Патент Способ спектрофотометрического определения аминокислот

(19)
RU
(51)
ÌÏÊ 5
(11)
2 012 869
(13)
C1
G 01 N 21/78
ÐÎÑÑÈÉÑÊÎÅ ÀÃÅÍÒÑÒÂÎ
ÏÎ ÏÀÒÅÍÒÀÌ È ÒÎÂÀÐÍÛÌ ÇÍÀÊÀÌ
(12)
ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÈÇÎÁÐÅÒÅÍÈß Ê ÏÀÒÅÍÒÓ
(21), (22) Çà âêà: 4912443/25, 18.02.1991
(71) Çà âèòåëü(è):
Êàçàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé òåõíîëîãè÷åñêèé
óíèâåðñèòåò
(46) Îïóáëèêîâàíî: 15.05.1994
(57) Ðåôåðàò:
Ñóùíîñòü: ñïîñîá ïîçâîë åò ñåëåêòèâíî
îïðåäåëèòü ïðîëèí èëè òðèïòîôàí â ïðèñóòñòâèè
äðóãèõ àìèíîêèñëîò. Äë ýòîãî ê ðàñòâîðó ïðîáû
äîáàâë þò
èçáûòîê
ðàñòâîðà
7-õëîð-4,6äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà
â
îðãàíè÷åñêîì
ðàñòâîðèòåëå,
íåéòðàëèçóþò
ðàñòâîð
è
ðåãèñòðèðóþò îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ðàñòâîðà â
îáëàñòè 500 - 550 íì. Â ýòîé îáëàñòè ñïåêòðà
ïîãëîùàþò òîëüêî ïðîäóêòû ðåàêöèè ïðîëèíà èëè
òðèïòîôàíà ñ öâåòîðåàãåíòîì, ÷òî ïîçâîë åò
ñåëåêòèâíî îïðåäåë òü óêàçàííûå àìèíîêèñëîòû â
ñìåñè
ñ
äðóãèìè
àìèíîêèñëîòàìè
áåç
ïðåäâàðèòåëüíîãî èõ âûäåëåíè . 1 òàáë.
R U
2 0 1 2 8 6 9
C 1
C 1
(54) ÑÏÎÑÎÁ ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈß ÀÌÈÍÎÊÈÑËÎÒ
Ñòðàíèöà: 1
RU
2 0 1 2 8 6 9
(73) Ïàòåíòîîáëàäàòåëü(ëè):
Êàçàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé òåõíîëîãè÷åñêèé
óíèâåðñèòåò
R U
(72) Àâòîð(û):
Åâãåíüåâ Ì.È.,
Íèêîëàåâà Í.Ã.,
Åâãåíüåâà È.È.,
Ëåâèíñîí Ô.Ñ.,
Ïîáåäèìñêèé Ä.Ã.
(19)
RU
(51) Int.
Cl. 5
(11)
2 012 869
(13)
C1
G 01 N 21/78
RUSSIAN AGENCY
FOR PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 4912443/25, 18.02.1991
(71) Applicant(s):
KAZANSKIJ GOSUDARSTVENNYJ
TEKHNOLOGICHESKIJ UNIVERSITET
(46) Date of publication: 15.05.1994
(54) METHOD OF SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF AMINOACIDS
density is registered at wave- length 500-550 nm.
Proposed method enables selective determination
of proline or triptophan in the presence of other
aminoacids. EFFECT: improves efficiency of the
method. 1 tbl
R U
2 0 1 2 8 6 9
C 1
C 1
(57) Abstract:
FIELD: analytic chemistry. SUBSTANCE: excess
of
7-chlorine-4,6-dinitrobenzofuroxane
solution
in organic solvent is added into sample. Thus
prepared solution is neutralized, its optical
Ñòðàíèöà: 2
EN
2 0 1 2 8 6 9
(73) Proprietor(s):
KAZANSKIJ GOSUDARSTVENNYJ
TEKHNOLOGICHESKIJ UNIVERSITET
R U
(72) Inventor(s):
EVGEN'EV M.I.,
NIKOLAEVA N.G.,
EVGEN'EVA I.I.,
LEVINSON F.S.,
POBEDIMSKIJ D.G.
