Министерство образования и науки Российской Федерации САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Приоритетный национальный проект «Образование» Национальный исследовательский университет Д. С. БОГОЛЮБОВ, В. М. СЕДОВА, И. М. СПИВАК РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭКСПЕРЕССИИ ГЕНОМА Рекомендовано Учебно-методическим объединением по университетскому политехническому образованию в качестве учебного пособия для магистров, обучающихся по основной образовательной программе «Прикладные основы генной и клеточной инженерии» направления подготовки магистров «Техническая физика» Санкт-Петербург Издательство Политехнического университета 2011 Рецензенты: Доктор биологических наук, профессор, декан биолого-почвенного факультета СПбГУ А. Д. Харазова Кандидат физико-математических наук, доцент СПбГПУ О. Л. Власова, Боголюбов Д. С. Регуляторные механизмы экспрессии генома: учебнометодическое пособие / Д. С. Боголюбов, В. М. Седова, И. М. Спивак. – СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2011. – 241 с. Сформулированы современные представления о структуре и механизмах функционирования генетического аппарата эукариотической клетки, процессах созревания матричных РНК, процессах поддержания в нативном состоянии носителя генетической информации – ДНК. Раздел РНК – интерференция посвящен описанию нового механизма регуляции генной экспрессии, действующего как на уровне хроматина, так и на уровне трансляции. Представлены современные знания о роли малых интерферирующих РНК в развитии некоторых заболеваний человека и перспективах использования механизмов РНК – интерфернции для лечения этих заболеваний. Учебное пособие предназначено для студентов высших учебных заведений, обучающихся по основной образовательной программе «Прикладные основы генной и клеточной инженерии» направления подготовки магистров «Техническая физика». Также может быть использовано при обучении в системах повышения квалификации, в учреждениях дополнительного профессионального образования. Работа выполнена в рамках реализации программы развития национального исследовательского университета «Модернизация и развитие политехнического университета как университета нового типа, интегрирующего мультидисциплинарные научные исследования и надотраслевые технологии мирового уровня с целью повышения конкурентоспособности национальной экономики». Печатается по решению редакционно-издательского совета Санкт-Петербургского государственного политехнического университета. © Боголюбов Д. С., Седова В. М., Спивак И. М.,2011 © Санкт- Петербургский государственный политехнический университет, 2011 Д.С. БОГОЛЮБОВ, В.М. СЕДОВА, И.М. СПИВАК РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭКСПЕРЕССИИ ГЕНОМА Налоговая льгота – Общероссийский классификатор продукции ОК 005-93, т. 2; 95 3005 – учебная литература Подписано в печать ________2011. Формат 60×84/16. Печать цифровая Усл. печ. Л 15,01. Уч.-изд. л. _____. Тираж . Заказ Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного авторами в цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета: 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел. (812) 540-40-14 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение…………………………………………………………………..6 1. Ремоделирование и регуляция активности хроматина…………….10 1.1. Структура хроматина……………………………………………..10 1.1.1. Три уровня упаковки хроматина……………………………..10 1.1.2. Белки хроматина……………………………………………....12 1.1.3. Модификации компонентов хроматина……………………..17 1.1.4. Гистоновый код……………………………………………….23 1.1.5. Белковые комплексы, ремоделирующие хроматин………...25 1.1.6. Механизм ремоделирования нуклеосом…………………….31 1.1.7. Общие свойства механизмов ремоделирования комплексов ISWI и SWI/SNF……………………………………….33 1.1.8. Модели перемещения (транслокации) нуклеосом……….…34 1.1.9. Направление передвижения нуклеосом. Роль сопутствующих факторов……………………………………..35 1.1.10. Роль модификаций гистоновых ―хвостов‖ в ремоделировании хроматина………………………………………..37 1.1.11. Модель регуляции активности хроматина…………………38 2. РНК ― интерференция………………………………………………44 2.1. Интерферирующие РНК………………………………………….46 2.2. Биогенез siРНК……………………………………………………47 2.3. Ферментативные комплексы процессинга siРНК………………47 2.4. Micrо РНК и ее биогенез…………………………………………552 2.5. Ферменты процессинга miРНК…………………………………..574 2.6. Белки семейства Argonaute……………………………………….596 2.7. Другие компоненты РНК интерференции……………………....57 2.8. Механизм действия комплекса miРНК-RISC…………………...57 2.9. Использование РНК интерференции в эксперименте и медицине…………………………………………...60 3. Процессинг РНК в эукариотической клетке………………………..67 3.1. Механизмы процессинга РНК…………………………………...67 3.1.1. Процессинг 5 -конца мРНК…………………………………..70 3.1.2. Процессинг 3 -конца мРНК: расщепление и полиаденилирование………………………………73 6 3.1.3. Процессинг 3 -конца пре-мРНК гистонов…………………..77 3.1.4. Гетерогенные ядерные РНП и экспрессия генов……………82 3.1.5. Сплайсинг пре-мРНК…………………………………………84 3.1.6. Автокаталитический сплайсинг…………………………….127 3.1.7. Процессинг транспортных РНК…………………………….133 3.1.8. Редактирование мРНК………………………………………139 4. Функциональная компартментализация клеточного ядра и процессинг РНК……………………………………………………...143 4.1. Универсальные ядерные домены интерхроматиновой области ядра…………………………………..144 4.1.1. Перихроматиновые гранулы………………………………..145 4.1.2. Перихроматиновые фибриллы……………………………...146 4.1.3. Интерхроматиновые гранулы……………………………….147 4.1.4. Тельца Кахала………………………………………………..152 4.2. Некоторые особенности экстрахромосомных ядерных структур ооцитов………………………….........................156 4.2.1. Снѐрпосомы………………………………………………….157 4.2.2. Особенности телец Кахала ооцитов………………………..158 5. ДНК как самоподдерживающаяся структура. Регуляция экспрессии генов, вовлеченных в ДНК-метаболизм……163 5.1. ДНК-метаболизм: репликация, рекомбинация и репарация…………………………………………..163 5.1.1. Конститутивные и индуцибельные процессы в клетке…...163 5.1.2. Основные группы белков, вовлеченные в процессы ДНКметаболизма………………………………………………………...164 5.2. Клеточный цикл у эукариот…………………………………….167 5.2.1. Чекпойнт-контроль клеточного цикла……………………..167 5.2.2. Циклин-зависимые киназы и циклины…………………….169 5.2.3. Роль ростовых факторов в экспрессии генов, ответственных за движение клетки по циклу……………………………………...171 5.2.4. Точка рестрикции клеточного цикла и ее биологический смысл…………………………………………173 5.2.5. Роль белка ретинобластомы в регуляции клеточного цикла…………………………………………………...174 5.3. Регуляция репликации ДНК…………………………………….175 5.3.1. Инициация репликации……………………………………..175 5.3.2. Регуляция экспрессии ДНК-полимераз…………………….180 5.3.3.Регуляция экспрессии ДНК-лигаз…………………………...182 5.3.4.Белки, влияющие на топологию ДНК. 7 Топоизомеразы и геликазы……………………………………….................................183 5.3.5. Нуклеазы, их классификация и роль в процессе репликации………………………………………185 5.3.6. Метилирование ДНК. Роль метилаз семейства DCMT…...186 5.4. Процессы рекомбинации и их регуляция……………………...189 5.4.1. Типы рекомбинации и их роль в жизни клетки и организма……………………………………….189 5.4.2. Белок RecA E. coli и его роль в гомологической рекомбинации………………………………………………………190 5.4.3.Белок Rad51 и другие гомологи RecA у эукариот…………193 5.4.4. SOS-ответ на повреждение ДНК у E.coli. Экспрессия генов SOS-регулона………………………………….194 5.4.5. Мейотическая рекомбинация у эукариот и ее регуляция………………………………………………………198 5.5. Репарация ДНК…………………………………………………..198 5.5.1. Фундаментальная роль процессов репарации ДНК в функционировании клеток и организмов…...…………………….198 5.5.2. Типы процессов репарации и механизмы регуляции их активности……………………………..199 5.5.3. Прямая репарация……………………………………………199 5.5.4. Эксцизионная репарация……………………………………206 5.5.5. Репарация двунитевых разрывов ДНК……………………..216 5.5.6. Пострепликативная репарация……………………………...220 5.5.7. Глобальный клеточный ответ на повреждение ДНК и его регуляция…………………………….224 5.6. Активная деградация белков и ее роль в регуляции ДНКметаболизма…………………………………………………………..227 5.6.1.Система убиквитинирования белков………………………..228 5.6.2. Протеасомы 20S и 26S, их строение и роль в активной деградации белков………………………………………………….230 5.6.3. Регуляция экспрессии различных белковых субъединиц протеасомы………………………………..234 5.6.4. Роль протеасомы в развитии иммунного ответа…………..236 5.6.5. Протеасомная регуляция клеточного цикла……………….239 Библиографический список………………………………………....241 8 ВВЕДЕНИЕ ДНК — главная молекула наследственности, и таковой ее делают ее уникальные способности: удваиваться при каждом клеточном делении (репликация), обмениваться генетическим материалом между собой (рекомбинация) и восстанавливать свою структуру при повреждении (репарация). Эти процессы составляют основу функционирования ДНК в клетке и получили название «три Р ДНК-метаболизма». Заинтересовавшись историей изучения трех Р ДНКметаболизма — репликации (копирование ДНК-предшественницы при каждом клеточном делении), рекомбинации (обмен между различными молекулами ДНК в клетке) и репарации (возвращение измененной ДНК к ее нормальному, «правильному» состоянию), с удивлением обнаруживаешь, что исследования репарации и мутагенеза (появления наследуемых изменений ДНК) резко, почти на 20 лет, отставали от изучения репликации и рекомбинации. Это в первую очередь связано с тем, что серьезные теоретические взгляды на мутационные повреждения ДНК и их репарацию идеологически противоречили изначально сложившейся в науке парадигме о физикохимическом, структурном и, если можно так выразиться, эстетическом совершенстве двойной спирали ДНК. Такое восторженное отношение к главной молекуле наследственности препятствовало развитию системы новых взглядов на динамическое состояние ДНК, которые в большинстве случаев даже не воспринимались всерьез. Фрэнк Сталь однажды заявил, что «возможность того, что гены являются субъектами суматохи, возникающей при одновременном действии оскорбления и неуклюжих усилий эти оскорбления загладить, неправдоподобна». Только через два десятилетия после того, как он и Джеймс Уотсон представили структуру ДНК, Френсис Крик признался в своем письме в «Nature» от 26 апреля 1974 года: «Мы совершенно 9 ошиблись в возможной роли ДНК-репарации, хотя позднее я пришел к пониманию того, что ДНК столь точна потому, что существует множество различных механизмов репарации». Это ретроспективное размышление одного из создателей модели двойной спирали ДНК дает намек на раннее понимание ДНК как крайне стабильного макромолекулярного образования. Именно это преобладающее в то время мнение задержало изучение таких биохимических процессов как мутагенез и репарация. Нужно сказать, что через короткий промежуток времени, после того как Уотсон и Крик сообщили о двойной спиральной структуре ДНК, они же приложили правила спаривания оснований к мутагенезу, формулируя его так: «Спонтанная мутация может быть результатом того, что основание случайно окажется в одной из его редких, но вероятных таутомерных форм». Таутомеризация — это свойство вещества, позволяющее ему находиться в одном из взаимопереходящих химических состояний; в случае ДНК оснований — это кето- и энол-формы. Уотсон и Крик вначале внимательно изучили все возможности и сложности таутомеризации и неудачно попробовали сконструировать свою ДНКмодель из редких энольных форм оснований. Проблема стабильного спаривания оснований была разрешена ими только после того, как Джерри Донахью, бывший аспирант Лайнуса Полинга, указал Уотсону на более разумное использование обычной кето-формы. При этом Уотсоном и Криком не было дано никакого объяснения тому факту, что химическая лабильность ДНК, проявляющая себя в виде той самой таутомеризации, может иметь широкое приложение к изучению проблемы стабильности генов. Действительно, эта область наблюдения указывает прямой подход к уточнению природы повреждения ДНК и его возможных биологических последствий. В науке создалась парадоксальная ситуация. Для исследования таких реальных проблем, как расшифровка генетического кода или понимание основных признаков 10 репликации и рекомбинации ДНК, активно разрабатывались и создавались многочисленные системы in vitro. При их разработке как инструмент для определения функций генов и их белковых продуктов широко применялся мутагенез, который сам еще долго не являлся предметом независимых серьезных исследований. И все это несмотря на тот факт, что существование репарационного феномена фотореактивации было известно за несколько лет до описания самой структуры ДНК. Так было до того момента, когда стало понятно, что ДНК всетаки постоянно подвергается повреждениям и что у клетки есть целый арсенал путей, чтобы реагировать на эти повреждения. При этом нарушение или врожденная недостаточность процессов репарации и возникающие в результате этого мутации могут иметь катастрофические последствия. Одновременно с этим укреплялось понимание, что мутации, тем не менее, необходимы, так как являются основой жизни и эволюции. Последующие работы подтвердили идею о динамическом состоянии ДНК, то есть серьезно изменили существующую парадигму. Это сделало почти в один миг очевидным, что ДНК всех живых организмов постоянно подвергаются мириадам типов повреждений, и что клетки изобрели остроумные механизмы, позволяющие им быть устойчивыми к этим повреждениям и/или избавляться от них. Характерной особенностью эукариот является упаковка геномной ДНК в дезоксирибонуклеопротеидный комплекс, который размещен в ядре. Дезоксирибонуклеопротеидный комплекс или хроматин представляет собой сложную пространственную структуру, с помощью которой достигаются две задачи. Это, с одной стороны упаковка очень протяженной по длине молекулы ДНК в ограниченном по размерам объеме клеточного ядра, а с другой — доступность или недоступность ДНК для макромолекулярных комплексов, осуществляющих репликацию, репарацию, рекомбинацию и 11 транскрипцию, т. е. экспрессию информации, закодированной в ДНК. Решение этих задач происходит на уровне упаковки ДНК в хроматин через взаимодействие с гистонами и негистоновыми белками. Экспрессия генов представляет собой каскад сложных многоступенчатых реакций, которые обеспечивают использование (реализацию) генетической информации, содержащейся в ДНК, в качестве программы для синтеза белков. В этом каскаде реакций ключевую роль посредника между нуклеотидной последовательностью ДНК и аминокислотной последовательностью белка играют информационные, или матричные, РНК (мРНК). Однако в экспрессию генов вовлечены и другие (некодирующие) РНК. В качестве основных этапов экспрессии генов, которые кодируют белки, в эукариотической клетке условно можно выделить: 1) транскрипцию соответствующего гена, в результате чего синтезируется молекула-предшественник мРНК (пре-мРНК); 2) процессинг 5 -конца пре-мРНК; 3) сплайсинг пре-мРНК; 4) процессинг 3 -конца пре-мРНК; 5) в некоторых случаях посттранскрипцонное редактирование нуклеотидной последовательности мРНК; 6) экспорт мРНК из ядра в цитоплазму; 7) трансляцию. Первые 6 этапов экспрессии генов осуществляются в ядре, а заключительный этап — трансляция — в цитоплазме. В последнее десятилетие спектр механизмов, обеспечивающих регуляцию экспрессии индивидуальных для каждого типа дифференцированных клеток наборов генов, пополнился новым механизмом — РНК интерференцией. Мир интерферирующих РНК (РНКi) включает разнообразие малых РНК: small interferencing (siРНК), micro (miРНК), short hairpin (shРНК), ассоциированных с белком PIWI (piРНК), рибозимы и т. д., способных регулировать экспрессию генов. Все эти молекулы запускают выключение 12 экспрессии генов-мишеней, не уничтожая в принципе возможность их экспрессии вообще, но блокируя продукт активного гена временно. РНКi не нокаутирует ген полностью как это делают антисмысловые молекулы, следовательно, РНК интерференция может быть представлена как нокдаун в отличие от нокаутной процедуры, где экспрессия гена выключена полностью. 1. РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ХРОМАТИНА 1.1. Структура хроматина 1.1.1. Три уровня упаковки хроматина Важным результатом взаимодействия ДНК с гистонами является ее компактизация. Компактизация происходит неравномерно, различают эухроматин, который менее компактизован, и гетерохроматин, который компактизован сильнее. В эухроматине локализованы активно экспрессирующиеся гены. Гетерохроматинизацию или переход хроматина в более компактизованное состояние связывают с подавлением экспрессии генов. У высших эукариот значительная часть хроматина находится в недоступном для экспрессии состоянии, т. е. в виде гетерохроматина. Гетерохроматиновые области остаются конденсированными при прохождении через клеточный цикл. К ним относят прицентромерные области хромосом, ядрышковый организатор и области теломер. Эти участки конститутивного гетерохроматина включают повторяющиеся последовательности ДНК и лишь незначительное число активных генов. Обычно эухроматиновые гены при переносе in vitro в гетерохроматиновое окружение репрессируются на уровне транскрипции. Процесс приобретения участком эухроматина свойств гетерохроматина, в связи с изменением тех или иных условий, называют гетерохроматинизацией. В организации структуры хроматина, как известно, различают несколько уровней. Наиболее исследованным является уровень 10 нм 13 фибриллы, когда происходит накручивание молекулы ДНК на гистоновый октамер с образованием нуклеосом. Нуклеосомы являются фундаментельными структурными единицами хроматина — это очень компактные и одновременно динамичные нуклеопротеиновые комплексы. В формировании минимальной нуклеосомы, нуклеосомной глобулы или коровой частицы участвуют гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4. В состав коровой частицы входят Н3–Н4 тетрамер и два димера Н2А–Н2В, вокруг которых накручено 1.7 витка ДНК. Гистон Н1 расположен между нуклеосомными частицами и участвует в компактизации 10 нм фибриллы в 30 нм. Долгое время гистоновый октамер считали структурным скелетом (основой) или молекулярными катушками, на которые накручена ДНК, однако в последнее время его принято рассматривать как более динамичную структуру, обладающую к тому же регуляторными функциями. Далее 10 нм фибрилла компактизуется в 30 нм фибриллу. Именно 30 нм фибрилла и ее формирование являются мишенями в механизмах регуляции активности и ремоделирования хроматина. В настоящее время рассматривают две модели этого уровня упаковки хроматина. Первая, полученная Клугом с соавторами при электронномикроскопическом исследовании протяженных участков нуклеосомных структур, содержащих линкерный гистон Н1, описывает 30 нм структуру как соленоид, виток которого включает 6 нуклеосом, а линкерная ДНК продолжает суперспираль, которая возникает при накручивании ДНК на коровую частицу нуклеосомы. Вторая, более поздняя модель, рассматривает организацию 30 нм фибриллы как зигзагообразную структуру. Зигзагообразная форма организации 30 нм фибриллы находит подтверждение в экспериментах, выполненных более современными методами на быстро замороженных объектах. Такая упаковка фибриллы является более динамичной по сравнению с соленоидом. Следует отметить, что в формировании структуры 30 нм фибриллы особенно существенными нужно считать межнуклеосомные взаимодействия и 14 взаимодействия экспонированных на поверхности нуклеосомы отрицательно заряженных аминокислотных остатков гистона Н2А с остатками N-терминального домена гистона Н4 соседней нуклеосомы. На формирование 30 нм фибриллы существенное влияние оказывают модификации этих доменов. Так, известно, что ацетилирование гистона Н4 по лизину в положении 16 препятствует формированию 30 нм фибриллы и таким образом может участвовать в ремоделировании хроматина. Далее 30 нм нить сворачивается в гигантские петли диаметром около 100 нм, закрепленные на ядерном матриксе — белковом ядерном скелете. 