belkovaya-korona-nanochastits-sulfida-serebra-poluchenn-h-v-prisutstvii-gramotritsateln-h-i-grampolojiteln-h-bakteriy
реклама
Экспериментальные статьи © Коллектив авторов, 2017 УДК 579.84/.86:579.22]:546.57’221.083.1 Воейкова Т.А.1, Журавлева О.А.1, 2, Булушова Н.В.1, Вейко В.П.3, Исмагулова Т.Т.4, Лупанова Т.Н.5, Шайтан К.В.4, 6, Дебабов В.Г.1 «БЕЛКОВАЯ КОРОНА» НАНОЧАСТИЦ СУЛЬФИДА СЕРЕБРА, ПОЛУЧЕННЫХ В ПРИСУТСТВИИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ И ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 1 ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», 117545, Москва, Россия; 2 Аграрно-технологический институт РУДН, 117198, Москва, Россия; 3 ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Россия; 4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Россия; 5 Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, Россия; 6 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова PАН, 119991, Москва, Россия В представленной работе впервые проведен сравнительный анализ количества и состава белков, адсорбированных на поверхности наночастиц сульфида серебра (NpAg2S), полученных методом биосинтеза с помощью бактерий: грамотрицательных — Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli К12, и грамположительных — Bacillus subtilis 168. Биосинтез NpAg2S проводили в 1 мM водном растворе солей AgNO3 и Na2S2O3×5H2O в присутствии клеток бактерий в аэробных условиях. Анализ NpAg2S методом просвечивающей электронной микроскопии показал, что частицы имеют сферическую форму и средний диаметр 8 ± 2 нм для S. oneidensis MR-1, E. coli К12 и 10 ± 3 нм для B. subtilis 168. Установлено, что наибольшее количество белка сорбируется на NpAg2S при использовании штамма B. subtilis 168, наименьшее — E. coli. Методом МАЛДИ/ТОФ/ТОФ определены основные белки, адсорбированные на NpAg2S, и выявлена гетерогенность белкового покрытия. Наименьшая гетерогенность белков на поверхности наночастиц наблюдается в случае использования B. subtilis (доминирует один белок — флагеллин); наибольшая гетерогенность белков выявлена на наночастицах, полученных с помощью S. oneidensis MR-1. Показано, что все белки, покрывающие поверхность NpAg2S, являются белками внешней оболочки или цитоплазматической мембраны исследованных бактерий. Состав белкового покрытия наночастиц индивидуален и постоянен для каждого из применяемых штаммов бактерий. Показано, что значения ζ-потенциала и эффективного диаметра наночастиц различаются в зависимости от «белковой короны» штамма, использованного для получения NpAg2S. Характеристика «белковой короны» биологически полученных наночастиц является важным и необходимым условием их практического применения. К л ю ч е в ы е с л о в а : наночастицы сульфида серебра, биосинтез, «белковая корона», Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli К12, Bacillus subtilis 168. Для цитирования: Воейкова Т.А., Журавлева О.А., Булушова Н.В., Вейко В.П., Исмагулова Т.Т., Лупанова Т.Н., Шайтан К.В., Дебабов В.Г. «Белковая корона» наночастиц сульфида серебра, полученных в присутствии грамотрицательных и грамположительных бактерий. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35(4): 151–156. DOI 10.18821/0208-0613-201735-4-151–156. Получение наночастиц халькогенидов металлов и наиболее доступных среди них сульфидов представляет значительный интерес, поскольку эти полупроводниковые материалы обладают уникальными оптическими и электрическими свойствами и используются при создании солнечных батарей, биосенсоров, отпико-электронных устройств, аккумуляторов [1, 2]. Наночастицы сульфида серебра (NpAg2S), биосинтезу которых посвящена настоящая работа, имеют большой потенциал применения в различных областях техники и медицины. NpAg2S используется в ИК-детекторах, топливных элементах, устройствах с оперативной памятью, датчиках H2S, фотопроводниках, фотогальванических элементах, в фотографии в качестве фотосенсибилизатора. Активно исследуется возможность применения NpAg2S в медицине для прижизненной визуализации органов и тканей [3—5]. Малый диаметр этих полупроводниковых наночастиц позволяет использовать их в качестве квантовых точек (КТ) [6]. Показано, что включение низкодиапазонных КТ Ag2S в солнечный элемент TiO2/CdS улучшает эффективность фотопревращения системы, оказывая синергическое действие на усиление способности к улавливанию света [7]. Наночастицы Ag2S могут выступать в роли суперэффективного катализатора, ускоряя реакцию восстановления 4-нитрофенола на нанокомпозитах графенового оксида более чем на порядок [8]. Наночастицы сульфидов металлов получают в основном химическими методами. Химические методы эффективны, однако они высокозатратны, экологически опасны, кроме того, химически синтезированные наночастицы менее биосовместимы, что существенно ограничивает их применение в биологических и медицинских системах [9, 10]. Биологический метод получения наночастиц имеет ряд преимуществ: не требует больших затрат энергии, дорогих и токсичных химических веществ, экологически безопасен. Поэтому простые и масштабируемые методы синтеза наночастиц с помощью биологических систем привлекают все большее внимание [11—15]. Сравнение преимуществ и недостатков химических и биологических методов рассмотрено в работе [16]. Свойства наночастиц, полученных в биологических системах, во многом определяются макромолекулами, главным образом, белками, адсорбированными на их поверхности и называемыми «белковой короной». Стабильность наночастиц в водных суспензиях, т.