Загрузил kaa_23

136-9811

Реклама
ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ
ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ
ÑÎÃËÀÑÎÂÀÍÎ
Íà÷àëüíèê îòäåëà
íàóêè è âíåäðåíèÿ
Í.È. Äîñòà
ÓÒÂÅÐÆÄÀÞ
Çàìåñòèòåëü
ìèíèñòðà çäðàâîîõðàíåíèÿ
Â.Ï. Ôèëîíîâ
18 ìàÿ 1999 ã.
Ðåãèñòðàöèîííûé ¹ 136-9811
18 ìàÿ 1999 ã.
ÌÅÒÎÄÈÊÈ
ÏÎ ÑÀÍÈÒÀÐÍÎ-ÂÈÐÓÑÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÌÓ ÊÎÍÒÐÎËÞ ÏÈÒÜÅÂÎÉ ÂÎÄÛ
È ÎÖÅÍÊÅ ÅÅ ÝÏÈÄÅÌÈ×ÅÑÊÎÉ ÁÅÇÎÏÀÑÍÎÑÒÈ
(ÄËß ÑÈÑÒÅÌÛ ÖÅÍÒÐÀËÈÇÎÂÀÍÍÎÃÎ
ÕÎÇßÉÑÒÂÅÍÍÎ-ÏÈÒÜÅÂÎÃÎ
ÂÎÄÎÑÍÀÁÆÅÍÈß)
Ìèíñê 1999
Îñíîâíîå ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: Áåëîðóññêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò ýïèäåìèîëîãèè è
ìèêðîáèîëîãèè
Ó÷ðåæäåíèå-ñîèñïîëíèòåëü: Áåëîðóññêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé ñàíèòàðíî-ãèãèåíè÷åñêèé èíñòèòóò
Àâòîðû: Ò.Â. Àìâðîñüåâà, Ñ.Â. Îðëîâà, Î.Â. Äüÿêîíîâà, Ç.Á. Êâà÷åâà, Ð.Ì. Øàðêî, Â.Ô. Åðåìèí, Ç.Ô. Áîãóø,
Î.Í. Êàçèíåö, Ò.À. Ñòåëüìàõ, Ï.À. Àìâðîñüåâ
Ðåöåíçåíòû: Ñ.Ã. Ïîçèí, Ñ.Ô. Êðåòîâà
 ìåòîäèêàõ îáîáùåí îïûò ðàáîòû ñîòðóäíèêîâ ÁåëÍÈÈÝÌ è ÁåëÍÈÑÃÈ. Îïèñàíû îðãàíèçàöèÿ è ïîðÿäîê
îñóùåñòâëåíèÿ ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîãî êîíòðîëÿ êà÷åñòâà âîäû, ìåòîäû óëàâëèâàíèÿ âèðóñîâ èç âîäû è
èõ êîíöåíòðèðîâàíèå. Ñ ó÷åòîì ðåêîìåíäàöèé ÂÎÇ äàíû ìåòîäû âûäåëåíèÿ è èäåíòèôèêàöèè ýíòåðîâèðóñîâ.
Ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ ñïåöèàëèñòîâ ÍÈÈ, ñàíýïèäñëóæáû, à òàêæå ñïåöèàëèñòîâ ïðåäïðèÿòèé ñèñòåìû
öåíòðàëèçîâàííîãî õîçÿéñòâåííî-ïèòüåâîãî âîäîñíàáæåíèÿ: âèðóñîëîãîâ, áàêòåðèîëîãîâ, ñàíèòàðíûõ âðà÷åé,
ýïèäåìèîëîãîâ.
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè óòâåðæäåíû Ìèíèñòåðñòâîì çäðàâîîõðàíåíèÿ Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü â êà÷åñòâå
îôèöèàëüíîãî äîêóìåíòà.
ÑÏÈÑÎÊ ÑÎÊÐÀÙÅÍÈÉ
ÁÎÅ — áëÿøêîîáðàçóþùàÿ åäèíèöà
ÂÃÀ — âèðóñ ãåïàòèòà À
ÈÔÀ — èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç
ÌÅÌ — ìèíèìàëüíàÿ ñðåäà Èãëà
ÍÌÔÀ — íåïðÿìîé ìåòîä ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë
ÏÝ× — êëåòêè ïî÷êè ýìáðèîíà ÷åëîâåêà
ÐÍ — ðåàêöèÿ íåéòðàëèçàöèè
ÐÒ-ÏÖÐ — ïîëèìåðàçíàÿ öåïíàÿ ðåàêöèÿ ñî ñòàäèåé
îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè
ÒÖÄ 50/ìë — òêàíåâàÿ öèòîïàòè÷åñêàÿ äîçà âèðóñà,
âûçûâàþùàÿ ÖÏÝ â 50% çàðàæåííûõ êëåòî÷íûõ êóëüòóð
ÔÈÒÖ — ôëóîðåñöåèíèçîòèîöèîíàò
ÔÝ× — ôèáðîáëàñòû ýìáðèîíà ÷åëîâåêà
ÖÏÀ — öèòîïàòè÷åñêèé àãåíò
ÖÏÝ — öèòîïàòè÷åñêèé ýôôåêò
BGM — êëåòêè ïî÷êè àôðèêàíñêîé çåëåíîé ìàðòûøêè
Hep-2 — êëåòêè êàðöèíîìû ãîðòàíè ÷åëîâåêà
FL — êëåòêè àìíèîíà ÷åëîâåêà
RD — êëåòêè ðàáäîìèîñàðêîìû ÷åëîâåêà
Vero — êëåòêè ïî÷êè çåëåíîé ìàðòûøêè
!
ÂÂÅÄÅÍÈÅ
 ñâÿçè ñ óñèëèâàþùåéñÿ â ïîñëåäíèå äåñÿòèëåòèÿ àíòðîïîãåííîé è òåõíîãåííîé íàãðóçêîé íà îáúåêòû
îêðóæàþùåé ñðåäû ïðîáëåìà çàãðÿçíåíèÿ âîäû ïàòîãåííûìè âèðóñàìè ñòàíîâèòñÿ âñå áîëåå àêòóàëüíîé.
Ðàñïðîñòðàíÿåìûå ñ âîäîé âèðóñíûå èíôåêöèè ïðîäîëæàþò îñòàâàòüñÿ îäíîé èç îñíîâíûõ ïðè÷èí ðîñòà
êèøå÷íûõ è ðÿäà ñîìàòè÷åñêèõ çàáîëåâàíèé ÷åëîâåêà. Ñðåäè íèõ íàèáîëüøóþ ñîöèàëüíóþ çíà÷èìîñòü èìåþò
âèðóñíûå ãåïàòèòû (À, Å), ìåíèíãèòû, ðîòàâèðóñíàÿ èíôåêöèÿ, çàáîëåâàíèÿ ñåðäöà (ìèî-, ïåðèêàðäèò,
äèëàòàöèîííàÿ êàðäèîìèîïàòèÿ), ãàñòðîýíòåðîêîëèòû ïå÷åíè (íåêðîòè÷åñêèé ãåïàòèò), ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû
(äèàáåò) è äð. Ê òàê íàçûâàåìûì «âîäíûì âèðóñàì», íàèáîëåå ÷àñòî îáíàðóæèâàåìûì â âîäå, îòíîñÿòñÿ:
ýíòåðîâèðóñû (âèðóñû ÅÑÍÎ, Êîêñàêè À è Â, âèðóñû ïîëèîìèåëèòà), âèðóñû ãåïàòèòà À è Å, àäåíî-, ðåî-,
êîðîíà-, ðåòðîâèðóñû. Â îñíîâå ïðîôèëàêòèêè âûçûâàåìûõ äàííûìè âîçáóäèòåëÿìè âèðóñíûõ èíôåêöèé ëåæèò
ðàçðàáîòêà ýôôåêòèâíîé ñèñòåìû ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîãî êîíòðîëÿ êà÷åñòâà âîäû, à òàêæå
ñîâåðøåíñòâîâàíèå êðèòåðèåâ îöåíêè åå ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè.
Äàííîé ïðîáëåìå ïîñâÿùåíû íàñòîÿùèå ìåòîäèêè, êîòîðûå ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ îðãàíèçàöèé, ïðåäïðèÿòèé
è èíûõ õîçÿéñòâåííûõ ñóáúåêòîâ, íåçàâèñèìî îò ïîä÷èíåííîñòè è ôîðì ñîáñòâåííîñòè, ýêñïëóàòèðóþùèõ
ñèñòåìû öåíòðàëèçîâàííîãî õîçÿéñòâåííî-ïèòüåâîãî âîäîñíàáæåíèÿ, à òàêæå îðãàíîâ è ó÷ðåæäåíèé ñàíèòàðíîýïèäåìèîëîãè÷åñêîé ñëóæáû, îñóùåñòâëÿþùèõ ãîñóäàðñòâåííûé è âåäîìñòâåííûé ñàíèòàðíûé íàäçîð.
Ðàçðàáîòêà è óòâåðæäåíèå äàííûõ ìåòîäèê îáóñëîâëåíû íåîáõîäèìîñòüþ ïðèâåäåíèÿ ìåòîäè÷åñêèõ
äîêóìåíòîâ Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü â ñîîòâåòñòâèå ñ ðåêîìåíäàöèÿìè Âñåìèðíîé îðãàíèçàöèè çäðàâîîõðàíåíèÿ
(ÂÎÇ) è íîâûìè íàó÷íûìè çíàíèÿìè î âëèÿíèè ïèòüåâîé âîäû íà ýïèäåìè÷åñêîå áëàãîïîëó÷èå íàñåëåíèÿ, à
òàêæå ïðèìåíåíèåì òåõíîëîãèé âîäîî÷èñòêè, ÷àñòî íå îòâå÷àþùèõ óðîâíþ çàãðÿçíåíèÿ âîäîèñòî÷íèêîâ.
1. ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈß È ÏÎÐßÄÎÊ ÎÑÓÙÅÑÒÂËÅÍÈß
ÑÀÍÈÒÀÐÍÎ-ÂÈÐÓÑÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÃÎ ÊÎÍÒÐÎËß ÊÀ×ÅÑÒÂÀ ÂÎÄÛ
Êîíòðîëü êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû ïðåäóñìàòðèâàåò åå ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîå èññëåäîâàíèå íà äâóõ
óðîâíÿõ: âîäîèñòî÷íèêîâ (ïîâåðõíîñòíûõ, ïîäçåìíûõ) è ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè.
1.1. Âèäû êîíòðîëÿ
Ðàçëè÷àþò 4 âèäà ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîãî êîíòðîëÿ:
1) òåêóùèé;
2) â ïåðèîä «ðèñêà»;
3) ýêñòðåííûé;
4) ïî ñàíèòàðíî-ýïèäåìèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàíèÿì.