1.1.2. Белки хроматина Что собой представляют белки, которые обеспечивают укладку ДНК в хроматиновую структуру? Мажорная часть этих белков — гистоны. Это очень консервативные по первичной структуре белки. Различают пять типов гистонов: Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Коровые гистоны, Н2А, Н2В, Н3 и Н4 — это небольшие белки с молекулярной массой, не превышающей 15 кДа, богатые остатками основных аминокислот лизина и аргинина, что сообщает им суммарный положительный заряд. Положительно заряженные аминокислотные остатки сосредоточены в Стерминальных и N-терминальных участках молекул коровых гистонов, а центральный домен обогащен остатками гидрофобных аминокислот. N-концевые участки коровых гистонов не имеют выраженной вторичной структуры и носят название «хвосты». В составе нуклеосом хвосты экспонированы вне коровой частицы и часто являются мишенью для действия ферментов, модифицирующих гистоны. Гистон Н1 имеет несколько большую по сравнению с коровыми гистонами молекулярную массу, более 20 кДа. Этот гистон обогащен остатками лизина. Положительно заряженные аминокислотные остатки сосредоточены преимущественно в С-терминальном домене 15 молекулы Н1. С-терминальный домен достаточно длинный и неупорядоченный. Центральная часть N-терминального домена гистона Н1 обогащена остатками гидрофобных аминокислот и способна в растворе образовывать глобулярную структуру. При мягком гидролизе трипсином эта глобула может быть отделена от остальной молекулы гистона Н1. Остальная часть N-терминального домена достаточно короткая и неструктурированная. Гистоны Н1, Н2А, Н2В и Н3 образуют семейства, в которых присутствуют несколько вариантов этих гистонов, отличающихся между собой по первичной структуре. В основном эти вариантные формы отличаются от основных, или канонических, лишь несколькими аминокислотными заменами. Но существуют вариантные формы гистонов, которые существенно отличаются от канонических. Известно, что каждая из вариантных форм гистонов кодируется собственным геном. Хорошо изучен вариант гистона Н1 — гистон Н5, который замещает гистон Н1 в неактивных ядрах птиц. Для гистона Н1 известно еще не менее восьми вариантов. Особенно вариативным является семейство Н1 в ядрах клеток мыши. Шесть вариантов Н1 идентифицировано в соматических клетках мыши и два — в зародышевых. Значение вариантных форм для выживания вида до конца не понятно, но последовательное удаление генов, кодирующих тот или иной вариант гистона Н1, не приводит к летальным исходам. Показано, что гистон Н1М, характерный для ооцитов шпорцевой лягушки, вероятно, участвует в экспрессии генов 5S рибосомной РНК, так как прекращение экспрессии этих генов приводит к замещению Н1М ооцитов на канонический Н1. Вариант гистона Н2А-macro сосредоточен в неактивной Xхромосоме млекопитающих у особей женского пола, имеющих две Xхромосомы. Кроме того, этот вариант присутствует в некоторых специфических сайтах других хромосом, что указывает на его специфические функции. Для macro-Н2А известны три субварианта. 16 В связи с тем, что он присутствует в хроматине птиц, где нет неактивной Х-хромосомы, этот вариант связывают с инактивацией генов в различных участках генома у всех высших эукариот. Вариант Н2А, функционально противоположный macro-Н2А — Н2А.Bdb. Этот вариант лишь на 40 % гомологичен кононическому Н2А и практически отсутствует в неактивной копии Х-хромосомы, в связи с чем его относят к активному хроматину. Компонентом активного хроматина считают другой вариант гистона Н2А — Н2.Z. Но однозначно отнести этот вариант к активному хроматину вряд ли возможно, так как его обнаруживают в гетерохроматине центромерной области хромосом и других неактивных участках генома. Вероятно, функции этого варианта гистона Н2А диктуются конкретным хромосомным контекстом. У всех высших эукариот обнаружен вариант Н2А.Х, функциональная роль которого скорее всего связана с репарацией ДНК, так как фосфорилированная форма этого варианта маркирует места разрывов на ДНК. Вариантные формы гистона Н2В — hTSH2B и H2BFWT — обнаружены только в семенниках и сперматозоидах. Вариантные формы гистона Н3 хорошо изучены. Одним из вариантов Н3 является белок CENP-A, замещающий гистон Н3 в нуклеосомах прицентромерных участков хромосом. По первичной структуре CENP-A существенно отличается от Н3 в N-терминальной области. Особые свойства центромерных участков хромосом связывают с присутствием белка CENP-A, так как привлечение этого белка в какой-либо участок хромосомы приводит к формированию в нем центромеры. В сперматозоидах этот белок, в отличие от других гистонов и их вариантов, не замещается на протамины. Другими вариантами гистона Н3 (Н3.1) являются Н3.2 и Н3.3. По первичной структуре эти варианты минимально отличаются от основного Н3 — Н3.1, в Н3.2 найдена только одна аминокислотная замена, в Н3.3 — четыре. Вариант Н3.3 эволюционно консервативен, и его связывают с 17 транскрипционно активным хроматином. Еще один вариант гистона Н3.1 обнаружен совсем недавно в клетках семенников — Н3.1t. Кроме гистонов в организации хроматина принимает участие большое число разнообразных белков, объединяемых названием «негистоновые». По мнению исследователей, занимающихся изучением структуры и функций хроматина, это название устарело и не вполне отражает все разнообразие белков, которые следует относить к этой группе. Здесь мы ограничимся лишь негистоновыми белками собственно хроматина, которые участвуют в формировании структуры хроматиновых фибрилл и их упаковке. Это, в первую очередь, High Mobility Group, или HMG, — белки и группа архитектурных белков, куда относят такие белки как HP1 — Heterochromatin Protein 1, белки Polycomb, белки MENT. Среди HMG-белков выделяют три наиболее существенные группы: HMGN, или по более ранней номенклатуре HMG 14/17, HMGB, или HMG 1/2, и HMG-А, или HMG 1/Y. HMGN — белки небольшой молекулярной массы, около 12 кДа, полипептидная цепь которых несет большой локальный заряд при физиологических значениях рН. N-терминальная часть этих белков обладает основными свойствами, С-терминальная ― кислыми. HMGN непосредственно с ДНК не связываются. Они содержат домен связывания с нуклеосомами, причем с нуклеосомами могут связываться гомодимеры (HMG-14)2 и (HMG-17)2. Связываясь с нуклеосомами, белки HMGN вызывают их декомпактизацию. Почти 10 % коровых частиц in vivo связаны с белками HMGN. HMGB ― это более крупные белки с молекулярной массой 25– 30 кДа. В составе этих белков идентифицирован домен HMG-1, состоящий из трех α-спиралей. Домен HMG-1 связывается с ДНК по малой бороздке и вызывает частичное разворачивание ДНК, что приводит к формированию резкого изгиба в молекуле ДНК. HMGB специфически связывают одноцепочечные участки ДНК, образующие крестообразные структуры в сайтах, содержащих палиндромные 18 последовательности. Это указывает на их возможное участие в процессах рекомбинации, репликации и репарации. Этих белков в хроматине существенно меньше, чем HMGN. HMGA взаимодействуют преимущественно с АТ-богатыми участками ДНК, в их составе присутствует так называемый АТкрючок. Это положительно заряженный домен, состоящий из 9 аминокислотных остатков с консервативной последовательностью Gly-Arg-Pro, которая окружена остатками аргинина. АТ-крючок связывает АТ-богатые последовательности в ДНК по малой бороздке. И хотя это взаимодействие не специфично относительно нуклеотидной последовательности, оно может предотвращать нарушения в правильной укладке двойной спирали ДНК. Функции HMG-белков не ограничиваются только декомпактизацией нуклеосом и формированием транскрипционно активного хроматина, они гораздо шире. Вызывая изгибы в ДНК и, тем самым изменяя уровень компактизации нуклеосом, HMG-белки могут модулировать связывание с ДНК различных регуляторных белков, в том числе и транскрипционных факторов. Они участвуют в большинстве процессов, протекающих в хроматине и требующих изменения порядка расположения нуклеосом на ДНК и декомпактизации хроматина. К другим, достаточно представленным и характерным для гетерохроматина белкам, следует отнести белки группы НР1. Первоначально этот белок был идентифицирован как компонент неактивного гетерохроматина в ядрах Drosophila melanogaster. Позднее гомологи этого белка были обнаружены и у других эукариот. Структура этих белков включает очень важный функциональный домен — хромодомен. Хромодомен расположен на N-конце молекулы НР1, способен связывать метилированный остаток лизина, локализованный в 9-м положении гистона Н3. На С-конце HP1 расположен теневой хромодомен, который участвует в димеризации НР1. Димеризованный НР1 приобретает способность взаимодействовать с рядом других белков. Основная функция НР1 — 19 участие в формировании компактных хроматиновых структур и гетерохроматизации. Белки группы Polycomb были обнаружены у Drosophila, а затем у других эукариот. Белки группы Polycomb участвуют в регуляции экспрессии хроматина через взаимодействие с регуляторными элементами ДНК, приводящей к инактивации генов, контролируемых этими элементами. HDAC1 — деацетилаза гистонов, представлена у всех эукариот, включая растения. SUV39 — метилтрансфераза гистонов, специфично метилирует остаток лизина в положении 9 гистона Н3, который является меткой гетерохроматина. 1.1.3. Модификации компонентов хроматина Хотя гистоны сами по себе весьма консервативны, выдающиеся свойства им сообщают ковалентные модификации «хвостовых» доменов, которые приводят к возникновению регуляторных контактов с ДНК. Ферменты, продуцирующие эти модификации, являются высоко специфичными в выборе гистоновых аминокислотных остатков, находящихся в совершенно определенных позициях. Одной из первых идентифицированных модификаций гистонов было ацетилирование -аминогруппы лизина. В транскрипционно активных областях хроматина был обнаружен повышенный уровень ацетилированных гистонов. Ацетилированию могут подвергаться все типы гистонов, а также их вариантные формы. Совершенствование методов идентификации модификаций в составе белков позволило установить, что ацетилированию подвергаются остатки лизинов, локализованные в различных участках молекул гистонов. Для поддержания транскрипционно активного состояния хроматина значение имеет не только общий высокий уровень ацетилирования гистонов, но и позиции модифицированных остатков в гистоновых молекулах. Было установлено, что ацетилирование лизина в 9-м положении молекулы гистона Н3 является маркерной модификацией 20 активного хроматина. Безусловно, ацетилирование гистонов является признаком транскрипционно активного хроматина, но ацетилирование лизина в положении 12 гистона Н4 идентифицировано и в некоторых неактивных участках хроматина. Ацетилирование лизина в этом гистоне в положении 16 препятствует формированию 30 нм фибриллы и, таким образом, является важным для активации хроматина. Ферменты, осуществляющие ацетилирование гистонов, хорошо изучены. Это гистоновые ацетилтрансферазы, или HAT. Их подразделяют на два семейства: HAT A и HAT B. HAT A локализована в ядре и ацетилирует гистоны в составе коровых частиц. HAT B локализована в цитоплазме и ацетилирует свободные гистоны H3 и H4, что важно для их транспорта в ядро. Сбалансированный уровень ацетилирования гистонов поддерживается координированным действием гистоновых ацетилтрансфераз и гистоновых деацетилаз (HdAc). Гистоновые деацетилазы также подразделяют на два семейтва: HdA и HdB. HdA деацетилирует все четыре коровых гистона. Помимо ацетилирования гистоны могут быть подвергнуты фосфорилированию, рибозилированию, метилированию, убиквитинилированию, биотинилированию и сумоилированию. Остатки аргинина в N-терминальном домене Н3 могут деиминироваться. Фосфорилирование гистонов происходит по остаткам тирозина, серина и триптофана. Убиквитинилирование — по остаткам лизина. Известно, что лизин гистона Н3 в 9-м положении может не только ацетилироваться, но и метилироваться, при этом может иметь место его моно-, ди- и триметилирование. В гистоне Н3 таким модификациям могут подвергаться остаток лизина в положении 27, а в гистоне Н4 — остаток лизина в положении 20. Понятно, что ацетилирование и метилирование ― это взаимоисключающие модификации, ацетилирование лизина в положении 9 гистона Н3 характерно для активного хроматина, а метилирование провоцирует 21 аффинность этого сайта для связывания белка НР1, что приводит к репрессии и инактивации. Таким образом, взаимоисключающие модификации всего лишь одного аминокислотного остатка в Nконцевом домене гистона Н3 могут выполнять функцию молекулярного переключателя «on — off», который способен регулировать транскрипционный статус хроматиновой фибриллы. Гистон Н3, метилированный по лизину в 9 положении, является маркером гетерохроматина. Но метилирование может выполнять не только репрессорную функцию. Влияние модификаций следует рассматривать в нуклеосомном контексте. Так, метилирование остатков лизина гистона Н3 в позициях 4, 36, 79 идентифицировано в областях активного хроматина. Моно-, ди- и триметилирование остатка лизина в положении 20 в гистоне Н4 обнаружено как в прицентромерном гетерохроматине, так и в эухроматиновых участках хромосом. Метилирование осуществляют метилтрансферазы гистонов — HMT. Гистоны могут убиквитинироваться по остаткам лизина. Эта модификация известна для гистонов Н2А и Н2В. Убиквитинирование белков очень распространенная модификация (ubiquitous — вездесущий). Механизм убиквитинирования хорошо изучен, в реакции участвуют три фермента. В результате происходит присоединение белка убиквитина размером 76 аминокислотных остатков по остаткам лизина белка-мишени. Наблюдают моно- и полиубиквитинирование. Полиубиквитиновая метка является сигналом деградации меченого белка. Моноубиквитинирование гистона Н2В связывают с активацией транскрипции в хроматине через цепь сложных белок–белковых и ДНК–белковых взаимодействий. Убиквитинирование — реверсивная модификация. Деубиквитинирование осуществляют тиоловые протеазы, известные как убиквитин-специфичные протеазы. Деубиквитинирование гистона Н2В связано с активацией элонгации транскрипции, так как удаление 22 именно этой модификации гистона Н2В способствует привлечению в транскрибирующий комплекс РНК-пол II специфической протеинкиназы, фосфорилирующей С-терминальный домен (CTD) самой субъединицы фермента, что, как известно, превращает РНКпол II в компетентную для элонгации форму. Известно биотинилирование гистонов Н2А, Н3 и Н4, которое катализируется ферментами биотинидазой и холокарбоксилазой синтетазой. Это очень консервативная модификация идентифицирована для остатков лизина в положениях 9, 13, 125, 127 и 129 гистона Н2А, в положениях 4, 9 и 18 гистона Н3 и в положениях 8 и 12 гистона Н4. Этими модификациями обогащены гистоны прицентромерного гетерохроматина. Биотинилирование гистона Н4 связывают с подавлением экспрессии генов и конденсацией хроматина в процессе митоза. Биотинилирование гистонов — модификация обратимая, но дефицит в биотинилировании гистонов исследователи склонны связывать с нарушениями структуры хроматина. Классическая роль биотина (витамина группы В) — участие в качестве компонента ферментов в липидном обмене, лейциновом катаболизме и глюконеогенезе. Впервые роль этой посттранляционной модификации гистонов в регуляции экспрессии генов была замечена в 1986–1988 годах. Фермент, осуществляющий эту модификацию гистонов, носит название биотинидазы и принадлежит к обширному семейству нитрилаз. Возможно, что биотинидаза осуществляет и обратную реакцию дебиотинилирования гистонов, так как другая ферментативная активность с этой функцией неизвестна. Описана недавно открытая модификация гистонов с присоединением специфических белков семейства SUMO, родственных убиквитину, получившая название сумоилирование. Описанные выше модификации гистонов относятся к модификациям N-концевых доменов, которые выступают за пределы 23 коровых частиц и непосредственно не участвуют в формировании ДНК–гистоновых взаимодействий. Различные модификации гистонов распознаются разными белками, имеющими специфические связывающие домены, такие как бромодомены и хромодомены. Эти белки могут иметь разнообразные функции, обладать определенной ферментативной активностью, такой как рекрутирование других белков, и таким образом участвовать в механизме перевода информации, закодированной в модификациях гистонов. Бромодомены идентифицированы в более чем ста белках из различных эукариотический организмов. Бромодомен представляет собой аминокислотную последовательность, включающую около 110 амнокислотных остатков. Осуществляет специфическую функцию — связывает ацетилированные остатки лизина. Бромодомены обнаружены в белках, которые участвуют в регуляции экспрессии генов, таких как гистоновые ацетилтрансферазы и компоненты ремоделирующих комплексов хроматина, обладающих АРТазной активностью. Хромодомен идентифицирован как аминокислотная последовательность, состоящая из 30–70 остатков и характерная для белков, участвующих в ремоделировании хроматина при переходе в гетерохроматиновое состояние, характерен для белков-репрессоров транскрипции НР1 и Polycomb. Хромодомены различаются по структуре, способны связываться с метилированными гистонами и, возможно, с РНК. Хромодомен белка HP1 и его аналогов специфически узнает гистон H3, метилированный по лизину в 9-м положении. Хромодомен белка Polycomb и родственные ему белки отличаются собственной специфичностью: они узнают гистон Н3, метилированный по остатку лизина в 27 положении. Исследования методом масс-спектрометрии идентифицировали значительное число модификаций гистонов, локализованных в коровой частице гистонового октамера. Эти модификации достаточно 24 точно картированы на структурированной глобуле нуклеосомы. Расположение этих модификаций на гистоновом октамере нуклеосом дрожжей выполнено с разрешением 3.1 Å. Показано, что много модификаций гистонов присутствуют на ДНК–белковом интерфейсе. Позднее эти модификации гистонового кора были идентифицированы на нуклеосомах Xenopus laevis с разрешением 1.9 А. 27 модификаций гистонов были картированы на корах нуклеосом, 12 из них расположены так, что не участвуют во взаимодействии с ДНК. Остальные 15 лежат на поверхности коровой частицы, которая и является ДНК–белковым интерфейсом. Известно, что гистоновый октамер связывает сахарофосфатный остов ДНК в 14 точках суперспирали, образуя более 100 атомных взаимодействий, азотистые основания нуклеотидов в этих взаимодействиях не участвуют. Положение модифицированных остатков на внешней поверхности кора нуклеосомы образует ограниченный путь подобно «железнодорожному тракту». Фосфорилированные серин и треонин, метилированные лизин и аргинин и ацетилированный лизин образуют «тропинку» для накручивания ДНК вокруг гистонового октамера. Какие-то из этих модификаций участвуют во взаимодействии с ДНК, что может прямо модулировать ДНК–гистоновые взаимодействия. Известно ковалентное метилирование ДНК. Метилируется остаток цитозина в последовательностях CpG — симметричное метилирование, CpNpG и CpHpH — несимметричное метилирование, H — это A, T или C. CpG-динуклеотиды представлены в геноме млекопитающих достаточно редко, но в ДНК существуют специфические сегменты, обогащенные CpG-динуклеотидами, так называемые CpG-островки. Это последовательности размером от 500 до 2000 пар оснований, их относят к сайтам старта инициации транскрипции. CpG-динуклеотиды, которые встречаются в промоторных последовательностях или в первом экзоне, метилированы гораздо реже. У высших эукариот метилирование ДНК может рассматриваться как еще один механизм регуляции экспрессии 25 генов. Абберантное, т. е. нехарактерное, неправильное, метилирование широко представлено в раковых клетках и может рассматриваться как очень раннее нарушение регуляторных процессов при канцерогенезе. Метилирование осуществляют ДНК-метилтрансферазы (DMT), деметилирование осуществляют ферменты деметилазы. Метилирование последовательности гена связано с подавлением транскрипции через взаимодействие с белками репрессирующих комплексов, которые содержат метил–цитозин-связывающий домен. 