е. отсутствие агрегации и последующей седиментации, связывают именно с наличием белков на их поверхности. Доводами в пользу такого предположения является обнаружение методом ИК-спектроскопии белков/пептидов на поверхности наночастиц, а также тот факт, что удаление полимерных молекул с помощью детергентов приводит к агрегации и осаждению наночастиц [17, 18]. В литературе очень редко анализируется качественный и количественный состав «белковой короны» наночастиц и тем более, сравнение состава «белковых корон» наночастиц, полученных в разных биологических системах. Большинство работ связано с изучением «белковой короны» наночастиц в плазме крови. Так, проведен анализ взаимодействия наночастиц золота и серебра, несущих различные заряды на поверхности, с плазмой крови человека [19]. Показано, что из 300 белков, обнаруженных в «белковой короне», примерно 30% являются общими и представлены в каждом наноматериале. Среди них обнаружены 20 наиболее часто встречающихся, которые составляют около 80% от общего количества белков, связывающихся с наночастицами. Таким образом, существует специфический паттерн белков плазмы крови, связывающийся как с серебряными, так и с золотыми наночастицами. Установлено, что заряд поверхности и химический состав наночастиц, так же, как и изоэлектрическая точка белков плазмы, играют существенную роль в определении состава «белковой короны». Эти исследования имеют большое значение для оценки возможности использования наночастиц в медицине и биотехнологии. В случае внеклеточного синтеза наночастиц с использованием микроорганизмов главная роль в формировании «белковой короны», по-видимому, принадлежит белкам поверхности клеток, или находящихся в зоне, прилегающей к клеточной стенке и содержащей большой набор биополимеров. Эта область названа «внеклеточная полимерная субстанция» (EPS — extracellular polymeric substances). Было проведено исследование Для корреспонденции: Воейкова Татьяна Александровна, кандидат биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории белковой инженерии, E-mail: [email protected] 151 Молекулярная генетика, микробиология и вирусология №4, 2017 внеклеточных биополимеров у штамма Shewanella sp. HRCR-1 и установлено наличие в EPS белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот, липидов и жирных кислот. Анализ белковой фракции EPS позволил идентифицировать 58 внеклеточных белков и белков внешней мембраны [20]. Таким образом, EPS и внешняя клеточная мембрана могут способствовать ассоциации наночастиц с белками, приводя к стабилизации наночастиц в водных суспензиях. В литературе описано получение наночастиц Ag2S в виде стабильных гидрозолей с помощью бактерий рода Shewanella [17, 21]. В работе А.К. Suresh и соавт. [17] показано наличие белков (пептидов) на поверхности наночастиц методом ИКспектроскопии, но не было проведено оценки количества и состава белков, адсорбированных на этих структурах. Целью данной работы является сравнительный анализ количества и состава белков, адсорбированных на поверхности NpAg2S, полученных с использованием бактерий различных таксономических групп — грамотрицательных (S. oneidensis MR-1, E. сoli К12) и грамположительных (B. subtilis 168) в водном растворе солей азотнокислого серебра и тиосульфата натрия. Определение физико-химических характеристик образующихся наночастиц. Материа лы и методы высушивали. Элементный состав наночастиц был подтвержден с помощью ПЭМ в комбинации с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (СПЭМ). Сканирование образца группы частицы производили электронным лучом диаметром порядка 10 нм. Измерения проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEM2100 c катодом из гексаборида лантана (LaB6), JEOl, Япония, оснащенном рентгеновским детектором X-Max, управляемым программным пакетом INCA («Oxford Instruments», Великобритания) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Регистрацию энергодисперсионных рентгеновских спектров проводили в диапазоне энергий рентгеновского излучения от 0 до 10 кэВ. ПЭМ высокого разрешения выделенных наночастиц проводили на микроскопе JEM-2100F, («JEOL», Япония), оснащенном корректором сферических аберраций. Анализ размеров частиц проводили с помощью программного обеспечения для обработки изображений Image J, измеряя наименьший и наибольший линейный размер частиц на полученных ПЭМ-изображениях. Для каждого образца измеряли порядка 100 частиц. Гистограммы распределения частиц по размеру строили в программе Origin 8.5. -ζ-потенциал и эффективный диаметр NpAg2S определяли с помощью анализатора ζ-потенциала, основанного на методе динамического светорассеяния с анализом фаз — ZetaPALS («Brookhaven Instruments Corporation», США). Электрофорез белков в денатурирующих условиях. ПААГ-электрофорез в присутствии додецилсульфат-натрия («Sigma», США) проводили в 12,5% гелях по методу Лэмли [22]. В качестве стандартов молекулярной массы использовали предокрашенные белковые маркеры #SM0671 («Fermentas», Литва). Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд [23], используя Bio-Rad protein assay («Bio-Rad Laboratories GmbH», Германия). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (БСА). Для опреде- Штаммы микроорганизмов. Штамм S. oneidensis MR-1 получен Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГБУ ГосНИИгенетика из коллекции микроорганизмов Института Пастера (№ CIP106686, Франция). Штаммы E. сoli К12 (№ В-6195) и B. subtilis 168 (№ В-7360) получены из ВКПМ ФГБУ ГосНИИгенетика. Получение наночастиц Ag2S. Бактерии выращивали на агаризованной среде Luria-Bertani (LBA) в течение 24 ч при 30°C для штаммов S. oneidensis MR-1, B. subtilis 168 и 37°C для штамма E. coli К12. Отдельные колонии со среды LBA переносили в 100 мл бульона LB в колбу объемом 750 мл и культивировали на круговой качалке при 220 об/мин при температуре, оптимальной для штамма, в течение 24 ч. Затем в колбу добавляли растворы солей AgNO3 и Na2S2O3×5H2O в деионизованной воде MilliQ (Millipore США) в объеме по 1.0 мл каждого до конечной концентрации в колбе 1 мМ:1 мМ. Реакционную смесь для всех трех штаммов инкубировали в аэробных условиях при соответствующих температурах на круговой качалке при 220 об/мин в течение 48 ч. Клетки удаляли, центрифугируя реакционную смесь как описано ранее, супернатант, содержащий наночастицы, фильтровали через стерильный фильтр c диаметpом поp 200 нм (Nucleopore). Наночастицы из фильтрата осаждали с помощью высокоскоростного центрифугирования при 100 000 g в течение 1 ч, дважды отмывали стерильной деионизированной водой Milli Q при центрифугировании в тех же условиях. Полученные наночастицы ресуспендировали в 1 мл деионизированной водой Milli Q. Водную суспензию наночастиц хранили при +4°C. В контрольном эксперименте в колбу, содержащую 100 мл среды LB, вносили водные растворы солей AgNO3 и Na2S2O3×5H2O до конечной концентрации 1мМ :1мМ без добавления бактериальных клеток. Все остальные манипуляции с контрольными образцами проводили аналогично опытному образцу. Выход NpAg2S рассчитывали весовым методом, как описано ранее [21]. Электронная микроскопия. Для анализа полученных наночастиц применяли метод аналитической просвечивающей электронной Рис. 1. Результаты анализа образца NpAg S,полученных с использованием штамма E. 2 микроскопии (ПЭМ). Подготовка образцов для coli K12, методом просвечивающей электронной микроскопии в комбинации с энерПЭМ: 3 мкл полученных суспензий наносили годисперсионной рентгеновской спектроскопией: ПЭМ-изображение выявленных на медную сетку с подложкой из дырчатого наночастиц (а); типичный энергодисперсионный рентгеновский спектр наночастиц углерода, покрытую ультратонкой углеродной (б). По оси абсцисс указана энергия характеристического рентгеновского излучения подложкой («Ted Pella Inc», США), инкубиро- (кэВ). По оси ординат – интенсивность рентгеновского излучения (количество импульсов; гистограмма распределения частиц по размерам (в). вали около 30 с, удаляли избыток жидкости, 152 Экспериментальные статьи ставило 2:1. С помощью ПЭМ анализа было показано, что форма всех частиц близка к сферической, распределение по размеру (диаметру) составляло от 4 до 12 нм. Средний диаметр NpAg2S при использовании штаммов S. oneidensis MR-1 и E. coli B. subtilis К12 составлял 8 ± 2 нм, а для B. subtilis 168 — 10 168 ± 3 нм. В качестве примера на рис. 1 представлены ПЭМ-изображения NpAg2S, полученных с исполь0,05 ± 0,02 зованием штамма E.coli (а), типичный энергодисперсионный спектр наночастиц (б) и гистограмма 5,3 ±0,2 распределения NpAg2S по размерам (в). Количественный анализ белков, сорбиро0,4 ± 0,05 ванных на наночастицах. В научной литературе редко встречаются данные по оценке массы белка, содержащейся на поверхности наночастиц, полу75,5 ± 15 ченных с помощью микроорганизмов. Нами было проведено исследование по определению количества белка, адсорбированного на поверхности NpAg2S, полученных с использованием разных штаммов, и проведены расчеты по оценке содержания белка в 1 мг наночастиц (см. табл. 1). Эксперименты были проведены в трех повторностях. Предварительно было определено количество белка в культуральной жидкости (КЖ) при культивировании штаммов в среде LB в течение 24 ч при оптимальных температурах. Как видно из результатов, количество белка, секретируемое в среду культивирования клетками бактерий, значительно различается в зависимости от штамма (см. табл. 1, п. 1). Наибольшее количество белков выделяется в среду штаммом S. oneidensis MR-1 (0,1 мг/мл), наименьшее — штаммом E. coli К12 (0,005 мг/мл). Эти данные представляют интерес, так как штаммы являются «донорами» белков, покрывающих поверхность наночастиц, обеспечивая таким образом стабильность частиц в водных суспензиях. Как видно из табл. 1, концентрации белков в КЖ различаются в 20 раз. Тем не менее, эти различия мало сказываются на выходе наночастиц, в среднем не более чем на 30% (см. табл. 1, п. 2). Для бактерий E. coli К12 наблюдается наибольший выход наночастиц (6,8 мг/мл) при наименьшем содержании белка (4,4 мкг/мг) на поверхности наночастиц. Для S. oneidensis MR-1 выявлено наибольшее содержание белка в КЖ (0,1 мг/ мл) и среднее количество (40 мг/мл) на наночастицах. У B. subtilis 168 наибольшее количество белка содержится на поверхности наночастиц (75,5 мкг/мг) при среднем количестве белка в КЖ (0,05 мг/мл). Все виды наночастиц были стабильны в водных суспен- Таблица 1 Количественное определение белков в КЖ и на поверхности NpAg2S, полученных с использованием различных штаммов № п/п 1 2 3 4 Параметры Количество белка в КЖ при культивировании штаммов (мг/мл) Концентрация наночастиц в исследуемых суспензиях (мг/мл) Количество белка в 1 мл исследуемой суспензии наночастиц (мг) Количество белка (мкг) на 1 мг наночастиц Штаммы S. oneidensis MR-1 E. coli К12 0,1 ± 0,05 0,005 ± 0,002 5,0 ± 0,2 6,8 ± 0,3 0,2 ± 0,05 0,03 ± 0,01 40,0 ± 10 4,4 ± 1,5 ления количества белка на