Рекомбинантный инсулин ПЛАН РАБОТЫ: I. ИНСУЛИН. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ II. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА И ПРОДУЦЕНТЫ III. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ IV. СОВРЕМЕННЫЕ КОММЕРЧЕСКИЕ НАЗВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ V. КОМПАНИИ – ПРОИЗВОДИТЕЛИ VI. ОБЪЕМЫ ПРОДАЖ VII. ПРИМЕНЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ VIII.ПЛЮСЫ И МИНУСЫ I. ИНСУЛИН. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ Инсулин - пептидный гормон, выделяемый βклетками островками Лангенгарса. Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь - из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. ВЫДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЖИВОТНЫХ • • • • • Измельчение желез Экстракция (этанолом, подкисленным раствором этанола) Отстаивание (осаждение белков на холоду) Центрифугирование Ионообменная хроматография (сульфокатионит, рН=3-3,3) • • • • Отмывка (жира этанолом, белков ацетатным буфером) Десорбция (аммонийный буфер, рН=10) Осаждение балласта из раствора (pH 4,5 + ацетон) Осаждение инсулина (цинка ацетатом pH=6,2) • • • • Растворение инсулина в воде (рН=2,8) Отстаивание и фильтрование (через гизельгур) Кристаллизация инсулина (+ZnCL2 0°C pH=8,5) Промывка кристаллов инсулина (водой, ацетоном, эфиром) ОТЛИЧИЯ ИНСУЛИНОВ – ВИДОСПЕЦИФИЧНОСТЬ Инсулин человека имеет последовательность аминокислот: тирозинсеринизолейцин, говяжий инсулин: аланинсерин-валин. Инсулин состоит из двух пептидных цепей. А-цепь человеческого инсулина содержит 21 аминокислоту, Вцепь – 30 аминокислот. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ Инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом. Результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина. 1922 ЗАГОЛОВОК LOREM IPSUM Датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат. Получение первых кристаллов инсулина. Расширение структуры инсулина. Получение однокомпонентного инсулина 1935 1952-1954 Советскими учеными А.Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина Начало 70-х г.г Синтез с помощью E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генноинженерных штаммов E.coli. 80-е годы II. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА И ПРОДУЦЕНТЫ • СИНТЕТИЧЕСКИЙ (БИОХИМИЧЕСКИЙ). • БИОСИНТЕТИЧЕСКИЙ (ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЙ). a) Через биосинтез проинсулина с дальнейшим выделением инсулина b) Раздельный биосинтез двух цепей инсулина с последующим их объединением химическим синтезом БИОСИНТЕЗ ИНСУЛИНА ЧЕРЕЗ ПРОИНСУЛИН. СТАДИИ. 1стадия. Конструирование рекомбинантной ДНК. 2 стадия. Ферментация. 3 стадия. Выделение из Бромциан – гидролиз (конц. НСООН) Структурный аналог проинсулина Сульфитолиз (Na2SO3+Na2S4O6 ) Проинсулин – S - сульфонат биомассы синтезированного рекомбинантного белка. 4 стадия. Химическая и Ренатурация (R-SH) ферментативная Проинсулин в нативной форме трансформация Ферментативный гидролиз Инсулин рекомбинантного белка. РАЗДЕЛЬНЫЙ БИОСИНТЕЗ ДВУХ ЦЕПЕЙ ИНСУЛИНА С ПОСЛЕДУЮЩИМ ИХ ОБЪЕДИНЕНИЕМ ХИМИЧЕСКИМ СИНТЕЗОМ СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА • 1 ЭТАП (UPSTREAM, U) «НАРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ МАССЫ» • 2 ЭТАП (DOWNSTREAM, D) «ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА» • 3 ЭТАП (FILL AND FINISH, F) «ПОЛУЧЕНИЕ ГОТОВОЙ ЛФ» 1 ЭТАП UPSTREAM 1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШТАММАПРОДУЦЕНТА (ФЕРМЕНТАЦИЯ) 2. СБОР КЛЕТОК 3. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ (ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ) 4. ОТДЕЛЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ «ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ» ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕМ 2 ЭТАП DOWNSTREAM 1.СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ 2. РЕНАТУРАЦИЯ 3.ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ 4. ОЧИСТКА МЕТОДАМИ ХРОМАТОГРАФИИ – ИОХ И ГФ 3 ЭТАП FILL AND FINISH 1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЛФ 2. УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ 3. РОЗЛИВ В КАРТРИДЖИ 4. ЭТИКЕТИРОВКА И УПАКОВКА АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ ПОЛНОГО ЦИКЛА ПРОИЗВОДСТВА ИНСУЛИНА НА ЭТАПАХ UPSTREAM И DOWNSTREAM ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ESCHERICHIA COLI • КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ: КЛЕТКИ МЕЛКИЕ, ПАЛОЧКОВИДНОЙ ФОРМЫ, ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ, 1×3,5 МКМ, ПОДВИЖНЫЕ. ШТАММ ХОРОШО РАСТЕТ НА ОБЫЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ (МПА, МПБ, LB-БУЛЬОН, LB-АГАР, МИНИМАЛЬНАЯ СРЕДА С ГЛЮКОЗОЙ). • ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ: КЛЕТКИ РАСТУТ ПРИ 4-42°С, ОПТИМУМ РН 6,8-7,6. В КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА АЗОТА ИСПОЛЬЗУЮТ КАК МИНЕРАЛЬНЫЕ СОЛИ АММОНИЯ, ТАК И ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ: АМИНОКИСЛОТЫ, ПЕПТОН, ТРИПТОН, ДРОЖЖЕВОЙ ЭКСТРАКТ. В КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА ПРИ РОСТЕ НА МИНИМАЛЬНОЙ СРЕДЕ ИСПОЛЬЗУЮТ ГЛИЦЕРИН, УГЛЕВОДЫ, АМИНОКИСЛОТЫ. • УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ: КЛЕТКИ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПРОЯВЛЯЮТ УСТОЙЧИВОСТЬ К АМПИЦИЛЛИНУ (ДО 300 МКГ/МЛ) • СОДЕРЖАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ ИНДУКЦИИ СОСТАВЛЯЕТ НЕ МЕНЕЕ 25% ОТ СУММАРНОГО КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА. III. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ • Рекомбинантный инсулин взаимодействует со специфическими рецепторами внешней цитоплазматической мембраны клеток и образует инсулин-рецепторный комплекс, стимулирующий внутриклеточные процессы, в т. ч. синтез ряда ключевых ферментов (гексокиназа, пируваткиназа, гликогенсинтетаза и др.). Снижение содержания глюкозы в крови обусловлено повышением ее внутриклеточного транспорта, усилением поглощения и усвоения тканями, стимуляцией липогенеза, гликогеногенеза, снижением скорости продукции глюкозы печенью и др. Продолжительность действия препаратов инсулина в основном обусловлена скоростью всасывания, которая зависит от нескольких факторов (например, от дозы, способа и места введения), в связи с чем профиль действия инсулина подвержен значительным колебаниям, как у различных людей, так и у одного и того же человека. • Полнота всасывания и начало эффекта инсулина зависит от способа введения (подкожно, внутримышечно), места введения (живот, бедро, ягодицы), дозы (объема вводимого инсулина), концентрации инсулина в препарате и др. IV. СОВРЕМЕННЫЕ КОММЕРЧЕСКИЕ НАЗВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ Протамины – это коммерческое название группы сильно основных пептидов, входящих в состав молок осетровых рыб. Для получения НПХинсулина обычно используют