1.1.4. Гистоновый код Посттрансляционные модификации гистонов с учетом вклада вариантов гистонов, которые тоже подвержены посттрансляционным модификациям, образуют «гистоновый код» активации или репрессии в эухроматине и гетерохроматине, соответственно. Гипоацетилированные локусы являются типичными для «молчащих» относительно экспрессии генов, а ацетилирование гистонов важно для активации. Ацетилирование гистоновых «хвостов» дестабилизирует хроматиновую фибриллу, вызывая усиление мобильности нуклеосом вдоль хромосом и облегчая доступность ДНК для транскрипционных факторов. Метилирование ДНК связано с модификациями гистонов взаимозависимыми отношениями, модифицикация каждого играет определенную роль в модулировании функций хроматина, не считаясь с тем, что эти молекулярные феномены играют определяющую роль в регуляции генетической информации. Множество других модификаций, включая, но не ограничиваясь только перечисленными — а именно, фосфорилированием, рибозилированием, убиквитинированием и сумоилированием, являются характерными для гистонов хроматина и играют важную роль в организации синтаксиса для координации хроматин–ДНК взаимодействия. Динамические изменения, которые вносят вариантные формы гистонов и их посттрансляционные модификации, 26 происходят в течение жизни организма и, похоже, вариантны в каждом типе клеток. Более того, эти динамические изменения являются специфичными в индивидуальных генных локусах, в эухроматине, конститутивном гетерохроматине и прицентромерном гетерохроматине. В литературе придается повышенное значение этим изменениям как коррелирующим с процессами активной экспрессии информации ДНК в хроматине, такой как транскрипция, репликация и репарация. Штраль и Аллис высказали гипотезу, что комбинации гистоновых модификаций, действуя вместе, образуют код сродни классическому генетическому коду, который различными комбинациями нуклеотидов детерминирует включение аминокислот. Гистоновые модификации, т. е. химические изменения, подобные фосфорилированию, ацетилированию и метилированию, генерируют специфический язык, который интерпретируется через способность рекрутировать белки, модулирующие хроматин. Штраль высказался так: «Текст гистонового кода более сложный, поскольку известно более 100 гистоновых модификаций и они работают в трехмерном пространстве, что очень трудно визуализовать. Сейчас мы не можем сказать, что эти определенные текстовые «марки» или комбинации модификаций будут всегда обозначать одно и тоже. Но я думаю, мы можем сказать, что множественность модификаций может быть толчком перехода одного сбалансированного состояния хроматина в другое, превращая ДНК в более или менее доступную для белковой машинерии». Использование иммуноблоттов, которое стало возможным с развитием техники производства специфических антител, показало, что связывание тех или иных модулирующих хроматин белков сильно зависит от модификаций соседних гистонов. «Этот результат дает дальнейшее подтверждение идеи гистонового кода, способность белков связываться с гистонами может зависеть от определенного ландшафта модификаций, а не от одной модификации», — сказал 27 Штраль. «Присутствие ацетилированного сайта по соседству будет влиять на связывание белков, предназначенных для связывания фосфорилированных сайтов. Все вместе эти модификации генерируют ландшафт, который жизненно важен и определяет, как белки читают гистоновый код. Метилирование гистонов по остаткам лизина и аргинина отгоняет специфических считывателей, которые несут собственные ферментативные комплексы ремоделирования хроматина, пишущие и подчищающие модификации гистонов». Сумма этих модификаций гистоновых вариантов и метилирование ДНК оборазуют молекулярный фундамент эпигенетической информации. Таким образом, эпигенетика может быть определена как информационное содержание, которое увеличивает сложность генома без изменения геномной последовательности. 1.1.5. Белковые комплексы, ремоделирующие хроматин Динамичная природа хроматина вытекает из двух механизмов, которыми обладает хроматин. Первый основан на ковалентных модификациях N-концов гистонов и не требует затрат энергии гидролиза АТФ. Второй механизм требует гидролиза АТФ, энергия которого необходима для передвижения нуклеосом, что и приводит к феномену доступности ДНК. И хотя эти механизмы различны, в клетке они функционально связаны и взаимозависимы. В большинстве случаев эти два механизма сосуществуют в одних и тех же комплексах, либо характерны для различных комплексов, но функционирование и тех, и других необходимо для максимальной доступности ДНК в хроматине при активации транскрипции, репликации и репарации ДНК. Существует достаточно большое число моделирующих или ремоделирующих хроматин комплексов, а также механизмов для мобилизации или сообщения нуклеосомам подвижности. Исследования последних лет показали, что функционально различные комплексы, ответственные за ремоделирование хроматина, используют для этой цели общие или подобные механизмы. 28 Первым комплексом, который был идентифицировани как обладающий функцией ремоделирования хроматина, был комплекс SWI/SNF из дрожжей. Сначала он был идентифицирован как регулятор определенного типа спаривания «switching» (SWI) или как источник энергии, другой, нежели сахароза (SNF — sucrose nonfermenting). В дрожжах, а затем в клетках Drosophila и человека были открыты два варианта комплекса SWI/SNF — SWI/SNF и RSC. Содержание комплекса RSC в клетках оказалось намного большим, чем SWI/SNF; кроме того, выяснилось, что RSC важен для роста клеток, а SWI/SNF — нет. RSC может функционировать в виде двух различных комплексов, отличающихся по набору функционально активных субъединиц. Каталитическая субъединица SWI/SNF, обладающая АТР-азной активностью, это Swi2/Snf2. В составе RSC функционирует ее паралог — субъединица Sth1. В клетках Drosophila комплекс SWI/SNF представлен двумя формами, также отличающимися субъединичным набором, в клетках же человека помимо двух форм SWI/SNF с различным набором субъединиц существует еще довольно много форм этого комплекса, которые отличаются присутствием тканеспецифичных субъединиц. Известна еще одна субформа SWI/SNF клеток человека, которая включает функциональные субъединицы, обладающие активностью гистоновых деацетилаз и гистоновых метилаз. Таким образом, роль комплекса SWI/SNF существенно шире, чем считали ранее. В клетках млекопитающих этот комплекс участвует во многих программах, таких как развитие мышечной ткани, сердечной мышцы, нейронов, адипоцитов, а также иммуной системы Т-клеток. Комплекс SWI/SNF дрожжей вовлечен в ранние этапы гомологичной рекомбинации хромосом, RSC — в хромосомную сегрегацию. В субъединицах комплекса SWI/SNF идентифицированы структурные домены, которые обеспечивают возможность связывания этого комплекса с ДНК или гистонами и, таким образом, способствовать SWI/SNF в «захвате» нуклеосом для эффективного реструктурирования. По 29 данным R-структурного анализа АТФазный домен SWI/SNF состоит из 7 субдоменов, организованных в виде «кулачков», совмещенных с геликазным мотивом, что образует подобие кармана для связывания ДНК. Все известные в настоящее время АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы являются родственными по гомологии их АТФазного домена и распадаются на несколько консервативных семейств: Swi/Snf, ISWI, Chd/Mi2, Ino80 и Rad54. Другие индивидуальные компоненты, или субъединицы, этих комплексов обладают множеством структурных и функциональных активностей: белок Swi2/Snf2 на С-конце молекулы содержит бромодомен, который способен специфично узнавать ацетилированные остатки лизинов в N-терминальных «хвостах» гистонов, белок Swi1 содержит специфический домен ARID (AT-rich interaction domain). ARID-домен обладает способностью связывать ДНК зависимо и независимо от нуклеотидной последовательности. ARID-домен образует структуру спираль–повот–спираль, которая предпочтительно связывает АТбогатые участки ДНК. Swi3 несет два функциональных домена с выраженной аффинностью к нуклеосомам и ДНК, которые, соответственно, названы SWIRM и SANT. SWIRM — это консервативный домен, который имеет множество паралогов у других организмов и является компонентом комплекса гистоновых ацетилтрансфераз, а также гистоновых деметилаз. SWIRM-домен белка Swi3 существенен для включения Swi3 в комплекс SWI/SNF и необходим для функционирования SWI/SNF in vivo. SANT-домен найден в составе компонентов большинства АТФ-зависимых ремоделирующих комплексов и в ферментах, модифицирующих гистоны, и имеет к ним выраженную аффиность. В составе SANT-домена, длиной около 50 аминокислотных остатков, идентифицирован домен спираль–поворот–спираль, содержащий много ароматических аминокислотных остатков, ДНК- 30 связывающий домен, характерный для гистоновых ацетилтрансфераз и транскрипционного фактора TFIIIB. Первые члены ISWI-семейства, ремоделирующих хроматин комплексов, dNURF и dCHRAC, были идентифицированы в клеточном экстракте из эмбрионов Drosophila при попытке исследовать активность, которая позволяет факторам транскрипции связаться со специфическим промоторами на ДНК в присутствии нуклеосом. В дальнейшем такие активности были обнаружены в дрожжах, клетках человека, мыши и шпорцевой лягушки. Субъединица, обладающая АТФазной активностью, получила название ISWI (Imitation SWI), так как обладала АТФазной активностью, характерной для Swi2/Snf2. В составе ISWI идентифицировано несколько структурных доменов. Помимо подобных Swi2/Snf2 АТФазных доменов, ISWI содержит домены SANT и SLIDE (SANT-like ISWI domain), HAND и AID (Acf1 interaction domain). Домены SANT и SLIDE в ISWI связаны между собой высококонсервативной спейсерной спиралью. Домен SLIDE в составе ISWI отвечает за связывание ДНК, делеции в этом домене приводят к значительной потере АТФазной активности ISWI. Делеции по доменам SANT или SLIDE раздельно не приводят к потере активности по связыванию нуклеосом, но делеции по обоим доменам одновременно такую активность элиминируют. В составе субъединиц ISWI обнаружены бромодомены и ДНКсвязывающие гомеобоксы. Комплексы этой группы относительно невелики (300–800 кДа) и включают 2–4 субъединицы, тогда как семейство SNF2 и другие, ему подобные CHD, INO80, состоят из 15 субъединиц с молекулярной массой до 2 МДа. В клетках эмбрионов дрозофилы семейство, включающее ISWI, состоит из трех различных комплексов: NURF, ACF, CHRAC. NURF (Nucleosome remodeling Factor) включает четыре субъединицы. Впервые NURF был идентифицирован как активность, 31 способная сделать промотор гена белка теплового шока БТШ70 доступным для транскрипционного фактора GAGA. АТФазная активность этого комплекса зависит от нуклеосом, но не от свободной ДНК. В комплексе SWI/SNF АТФазная активность в равной степени стимулируется и свободной ДНК, и нуклеосомами. NURF способен активировать транскрипцию in vivo и in vitro. Активация транскрипции с помощью NURF связана с передвижением нуклеосом вдоль молекулы ДНК и присуща самой крупной субъединице комплекса – NURF301. Направление передвижения нуклеосом модулируется транскрипционным фактором Gal4. В клетках эмбрионов Drosophila ISWI является компонентом другого мультисубъединичного комплекса ― ACF (ATP-utilasing chromatin factor), который участвует в сборке хроматина и распределяет гистоновые октамеры вдоль молекулы ДНК, образуя достаточно протяженные нуклеосомные области. ACF при сборке хроматина нуждается в гистоновых шаперонах. Негистоновый архитектурный белок HMGB1 регулирует ремоделирующую активность ACF, действуя как ДНК-шаперон, который может снижать уровень изгибания (кинкирования) ДНК. ACF транслоцируется вдоль ДНК в процессе сборки хроматина. В ядрах эмбрионов Drosophila ACS/CHRAC среди комплексов, ответственных за ремоделирование хроматина, являются преобладающими. CHRAC (chromatin accessibility complex) состоит из четырех субъединиц и включает субъединицу ISWI. Этот комплекс также генерирует области или пространства регулярно расположенных нуклеосом при формировании хроматина в делящихся клетках. В Saccharomyces cerevisiae найдены два гена ISWI — ISW1 и ISW2, которые высоко гомологичны генам ISWI дрозофилы. Семейство CHD-1 (chromodomain-helicase DNA binding protein). CHD-1 впервые был выделен из клеток мышей как белок, обладающий одновременно свойствами АТФазы Swi2/Snf2 семейства и свойством, присущим Polycomb/HP1 семейству белков, содержащих 32 хромодомен. Позднее гомолог CHD-1 дрозофилы был обнаружен в пуфах политенных хромосом, где, как известно, очень высока транскрипционная активность. Хромодомен и геликазный домен, как оказалось, необходимы CHD-1 для ассоциации с хроматином. CHD-1, идентифицированный в дрожжах, является ремоделирующим нуклеосомы фактором с зависимой от АТФ активностью, который может репозиционировать нуклеосомы вдоль ДНК. В отличие от действия SWI/SNF, подвижность (передвижение) нуклеосом с помощью CHD-1 не сопровождается экспонированием больших фрагментов нуклеосомной ДНК, как это имеет место при действии SWI/SNF. Семейства INO80 и SWR1. И INO80, и SWR1 являются крупными комплексами, включающими 15 и 14 субъединиц, соответственно. Оба комплекса участвуют в активации транскрипции и репарации ДНК. Ino80, самая крупная субъединица комплекса, содержит консервативный АТФазно-геликазный домен. В то время как АТФазно-геликазный домен суперсемейства SNF2, т. е. Swi2/Snf2, и ISWI являются по структуре непрерывными, АТФазно-геликазный домены Ino80 и Swr1 разделены большой спейсерной областью. В составе INO80 помимо субъединицы Ino80 идентифицированы актин и три родственных актину белка. Исследование структуры INO80 методом скоростной седиментации показало, что комплексу принадлежат все 15 субъединиц. Комплексы INO80 и SWR1 обладают гомологичными или родственными по функциональной активности субъединицами. Открытие SWR1 (Swi2/Snf2 related) комплекса определило открытие новой активности, ремоделирующей хроматин, зависимой от АТФ, но включающей вариантные формы гистонов. В одно и то же время три группы исследователей обнаружили новый комплекс, состоящий из 13 субъединиц, который взаимодействовал с гистоном Н2А.Z. Каталитическая субъединица этого комплекса Swr1 содержала АТФазный домен, родственный Snf2. In vitro Swr1 катализировала 33 замещение димера Н2А–Н2В на димер Н2А.Z–Н2В, зависимое от гидролиза АТФ и независимое от репликации. SWR1 имеет четыре общие субъединицы с комплексом NuA4HAT-специфической ацетилтрансферазы гистонов и вместе с ним эффективно блокирует распространение гетерохроматинизации. 1.1.6. Механизм ремоделирования нуклеосом И ISWI-содержащий комплекс, и SWI/SNF способны изменять положение нуклеосом, но различаются по способности дестабилизировать нуклеосомы. Это различие очень наглядно демонстрирует метод рестрикции эндонуклеазами. Комплекс SWI/SNF превращает нуклеосомную ДНК в доступную эндонуклеазам, предпочтительно образуя петли на поверхности нуклеосом. Усиление чувствительности нуклеосомной ДНК к эндонуклеазам, вызванное ремоделирующим действием SWI/SNF, не сопровождается перемещением нуклеосом вдоль ДНК в линкерную область. Комплекс ISWI, наоборот, не вызывает усиления чувствительности нуклеосомной ДНК к эндонуклеазам при ремоделировании, но при этом нуклеосома передвигается достаточно далеко от собственного сайта на ДНК в линкерную область. Эти различия наглядно отражают ту роль, которую играют эти комплексы в регуляторных процессах. Комплекс SWI/SNF, ремоделируя нуклеосомы, превращает их в доступные действию активирующих и репрессирующих транскрипцию факторов, тогда как основная функция комплексов семейства ISWI — участие в передвижении нуклеосом для установления репрессивного хроматинового окружения. И ISWI-содержащий комплексы, и SWI/SNF сообщают нуклеосомам подвижность, используя механизм выпетливания ДНК на поверхности нуклеосомы. Различия в ремоделировании заключаются в размерах шага, на который происходит выпетливание ДНК, и, тем самым, обеспечивается перемещение нуклеосомы вдоль 34 ДНК. ISWI обеспечивает маленький шаг по ДНК, около 10 п.о., что происходит через формирование небольшой выпуклости в ДНК на поверхности нуклеосомы. Такой же механизм осуществляется и при ремоделировании с помощью комплекса NURF. Эти данные были получены при использовании метода пришивки гистонов к ДНК через гидроксильные радикалы. Однако используемый метод имеет определенные недостатки. Так, реконструирование нуклеосом на ДНК in vitro происходит с высокой аффинностью к гистоновым октамерам и предпочтительным позиционированием нуклеосом в самых выгодных позициях, что необходимо учитывать при оценке шага, на который может быть перемещена нуклеосома. Другой подход заключается в картировании, когда нуклеосомы не жестко пришиты к ДНК. Шаг перемещения нуклеосом наблюдали при гидролизе одной молекулы АТФ с помощью ISW2. Реакция протекала слишком быстро, и оказалось, что новая позиция нуклеосомы была не столь выгодна термодинамически, что являлось результатом скорее внутренних свойств ДНК-матрицы, чем действия ISW2. Были разработаны оптимальные условия гидролиза АТФ, когда скорость гидролиза существенно понизили до 0.52 молекул АТФ в секунду. Это дало возможность адекватно оценить ремоделирующий ответ ISW2. Было показано, что ISW2 перемещает нуклеосому на 9–11 п.о., и для этого нужна энергия гидролиза 1 молекулы АТФ. Подобные эксперименты с SWI/SNF, где скорость гидролиза АТФ была еще ниже — 0.36 молекул в секунду, показали, что на той же матрице ДНК SWI/SNF перемещает нуклеосому на 52 п.о. Это перемещение идет в два этапа: на первом происходит потеря контакта гистона Н2А с ДНК и затем этот контакт Н2А-ДНК восстанавливается через 52 п.о. от предыдущей позиции нуклеосомы. Приведенные данные свидетельствуют в пользу того, что SWI/SNF может на первом этапе освободить большой сегмент ДНК на поверхности нуклеосомы, который превратится в большое ДНК- 35 выпячивание. После чего это выпячивание может мигрировать по поверхности нуклеосомы, контакт с гистоном Н2В при этом не разрушается. 1.1.7. Общие свойства механизмов ремоделирования комплексов ISWI и SWI/SNF Последние данные сформулировали ключевые аспекты того, как транслокация ДНК справляется с более чем 100 контактами ДНК– гистоны, участвующими в архитектуре нуклеосом. Футпринтинг с высоким разрешением показал, что ISW2 контактирует на нуклеосоме с тремя разными сайтами: линкерной ДНК, 10 п.о. внутри нуклеосомной ДНК и в сайте вход–выход, а также 10 п.о. в сайте SHL-2 — сайте оси двойной симметрии. Сайт, где ДНК транслоцировалась при ремоделировании, был определен через блокирование транслокации посредством внедрения 1 нуклеотидной вставки в ДНК. Сканирующий подход был использован для определения области, где этот вставленный нуклеотид (гап, gap) интерферировал бы ремоделирование, вызываемое ISW2. Был сконструирован набор нуклеосом с 1 нт-гапами в разнообразных позициях на ДНК. Эти нуклеосомы использовали при ремоделировании с помощью ISW2, а ремоделированные нуклеосомы и неремоделированные нуклеосомы затем разделили методом электрофореза. Распределение ДНК-гапов сравнили в ремоделированных и неремоделированных нуклеосомах. Оказалось, что лишь единственная область, включающая гап, интерферировала с ремоделированием ISW2 — это область, локализованная на растоянии двух витков спирали от оси двойной симметрии. Это был неожиданный результат; однако оказалось, что условием ремоделирования и транслокации нуклеосом для NURF, SWI/SNF, RSC является область около оси двойной симметрии. SWI/SNF из дрожжей обладал 3'–5' специфичной транслокационной активностью. 