наночастицах, его предварительно экстрагировали 8 М мочевиной. Идентификация белков методом МАЛДИ/ТОФ/ТОФ Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле, окрашенном Coomassie Brilliant Blue, проводили следующим образом: фрагмент геля размером 3—4 мм3 дважды промывали в 100 мкл 40% раствора ацетонитрила в 0,1 М NH4HCO3 в течение 20 мин при 37°C для удаления красителя. После удаления супернатанта для дегидратации к гелю добавляли 100 мкл ацетонитрила («Sigma-Aldrich», США). После удаления ацетонитрила и высушивания геля, к нему прибавляли 3,5 мкл раствора модифицированного трипсина («Promega», США) в 0,05 М NH4HCO3 с концентрацией 15 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 2 ч при 37°C, затем к раствору добавляли 5,25 мкл 0,5% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в 50% растворе водного ацетонитрила и тщательно перемешивали. Надосадочный раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров. Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на мишени смешивали по 1,5 мкл раствора образца и 0,5 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты («Sigma-Aldrich», США), 10 мг/мл в 20% водном ацетонитриле, 0,5% ТФУ и полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры получали на MALDI-времяпролетном массспектрометре «Ultraflex II BRUKER» («Bruker», Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов. Масс-спектр триптического гидролизата белков получен с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляет 0,01%. Масс-спектры фрагментации пептидов получены в тандемном режиме работы массспектрометра, погрешность определения масс дочерних ионов не превосходила 1 Д. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Масс-спектры были обработаны с помощью программного пакета FlexAnalysis 3.3 («Bruker Daltonics», Германия). Кандидатные белки, имеющие параметр достоверности score > 75 в базе данных NCBI, считали определенными надежно (p < 0,05). Также были получены спектры фрагментации отдельных пептидов. С использованием программного обеспечения Biotools 3.3 («Bruker Daltonics», Германия) проведен поиск по объединенным MS+MS/MS результатам. Ре зул ьт ат ы и о б суж д е н и е Характеристики NpAg2S. Наночастицы сульфида серебра (NpAg2S) были получены микробным синтезом с использованием 3 штаммов различных таксономических групп — грамотрицательных S. oneidensis MR-1 [21] и E. coli К12 и грамположительного — B. subtilis 168 из 1 мM водного раствора солей AgNO3 и Na2S2O3 × 5Н2О в аэробных условиях при температуре, оптимальной для данного штамма. Выход наночастиц, рассчитанный по введенному в реакцию серебру, составлял 40—50% вне зависимости от использованного штамма. Концентрацию наночастиц в водных суспензиях определяли также весовым методом для дальнейшего определения количества белка на наночастицах (табл. 1, п. № 2) Методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии определён элементный состав синтезированных частиц, рассчитанное атомное соотношение серебра и серы со- А Б В Г Д Е Ж Рис. 2. Электрофореграмма в полиакриламидном геле белков культуральной жидкости после культивирования штаммов и белков с поверхности наночастиц Ag2S, полученных с использованием тех же штаммов. Условные обозначения представлены на иллюстрации. Треки: А – белки культуральной жидкости после культивирования штамма S. oneidensis MR-1; В – штамма B. subtilis 168; Д – E. coli K12; Б – белки с поверхности наночастиц Ag2S, полученных с использованием штамма S.oneidensis MR-1; Г − B. subtilis 168; Е − E. coli K12; Ж – маркеры молекулярной массы белков (кД) 153 Молекулярная генетика, микробиология и вирусология №4, 2017 Таблица 2 Характеристики NpAg2S, полученных с использованием различных штаммов Параметры наночастиц Диаметр NpAg2S (ПЭМ), (нм) Эффективный диаметр NpAg2S, (нм) ζ-потенциал, (мВ) Полидисперсность Штаммы S. oneidensis MR-1 E. coli К12 B. subtilis 168 8±2 8±2 10 ± 3 106,8 43,1 163,6 –21,82 0,298 –16,57 0,352 –37,82 0,352 зиях и не агломерировали в течение нескольких месяцев. Таким образом, выход наночастиц при использовании разных штаммов не коррелирует с количеством белка в среде. Эти результаты указывают на специфичность сорбции белков микроорганизмов на поверхность наночастиц, что наблюдалось и для белков плазмы крови, сорбированных на наночастицах золота и серебра [19]. Мы исследовали параметры наночастиц, полученных биогенным синтезом, в водных суспензиях и с этой целью определили ζ-потенциал, эффективный диаметр и полидисперсность (табл. 2). Эффективный диаметр супрамолекулярного комплекса — это наночастица + окружение, в нашем случае «белковая корона». Эффективный диаметр рассчитывается по усреднению пиковых значений размеров частиц в каждой фракции. Как видно из табл. 2, эффективные диаметры наночастиц коррелируют с количеством белка, которое приходится на 1 мг наночастиц (см. табл. 1, п. 4). Так, наибольшее количество белка на 1 мг наночастиц (75,5 мкг) и наибольший эффективный диаметр (163,6 нм) у супрамолекулярного комплекса, полученного с использованием B. subtilis 168. Для штамма E. coli К12 эти показатели будут наименьшими, а именно, количество белка на 1 мг наночастиц 4,4 мкг, эффективный диаметр (43,1 нм). ζ-потенциал всех типов наночастиц является отрицательным (см. табл. 2) и также коррелирует с количеством белка на 1 мг наночастиц (см. табл. 1, п. 4). Параметр полидисперстности показывает соотношение количества молекул различного размера в образце. Чем больше разброс в размерах частиц в растворе, тем больше будет параметр полидисперстности. В представленных образцах показатели полидисперсности близки по значениям. Качественный анализ белков, сорбированных на наночастицах. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Нами был проведен анализ электрофореграмм белков, выделенных из КЖ при культивировании штаммов и белков, сорбированных на поверхности NpAg2S (рис. 2). Основная задача этого исследования состояла в решении вопроса: существует ли специфичность сорбции белков на поверхность NpAg2S из общего пула белков, секретируемых клетками, или любые белки в равной степени могут «прилипать» к наночастицам. Сравнительный анализ электрофореграмм белков КЖ (см. рис. 2, треки А, В, Д) и белков с поверхности наночастиц (см. рис. 2, треки Б, Г, Е) показал, что существуют белки, преимущественно сорбирующиеся на наночастицах. На электрофореграммах эти белки выглядят как мажорные полосы в треках Б, Г, Е. Часть окрашенных полос, присутствующих в КЖ, не выявлена при анализе белков на наночастицах. Особенно наглядно это выглядит при анализе электрофореграмм белков из КЖ B. subtilis 168, где выявлено более 10 полос (см. рис. 2, трек В) и белков с поверхности наночастиц от этого же штамма (см. рис. 2, трек Г), где присутствует только одна полоса. Этот белок впоследствии был определен как флагеллин. Анализ электрофореграмм белков наночастиц из образцов, полученных в различных экспериментах, показал, что состав белкового покрытия наночастиц индивидуален и постоянен для каждого из применяемых штаммов бактерий. Таким образом, полученные результаты подтверждают специфичность адсорбции белков на поверхности наночастиц, выявляют преимущественные белки для каждого штамма и указывают на повторяемость результатов в различных экспериментах. Белки из пронумерованных полос треков Б, Г, Е электрофореграммы были идентифицированы методом МАЛДИ/ТОФ/ТОФ. Идентификация белков, сорбированных на поверхности NpAg2S. Методом МАЛДИ/ТОФ/ТОФ были проанализированы белки из наиболее интенсивно окрашенных полос, полученных после электрофореза белков с поверхности наночастиц в ПААГ. На рис. 2 цифрами обозначены окрашенные полосы белков в треках Б, Г, Е, которые были вырезаны из ПААГ и проанализированы методом МАЛДИ/ТОФ/ТОФ согласно методике. Результаты идентификации белков представлены в табл. 3. Показано, что все белки, покрывающие поверхность NpAg2S, являются белками внешней оболочки или цитоплазматической мембраны исследованных бактерий. В некоторых случаях масс-спектрометрический анализ состава белков в электрофоретических полосах показал наличие одних и тех же белков в полосах с разной электрофоретической подвижностью, т.е. с разными молекулярными массами. Такое кажущееся противоречие связано с расщеплением белков, что подтверждается следующими фактами. Так, белок Arg R-регулируемый TonB-зависимый рецептор S. oneidensis MR-1 обнаружен в электрофоретических полосах 1 и 3 трека Б (см. рис. 2, трек Б, полосы 1 и 3). Расчетная молекулярная масса этого белка 91.901 Дa; экспериментальные данные, учитывая молекулярную массу стандартов белковых маркеров, составляют для полосы 1 примерно 87 кД, и 60 кД для полосы 3. При этом гомологичное покрытие белков детектированными пептидами составляло 69% и 47%, соответственно. Интересно, что в полосе 3 не обнаружено ни одного пептида, относящегося к N-концевой части белка длиной в 328 аминокислотных оснований (а.о.). Тогда как в полосе 1 из этих 328 а.о. перекрываются 258 а.о., т.е. 78%. В полосе 3 все перекрывающиеся последовательности локализованы в С-концевой части белка протяженностью 525 а.о. и в этой области перекрывание достигает 76%. Из этих данных следует однозначный вывод, что в полосе 3 присутствует С-концевая часть белка. Аналогичные результаты получены с белком TonB-зависимый рецептор гема/гемоглобина S. oneidensis MR-1 (см. рис. 2, трек Б, полосы 2 и 9). Этот белок обнаружен в полосах 2 и 9, но в полосе 9 присутствует только С-концевая область белка, размером 250 а.о. с перекрыванием 79%, в то время как в N-концевой области перекрывание составляет 2,7%, что можно считать погрешностью эксперимента. В отношении белков, адсорбированных на поверхности NpAg2S, Таблица 3 Идентификация белков с NpAg2S, полученных с использованием штаммов S. oneidensis MR-1, B. subtilis 168 и E. coli К12 № полосы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 1 2 3 4 5 6 154 Белки NpAg2S, полученных с использованием штаммов: S. oneidensis MR-1 Arg R-регулируемый TonB-зависимый рецептор а) TonB-зависимый сидерофор рецептор; б) TonB-зависимый рецептор гема/гемоглобина; в) TonB-зависимый рецептор витамина B12. Arg R-регулируемый TonB-зависимый рецептор а) Рецептор наружной мембраны семейства FadL б) Глобальная система секреции секретин TolC. Порин наружной мембраны Порин наружной мембраны Omp35 Флагеллин FliC а) Рецептор семейства FadL б) Порин наружной мембраны OmpК TonB-зависимый рецептор гема/гемоглобина; а) Протеин наружной мембраны OmpW б) Протеин наружной мембраны А Порин наружной мембраны OmpК B. subtilis 168 Флагеллин E. coli К12 Мальтопорин Порин наружной мембраны OmpС Порин наружной мембраны OmpА Порин наружной мембраны OmpС Порин наружной мембраны OmpА Порин наружной мембраны OmpХ Экспериментальные статьи полученных с использованием клеток E. coli, выявляется такая же картина, как в случае с белками S. oneidensis MR-1. Таким образом, если один и тот же белок присутствует в полосах с разной