:
какие параметры определяют выход продукции? Biotechnol. Adv., 27, 133 е 144 (2009).
Гросвенор, С .: Новая эра в разработке сред для клеточных культур, BioPharm Int., 25,
28 е 35 год (2012).
16.
Biotechnol., 9, 100 е 112 (2009).
29.
Абу-Абси, Н.Р., Кенти, Б.М., Куэльяр, М.Э., Борис, МС, Сахамури, С., Страчан, DJ, Хаусладен, М.С., и Ли, З.Дж .: Мониторинг
в реальном времени множества параметров в биореакторах культур клеток млекопитающих с использованием
Нельсен, К., Шухт, Р., Да Гама-Нортон, Л., Кремер, В., Баер, А., Кейли, А., Хаузер, Х., и Вирт, Д.: Экспрессия
рекомбинантного белка путем нацеливания на предварительно выбранные хромосомные локусы, BMC
Бургенер А. и Батлер М .: Среднее развитие, стр.41 е 80, в: Озтюрк, С.
и Ху, WS (ред.), Технология клеточных культур для фармацевтической и клеточной терапии. CRC Press,
13.
28.
Зустяк, депутат, Дораи, Х., Бетенбо, MJ, и Зауэрвальд, TM: Контроль апоптоза для оптимизации выхода
белков из клеток млекопитающих, Methods Mol. Биол., 801, г. 111 е 123 (2012).
Коста, М., Мальхо, Р., Гонсалвес, Дж., И Феррейя, Г.: Разработка клеточной линии 293T для производства
вирусоподобных частиц в биореакторах, стр. 325 е 328, в: Gòdia, F. и Фуссенегер, М. (ред.), Технология
линии клеток млекопитающих, Trends Biotechnol., 25, 425 е 432 (2007).
9. Чен, К., Лю, К., Се, Л., Шарп, Пенсильвания, и Ван, Д.И.: Разработка
линия клеток млекопитающих для снижения образования лактата и продукции высоких моноклональных
Руисс Р., Йохум С., Ваннер Г., Райсбах Г., Хаммершмидт В. и Цейдлер Р.: Эпштейн на основе
35.
Жардон, М. и Гарнье, А .: PH, pCO 2, и влияние температуры на продукцию R-аденовируса, Biotechnol.
Прог., 19, 202 е 208 (2003).
36.
Шен, К.Ф., Войер, Р., Том, Р., и Камен, А .: Переоценка питательных сред и критических метаболитов,
влияющих на продукцию аденовирусов, Biotechnol. Прог., 26,
200 е 207 (2010).