36 1.1.8. Модели перемещения (транслокации) нуклеосом Существуют несколько моделей, описывающих, как ДНК транслоцируется внутри нуклеосомы, вызывая нуклеосомное перемещение. Первая модель «twisting» предполагает, что ДНК движется волной в 1 п.о. от сайта транслокации до кромки нуклеосомы. Достоинством этой модели является то, что она допускает движение ДНК за пределы нуклеосомы без изменений в структуре коровых частиц. Это передвижение, или транслокация, происходит за счет торсионных сил, возникающих при суперспирализации ДНК. Кристаллография нуклеосом показывает, что на поверхности нуклеосомы суперспирализованная ДНК возникать может. Однако не все данные согласуются с этой моделью, так как шаг движения нуклеосомы гораздо больше, чем 1 п.о. Существуют еще некоторые данные, которые не укладываются в эту модель. Вторая модель ― это модель «возвращенной петли». Она предполагает, что транслокация нуклеосом синергично функционирует вместе с ремоделирующим комплексом и создает на поверхности нуклеосомы ДНК-выпячивание размером не менее 10 п.о. ISW2 контактирует с нуклеосомой в двух сайтах, один из которых может располагаться на линкерной ДНК, второй — внутри нуклеосомы. Контакты ISW2–ДНК могут вызывать конформационный сдвиг, результатом чего может быть открытие сайта и запуск отрыва суперспирализованной ДНК от поверхности нуклеосомы для высвобождения торсионного напряжения в ДНК. Образуется небольшое выпячивание ДНК между сайтом входа и сайтом транслокации, оно задерживается на поверхности нуклеосомы до тех пор, пока один из двух мажорных контактов ISW2 не разрушится. Благодаря однонаправленному движению нуклеосомы, которое наблюдали при действии ISW2, контакт внутри нуклеосомы необходим для того, чтобы осуществилось последовательное распространение выпячивания и правильное движение ДНК по 37 нуклеосоме. Модель могла бы описывать и механизм транслокации с помощью SWI/SNF, но необходимы некоторые дополнения. Взаимодействие SWI/SNF с нуклеосомной ДНК более жесткое, чем у ISW2, и поэтому потенциально может создаваться более крупное выпячивание (петля). Транслокация ДНК остается тем моментом, который запускает высвобождение ДНК от поверхности нуклеосомы, и, скоординированное с жестким связыванием SWI/SNF с этим сайтом ДНК, оно вызовет образование большей петли ДНК для распространения вокруг нуклеосомы. Более подробные данные для модели «возвращенной петли» и распространением выпячивания ДНК были получены в опытах с этидиумом бромидом, когда наблюдали передвижение нуклеосом при действии ACF, ремоделирующего комплекса Drosophila. Этидиум бромид интеркалирует в свободную ДНК лучше, чем в ДНК, организованную в нуклеосомы. Если нуклеосомная ДНК становится доступной интеркаляции этидиумом бромидом в процессе передвижения, специфические сайты интеркаляции обнаруживаются с помощью индуцированного лазером одноцепочного разрыва в сайте интеркаляции. Интеркаляция этидиумом бромидом зависела от ACF, но не зависела от АТФ. Это означает, что взаимодействие ремоделирующего компонента генерируется свободной ДНК на поверхности нуклеосомы. Далее ACF может ремоделировать нуклеосомы даже когда ДНК модифицирована биотином. Это указывает на то, что «возвращенная петля» является действенным механизмом для передвижения нуклеосом. 1.1.9. Направление передвижения нуклеосом. Роль сопутствующих факторов Первые данные определения направления движения нуклеосом были получены для Drosophila. Каталитическая субъединица ISWI, обладающая АТФазной активностью, является компонентом комплексов NURF, ACF и CHRAC. ISWI самостоятельно способна передвинуть нуклеосому из центра к концу ДНК-фрагмента. CHRAC, 38 который включает субъединицу Acf1 и два небольших белка, отвечающих за фолдинг гистонов, в дополнение к ISWI, осуществляют передвижение нуклеосом от конца ДНК к центру. Acf1, вероятно, отвечает за выбор направления, так как добавление Acf1 и ISWI раздельно приводит к изменению направления в характерное для CHRAC. Картировано взаимодействие сопутствующих факторов с ДНК. Так, Isw2 требует для взаимодействия длину линкера не менее 67 п.о. Преобладающее количество этой линкерной ДНК взаимодействует с белком Itc1. Itc1 очень жестко связывается с линкерной ДНК, в менее жесткой манере с ней взаимодействует субъединица Isw2. Взаимодействие Itc1 с линкерной ДНК создает стерический блок, который не допускает соскальзывание нуклеосом слишком близко друг к другу. Itc1 не только взаимодействует с линкерной ДНК, но и ориентирует комплекс через этот контакт. Когда выпячивание захватывается нуклеосомой, Its1 помогает ему распространяться в правильном направлении и предотвращает вход петли в линкерную область. Таким образом, петля может достичь другого конца нуклеосомы, и нуклеосома направленно передвинется. Отсутствие дополняющих субъединиц, таких как Itc1 и Acf1, могут дезориентировать направление ремоделирующего комплекса при передвижении нуклеосом. Нуклеосомный интервал определяется как распределение нуклеосом в пространстве с одинаковой длиной линкерной ДНК между нуклеосомами. Это особенно важно при формировании хроматина в процессе репликации ДНК. Только ISWI-содержащий класс ремоделирующих комплексов обладает способностью правильно распределять в пространстве, или спайсировать, нуклеосомы. ACF и CHRAC дрозофилы и человека, RSF человека, Isw1a и Isw2 дрожжей способны распределять нуклеосомы. Isw2 тоже может правильно распределять нуклеосомы, но не столь точно, как это делает Isw1a. Молекулярная основа этого свойства ISWI непонятна. Содержащие ISWI ремоделирующие комплексы, которые 39 проявляют строгое предпочтение при выборе направления движения нуклеосом, могут не обладать свойством спайсирования. Isw1b ремоделирует нуклеосомы, при этом они могут двигаться и от центра к концу ДНК-фрагмента и наоборот, но комплекс с этой каталитической субъединицей не может спайсировать нуклеосомы. Isw1a вызывает движение нуклеосом лишь в одном направлении, но может их правильно распределять вдоль ДНК. Isw2 распределяет нуклеосомы через каждые 200 п.о., размер линкера при этом составляет 67 п.о. Isw1a распределяет нуклеосомы через каждые 175 п.о., а линкер составляет 30 п.о. Распределение нуклеосом с помощью Isw2 функционально вытекает из аффинности к линкерной ДНК, что диктует его субъединица Itc1. Экстенсивное связывание Itc1 с линкером не допускает движение нуклеосом слишком близко друг к другу и, таким образом, степень жесткости взаимодействия с линкерной ДНК детерминирует распределение нуклеосом. Последние данные указывают, что в регуляцию скольжения нуклеосом с помощью Isw2 определенный вклад вносит взаимодействие между линкерной ДНК и «хвостом» гистона Н4, причем это взаимодействие зависит от длины линкерной ДНК. Хвост Н4 рекрутирует Isw2p и Itc1p к сайту SHL2, но это также зависит от длины линкерной или экстрануклеосомной ДНК. Оптимальное рекрутирование хвоста Н4 наблюдали, когда длина линкерной ДНК была 70–85 п.о. Isw1a имеет другой размер линкера при распределении нуклеосом. Isw1a взаимодействует и с сайтом входа, и с сайтом выхода ДНК на нуклеосоме одновременно, когда длина экстрануклеосомной ДНК составляет только 30 п.о. с обеих сторон от сайтов входа–выхода, то взаимодействие с «хвостом» гистона Н4 не происходит. 1.1.10. Роль модификаций гистоновых ―хвостов‖ в ремоделировании хроматина Первые данные о роли N-концевых хвостов гистонов в ремоделировании нуклеосом были получены в экспериментах по 40 удалению хвоста гистона Н4, что повлияло на ремоделирующую активность NURF. От вида модификации гистона Н3 по лизину в 9-м положении (ацетилирование или метилирование) зависит рекрутирование PHD домена NURF. Эти модификации влияют также на рекрутирование Isw1p АТФазы в хроматин. Однако потребность в модификациях «хвоста» гистона Н4 не является общей для ремоделирующих комплексов. Ацетилирование гистона Н3 в глобулярной части вместо «хвоста» облегчает связывание SWI/SNF. Повышенное связывание SWI/SNF может происходить из-за того, что ацетилирование гистона Н3 у сайта входа–выхода ДНК дестабилизирует нуклеосому. Целостность глобулярной части гистона Н3, видимо, важна для связывания SWI/SNF. 1.1.11. Модель регуляции активности хроматина Ферменты, модифицирующие гистоны, внедряют посттрансляционые модификации, которые и приводят к активации или репрессии транскрипции в зависимости от типа химических модификаций гистонового октамера. Исследования показали, что экспонированные над поверхностью нуклеосом подвижные NH2«хвосты» гистонов являются мишенями для большого числа функционально значимых модификаций. Можно предположить, что особый набор модификаций гистонов образует «гистоновый код», который может участвовать в изменении структуры высшего порядка хроматина и помогает рекрутировать молекулы-эффекторы. Установлено достаточно большое разнообразие модификаций в гистонах, локализованых не только в «хвостах», но и в глобулярных частях гистонового кора. Некоторые из этих модификаций влияют на связывание ДНК с нуклеосомной поверхностью, но большинство модификаций не могут участвовать и вмешиваться в накручивание ДНК на гистоновый октамер. Исходя из этих представлений была сформулирована модель модуляции динамики хроматина, модель «регулируемой нуклеосомной мобильности», в которой изменение аффинности 41 гистонового октамера к ДНК является результатом изменения балланса между мобильными и относительно стационарными нуклеосомами. Модель предусматривает, что модификации глобулярной части гистонового кора регулируют ДНК–гистоновое взаимодействие. В основе механизма регуляции активности хроматина лежит контроль с помощью факторов, которые регулируют равновесие между нуклеосомами с низкой мобильностью и нуклеосомами с высокой мобильностью. Эта модель является основой для понимания того, как ферменты, осуществляющие посттрансляционные модификации и АТФ-зависимое ремоделирование нуклеосом, работают «in concert» для катализа нуклеосомной мобильности. Кроме этого, модель призвана объяснить, как работает гистоновый код. Природа разработала тонкий механизм деликатного балланса между упаковкой хроматина в ограниченном объеме клеточного ядра и доступности последовательности ДНК для макромолекулярных комплексов. Центром этого является нуклеосома, где из глобулы торчат NH2-терминальные «хвосты» гистонов, которые не структурированы в контекст нуклеосомы, но участвуют в формировании хроматиновой структуры высшего порядка за счет взаимодействия с другими, помимо гистонов, белками хроматина. Гистоновый кор связывает остов ДНК в 14 точках суперспирали, образуя более 100 атомных взаимодействий. Несмотря на это, нуклеосомы весьма динамичны и могут скользить вдоль ДНК на существенные расстояния. Энергетический барьер для скольжения in vivo покрывается за счет гидролиза АТФ с помощью АТФ-зависимых комплексов, ремоделирующих хроматин. Ремоделирующий хроматин комплекс ослабляет контакты гистон–ДНК, генерируя стабильное ремоделирование нуклеосомы, что усиливает ее мобильность и делает ДНК более доступной для взаимодействия с белками. Предложены несколько моделей ремоделирования хроматина. Выше описаны модели транслокации нуклеосом и роли отдельных 42 компонентов ремоделирующих комплексов в этом механизме. Однако эти модели не до конца используют и объясняют все известные в настоящее время данные о регуляции активности хроматина. Так, модель «twisting» не может объяснить тот факт, что одиночные разрывы в ДНК не вызывают смещения нуклеосом. Модель «возвращенной петли» предполагает, что линкерная ДНК, лежащая на пути гистоновых перемещений, подтягивается к нуклеосоме для замещения раскрученного сегмента ДНК. Смещение петли ДНК по нуклеосоме может приводить к смещению самой нуклеосомы. Однако не было убедительно продемонстрировано, как эта модель может быть использована для объяснения возникновения стабильно ремоделированных нуклеосом, которые сохраняют высокую доступность ДНК и усиливают уровень смещения (скольжения) нуклеосом даже после удаления ферментов, ответственных за ремоделирование нуклеосом, и в остсутствие гидролиза АТФ. Посттрансляционные модификации гистнов могут изменять активность хроматина, генерируя места связывания для белковых доменов, узнающих специфические гистоновые модификации. Ацетилирование и метилирование являются химическими маркерами, которые могут запускать рекрутирование белков, специфически влияющих на хроматин или ДНК. Фосфорилирование по тирозину/серину/триптофану и убиквитинилирование по лизину могут быть одинаково узнаваемы специализированными доменами. Плотное распределение многих из этих модификаций в Nтерминальных «хвостах» гистонов ведет к предположению, что наборы определенных комбинаций модификаций могут узнаваться специфически. Исследования методом масс-спектрометрии идентифицировали значительное число новых модификаций гистонов, локализованных в коре гистонового октамера. Хотя все предыдущие модификации были идентифицированы на N-терминальных концах гистонов октамера, 43 локализация модификаций на хорошо структурированной глобуле кора нуклеосомы сделала возможным картировать достаточно точно их локализацию на нуклеосоме. Было смоделировано расположение этих модификаций на октамеровом коре нуклеосомы хроматина дрожжей с разрешением 3.1 Å и показано, что много модификаций гистонов присутствует на ДНК–белковом интерфейсе. На нуклеосомах Xenopus эти модификации гистонового кора были идентифицированы с разрешением 1.9 Å. 27 модификаций гистонов были картированы на корах нуклеосом, 12 из них расположены так, что не участвуют во взаимодействии с ДНК. Остальные 15 лежат на поверхности коровой частицы, которая и является ДНК–белковым интерфейсом. Положение модифицированных остатков на внешней поверхности кора нуклеосомы образует блокированный «железнодорожный тракт», подобно фосфорилированным серину и треонину, метилированным лизину и аргинину и ацетилированному лизину, которые образуют «тропинку» для накручивания ДНК вокруг гистонового октамера. Какие-то из этих модификаций участвуют во взаимодействии с ДНК, подтверждая, что они могут прямо модулировать ДНК–гистоновые взаимодействия. Это наблюдение может дать другую картину свободной энергии ДНК–гистоновых взаимодействий. Предполагается, что различные комбинации ковалентных модификаций на внутренней поверхности нуклеосомы влияют на относительный уровень нуклеосомной мобильности. Стабильные модификации, например, метилирование лизина, может быть механизмом, определяющим различный базальный уровень мобильности нуклеосом в зависимости от типа хроматина и положения метильных меток. Дальнейший контроль нуклеосомной мобильности может достигаться с помощью обратимого фосфорилирования и ацетилирования. Присутствие модифицированных гистонов на поверхности кора нуклеосомы показывает, что модификации могут играть прямую роль в модуляции ДНК–гистоновых взаимодействий в нуклеосоме, могут 44 детерминировать стабильность нуклеосомной позиции и легкость, с которой нуклеосома может транслоцироваться вдоль ДНК. Равновесие может регулироваться совместным действием макромолекулярной машины, ремоделирующей нуклеосомы, и ферментов, модифицирующих гистоны, которые модифицируют также и остатки коровых гистонов на ДНК–гистоновом интерфейсе как в присутствии, так и при отсутствии нуклеосомной ДНК. Этот макроммолекулярный комплекс включает АТФ-зависимые ферменты, ремоделирующие нуклеосомы, которые катализируют либо нуклеосомный момент, либо вариант изменения гистона, а также молекулярные машины, собирающие и деградирующие нуклеосомы. Через модуляцию энергии ДНК–гистонового взаимодействия достигается доступность геномной ДНК и регуляция упаковки ДНК в хроматине в структуры высшего порядка. Модель регуляции нуклеосомной мобильности может быть использована для объяснения механизма нуклеосомной подвижности с помощью АТФ-зависимых ремоделирующих ферментов. Энергия гидролиза АТФ используется для экспонирования потенциального сайта для посттрансляционной модификации на интерфейсе нуклеосомы, что в противном случае может быть блокировано суперспирализацией ДНК. Одна или более таких экспонированных цепей могут быть затем химически модифицированы ферментами, модифицирующими гистоны, что приведет к разрушению оптимальных ДНК–гистоновых контактов и позволит гистоновому октамеру скользить вдоль цепи ДНК до достижения стабильного ремоделированного состояния. Мобильные нуклеосомы могут далее быть более готовыми к транслокации белками-ферментами, которые должны получить доступ к ДНК для репликации, репарации, рекомбинации и транскрипции. Нуклеосомы могут быть возвращены в менее мобильное состояние путем удаления обратимых модификаций, таких, как ацетилирование и фосфорилирование, опять же с помощью АТФ-зависимых ферментов, ремоделирующих 45 нуклеосомы через экспозицию (доступность) коровых гистонов действию гистновых деацетилаз и фосфатаз. Эта модель легко объясняет, как АТФ-зависимые ремоделирующие ферменты могут и активировать, и ингибировать хроматин. Модель осуществляет механистическую связь между ремоделированием нуклеосом и ковалентными модификациями гистонов и объясняет, почему некоторые АТФ-зависимые комплексы, ремоделирующие нуклеосомы, включают ферменты, модифицирующие гистоны. На системе из дрожжей было показано, что мутации в субъединицах комплекса SWI/SNF, ремоделирующего нуклеосомы, являются летальными в присутствии мутаций в компонентах GCN5-зависимой гистоновой ацетилтрансферазы (HAT), подтверждая, что эти комплексы функционально взаимосвязаны в дрожжах. Несколько субъединиц SWI/SNF комплекса являются общими с комплексом Gcn5p, содержащим и HAT, и бромодомен Gcn5, которые необходимы для стабильного связывания SWI/SNF с промотором in vivo. И, наконец, комплекс SWI/SNF может генерировать стабильное ремоделированное состояние в нуклеосомах, сохраняющееся даже после его удаления. С позиций данной модели это подтверждает факт, что ассоциированная с Gcn5p HAT-активность ацетилирует остатки коровых гистонов внутренних нуклеосомных поверхностей, редуцируя энергию взаимодействия гистонов с ДНК и позволяя усиленной нуклеосомной мобильности, однажды созданной, сохраняться. Модель регулируемой нуклеосомной мобильности нашла строгое подтверждение при использовании генетических методов скрининга, Sin-мутаций в комплексе SWI/SNF и гистоновых октамерах, которые снижают зависимость экспрессии определенных генов от действия этого комплекса в дрожжах. Вывод, который сделали авторы этой работы, указывает на то, что в зависимости от положения Sin-мутаций наблюдали двойственный эффект. Sin-мутации по гистонам, локализованные в специфичных петельных областях гистоновых октамеров, приводят к снижению сродства ДНК в суперспиральной 46 области 0.5 и гистонового октамера и, тем самым, к усилению нуклеосомной мобильности. Снижение сродства связано с тем, что комплекс SWI/SNF экспонирует остатки гистонов, коровой частицы, делая их доступными для ацетилирования. С другой стороны, Sinмутации компонентов комплекса SWI/SNF или компонентов, обладающих активностью гистоновой ацетилтрансферазы, приводят к снижению уровня доступности коровых гистонов и уменьшению степени ацетилирования, из чего вытекает снижение мобильности нуклеосом и подавление транскрипционной активности хроматина. Модель регулируемой нуклеосомной мобильности предусматривает, что деацетилирование гистонов внутренней поверхности нуклеосом будет сохранять ДНК–гистоновые контакты, усиливая аффиность нуклеосомной ДНК к кору и снижая мобильность нуклеосом. Последние исследования показывают, что гетерохроматинизация может также регулироваться изменением нуклеосомной мобильности. Вопросы для повторения: 1. Структура нуклеосомы, три уровня организации хроматина. 2. Комплексы, ремоделирующие хроматин. 3. Вариантные формы гистонов. Модификации N-концевых «хвостов» гистонов. 