электрофоретической подвижностью, то в одной из полос присутствует целый белок, а в другой его крупный фрагмент. Совершенно иная ситуация с белками, адсорбированными на поверхности NpAg2S, полученными с помощью B. subtilis 168. Из всего многообразия белков, выделяемых в среду в процессе культивирования штамма, на наночастицах адсорбируется только один полноценный белок — флагеллин, молекулярная масса которого составляет 32607 Д. Таким образом, на поверхности наночастиц присутствуют как целые белки, так и их крупные фрагменты. Происходит ли протеолиз во время культивирования штамма в питательной среде или в процессе адсорбции на наночастицы, на сегодня не выяснено. Общее количество белка, адсорбированное на наночастицах, не велико, поэтому значительный интерес представляет вопрос о том, какое количество белковых молекул находится на поверхности наночастиц, присутствуют ли они в виде моно- или бислоя, или занимают только часть поверхности. На основании полученных результатов мы провели расчёт числа молекул белка, которые могут находиться на поверхности NpAg2S, имеющих определенные размеры. В силу особенностей выделения и очистки NpAg2S (отмывка водой с повторными циклами центрифугирования) мы, очевидно, имеем дело с жесткой короной (Hard Protein Corona), т.е. белками, прочно адсорбированными на поверхности NpAg2S. Количество белка, связанного с наночастицами, приведено в табл. 1. Зная средний диаметр наночастиц (8 нм) и плотность Ag2S (7,317 г/см3), можно рассчитать, сколько NpAg2S составляют 1,0 мг и какова их общая площадь. Площадь поверхности одной NpAg2S составляет 4πR2 = 4 × 3,14 × 16 ≈ 200 нм2. Количество наночастиц в 1,0 мг составляет: 1,0 мг/2 × 10–15 мг = 5,0 × 1014. Общая площадь поверхности NpAg2S в 1 мг оценивается как 200 нм2 × 5,0 × 1014 = 1,0 × 1017 нм2. При расчете средний молекулярный вес белка принят за 40 000 Д и он апроксимирован сферой с диаметром 5,0 нм. Такая сфера будет занимать поверхность в ~20 нм2 (πR2 = 3,14 × 6,25 = 19,6). Вес молекулы белка массой 40 кД составляет 6,6 × 10–14 мкг. У NpAg2S, полученных с использованием S. oneidensis MR-1, мы обнаружили 40 мкг белка на 1 мг наночастиц. Если одна молекула белка весит 6,6 × 10–14 мкг, то в 40 мкг белка число молекул составит: 40/6,6 × 10–14 ≈ 6,0 × 1014 молекул. Эти молекулы адсорбированы на площади 1,0 × 1017 нм2. Если каждая молекула занимает площадь 20 нм2, то занятой оказывается площадь в 1,2 × 1016 нм2 (6,0 × 1014 × 20 нм2), что составляет ~12% поверхности для S. oneidensis MR-1, 22% для B. subtilis, а для E. coli около 1%. Конечно, эти расчеты приблизительны. В настоящее время не определено, как белок или его фрагмент прикрепляются к поверхности наночастиц, денатурирован он или нет, но эти расчеты дают представление о степени заполнения поверхности наночастиц белками. Таким образом, белки не образуют монослоя, что может представлять интерес с точки зрения их функциональности и возможностей дальнейшей модификации поверхности наночастиц. Представленная работа является основанием для проведения дальнейших исследований по определению природы взаимодействия белка с поверхностью наночастицы. Особенностью данной работы является обнаружение факта существования наночастиц Ag2S с покрытием, состоящим из одного белка — флагеллина, что может послужить моделью для определения характера взаимодействия наночастиц и биомакромолекул. В более широком плане изучение таких взаимодействий вносит вклад в понимание интерфейса живой и неживой материи, что потенциально важно для многих областей, включая регенеративную медицину, робототехнику и связь с искусственным интеллектом. Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 16-04-00471). Исследования по электронной микроскопии объектов проведены при финансовой поддержке Программы Президиума PАН (№ 24). Исследования с использованием методов аналитической ПЭМ выполнены на оборудовании ЦКП МГУ им. М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки PФ. В работе использовалось оборудование ЦКП ИБГ РАН. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов литература (№№ 1—20, 22—23 см. RE F EREN C ES ) 21. Дебабов В.Г., Воейкова Т.А., Шебанова А.С., Шайтан К.В., Емельянова Л.К., Новикова Л.М., Кирпичников М.П. Бактериальный синтез наночастиц сульфида серебра. Российские нанотехнологии. 2013; 8(3-4): 101—7. 24. Шебанова А.С., Воейкова Т.А., Егоров А.В., Новикова Л.М., Емельянова И.Н., Емельянова Л.К., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П., Шайтан К.В. Исследование некоторых биофизических аспектов механизма бактериального синтеза наночастиц сульфида серебра металл восстанавливающими бактериями Shewanella oneidensis MR-1. Биофизика. 2014; 59(3): 500—7. RE F EREN C ES 1. Dolez P.I. Nanomaterials. Definition, classification and application. In: Dolez P.I., ed. Nanoengineering: global approaches to health and safety issues. Amsterdam: Elsevier; 2015: 3—40. 2. Bhadwal A.S., Tripathi R., Gupta R.K., Kumar N., Singh R., Shrivastav A. Biogenic synthesis and photocatalytic activity of CdS nanoparticles. RSC Advances. 2014; 4: 9484—90. 3. Bouccara S., Sitbon G., Fragola A., Lorette V., Lequeny N., Pons T. Enhancing fluorescence in vivo imaging using inorganic nanoprobes. Curr. Opin. Biotechnol. 2015; 34: 65—72. 4. Dong B., Li C., Chen G., Zhang Y., Deng M., Wang Q. Facile synthesis of highly photholumenescent Ag2Se quantum dotes as a new fluorescent probe in second near-infrared window for in vivo imaging. Chem. Mater. 