Òåêóùèé êîíòðîëü îñóùåñòâëÿåòñÿ ïëàíîâî (â òå÷åíèå ãîäà) â ñîîòâåòñòâèè ñ ðàçðàáîòàííîé ðåãèîíàëüíîé
ðàáî÷åé ïðîãðàììîé äëÿ êîíêðåòíîé òåððèòîðèè (ãîðîäà, íàñåëåííîãî ïóíêòà). Ðàáî÷àÿ ïðîãðàììà äîëæíà
ñîäåðæàòü:
"
− ïåðå÷åíü êîíòðîëèðóåìûõ ïîêàçàòåëåé;
− ïåðå÷åíü ïðèìåíÿåìûõ äëÿ èññëåäîâàíèé ìåòîäèê;
− ïëàí ïóíêòîâ (òî÷åê) îòáîðà ïðîá âîäû â ìåñòàõ âîäîçàáîðà ïåðåä ïîäà÷åé â ðàñïðåäåëèòåëüíóþ ñåòü è â
ìåñòàõ âîäîðàçáîðà â ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè âîäîïðîâîäà;
− êîëè÷åñòâî êîíòðîëèðóåìûõ ïðîá âîäû è ïåðèîäè÷íîñòü èõ îòáîðà;
− êàëåíäàðíûå ãðàôèêè îòáîðà ïðîá âîäû è ïðîâåäåíèÿ èõ èññëåäîâàíèé.
Ðàáî÷àÿ ïðîãðàììà, ðàçðàáîòàííàÿ öåíòðîì ãèãèåíû è ýïèäåìèîëîãèè (ÖÃÝ), óòâåðæäàåòñÿ ãëàâíûì
ãîñóäàðñòâåííûì ñàíèòàðíûì âðà÷îì ÖÃÝ íà ñðîê íå áîëåå 1 ãîäà.  íåé äîëæåí áûòü îïðåäåëåí ïîðÿäîê
ïåðåäà÷è èíôîðìàöèè îðãàíó ìåñòíîãî ñàìîóïðàâëåíèÿ. Ðàáî÷àÿ ïðîãðàììà, ðàçðàáîòàííàÿ âåäîìñòâåííûìè
ëàáîðàòîðèÿìè âîäîêàíàëîâ (ïðè îñóùåñòâëåíèè ïðîèçâîäñòâåííîãî êîíòðîëÿ), à òàêæå âñå èçìåíåíèÿ è
äîïîëíåíèÿ â íåé äîëæíû ñîãëàñîâûâàòüñÿ ñ òåððèòîðèàëüíûìè ÖÃÝ, à ïîëó÷åííàÿ èíôîðìàöèÿ — íàïðàâëÿòüñÿ
â ÖÃÝ è îðãàíû ìåñòíîãî ñàìîóïðàâëåíèÿ.
Ïðîèçâîäñòâåííûé êîíòðîëü êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû ïî âèðóñîëîãè÷åñêèì ïîêàçàòåëÿì ìîæåò
îñóùåñòâëÿòüñÿ òàêæå ïî äîãîâîðó ñî ñïåöèàëèçèðîâàííûìè ëàáîðàòîðèÿìè ÍÈÈ è ñàíèòàðíîé ñëóæáû.
Êîíòðîëü â ïåðèîä «ðèñêà» ïðåäóñìàòðèâàåò ïðîâåäåíèå ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé â
âåñåííå-ëåòíå-îñåííåå âðåìÿ — III–IÕ ìåñÿöû êàæäîãî ãîäà, êîòîðûå ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå óÿçâèìûìè â ïëàíå
âèðóñíîãî çàãðÿçíåíèÿ âîäû.
Ýêñòðåííûé êîíòðîëü ïðåäóñìàòðèâàåò îñóùåñòâëåíèå èññëåäîâàíèé â ñëó÷àå êàêèõ-ëèáî âíåçàïíûõ
íàðóøåíèé èëè àâàðèé â ñèñòåìå âîäîñíàáæåíèÿ, â ðåçóëüòàòå êîòîðûõ ìîæåò ïðîèçîéòè ìèêðîáíîå çàãðÿçíåíèå
âîäîïðîâîäíîé âîäû â ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè.
Êîíòðîëü ïî ñàíèòàðíî-ýïèäåìèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàíèÿì îñóùåñòâëÿåòñÿ â ñëó÷àå ïîäúåìà çàáîëåâàåìîñòè
íàñåëåíèÿ êèøå÷íûìè âèðóñíûìè èíôåêöèÿìè, óðîâåíü êîòîðîé ïðåâûøàåò ñðåäíèå ñåçîííûå ïîêàçàòåëè, à
òàêæå ïðè âñïûøêå èëè ýïèäåìèè âîäíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ.
Ýêñòðåííûé êîíòðîëü è êîíòðîëü ïî ñàíèòàðíî-ýïèäåìèîëîãè÷åñêèì ïîêàçàíèÿì îñóùåñòâëÿþòñÿ ïî
ñîãëàñîâàíèþ çàèíòåðåñîâàííûõ ñïåöèàëèñòîâ (ýïèäåìèîëîãà, ñàíèòàðíîãî âðà÷à, áàêòåðèîëîãà, âèðóñîëîãà)
è ïðåäóñìàòðèâàþò áîëåå ÷àñòûå èññëåäîâàíèÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ óñòàíîâëåííûìè â ïðîãðàììå òåêóùåãî êîíòðîëÿ.
1.2. Âèðóñîëîãè÷åñêèå ïîêàçàòåëè êà÷åñòâà
ïèòüåâîé âîäû
Ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêèé êîíòðîëü êà÷åñòâà ïèòüåâîé âîäû ïðåäóñìàòðèâàåò èññëåäîâàíèÿ ïî äâóì
ïîêàçàòåëÿì:
− íàëè÷èå èëè îòñóòñòâèå êîëèôàãîâ â 100 ìë âîäû (ÁÎÅ);
− íàëè÷èå èëè îòñóòñòâèå èíôåêöèîííûõ ýíòåðîâèðóñîâ (âèðóñîâ ïîëèîìèåëèòà, ÅÑÍÎ, Êîêñàêè À è Â) â
1000 ë âîäû (ÒÖÄ50/ìë).
Îñíîâíûì êîíòðîëèðóåìûì ïîêàçàòåëåì ÿâëÿþòñÿ êîëèôàãè, êîòîðûå â ñîîòâåòñòâèè ñ ðàáî÷åé ïðîãðàììîé
îïðåäåëÿþòñÿ êàê â âîäîèñòî÷íèêàõ, òàê è â âîäå ðàñïðåäåëèòåëüíîé ñåòè.
#
Ïðè îáíàðóæåíèè â ïðîáå (100 ìë) ïèòüåâîé âîäû êîëèôàãîâ ïðîâîäèòñÿ èõ îïðåäåëåíèå â ïîâòîðíî âçÿòîé
â ýêñòðåííîì ïîðÿäêå ïðîáå (â òå÷åíèå ñóòîê). Ïðè îáíàðóæåíèè êîëèôàãîâ â ïîâòîðíî âçÿòîé ïðîáå âîäû
ïðîâîäÿòñÿ èññëåäîâàíèÿ íà ýíòåðîâèðóñû.
2. ÎÖÅÍÊÀ ÝÏÈÄÅÌÈ×ÅÑÊÎÉ ÁÅÇÎÏÀÑÍÎÑÒÈ ÏÈÒÜÅÂÎÉ ÂÎÄÛ
Ïèòüåâàÿ âîäà äîëæíà áûòü áåçîïàñíà â ýïèäåìè÷åñêîì îòíîøåíèè. Êðèòåðèåì ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè
ïèòüåâîé âîäû ÿâëÿåòñÿ îòñóòñòâèå èçìåíåíèé â ñîñòîÿíèè çäîðîâüÿ íàñåëåíèÿ, îáóñëîâëåííûõ, íàðÿäó ñ äðóãèìè
ìèêðîáèîëîãè÷åñêèìè ôàêòîðàìè, âîçáóäèòåëÿìè âèðóñíûõ èíôåêöèé, ïåðåäàþùèõñÿ âîäíûì ïóòåì. Îñíîâíûì
ïðèíöèïîì ðåãëàìåíòèðîâàíèÿ âèðóñíîãî çàãðÿçíåíèÿ âîäû íà íàñòîÿùåì ýòàïå ðàçâèòèÿ ãèãèåíû, âèðóñîëîãèè
è ýïèäåìèîëîãèè ÿâëÿåòñÿ îòñóòñòâèå âîçáóäèòåëåé âèðóñíûõ èíôåêöèé â îïðåäåëåííîì îáúåìå âîäû äëÿ
êàæäîãî âèäà âîäîïîëüçîâàíèÿ.
Îöåíêà ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè ïèòüåâîé âîäû äîëæíà îñóùåñòâëÿòüñÿ èñõîäÿ èç íîðìàòèâîâ,
ïðåäñòàâëåííûõ â òàáë. 1.
Òàáëèöà 1
Âèðóñîëîãè÷åñêèå êðèòåðèè äëÿ îöåíêè
ýïèäåìè÷åñêîé áåçîïàñíîñòè ïèòüåâîé âîäû
Ïîêàçàòåëè
Åäèíèöà èçìåðåíèÿ
Íîðìàòèâû
Êîëèôàãè
ÁÎÅ
Îòñóòñòâèå â 100 ìë âîäû
Ýíòåðîâèðóñû
ÒÖÄ50/ìë
Îòñóòñòâèå â 1000 ë âîäû
3. ÌÅÒÎÄÛ ÑÀÍÈÒÀÐÍÎ-ÂÈÐÓÑÎËÎÃÈ×ÅÑÊÎÃÎ
ÊÎÍÒÐÎËß ÏÈÒÜÅÂÎÉ ÂÎÄÛ
Ñàíèòàðíî-âèðóñîëîãè÷åñêîå èññëåäîâàíèå ïèòüåâîé âîäû ïðîâîäèòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèâåäåííîé íà
ðèñ.1 ñõåìîé ïðèìåíåíèÿ âèðóñîëîãè÷åñêèõ, ñåðîëîãè÷åñêèõ è ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ. Îñíîâíûå
íåîáõîäèìûå ìàòåðèàëû, îáîðóäîâàíèå, ðåàêòèâû è ðå-àãåíòû ïðèâåäåíû â Ïðèëîæåíèÿõ 1 è 2.
3.1. Óëàâëèâàíèå âèðóñîâ èç âîäû
è èõ êîíöåíòðèðîâàíèå
Äëÿ óëàâëèâàíèÿ âèðóñíûõ àãåíòîâ èç âîäíîé ñðåäû èñïîëüçóåòñÿ ïðîòî÷íûé ìåòîä, îñíîâàííûé íà
ïðèìåíåíèè ñïåöèàëüíî èçãîòîâëåííûõ ëîâóøåê èëè ëîâóøå÷íûõ óñòðîéñòâ, âõîäÿùèõ â ñîñòàâ íàáîðîâ äëÿ
ñáîðà è êîíöåíòðèðîâàíèÿ âèðóñîâ. Äàííîå óñòðîéñòâî ñîñòîèò èç íàñàäêè íà âîäîïðîâîäíûé êðàí, ê êîòîðîé
ñ ïîìîùüþ ñèíòåòè÷åñêîé òðóáêè ïðèêðåïëåí äåðæàòåëü.  äåðæàòåëü, ñîñòîÿùèé èç äâóõ ñâèí÷èâàþùèõñÿ
÷àñòåé ñ ðåçüáîé, âñòàâëÿåòñÿ ñïåöèàëüíûé êàðòðèäæ-ëîâóøêà, âíóòðè êîòîðîãî íàõîäèòñÿ àäñîðáåíò,
$
ñîðáèðóþùèé âèðóñû èç âîäû. Ïðèìåíÿåìàÿ ëîâóøêà ÿâëÿåòñÿ îäíîðàçîâîé, à ñàìî óñòðîéñòâî ìîæåò
èñïîëüçîâàòüñÿ ïîñëå ñòåðèëèçàöèè ìíîãîêðàòíî â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé èíñòðóêöèåé.
