CrossMark click for updates Спиронолактон (SPR) блокирует выработку вируса ЭпштейнаБарр путем ингибирования функции белка EBV SM Динеш Верма, Джейкоб Томпсон и Санкар Сваминатан Отдел инфекционных заболеваний, Медицинский факультет, Медицинский факультет Университета Юты, Солт-Лейк-Сити, Юта, США 84132 Отредактировано Эллиоттом Киффом, Гарвардская медицинская школа и Бригам и женская больница, Бостон, Массачусетс, и утверждено 17 февраля 2016 г. (получено на рассмотрение 1 декабря 2015 г.) Epstein-Barr virus | spironolactone | posttranscriptional regulation | herpesvirus | antiviral Вирус Эпштейна-Барра (EBV) представляет собой лимфотропный герпес человека, связанный с несколькими типами лимфоидных и эпителиальных злокачественных новообразований и лимфопролиферативных синдромов (обзор см. В ссылке 1). ВЭБ инфицирует большинство людей во всем мире и вызывает постоянную латентную инфекцию на протяжении всей жизни в В-клетках памяти. Происходит периодическая реактивация из-за латентности, и EBV входит в литическую фазу репликации, во время которой экспрессируется строго регулируемая серия литических генов, кульминацией которой является лизис клетки-хозяина и высвобождение инфекционного вирусного потомства. Все герпесвирусы разделяют эти способности, чтобы установить бессимптомное скрытое инфицирование и периодически активировать. Все герпесвирусы также экспрессируют регуляторный белок на ранней стадии литической репликации, который необходим для эффективной экспрессии генов и производства инфекционных вирионов. Член EBV этого семейства, который включает вирус простого герпеса ICP27, цитомегаловирус (CMV) UL69 и ассоциированный с саркомой герпеса вирус Kaposi (KSHV) ORF57, известен как SM (2). SM действует посттранскрипционно, чтобы усилить накопление многих литических транскриптов EBV. Активность SM является высокоспецифичной по отношению к генам и преимущественно усиливает экспрессию нескольких поздних литических транскриптов, в том числе кодирующих основной вирусный капсидный антиген (VCA) и gp350, который необходим для инфицирования B-лимфоцитами (3-5). SM и его гомологи в других вирусах герпеса могут также усиливать транскрипцию и трансляцию специфических вирусных генов (6) В настоящее время все доступные противогерпесвирусные препараты нацелены на вирусные ДНК-полимеразы и обычно являются высокоэффективными, но токсичность и развитие резистентности ограничивают их использование (7). Чтобы обнаружить потенциальные новые терапевтические соединения, мы применили клеточный скрининганализ для выявления соединений, которые специфически нацелены на функцию SM (8). Используя этот анализ, спиронолактон (SPR), лекарственное средство, применяемое в клинической практике более 50 лет, было идентифицировано как ингибирующее функцию SM и 3614 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1523686113 продукцию вирионов EBV. SPR является антагонистом альдостерона, который связывается с рецептором минералокортикоидов, но сравнение с производными SPR показало, что блокирующая активность минералокортикоидов не является основой его противовирусной активности. Скорее, профиль влияния SPR на экспрессию гена EBV соответствовал генетически инактивирующему SM. SM и его аналоги в других вирусах герпеса не имеют клеточных гомологов и действуют на стадии репликации герпесвируса, отличной от репликации ДНК (9). Таким образом, соединения на основе SPR могут давать противовирусные препараты с новым механизмом действия и ограниченной токсичностью. Результаты SPR блокирует функцию EBV SM. Ранее мы описали скрининг-анализ для выявления соединений, которые могут ингибировать функцию белка EBV SM, который необходим для репликации литического EBV (3, 8). Анализ основан на обнаружении того, что мРНК, зависящие от белка SM EBV для эффективной экспрессии, придают зависимость SM от гетерологичных генов, с которыми они слиты. В анализе используется линия репортерных клеток, стабильно экспрессирующая SM-чувствительный ген KSHV ORF59, слитый в рамке с GFP, и в котором продукт слияния не экспрессируется эффективно. Они также содержат индуцируемый доксициклином ген SM, и когда продуцируется белок SM, экспрессируется слитая мРНК ORF59-GFP, и клетки проявляют сильную зеленую флуоресценцию (8). Мы провели скрининг соединений с известной активностью и структурой (10) на их способность ингибировать функцию SM в этом анализе и идентифицировали SPR как потенциальный ингибитор функции SM. Обработка репортерных клеток с помощью 10 мкМ SPR приводила к ингибированию флуоресценции, сопровождаемой почти полным отсутствием ORF59-GFP РНК и накоплением белка (фиг. 1A-C). Затем мы проверили, может ли SPR влиять на локализацию SM, выполняя иммунофлуоресцентную микроскопию для SM в присутствии или отсутствии SPR. Как видно на рис. 1D, SPR не влияет на локализацию SM в ядерной области. Специфичность активности SPR тестировали путем определения влияния SPR на аналогичную конструкцию, экспрессирующую гибридную конструкцию UL44-GFP CMV, которая не является SM-зависимой или -реагирующей. Важность Вирус Эпштейна-Барр - это вирус герпеса человека, связанный с несколькими типами злокачественных новообразований. Мы показываем, что спиронолактон, препарат, используемый