RU 2 012 869 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê àíàëèòè÷åñêîé õèìèè àìèíîêèñëîò, à èìåííî ñïîñîáó
ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ðàñòâîðàõ â
ïðèñóòñòâèè äðóãèõ α -àìèíîêèñëîò (ëåéöèí, èçîëåéöèí, âàëèí, ãëóòàìèíîâà êèñëîòà,
àëàíèí) ñ ïîìîùüþ ðåàãåíòà 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà.
Èçîáðåòåíèå ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî äë àíàëèçà ïðîäóêòîâ ôåðìåíòàöèîííîãî
ïðîöåññà áèîñèíòåçà ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà, â õîäå êîòîðîãî îáðàçóþòñ óêàçàííûå
âûøå àëèôàòè÷åñêèå àìèíîêèñëîòû.
Èçâåñòåí ñïîñîá êîëè÷åñòâåííîãî ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò,
ðåàêöèîííîñïîñîáíûõ ïî îòíîøåíèþ ê ïàðà-íèòðîàíèëèäàì (íà íåðàñòâîðèìûõ íîñèòåë õ).
Ïîëèìåð îáðàáàòûâàþò íèòðîàíèëèäîì àìèíîêèñëîòû (ëåéöèíà, ãëèöèíà, àëàíèíà).
Îïðåäåë þò ðåàêöèîííûå ïî îòíîøåíèþ ê íèòðîàíèëèäàì ôóíêöèîíàëüíûå ãðóïïû
(àëüäåãèäíûå, áåíçîõèíîíîâûå è ò. ä. ), ôîòîìåòðèðó ïðè 310 íì [1] .
Îäíàêî ñïîñîá äëèòåëåí, òðóäîåìîê è íå ïîçâîë åò ïðîâîäèòü ðàçäåëüíîå îïðåäåëåíèå
àìèíîêèñëîò â ñìåñè.
Èçâåñòåí ñïîñîá ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò ñ ïîìîùüþ
öâåòîðåàãåíòà (1-õèíîêñàëèë-2)-3-ìåòèë-5(n-êàðáîêñèôåíèë) ôîðìàçàíà â ïðèñóòñòâèè
íèòðàòà ðòóòè [2] .
Îäíàêî ïðåäëîæåííûé ñïîñîá íå îáåñïå÷èâàåò ñåëåêòèâíîñòè îïðåäåëåíèé
àìèíîêèñëîò â ñìåñè.
Èçâåñòåí ñïîñîá ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè òðèïòîôàíà ïóòåì
ðàñùåïëåíè ãåòåðîöèêëà äåéñòâèåì àçîòèñòîé êèñëîòû è ïîëó÷åíèåì îêðàøåííûõ
ïðîäóêòîâ [3] .
Ïðåäëîæåííûé ñïîñîá òàêæå íå îáåñïå÷èâàåò ñåëåêòèâíîñòü îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîò
â ñìåñ õ.
Íàèáîëåå áëèçêèì ïî òåõíè÷åñêîé ñóùíîñòè è äîñòèãàåìîìó ðåçóëüòàòó ê íàñòî ùåìó
ñïîñîáó âë åòñ ñïîñîá êîëè÷åñòâåííîãî ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî îïðåäåëåíè
àìèíîêèñëîò ñ ïðèìåíåíèåì íèíãèäðèíîâîãî ðåàãåíòà [4] .
Îäíàêî èñïîëüçîâàíèå óêàçàííîãî ðåàãåíòà íå ïîçâîë åò ïðîâîäèòü ñåëåêòèâíûå
îïðåäåëåíè îäíèõ àìèíîêèñëîò â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ, ïîñêîëüêó îáðàçóþùèåñ ïðîäóêòû
ðåàêöèè äë áîëüøèíñòâà àìèíîêèñëîò èìåþò ïîëîñû ïîãëîùåíè , íàêëàäûâàþùèåñ äðóã
íà äðóãà.