3.1.1. Îáùèå ïðàâèëà îòáîðà ïðîá
Îòáîð ïðîá îñóùåñòâëÿþò â õàëàòå è ðåçèíîâûõ ïåð÷àòêàõ. Ïîñëå îêîí÷àíèÿ ðàáîòû ïåð÷àòêè îáðàáàòûâàþò
ñïèðòîì, à õàëàòû ñòåðèëèçóþò. Ïðîáû ìàðêèðóþò, óêàçûâàÿ íàñåëåííûé ïóíêò, òî÷êó îòáîðà, äàòó (÷èñëî,
ìåñÿö, ãîä), äîëæíîñòü è Ô.È.Î. ïðîèçâîäèâøåãî îòáîð. Ìàòåðèàë äîñòàâëÿþò â ëàáîðàòîðèþ â ìàêñèìàëüíî
êîðîòêèé ñðîê (íå áîëåå 6 ÷). Äîñòàâëåííûé ìàòåðèàë íåìåäëåííî îáðàáàòûâàþò.  ïîðÿäêå èñêëþ÷åíèÿ
äîïóñêàåòñÿ åãî õðàíåíèå ïðè òåìïåðàòóðå +4°Ñ±0,1°Ñ â òå÷åíèå îäíèõ ñóòîê. Êàæäóþ ïðîáó ðåãèñòðèðóþò â
ðàáî÷åì æóðíàëå.
3.1.2. Îòáîð ïðîá
Ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì â ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî âñòàâëÿþò ëîâóøêó, ïîñëå ÷åãî åãî çàâîðà÷èâàþò â áóìàãó
äëÿ ñòåðèëèçàöèè è ñòåðèëèçóþò ñóõèì æàðîì ïðè òåìïåðàòóðå 80°Ñ 45 ìèí. Ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî ñî
âñòàâëåííîé ëîâóøêîé äîñòàâëÿþò íà ìåñòî îòáîðà â ñòåðèëüíîé óïàêîâêå. Ïîñëå òðåõêðàòíîãî îáæèãàíè ÿ
âîäîïðîâîäíîãî êðàíà è ñïóñêà âîäû â òå÷åíèå 15 ìèí óñòàíàâëèâàþò íåîáõîäèìóþ ñêîðîñòü åå ïðîòåêàíèÿ —
1ë çà ~ 1,5 ìèí, ÷òî ñîñòàâëÿåò 40–45 ë/÷.  òî÷êå îòáîðà ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî èçâëåêàþò èç ñòåðèëüíîé
óïàêîâêè è óñòàíàâëèâàþò íà êðàí ñ ïîìîùüþ íàñàäêè. Îáúåì ïðîïóñêàåìîé âîäû äîëæåí ñîñòàâèòü 1000 ë.
Ñïóñòÿ 24 ÷ ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî ïîìåùàþò â ñòåðèëüíûé ïàêåò è äîñòàâëÿþò â âèðóñîëîãè÷åñêóþ
ëàáîðàòîðèþ. Ïîñëå èçâëå÷åíèÿ ëîâóøêè èñïîëüçîâàííîå ëîâóøå÷íîå óñòðîéñòâî ïîäâåðãàþò îáåççàðàæèâàíèþ
â 3%-ì ðàñòâîðå ïåðåêèñè âîäîðîäà â òå÷åíèå 12 ÷, çàòåì ìíîãîêðàòíî (íå ìåíåå 10 ðàç) ïðîìûâàþò â ïðîòî÷íîé
âîäå è âûñóøèâàþò äëÿ ïîñëåäóþùåé ñòåðèëèçàöèè è ïîâòîðíîãî èñïîëüçîâàíèÿ.
3.1.3. Îáðàáîòêà ïðîá è êîíöåíòðèðîâàíèå âèðóñîâ
Ëîâóøêó ñ àäñîðáåíòîì â ñòåðèëüíûõ óñëîâèÿõ èçâëåêàþò èç ëîâóøå÷íîãî óñòðîéñòâà è ïîìåùàþò â ÷àøêó
Ïåòðè. Ñ ïîìîùüþ íîæíèö ëîâóøêó âñêðûâàþò, ñîäåðæàùèéñÿ âíóòðè àäñîðáåíò âûìûâàþò â ÷àøêó Ïåòðè
ñòåðèëüíîé äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé â îáúåìå 5–10 ìë. Ïîëó÷åííóþ âçâåñü àäñîðáåíòà â äèñòèëëèðîâàííîé
âîäå ïåðåíîñÿò ñ ïîìîùüþ ïèïåòêè ñ îòïèëåííûì êîíöîì â ñòåêëÿííóþ êîëîíêó. Âûòåêàþùóþ èç êîëîíêè
âîäó ñîáèðàþò â ñòåðèëüíûé ïåíôëàêîí. Ýëþ-èðîâàíèå «óëîâëåííûõ» àäñîðáåíòîì âèðóñîâ îñóùåñòâëÿþò ñ
ïîìîùüþ ñïåöèàëüíîãî ýëþåíòà. Äàííûé ýëþåíò (10× êîíöåíòðàò) íàõîäèòñÿ â ñîñòàâå íàáîðà1 . Äëÿ ïîëó÷åíèÿ
ðàáî÷åãî ðàñòâîðà êîíöåíòðàò ýëþåíòà ðàçâîäÿò â ñòåðèëüíîé äèñòèëëèðîâàííîé âîäå â ñîîòíîøåíèè 1:10
(îáúåì ýëþåíòà/îáúåì âîäû). Âèðóñ ýëþèðóþò ïóòåì ïðîïóñêàíèÿ ýëþåíòà â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè â îáúåìå 3 ìë
÷åðåç ñòîëá àäñîðáåíòà â êîëîíêå. Ïîëó÷åííóþ ôðàêöèþ (ýëþàò) ñîáèðàþò â ñòåðèëüíûé ïåíôëàêîí. Äëÿ óäàëåíèÿ
áàêòåðèàëüíîé ôëîðû ñîáðàííûé ýëþàò îáðàáàòûâàþò õëîðîôîðìîì â ñîîòíîøåíèè 1/2 (îáúåì ïðîáû/îáúåì
õëîðîôîðìà). Ïîëó÷åííóþ ñìåñü âñòðÿõèâàþò â òå÷åíèå 10 ìèí íà øþòòåëü-àïïàðàòå, à çàòåì öåíòðèôóãèðóþò
Íàáîðû äëÿ ñáîðà è êîíöåíòðèðîâàíèÿ âèðóñîâ èç âîäû ïðîèçâîäÿòñÿ
â ÁåëÍÈÈÝÌ (220050 ã. Ìèíñê, óë. Ê. Öåòêèí, 4, òåë. ôàêñ. (0172) 226-52-63)
1
%
ïðè 2000 îá/ìèí 10 ìèí. Ïîñëå öåíòðèôóãèðîâàíèÿ âåðõíþþ ôàçó îñòîðîæíî îòáèðàþò ñ ïîìîùüþ ïèïåòêè â
ñòåðèëüíûé ôëàêîí. Äëÿ óäîáñòâà â ðàáîòå ïîëó÷åííûé ýëþàò ñðàçó ìîæíî ðàçäåëèòü íà ïîðöèè (àëèêâîòû) ïî
âèäàì èññëåäîâàíèÿ (êóëüòóðàëüíûå, ñåðîëîãè÷åñêèå, ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèå).
Èñïîëüçîâàííûé àäñîðáåíò çàëèâàþò 3%-ì ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà äëÿ îáåççàðàæèâàíèÿ íà 12 ÷.
Ýëþàò ìîæíî õðàíèòü ïðè òåìïåðàòóðå -20°Ñ íå áîëåå 6 ìåñ. ïðè òåìïåðàòóðå +4°Ñ íå áîëåå 3 ñóòîê. Ïðè ýòîì
àëèêâîòû ýëþàòà, ïðåäíàçíà÷åííûå äëÿ âèðóñîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé, íå ñëåäóåò ðàçìîðàæèâàòü áîëåå 2 ðàç.
3.2. Âûäåëåíèå ýíòåðîâèðóñîâ íà êóëüòóðàõ êëåòîê
3.2.1. Ðåêîìåíäóåìûå êóëüòóðû êëåòîê
Ñáîð âèðóñà â ïðîòî÷íîé ñèñòåìå ñ ïîìîùüþ
ëîâóøåê èëè ëîâóøå÷íîãî
óñòðîéñòâà
Ýëþèðîâàíèå àäñîðáèðîâàííîãî âèðóñà
ñ èñïîëüçîâàíèåì êîëîíêè
Ýëþàò
Îáíàðóæåíèå àíòèãåíîâ âèðóñà ãåïàòèòà À è ðîòàâèðóñà ñ ïîìîùüþ ÈÔÀ
Îáíàðóæåíèå ÐÍÊ
ýíòåðîâèðóñîâ ñ
ïîìîùüþ ÐÒ-ÏÖÐ
Âûäåëåíèå âèðóñîâ íà 2 êóëüòóðàõ
êëåòîê
Èíäèêàöèÿ âèðóñ-
Èäåíòèôèêàöèÿ âû-
íûõ àíòèãåíîâ â
äåëåííûõ ÖÏÀ â ÐÍ
ÍÌÔÀ
Ðèñ. 1. Ñõåìà âûäåëåíèÿ êèøå÷íûõ âèðóñîâ èç âîäû è èõ èäåíòèôèêàöèÿ
&
Íàèáîëåå ÷àñòî äëÿ âûäåëåíèÿ ýíòåðîâèðóñîâ ïðèìåíÿþòñÿ ïåðåâèâàåìûå ëèíèè êëåòîê ÷åëîâåêà è îáåçüÿíû.
Ê íèì îòíîñÿòñÿ êëåòêè RD, BGM, â êîòîðûõ àêòèâíî ðåïðîäóöèðóþòñÿ âèðóñû ïîëèîìèåëèòà, Êîêñàêè À,
áîëüøèíñòâî âèðóñîâ ÅÑÍÎ; â Hep-2 ðåïðîäóöèðóþòñÿ âèðóñû Êîêñàêè Â, à òàêæå çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü âèðóñîâ
ÅÑÍÎ.  âèðóñîëîãè÷åñêèõ ëàáîðàòîðèÿõ ÐÁ äëÿ âûäåëåíèÿ ýíòåðîâèðóñîâ øèðîêî èñïîëüçóþòñÿ ïåðåâèâàåìûå
ëèíèè êëåòîê — FL è Vero, êîòîðûå òàêæå ÷óâñòâèòåëüíû ê ýíòåðîâèðóñàì.
Êðîìå ïåðåâèâàåìûõ, âåñüìà ÷óâñòâèòåëüíûìè ÿâëÿþòñÿ ïåðâè÷íûå è äèïëîèäíûå êóëüòóðû êëåòîê ÷åëîâåêà
è îáåçüÿíû. Ñðåäè íèõ â êà÷åñòâå íàèáîëåå ïîäõîäÿùèõ ìîæíî ðåêîìåíäîâàòü ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûå
êëåòêè ÏÝ× è ÔÝ×.