4. Домены, узнающие специфические модификации гистонов. 5. Модификации компонентов хроматина. 6. Гистоновый код. 7. Модели транслокации и нуклеосомной подвижности. 8. Модель регуляции активности хроматина. 2. РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ Биосинтез белка — очень хорошо регулируемый процесс в живых клетках, особенно у эукариот. Процесс включает несколько этапов, начинающихся с копирования гена в мРНК в ядре. За этим следует перекодирование мРНК и трансляция в белок уже в цитоплазме. Типичная мРНК производит около 5000 копий белка. 47 Белки включаются в клеточную рибосомную фабрику с точностью швейцарских часов, но когда эти самые белки мутируют или выпадают из правильного контекста, клетка не только перестает в них нуждаться, но и возникает ситуация дезорганизации и предрасположенности к болезням, таким как рак и т. д. Во избежание таких ситуаций природа сама применяет специфические подходы — так сегодня можно трактовать концепцию РНК-интерференции. РНК-интерференция возникла в ранней эволюции, скорее всего как защита от внешней генетической информации. РНК-вирусы и мобильные элементы, способные образовывать двуспиральные РНКструктуры, широко распространенные в природе, являются основными экзогенными компонентами системы выключения генов у растений, червей, насекомых и человека. Помимо этого существуют и эндогенные РНК, которые служат для регуляции экспрессии собственных генов, например в процессе развития, где эндогенные некодирующие РНК после созревания участвуют в выключении собственных генов-мишеней. Для противостояния антивирусному действию РНКинтерференции вирусы растений, насекомых и грибов кодируют РНК-супрессор подавления активности генов малых некодирующих РНК (RSSs). Последние результаты подтверждают, что РНКинтерференция у млекопитающих также вовлечена в антивирусный ответ. В частности, накапливаются данные о том, что клеточные регуляторные микро-РНК обладают способностью подавлять репликацию вирусов в клетках млекопитающих. Подобно вирусам насекомых и растений, некоторые вирусы млекопитающих кодируют специфический фактор, который ингибирует механизм РНКинтерференции. Некоторые из этих факторов являются мультифункциональными белками, ранее известными как блокаторы природного антивирусного иммунного ответа, включая интерфероновый ответ. 48 2.1. Интерферирующие РНК РНКi (РНК-интерференция) впервые была идентифицирована в нематоде Caenorhabditis elegans и далее в D. melanogaster и млекопитающих. Существует достаточно различий между механизмами РНКi у млекопитающих и других эукариот. Растения и черви показали системное выключение генов, основанное на распространении амплифицированного, специфичного по нуклеотидной последовательности, сигнала по всему организму. У C. elegans предполагается, что трансмембранный белок SID1 ассоциирован с распространением информационного генного «замолкания» между тканями, но это не связано с инициацией и накоплением RNAi. Kennedrell и Carthew (2000) показали отсутствие гомолога SID1 в геноме мух. Однако строгое подобие для гомолога SID1 предсказано для человеческого и мышиного белков, что подтверждает возможность того, что РНКi может иметь гомологичный компонент и у млекопитающих. Основное различие млекопитающих и остальных эукариот заключается в отсутствии системы амплификации для удлинения времени присутствия РНКi в клетках млекопитающих. У низших эукариот в растениях и грибах амплификацию интерферирующих РНК осуществляет РНК-зависимая РНК-полимераза, которая отсутствует у млекопитиющих. Так, РНКi в клетках млекопитающих эффективно работает только в течение около 66 ч до того, как siРНК распределится по нескольким клеточным делениям. В то же время, у других эукариот РНКi может присутствовать во многих генерациях, как у Drosophila, где 35 молекул малой интерферирующей РНК (siРНК) могут выключать около 1000 копий мРНК-мишеней и могут присутствовать во многих клеточных генерациях. В случае млекопитающих присутствие длиной двуцепочечной РНК (dsРНК) будет приводить к интерферонному ответу, хотя такой ответ не встречается в других организмах. Процессинг dsРНК в siРНК у низших эукариот АТФ-зависимый, а у млекопитающих такая зависимость не отмечена. Направляемое малыми некодирующими 49 РНК «замолкание» генов — это эволюционно консервативный механизм регуляции активности генов со многими видоспецифичными вариациями. 2.2. Биогенез siРНК SiРНК имеют происхождение из различных по длине и природе предшественников dsРНК и являются экзогенными, хотя в последнее время появились данные о существовании эндогенных малых некодирующих РНК с аналогичными функциями. Две РНКазы участвуют в процессинге dsРНК в siРНК: DICER — это многодоменное семейство РНКаз III, которые инициируют процессинг dsРНК; ARGONAUTE, или SLICER — семейство РНКазы Н, которая гидролизует РНК в составе ДНК–РНК дуплексов; Биогенез siРНК может быть разделен на 3 основных шага. 1. Превращение массы dsРНК в 21–23 п.н. малые фрагменты с помощью ферментов DICER. 2. Помещение малых siРНК в большой мультибелковый комплекс RISC (RNA Induced Silencing Complex). 3. Зависимое от нуклеотидной последовательности выключение (замолкание) родственного гена с помощью RISC, где нуклеотидными гидами служат siРНК. DsРНК-предшественники размером около 70 п.о. подвергаются действию ферментов DICER или DICER-подобных белков, результатом чего является возникновение малых интерферирующих siРНК-дуплексов длиной 21–23 п.н. с 5 –РО4 концом и характерными двумя неспаренными нуклеотидами, выступающими с 3 –ОН конца. 2.3. Ферментативные комплексы процессинга siРНК. Комплекс DICER Эукариотический DICER и DICER-подобные белки включают тандемный повтор каталитических доменов РНКазы III — фермента, специфично разрушающего двуспиральные РНК, фланкированные Стерминальными доменами, связывающими dsРНК, N-терминальным 50 РНК-геликазным доменом и PAZ-доменом (Рис.2.1). Структура интактного DШСУК-комплекса включает PAZ-домен, отделѐнный от доменов РНКазы III плоскостью с избытком положительных зарядов. PAZ-домен является модулем, который связывает конец dsРНК, и прямо связан с доменом РНК-азы III посредством альфа-спирали. Два домена РНКазы III разделены в пространстве большим спиральным доменом. PAZ-домен образует платформу вне РНКазы III и отличается большим положительным зарядом, который взаимодействует прямо с отрицательно заряженным фосфодиэфирным остовом спирали РНК. DICER узнает и нарезает dsРНК на фрагменты размером около 21– 23 п.н. — siRNA. SiРНК–DICER комплексы затем ассиметрично включаются в комплекс RISС. Рис. 2.1. Схема строения ферментного комплекса DICER DICER помимо того, что генерирует siРНК-молекулы, играет также важную роль в помещении одного или двух siРНК-фрагментов в комплекс RISC. Некоторые организмы располагают более чем одним геном, кодирующим DICER, с каждым из которых связаны нарезание dsРНК, имеющих различное происхождение. Но клетки млекопитающих содержат только один ген белка DICER, который участвует в процессинге и miРНК, и siРНК. Геном Drosophila располагает двумя паралогами гена Dicer: Dicer1 участвует в созревании miРНК, а Dicer2 — siРНК. Четыре гена белка DICER идентифицированы в геноме растения Arabidopsis thaliana. Только один ген Dicer идентифицирован у С. elegans. Изучение аминокислотной последовательности показало, что PAZ-домен комплекса DICER несет консервативные участки гидрофобных и гидрофильных аминокислотных последовательностей. 51 Все исследованные белки DICER содержат у N-конца молекулы консервативный домен пролина, состоящий из 11 остатков. Многие белки DICER содержат консервативную область, около 100 аминокислотных остатков, названную «домен с неизвестной функцией 283» — DUF283. Комплекс RISC Формирование комплекса RISC-siРНК, который катализирует деградацию мРНК, — АТФ-зависимый и отражает потребность в энергии, направленной на расплетание siРНК-дуплекса или на другие конформационные или композиционные изменения предсобранного рибонуклеотидного комплекса, содержащего РНК-дуплекс. Основные компоненты активного RISC — это одноцепочечная siРНК и один или несколько белков семейства ARGONAUTE (Ago). У человека типированы семь Ago-белков, которые принадлежат этому семейству, белок Ago2 идентифицирован в комплексе RISC. Белок ARGONAUTE рассматривается как каталитический компонент RISC, который направляется siРНК и разрезает мРНКмишень с помощью эндонуклеазы «slicer». Комплекс RISC включает дополнительный набор субъединиц, весьма существенных для его функционирования. В RISC Drosophila идентифицированы VIG (Vasa Intronic Gene product), dFXR (fragile Xrelated protein) и Tudor–SM (Tudor Stafiloccocal-nuclease domaincontaining protein). Структура белка ARGONAUTE достаточно хорошо изучена. В его составе идентифицированы четыре функциональных домена: Nтерминальный, средний и PIWI-домены, которые образуют основу в виде полумесяца с PIWI-доменом в центре основания, а PAZ-домен (PIWI/ARGONAUTE/Zwille) удерживается с помощью линкера и локализован над основанием (Рис.2.2). Такая архитектура формирует бороздку с большим положительным зарядом между PAZ-доменом и основанием в виде полумесяца и малым положительным зарядом между N-терминальным и PIWI-доменами. PIWI-домен уникален в 52 этом белке, тогда как PAZ-домен является общим с комплексом DICER. PAZ-домен включает около 130 аминокислотных остатков и характерен стабильным фолдингом, который состоит из бета-кора в виде бочонка с двумя придатками для слабого связывания с одноцепочечной РНК, как минимум 5 нуклеотидов длиной, а также с dsРНК. Рис. 2.2. Схематическая структура белка ARGONAUTE PIWI-домен в составе белка ARGONAUTE локализован через основную бороздку от PAZ домена. Его коровый фолдинг характерен для семейства РНКазы Н, содержит два высоко консервативных аспартата на смежных ветвях β-складки. Кристаллическая структура PIWI-домена выявила существование положительно заряженного кармана, представленного двумя остатками аспартата и остатком гистидина, названного DDH-мотив. Мутации по DDH-мотиву приводят к потере «slicer»-активности. Этот мотив обеспечивает место связывания для двухвалентных катионов, предпочтительно Mg2+ или Mn2+ и для захвата 5 –PO4 группы направляющей цепи siРНК. Таким образом, взаимодействие между белком Ago и siРНК облегчает позиционирование направляющей цепи РНК для эффективного гидролиза с помощью эндонуклеазной активности «slicer». Домены PAZ и PIWI взаимодействуют с 5 и 3 выступающими нуклеотидами siРНК-гида и оставляют среднюю 53 часть последовательности siРНК для взаимодействия с мРНКмишенью. Итак, белок Ago связывает оба конца РНК-гида, затем РНК гибридизуется с мРНК-мишенью, после чего мРНК-мишень подвергается гидролизу. В клетках эукариот RISС присутствует в неактивной и активной формах. Превращение неактивной формы RISK в активную наступает после расплетания двуспиральной siРНК. Расплетание siРНК требует затраты энергии, расплетенная и связанная с комплексом антисмысловая цепь, или странда, является гидом для узнавания активным RISC комплементарной мРНК, т. е. является компонентом активной формы RISC. Антисмысловая цепь siРНК образует дуплекс с гомологичной последовательностью в мРНК в виде достаточно несовершенной А-спирали, но комплементарность гетеродуплекса siРНК–мРНК весьма совершенна. М-РНК–мишень дробится комплексом RISC в единичном сайте, который определяется по позиции 5 -конца антисмысловой странды siРНК, связанной с последовательностью-мишенью в мРНК. RISC разрезает комплементарную мРНК в сайте, удаленном на 10 нуклеотидов upstream от 5 -конца дуплекса, образованного между мРНК и siРНКгидом. Реакция гидролиза мРНК не требует энергии АТФ. Однако, множественные раунды гидролиза мРНК, которые необходимы для полного гидролиза мРНК, протекают более эффективно в присутствии АТФ. Комплекс RISC катализирует гидролиз фосфодиэфирных связей в мРНК вплоть до 5 –PO4 и 3 –OH. Такая мишенная реакция гидролиза мРНК требует ионов Mg2+. Гидролиз катализируется PIWIдоменом белка ARGONAUTE. Этот домен является структурным гомологом РНКазы Н — Mg2+-зависимой эндонуклеазы, которая гидролизует РНК-цепь в РНК–ДНК гибридах. Таким образом, два важных условия для достижения успешного выключения мРНК с помощью siРНК определены как: a) 5 -фосфорилирование антисмысловой цепи; б) двойная спирализация гетеродуплекса антисмысловой siРНК и мРНК-мишени, спираль в А форме. 54 А-форма спирали необходима для стабилизации образования гетеродуплекса между siРНК и комплементарного к ней участка мРНК-мишени. Это подтверждено тем фактом, что активность siРНК теряется при возникновении искажения в геометрии А-формы спирали с помощью включения двух нуклеотидов в середину антисмысловой цепи, и никакого изменения siРНК активности не наблюдали после такого включения нуклеотидов в смысловую цепь. 2.4. Micrо-РНК и ее биогенез Другая группа малых некодирующих — РНК-micro (miРНК). MiРНК кодируются в геноме клетки и являются, таким образом, эндогенными по своей природе. Около 1000 miРНК в клетках человека участвуют в регуляции почти 30 % генов. MiРНК играют существенную роль в регуляции широкого спектра биологических процессов, включая клеточный цикл, дифферецировку, клеточное выживание и развитие. Кроме того, регуляция генной активности через miРНК показана в клетках, имеющих отношение к широкому спектру заболеваний человека. Гены, кодирующие мiРНК, транскрибируются РНК-пол II как первичный транскрипт pri-miРНК, который нуждается в целом ряде процессов, чтобы стать зрелой, функционально активной miРНК. PrimiРНК-транскрипт имеет на 5 -конце молекулы 7-метилгуанозиновый кэп (см. разд. 3.1.1.), 3'-полиаденилированный конец (см. разд. 3.1.2) и включает либо одну, либо несколько копий miРНК. Процессинг и механизм действия miРНК частично характерны и для других dsРНК, которые индуцируют замолкание генов. MiРНК подобны siРНК по структуре, но происходят из предшественников, которые имеют шпилечную структуру, где комплементарность шпильки может быть не очень совершенной. Первые два гена miРНК были идентифицированы генетическими методами в гене lin-4 с антисмысловой комплементарностью к гену lin-14 нематоды С. elegans. Далее гены miРНК были идентифицированы в геномах других организмов в основном с 55 использованием компютерных предсказаний. В геномах С. elegans, D. melanogaster и человека гены miРНК составляют от 0.5 до 1 % общего числа генов. Геном Arabidopsis thaliana содержит около 0.2 % генов различных miРНК. Количество генов miРНК сравнимо с количеством генов, кодирующих регуляторные белки, таких как гены ДНК-связывающих транскрипционных факторов. Большинство генов miРНК консервативны среди родственных видов, а около 30 % генов miРНК высоко консервативны, их ортологи найдены в геномах позвоночных и беспозвоночных, т. е. существенная часть эти генов имеет эволюционно консервативные биологические функции. В последнее десятилетие более 700 miРНК были открыты в клетках человека, и было оценено, что большинство генов, кодирующих белки, находятся под контролем этих коротких по размеру miРНК длиной 21–23 нуклеотида. Первичные предшественники miРНК — pri-miРНК транскрибируются РНК-пол II и представляют собой длинные шпильки и петельные структуры. Биогенез miРНК включает четыре стадии: 1) ферментативный процессинг первичного транскрипта primiРНК в предшесвенник pre-miРНК; 2) транспорт предшественника pre-miРНК из ядра в цитоплазму; 3) ферментативный процессинг предшественника pre-miРНК в зрелую двуспиральную miРНК; 4) сборка эффекторного комплекса для гидролиза мРНК и подавление трансляции. Следует отметить, что первая и вторая стадии биогенеза miРНК протекают в ядре, две другие стадии — в цитоплазме. Процессинг первичного предшественника pri-miРНК осуществляется ферментами комплекса Drosha. Рибонуклеаза III, известная как Drosha, разрезает длиный предшественник pri-miРНК в pre-miРНК-предшественник. Для рri-miРНК характерно наличие 56 шпилечной структуры, которую Drosha режет на расстоянии 22 нуклеотидов от петли. Drosha режет дуплекс зигзагообразно, что является типичным для РНКазы III, и оставляет предшественники premiРНК размером около 70 нуклеотидов; при этом формируется 3'конец, имеющий два неспаренных нуклеотида. Drosha является частью белкового комплекса, названного микропроцессорным комплексом, который включает по крайней мере один полипептид DGCR8, необходимый для процессинга pri-miРНК. Предшественник prе-miРНК транспортируется в цитоплазму белком экспортином 5. Необходимым условием транспорта premiРНК является наличие в составе pre-miРНК дуплекса не менее 16 пар нуклеотидов и двух неспаренных нуклеотидов на 3'-конце. Экспортин-5 защищает pre-miРНК от деградации в процессе транспорта в цитоплазму. После попадания в цитоплазму pre-miРНК подвергается действию другой РНКазы III — DICER, которая узнает pre-miРНК и режет около двух витков спирали от конца, который сформирован действием Drosha. В результате образуется дуплексная структура miРНК, подобная siРНК. Дуплексная miРНК имеет по два характерных неспаренных нуклеотида на 3 - и 5 -концах, что является результатом каталитического действия Drosha и DICER. 2.5. Ферменты процессинга miРНК Ядерный фермент, осуществляющий процессинг pri-miРНК в pre-miРНК, ― это Drosha, принадлежащий семейству РНКаз III. Drosha-компплекс был впервые идентифицирован биохимически как активность, которая превращала транскрипты pri-miРНК, содержащие множество повторяющихся miРНК, в более короткие miРНК до того, как начинала функционировать активность DICER. Комплекс Drosha представляет собой крупный, 500–600 кДа, сложный белок, внутри которого находится микропроцессор для нарезания длинного pri-miРНК транскрипта на более короткие pre-miРНК. Drosha генерирует в составе pre-miРНК 3 -конец с двумя 57 неспаренными нуклеотидами. Для выполнения своей функции Drosha связывается с двумя компонентами DGCR8/Pasha, характерными, соответственно, для клеток позвоночных и беспозвоночных. Эти компоненты инициируют связывание с pri-miРНК и существены для выполнения комплексом Drosha каталитической функции. Сайт разрезания детерминируется границей одноцепочечной– двуцепочечной РНК у основания шпильки miРНК, где Drosha режет около 11 пар нуклеотидов от основания шпильки или один шаг спирали РНК, генерируя в результате «pre-miRNA-шпилечную» структуру, которая содержит на 3 -конце два неспаренных нуклеотида, которые таким образом определяют один конец зреющей mi-РНК. Drosha консервативна только в клетках животных; у растений, которые продуцируют огромное количество различных miРНК, гомолог Drosha неизвестен. Вместо Drosha в клетках растений этот этап созревания miРНК осуществляется ферментативным комплексом Dicer. Pre-miРНК затем экспортируется в цитоплазму белком Экспортин-5/Ran-ГТФ, где она перехватывается специфическим комплексом RLC (RISC loading complex), в составе которого присутствует другой представитель РНКаз III — Dicer, TAR-РНК сявзывающий белок (TRBP), а также представители семейства белков Argonaute — Ago 1-4. Pre-mi-РНК разрезается Dicer’ом в области шпилечных структур на короткие шпильки размером от 21 до 27 пар оснований с несовершенными дуплексами; при этом определяется второй, 5'-конец mi-РНК. Тот факт, что шпилечная структура в miРНК несовершенна, облегчает удаление из RLC странды miРНК, не являющейся гидом для связывания мРНК-мишени, для формирования активного miРНК–RISC комплекса. Подобно Drosha, DICER может нарезать miРНК как мономеры, он несет в своем составе несколько тандемных доменов РНК-азы III. В связи с тем, что DICER нарезает фрагменты miРНК очень точного 58 размера была высказана гипотеза, что нарезание осуществляется от 3 -конца pre-miРНК. Эта гипотеза основывалась еще и на том, что DICER содержал в своем составе PAZ-домен, который присутствует только в DICER и белках семейства ARGONAUTE и весьма консервативен. Далее экспериментально было установлено, что PAZдомен предпочтительно связывает 3 –ОН на конце pre-miРНК. Таким образом, присутствие в составе белка Dicer PAZ-домена координировало размеры созревающей miРНК. Кристаллическая структура DICER из паразита Guardia содержит домены PAZ и RIIIDS на расстоянии, точно соответствующем размерам нарезанного DICER’ом продукта (25 пар нуклеотидов двуспиральной РНК). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что DICER — это молекулярный руль, который распознает конец двуспиральной РНК и предпочтительно его связывает, а затем нарезает на предетерминированные от3 -конца куски. 2.6. Белки семейства ARGONAUTE ARGONAUTE и Ago-родственные белки, например, ABERDINE, работают как эффекторы и используют siРНК и miРНК в качестве гида для выключения комплементарного гена-мишени. Молекулы белков Ago-семейства располагают, по крайней мере, двумя консервативными доменами, важными для выполнения их фунцкции: PAZ и PIWI. PAZ-домен способен связывать 3 -конец РНК-гида; функциональная значимость PIWI-домена заключается в том, что он гомологичен каталитическому коровому домену РНКазы H, содержащему DDH-мотив, состоящий из двух остатков аспартата и остатка гистидина. Присутствие этих трех аминокислот определяет гидролизующую активность белка. Сайт приложения этой активность детерминируется комплементарностью si- или miРНК-гида к мРНКмишени. Если комплементарность совершенная, то комплекс RISC гидролизует мРНК на расстоянии 10 нуклеотидов от 5 -конца РНК59 дуплекса или гибрида РНК-гида и мРНК-мишени. Если комплементарность несовершенная, как в случае большинства miРНК высших эукариот, возможны варианты: ингибирование трансляции на стадии инициации или элонгации, деаденилирование мРНК, транспорт мРНК-мишени в цитоплазматические Р-тельца для нуклеазной деградации или комбинация всех трех вариантов. И miРНК, и siРНК могут провоцировать посттранскрипционное замолкание генов, где РНКi играет роль в обратном выключении транскрипции. При этом сценарии, охарактеризованном для растений и почкующихся дрожжей, Ago-комплекс с si- или miРНК, которые могут быть комплементарными промоторным последовательностям генов-мишеней, проникает в ядро и модулирует структуру хроматина в области этих генов, вызывая репрессивные модификации гистонов и ДНК. 2.7. Другие компоненты РНК-интерференции Drosha, DICER и Ago-родственные белки не исчерпывают всех участников механизма РНК-интерференции. Клетки некоторых беспозвоночных содержат системы амплификации или транспорта РНК-гидов в другие части организма. У С. elegans и у растений амплификация dsРНК-сигнала осуществляется РНК-зависимой РНКполимеразой. Si- или miРНК может служить праймером для РНКзависимой РНК-полимеразы при транскрипции мРНК, результатом чего является продукция dsРНК, гомологичной 5 -концу последовательности мРНК-мишени. В комбинации с транспортом амплификация приводит к самораспространению dsРНК и эффекту выключения гена-мишени по всему организму. Млекопитающие и насекомые не имеют таких механизмов амплификации и транспорта. 2.8. Механизм действия комплекса miРНК-RISC Комплекс miРНК–RISC использует miРНК в качестве гида, которая имеет на 3'-конце комплементарную мРНК нетранслируемую последовательность UTR (untranslated region). С помощью последовательности UTR осуществляется поиск мРНК-мишени. 60 После гибридизации с miРНК мРНК становится непригодной для трансляции и либо деаденилируется, либо деградирует. MiРНК растений могут запускать деградацию мРНК, образуя нуклеотидные пары с очень несовершенной коплементарностью. МiРНК других видов могут блокировать трансляцию мРНК в белки. Они взаимодействуют со своими мРНК-мишенями через несовершенное комплементарное спаривание в области 3 нетранслируемого конца. Si-РНК, в отличие от miРНК, запускают деградацию мРНК только через достаточно совершенное спаривание с комплементарной последовательностью мРНК-мишени. Несовершенное спаривание miРНК дает определенный выигрыш в репрессии большего количества мРНК при трансляции, так как комплементарное несовершество приводит к возможности взаимодействия с большим числом мРНК. В исследовательской практике помимо хорошо изученных компонентов РНК-интерференции — siРНК и miРНК — применяют и другие некодирующие РНК. ShРНК ― короткие шпилечные (short hairpin) РНК, как правило, синтетические, которые используют в эксперименте в качестве векторов для проникновения siРНК в клетку и обеспечения стабильного замолкания гена. В конструкциях для продуктивной транскрипции шпилечных shРНК используют строгие промоторы, например промотор U6 малой ядерной РНК (см. разд. 3.1.5.1), транскрибируемой РНК-пол III. Транскрипты, представляющие собой обращенные повторы, включаются в клеточные механизмы РНК интерференции, в результате чего образуются зрелые siРНК. PiРНК ― это особый класс эндогенных малых некодирующих РНК. Белки ARGONAUTE филогенетически могут быть разделены на два субсемейства: Ago и PIWI. SiРНК и miРНК ассоциированы с субсемейством Ago, а по полученным в последнее время данным, открыт новый класс некодирующих эндогенных РНК размером 24–30 нуклеотидов, которые специфично связываются с белками 61 субсемейства PIWI. PiРНК играют существенную роль в процессах развития у мух, рыб и мышей. В процессе биогенеза piРНК не требуют активности DICER. Впервые piРНК были идентифицированы в экспериментах по клонированию повторяющихся последовательностей генома Dr. melanogaster. Их происхождение относят к ретротранспозонам и другим повторяющимся элементам генома, а функциональная роль состоит в выключении экспрессии ретротранспозонов. В результате класс этих малых РНК получил название rasiРНК, т. е. repeated associated siРНК. Далее было показано, что rasiРНК связаны с компонентом PIWI белков семейства ARGONAUTE, после чего этот класс малых некодирующих РНК получил название piРНК. В настоящее время piРНК идентифицированы в геномах насекомых и млекопитающих. Они часто кодированы в геноме в виде кластеров длиной до 100 тысяч пар оснований. В геноме Dr. melanogaster гены piРНК, по данным картирования, рассеяны по различным областям. В геноме млекопитающих все piРНК находятся в уникальном большом кластере, включающем всѐ разнообразие piРНК. Подробный анализ показал, что этот кластер отличается определенной ассиметрией, и все piРНК происходят либо от смысловой, либо от антисмысловой предковой цепи, что указывает на то, что piРНК происходят от одного длинного одноцепочечного предшественника. Но в некоторых кластерах piРНК являются копиями обеих цепей ДНК. Различные белки семейства ARGONAUTE имеют сродство к piРНК, произошедших от разных цепей кластера. Так, у насекомых, белки Piwi и Aberdine (Aub) предпочтительно связаны с piРНК, которые являются копиями антисмысловой цепи и проявляют строгое предпочтение к уридину на 5'-конце piРНК. Белок Ago3, наоборот, предпочитает piРНК, имеющую происхождение от смысловой цепи ретротранспозонов, а в десятой нуклеотидной позиции в этих piРНК находится аденин. Эти piРНК отличаются комплементарностью к первым десяти нуклеотидам некоторых piРНК, имеющих сродство к 62 белкам Aub, т. е. имеющим происхождение с антисмысловой цепи. Такое наблюдение можно интерпретировать как тот факт, что piРНК, связанная с Ago3, может участвовать в гидролизе предшественника антисмысловой цепи и генерировать 5'-конец антисмысловой piРНК. Реципрокная реакция может генерировать 5'-конец piРНК, имеющей происхождение от смысловой цепи. Эта модель биогенеза piРНК получила название ―пинг-понг‖. Однако, убедительных данных о таком механизме биогенеза piРНК пока недостаточно. Функциональная роль piРНК у насекомых проявляется в процессе гаметогенеза. PIWI-белки в комплексе с piРНК и дополнительными факторами образуют своего рода иммунную, основанную на РНК систему, осуществляющую защиту организма от мобильных элементов генетического происхождения. Что касается других видов животных и растений, то роль piРНК связывают с выключением экспрессии ретротранспозонов. 2.9. Использование РНК-интерференции в эксперименте и медицине Для использования механизмов РНК-интерференции в исследовательской и медицинской практике необходимо было получить определенную панель последовательностей miРНК и комплементарных им мРНК-мишеней. Особое значение это имело для компонентов опухолевых клеток человека, нейродегенеративных и других клеток и тканей, пораженных теми или иными заболеваниями. Это оказалось очень непростой задачей, так как несовершенная комплементарность, с которой miРНК обычно связываются со своей мишенью, позволяет короткой последовательности образовывать ошибочные пары, в том числе и G–U, либо вообще использовать частично неспаренные участки. Все это затрудняет идентификацию генов-мишеней методами биоинформатики. Но тот факт, что 5 -конец miРНК является критичным для вступления miРНК в RISC и для осуществления биологической функции, позволил выделить фрагмент от 2 до 8 нуклеотида зрелой miРНК, который получил название 63 «miРНК seed». Именно этот фрагмент стал тем алгоритмом, который использовали для компьютерного поиска 3 -нетранслируемой последовательности в экспрессируемых генах. Этот подход показал, что одиночная miРНК может связывать до 200 генов-мишеней, среди которых самые разнообразные с точки зрения функции гены белков: транскрипционные факторы, секреторные факторы, рецепторы, белки-транспортеры. Получается, что miРНК потенциально могут контролировать около 1/3 всех структурных генов человека. Помимо «miРНК seed», есть данные, что и другие последовательности miРНК могут диктовать и направлять miРНК-регуляцию. Показано, что последовательность зрелой mi-РНК let7, которая высоко консервативна, требует для функционирования спаривания не только по 5 -концу, но и по 3 -концу. Это позволяет miРНК при определенной комбинаторности спариваемых последовательностей регулировать большее число мРНК-мишеней. Применение техники РНКi в исследовании функционирования и роли индивидуальных генов в различных клеточных процессах является весьма перспективным. Подход, заключающийся в выключении экспрессии гена и дальнейшем исследовании последствий этого выключения, получил в свое время название реверсивной генетики. Но такой подход оказался достаточно дорогим и медленным в отличие от РНК-интерференции. РНКi используется для развития новых модельных систем, для идентификации новых молекулярных мишеней, для изучения функционирования генов в контексте генома и развития новых подходов для клинических целей. SiРНК может быть получена при отжиге синтетических олигонуклеотидов. Большинство синтетических siРНК включают 19 спаренных рибонуклеотидов с совершенной комплементарностью и два неспаренных нуклеотида на 3 -конце. Это несложно синтезировать химически. Такие препараты уже выпускают коммерческие фирмы. Реже такие siРНК изготавливают другими методами, например, транскрипцией in vitro как специальные кассеты, 64 встроенные в плазмиды и несущие обращенные повторы, с помощью полимеразной цепной реакции или эндонуклеазным расщеплением длинных двуспиральных РНК, которые в результате продуцируют пул siРНК. Введение siРНК в клеточные культуры производят стандартными физико-химическими методами трансфекции, включая катионные липиды, катионные полимеры или электропорацией. Эффективность трансфекции определяют эмпирическим путем для каждого вида культуры клеток. Оптимальными являются условия, когда наблюдается устойчивое снижение уровня мРНК-мишени в течение 24–120 ч. Как метод, не требующий прямой трансфекции, используют плазмиду или вирусный вектор, содержащие shРНК. ShРНК процессируется эндогенной клеточной РНКi-машинерией и попадает в комплекс RISС. В настоящее время разработано достаточно большое число различных экспрессирующих shРНК-систем. Вариативность этих систем связана с использованием различных промоторов и терминаторов для экспрессии последовательностей shРНК, фланкирующих последовательностей, обращенных повторов разной длины в составе генетических конструкций и других регуляторных элементов, которые необходимы для специфической экспрессии тех или иных shРНК. Дополнительно применяют селективные маркеры, используемые для создания постоянных клеточных линий и уникальные элементы последовательностей для идентификации активных shРНК в большой популяции тотальной shРНК. В противовес siРНК, стабильная экспрессия shРНК приводит к необратимому разрушению мРНК-мишени. Таким образом, выбор между эффектором РНКинтерференции — siРНК или shРНК — зависит от цели исследования. Независимо от выбора эффектора РНКi, любой эксперимент, основанный на РНК интерференции, всегда нуждается в негативном контроле эффекторной молекулы. Поэтому эти контроли включают последовательности с минимальной комплементарностью к любому эндогенному транскрипту. 65 Терапия, основанная на РНКi-механизме, имеет определенные преимущества, что делает ее более привлекательной по сравнению с традиционными медицинскими подходами. Она может довольно широко применяться для лечения заболеваний различной этиологии и отличается терапевтической точностью и избирательностью, которые позволяют избегать побочных эффектов. Широкие возможности для применения вместе с относительной легкостью синтеза коротких олигонуклеотидов и их относительная дешевизна, делают терапию, основанную на интерферирующих РНК, очень перспективным лекарственным средством. РНКi лекарственное средство может подавлять трансляцию информационной РНК-мишени и тем самым препятствовать синтезу белка, важного и необходимого для развития того или иного заболевания. В раковых клетках протоонкогены могут активироваться различными механизмами, продуцируя онкогены, которые функционируют как доминирующие компоненты клеток. В эпителиальных опухолях можно наблюдать нарушение клеточного цикла, которое выражается в неконтролируемом росте, и устойчивость клеток к апоптозу в связи с нарушением функционирования определенных белков, ответственных за апоптоз. Нокаут генов, ответственных за дерегуляцию клеточного цикла, или антиапоптотических генов с помощью РНКi может приводить к остановке роста опухоли и уничтожению раковых клеток. Для селективного удаления раковых клеток без повреждения нормальных клеток могут быть использованы очень специфичные miРНК, которые в качестве мишеней выбирают гены, вовлеченные в регуляцию роста раковых клеток и их выживание, или siРНК могут быть селективно внедрены в раковые клетки. РНК интерференция может функционировать как супрессор опухолей и онкогенов и в связи с этим miРНК, применяемые как терапевтические средства получили название «oncomirs». Последние исследования показали, что нарушения экспрессии miРНК и мутации в miРНК-генах связаны 66 с возникновением различных форм рака человека, т. е. miРНК, с одной стороны, могут действовать как супрессоры опухолей, а с другой — как онкогены. Поскольку miРНК могут подавлять активность важных для развития рака генов, они могут быть использованы не только для лечения этих заболеваний, но и для диагностики. По современным данным, около 50 % известных генов miРНК локализованы в области генома, известной как «хрупкий сайт» (fragile site), которую ассоциируют с возникновением рака. Это указывает на то, что функционирование miРНК самих по себе может быть критичным при возникновении рака. Различная экспрессия некоторых miРНК в определенных формах рака делает возможным применение механизма РНК-интерференции в диагностике и лечении рака. Набор генов miРНК, относящихся к тем или иным формам рака, был идентифицирован и определен с помощью методов Нозерн-блот и анализа нуклеотидных последовательностей (микроаррэй) miРНК. Использование панелей различных miРНК позволяет в настоящее время определять экспрессию тех или иных miРНК в процессе диагностики, идентифицировать и классифицировать формы рака и делать определенные прогнозы развития заболевания. Генная терапия должна стать эффективным средством подавления развития опухолей. MiРНК let-7, негативно регулирующая онкогены Ras, mir-15 и mir-16, которые негативно регулируют BCL2, рассматриваются как перспективные кандидаты для подавления активности соответствующих онкогенов. Заболевания, вызываемые вирусной или бактериальной инфекцией, являются очень важной и, можно сказать, глобальной причиной смерти человека из-за развития устойчивых к лекарственным препаратам штаммов бактерий и из-за возможной деятельности террористов. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), грипп, гепатит и лихорадка западного Нила — вот неполный перечень заболеваний, в лечении которых человечество испытывает значительные трудности и подчас терпит 67 поражения. Способность интерферирующих РНК подавлять репликацию или их способность проникать в вирусы и клетки инфекционных агентов наглядно показаны при исследованиях на клеточных культурах и указывают на перспективность использования таких подходов для терапевтических целей. Показано, что введение в клетки человека набора siРНК против различных генов полиовируса привело к устойчивости этих клеток к инфекции полиовирусом. Была протестирована возможность использования siРНК против гена Fas мышей с заболеванием аутоиммунного гепатита, которая дала весьма положительные результаты. Вирус СПИДа был первым инфекционным агентом, против которого была применена методика siРНК, в связи с тем, что жизненный цикл и экспрессия генов этого вируса были достаточно хорошо изучены. Были использованы синтетические siРНК и эндогенные shРНК против целого набора различных РНК вируса СПИДа. Несмотря на успешное применение этого подхода в эксперименте на культуре клеток, использование его в клинике сопряжено с определенными трудностями, так как вирус отличается очень высоким мутационным потенциалом, что делает его мутированные РНК-мишени малоуязвимыми с помощью разработанных синтетических siРНК. Подавление методом РНКi экспрессии клеточных кофакторов — таких, как NF-B, рецептора вируса СПИДа CD-4 и корецепторов CXCR4 и CCR5, привело к достаточно успешному подавлению репликации вируса. Но одновременно такой подход имел очень серьезный недостаток, так как приводил к аналогичному подавлению экспрессии компонентов Т-лимфоцитов и макрофагов, неинфицированных вирусом. Таким образом, стратегия применения РНКi для лечения СПИДа требует дальнейших исследований. Делаются попытки разработать стратегию использования РНКi для лечения таких нейродегенеративных заболеваний как синдром Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона. Один из 68 подходов предусматривает блокирование специфичных для заболевания ответов, которые приводят к развитию нейродегенерации. Другой подход нацелен на использование РНКi для подавления проявлений в нейродегенеративных каскадах. Однако эти исследования пока не вышли из стадии эксперимента на соответствующих клеточных культурах. Кроме того, РНК-интерференцию рассматривают как весьма перспективный подход для исследования механизмов старения и выяснения и характеристики роли специфических генов в процессе старения, а также выявление новых генов, имеющих отношение к процессам старения. РНК-интерференцию рассматривают как более перспективный, по сравнению с мутационным, подход к изучению зависимых от возраста заболеваний. Последние исследования сделали возможным осуществить с высоким разрешением скрининг экспрессируемого генома с помощью постоянного и расширенного контроля индукции РНКi. Эти исследования открывают новые возможности в исследовании генетики старения и зависимых от старения заболеваний. Вопросы для повторения: 1. Механизм действия РНК интерференции. 2. SiРНК, биогенез, ферменты, участвующие в созревании siРНК. 3. MiРНК, биогенез, ферменты, участвующие в созревании miРНК, сходство и отличие от siРНК. 4. РНКi-комплексы. 5. Многообразие интерферирующих РНК и осбенности их действия. 