для блокирования минералокортикоидной активности, также обладает активностью против EBV и что он действует, ингибируя функцию незаменимого белка EBV SM, который преимущественно увеличивает экспрессию специфических генов EBV. Мы также показываем, что активность блокирования минералокортикоидов не является основой противовирусной активности спиронолактона. Поскольку белок SM действует на этапах жизненного цикла вируса, отличных от тех, на которые нацелены доступные в настоящее время терапии, это исследование прокладывает путь для разработки новых препаратов против EBV для решения возникающих проблем лекарственной устойчивости и токсичности. Author contributions: D.V. and S.S. designed research; D.V., J.T., and S.S. performed research; D.V., J.T., and S.S. analyzed data; and D.V. and S.S. wrote the paper. The authors declare no conflict of interest. This article is a PNAS Direct Submission. 1 To whom correspondence should be addressed. Email: [email protected]. edu. This article contains supporting information 1073/pnas.1523686113/-/DCSupplemental. online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10. Verma et al. MEDICAL SCIENCES Клинически доступные препараты, активные против вируса ЭпштейнаБарра (EBV) и других герпесвирусов человека, ограничены теми, которые нацелены на репликацию вирусной ДНК. Чтобы идентифицировать соединения, направленные против других этапов жизненного цикла вируса, мы искали препараты, активные против белка EBV SM, который необходим для производства инфекционных вирусов. SM обладает высокоспецифичным геном действия и преимущественно усиливает экспрессию нескольких генов EBV позднего литического цикла. Здесь мы демонстрируем, что спиронолактон, антагонист минералокортикоидных рецепторов, одобренный для клинического применения, ингибирует функцию SM и инфекционную продукцию EBV. Экспрессия вирусного капсидного вируса EBV сильно зависит от SM, и спиронолактон ингибирует синтез вирусного капсидного антигена и образование капсида, блокируя продукцию вириона EBV на стадии, следующей за репликацией вирусной ДНК. Кроме того, спиронолактон ингибирует экспрессию других SM-зависимых генов, необходимых для образования инфекционных вирионов. Кроме того, мы демонстрируем, что молекулы, структурно связанные со спиронолактоном с подобной антиминералокортикоидной блокирующей активностью, не ингибируют продукцию EBV. Эти данные открывают путь для разработки противогерпесвирусных препаратов с новыми механизмами действия, направленными против SM и гомологичных незаменимых белков в других вирусах герпеса. и EPR - нет (рис. 3B). Сравнение их структур показывает, что эти молекулы различаются только по модификациям углерода №7 родительской молекулы (рис. 3C). Следовательно, остатки в этом случае, по-видимому, являются критическими для анти-SM и EBV-направленной противовирусной активности, но не для минералокортикоидной активности. Все четыре соединения были также протестированы в репортерном анализе SM, и SPR был очень активен, при этом CAN проявлял небольшую активность, а EPR и TMS не обнаруживали активности (Fig. S2). Чтобы подтвердить альдостерон-блокирующую активность четырех соединений, был проведен клеточный репортерный анализ на функцию альдостерона и подтверждено, что все четыре соединения, хотя и различающиеся по эффективности, обладали максимальной активностью при концентрациях 10 мкМ и выше (рис. S3). Рис. 1. Идентификация SPR как препарата, который ингибирует функцию EBV SM. (A) Клетки HEK293 стабильно трансфицировали репортерной плазмидой KSHV ORF59-GFP и трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим индуцибельный белок EBV SM. Флуоресцентную микроскопию проводили на репортерных клетках в присутствии или в отсутствие SPR. Клетки экспрессировали белок GFP только тогда, когда экспрессировался SM (+ SM), но были GFP-негативными при обработке 10 мкМ SPR (S). (B) SPR ингибирует SM-зависимое накопление РНК ORF59-GFP. Экспрессию слитой РНК ORF59-GFP измеряли с помощью qRT-PCR через 24 ч после обработки 10 мкМ SPR. (C) SPR ингибирует накопление белка ORF59-GFP. Иммуноблоттинг с антителом против GFP или актина проводили на лизатах клеток, обработанных, как показано. (D) Репортерную клеточную линию индуцировали для экспрессии SM и обрабатывали либо носителем (-S), либо обрабатывали SPR (+ S). Клетки фиксировали через 30 ч после индукции и окрашивали либо антителами DAPI (синий) к oranti-SM (красный). (E) 293 клетки трансфицировали CMV UL44-GFP и пустым вектором (-) или SM (+) и обрабатывали либо носителем, либо 10 мкМ SPR, как показано. SPR не влиял на экспрессию UL44-GFP, указывая на то, что его действие является SM-специфичным (рис. 1E). Противовирусная активность SPR не связана с активностью блокирования минералокортикоидных рецепторов. SPR блокирует активность альдостерона, связываясь с рецептором минералокортикоида и действуя как антагонист рецептора (11). Чтобы определить, связано ли ингибирование SM с помощью SPR с его активностью, блокирующей минералокортикоиды, мы сравнили его влияние на SM с эффектом эплеренона (EPR), химически сходного конгенера, также клинически используемого в качестве антагониста альдостерона (12). Как показано на