Äëÿ ðàáîòû èñïîëüçóþòñÿ êóëüòóðû êëåòîê ñî ñôîðìèðîâàííûì ìîíîñëîåì íà 2-å–3-è ñóòêè èõ ðîñòà in vitro.
3.2.2. Ðàáîòà ñ êóëüòóðîé êëåòîê
Ïðè ðàáîòå ñ êóëüòóðàìè êëåòîê îáÿçàòåëüíû ñîáëþäåíèå ïðàâèë àñåïòèêè è òùàòåëüíàÿ ïîäãîòîâêà
ñòåêëÿííîé ïîñóäû, ñðåä è ðåàãåíòîâ. Êóëüòèâèðîâàíèå êëåòîê ìîæíî îñóùåñòâëÿòü âî ôëàêîíàõ èç íåéòðàëüíîãî
ñòåêëà (íàïðèìåð ¹ 179, åìêîñòüþ 50 ìë), à òàêæå â ïðîáèðêàõ è ïåíôëàêîíàõ èëè â ïëàñòèêîâûõ ôëàêîíàõ è
ïëàíøåòàõ (96-, 24-ëóíî÷íûõ). Íà ïåðâîé ñòàäèè âûðàùèâàíèÿ êëåòêè ïîìåùàþò â ðîñòîâóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ
ñûâîðîòêó. Êàê òîëüêî êëåòêè îáðàçóþò ñïëîøíîé ìîíîñëîé, êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ìåíÿþò íà ïîääåðæèâàþùóþ,
êîòîðàÿ ïðåäíàçíà÷åíà äëÿ ïîääåðæàíèÿ êóëüòóð â æèçíåñïîñîáíîì ñîñòîÿíèè êàê ìîæíî äîëüøå áåç ñòèìóëÿöèè
èõ ðîñòà. Ýòî îáû÷íî äîñòèãàåòñÿ ñíèæåíèåì êîíöåíòðàöèè ñûâîðîòêè â ïèòàòåëüíîé ñðåäå äî 1–2 % èëè åå
îòñóòñòâèåì. Èñïîëüçóþò ïðåèìóùåñòâåííî ýìáðèîíàëüíóþ òåëÿ÷üþ ñûâîðîòêó, òàê êàê îíà ñïîñîáñòâóåò ðîñòó
êëåòîê è íå ñîäåðæèò èíãèáèòîðîâ ýíòåðîâèðóñîâ. Åñëè èñïîëüçóþò ñûâîðîòêó äðóãîãî ïðîèñõîæäåíèÿ, ñëåäóåò
ïðåäâàðèòåëüíî ïðîâåðèòü íàëè÷èå èíãèáèòîðîâ èçó÷àåìûõ âèðóñîâ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè êóëüòóð êëåòîê
ðåêîìåíäóåòñÿ ïðèìåíÿòü ñòàíäàðòíûå ïèòàòåëüíûå ñðåäû, ê êîòîðûì àäàïòèðîâàíû èñïîëüçóåìûå ëèíèè êëåòîê.
Ïðè ðàáîòå ñ êóëüòóðàìè êëåòîê ñëåäóåò ÷åòêî âûïîëíÿòü ìåòîäè÷åñêèå èíñòðóêöèè äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ
ìèêðîáíîé êîíòàìèíàöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð è çàùèòû îò êîíòàìèíàöèè êóëüòóðàëüíûìè ìàòåðèàëàìè
îêðóæàþùåãî ðàáî÷åãî ïðîñòðàíñòâà. Âñÿ ðàáîòà äîëæíà ïðîâîäèòüñÿ â ñïåöèàëüíûõ ñòåðèëüíûõ ïîìåùåíèÿõ
èëè ëàìèíàðíûõ áîêñàõ.
3.2.3. Ìîðôîëîãè÷åñêàÿ õàðàêòåðèñòèêà ÖÏÝ ýíòåðîâèðóñîâ â êóëüòóðàõ êëåòîê
Öèêë ðåïðîäóêöèè ýíòåðîâèðóñîâ â ÷óâñòâèòåëüíûõ êóëüòóðàõ äëèòñÿ 5–7 ÷. Ïðè ìèêðîñêîïèè
èíôèöèðîâàííûõ êóëüòóð ìîðôîëîãè÷åñêèå ïðîÿâëåíèÿ ðàçìíîæåíèÿ âèðóñîâ çàêëþ÷àþòñÿ â ðàâíîìåðíîé
ìåëêîçåðíèñòîé äåñòðóêöèè êëåòîê, âûðàæàþùåéñÿ â èõ îêðóãëåíèè è ïîñòåïåííîì îòñëîåíèè îò ñòåíêè
êóëüòóðàëüíûõ ôëàêîíîâ. Â îêðàøåííûõ ïîðàæåííûõ êëåòêàõ ìîæíî âèäåòü ýîçèíîôèëüíûå ìàññû, îòòåñíÿþùèå
ÿäðî ê ïåðèôåðèè (ïðîäóêòû âíóòðèêëåòî÷íîãî ðàçâèòèÿ âèðóñîâ). Ê ôàêòîðàì, îïðåäåëÿþùèì ìîðôîëîãè÷åñêóþ
êàðòèíó ÖÏÝ, è ñðîêàì åãî ïðîÿâëåíèÿ îòíîñÿòñÿ òàêæå êîíêðåòíûå óñëîâèÿ èññëåäîâàíèÿ, âàðèàöèè â
õèìè÷åñêîì ñîñòàâå è ðÍ êóëüòóðàëüíîé ñðåäû, òåìïåðàòóðå èíêóáàöèè, êîíöåíòðàöèè êëåòîê, ñðîêàõ èõ ðîñòà
in vitro è ìíîæåñòâåííîñòè çàðàæåíèÿ è ò. ä.
'
3.2.4. Ïîðÿäîê è òåõíèêà âûäåëåíèÿ ýíòåðîâèðóñîâ
Âûäåëåíèå ýíòåðîâèðóñîâ ñëåäóåò îñóùåñòâëÿòü ïàðàëëåëüíî íå ìåíåå ÷åì íà äâóõ êóëüòóðàõ êëåòîê, ïðè
âûáîðå êîòîðûõ ñëåäóåò ó÷èòûâàòü èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ðàçíûì âèðóñíûì òèïàì ñ öåëüþ ñîçäàíèÿ
áëàãîïðèÿòíûõ óñëîâèé äëÿ ðàçìíîæåíèÿ êàê ìîæíî áîëåå øèðîêîãî ñïåêòðà ýíòåðîâèðóñíûõ àãåíòîâ. Íàïðèìåð:
RD + Hep-2; Hep-2 + BGM; RD + BGM; ÔÝ× + RD è ò. ä. Âûäåëåíèå ïðîèçâîäèòñÿ â òðåõ ïîñëåäîâàòåëüíûõ
ïàññàæàõ. Íèæåîïèñàííàÿ òåõíèêà âûäåëåíèÿ âèðóñîâ êàñàåòñÿ îñóùåñòâëåíèÿ ïðîöåäóðû íà ïðîáèðêàõ èëè
ïåíôëàêîíàõ ñ îáùèì îáúåìîì çàëèâàåìîé æèäêîñòè 1 ìë.
−  ïðîáèðêàõ (ïåíôëàêîíàõ) ñ õîðîøî ñôîðìèðîâàííûì êëåòî÷íûì ìîíîñëîåì çàìåíÿþò ðîñòîâóþ ñðåäó
íà ïîääåðæèâàþùóþ ñ 1–2% ñûâîðîòêè êðîâè ýìáðèîíîâ êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà è äîáàâëåíèåì àíòèáèîòèêîâ:
ãåíòàìèöèíà Ê â äîçå 80–100 ìêã/ìë, àìôîòåðèöèíà  — 2,5 ìêã/ìë. Ïðè êóëüòèâèðîâàíèè êëåòîê â èíêóáàòîðå
áåç ñîäåðæàíèÿ ÑÎ2 ðåêîìåíäóåòñÿ äëÿ ñòàáèëèçàöèè ðÍ â ñèíòåòè÷åñêèå ñðåäû äîáàâëÿòü áóôåð Hepes (25 ìÌ).
− Íà ýòèêåòêå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíà) îáîçíà÷àþò ðåãèñòðàöèîííûé íîìåð ïðîáû ïî æóðíàëó, ãîä, âèä
êëåòî÷íîé êóëüòóðû, íîìåð ïàññàæà.
− Â äâå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíà) ñ êóëüòóðîé êëåòîê êàæäîãî âèäà èíîêóëèðóþò ïî 0,2 ìë èññëåäóåìîé ïðîáû,
èíêóáèðóþò â ãîðèçîíòàëüíîì, ñëåãêà íàêëîíåííîì ïîëîæåíèè ïðè 36,5–37°Ñ â òåðìîñòàòå. Äëÿ êîíòðîëÿ
îñòàâëÿþò ïî íåñêîëüêî ïðîáèðîê (ïåíôëàêîíîâ) ñ êóëüòóðîé ñî ñìåíîé è áåç ñìåíû ñðåäû.
− Çà êóëüòóðîé êëåòîê íàáëþäàþò, ìèêðîñêîïèðóÿ èõ åæåäíåâíî è ñëåäÿ çà ïîÿâëåíèåì ÖÏÝ â ïåðåâèâàåìûõ
êóëüòóðàõ êëåòîê â òå÷åíèå 7–10 äíåé è â ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûõ êóëüòóðàõ êëåòîê 4–5 äíåé.
− Ïðè ïåðâûõ ïðèçíàêàõ ñòàðåíèÿ êîíòðîëüíûõ êóëüòóð êëåòîê (îáû÷íî 5–7 äíåé ïîñëå ïîñåâà ïåðåâèâàåìûõ
êóëüòóð êëåòîê è 4–6 ñóòîê äëÿ ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûõ è äèïëîèäíûõ) îïûòíûå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû)
çàìîðàæèâàþò ïðè -20°Ñ. Ìàòåðèàë 1-ãî ïàññàæà èñïîëüçóþò äàëåå â êà÷åñòâå çàðàæàþùåãî äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ
2-ãî ïàññàæà. Äëÿ ýòîãî îí òðåõêðàòíî çàìîðàæèâàåòñÿ–îòòàèâàåòñÿ, çàòåì âíîñèòñÿ â ñâåæóþ êóëüòóðó òîãî æå
âèäà êëåòîê â îáúåìå 0,2 ìë, ê êîòîðîìó ïðèáàâëÿåòñÿ 0,8 ìë ïîääåðæèâàþùåé ñðåäû. Çàðàæåííûå íà 2-ì
ïàññàæå ïåðåâèâàåìûå êóëüòóðû íàáëþäàþò åæåäíåâíî â òå÷åíèå 7 ñóòîê, à ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûå —
4–5 ñóòîê. Òðåòèé ïàññàæ èññëåäóåìîãî ìàòåðèàëà îñóùåñòâëÿþò àíàëîãè÷íî âòîðîìó. Îáùèé ïåðèîä íàáëþäåíèÿ
çà òðåìÿ ïàññàæàìè ñîñòàâëÿåò ~21 è 15 äíåé ñîîòâåòñòâåííî. Åñëè çà ýòî âðåìÿ õàðàêòåðíûé ýíòåðîâèðóñíûé
ÖÏÝ íå âûÿâëÿåòñÿ, òî ðåçóëüòàò îöåíèâàåòñÿ êàê îòðèöàòåëüíûé.  ñëó÷àå íàëè÷èÿ òèïè÷íîãî âèðóñíîãî ÖÏÝ
äåëàåòñÿ âûâîä î âûäåëåíèè ÖÏÀ, êîòîðûé äàëåå èäåíòèôèöèðóåòñÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì ðÿäà ìåòîäèê.