6. ShРНК, перспективы использования в медицине. 7. Использование РНК-интерференции в эксперименте. 8. Использование интерферирующих РНК в медицине. Успехи и недостатки. 69 3. ПРОЦЕССИНГ РНК В ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКЕ 3.1. Механизмы процессинга РНК В ядре эукариотической клетки синтезируется множество различных РНК. Однако, в отличие от прокариот, ни одна из этих РНК не образуется сразу в своей функционально зрелой форме. Прежде чем осуществлять свои функции РНК любого типа должны претерпеть специфическое для каждого типа РНК «созревание», или процессинг (от англ. processing — обработка, окончательная переработка). В ходе процессинга молекулы РНК претерпевают ряд сложных химических и конформационных модификаций, специфических для РНК каждого типа, а также могут связываться с различными белками, а иногда — с другими РНК. Первичный продукт транскрипции, т. е. вновь синтезированная РНК, носит название первичного транскрипта. В зависимости от конкретного типа такие РНК обозначаются, соответственно, пре-мРНК, пре-рРНК, пре-тРНК и т. д. Таким образом, первичный транскрипт — это вновь синтезированная РНК определенного типа, которая еще не претерпела или не завершила свой процессинг. Все РНК эукариотической клетки можно условно разделить на три группы. К первой группе относятся цитоплазматические информационные, или матричные, РНК (иРНК, или мРНК; mRNAs), а также их ядерные предшественники — пре-мРНК (pre-mRNAs) в форме гетерогенных ядерных РНК (гяРНК; hnRNAs — разд. 3.1.4). Эти РНК несут информацию, которая определяет аминокислотную последовательность, а следовательно, и структуру всех клеточных белков. Ко второй группе относят остальные РНК, которые не несут кодирующую информацию, но напрямую участвуют во многих процессах, связанных с экспрессией генов, в том числе и в биосинтезе 70 белка. Это рибосомные РНК (рРНК; rRNAs), транспортные РНК (тРНК; tRNAs), малые ядерные РНК сплайсинга (мяРНК; snRNAs), малые ядрышковые РНК (мяшРНК; snoRNAs), которые играют важную роль в биогенезе рибосом, а также специфические для телец Кахала малые РНК (мткРНК, scaRNAs), участвующие в процессинге мяРНК. Большинство этих РНК являются более долгоживущими, чем мРНК, и потому их часто все вместе называют стабильными, или некодирующими, РНК (stable or nonprotein coding RNAs, ncRNAs). Наконец, третью группу составляют различные очень короткие РНК (всего 21–25 нуклеотидов), которые играют важную регуляторную роль в процессах экспрессии генов (см. разд. 2). Сюда относят: а) микро-РНК (miRNAs), спаривание основание которых с мРНК в цитоплазме подавляет трансляцию; б) малые гетерохроматиновые РНК (shRNAs), которые обеспечивают упаковку ДНК в нетранскрибируемую форму — гетерохроматин; в) малые интерферирующие РНК (siRNAs) — двуцепочечные РНК, введение которых в клетку приводит к расщеплению определенных мРНК и, соответственно, к выключению экспрессии конкретных генов. Процессинг пре-рРНК останется за рамками данного пособия, в котором наиболее подробно будет рассмотрен процессинг мРНК и мяРНК и в общих чертах — процессинг тРНК. Важнейшими участниками экспрессии генов, а именно собственно передачи генетической информации из ядра, где находится ДНК, в цитоплазму, где происходит синтез белков, являются информационные, или матричные, РНК (мРНК). Процессинг большинства мРНК включает несколько этапов: 1) кэпирование 5 -конца пре-мРНК (характеризует 100 % всех мРНК; разд. 3.1.1); 2) полиаденилирование 3 -конца пре-мРНК (характеризует примерно 95 % всех мРНК; разд. 3.1.2); 3) сплайсинг, представляющий собой процессинг внутренних областей молекулы пре-мРНК (также характеризует около 95 % всех 71 мРНК, поскольку сплайсингу подвергаются только те мРНК, которые полиаденилируются; разд. 3.1.5); 4) редактирование, т. е. изменение генетической информации на уровне нуклеотидной последовательности РНК (показано для ограниченного числа мРНК; разд. 3.1.8). Следует подчеркнуть, что границы между транскрипцией и различными этапами процессинга РНК оказываются размытыми. Не следует представлять себе транскрипцию и процессинг пре-мРНК в качестве изолированных, не связанных между собой событий, которые осуществляются последовательно друг за другом. Эти этапы экспрессии генов теснейшим образом скоординированы между собой как в пространстве, так и во времени. Субстратами реакций кэпирования, сплайсинга и полиаденилирования служат не изолированные пре-мРНК, а сложные молекулярные комплексы между первичным транскриптом, белками гетерогенных ядерных РНП (разд. 3.1.4), белками комплекса элонгации и матрицей ДНК. Таким образом, процессинг пре-мРНК в эукариотической клетке по большей части осуществляется котранскрипционно. При этом в координации транскрипции и процессинга пре-мРНК важную регуляторную роль играет C-концевой домен (carboxy-terminal domain, CTD) большой субъединицы РНК-полимеразы II. Анализ протеома (белкового состава) биохимически очищенного комплекса РНК-полимеразы II выявил большое количество факторов процессинга пре-мРНК, которые оказались физически интегрированы в транскрипционное молекулярное «оборудование» эукариотической клетки. Соответственно, многие молекулярные факторы процессинга пре-мРНК оказались связанными с транскрибируемыми генами. Открытие функциональной и структурной координации между транскрипцией и процессингом премРНК, включая кэпирование, сплайсинг и полиаденилирование, установило новые концептуальные рамки для исследования контролирующих механизмов экспрессии генов как интегрированного процесса. 72 3.1.1. Процессинг 5 -конца мРНК 5 -конец всех молекул пре-мРНК, как и других продуктов РНКполимеразы II, подвергается особой биохимической модификации, которая состоит в присоединении метилированного гуанозинтрифосфата, или метилгуанозинового кэпа (англ. cap — шапочка, кепка или какой-либо предмет, предохраняющий что-либо от внешних воздействий). Этот процесс называется кэпированием. Кэпирование 5 -конца молекулы пре-мРНК необходимо для осуществления эффективной экспрессии генов и критично для жизнеспособности клеток всех эукариот, от дрожжей до человека. Кэпирование молекулы пре-мРНК происходит уже в течение первой секунды после начала ее синтеза, когда длина новообразованной РНК составляет всего 25–30 нуклеотидов. Таким образом, кэпирование осуществляется котранскрипционно, т. е. завершается задолго до того момента, когда происходит терминация транскрипции. Кэп на 5 -конце молекулы мРНК — уникальная структура, которая представляет собой гуанозин, метилированный в 7-м положении (m7G) и связанный с первым нуклеотидом цепи РНК в необычной позиции 5 —5 , т. е. инвертировано. Метильная группа также присоединяется необычно; так что такой кэп оказывается положительно заряженным (рис. 3.1). Последовательность событий кэпирования можно представить себе следующим образом. Кэпирующие ферменты вначале удаляют -фосфат первого нуклеотида РНК, после чего переносят на это место гуанозинмонофосфат (ГМФ) от гуанозинтрифосфата (ГТФ). Таким образом, гуанозин оказывается связанным трифосфатным мостиком с первым нуклеотидом РНК. Наконец, гуанин метилируется в 7-м положении. 73 Рис. 3.1. Строение 7-метилгуанозинтрифосфатного кэпа мРНК Присутствие кэпа на 5 -конце молекулы мРНК в значительной степени предотвращает действие нуклеаз и, соответственно, минимизирует деградацию мРНК. Кроме того, после экспорта мРНК из ядра в цитоплазму кэп обеспечивает правильную установку мРНК на рибосоме за счет определенных РНК-связывающих белков. Таким образом, метилгуанозиновый кэп мРНК является одним из сигналов, необходимых для инициации синтеза белка. У эукариот трансляция мРНК всегда начинается с ближайшего к кэпу инициирующего кодона AUG. Наконец, кэп может увеличивать эффективность сплайсинга первого интрона в молекуле пре-мРНК, а также эффективность процессинга ее 3 -конца за счет связывания с ним белков так называемого кэп-связывающего комплекса (cap binding complex, CBC), которые повышают эффективность 74 сплайсинга и процессинга 3 -конца молекулы пре-мРНК. В процессе кэпирования имеют место три ферментативные активности: трифосфатазная, гуанилилтрансферазная и метилтрансферазная. Трифосфатаза осуществляет удаление фосфата первого нуклеотида цепи РНК, т. е. гидролизует 5 -концевой трифосфат первичного транскрипта до дифосфата. С гуанилилтрансферазой ковалентно связывается ГМФ, который она переносит на этот дифосфат, формируя 5 —5 -трифосфатный мостик. После этого гуанин в составе концевого гуанозина метилируется 7-метилтрансферазой. В клетках многоклеточных организмов присутствует единый полипептид (кэпирующий фермент), который выполняет одновременно обе функции — трифосфатазы и гуанилилтрансферазы. Метилтрансфераза при этом представлена отдельным ферментом. Клетки дрожжей (низших эукариот) содержат трифосфатазу и гуанилилтрансферазу в качестве двух различных полипептидов. Современная рабочая модель предполагает, что кэпирующие ферменты направляются к 5 -концу пре-мРНК за счет связывания с CTD РНК-полимеразы II, когда этот домен оказывается фосфорилирован вскоре после инициации транскрипции. При этом связь с РНК-полимеразой II служит не только для привлечения (рекрутирования) кэпирующих ферментов к местам синтеза РНК, но также регулирует активность самих ферментов. Удаление фосфата Ser5 определенными фосфатазами в ходе элонгации первичного транскрипта приводит к высвобождению кэпирующих ферментов. После образования кэпа происходит метилирование 2 –OHгрупп остатков рибозы первых двух нуклеотидов в цепи пре-мРНК с помощью кэп-специфических метилтрансфераз. При этом метилирование второго нуклеотида происходит не всегда (рис. 3.1). 75 3.1.2. Процессинг 3 -конца мРНК: расщепление и полиаденилирование Корректное осуществление молекулярных событий, составляющих процессинг 3 -конца пре-мРНК, является необходимым условием функционирования зрелых мРНК. Все премРНК эукариотической клетки подвергаются, во-первых, специфическому эндонуклеолитическому расщеплению (cleavage) растущей нуклеотидной цепи. Во-вторых, значительная часть премРНК (около 95 %) подвергается полиаденилированию, которое состоит в добавлении по принципу безматричного синтеза к последнему нуклеотиду от 30 до 300 адениловых нуклеотидов, которые образуют так называемый поли(А)-«хвост» мРНК. В клетках человека длина поли(А)-«хвоста» составляет в среднем 200–250 адениловых остатков, а в клетках дрожжей — 70–90. Процессинг 3 -конца молекулы пре-мРНК — ядерный котранскрипционный процесс, который имеет существенное значение для экспрессии генов и необходим для успешного осуществления терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра, а также оказывает влияние на стабильность мРНК и трансляцию в цитоплазме. В клетках млекопитающих, в отличие от бактерий, транскрипция продолжается дальше точки, соответствующей 3 -концу зрелой мРНК. Точка эндонуклеолитического расщепления и полиаденилирования пре-мРНК эукариот определяется особыми нуклеотидными последовательностями в ее составе (рис. 3.2). 76 В данном пособии молекулярное строение последовательностей пре-мРНК, необходимых для осуществления расщепления и полиаденилирования, а также белковые факторы, катализирующие эти процессы, мы будем рассматривать на примере животной клетки. В клетках растений и дрожжей имеются определенные отличия, с которыми при необходимости можно ознакомиться в специальных обзорах по данной теме. В клетках Metazoa точкой эндонуклеолитического расщепления (cleavage site) является динуклеотид CA (рис. 3.2). Это место является также точкой начала добавления остатков аденозина в ходе полиаденилирования и потому часто называется, поли(А)-сайтом. Впереди от этой точки (upstream) на расстоянии примерно 10–30 нуклеотидов расположена особая консенсусная последовательность AAUAAA, которая является одним из основных поли(А)-сигналов. Позади поли(А)-сайта (downstream) на расстоянии примерно в 30 нуклеотидов или немного меньше располагается участок DSE (downstream element). Этот участок богат остатками уридина или гуанозина и уридина (U-rich or GU-rich elements). Он гораздо менее консервативен, чем последовательность AAUAAA. Последовательность AAUAAA является одной из наиболее консервативных нуклеотидных последовательностей, известных к настоящему времени. Известен лишь один ее вариант — AUUAAA, активность которого сравнима с активностью канонической последовательности. Однако замена в результате мутации любого Рис. 3.2. Сигналы расщепления и полиаденилирования в молекуле пре-мРНК клеток животных 77 другого нуклеотида данной последовательности существенно нарушает расщепление пре-мРНК и полиаденилирование. Последовательность AAUAAA, поли(А)-сайт и DSE вместе составляют в молекуле пре-мРНК центральный, или коровый (от англ. core — центр, сердцевина), сигнал эндонуклеолитического расщепления и полиаденилирования. Дополнительные последовательности вне этого центра рекрутируют регуляторные факторы или поддерживают центральный сигнал расщепления и полиаденилирования в открытом состоянии, т. е. в доступном для факторов, непосредственно осуществляющих эти реакции. К таким последовательностям относится богатый уридином участок USE (upstream element), расположенный перед последовательностью AAUAAA (рис. 3.2). Он может позитивно или негативно влиять на эффективность процессинга 3 -конца молекулы пре-мРНК. В молекуле пре-мРНК может быть сразу несколько поли(А)сигналов, которые могут использоваться альтернативно (разд. 3.1.5.4). Примеры альтернативного использования различных поли(А)сигналов можно обнаружить либо в тканях определенного типа, либо в ответ на внеклеточные стимулы. Выбор одного или другого (альтернативного) поли(А)-сигнала молекулярным «оборудованием» расщепления и полиаденилирования в одной и той же транскрипционной единице служит количественной и качественной регуляции экспрессии генов в различных биологических процессах. В результате такой регуляции будут образовываться различные изоформы белков. Они могут различаться как по своей информативной последовательности, когда расщепление происходит внутри участка, кодирующего аминокислотную последовательность белка, так и по строению имеющегося на 3 -конце молекулы мРНК нетранслируемого участка (3 -UTR). В последнем случае транскрипты одного гена будут различаться по их стабильности, локализации, способностям к транспорту и трансляции. 78 Транскрипты, которые не претерпели процессинг 3 -конца, быстро деградируют и не транспортируются в цитоплазму. Несмотря на свою кажущуюся простоту, реакции расщепления и полиаденилирования для своего осуществления требуют множество белковых факторов, которые ассоциируют в мегадальтонные молекулярные машины. Эти фаторы оказались в основном довольно консервативны у всех эукариот. В клетках млекопитающих к настоящему времени идентифицировано 14, а в клетках дрожжей — более 20 белков, принимающих участие в расщеплении и полиаденилировании пре-мРНК. Их сборка в надмолекулярные комплексы происходит на поли(А)-сигналах (см. выше). Центральное место в составе молекулярного «оборудования» расщепления и полиаденилирования (коровый комплекс полиаденилирования) животной клетки составляют пять белков: специфический фактор расщепления и полиаденилирования CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor), фермент поли(А)-полимераза (PAP), а также факторы CstF (cleavage stimulating factor), CF-Im и CF-IIm (cleavage factors Im, IIm). Добавочными к этому центральному комплексу являются поли(А)связывающий белок PABP (poly(A) binding protein), белок симплекин и CTD РНК-полимеразы II. В условиях in vitro все белки (за исключением PABP) требуются для осуществления реакции эндонуклеолитического расщепления, а для полиаденилирования — только CPSF, поли(А)-полимераза и PABP. Поли(А)-полимераза в клетках млекопитающих необходима как для расщепления, так и для полиаденилирования, а в клетках дрожжей — только для полиаденилирования. Основные факторы процессинга 3 -конца премРНК приведены табл. 1, где также кратко указаны их функции. Таблица 1 Фактор (субъединица) Свойства, функции 1 2 79 CPSF-73 CPSF-160 CstF-77 Связывается с последовательностью AAUAAA премРНК. Является эндонуклеазой. Катализирует специфическое расщепление пре-мРНК в точке, определяемой динуклеотидом СА. Связывает поли(А)-полимеразу и CstF-77. Обеспечивает корректность расщепления премРНК. Окончание табл. 1 1 CstF-64 CF-Im CF-IIm Поли(А)полимераза (PAP) PABP 80 2 Специфически распознает элемент DSE молекулы пре-мРНК за счет своей РНК-распознающей последовательности (RNA recognition motif, RRM). Определяет правильный поли(А)-сайт. Способствует распознаванию пре-мРНК другими факторами. Содержит домен, ответственный за связь с CTD РНК-полимеразы II. Катализирует присоединение адениловых остатков (рост поли(А)-«хвоста»). Стимулирует каталитическую активность поли(А)полимеразы. Содержит 4 РНК-распознающие последовательности и связывается непосредственно со вновь синтезированным тяжом поли(А)нуклеотидов, когда их число достигает 11–14. Остается в этой связи до тех пор, пока поли(А)«хвост» не достигнет конечной длины. Симплекин Играет центральную роль в объединении и поддержании целостности макромолекулярных машин, обеспечивающих процессинг 3 -конца премРНК. CTD РНК- Интегральный компонент молекулярного полимеразы II комплекса процессинга пре-мРНК. Платформа сборки и высвобождения факторов полиаденилирования. 3.1.3. Процессинг 3 -конца пре-мРНК гистонов В предыдущем разделе было отмечено, что большинство эукариотических мРНК заканчивается поли(А)-«хвостом», который добавляется к 3 -концу молекулы пре-мРНК в результате последовательных реакций эндонуклеолитического расщепления (cleavage) и полиаденилирования. Среди мРНК известное исключение из этого правила составляет процессинг 3 -конца мРНК, кодирующих белки гистоны; причем не все, а лишь те, которые синтезируются в Sфазе клеточного цикла. Для справки, большинство генов, кодирующих гистоны, распологается в геноме повторяющимися кластерами и транскрибируются только в S-фазе клеточного цикла. В этот период в клетке резко возрастает интенсивность синтеза новых гистонов, которые необходимы для быстрой упаковки вновь реплицированной ДНК в хроматин. Оставшаяся небольшая часть гистоновых генов расположена отдельно и транскрибируется в различных фазах клеточного цикла. Считываемая с них мРНК процессируется обычным образом, т. е. 3 -конец таких пре-мРНК подвергается стандартным расщеплению и полиаденилированию. Основная функция гистонов, транслируемых с таких мРНК, — замена поврежденных нуклеосом. 