МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (ФГБОУ ВО КНИТУ) ___________________ИППБТ, ФПТ__________________ (название института, факультета) Кафедра ____________Биотехнологии__________________ Реферат По дисциплине: «Научно-практические основы биоинженерии» Тема: Системы контроля и управления процессом ферментации. Выполнила студентка гр. 619-М11 (Сидорова Е.И.) Проверил Доцент кафедры ПБТ, к.т.н (Агзамов Р.З.) Казань 2020 г. Способы организации процессов ферментации Периодические Непрерывные Многоциклические Отъёмно-доливные Периодические с подпиткой субстрата Полунепрерывные с подпиткой субстрата Требования к ферментационному процессу в зависимости от физиологического значения целевых продуктов для продуцента – первичные метаболиты, вторичные метаболиты, высокомолекулярные вещества В общих словах микроорганизмы должны: обладать высокой скоростью роста (размножения); расти на дешевых питательных средах; быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать высокой конкурентоспособностью; не обладать патогенностью по отношению к человеку, домашним животным и растениям Требования к ферментационному процессу при использовании рекомбинантных штаммов, образующих чужеродные для биообъекта целевые продукты Неотъемлемым компонентом в процессе создания наиболее ценных и активных продуцентов, т. е, при подборе объектов в биотехнологии, является их селекция. А генеральным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента. В развитии микробных технологий в свое время сыграли (да и сейчас еще продолжают играть!) очень важную роль методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных вариантов,характеризующихся нужными полезными признаками. Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза. Независимо от типа биореактора процесс ферментации строго контролируют по: концентрации растворенного кислорода; pH; температуре; интенсивности перемешивания биомассы. Существенные изменения любого из этих параметров резко снижают скорость роста клеток и стабильность белкового продукта. Для оптимального роста Е. coli и других микроорганизмов, используемые при экспрессии рекомбинантных белков, нужна хорошо аэрируемая культуральная среда. Кислород плохо растворим в воде (0,0084 г/л при 25 °С), поэтому он должен подаваться в среду непрерывно. В процессе ферментации специальный датчик контролирует содержание растворенного кислорода в среде, равномерность его распределения по всему объему, тщательность перемешивания культуры, что, вместе взятое, обеспечивает эффективность диспергирования пузырьков. Пространство, где взаимодействуют микроорганизмы и питательная среда, принято называть микросредой. Если микросреда данной культуры одинакова в каждой точке, такую культуру считают гомогенной. Гомогенность достигается эффективным перемешиванием всех компонентов среды и микроорганизмов по всему рабочему объему. Гомогенность невозможна без аэрации, которая осуществляется барботерами различных конструкций, например, в виде кольцевого желоба с отверстиями, перфорированной трубы или форсунки. Оптимальный рост большинства микроорганизмов идет при pH от 5,5 до 8,5; однако клеточные метаболиты, выделяющиеся в культуральную среду, могут изменять рН. Изменение рН среды заметно сказывается на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.п., что значительно влияет на выход конечного продукта. Тщательно контролируя pH, при необходимости в ферментер добавляют кислоту или основание, хорошо перемешанные с питательной средой и равномерно распределенные по всему объему. Успех ферментации зависит от температуры. Если она ниже оптимальной (37 °С), рост микроорганизмов замедлен, интенсивность их метаболизма снижена. При повышении температуры до 38 °С, возможна преждевременная индукция, синтеза белка или индукция белков теплового шока, что активирует клеточные протеиназы и снижает выход белкового продукта. Для отвода тепла используют охлаждающую рубашку. Тщательное перемешивание культуральной среды — один из наиболее распространенных процессов в биотехнологии. Перемешивание необходимо для: равномерной доставки питательных веществ к клеткам; предотвращения накопления токсических побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом участке биореактора. Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую культуру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиологическое тепло, выделяемое микроорганизмами в процессе биосинтеза, способствуют гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов масса- и теплообмена. Конструкция мешалки играет важную роль в работе биореактора. Мешалки делят на быстро- и тихоходные. Быстроходные аппараты с большой и Средней циркуляционной производительностью используют в препаратах ш отражательными перегородками; (отбойниками). Отсутствие перегородок приводит к завихрению жидкости, снижению скорости у стенки аппарата и образованию воронки. Мешалки быстроходные – турбинные, пропеллерные, лопастные, дисковые. Тихоходные – якорные, рамные, ленточные, вибрационные, скребковые; последние для перемешивания средне- и высоковязких сред. Для глубинного культивирования чаще всего используют турбинную мешалку с прямыми лопастями, расположенными радиально. Перемешивание культуральной среды влияет на другие параметры: скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду, из среды – в клетки; эффективность теплопередачи; точность измерения концентрации метаболитов культуральной жидкости; эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных сред и т.д.). Следует соблюдать баланс между необходимостью тщательного перемешивания среды и целостностью клеток, так как при чрезмерном перемешивании в среде могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток. Непрерывный мониторинг всех параметров, дает возможность изменять условия в ходе ферментации. Как правило, оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора. Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании. Апоптоз и некроз клеток Под определением биомасса подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твёрдой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля биомассы — подсчёт клеток е определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа. Количество клеток в биомассе можно контролировать и по объёму осаждения в центрифужных стаканчиках. Также используют косвенные методы определения биомассы по интенсивности дыхания (изменению концентрации СО2 инфракрасным газоанализатором) или содержанию белка (самый чувствительный метод – бромсульфалеиновая проба, основанная на связывании бромсульфалеина основными группами белка). Количество микроорганизмов и клеток можно определять физико-химическими методами: кондуктометрически (по удельной электропроводимости), спектрофотометрически, колориметрически, нефелометрически. Таблица 1. Основные факторы среды, биосинтетическую активность продуцентов. определяющие рост и Возможности современных ферментеров для контроля и управления факторами среды. Биотехнологические анализаторы Ферментер (биореактор) занимает ключевое место в аппаратурном оформлении биотехнологического процесса. Он представляет собой аппарат для глубинного выращивания (культивирования) микроорганизмов (или культур клеток) в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной температуры. Современные ферментационные аппараты позволяют контролировать и управлять процессом культивирования клеток и добиваться высоких результатов в получении целевого продукта. Однако даже самый современный ферментер не позволит технологу контролировать и управлять всеми факторами среды (см. табл. 1). Во многих случаях технолог или оператор ферментационного отделения вынужден использовать рутинные методики для определения, например, концентрации метаболитов или питательных веществ. В качестве альтернативы рутинным методикам в последнее время широкое распространение получили биотехнологические анализаторы. Их работа основана на использовании биосенсоров, время выполнения анализа составляет 1-2 мин. Данные о биотехнологическом процессе, полученные с помощью ферментера и биотехнологического анализатора, являются мощным инструментом для управления ферментацией в непрерывном и периодических режимах. В таблице 2 обобщены аппаратурные методы управления факторами среды при использовании ферментера в комплекте с анализатором. При этом в таблице использованы данные о характеристиках анализатора Bioprfile FLEX как самого современного и мощного биотехнологического анализатора на настоящий момент, который способен заменить несколько отдельных приборов или рутинных методик. Bioprofile FLEX позволяет оператору в экспресс-режиме измерять концентрации питательных веществ, метаболитов, осмотическое давление, а также измерять физиологический статус продуцента. Кроме того анализатор может быть интегрирован в контроллер ферментера, а управление подпиткой автоматизировано. В многочисленных опубликованных статьях описано успешное использование анализаторов Bioprofile или аналогов для решения задач составления оптимальных сред, оптимизации подпитки, увеличения выхода целевого продукта и др. Поэтому использование биотехнологических анализаторов на производствах и в лабораториях является стандартным и доказано эффективным. Таблица 2. Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов, аппаратурные способы контроля и управления ими.