3.2.5. Îïðåäåëåíèå èíôåêöèîííîãî òèòðà ÖÏÀ è âûäåëåííûõ ýíòåðîâèðóñîâ
Âûäåëåííûå ÖÏÀ, äàþùèå áûñòðûé ÖÏÝ íà 3-ì ïàññàæå (â òå÷åíèå 1–2 äíåé ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ), íå
òðåáóþò îïðåäåëåíèÿ òèòðà ïåðåä ïîñòàíîâêîé îïûòîâ ïî èäåíòèôèêàöèè.  äàííîì ñëó÷àå ïðè èäåíòèôèêàöèè
èñïîëüçóþòñÿ ïðîèçâîëüíî âûáðàííûå ðàçâåäåíèÿ (103–10-4) ÖÏÀ-ñîäåðæàùåãî ìàòåðèàëà.  äðóãèõ ñëó÷àÿõ
íåîáõîäèìî ïðîâåñòè îïðåäåëåíèå òèòðà âûäåëåííîãî ÖÏÀ. Äëÿ ýòîãî ãîòîâÿò äåñÿòèêðàòíûå åãî ðàçâåäåíèÿ â
êóëüòóðàëüíîé ñðåäå. Ñíà÷àëà ðàçëèâàþò ñðåäó ïî 0,9 ìë â ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû), çàòåì â ïåðâóþ ïðîáèðêó
(ïåíôëàêîí) âíîñÿò 0,1 ìë öåëüíîãî (íåðàçâåäåííîãî) âèðóñà, íå äîòðàãèâàÿñü äî ñðåäû. Íîâîé ïèïåòêîé
ïåðåìåøèâàþò ñîäåðæèìîå ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíà), èçáåãàÿ âñïåíèâàíèÿ, è ïåðåíîñÿò ïî 0,1 ìë èç ïåðâîãî
ðàçâåäåíèÿ âî âòîðîå è ò. ä. Ñõåìàòè÷íî ýòó ïðîöåäóðó ìîæíî ïðåäñòàâèòü ñëåäóþùèì îáðàçîì:
Öåëüíûé âèðóñ 10-1 → 10-2 → 10-3 → 10-4
è ò. ä.
×òîáû èñêëþ÷èòü ïåðåíîñ èçáûòêà âèðóñà ïèïåòêîé, íåîáõîäèìî ñëåäîâàòü ïðàâèëó: ñìåøàé, ïåðåíåñè,
âûáðîñè. Äàëåå ïðèãîòîâëåííûìè ðàçâåäåíèÿìè âèðóñà èíôèöèðóþò êóëüòóðû êëåòîê ñ õîðîøî
ñôîðìèðîâàâøèìñÿ ìîíîñëîåì, íà êîòîðîì áûë ðàíåå âûäåëåí ÖÏÀ. Íà êàæäîå ðàçâåäåíèå ñ 10-1 äî 10-8
èñïîëüçóþò íå ìåíåå äâóõ ïðîáèðîê (ïåíôëàêîíîâ) ñ êóëüòóðîé êëåòîê, êóäà âíîñÿò ïî 0,9 ìë ñðåäû ïîääåðæêè
è ïî 0,1 ìë êàæäîãî ðàçâåäåíèÿ âèðóñà, íà÷èíàÿ ñ íàèáîëüøåãî. Ïðè ýòîì ïèïåòêó ìîæíî íå ìåíÿòü. Ïîñòàíîâêó
ìîæíî îñóùåñòâëÿòü ìèêðîìåòîäîì, èñïîëüçóÿ ìèêðîòèòðîâàëüíûå ïëîñêîäîííûå ïëàíøåòû (Ïðèëîæåíèå 1),
èëè ìàêðîìåòîäîì, èñïîëüçóÿ äëÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê ïðîáèðêè èëè ïåíôëàêîíû, à òàêæå ñòåðèëüíûå
ïëîñêîäîííûå 24-ëóíî÷íûå ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû. Òèòð âèðóñà (ÒÖÄ50/ìë) îïðåäåëÿåòñÿ êàê íàèáîëüøåå
ðàçâåäåíèå, êîòîðîå âûçûâàåò ÖÏÝ â 50% çàðàæåííûõ êëåòî÷íûõ êóëüòóð. Ðàññ÷èòûâàåòñÿ òèòð âèðóñà ïî
ôîðìóëå Êåðáåðà:
lg ÒÖÄ50 = L-d (S-0,5),
ãäå L — lg íàèìåíüøåãî ðàçâåäåíèÿ, èñïîëüçóåìîãî â òèòðîâàíèè;
d — èíòåðâàë â lg ìåæäó äâóìÿ ïîñëåäîâàòåëüíûìè ðàçâåäåíèÿìè;
S — ñóììà ïðîïîðöèé ïîëîæèòåëüíûõ òåñò-åäèíèö (ò.å. ëóíîê èëè ïðîáèðîê ñ êóëüòóðîé, ãäå ïðîÿâèëñÿ
ÖÏÝ) â êàæäîì ðàçâåäåíèè.
Ïðèìåð:
Ðàçâåäåíèå âèðóñà
Äîëÿ êóëüòóð ñ ÖÏÝ
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
2/2 = 1
2/2 = 1
2/2 = 1
1/2 = 0,5
1/2 = 0,5
0/2 = 0
0/2 = 0
0/2 = 0
lg ÒÖÄ50 = -1 -1(4 - 0,5) = -4,5
Ôîðìóëà Êåðáåðà èñïîëüçóåò «îòðèöàòåëüíûé ëîãàðèôì». 10-4,5 — ýòî êîíå÷íîå ðàçâåäåíèå, ñîäåðæàùåå 1
ÒÖÄ50 â åäèíèöå îáúåìà. Ïðè îêîí÷àòåëüíîì âûðàæåíèè èíôåêöèîííîé àêòèâíîñòè ñëåäóåò óêàçûâàòü îáúåì
âèðóñíûõ ðàçâåäåíèé, âíîñèìûõ â êàæäóþ êóëüòóðó êëåòîê (â äàííîì ñëó÷àå 0,1 ìë).
Òàêèì îáðàçîì, èíôåêöèîííàÿ àêòèâíîñòü âèðóññîäåðæàùåãî ìàòåðèàëà (òèòð âèðóñà) ñîñòàâëÿåò 10-4,5 ÒÖÄ50
â 0,1 ìë, ò. å.
òèòð âèðóñà = 4,5 lg ÒÖÄ50/0,1ìë
Òèòðîâàíèå ýíòåðîâèðóñîâ îñóùåñòâëÿåòñÿ àíàëîãè÷íî âûøåîïèñàííîé äëÿ ÖÏÀ ïðîöåäóðå. Ïðè ýòîì âàæíî
ïîìíèòü, ÷òî ëþáûå èçìåíåíèÿ â èñïîëüçóåìîé êëåòî÷íîé ñèñòåìå, îáúåìàõ âèðóñíîãî ìàòåðèàëà èëè äíåé
ó÷åòà ðåçóëüòàòîâ îïûòà äåëàþò íåîáõîäèìûì ïîâòîðíîå òèòðîâàíèå èñõîäíîãî âèðóñíîãî ìàòåðèàëà. Ãðóïïà
ýíòåðîâèðóñîâ õàðàêòåðèçóåòñÿ âûñîêîé ñòàáèëüíîñòüþ ïðè õðàíåíèè ïðè -20°Ñ, ïîýòîìó èõ òèòðû îáû÷íî
âîñïðîèçâîäèìû è ïîñëå îòòàèâàíèÿ âî âðåìÿ ïîäãîòîâêè ê èññëåäîâàíèþ.
3.3. Èäåíòèôèêàöèÿ âûäåëåííûõ ÖÏÀ â ÐÍ
Ñóùíîñòü ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â ñïîñîáíîñòè èììóííîé ñûâîðîòêè íåéòðàëèçîâàòü ñîîòâåòñòâóþùèé åé
òèï âèðóñà. Îñíîâíîé ýôôåêò â êóëüòóðå êëåòîê çàêëþ÷àåòñÿ â ðàçðóøàþùåì öèòîïàòîãåííîì äåéñòâèè âèðóñà
íà êëåòêè ïðè îòñóòñòâèè òàêîâîãî â ñëó÷àå íåéòðàëèçàöèè èíôåêöèîííîñòè âèðóñà ñîîòâåòñòâóþùåé åìó
ñûâîðîòêîé. Ïîñòàíîâêó ìåòîäà ìîæíî ïðîâåñòè, èñïîëüçóÿ ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû ñ ïëîñêèì äíîì
(ìèêðîìåòîä) èëè ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) ñ êóëüòóðîé êëåòîê (ìàêðîìåòîä). Âìåñòî ïðîáèðîê (ïåíôëàêîíîâ)
â ìàêðîìåòîäå ìîæíî èñïîëüçîâàòü ñòåðèëüíûå ïëàñòèêîâûå ïëîñêîäîííûå 24-ëóíî÷íûå ïëàíøåòû. Ìèêðîìåòîä
ÿâëÿåòñÿ áîëåå ýêîíîìè÷íûì, òàê êàê ðàñõîäóåòñÿ ìåíüøå äîðîãîñòîÿùèõ äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê è äðóãèõ
êîìïîíåíòîâ, îäíàêî çíà÷èòåëüíî âîçðàñòàåò âîçìîæíîñòü ïåðåêðåñòíîé âèðóñíîé êîíòàìèíàöèè ìåæäó
èçîëÿòàìè. Ìàêðîìåòîä òðåáóåò áîëüøèõ îáúåìîâ ðåàãåíòîâ, íî èìååò è ïðåèìóùåñòâî: êàæäàÿ îòäåëüíàÿ
ïðîáèðêà (ïåíôëàêîí) îòêðûâàåòñÿ òîëüêî îäèí ðàç. Åñëè èç îäíîãî è òîãî æå ìàòåðèàëà ÖÏÀ âûäåëåí â ðàçíûõ
êëåòî÷íûõ êóëüòóðàõ, íåîáõîäèìî ïðîâîäèòü èäåíòèôèêàöèþ îáîèõ èçîëÿòîâ, òàê êàê ïåðìèññèâíîñòü ðàçíûõ
ëèíèé êëåòîê äëÿ ðàçëè÷íûõ òèïîâ ýíòåðîâèðóñîâ íåîäèíàêîâà. Ïðè ïîñòàíîâêå ÐÍ íà êóëüòóðå êëåòîê
ñîáëþäàþòñÿ ðàâíûå êîëè÷åñòâåííûå è îáúåìíûå ñîîòíîøåíèÿ âèðóññîäåðæàùåé æèäêîñòè è äèàãíîñòè÷åñêîé
ñûâîðîòêè.  ðåàêöèþ âêëþ÷àåòñÿ ìàòåðèàë, ñîñòîÿùèé èç 100 ÒÖÄ50/ìë âèðóñà è ñûâîðîòêè, ñîäåðæàùåé 20
âèðóñíåéòðàëèçóþùèõ åäèíèö.