2013; 25(12): 2503—9. 5.Hong G., Robinson J.T., Zhang Y., Diao S., Artaris Al., Wand Q., Dai H. In vivo fluorescence imaging with Ag2S quantum dots in the second near-infrared region. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2012; 51(39): 9818—21. 6.El-Shanshoury A.E., Elsilk S.E., Ebeid M.E. Rapid biosynthesis of cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using culture supernatants of Escherichia coli ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 and Lactobacillus acidophilus DSMZ 20079T. Afr. J. Biotechnol. 2012; 11(31): 7957—65. 7. Pawar S.A., Patil D.S., Kim J.H., Patil P.S., Shin J.C. Quantum dot sensitized solar cell based on TiO2/CdS/Ag2S heterostructure. Opt. Mater. 2017; 66: 644—50. 8.Lang B., Yu H.K. Novel Ag2S nanoparticles on reduced graphene oxide sheets as a supe r-efficient catalyst for the reduction of 4-nitrophenol. Chin. Chem. Lett. 2017; 28(2): 417—21. 9.Sandana Mala J.G., Rose C. Facile production of ZnS quantum dot nanoparticles by Saccharomyces cerevisiae MTCC 2918. J. Biotechnol. 2014; 170: 73—8. 10. Gallardo C., Monrás J.P., Plaza D.O., Collao B., Saona L.A., Durán-Toro V. et al. Low-temperature biosynthesis of fluorescent semiconductor nanoparticles (CdS) by oxidative stress resistant Antarctic bacteria. J. Biotechnol. 2014; 187: 108—15. 11.Hulkoti N.I., Taranath T.C. Biosynthesis of nanoparticles using microbes — A review. Colloids Surf. B Biointerfaces. 2014; 121: 474—83. 12.Narayanan K.B., Sakthivel N. Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Adv. Colloid Interface Sci. 2010; 156(1-2): 1—13. 13. Bansal V., Bharde A., Ramanathan R., Bhargava S.K. Inorganic materials using ‘unusual’ microorganisms. Adv. Colloid Interface Sci. 2012; 179—182: 150—68. 14. Zhang X., Yan S., Tyagi R.D., Surampalli R.Y. Synthesis of nanoparticles by microorganisms and their application in enhancing microbiological reaction rates. Chemosphere. 2011; 82(4): 489—94. 15.Hosseini M.R., Sarvi M.N. Recent achievements in the microbial synthesis of semiconductor metal sulfide nanoparticles. Materials Science in Semiconductor Processing. 2015; 40: 293—301. 16. Faramari M.A., Sadighi A. Insights into biogenic and chemical production of inorganic nanomaterials and nanostructure. Adv. Colloid Interface Sci. 2013; 189—190: 1—10. 17.Suresh A.K., Doktycz M.J., Wang W., Moon Ji-W., Gu B., Meyer H.M. et al. Monodispersed biocompatible silver sulfide nanoparticles: facile extracellular biosynthesis using gamma-proteobacterium Shewanella oneidensis. Acta Biomater. 2011; 7(12): 4253—8. 18.Ng C.K., Sivakumar K., Liu X., Madhaiyan M., Ji L., Yang L. et al. Influence of outer membrane c-type cytochromes on particle size and activity of extracellular nanoparticles produced by Shewanella oneidensis. Biotechnol. Bioeng. 2013; 110(7): 1831—7. 19.Lai W., Wang Q., Li L., Hu Z., Chen J., Fang Q. Interaction of gold and silver nanoparticles with human plasma: Analysis of protein corona reveals specific binding patterns. Colloids Surf. B Biointerfaces. 2017; 152: 317—25. 20. Xiong Y., Fredrickson J.K., Romine M.F., Marshall M.J., Lipton M.S., Beyenal H. Extracellular polymeric substances from Shewanella sp. HRCR-1 biofilms: characterization by infrared spectroscopy and proteomics. Environ. Microbiol. 2011; 13(4): 1018—31. 21. Debabov V.G., Voeykova T.A., Shebanova A.S., Shaytan K.V., Emel’yanova L.K., Novikova L.M., Kirpichnikov M.P. Bacterial synthesis of silver sulfide nanoparticles. Rossiyskie nanotekhnologii. 2013; 8(3-4): 101—7. (in Russian) 22.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680—5. 23. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248—54. 24.Shebanova A.S., Egorov A.V., Kirpichnikov M.P., Shaytan K.V., Voeikova T.A., Novikova L.M., Krestyanova I.N., Emelyanova L.K., Debabov V.G. Study of some aspects of the mechanism of bacterial synthesis of silver sulfide nanoparticles by metal reducing bacteria Shewanella oneidensis MR-1. Biophysics. 2014; 59(3): 408—14. (in Russian) 155 Молекулярная генетика, микробиология и вирусология №4, 2017 Voeikova T.A.1, Zhuravliova O.A.1, 2, Bulushova N.V.1, Veiko V.P.3, Ismagulova T.T.4, Lupanova T.N.5, Shaitan K.V.4, 6, Debabov V.G.1 «Protein Corona» Of Nanoparticles Of Sulfide Silver Obtained In The Presence Of Gram-Negative And Gram-Positive Bacteria State Research Institute оf Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, 117545, Moscow, Russian Federation 2 Agricultural Technology Institute, People’s Friendship University, 117198, Moscow, Russian Federation 3 Research Center of Biotechnology RAS, Bach Institute of Biochemistry RAS, 119071, Moscow, Russian Federation 4 Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russian Federation 5 Institute of Gene Biology of the RAS, 119334, Moscow, Russian Federation 6 Semenov Institute of Chemical Physics, RAS, 119991, Moscow, Russian Federation 1 The comparative analysis of the amount and composition of proteins adsorbed on the surface of silver sulfide nanoparticles (NpAg2S) obtained by biosynthesis with bacteria: gram-negative — Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli K12 and gram-positive bacteria — Bacillus subtilis 168 was carried out for the first time. The biosynthesis of NpAg2S was carried out in a 1 mM aqueous solution of AgNO3 and Na2S2O3 × 5H2O salts in the presence of bacterial cells under aerobic conditions. Analysis of Ag2S nanoparticles by transmission