Ðîçä³ë 7. Ïàðàçèòîëîã³ÿ Таким образом, взаимодействие F. hepatica и полиовируса сводится к адсорбции последнего на поверхности гельминта (в основном в области ротовой и абдоминальной присосок) с последующим разрушением вируса. Список литературы 1. Collins, P. R., Stack, C. M., O’Neill, S.M., Doyle, S., Ryan, T., Brennan, G. P., Mousley, A., Stewart, M., Maule, A. G., Dalton, J. P., Donnelly, S. Cathepsin L1, the Major Protease Involved in Liver fluke (Fasciola hepatica) Virulence. J. Biol. Chem., Vol. 2004, 279, Issue 17. – P. 17038-17046. 2. Daweb, B. Maintenance in vitro of Fasciola hepatica. Nature 1954, 174. – P. 654-655. 3. Kew, O. M., R. W. Sutter, E. M. de Gourville, W. R. Dowdle, and M. A. Pallansch. Vaccine-derived poliovirus and the endgame strategy for global polio eradication. Annu. Rev. Microbio, 2005, 59. – P. 587-635. 4. Morphew, R.M., Wright, H. A., LaCourse, E. J., Woods, D. J., Brophy, P. M. Comparative Proteomics of Excretory-Secretory Proteins Released by the Liver fluke - Fasciola hepatica in Sheep Host Bile and during in Vitro Culture ex Host. Molecular & Cellular Proteomics 2007, 6. – P. 963-972. CO-INCUBATION OF FASCIOLA HEPATIKA WITH POLIOVIRUS-1 Karalyan Z.A., Ramazyan N.V., Voskanyan H.E., Karalova E.M. Institute of Molecular Biology NAS RA, Yerevan, Armenia Interaction between Fasciola hepatica and Poliovirus-1 (Sabin) in vitro is studied in the article. It is shown that the present of virus did not influence on survival value of fasciola. At the same time, during co-incubation period, viral titer decreased after 12 hours and became maximal value in 24-36 hours of incubation. We have shown ability of viruses to adsorb on surface of fasciola (particularly on oral and ventral suckers) by means of monoclonal antibodies to Poliovirus-1. In this article, we discussed possible mechanism of deactivation of viruses by proteases of fasciola. УДК 619:576.8:577.2 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ ОПИСТОРХИДОЗНЫХ ИНВАЗИЙ Катохин А.В., Брусенцов И.И., Мордвинов В.А. Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Российская Федерация Евтушенко А.В., Солодянкин А.С. ННЦ «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», Харьков, Украина Ромашов Б.В. Воронежский государственный природный биосферный заповедник, Российская Федерация Заражение человека и домашних животных паразитами семейства Opisthorchiidae (Platyhelminthes, Trematoda) происходит при потреблении сырой или полусырой рыбы семейства карповых, инвазированной личинками гельминтов [1]. Это приводит к заболеванию описторхидозом, при котором происходит поражение печеночных протоков и желчного пузыря. Поскольку наиболее распространенным паразитом из этого семейства на территории России и республик бывшего СССР – Украины, Белоруссии и Казахстана является Opisthorchis felineus, описторхидоз часто определяют как «описторхоз». По приблизительным оценкам на указанной территории описторхидозами заражено около 2 млн людей [1, 2]. В некоторых населенных пунктах на севере Западной Сибири описторхидозами заражено до 90 % населения [1]. На территории России, Украины, Белоруссии и Казахстана кроме Opisthorchis felineus расположены ареалы еще трех описторхид, опасных для человека и домашних животных: Metorchis bilis, Clonorchis sinensis и Pseudamphistomum truncatum [1-5]. Особое внимание заслуживает изменение современной эпизоотической ситуации по описторхидозам на территории Украины. Результаты проведенных на протяжении последних восьми лет научных исследований свидетельствуют про значительное увеличение количества природных очагов инвазий. При этом установлено и стабильный рост напряженности очагов, особенно в бассейнах Северского Донца, Ворсклы, Сулы, Днепра, Припяти и Дуная, о чем свидетельствует высокий уровень инвазирования рыб – промежуточных хозяев возбудителей. На отдельных участках вышеупомянутых водных объектов экстенсинвазированность отдельных видов рыб составляет до 100 %, а общий уровень зараженности популяций карповых в бассейнах этих рек составляет от 9 % до 63 % [6]. Напряженной остается ситуация и в бассейнах рек Европейской части России [2]. Рыба, как фактор передачи возбудителя, играет решающую роль в заражении людей описторхидами. Традиционными методами выявления возбудителей в рыбе являются паразитологические – компрессионный метод исследования мышечной ткани или метод ее переваривания в искусственном желудочном соке с последующей идентификацией возбудителей по морфологическим