3.3.1. Ïðèãîòîâëåíèå ðàáî÷èõ ðàçâåäåíèé äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê
Äëÿ èäåíòèôèêàöèè ýíòåðîâèðóñíûõ èçîëÿòîâ âíà÷àëå èñïîëüçóþò ãðóïïîñïåöèôè÷åñêèå ãîìîëîãè÷íûå
äèàãíîñòè÷åñêèå ñûâîðîòêè1 ê ñëåäóþùèì ãðóïïàì ýíòåðîâèðóñîâ:
à) âèðóñó ïîëèîìèåëèòà 1–3;
á) Êîêñàêè  1–6; Êîêñàêè À 1–5, 6–10, 11–15, 16–19, 20–24;
â) ÅÑÍÎ 1–6, 7–13, 14–24, 15–22, 25–32;
ã) ýíòåðîâèðóñàì 68, 69, 70, 71.
Ïåðåä ïîñòàíîâêîé ÐÍ ñóõóþ ñûâîðîòêó, ñîáëþäàÿ ñòåðèëüíîñòü, ðàñòâîðÿþò â óïàêîâî÷íîé àìïóëå â 1 ìë
ñòåðèëüíîé äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ìîæíî ðàñôàñîâàòü è çàìîðîçèòü ïðè
-20°Ñ. Ïåðåä ðàáîòîé ñûâîðîòêó èíàêòèâèðóþò ïðè 56°Ñ â òå÷åíèå 30 ìèí, à çàòåì ðàçâîäÿò äî ðàáî÷åãî
ðàçâåäåíèÿ, óêàçàííîãî íà ýòèêåòêå, ïèòàòåëüíîé ñðåäîé èëè ðàñòâîðîì Õåíêñà. Ðàçâåäåííûå ñûâîðîòêè ìîæíî
õðàíèòü ïðè +4°Ñ â òå÷åíèå 14 äíåé.
Ïðè âûÿâëåíèè íåéòðàëèçàöèè èññëåäóåìîãî âèðóñà îäíîé èç ñìåñåé ãðóïïîâûõ ñûâîðîòîê ïðîâîäèòñÿ
ðàçäåëüíîå òèïèðîâàíèå âèðóñà ñ èñïîëüçîâàíèåì êàæäîé òèïîñïåöèôè÷åñêîé ñûâîðîòêè, âîøåäøåé â ñîñòàâ
äàííîé ãðóïïîâîé ñìåñè. Äëÿ òèïèðîâàíèÿ âèðóñà ïîëèîìèåëèòà ãîòîâÿò òðè ñìåñè ïîëèâàëåíòíûõ ãðóïïîâûõ
èììóííûõ ñûâîðîòîê: Ð1+Ð2; Ð1+Ð3; Ð2+Ð3. Ïðè ýòîì ñûâîðîòêè ðàçâîäÿò â äâà ðàçà ìåíüøå, ÷åì óêàçàíî íà
ýòèêåòêå, ó÷èòûâàÿ èõ äàëüíåéøåå ñìåøèâàíèå.
3.3.2. Ïðèãîòîâëåíèå ñìåñåé âèðóñà è àíòèñûâîðîòîê äëÿ ÐÍ
Èç ðàâíûõ îáúåìîâ ñîñòàâëÿþò: ñìåñü ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ ñûâîðîòêè è ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ
âèðóññîäåðæàùåé æèäêîñòè êàæäîãî èñïûòóåìîãî øòàììà (âèðóñ + àíòèñûâîðîòêà); ñìåñü òåõ æå ðàçâåäåíèé
âèðóññîäåðæàùåé æèäêîñòè è ðàçáàâèòåëÿ (êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà èëè ðàñòâîð Õåíêñà) äëÿ êîíòðîëÿ äåéñòâèÿ
âèðóñà (êîíòðîëü âèðóñà); ñìåñü ðàáî÷èõ ðàçâåäåíèé ñûâîðîòêè è ðàçáàâèòåëÿ äëÿ êîíòðîëÿ òîêñè÷åñêîãî
äåéñòâèÿ ñûâîðîòêè (êîíòðîëü ñûâîðîòêè). Êàæäûé èíãðåäèåíò âõîäèò â ñîñòàâ ñìåñè â îáúåìå 0,25 ìë ïðè
ïîñòàíîâêå ìàêðîìåòîäà è 0,05 ìë ïðè ïîñòàíîâêå ìèêðîìåòîäà. Ñìåñè èíêóáèðóþò ïðè òåìïåðàòóðå 36°–
36,5°Ñ â òå÷åíèå 1 ÷àñà èëè ïðè òåìïåðàòóðå +4°Ñ â òå÷åíèå 18 ÷.
3.3.3. Ïîñòàíîâêà ìàêðîìåòîäà ÐÍ
− Ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) ñ êóëüòóðîé êëåòîê (ïî äâå ïðîáèðêè èëè ïåíôëàêîíà íà êàæäóþ ñìåñü) ìàðêèðóþò
è îñóùåñòâëÿþò ñìåíó ðîñòîâîé ñðåäû íà 0,8 ìë ïîääåðæèâàþùåé.
− Ïåðåíîñÿò ïî 0,2 ìë ñìåñè âèðóñà ñ àíòèñûâîðîòêîé â êàæäóþ ïðîáèðêó (ïåíôëàêîí).
− Ñòàâÿò ñîîòâåòñòâóþùèå êîíòðîëè:
à) êîíòðîëü ðàáî÷åãî ðàçâåäåíèÿ âèðóñà,
á) êîíòðîëü òîêñè÷íîñòè äèàãíîñòè÷åñêîé ñûâîðîòêè,
â) êîíòðîëü òèòðà âèðóñà,
ã) êîíòðîëü êëåòîê (ñî ñìåíîé ðîñòîâîé ñðåäû íà ïîääåðæèâàþùóþ è áåç ñìåíû ðîñòîâîé ñðåäû).
− Èíêóáèðóþò ïðîáèðêè (ïåíôëàêîíû) â ñòàöèîíàðíîì íàêëîííîì ïîëîæåíèè ïðè 36,5°Ñ–37°Ñ.
− Åæåäíåâíî ïðîáèðêè ìèêðîñêîïèðóþò äî îáíàðóæåíèÿ ïîëíîãî ÖÏÝ âèðóñà (îáû÷íî 3 äíÿ).
Àíòèñûâîðîòêà, êîòîðàÿ ñäåðæèâàåò ðàçâèòèå ÖÏÝ âèðóñà, íàõîäÿùåãîñÿ â ñìåñè ñ íåé, óêàçûâàåò íà òèï
âûäåëåííîãî âèðóñà.
3.3.4. Ïîñòàíîâêà ìèêðîìåòîäà ÐÍ
Ïîñòàíîâêà ïðîèçâîäèòñÿ â ïëîñêîäîííûõ 96-ëóíî÷íûõ ïàíåëÿõ ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè â
ðîñòîâîé ñðåäå â îáúåìå 0,1 ìë è ñìåñè àíòèñûâîðîòêè ñ âèðóñîì â òàêîì æå îáúåìå íà îäíó ëóíêó. Òàêèì îáðàçîì,
îáùèé îáúåì âíîñèìûõ èíãðåäèåíòîâ ñîñòàâëÿåò 0,2 ìë íà îäíó ëóíêó. Ìåòîä âêëþ÷àåò ñëåäóþùóþ
ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ýòàïîâ:
!
− ðàáî÷åå ðàçâåäåíèå ñûâîðîòêè â êîëè÷åñòâå 50 ìêë ñìåøèâàþò â ëóíêàõ ìèêðîïàíåëåé ñ 50 ìêë
èññëåäóåìîãî àãåíòà ñ òèòðîì 100 ÒÖÄ50/ìë. Äëÿ àãåíòîâ, êîòîðûå â ïàññàæå áûñòðî âûçûâàþò ÖÏÝ (â òå÷åíèå
ïåðâûõ 2-õ ñóòîê), îáû÷íî èñïîëüçóþò ðàçâåäåíèÿ 10-3 è 10-4, à äëÿ âèðóñîâ, êîòîðûå âûçûâàþò ÖÏÝ â áîëåå
ïîçäíèå ñðîêè, — 10-1 è 10-2;
− â êîíòðîëè êëåòîê âíîñÿò íà ëóíêó 100 ìêë ïèòàòåëüíîé ñðåäû ñ 2% òåëÿ÷üåé ýìáðèîíàëüíîé ñûâîðîòêîé
(ÒÝÑ);
− â êîíòðîëè âèðóñà âíîñÿò íà ëóíêó 50 ìêë òîé æå ñðåäû è 50 ìêë èññëåäóåìîãî âèðóñà â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè
(100 ÒÖÄ50/ìë);
− ìèêðîïàíåëè ïîìåùàþò â ÑÎ2-èíêóáàòîð ïðè +36°– 36,5°Ñ íà 1 ÷ äëÿ êîíòàêòà âèðóñà ñî ñïåöèôè÷åñêèìè
ñûâîðîòêàìè;
− ïîñëå êîíòàêòà âî âñå ëóíêè äîáàâëÿþò ïî 100 ìêë ñóñïåíçèè êóëüòóð êëåòîê: ïåðåâèâàåìûõ — 200–250 è
ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûõ — 500 òûñ. êëåòîê â 1 ìë ïèòàòåëüíîé ñðåäû;
− ìèêðîïàíåëè çàêðûâàþò ñòåðèëüíîé êëåéêîé ëåíòîé è ïîìåùàþò â ÑÎ 2-èíêóáàòîð; åæåäíåâíî
ïðîñìàòðèâàþò ïîä èíâåðòèðîâàííûì ìèêðîñêîïîì, îêàí÷èâàþò ó÷åò ðåçóëüòàòîâ ïîñëå âûÿâëåíèÿ 100% ÖÏÝ
â ëóíêàõ êîíòðîëÿ âèðóñà.
3.4. Îáíàðóæåíèå âèðóñíîãî ìàòåðèàëà â ïðîáàõ âîäû
 íàñòîÿùåå âðåìÿ äëÿ ýêñïðåññ-îáíàðóæåíèÿ âèðóñîâ èñïîëüçóåòñÿ êîìïëåêñ âèðóñîëîãè÷åñêèõ,
ñåðîëîãè÷åñêèõ è ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ èññëåäîâàíèÿ, êîòîðûå âêëþ÷àþò: èììóíîôåðìåíòíûé
àíàëèç (ÈÔÀ) äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ âèðóñà ãåïàòèòà À (ÂÃÀ) è ðîòàâèðóñîâ, íåïðÿìîé ìåòîä
ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë (ÍÌÔÀ) äëÿ îïðåäåëåíèÿ àíòèãåíîâ ýíòåðîâèðóñîâ, ìåòîä ïîëèìåðàçíîé öåïíîé
ðåàêöèè ñî ñòàäèåé îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè (ÐÒ-ÏÖÐ) äëÿ îáíàðóæåíèÿ âèðóñíîé ÐÍÊ.