рис. 2, SPR демонстрирует дозозависимый ингибирующий эффект SM в функциональном анализе SM, тогда как EPR не оказывает никакого эффекта. Таким образом, эти результаты показывают, что блокада минералокортикоидных рецепторов недостаточна для ингибирования SM и что она вряд ли связана с влиянием SPR на активность SM. SPR демонстрирует мощную, зависимую от структуры противовирусную активность против EBV. Чтобы определить, приводит ли SPRингибирование активности SM к противовирусной активности, мы измерили его влияние на инфекционную продукцию EBV. Эпителиальную клеточную линию карциномы желудка (AGS), инфицированную GFPэкспрессирующим EBV (13), использовали для проверки влияния SPR и SPR-связанных соединений на продукцию EBV. Клетки AGS индуцировали литическую репликацию EBV и обрабатывали либо носителем (ДМСО), либо SPR. Высвобождение инфекционного EBV затем измеряли путем инкубации супернатанта из индуцированных клеток AGS с неинфицированными клетками 293. EBV-инфицированные клетки экспрессируют GFP, что позволяет им быть точно подсчитанным с помощью проточной цитометрии, как описано ранее (5, 14). SPR приводил к связанному с дозой снижению титра инфекционного EBV в супернатанте (рис. 3A). IC50 SPR (2,1 мкМ) был аналогичен таковому для ацикловира (3,4 мкМ) в этом анализе (рис. S1). Противовирусный эффект EPR и двух метаболитов SPR, которые также обладают активностью антагониста минералокортикоидов (11), canrenone (CAN) и 7a-тиометил SPR (TMS), сравнивали с эффектом SPR. Интересно, что CAN проявлял противовирусную активность, хотя и меньшую, чем у SPR, тогда как TMS 3614 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1523686113 SPR ингибирует выработку вируса на стадии, следующей за репликацией ДНК EBV, но до высвобождения вируса. Чтобы исследовать механизм противовирусного действия SPR, мы измерили влияние SPR на репликацию ДНК EBV и раннюю (E) и немедленную-раннюю (IE) экспрессию генов, которые происходят до репликации ДНК (1). Инфицированные EBV клетки AGS индуцировались для репликации и обрабатывались SPR или носителем. Репликацию ДНК измеряли с помощью КПЦР ДНК, собранной из индуцированных клеток, и экспрессию белка EBV оценивали с помощью вестерн-блоттинга клеточных лизатов (рис. 4А и С). Несмотря на то, что SPR оказывает ожидаемое ингибирующее влияние на инфекционную продукцию EBV, SPR не влияет на увеличение числа копий внутриклеточного EBV, которое происходит при литической репликации (рис. 4 A и B). SPR также не влиял на экспрессию генов IE или E, включая экспрессию SM (рис. 4C). Многие гены E необходимы для репликации литической ДНК EBV, тогда как экспрессия поздних генов EBV сильно зависит от репликации ДНК EBV (1). Сохранение экспрессии генов EI и E и репликации ДНК в присутствии SPR, следовательно, указывает на то, что SPR ингибирует экспрессию одного или нескольких поздних генов, необходимых для инфекционной продукции EBV. Чтобы определить, выделяются ли дефектные неинфекционные частицы EBV после обработки SPR, мы измерили влияние SPR на высвобождение внеклеточной ДНК EBV с помощью КПЦР. Как показано на рис. 4D, SPR, но не EPR, предотвращал высвобождение ДНК EBV в супернатант. Чтобы определить, имел ли SPR сходный эффект в В-лимфоцитах, инфицированных EBV, мы измерили экспрессию литического белка E и IE в EBV-положительных клетках P3HR1-ZHT-лимфомы, обработанных SPR (рис. S4). SPR не влиял на экспрессию гена E или IE в клетках лимфомы. Однако, как и в эпителиальных клетках, SPR ингибировал высвобождение внеклеточной ДНК EBV в супернатант (рис. S4A). Следовательно, эти данные указывают на то, что, поскольку ДНК EBV обычно реплицируется в присутствии SPR, последующие стадии упаковки, сборки или выхода вируса могут быть ингибированы SPR. SPR предотвращает образование капсида EBV. Поскольку SPR предотвращал образование инфекционного вируса, несмотря на то, что он не влиял на репликацию ДНК, мы исследовали влияние SPR на сборку и выход вириона. Рис. 2. Ингибирующий эффект SPR на активацию SM экспрессии генов не зависит от антагонистической активности минералокортикоидных рецепторов. Репортерную клеточную линию ORF59-GFP либо подвергали ложной обработке (-), либо обрабатывали докс (+) для индукции экспрессии SM, которая требуется для экспрессии GFP. Индуцированные клетки также обрабатывали либо носителем ДМСО (0), либо различными концентрациями SPR (S) или антагонистом рецептора минералокортикоида EPR (E), и клетки исследовали на экспрессию GFP с помощью флуоресцентной микроскопии через 24 часа после обработки. Концентрации лекарств показаны под панелью. Verma et al. Лектронную микроскопию проводили на EBV-инфицированных клетках AGS после индукции репликации EBV и обработки SPR, чтобы исследовать потенциальное влияние SPR на образование вириона. Как показано на рис. 5, SPR полностью отменил образование капсида EBV. Принимая во внимание, что внутриядерные капсиды EBV на различных стадиях образования были легко обнаруживаемыми в клетках AGS, инфицированных EBV (32% индуцированных клеток), капсиды не были обнаружены в клетках, обработанных SPR (0%). Репликация вирусной ДНК снова не была затронута медикаментозным лечением (рис. S5). Таким образом, эти данные подтверждают, что