Òàêèì îáðàçîì, èçâåñòíûå ñïîñîáû íå ïîçâîë þò ïðîâîäèòü êîëè÷åñòâåííûå
îïðåäåëåíè îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîò â ñìåñ õ áåç èõ ïðåäâàðèòåëüíîãî ðàçäåëåíè .
Öåëüþ èçîáðåòåíè âë åòñ ïîâûøåíèå ñåëåêòèâíîñòè îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè
òðèïòîôàíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò, îáðàçóþùèõñ â ïðîäóêòàõ ôåðìåíòàöèè
ïðè èõ áèîñèíòåçå, à òàêæå óïðîùåíèå ñïîñîáà.
Öåëü äîñòèãàåòñ çà ñ÷åò òîãî, ÷òî â ñïîñîáå îïðåäåëåíè òðèïòîôàíà èëè ïðîëèíà â
ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò àíàëèçèðóåìóþ ñìåñü îáðàáàòûâàþò ðàñòâîðîì 7-õëîð4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà è îïðåäåë þò ñîäåðæàíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà
ôîòîìåòðèðîâàíèåì ðàñòâîðà â îáëàñòè 500-550 íì. 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàí â
óêàçàííûõ óñëîâè õ ðåàãèðóåò ñî âñåìè àìèíîêèñëîòàìè, íàõîä ùèìèñ â àíàëèçèðóåìîé
ñìåñè. Îäíàêî êîíòðàñòíîñòü ïðîäóêòîâ ðåàêöèè (ñäâèã ìàêñèìóìà ïîãëîùåíè ïðîäóêòà
ðåàêöèè ïî ñðàâíåíèþ ñ ìàêñèìóìîì ïîãëîùåíè ðåàãåíòà) äë ïðîëèíà è òðèïòîôàíà
çíà÷èòåëüíî áîëüøå, ÷åì äë äðóãèõ àìèíîêèñëîò. Ýòîò ôàêò ïîçâîë åò ïðîâîäèòü
îïðåäåëåíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò.
Ï ð è ì å ð 1. Îïðåäåëåíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â èñêóññòâåííîé ñìåñè
àìèíîêèñëîò.
Äë îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â àíàëèçèðóåìîé ñìåñè àìèíîêèñëîò ãîòîâ ò
íåâîäíûé (àöåòîíèòðèë, ñïèðòû) ðàñòâîð ðåàãåíòà - 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà ñ
êîíöåíòðàöèåé 10 -2 ìîëü/ë. Â ìåðíóþ êîëáó îáúåìîì 25 ñì 3 îòáèðàþò 1
ñì 3 àíàëèçèðóåìîãî ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 0,01-0,2 ìã àìèíîêèñëîò, äîáàâë þò 4
ñì 3 ðàñòâîðà ðåàãåíòà (7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà) è äîâîä ò ñîäåðæèìîå ìåðíîé
êîëáû äî ìåòêè áóôåðíûì ðàñòâîðîì ñ pH 6,86. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ôîòîìåòðèðóþò ïðè
Ñòðàíèöà: 3
DE
RU 2 012 869 C1
5
10
15
20
25
30
äëèíàõ âîëí 500-550 íì îòíîñèòåëüíî ðàñòâîðà ñðàâíåíè , ñîäåðæàùåãî ðàñòâîð ðåàãåíòà
òîé æå êîíöåíòðàöèè. Ñîäåðæàíèå ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà îïðåäåë þò ïî