признакам. Такие методы часто дают недостоверный результат. Более надежным считается метод постановки биологической пробы с использованием опытных животных – котят либо хомяков. Но этот метод более длительный (14-21 сутки) и часто не соответствует современным правилам биоэтики. Несовершенство методов ветеринарно-санитарной экспертизы рыбы и рыбной продукции способствуют увеличению уровня заболеваемости населения. При этом, используемые в медицинской практике и в санитарно-эпидемиологическом надзоре методы диагностики заболевания у людей, основанные на обнаружении гельминтов, их яиц в фекалиях или в дуоденальном содержимом при микроскопировании клинического материала, также не позволяют различать отдельные виды возбудителей описторхидозов, и уровень лабораторной диагностики этих заболеваний не отвечает современным требованиям. Актуальность изучения генетического разнообразия паразитов семейства Opisthorchiidae и разработки на основе полученных результатов методов ДНК-диагностики описторхидозов обусловлена, с одной стороны, обострением ситуации с распространением биогельминтозов в результате интенсификации миграции населения и транспортировки рыбной продукции. С другой стороны, актуальность обусловлена отсутствием в практике биомедицинских исследований, а также санитарно-эпидемиологического и экологического мониторинга ситуации в природных и антропургических очагах описторхидозов быстрых, точных и нетрудоёмких методов выявления возбудителей описторхидозов. 273 ÂÅÒÅÐÈÍÀÐÍÀ ÌÅÄÈÖÈÍÀ âèïóñê 94, 2010 ð Для выявления возбудителей инфекционных заболеваний микробной, вирусной и гельминтной природы в последнее время успешно используются различные модификации ПЦР и молекулярной гибридизации [7-10]. Эффективное применение этих технологий для диагностики паразитарных заболеваний, в частности, гельминтозов, зависит от степени изученности генетического разнообразия возбудителей гельминтозов и наличия надежных данных о нуклеотидных последовательностях генетических маркеров этих паразитов [11]. Поэтому важной предварительной частью такого рода проектов является исследование геногеографической изменчивости по ряду генетических маркеров, т.е. амплификация отдельных фрагментов, их секвенирование, анализ нуклеотидных текстов, выявление инвариантных и вариабельных (информативных) участков в полученных текстах, выбор фрагментов, пригодных стать целью для разработки систем ДНК-диагностики. В ИЦиГСО РАН была разработана ПЦР-диагностика для видоспецифичного выявления возбудителей описторхидозов, основанная на выявленном нуклеотидном полиморфизме фрагмента ядерного генного кластера рибосомальных РНК, включающего ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2). Для двух возбудителей – Opisthorchis felineus и Metorchis bilis – было проведено успешное тестирование ПЦР-диагностики на клиническом материале от пациентов из г. Томска [12]. Подобные исследования были проведены и в ННЦ «ИЭКВМ» – разработаны методы ПЦР–идентификации личинок описторхисов в мышечной ткани рыб, которые были рекомендованы Госкомитетом ветмедицины Украины для использования в практике ветеринарной медицины. Особое внимание заслуживает использование молекулярно-генетических методов исследований в изучении путей миграции описторхид и расширения их ареала, основанных на филогенетическом анализе различных популяционных групп возбудителей. ИЦиГСО РАН были начаты исследования по изучению внутривидовой генотипической изменчивости O. felineus и определения его генетического родства с видами C. sinensis и O. viverrini. По результатам этих исследований и проведенного филогенентического анализа была установлена возможность синонимации родов Opisthorchis и Clonorchis. Кроме того, установлено, что виды O. felineus и C. sinensis генетически ближе друг к другу, чем к виду O. viverrini. Следует отметить, что при проведении сравнительного анализа гаплотипов ITS2-маркера у западносибирских и восточноевропейских популяций O. felineus, установлено, что европейская популяция демонстрирует новый ITS2-гаплотип, который генетически более родственный с дальневосточными (Россия и Япония) и восточноазиатскими (Китай и Южная Корея) популяциями вида C. sinensis [13]. Несмотря на актуальность проблемы описторхидозов, широкомасштабных молекулярно-генетических исследований европейских популяций описторхид практически не проводилось. В то же время, такие исследование могут позволить установить генетическое разнообразие представителей семейства Opisthorchidae на территории