SPR ингибирует экспрессию одного или нескольких белков, необходимых для образования капсида EBV, но не исключают дополнительных эффектов на другие поздние гены. SPR ингибирует экспрессию необходимого SM-зависимого позднего литического капсидного гена. Недавно мы показали, что SM преимущественно усиливает экспрессию нескольких поздних литических генов, но не требуется для эффективной экспрессии генов IE или E (9). Чтобы исследовать влияние SPR на экспрессию поздних генов EBV, мы сравнили влияние SPR на экспрессию белка EBV из нескольких генов EBV разных временных классов с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Как и ожидалось, SPR не оказывал влияния на экспрессию IE генов Z или E, генов EA или SM (рис. 6). Однако SPR сильно ингибировал экспрессию VCA, которая сильно зависит от SM для эффективной экспрессии (4, 9). Хотя процентное содержание BMRF1 (EA-D) -, ZTA- и SMэкспрессирующих клеток не подвергалось воздействию или незначительно увеличивалось при обработке SPR, процент VCAпозитивных клеток снизился на 73% (P <0,0001; фиг. 6В). Чтобы подтвердить эти результаты и изучить влияние SPR на дополнительные SM-зависимые гены, для некоторых литических генов EBV была выполнена qPCR с использованием РНК из обработанных SPR клеток AGS. Как показано на фиг. S6A, влияние SPR на поздние литические гены было геноспецифичным, ингибируя экспрессию SM-зависимых мРНК, таких как BDLF1, BLLF1 (gp350) и BcLF1 (VCA), но мало влияя на BFRF3 или BALF4, которые не зависят от SM (9). Эффект SPR на эти гены в клетках лимфомы, инфицированных EBV, был аналогичен эффекту, наблюдаемому в эпителиальных клетках AGS (Fig. S6B). Мы также сравнили влияние SPR на SM-чувствительные и SMневосприимчивые транскрипты в анализах котрансфекции (Fig. S7) и продемонстрировали, что SPR ингибирует только SMчувствительную экспрессию генов. Соответствие между эффектами лечения SPR и удалением SM на транскриптоме EBV. 3614 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1523686113 0 0 1 2.5 5 10 15 20 10 20 JlM S E MEDICAL SCIENCES Рис. 3. Противовирусная активность SPR в эпителиальных клетках. (A) Литическая репликация EBV была индуцирована TPA (+ ind.) В клеточной линии карциномы желудка (AGS), инфицированной GFP-EBV, которая затем была обработана различными концентрациями SPR или EPR, как показано. Продукцию вирионов измеряли путем пассирования в клетки 293 и количественно определяли проточной цитометрией. Титр EBV, выраженный как количество GFPтрансдуцирующих единиц на мл, показан на оси y. (B) Противовирусную активность CAN, TMS и EPR (E) сравнивали с SPR, как в A. Клетки либо не обрабатывали (-), либо обрабатывали (+) для индукции литической репликации (ind). (C) Структуры SPR, CAN, TMS и EPR показаны. Тиоацетильная группа у C-7 SPR обведена кружком. Мы всесторонне охарактеризовали специфичность воздействия SM на транскриптом EBV, сравнивая транскриптом SMKO EBVинфицированных клеток с транскриптомом клеток, инфицированных wt EBV и SMKO-спасенным SMKO EBV (9). Эффект SM сильно зависит от генов и в первую очередь усиливает экспрессию нескольких важных поздних генов, включая VCA и gp350 (4, 5, 9). Таким образом, было возможно провести аналогичное глобальное сравнение между эффектами SPR на WT EBV-инфицированных клетках и эффектом генетического выключения функции SM. Мы обрабатывали AGS (эпителиальные клетки) и P3HR1-ZHT (клетки лимфомы) с помощью SPR или носителя и собирали РНК из инфицированных клеток через 48 ч после индукции литической репликации EBV. Характер экспрессии генов в присутствии и отсутствии SPR затем определяли с помощью высокопроизводительного секвенирования и транскриптомного анализа, в котором определяли количество считываний для каждого гена EBV. Затем результаты были рассчитаны как бинарные отношения между экспрессией гена в отсутствие или присутствии SPR и экспрессией гена в присутствии или отсутствии SM. Как показано на рис. 7, многие из генов, сильно ингибируемых SPR в обоих типах клеток, также были сильно SMзависимыми. Чтобы исследовать общую корреляцию между эффектами удаления SM и SPR, был проведен неконтролируемый кластерный анализ данных дифференциального выражения. Хотя эффект SPR не был одинаковым в каждой клеточной линии, была высокая степень согласованности между эффектом SPR и эффектом инактивации SM (Fig. S8), с коэффициентом корреляции Пирсона 0,68 и 0,63 между эффект нокаута SM и лечения SPR в P3HR1 и клетки AGS соответственно. Следовательно, эти данные указывают на то, что основной аспект противовирусного эффекта SPR опосредован его ингибирующим действием на SM и его специфическим для мишеней способом действия. S E Рис. 4. SPR ингибирует продукцию вируса на литической репликативной стадии после репликации ДНК. (А) Противовирусный эффект SPR не связан с ингибированием репликации вирусной ДНК. EBV-положительные клетки желудочной карциномы AGS трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим белок ZTA-трансактиватор EBV, под контролем индуцируемого доксициклином промотора для генерации клеточной линии, в которой EBV устойчиво реплицируется при обработке доксициклином (AGSiZ). Клеточную линию AGSiZ либо ложно обрабатывали (-), либо обрабатывали (+) доксициклином для