3.4.1. Îáíàðóæåíèå àíòèãåíîâ ÂÃÀ è ðîòàâèðóñîâ ìåòîäîì ÈÔÀ
Ìåòîä ÈÔÀ âåñüìà ñïåöèôè÷åí, îáëàäàåò âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ è âîñïðîèçâîäèìîñòüþ. Èíãðåäèåíòû
ðåàêöèè ñòàáèëüíû è íå òðåáóþò ñïåöèàëüíûõ ìåð ïðåäîñòîðîæíîñòè. Ê ïðåèìóùåñòâàì ìåòîäà îòíîñèòñÿ
òàêæå âîçìîæíîñòü èññëåäîâàíèÿ èíôåêöèîííîãî è èíàêòèâèðîâàííîãî ìàòåðèàëà áåç äëèòåëüíîãî ýòàïà
íàêîïëåíèÿ åãî â êóëüòóðå êëåòîê. Ó÷åò ïðîâîäÿò ôîòîìåòðè÷åñêè, íà èììóíîôåðìåíòíîì àíàëèçàòîðå èëè
ìóëüòèñêàíå ïðè äëèíå âîëíû 492 íì èëè âèçóàëüíî ïî èíòåíñèâíîñòè îêðàñêè, ÷òî òàêæå äàåò ïðåèìóùåñòâî
â ïðàêòè÷åñêîé ðàáîòå.
1
Äàííûé íàáîð äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê ìîæíî ïðèîáðåñòè â Èíñòèòóòå ïîëèîìèåëèòà è âèðóñíûõ ýíöåôàëèòîâ èì. Ì.Ï.×óìàêîâà, ã.
Ìîñêâà
"
Äëÿ îáíàðóæåíèÿ ìîæíî èñïîëüçîâàòü êîììåð÷åñêèå òåñò-ñèñòåìû ïðîèçâîäñòâà ÁåëÍÈÈÝÌ ÌÇ ÐÁ
(ã. Ìèíñê).  ñâÿçè ñ òåì, ÷òî ÂÃÀ è ðîòàâèðóñû â ïèòüåâîé âîäå ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü â î÷åíü íèçêèõ
êîíöåíòðàöèÿõ, êîòîðûå íàõîäÿòñÿ çà ïðåäåëàìè ïîðîãîâîé ÷óâñòâèòåëüíîñòè äàííûõ ñèñòåì, íåîáõîäèìî:
1) èñïîëüçîâàíèå ñïåöèàëüíîãî ìåòîäà êîíöåíòðèðîâàíèÿ, ïðåäóñìîòðåííîãî ïðè îòáîðå ïðîá âîäû
(ðàçäåë 3.1.);
2) èçìåíåíèå óñëîâèé ñåíñèáèëèçàöèè òâåðäîé ôàçû èììóíîãëîáóëèíîì ïóòåì óâåëè÷åíèÿ âðåìåíè
êîíòàêòà äî 1 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå 37°Ñ ñ ïîñëåäóþùèì êîíòàêòîì â òå÷åíèå 16–18 ÷ ïðè êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå. Îñòàëüíûå ýòàïû ïîñòàíîâêè ÈÔÀ ïðîèçâîäÿòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé ê òåñòñèñòåìàì èíñòðóêöèåé.
3.4.2. Âûÿâëåíèå âèðóñíûõ àíòèãåíîâ ñ ïîìîùüþ ÍÌÔÀ
Ìåòîä ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë îáåñïå÷èâàåò âèçóàëüíîñòü ðåàêöèè ìåæäó àíòèãåíîì è àíòèòåëîì è
íàõîäèò ïðèìåíåíèå òàì, ãäå èìååòñÿ ëþìèíåñöåíòíûé ìèêðîñêîï, àíòèâèäîâàÿ ìå÷åííàÿ ôëóîðîõðîìîì
ñûâîðîòêà, íàáîð äèàãíîñòè÷åñêèõ ñûâîðîòîê. Ýòîò ìåòîä øèðîêî èñïîëüçóåòñÿ â âèðóñîëîãèè áëàãîäàðÿ
ñâîåé ñïåöèôè÷íîñòè, äîñòóïíîñòè, áûñòðîòå è îòíîñèòåëüíîé ïðîñòîòå. ÍÌÔÀ äåëàåò âîçìîæíûì
ìîðôîëîãè÷åñêîå èçó÷åíèå ïðîöåññîâ âçàèìîîòíîøåíèÿ âèðóñîâ ñ êëåòêàìè, à òàêæå èññëåäîâàíèå
äèíàìèêè íàêîïëåíèÿ âèðóñíûõ àíòèãåíîâ â êëåòêå è àíòèãåííûõ ñâÿçåé âèðóñîâ. Äëÿ èíäèêàöèè âèðóñíûõ
àíòèãåíîâ æåëàòåëüíî âûáèðàòü îïòèìàëüíûå ñðîêè íàáëþäåíèÿ, êîãäà â êóëüòóðå óæå èìååòñÿ äîñòàòî÷íî
áîëüøîå êîëè÷åñòâî èíôèöèðîâàííûõ êëåòîê, íî åùå îòñóòñòâóþò çíà÷èòåëüíûå äåãåíåðàòèâíûå èçìåíåíèÿ,
ïðèâîäÿùèå ê ãèáåëè è ñïîñîáñòâóþùèå íåñïåöèôè÷åñêîé îêðàñêå òàêèõ ñòðóêòóð.
3.4.2.1. Ïðèãîòîâëåíèå ïðåïàðàòîâ èíôèöèðîâàííûõ êëåòîê
Ïðîöåäóðà ïðèãîòîâëåíèÿ:
− êóëüòóðó êëåòîê (Hep-2, FL, RD, Vero) ñ ïîñåâíîé äîçîé 100–150 òûñ. êëåòîê/ìë âûðàùèâàþò íà
ïîêðîâíûõ ñòåêëàõ â ïðîáèðêàõ èëè ïåíôëàêîíàõ;
− ê íå ïîëíîñòüþ ñôîðìèðîâàííîìó ìîíîñëîþ êëåòîê (2-å ñóòêè in vitro) äîáàâëÿþò âûäåëåííûé ðàíåå
íà êóëüòóðå èññëåäóåìûé ÖÏÀ èëè âèðóñ â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè (100 ÒÖÄ50 /ìë) ïî 0,2 ìë íà 2 ìë
ïîääåðæèâàþùåé ñðåäû;
− êóëüòóðó êëåòîê èíêóáèðóþò ñ èññëåäóåìûì ìàòåðèàëîì â òå÷åíèå 12–16 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå 36–36,5°Ñ;
− êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü óäàëÿþò èç ïðîáèðîê èëè ïåíôëàêîíîâ, à ñòåêëà ïðîìûâàþò ôèçðàñòâîðîì
èëè ôîñôàòíî-ñîëåâûì áóôåðîì (ðÍ 7,2–7,4);
− êëåòêè íà ñòåêëàõ ôèêñèðóþò îõëàæäåííûì äî -20°Ñ àöåòîíîì èëè ñìåñüþ àöåòîí:ìåòàíîë (1:1).
Ïîëó÷åííûå ïðåïàðàòû ìîæíî õðàíèòü ïðè -20°Ñ.
#
3.4.2.2. Ïîñòàíîâêà ÍÌÔÀ
Îñíîâíûå ýòàïû:
− ïðèêðåïèòü ïîêðîâíûå ñòåêëà ñ êëåòêàìè íà ïðåäìåòíîì ñòåêëå è ïðîíóìåðîâàòü;
− íàíåñòè íà ôèêñèðîâàííûå êëåòêè ñ àíòèãåíîì äèàãíîñòè÷åñêèå ñûâîðîòêè (êðîëè÷üè) â ðàáî÷èõ
ðàçâåäåíèÿõ, óêàçàííûõ íà ýòèêåòêå;
− ïîìåñòèòü ñòåêëà ñ íàíåñåííîé ñûâîðîòêîé âî âëàæíóþ êàìåðó è ïîñòàâèòü â òåðìîñòàò ïðè 37°Ñ íà 30–
45 ìèí;
− ïîñëå îêîí÷àíèÿ èíêóáàöèè ïðîìûòü ñòåêëà òðèæäû â ñîëåâîì ôîñôàòíîì áóôåðå ïî 5–7 ìèí è ïîäñóøèòü
íà âîçäóõå;
− íàíåñòè íà ôèêñèðîâàííûå êëåòêè àíòèñûâîðîòêó ïðîòèâ ãëîáóëèíîâ êðîëèêà, ìå÷åííóþ ÔÈÒÖ, â ðàáî÷åì
ðàçâåäåíèè; äëÿ óäàëåíèÿ íåñïåöèôè÷åñêîãî ñâå÷åíèÿ ìîæíî äîáàâèòü ýâàíñ-ãîëóáîé â êîíöåíòðàöèè 0,005%
èëè àëüáóìèí, ìå÷åííûé ðîäàìèíîì, â ðàáî÷åì ðàçâåäåíèè, ñîãëàñíî ïðèëàãàåìîé èíñòðóêöèè (ïðîèçâîäñòâî
Èíñòèòóòà ïîëèîìèåëèòà, ã. Ìîñêâà);
− ïîìåñòèòü ñòåêëà âî âëàæíóþ êàìåðó è èíêóáèðîâàòü ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 30–45 ìèí;
− ïîñëå îêîí÷àíèÿ èíêóáàöèè ïðîìûòü ñòåêëà îäèí ðàç â ôîñôàòíî-ñîëåâîì áóôåðå (ðÍ 7,2–7,4) ïî 5 ìèí è
äâàæäû â äèñòèëëèðîâàííîé âîäå ïî 10 ìèí;
− ïàðàëëåëüíî ñ îïèñàííûìè âûøå ìàíèïóëÿöèÿìè ïîñòàâèòü êîíòðîëè ñïåöèôè÷íîñòè ñâå÷åíèÿ â
ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé ê íàáîðó äèàãíîñòè÷åñêèõ ëþìèíåñöèðóþùèõ àíòèâèäîâûõ ñûâîðîòîê èíñòðóêöèåé.
Ïîëó÷åííûå ïðåïàðàòû èññëåäóþòñÿ â ëþìèíåñöåíòíîì ìèêðîñêîïå.  ñëó÷àå ïîëîæèòåëüíûõ ðåçóëüòàòîâ
â öèòîïëàçìå êëåòîê, ñîäåðæàùèõ àíòèãåíû, îáíàðóæèâàåòñÿ ñâå÷åíèå â âèäå îòäåëüíûõ ñâåòÿùèõñÿ ãðàíóë
(ñïóñòÿ 5–6 ÷ ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ), à çàòåì — â âèäå áîëüøîãî âêëþ÷åíèÿ, îòòåñíÿþùåãî ÿäðî êëåòêè ê
ïåðèôåðèè, èëè ïåðèíóêëåàðíî ðàñïîëîæåííîãî îäíîðîäíîãî ñâå÷åíèÿ (ñïóñòÿ 12–16 ÷ ïîñëå èíôèöèðîâàíèÿ).
Îêðàøåííûå ïðåïàðàòû ðåêîìåíäóåòñÿ èçó÷àòü ïîä ìèêðîñêîïîì íåìåäëåííî ïîñëå ïðèãîòîâëåíèÿ. Íàèáîëåå
ÿðêàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ íàáëþäàåòñÿ â äåíü îêðàñêè. Ïðåïàðàòû ìîæíî ñîõðàíÿòü ïðè +4°Ñ, íî èíòåíñèâíîñòü
ôëóîðåñöåíöèè ïîñòåïåííî ïàäàåò.