Европы, определить межпопуляционные различия внутри видов, установить уровень изменчивости возбудителей. На основе изучения филогеографии эпидемиологически-опасных описторхид можно определить риск расширения ареала возбудителей, разработать систему прогнозирования вспышек заболеваний и напряженности очагов инвазии. Результаты подобных исследований позволят создать методическую базу для развития методов ДНК-диагностики заболеваний у людей и животных, совершенствования методов ветеринарносанитарной экспертизы рыбы и рыбной продукции, разработки методов молекулярной эпизоотологии с целью мониторинга природных очагов описторхидозных инвазий. Список литературы 1. Бэер, С.А. Биология возбудителя описторхоза [Текст] / С.А. Бэер // М., 2005. – 336 с. 2. Описторхоз в бассейне верхнего Дона (Воронежская область): фауна описторхид, эколого-биологические закономерности циркуляции и очаговость описторхидозов [Текст] / Б.В. Ромашов. Воронеж: Воронеж. гос. ун-т, 2005. – 201 с. 3. King, S., Scholz, T. Trematodes of the family Opisthorchiidae: a minireview [Тext] / S. King, Т. Scholz // Korean J. Parasitol. – 2001. – V. 39. – № 3. – P. 209-221. 4. О некоторых актуальных вопросах проблемы описторхидозов человека [Текст] / К.П. Федоров [и др.] // Мед. паразитология. – 2002. – № 3. – С. 7-9. 5. Беспрозванных, В.В. Природноочаговые гельминтозы человека в Приморском крае [Текст] / В.В. Беспрозванных, А.В. Ермоленко. – Владивосток: Дальнаука, 2005. – 120 с. 6. Євтушенко, А.В. Поширення збудників опісторхідозних інвазій серед прісноводних риб внутрішніх водойм України [Текст] / А.В. Євтушенко, О. Гайдей // Вісн. аграр. наук України. – К., 2008. – С. 43-46. 7. Foxman, B. Molecular Epidemiology: Focus on Infection [Теxt] / В. Foxman, L. Riley // Am. J. Epidemiol. – 2001. – V. 153. – P. 1135-1141. 8. Reverse line blot hybridization used to identify hemoprotozoa in Minorcan cattle [Теxt] / S. Almeria [at al.] // Ann. N Y Acad. Sci. – 2002. – V. 969. – P. 78-82. 9. Molecular approaches for the detection of Schistosoma mansoni: possible applications in the detection of snail infection, monitoring of transmission sites, and diagnosis of human infection [Текст] / F.G. Abath [at al.] // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. – 2006. – V. 101. – Suppl 1. – P. 145-148. 10. Validation of the line-probe assay for rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Vietnam [Теxt] / N.S. Shah [at al.] // Int. J. Tuberc. Dis. – 2009. – V. 13. – № 2. – P. 247-252. 11. Bergquist, R. Diagnostic dilemmas in helminthology: what tools to use and when? [Теxt] / R. Bergquist, М.V. Johansen, J. Utzinger // Trends Parasitol. – 2009. – V. 25. – № 4. – P. 151-156. 12. Брусенцов, И.И., Катохин, А.В., Сахаровская, З.В., Сазонов, А.Э., Огородова, Л.М., Федорова, О.С., Колчанов, Н.А., Мордвинов, В.А. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchis felineus и Metorchis bilis с помощью метода ПЦР [Текст] / И.И. Брусенцов [и др.] // Мед. паразитология. – 2010. – №1. – С. 10. 13. Оценка генетических отличий Opisthorchis felineus от Opisthorchis viverreni Clonorchis sinensis по ITS2- и CO1-последовательностям [Текст] / А.В. Катохин [и др.] // Докл. акад. наук. – 2008. – Т. 421, № 4. – С. 549-552. PERSPECTIVES OF USING OF MOLECULAR-AND-GENETIC METHODS OF INVESTIGATIONS IN DIAGNOSIS OF OPISTHORCHIIDIASIS INVASIONS Katokhin A.V., Brusentsov I.I., Mordvinov V.A. Institute of Cytology and Genetic of RAS, Novosibirsk, Russian Federation, Yevtushenko A.V., Solodyankin A.S. National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine” of NAASU, Kharkov, Ukraine, Romashov B.V. Voronezh State Natural Biosphere Reserve, Russian Federation The diseases opisthorchiidiasis is caused by parasitizing of several Opisthorchiidae trematodes in liver and gall bladder of humans and pets, namely by Opisthorchis felineus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis and Pseudamphistomum truncatum. The diseases are wide-spread on territory of Russian Federation, Ukraine, Belarus and Kazakhstan. Need for applying of modern reliable, cost-effective and species-specific PCR diagnostic tools for diagnosis and for epidemiological and epizootological monitoring. In ICG SB RAS such PCR diagnostic tool was recently developed and approved for detection of Opisthorchis felineus and Metorchis bilis invasion in humans by clinical samples analysis. Method of PCR-identification of larvae in muscular tissue of fishes was developed In NSC “IECVM”. 274