индукции литической репликации ДНК (инд.), А также обрабатывали SPR или EPR в указанных концентрациях. Количество копий ДНК измеряли с помощью КПЦР клеточных гранул через 70 ч после индукции. RQ - относительное количество внутриклеточной вирусной ДНК. (B) SPR, но не EPR специфически ингибирует производство инфекционных вирусов. Серийные разведения вирусосодержащих супернатантов были использованы для заражения клеток 293, и количество GFPпозитивных клеток, представляющих инфекционные вирусные частицы, было измерено с помощью проточной цитометрии. (C) SPR не влияет на экспрессию белков IE или E EBV. Лизаты белковых клеток из клеток, обработанных SPR (S) или EPR (E), подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против SM, EA-D, RTA, ZTA или актина через 24 и 48 ч после индукции репликации. (D) SPR, но не EPR ингибирует продукцию внеклеточного EBV. Внеклеточную ДНК EBV измеряли с помощью супернатантов клеток КПЦР, собранных через 5 дней после обработки SPR (S) или EPR (E). RQ, относительное количество ДНК. Verma et al. Активность SPR была структурно-зависимой со специфическими заменами в 7 положении SPR, изменяющими активность против SM и против EBV. В соответствии с его анти-SM активностью, эффект SPR на экспрессию гена EBV был в высокой степени согласован с эффектом мутационного удаления SM из генома EBV. Наиболее сильно SM-зависимый и SPR-чувствительные гены являются поздними литическими генами, и большинство из них кодируют либо тегментные белки, либо гликопротеины (4, 5, 9). Кроме того, два гена, которые важны для инкапсидирования перед включением тегума и оболочкой вириона, основной VCA и продукт минорного капсидного гена (BDLF1), также сильно зависят от SM (9). Таким образом, ингибирование экспрессии VCA представляет собой наиболее приблизительный блок в продукции EBV из-за SPR, и SPR полностью предотвращает образование капсида, несмотря на адекватную репликацию ДНК EBV. •S (5000X) +S (5000X) Рис. 5. SPR ингибирует образование капсида EBV. Клетки AGSiZ индуцировали, чтобы позволить репликацию EBV с доксициклином, и обрабатывали 10 мкМ SPR (+ S) или одним носителем (-S). Клетки собирали, фиксировали при 4-й постиндукции и анализировали с помощью электронной микроскопии. Вирусные частицы были обнаружены в клетках, обработанных носителем (-S), как показано в увеличениях 1500х и 5000х. В образцах, обработанных SPR (+ S), вирусные частицы не обнаруживались. Обсуждение В этом исследовании мы описываем способность SPR ингибировать функцию белка EBV SM, уменьшая накопление РНК-мишеней SM и тем самым предотвращая образование инфекционных частиц EBV. Это свойство SPR не основано на его активности блокирования минералокортикоидных рецепторов, так как конгенеры с активностью антиальдостерона не обладали анти-SM или противовирусной активностью. Механизм(ы) действия белка SM остается не полностью охарактеризованным. SM связывает РНК EBV и влияет на стабильность РНК (15-19). Хотя он преимущественно усиливает накопление некоторых мРНК EBV, действие СМ, вероятно, зависит от внутренних характеристик неэффективно экспрессируемых РНК, таких как стабильность или ядерная экспортность (8, 9). Кроме того, не исключена возможность того, что SM оказывает транскрипционные эффекты на один или несколько генов-мишеней. ORF57, KSHV гомолог SM, также может действовать как транскрипционно, так и посттранскрипционно (6, 20). SPR может напрямую взаимодействовать с SM или сотовыми партнерами SM для блокирования функции. Даже если SPR напрямую не влияет на способность SM взаимодействовать с РНК-мишенями, он все же может препятствовать образованию РНК-связывающих белковых комплексов, рекрутируемых SM. SPR также может действовать опосредованно, ингибируя экспрессию клеточных белков, необходимых для функционирования SM на уровне транскрипции. Было показано, что SPR оказывает ингибирующее действие на некоторые факторы транскрипции в мононуклеарных клетках независимо от антагонизма к минералокортикоидным рецепторам (21). Поэтому установление точного механизма (механизмов), с помощью которого SPR ингибирует функцию SM, потребует дальнейшего изучения механизма действия SM. Рис. 6. SPR ингибирует экспрессию капсидного белка EBV. Клетки AGSiZ либо подвергались ложной обработке (-D), обрабатывались доксициклином (+ D) для индукции репликации, либо индуцировались, а также обрабатывались SPR (+ D + S) в течение 48 часов. Клетки фиксировали и окрашивали антителами BMRF1, SM, ZTA и VCA и анализировали иммунофлуоресцентной микроскопией. Показаны окрашенные DAPI ядра (синие), GFP-позитивные EBV-инфицированные клетки (зеленый) и специфическая экспрессия антигена (красный). (A) Представлены репрезентативные изображения для экспрессии каждого белка. (B) Процент клеток, положительных для каждого белка. 