3.4.3. Îáíàðóæåíèå âèðóñíîé ÐÍÊ ìåòîäîì ÐÒ-ÏÖÐ
ÐÒ-ÏÖÐ ïîçâîëÿåò âûÿâèòü ãåíåòè÷åñêèé âèðóñíûé ìàòåðèàë â èññëåäóåìîì ýëþàòå â òå÷åíèå 6 ÷ ñ âûñîêîé
ñïåöèôè÷íîñòüþ (98%) è ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ (96%).
3.4.3.1. Îáðàáîòêà ýëþàòîâ
Ïîëó÷åííûé ýëþàò (ðàçäåë 3.1) â îáúåìå 3 ìë:
− çàëèòü â öåíòðèôóæíóþ ïðîáèðêó;
$
− îñòîðîæíî øïðèöîì íà äíî ïðîáèðêè íàñëîèòü 300 ìêë 10%-é ñàõàðîçû;
− âñå ïðîáèðêè òùàòåëüíî óðàâíîâåñèòü ïî îäíîé;
− âñòàâèòü ïðîáèðêè â ëþëüêè;
− ïîäâåñèòü ëþëüêè ê áàêåò-ðîòîðó SW 50.1;
− âñòàâèòü ðîòîð â óëüòðàöåíòðèôóãó;
− îñàæäàòü âèðóñ (ÖÏÀ) ïðè ñêîðîñòè 30 000 îá./ìèí â òå÷åíèå 1,5 ÷.
Ïîñëå îñàæäåíèÿ âèðóñà (ÖÏÀ):
− óäàëèòü ñóïåðíàòàíò;
− âèðóñíóþ áëÿøêó ðåñóñïåíäèðîâàòü â 300 ìêë ñòåðèëüíîé äå-èîíèçîâàííîé èëè äèñòèëëèðîâàííîé âîäû;
− îñòîðîæíî ñîáðàòü áëÿøêó ñòåðèëüíûì íàêîíå÷íèêîì;
− ïåðåíåñòè ðåñóñïåíäèðîâàííûé ìàòåðèàë â ïëàñòèêîâóþ ïðîáèðêó îáúåìîì 0,5–1,0 ìë.
Ïðèãîòîâëåííûå ïðîáû ìîæíî áðàòü ñðàçó â ðåàêöèþ èëè õðàíèòü â õîëîäèëüíèêå ïðè -20–50îÑ äî
èñïîëüçîâàíèÿ â òå÷åíèå 3 ìåñ.
3.4.3.2. Ïîñòàíîâêà ìåòîäà ÐÒ-ÏÖÐ
Äëÿ âûÿâëåíèÿ ÐÍÊ ýíòåðîâèðóñîâ â èññëåäóåìûõ ïðîáàõ ìîæíî èñïîëüçîâàòü êîììåð÷åñêóþ òåñò-ñèñòåìó
ôèðìû «Roche» (ÑØÀ). Èññëåäîâàíèÿ âûïîëíÿþòñÿ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèëàãàåìîé èíñòðóêöèåé.
3.5. Îïðåäåëåíèå êîëèôàãîâ â âîäå
3.5.1. Îòáîð ïðîá
Ïðîáû îòáèðàþò â ñòåðèëüíûå åìêîñòè ñ ñîáëþäåíèåì ïðàâèë ñòåðèëüíîñòè. Áóìàæíûé êîëïà÷îê ñ ôëàêîíà
ñíèìàþò âìåñòå ñ ïðîáêîé íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä îòáîðîì ïðîáû, íå êàñàÿñü ïðîáêè ðóêàìè. Íàïîëíåííûå
åìêîñòè çàêðûâàþò ïðèòåðòûìè ïðîáêàìè (ñèëèêîíîâûìè, ðåçèíîâûìè èëè èç äðóãèõ ìàòåðèàëîâ) è
ñòåðèëüíûìè áóìàæíûìè êîëïà÷êàìè. Ìíîãîðàçîâàÿ ïîñóäà äëÿ îòáîðà ïðîá, â òîì ÷èñëå è ïðîáêè, äîëæíà
ïîäâåðãàòüñÿ ñòåðèëèçàöèè ñóõèì æàðîì èëè àâòîêëàâèðîâàíèåì.
3.5.2. Ìåòîä îïðåäåëåíèÿ
Îïðåäåëåíèå êîëèôàãîâ â âîäå ïðîâîäÿò ìåòîäîì îäíîñëîéíîãî àãàðà â ñîîòâåòñòâèè ñ ñóùåñòâóþùèìè
íîðìàòèâíî-ìåòîäè÷åñêèìè äîêóìåíòàìè.
%
Ïðèëîæåíèå 1
ÎÑÍÎÂÍÛÅ ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÎÁÎÐÓÄÎÂÀÍÈÅ
1. Àâòîêëàâ
2. Àâòîìàòè÷åñêèå ìèêðîïèïåòêè ñî ñòåðèëüíûìè íàêîíå÷íèêàìè*
3. Àíàëèçàòîð èììóíîôåðìåíòíûé ÀÈÔ-340 èëè ìóëüòèñêàí
4. Âåñû àíàëèòè÷åñêèå
5. Âåñû òåõíè÷åñêèå àïòå÷íûå
6. Âåñû òîðñèîííûå
7. Âûòÿæíîé øêàô ñ ëàìèíàðíûì ïîòîêîì äëÿ êóëüòóðû êëåòîê**
8. Âûòÿæíîé øêàô ñ ëàìèíàðíûì ïîòîêîì (êëàññà II) **
9. Èíñòðóìåíòû ëàáîðàòîðíûå: ïèíöåòû, íîæíèöû, ñîâîê äëÿ âçâåøèâàíèÿ
10. Èîíîìåð (ðÍ-121)
11. Ìèêðîñêîï èíâåðòèðîâàííûé
12. Ìèêðîñêîï ëþìèíåñöåíòíûé
13. Ïèïåòêè ñòåêëÿííûå íà 1, 5, 10 ìë
14. Ïîñóäà ëàáîðàòîðíàÿ (÷àøêè Ïåòðè, êîëîíêè 10–20 ìë, êîëáû)
15. Ïðîáèðêè
16. Ñòåêëà ïðåäìåòíûå è ïîêðîâíûå
17. Ñòåðèëüíàÿ êëåéêàÿ ëåíòà äëÿ çàêëåèâàíèÿ êóëüòóðàëüíûõ ïàíåëåé
18. Ñòåðèëüíûå ïëîñêîäîííûå 24-ëóíî÷íûå ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû
19. Ñòåðèëüíûå ïëîñêîäîííûå 96-ëóíî÷íûå ïëàñòèêîâûå ïëàíøåòû
20. Ñòåðèëüíûå ñòåêëÿííûå ôëàêîíû äëÿ êóëüòóðû êëåòîê (ïåíôëàêîíû åìêîñòüþ 25, 50 ìë)
21. Òåðìîñòàò, ðåãóëèðóåìûé äî 37îÑ+1îÑ
22. Òåðìîñòàò ÑÎ2 èíêóáàòîð*
23. Óëüòðàöåíòðèôóãà***
24. Õîëîäèëüíèêè (-20îÑ, +4îÑ)
25. Öåíòðèôóãà ðåôðèæåðàòîðíàÿ íà 1-5 òûñ. îá./ìèí
26. Öåíòðèôóæíûå ïëàñòèêîâûå ïðîáèðêè îáúåìîì 0,5–1,0 ìë
27. Øïðèöû
28. Øòàòèâû (äëÿ ôèêñàöèè ôëàêîíîâ)
29. Øþòòåëü-àïïàðàò
*äëÿ ìèêðîìåòîäà ðåàêöèè íåéòðàëèçàöèè
**æåëàòåëüíî
***äëÿ ïîñòàíîâêè ÐÒ-ÏÖÐ
&
Ïðèëîæåíèå 2
ÎÑÍÎÂÍÛÅ ÐÅÀÊÒÈÂÛ È ÐÅÀÃÅÍÒÛ
1. Àëüáóìèí, ìå÷åííûé ðîäàìèíîì
2. Àíòèáèîòèêè: ãåíòàìèöèí, àìôîòåðèöèí
3. Àíòèñûâîðîòêà ïðîòèâ ãëîáóëèíîâ êðîëèêà, ìå÷åííàÿ ÔÈÒÖ
4. Àöåòîí
5. Áèô-ýêñòðàêò (Sigma, õ.÷.)
6. Âîäà äåèîíèçèðîâàííàÿ (èëè äèñòèëëèðîâàííàÿ âîäà, ñòåðèëèçîâàííàÿ àâòîêëàâèðîâàíèåì ïðè 121îÑ+1îÑ
â òå÷åíèå 20 ìèí)
7. Äèýòèëîâûé ýôèð, õ.÷.
8. Êîììåð÷åñêàÿ òåñò-ñèñòåìà ôèðìû «Roche» (CØA) — äëÿ ÏÖÐ
9. Êóëüòóðàëüíûå ïèòàòåëüíûå ñðåäû: ÌÅÌ, Èãëà ÌÅÌ, 199, ãåìîãèäðîëèçàò
10. Ìåòèëîâûé ñïèðò (ìåòàíîë, õ. ÷. ÃÎÑÒ 6995–77)
11. NàÑl (íàòðèé õëîðèñòûé, õ.÷.)
12. Ïåðâè÷íî-òðèïñèíèçèðîâàííûå ëèíèè êëåòîê ÏÝ×, ÔÝ×
13. Ïåðåâèâàåìûå ëèíèè êëåòîê RD, BGM, Hep-2, FL, Vero
14. 33%-ÿ ïåðåêèñü âîäîðîäà (ÒÓ 6–02–570–75 ÎÑ.×)
15. Ðàñòâîð Õåíêñà (ðÍ 7,4)
16. 10%-ÿ ñàõàðîçà
17. Ñèëèêîíîâîå ìàñëî
18. ÍÑ1 (ñîëÿíàÿ êèñëîòà, õ. ÷., ÃÎÑÒ 3118-77, 35–38%)
19. Ñûâîðîòêè äèàãíîñòè÷åñêèå ýíòåðîâèðóñíûå ñóõèå (äëÿ ðåàêöèè íåéòðàëèçàöèè, ãðóïïîñïåöèôè÷åñêèå
è òèïîñïåöèôè÷åñêèå)
20. Ñûâîðîòêà êðîâè ýìáðèîíîâ êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà
21. Òåñò-ñèñòåìà èììóíîôåðìåíòíàÿ äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ âèðóñà ãåïàòèòà À
22. Òåñò-ñèñòåìà èììóíîôåðìåíòíàÿ äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ ðîòàâèðóñà
23. Òðèñ-ÍÑ1 (õ.÷.)
24. Ôîñôàòíî-ñîëåâîé áóôåð (ðÍ 7,2–7,4)
25. Õåïåñ (áóôåð — 4-(2-ãèäðîêñèýòèë)-1-ïèïåðàçèíýòàíîëñóëüôîíîâàÿ êèñëîòà)
26. Õëîðîôîðì (õ. ÷.)
27. Ýâàíñ-ãîëóáîé
28. Ýòèëîâûé ñïèðò (ýòàíîë, ÃÎÑÒ 5962–67)
'
Скачать