electron microscopy showed that the particles are spherical with an average diameter of 8 ± 2 nm for S. oneidensis MR-1, E. coli K12 and 10 ± 3 nm for B. subtilis 168. It was found that the greatest amount of protein is sorbed on NpAg2S when B. subtilis was used, the smallest when E. coli was used. The main proteins, adsorbed on NpAg2S, were determined by the MALDI/TOF/TOF method, and the heterogeneity of the protein coating was revealed. The least heterogeneity of proteins on the surface of nanoparticles is observed in the case of using B. subtilis (only one protein predominates — flagellin); the greatest heterogeneity of proteins on nanoparticles obtained with S. oneidensis MR-1. It is shown that all the proteins covering the surface of NpAg2S are proteins of the outer membrane or cytoplasmic membrane of the bacteria studied. The composition of the protein coating of nanoparticles is individual and constant for each strain of bacteria. The ζ-potential and hydrodynamic diameter differ in magnitude, depending on the «protein corona» of the strain used to obtain NpAg2S. The characteristic of the «protein corona» of biologically produced nanoparticles is an important and necessary condition for their practical application. K e y w o r d s : silver sulfide nanoparticles, biosynthesis, «protein corona», Shewanella oneidensis MR-1, Escherichia coli K12, Bacillus subtilis 168. For citation: Voeikova T.A., Zhuravliova O.A., Bulushova N.V., Veiko V.P., Ismagulova T.T., Lupanova T.N., Shaitan K.V., Debabov V.G. «Protein Corona» Of Nanoparticles Of Sulfide Silver Obtained In The Presence Of Gram-Negative And Gram-Positive Bacteria. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 151–156 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-151–156. For correspondence: Voeikova Tatiana Aleksandrovna, PhD, Chief Researcher scientist of the Laboratory of Protein Engineering, Email: [email protected] Acknowledgments. The work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grant No.16-04-00471). Studies on electron microscopy of objects were carried out with the financial support of the Program of the Presidium of the RAS (No. 24). Studies using analytical TEM methods were performed on the equipment of the centre of collective usage MSU M.V. Lomonosov with financial support of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation. In this work we used the equipment of the centre of collective usage of the IBG RAS. Conflict of interest. The authors state that there is no conflict of interest. Received 24.07.17 Accepted 05.10.17 © Коллектив авторов, 2017 УДК 578.832.1.083.2 Зайнутдинов С.С.1,2, Гражданцева А.А.2, Кочетков Д.В.3, Чумаков П.М.3,4, Нетесов С.В.1, Матвеева О.В.5, Кочнева Г.В.1,2 Изменение онколитической активности вируса Cендай при адаптации к культурам клеток Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, Россия; ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Россия; 3 Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, 119991, Москва, Россия; 4 Федеральный научный центр по исследованиям и разработке иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН, 108819, Москва, Россия; 5 Biopolymer Design LLC, Acton, Massachusetts, USA 1 2 Данная работа посвящена изучению корреляции между мутационной изменчивостью и цитотоксическими свойствами онколитического вируса Сендай при использовании разных систем культивирования. Мы показали, что в результате 12-ти последовательных пассажей в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов вирус Сендай накапливается в ней в высоких титрах без изменения геномной последовательности РНК и цитотоксических свойств в отношении клеток меланомы (Mel8) и глиомы человека (U87MG). Однако для препаратов, полученных в этой системе, существует проблема аллергенности и стандартизации. Её решением могла бы явиться адаптация вируса к культуре клеток. Мы использовали культуры клеток 4647 (клетки почки африканской зелёной мартышки) и 293 (клетки почки эмбриона человека), которые аттестованы для производства вакцин в России. Для корреспонденции: Кочнева Галина Вадимовна — д-р биол. наук, зав. лабораторией вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора; е-mail: [email protected], [email protected] Оказалось, что при репродукции вируса в данных культурах клеток в течение 21—25 пассажей происходит накопление мутаций с наибольшей плотностью несинонимичных замен в генах F и HN, которые кодируют поверхностные белки вириона и обеспечивают его инфекционность. Накопление мутаций приводит к существенному снижению цитотоксической активности штамма Moscow вируса Сендай в отношении клеток меланомы и глиомы человека. Возвратное пассирование на куриных эмбрионах адаптированного к клеткам 4647 вируса Сендай обеспечивает частичную элиминацию адаптивных мутаций и восстановление онколитической активности вируса. Мутации, приобретённые при адаптации к клеткам 293, не элиминируются в процессе 10кратного обратного пассирования на куриных эмбрионах и не происходит восстановления онколитической активности вируса. Таким образом, стабильность генома вируса Сендай имеет важное значение для реализации его онколитического потенциала, и это необходимо учитывать при выборе технологии производства противоопухолевых препаратов на основе данного вируса. К л ю ч е в ы е с л о в а : вирус Сендай, онколитический вирус, культура клеток, структура генома, цитотоксическая активность, адаптивные мутации. 156