3614 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1523686113 Verma et al. Ratio of SMKO/Z +SM to SMKO/Z -SM Ratio of AGS -S to AGS +S co Ratio of P3HR1 -S to P3HR1 +S Рис. 7. Сравнение влияния обработки SPR на нокаут SM на экспрессию гена EBV в эпителиальных и лимфоидных клетках. (A) SMKO EBV-инфицированные клетки 293 трансфицировали ZTA, чтобы вызвать репликацию, или трансфицировали обеими ZTA и SM, чтобы спасти SM-зависимую экспрессию генов. РНК готовили из клеток через 48 ч после индукции репликации. Высокопроизводительное секвенирование РНК было выполнено для определения влияния SPR или SM-нокаутов на литический транскриптом EBV. Дифференциальная экспрессия SM-зависимых генов показана как отношение экспрессии РНК в SMKOEBV, трансфицированных Z + SM, по сравнению с SMKO Zalone. Гены, экспрессия которых наиболее сильно зависит от SM, отмечены синим цветом. (B) Эпителиальные клетки AGSiZ обрабатывали доксициклином для индукции репликации. Дифференциальная экспрессия SPR-чувствительных генов во время репликации EBV показана как отношение РНК в обработанных носителем (-S) к соотношению в клетках, обработанных SPR (+ S). Поэтому большинство SPR-чувствительных генов имеют самые высокие соотношения РНК. (C) Сравнение клеток, обработанных SPR, и необработанных EBV-инфицированных лимфом P3HR1-ZHT проводили, как в B, за исключением того, что клетки обрабатывали тамоксифеном для индукции литической репликации. +, значения, превышающие предел оси y; *, гены в области, которые были удалены в геномах B95.8 и P3HR1. Замены в C-7 SPR, по-видимому, имеют решающее значение для противовирусной активности. Тот факт, что CAN и SPR сохраняют активность, но TMS не предполагает, что молекулы могут действовать как электрофильная ловушка. Тиоацетат в С-7 в SPR может служить донором ацила или может быть элиминирован в Y, S-ненасыщенную форму, продуцируя CAN in vivo. Таким образом, целевой нуклеофил будет реагировать с образованием ацилированного варианта или подвергаться добавлению Михаэля с образованием CANалкилированного аддукта. Тиометиловый эфир в TMS не может переносить ацильную группу, и элиминирование менее вероятно на основе pKa метантиолата. Любое обоснование может объяснить отсутствие активности с TMS. Хотя SPR использовался клинически в течение десятилетий как мочегонное средство и для лечения сердечной недостаточности, гиперальдостеронизма и отечных состояний, некоторые побочные эффекты ограничивают его использование (22, 23). К ним относятся влияние на репродуктивную и другие метаболические функции. Следует отметить, что IC50 SPR (~ 2,1 мкМ) для блокирования продукции инфекционного EBV ниже, чем у ацикловира (3,4 мкМ) в том же анализе (рис. S1). Хотя устойчивые уровни SPR, достигнутые in vivo, вероятно, будут ниже концентраций, используемых in vitro в нашем исследовании (24), метаболит CAN имеет гораздо более длительный период полужизни in vivo (24) и может усиливать активность исходного соединения. Тем не менее, поскольку активность SPR минерало-кортикоидного антагониста, повидимому, не связана с его активностью против EBV, SPR обеспечивает идеальное соединение свинца для разработки антигерпесвирусных препаратов без известных побочных эффектов SPR. Устойчивость к доступным в настоящее время антигерпесвирусным препаратам, таким как ацикловир и ганцикловир, является новой проблемой в лечении пациентов с ослабленным иммунитетом (25). Перекрестная резистентность к другим агентам, активным против вирусной 3614 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1523686113 ДНК-полимеразы, таким как фоскарнет и цидофовир, нередко осложняет терапию (25). Кроме того, эти агенты имеют значительную миелосупрессивную или нефротоксическую токсичность. Таким образом, лекарственные средства, направленные против других вирусных белков, таких как СМ, могут значительно расширить противовирусный вооружение. Использование комбинированной терапии с агентами, направленными против различных этапов жизненного цикла вируса, также может ограничить возникновение лекарственной устойчивости. Каждый вирус герпеса человека экспрессирует гомолог SM, который необходим для производства вируса (3, 26-28). Хотя они обычно не дополняют друг друга при спасении вирусной репликации (3, 26, 29), они структурно и функционально похожи. Таким образом, SPR и его производные могут быть активными против других вирусов герпеса человека. Кроме того, скрининговый анализ, который мы использовали для специфической идентификации ингибиторов СМ, может быть легко адаптирован для скрининга агентов, активных против гомологов СМ от других герпесвирусов (8). Таким образом, мы показали, что SPR специфически действует, ингибируя функцию белка EBV SM, которая необходима для экспрессии нескольких поздних литических генов EBV и инфекционной продукции EBV. Эффект SPR аналогичен эффекту выбивания функции SM, которая является критической для экспрессии VCA EBV и, следовательно, приводит к неспособности вируса образовывать вирусные капсиды. В дополнение к предотвращению образования капсида SPR ингибирует экспрессию других SM-зависимых генов EBV, важных для инфективности, включая gp350, тем самым ингибируя EBV на нескольких стадиях в производстве вирионов. SPR может использоваться в качестве матрицы для разработки антигерпесвирусных препаратов, которые действуют на стадиях репликации герпесвируса, отличных от всех других доступных в настоящее время препаратов. Verma et al. Материалы и методы Клеточный материал. Клетки HEK293, стабильно несущие слитый ген ORF59-GFP, который также индуцибельно экспрессирует SM-зависимую GFP, сохраняли, как описано ранее (8). P3HR1-ZHT представляет