ãðàäóèðîâî÷íîìó ãðàôèêó èëè ìåòîäîì äîáàâîê. Äë ïîñòðîåíè ãðàäóèðîâî÷íîãî ãðàôèêà
ãîòîâ ò ðàñòâîðû, ñîäåðæàùèå 0,01-0,2 ìã ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â ìåðíîé êîëáå íà 25
ñì 3, äîáàâë þò 4 ñì 3 ðåàãåíòà è äîâîä ò ñîäåðæèìîå êîëáû äî ìåòêè áóôåðíûì
ðàñòâîðîì ñ pH 6,86. Â óêàçàííûõ óñëîâè õ íàáëþäàåòñ ïî âëåíèå îðàíæåâîé îêðàñêè
àíàëèçèðóåìîãî ðàñòâîðà, ñâ çàííîé ñ îáðàçîâàíèåì ïðîäóêòîâ ðåàêöèè ñ òðèïòîôàíîì
èëè ïðîëèíîì. Â òî æå âðåì îñòàëüíûå àìèíîêèñëîòû (âàëèí, ëåéöèí, èçîëåéöèí, àëàíèí,
ãëóòàìèíîâà êèñëîòà, ãëèöèí) ñ ðåàãåíòàìè îáðàçóþò ïðîäóêòû ðåàêöèè, íå ìåøàþùèå
îïðåäåëåíèþ òðèïòîôàíà èëè ïðîëèíà. Ðåçóëüòàòû, àíàëîãè÷íûå îïðåäåëåíèþ
òðèïòîôàíà, ïîëó÷åíû äë îïðåäåëåíè ïðîëèíà.
 òàáëèöå ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíè ïðîëèíà èëè òðèïòîôàíà â
ïðèñóòñòâèè óêàçàííûõ âûøå àìèíîêèñëîò.
Ï ð è ì å ð 2. Îïðåäåëåíèå òðèïòîôàíà â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè áèîñèíòåçà
òðèïòîôàíà.
Ôåðìåíòàöèîííûé ðàñòâîð ïîäãîòîâëåí â àíàëèçó ñëåäóþùèì îáðàçîì:
Áèîìàññà ïðîäóöåíòà îòäåëåíà öåíòðèôóãèðîâàíèåì,
Ïîñëå ïîäêèñëåíè ñîë íîé êèñëîòîé ôèëüòðàòà êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè äî pH 1
âûïàâøèé îñàäîê îòäåëåí ïîâòîðíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì.
Ôèëüòðàò íåéòðàëèçîâàí áóôåðíûì ðàñòâîðîì 7,05 è çàòåì ïðîâåäåíî îïðåäåëåíèå
ñîäåðæàíè òðèïòîôàíà ìåòîäîì äîáàâîê íàñòî ùèì ñïîñîáîì.
 ðåçóëüòàòå îïðåäåëåíè ïîëó÷åíî ñîäåðæàíèå òðèïòîôàíà â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè
8,7±0,1 ã/ë.
Ôîðìóëà èçîáðåòåíè
ÑÏÎÑÎÁ ÑÏÅÊÒÐÎÔÎÒÎÌÅÒÐÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈß ÀÌÈÍÎÊÈÑËÎÒ,
çàêëþ÷àþùèéñ â òîì, ÷òî ê àíàëèçèðóåìîé ïðîáå äîáàâë þò ðàñòâîð öâåòîðåàãåíòà è
ôîòîìåòðèðóþò ïîëó÷åííûé ðàñòâîð, îòëè÷àþùèéñ òåì, ÷òî, ñ öåëüþ ñåëåêòèâíîãî
îïðåäåëåíè òðèïòîôàíà èëè ïðîëèíà â ïðèñóòñòâèè äðóãèõ àìèíîêèñëîò è óïðîùåíè
ñïîñîáà, â êà÷åñòâå öâåòîðåàãåíòà äîáàâë þò ðàñòâîð 7-õëîð-4,6-äèíèòðîáåíçîôóðîêñàíà
â îðãàíè÷åñêîì ðàñòâîðèòåëå, çàòåì íåéòðàëèçóþò ðàñòâîð, à ôîòîìåòðèðóþò ïðè 500 550 íì.
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 4
CL
RU 2 012 869 C1
Ñòðàíèöà: 5
DR