протамин сульфат, полученный из молок лососевых рыб. Эффект пролонгации обеспечивается за счет медленной деградации протаминового комплекса под действием фибринолитических ферментов. Наиболее известные инсулиновые препараты этого класса: Хумулин НПХ (“Eli Lilly”, США), Протафан НМ (“NovoNordisk”, Дания) Инсуман Базал (“Sanofi-Aventis”, ФранцияГермания). В России производятся Инсуран НПХ (ИБХ РАН), Биосулин Н (“Фармстандарт-Уфавита”), Ринсулин Н (Национальные биотехнологии). V. КОМПАНИИ – ПРОИЗВОДИТЕЛИ • «NOVO NORDISK» (ДАНИЯ) • «ELI LILLY AND COMPANY» (США) • «SANOFI» (ФРАНЦИЯ) • «BIOCON» (МИЛАН) • «WANBANG BIOPHARMA» (КИТАЙ) • «JULPHAR» (РАС-АЛЬ-ХАЙМ) • «ГЕРОФАРМ», «МЕДСИНТЕЗ», «ФАРМСТАНДАРТ» (РОССИЯ) VI. ОБЪЕМЫ ПРОДАЖ РОССИЙСКИЙ РЫНОК ИНСУЛИНА VII. ПРИМЕНЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ • Зафиксировано значимое снижение уровней ГН, ППГ, HbA1c, что стало следствием увеличения как суточной дозы инсулина, так и охвата пациентов инсулинотерапией. Последний вырос с 32% на старте исследования до 99% через 3 месяца наблюдения. У 2 (1%) пациентов через 3 месяца наблюдения инсулинотерапия была прекращена в связи с достижением целевого значения HbA1c и стойкой компенсацией гликемии. • Общая частота гипогликемий составила 1 гипогликемию на 1 человека за 3 месяца, т.е. 4 гипогликемии на человека в год. При этом не было зафиксировано ни одной тяжелой гипогликемии, ни одного побочного эффекта и ни одной местной реакции на введение инсулина. VII. ПЛЮСЫ И МИНУСЫ ПЛЮСЫ: - ПРОДЛЕННЫЙ ЭФФЕКТ ДЕЙСТВИЯ СВЯЗАН С ЕГО ВЫСОКОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К САМОАССОЦИАЦИИ И ВОЗМОЖНОСТЬЮ ОБРАТИМОЙ СВЯЗИ С АЛЬБУМИНОМ КАК В ПОДКОЖНО-ЖИРОВОЙ КЛЕТЧАТКЕ, ТАК И В ПЛАЗМЕ КРОВИ, ЧТО ЗАМЕДЛЯЕТ ЕГО СИСТЕМНУЮ АБСОРБЦИЮ ИЗ МЕСТ ИНЪЕКЦИИ, ОБЕСПЕЧИВАЕТ БУФЕРНЫЙ ЭФФЕКТ И НИЗКУЮ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ; - ЗНАЧИТЕЛЬНО МЕНЬШИЙ РИСК РАЗВИТИЯ ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКИХ ЭПИЗОДОВ, В Т.Ч. НОЧНОЙ ГИПОГЛИКЕМИИ У ПАЦИЕНТОВ С СД1 И СД2; - ЗНАЧИМО МЕНЬШИЙ НАБОР МАССЫ ТЕЛА; - БОЛЬШАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ ПРЕПАРАТА. МИНУСЫ: - ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКИЕ СОСТОЯНИЯ (БЛЕДНОСТЬ КОЖНЫХ ПОКРОВОВ, УСИЛЕНИЕ ПОТООТДЕЛЕНИЯ, ОЩУЩЕНИЕ СЕРДЦЕБИЕНИЯ, ТРЕМОР, ОЗНОБ, ЧУВСТВО ГОЛОДА, ВОЗБУЖДЕНИЕ, ПАРЕСТЕЗИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА, СЛАБОСТЬ, ГОЛОВНАЯ БОЛЬ, ГОЛОВОКРУЖЕНИЕ, СНИЖЕНИЕ ОСТРОТЫ ЗРЕНИЯ); - АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ: КОЖНАЯ СЫПЬ, ОТЕК КВИНКЕ, АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ШОК; - МЕСТНЫЕ РЕАКЦИИ: ГИПЕРЕМИЯ, ОТЕЧНОСТЬ И ЗУД В МЕСТЕ ИНЪЕКЦИИ, ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ – ЛИПОДИСТРОФИЯ В МЕСТЕ ИНЪЕКЦИИ. - ОТЕКИ - ПРЕХОДЯЩИЕ СНИЖЕНИЯ ОСТРОТЫ ЗРЕНИЯ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ СУЩЕСТВУЮТ 3 МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА. ПОТРЕБНОСТЬ РФ В ИНСУЛИНЕ – ЗНАЧИТЕЛЬНАЯ И НЕ УДОВЛЕТВОРЯЕТСЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫМ ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ КОМПЛЕКСОМ. НЕОБХОДИМО ИМЕТЬ 2-3 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕДПРИЯТИЯ С ДВОЙНОЙ ЛИНИЕЙ ПРОИЗВОДСТВА НА ТЕРРИТОРИИ РФ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА, СООТВЕТСТВУЮЩИХ СОВРЕМЕННЫМ СТАНДАРТАМ КАЧЕСТВА. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!