собой EBV-позитивную клеточную линию лимфомы, которая содержит ген EBV BZLF1, слитый с гормонсвязывающим доменом рецептора 4-гидрокситамоксифена (4HT), который обеспечивает надежную индукцию репликации EBV при обработке 4HT (30). Клеточная линия карциномы желудка AGS была инфицирована экспрессирующим GFP EBV Akata BX1 (31). Клетки AGS Akata BX1 стабильно экспрессируют трансактиваторный белок EBV BZLF1 под контролем индуцируемого доксициклином промотора (AGSiZ). См. Вспомогательную информацию для получения подробной информации о конструкции клеточной линии AGSiZ с использованием лентивирусной трансдукции (32). Индукционные реагенты и скрининг противовирусных соединений. Литическую репликацию EBV в клетках AGS Akata BX1, AGSiZ и P3HR1-ZHT проводили путем добавления 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (TPA), доксициклина или 4HT соответственно. Репортерные клетки HEK293, несущие ORF59-GFP и индуцибельный SM, индуцировали для экспрессии SM с 1 мкг / мл доксициклина. SPR (Sigma, S3378), CAN (TOCRIS Bio¬science, 3281), TMS (TRC Toronto, T353500) и EPR (Sigma, E6657) использовались в различных концентрациях от 0 до 20 мкМ, как указано. Скрининг проводился с использованием ORF59-GFP-iSM-клеток, который был разработан и подтвержден для высокопроизводительного скрининга ингибиторов SM, как описано ранее (8). ДНК EBV, высвобождаемая в супернатанте, измерялась с помощью КПЦР. Для измерения репликации ДНК клеточные осадки собирали через 70 ч после обработки, как описано выше, и количество копий ДНК EBV измеряли с помощью КПЦР, как описано ранее (5, 14). Электронная микроскопия. Клетки AGSiZ обрабатывали доксициклином для индукции литической репликации, а также обрабатывали SPR. Клетки собирали через 4 дня после обработки и исследовали с помощью электронной микроскопии. По меньшей мере 150 клеток были исследованы из трех разных препаратов. РНК-секвенирование и анализ данных. Библиотеки кДНК были получены из поли (A) РНК и секвенированы на приборе HiSeq2000 с 50 циклами считывания gleend. Последовательные считывания, полученные из клеток AGS и P3HR1, инфицированных EBV, были сопоставлены с геномами Akata EBV (инвентарный номер GenBank KC207813.1) и геномами P3HR1 (инвентарный номер GenBank DQ279927.1). Дифференциальную экспрессию генов измеряли с использованием приложения USeq Defined Region Differential Seq, как описано ранее (14). Тепловые карты, показывающие кластеризацию SM-зависимых и чувствительных к SPR генов и трансформированные log2 изменения складок, были кластеризованы с использованием pheatmap пакета R (cran.rproject.org/web/packages/pheatmap/index.html). Метод расстояний был «евклидовым», а метод кластеризации - «полным». Количественная оценка производства инфекционных вирионов и репликации вирусной ДНК. Литическая репликация EBV в клетках AGS и AGSiZ была индуцирована обработкой TPA или доксициклином, соответственно, и также обработана либо контролем DMSO, либо SPR, CAN, TMS или EPR в течение 5 дней. Отфильтрованные клеточные супернатанты использовали для инфицирования клеток 293T, а количество GFP-позитивных клеток 293T, представляющих инфекционные вирусные частицы, определяли количественно с помощью проточной цитометрии, как описано ранее (14, 33). Для клеток P3HR1ZHT, супернатанты клеток собирали через 5 дней после индукции репликации, и БЛАГОДАРНОСТЬ. Мы благодарим Линду Николову из основного медицинского факультета медицинского факультета Университета Юты, Тима Мосбрюгера из Общего ресурса биоинформатики Института рака Хантсмана и Райана Лупера из химического факультета за их помощь в электронной микроскопии, анализе данных RNAseq и структурном анализе. соответственно. Эта работа была профинансирована грантом Государственной службы здравоохранения R01 81133 (toS.S.) от Национального института рака. 1. Longnecker RM, Kieff E, Cohen JI (2013) Epstein-Barr virus. Fields Virology, eds Knipe DM, 19. Hiriart E, et al. (2003) A novel nuclear export signal and a REF interaction domain both promote Howley PM (Wolters Kluwer/Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia), 6th Ed, Vol 2, pp 18981959. 20. Malik P, Blackbourn DJ, Cheng MF, Hayward GS, Clements JB (2004) Functional cooperation 2. 3. 4. Swaminathan S, Kenney S (2009) The Epstein-Barr virus lytic lifecycle. DNA Tumor Viruses, eds Damania B, Pipas J (Springer, New York). Gruffat H, et al. (2002) Epstein-Barr virus mRNA export factor EB2 is essential for production of infectious virus. J Virol 76(19):9635-9644. Batisse J, Manet E, Middeldorp J, Sergeant A, Gruffat H (2005) Epstein-Barr virus mRNA export factor EB2 is essential for intranuclear capsid assembly and production of gp350. J Virol 79(22):14102-14111. 5. Han Z, et al. (2007) Multiple roles of Epstein-Barr virus SM protein in lytic replication. J Virol 6. 81(8):4058- 4069. Palmeri D, Spadavecchia S, Carroll KD, Lukac DM (2007) Promoter- and cell-specific transcriptional transactivation by the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF57/ Mta protein. J Virol 81(24):13299-13314. 7. 8. 9. Coen DM, Richman DD (2013) Antiviral agents. Fields Virology, eds Knipe DM, Howley PM (Wolters Kluwer/Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia), 6th Ed, Vol 1, pp 338-373. Verma D, Kim EA, Swaminathan S (2013) Cell-based screening assay for antiviral compounds targeting the ability of herpesvirus posttranscriptional regulatory proteins to stabilize viral mRNAs. J Virol 87(19):10742-10751. Thompson J, Verma D, Li D, Mosbruger T, Swaminathan S (2016) Identification and characterization of the physiological gene targets of the essential lytic replicative EBV SM protein. J Virol 90(3):1206-1221. 10. Kocisko DA, et al. (2003) New inhibitors of scrapie-associated prion protein formation in a library of 2000 drugs and natural products. J Virol 77(19):10288-10294. 11. Szasz G, Budvari-Barany Z (1990) Pharmaceutical Chemistry of Antihypertensive Agents (CRC Press, Boca Raton, FL), p 288. 12. Kolkhof P, Borden SA (2012) Molecular pharmacology of the mineralocorticoid receptor: Prospects for novel therapeutics. Mol Cell Endocrinol 350(2):310-317. 13. Wang HB, et al. (2015) Neuropilin 1 is an entry factor that promotes EBV infection of nasopharyngeal epithelial cells. Nat Commun 6:6240. 14. Li DJ, Verma D, Mosbruger T, Swaminathan S (2014) CTCF and Rad21 act as host cell restriction factors for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) lytic replication by modulating viral gene transcription. PLoS Pathog 10(1):e1003880. 15. Ruvolo V, Wang E, Boyle S, Swaminathan S (1998) The Epstein-Barr virus nuclear protein SM is both a post-transcriptional inhibitor and activator of gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 95(15):8852-8857. 16. Ruvolo V, Gupta AK, Swaminathan S (2001) Epstein-Barr virus SM protein interacts with mRNA in vivo and mediates a gene-specific increase in cytoplasmic mRNA. J Virol 75(13):6033-6041. 17. Han Z, Verma D, Hilscher C, Dittmer DP, Swaminathan S (2009) General and targetspecific RNA binding properties of Epstein-Barr virus SM posttranscriptional regulatory protein. J Virol 83(22):11635-11644. 18. Hiriart E, et al. (2003) A region of the Epstein-Barr virus (EBV) mRNA export factor EB2 containing an arginine-rich motif mediates direct binding to RNA. J Biol Chem 278(39):37790-37798. 3614 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1523686113 mRNA export by the Epstein-Barr virus EB2 protein. J Biol Chem 278(1): 335-342. between the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF57 and ORF50 regulatory proteins. J Gen Virol 85(Pt 8):2155-2166. 21. S0nder SU, Mikkelsen M, Rieneck K, Hedegaard CJ, Bendtzen K (2006) Effects of spironolactone on human blood mononuclear cells: Mineralocorticoid receptor independent effects on gene expression and late apoptosis induction. Br J Pharmacol 148(1):46-53. 22. Lainscak M, et al. (2015) Safety profile of mineralocorticoid receptor antagonists: Spironolactone and eplerenone. Int J Cardiol 200:25-29. 23. Meng Q, et al. (2010) The Epstein-Barr virus (EBV)-encoded protein kinase, EBV-PK, but not the thymidine kinase (EBV-TK), is required for ganciclovir and acyclovir inhibition of lytic viral production. J Virol 84(9):4534-4542. 24. Gardiner P, et al. (1989) Spironolactone metabolism: Steady-state serum levels of the sulfurcontaining metabolites. J Clin Pharmacol 29(4):342-347. 25. Hanson KE, Swaminathan S (2015) Cytomegalovirus antiviral drug resistance: Future prospects for prevention, detection and management. Future Microbiol 10(10): 1545- 1548. 26. Han Z, Swaminathan S (2006) Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic gene ORF57 is essential for infectious virion production. J Virol 80(11):5251-5260. 27. Toth Z, Stamminger T (2008) The human cytomegalovirus regulatory protein UL69 and its effect on mRNA export. Front Biosci 13:2939-2949. 28. Sandri-Goldin RM (2011)ThemanyrolesofthehighlyinteractiveHSVproteinICP27,a key regulator of infection. Future Microbiol 6(11):1261-1277. 29. Boyer JL, Swaminathan S, Silverstein SJ (2002) The Epstein-Barr virus SM protein is functionally similar to ICP27 from herpes simplex virus in viral infections. J Virol 76(18):9420-9433. 30. Verma D, Ling C, Johannsen E, Nagaraja T, Swaminathan S (2009) Negative autoregulation of Epstein-Barr virus (EBV) replicative gene expression by EBV SM protein. J Virol 83(1 6): 8041 8050. 31. Molesworth SJ, Lake CM, Borza CM, Turk SM, Hutt-Fletcher LM (2000) Epstein-Barr virus gH is essential for penetration of B cells but also plays a role in attachment of virus to epithelial cells. J Virol 74(14):6324-6332. 32. Linnstaedt SD, Gottwein E, Skalsky RL, Luftig MA, Cullen BR (2010) Virally induced cellular microRNA miR-155 plays a key role in B-cell immortalization by Epstein-Barr virus. J Virol 84(22):11670-11678. 33. Li DJ, Verma D, Swaminathan S (2012) Binding of cellular export factor REF/Aly by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) ORF57 protein is not required for efficient KSHV lytic replication. J Virol 86(18):9866-9874. 34. Reynolds ES (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol 17:208-212. 35. Ruvolo V, et al. (2004) Functional analysis of Epstein-Barr virus SM protein: Identification of amino acids essential for structure, transactivation, splicing inhibition, and virion production. J Virol 78(1):340-352. Verma et al.