3 -конец мРНК, кодирующих большинство гистонов, не содержит поли(А)-«хвоста» и заканчивается особой консервативной 81 «шпилькой» (stem-loop). Специализированное молекулярное «оборудование» процессинга распознает эту «шпильку» и лежащую позади нее специфическую последовательность HDE (histone downstream element), богатую остатками пуриновых нуклеотидов. Эндонуклеолитическое расщепление молекулы пре-мРНК гистонов осуществляется между этими двумя элементами и не сопровождается полиаденилированием. Реакция расщепления уже достаточна для формирования зрелых мРНК гистонов, способных экспортироваться в цитоплазму. Основными факторами процессинга 3 -конца молекул пре-мРНК гистонов являются (1) U7 малый ядерный рибонуклеопротеин (U7 мяРНП), по своей природе и строению родственный U1, U2, U4 и U5 мажорным мяРНП сплайсинга — см. разд. 3.1.5.1, и (2) белок SLBP (stem-loop binding protein), известный также как HBF (hairpin binding factor; от англ. hairpin — шпилька, заколка-невидимка для волос). Центральный элемент частицы U7 мяРНП — U7 мяРНК. Она синтезируется РНК-полимеразой II и является самым коротким ее продуктом, известным в настоящее время: от 51 (морской еж) до 71 (дрозофила) нуклеотидов. Клеточный метаболизм (биогенез) этой РНК напоминает таковой U1, U2, U4 и U5 мяРНК сплайсинга и будет рассмотрен в разд. 3.1.5.1 (табл. 2). Во время процессинга 3 -конца молекулы пре-мРНК гистонов U7 мяРНК за счет обширного комплементарного спаривания оснований взаимодействует с последовательностью HDE, а белок SLBP распознает характерную «шпильку» молекулы пре-мРНК (рис. 3.3). Основная функция белка SLBP состоит в стабилизации связывания U7 мяРНП с пре-мРНК гистонов. После завершения процессинга пре-мРНК этот белок остается в связи со «шпилькой» и стимулирует трансляцию мРНК гистонов в цитоплазме. Внутриклеточная концентрация белка SLBP достигает максимума в Sфазе клеточного цикла и быстро снижается при переходе из S-фазы в 82 фазу G2. Исчезновение SLBP из клетки совпадает с деградацией существующего пула мРНК гистонов и, по-видимому, эти процессы функционально взаимосвязаны. Таким образом, белок SLBP может выступать в качестве главного регулятора, который запускает процессинг 3 -конца премРНК гистонов, активирует трансляцию зрелых мРНК гистонов в фазе S клеточного цикла и, наконец, приводит в действие деградацию этих РНК при переходе клетки из фазы S в фазу G2. Такая посттранскрипционная регуляция приводит к скоординированному синтезу гистонов всех классов в одно и то же время репликации ДНК и прекращению экспрессии гистоновых генов вне фазы S клеточного цикла. В стабилизации связывания U7 мяРНП с пре-мРНК гистонов принимает участие еще один необходимый белок — так называемый «цинк-шарнирный» белок с молекулярной массой 100 кДа (ZFP100, Zn finger protein), который взаимодействует с комплексом SLBP— пре-мРНК и белком Lsm11 U7 мяРНП (см. рис. 3.3). Отсутствие белка ZFP100 не позволяет клетке перейти из фазы G1 в фазу S клеточного цикла. Белок ZFP100 рекрутируется белком SLBP перед формированием дуплекса между U7 мяРНК и HDE пре-мРНК. Его первоначальное взаимодействие с SLBP может быть важным событием для обеспечения правильного выравнивания двух молекул РНК — U7 мяРНК и пре-мРНК гистонов, препятствуя либо непродуктивному спариванию оснований, либо неточному определению точки расщепления молекулы пре-мРНК. Вовлечение U7 мяРНП в процессинг пре-мРНК — уникальная особенность процессинга 3 -конца пре-мРНК гистонов. Однако существуют два общих фактора процессинга 3 -конца молекул премРНК гистонов и других белков: белок CPSF-73, выступающий в качестве эндонуклеазы, и симплекин (см. разд. 3.1.2). Не исключено, что также имеются и другие общие факторы. 83 Фактор CPSF-73 осуществляет непосредственно эндонуклеолитическое расщепление молекулы пре-мРНК. В качестве медиатора (посредника) в связывании эндонуклеазы CPSF-73 с точкой расщепления выступает фактор CPSF-100 (рис. 3.3). Симплекин является термочувствительным белком и, как и в случае расщепления и полиаденилирования остальных пре-мРНК, выступает в качестве платформы для сборки множества других факторов процессинга (рис. 3.3). В результате реакции эндонуклеолитического расщепления молекулы пре-мРНК гистонов образуется зрелая мРНК и остаточный продукт, содержащий последовательность HDE, с которой связан U7 мяРНП. Этот продукт очень быстро деградирует по направлению 5 →3 за счет экзонуклеазной активности CPSF-73 (обратите внимание, что CPSF-73 в ходе процессинга пре-мРНК гистонов выступает и как эндо-, и как экзорибонуклеаза), Высвободившийся U7 мяРНП может рециклироваться для очередного цикла процессинга. 84 Роль CTD РНК-полимеразы II в сопряжении транскрипции гистоновых генов и процессинга соответствующих пре-мРНК, в отличие от процессинга других пре-мРНК, очень незначительна. Лучшим кандидатом на роль связующего звена между транскрипцией Рис. 3.3. Компоненты молекулярного «оборудования», участвующего в процессинге 3 -конца пре-мРНК гистонов, и их взаимодействия. Точка расщепления на границе последовательности CA обозначена стрелкой По Dominski, Marzluff, 2007. Gene 396: 373-390 гистоновых генов и расщеплением пре-мРНК гистонов является белок ZFP100, который имеет ряд особенностей транскрипционного фактора. 3.1.4. Гетерогенные ядерные РНП и экспрессия генов Вся совокупность ядерных транскриптов пре-мРНК известна как гетерогенная ядерная РНК (гяРНК; heterogeneous nuclear RNA, hnRNA). Этот во многом исторический термин отражает, во-первых, значительные различия первичных транскриптов мРНК одного гена 85 по длине, а во-вторых, подчеркивает именно ядерную локализацию этих транскриптов. Таким образом, одна из основных характеристик, отличающих эту фракцию ядерных РНК, — чрезвычайно высокая вариабельность размеров входящих в нее транскриптов. Термины «гяРНК» и «пре-мРНК» обычно используются взаимозаменяемо. Однако следует иметь в виду, что только некоторая часть гяРНК является действительными предшественниками зрелых мРНК, участвующих в трансляции, в то время как остальная, довольно значительная часть перерабатывается (деградирует) в ядре. В эукариотической клетке мРНК никогда не бывает свободной от белков. Вновь синтезированные транскрипты пре-мРНК связываются с определенными белками, в результате чего образуются частицы гяРНП. Ассоциация пре-мРНК с белками происходит сразу после того, как РНК высвобождается из транскрипционного молекулярного «оборудования». Структура гяРНП чисто формально напоминает нуклеосомную укладку ДНК в хроматине (рис. 3.4). Высокомолекулярная гяРНК наматывается на глобулярные белковые частицы — информоферы. Величина отрезка РНК, приходящаяся на каждый информофер, составляет примерно 500–600 нуклеотидов. Такой молекулярный комплекс гяРНК (пре-мРНК) с белковой глобулой (информофером) составляет мономер с константой седиментации 30 S, иногда называемый информосомой. В состав каждого информофера входит 30–40 белков с молекулярной массой от 34 до 120 кДа, которые формируют сердцевину частицы гяРНП. Эти белки называют информатинами или, чаще, коровыми белками гяРНП (hnRNP core proteins). 86 Таким образом, первичный транскрипт структурного гена, подвергающийся процессингу, представляет собой гигантскую молекулу гяРНК, связанную с множеством белков и определенным образом упакованную в составе гяРНП-частиц. Рис. 3.4. Структурная организация гетерогенных ядерных РНП Белки гяРНП в клетках позвоночных так же многочисленны, как и гистоны, а частицы гяРНП — одни из главных ядерных структур. К настоящему времени идентифицировано около 20 главных белков гяРНП и несколько дополнительных. 87 Как и множество других ядерных белков, белки гяРНП полифункциональны; при этом полный набор функций, как и механизмы их действия, еще полностью не расшифрованы. Некоторые белки гяРНП участвуют в регуляции транскрипции. Многие белки гяРНП напрямую принимают участие в различных этапах метаболизма клеточных мРНК, включая процессинг 3 -конца и сплайсинг. Существенна роль ряда белков гяРНП как регуляторов альтернативного сплайсинга. Белки гяРНП, перемещаясь из ядра в цитоплазму и обратно, оказывают влияние на регуляцию ядерноцитоплазматического транспорта мРНК. Они участвуют в поддержании стабильности мРНК и влияют на их локализацию в клетке. Некоторые белки гяРНП играют ключевую роль в эмбриональном развитии организма. Таким образом, белки гяРНП в целом можно рассматривать в качестве одних из важных регуляторов экспрессии генов в эукариотической клетке. Наиболее заметной структурной особенностью коровых белков гяРНП является наличие РНК-связывающих участков, а также необычных добавочных доменов, которые, по-видимому, отвечают за межбелковые взаимодействия. Другая яркая их особенность — существование в виде многочисленных изоформ, возникающих в результате альтернативного сплайсинга соответствующих пре-мРНК (см. разд. 3.1.5.4) или посттрансляционных модификаций. 3.1.5. Сплайсинг пре-мРНК Структурные гены эукариот мозаичны (split genes) и наряду с участками, которые несут информацию об аминокислотной последовательности белка или, во всяком случае, входят в состав соответствующих транскриптов, содержат участки, которые транскрибируются, но не транслируются. Установившие этот факт в 1977 г. Ричард Робертс (Richard J. Roberts) и Филип Шарп (Phillip A. Sharp) были удостоены Нобелевской премии за 1993 г. в области физиологии или медицины. 88 Участки гена, копии которых присутствуют в составе зрелых РНК, называют экзонами (от англ. exit — выход, поскольку транскрипты этих участков выходят в цитоплазму), а участки, которые транскрибируются, но не входят в состав зрелых РНК, называют интронами (англ. introns, от intragenic [межгенные] или interveneing [лежащие между чем-либо] regions). В большинстве случаев интроны содержат некодирующие последовательности, однако иногда часть интрона может содержать информацию о некоторых некодирующих РНК (см. ниже). Вот почему не вполне корректно говорить, что интроны целиком представляют собой некодирующие последовательности. Обычно термины «экзон» и «интрон» употребляют, когда речь идет о последовательностях в составе ДНК. В случае РНК более строго говорить, соответственно, о копиях экзонов и интронов. Однако очень часто для простоты изложения термины «экзон» и «интрон» употребляются и в отношении РНК. У низших эукариот (дрожжей) 95 % всех генов содержат только один экзон (не прерываются интронами). В клетках дрозофилы количество генов, не имеющих интронов, составляет уже всего 17 %, а у млекопитающих — всего 6 %, при этом количество экзонов в одном гене млекопитающих может достигать 60. Экзоны, как правило, имеют небольшую длину — в среднем от 100 до 600 пар нуклеотидов. Интроны обычно значительно длиннее экзонов, а их длина может варьировать в широких пределах: от нескольких десятков пар нуклеотидов до многих десятков тысяч. Общая длина всех интронов гена зачастую значительно превышает суммарную длину экзонов и может составлять до 75 % общей длины всех генов. Большинство генов человека содержит интроны, размер которых составляет в среднем 1000–2000 нуклеотидных пар, но даже это примерно в 10 раз превышает размер экзонов. Соответственно, цитоплазматические мРНК значительно короче ядерных (пре-мРНК, или гяРНК) за счет того, что в ходе процессинга 89 срединной части молекулы пре-мРНК из нее удаляются интроны. Интрон-содержащие молекулы мРНК не могут экспортироваться из ядра в цитоплазму, поэтому зрелые цитоплазматические мРНК никогда не содержат интронов. Процессинг срединной части молекул-предшественников РНК, в ходе, которого обеспечивается точное удаление интронов и точное соединение (лигирование) концов соседних экзонов носит название сплайсинг (от англ. to splice — сращивать, сшивать без узлов). Сущность сплайсинга схематически отражена на рис. 3.5. Следует обратить внимание, что к категории экзонов формально относятся не только кодирующие последовательности, но также лидерная последовательность на 5 -конце между кэпом и инициирующим кодоном AUG, а также последовательность между стоп-кодоном и поли(А)-«хвостом». Эти экзонные последовательности входят в состав зрелых мРНК, но не транслируются и называются нетранслируемыми участками (untranslated regions, UTRs). Рис. 3.5. Экзоны и интроны. Сущность сплайсинга 90 Совершенно очевидно, что процесс «вырезания» интронов из молекулы пре-мРНК должен происходить с необычайной точностью, так как ошибка, приводящая к появлению хотя бы одного неправильного нуклеотида в результате последующего соединения экзонов, сместит рамку считывания и сделает бессмысленной всю нуклеотидную последовательность вновь образованной молекулы мРНК. Такая точность обеспечивается особым молекулярным строением экзонов и интронов и работой чрезвычайно сложного молекулярного «оборудования» (splicing machinery), которое распознает консервативные участки в молекуле пре-мРНК. В целом нуклеотидные последовательности интронов в молекуле пре-мРНК не являются консервативными за исключением коротких специфических фрагментов — сайтов сплайсинга (splice sites), которые служат для первичного распознавания и связязывания факторов сплайсинга. Наиболее консервативными являются нуклеотиды GU на 5 -конце интрона (так называемый донорный сайт сплайсинга, или 5 ss) и нуклеотиды AG на 3 -конце интрона (акцепторный сайт, или 3 ss). Следует обратить внимание на то, что пограничные участки соседних экзонов также содержат консервативные нуклеотиды: AG — на 3 -конце первого экзона и G — на 5 -конце второго (рис. 3.6, вверху). Таким образом, удаление интрона из молекулы пре-мРНК становится принципиально возможным только в случае присутствия определенных последовательностей нуклеотидов: AG*GURAGU в донорном сайте сплайсинга («*» — граница экзон–интрон, R — пуриновое основание) и YG*AG — в акцепторном (Y — любое пиримидиновое основание) (рис. 3.6, вверху; см. также рис. 3.18, вверху). Интроны такого типа носят название GT—AG (по обрамляющим последовательностям нуклеотидов в молекуле ДНК), или U2-зависимые интроны (по одному из ведущих факторов сплайсинга интронов этого типа — U2 малому ядерному (мя) РНП). 91 Еще одним участком в составе интрона, принципиально важным для осуществления сплайсинга, является так называемый участок ветвления (branch site). Собственно точка ветвления представляет собой аденозин, обладающий особой реакционной способностью и расположенный в пределах нуклеотидной последовательности, которая малоконсервативна у различных организмов (рис. 3.6, вверху). Рис. 3.6. Строение U2-зависимых (вверху) и U12-зависимых интронов (внизу) Последовательность точки ветвления обычно находится на расстоянии примерно 15–40 нуклеотидов выше (upstream) 3 -сайта сплайсинга. Она определяет особые свойства аденозина в точке ветвления и служит участком связывания определенных факторов сплайсинга. В пределах участка между точкой ветвления и 3 -сайтом сплайсинга расположен так называемый полипиримидиновый тракт, или полипиримидиновый участок (polypirimidine tract), образованный следующими друг за другом пиримидиновыми основаниями (Yn). Полипиримидиновый тракт — еще один важный 92 структурный участок интрона, служащий для связывания с пре-мРНК определенных факторов сплайсинга. Однако в пре-мРНК низших эукариот (например, дрожжей) полипиримидиновый тракт слабо выражен или отсутствует (рис. 3.6). Обратите внимание на последовательности нуклеотидов (рис. 3.6) в районе донорного (5 -) и акцепторного (3 -) сайтов сплайсинга. Аденозин в точке ветвления обозначен звездочкой. R – любой пуриновый нуклеотид, Y – любой пиримидиновый нуклеотид. (Yn) — полипиримидиновый тракт. Нуклеотидные последовательности экзонов, в отличие от интронов, напрямую не требуются для сплайсинга. Однако в них существуют важные регуляторные элементы, с которыми связываются определенные белки, стимулируя альтернативный сплайсинг (см. разд. 3.1.5.4). Кроме вышеописанных, широко распространенных «классических» U2-зависимых интронов существует небольшая группа так называемых AT—AC (произносится ―attack‖), или U12зависимых, интронов. После открытия интронов AT—AC было обнаружено, что в некоторых случаях обрамляющие нуклеотиды таких интронов могут быть другими. Участок в районе точки ветвления интронов AT—AC также отличается от такового «классических» интронов, а полипиримидиновый тракт отсутствует (рис. 3.6, внизу). В клетках человека U12-зависимые интроны составляют всего около 1 % от общего количества интронов. Тем не менее, интроны этого типа обнаружены в генах, продукты которых принимают участие в выполнении важнейших клеточных функций (например, в репликации и репарации ДНК, транскрипции, процессинге РНК и трансляции). Эволюционное происхождение и значение различных типов интронов неизвестно. Химические реакции, лежащие в основе сплайсинга пре-мРНК как с U2-зависимыми, так и с U12-зависимыми интронами, одинаковы (разд. 3.1.5.3). Сплайсинг таких пре-мРНК представляет собой 93 двушаговый механизм, который включает в себя две последовательные реакции трансэтерификации, названные так потому, что нуклеотиды в цепи РНК исходно соединены между собой фосфодиэфирными связями, а новая связь образуется в то же самое время, когда старая разрушается. Реакции сплайсинга катализируются сплайсосомами (дословно «тельца сплайсинга»), которые наряду с рибосомами считают самыми сложными молекулярными машинами эукариотической клетки. Действительно, количество известных факторов сплайсинга, которые присутствуют в эукариотической клетке, поистине впечатляет. Подсчеты показали, что в сплайсинге пре-мРНК клеток человека задействовано более 300 различных белков, в том числе структурные белки гяРНП, РНК-связывающие белки, SR-белки (разд. 3.1.5.2). Ферментативную активность обеспечивают многочисленные протеинкиназы и РНК-зависимые АТФазы, одна ГТФаза и ряд других ферментов. Ключевыми компонентами сплайсосом являются 5 малых ядерных (мя) РНК. Эти РНК находятся в комплексе с особыми белками (Sm или Lsm), составляющими основу мяРНП, а также 3–15 белками, специфичными для каждого типа мяРНП (разд. 3.1.5.1). Сплайсосомы формируются в строго определенном порядке (разд. 3.1.5.3) с участием белковых факторов сплайсинга на пре-мРНК перед осуществлением химических реакций сплайсинга и разбираются по завершении сплайсинга. Ассоциация между собой компонентов сплайсосом происходит каждый раз заново для каждого цикла сплайсинга путем пошаговой (piece-by-piece) сборки. Хотя сами по себе реакции трансэтерификации не требуют энергетических затрат, сборка и последующая разборка сплайсосом требует энергии АТФ. Сплайсосомы удалось биохимически изолировать in vitro как частицы с константой седиментации 60 S, после чего исследовать под электронным микроскопом: это частицы диаметром около 40–60 нм. 94 3.1.5.1. Малые ядерные РНП и процессинг мяРНК Малая ядерная рибонуклеопротеиновая частица (мяРНП) состоит из (1) молекулы одной из малых ядерных РНК (мяРНК), которые имеют сравнительно небольшой размер, характерную вторичную структуру (присутствие специфических «шпилек») и обогащены остатками уридина (UsnRNA, от англ. uridine), (2) набора из семи так называемых Sm-белков и (3) нескольких белков, специфичных для мяРНП-частиц определенного класса. Главными (major) мяРНК сплайсинга, которые входят в состав сплайсосом, катализирующих сплайсинг подавляющего большинства интронов (U2-зависимых интронов), являются U1, U2, U4, U5 и U6 мяРНК. Сплайсинг минорной (minor) группы интронов (U12-зависимых интронов) катализируют сплайсосомы, в состав которых входят U11, U12, U4atac (по первоначальному названию этой группы интронов AT—AC), U6atac и U5 мяРНК; последняя мяРНК является общей для обоих типов сплайсосом. Частицы различных U мяРНП (амер. «snurps», произносится «снѐрпс», от small nuclear RNPs) выполняют во время сплайсинга множество необходимых функций. За счет взаимодействий их РНК- и белковых компонентов с определенными участками пре-мРНК они способствуют распознаванию 5 - и 3 -сайтов сплайсинга интрона и последующему сближению этих сайтов друг с другом. Кроме того, мяРНП ответственны за создание трехмерной структуры, которая необходима для формирования двух активных участков сплайсосомы, по одному для каждой из двух последовательных реакций сплайсинга. Метаболизм мяРНП по типу U1 Метаболизм (биогенез) мажорных мяРНК U1, U2, U4, U5 и минорных мяРНК U11, U12 и U4atac осуществляется сходным образом; его этапы представлены на примере U1 мяРНК в табл. 2. U1, U2, U4, U4atac, U5, U11 и U12 мяРНК кодируются индивидуальными генами, которые, как и структурные гены, транскрибируются РНК-полимеразой II. Соответственно, вновь 95 синтезируемые пре-мяРНК подвергаются котранскрипционному кэпированию их 5 -конца с формированием на нем 7метилгуанозинового кэпа (см. разд. 3.1.1), но не полиаденилируются. Вместо этого на своем 3 -конце их молекулы имеют цепочку добавочных нуклеотидов, которые в ходе процессинга удаляются. Следующие этапы процессинга пре-мяРНК данной группы осуществляются в цитоплазме, где, собственно, и происходит сборка мяРНП-частиц. Перед экспортом формируется особый комплекс экспорта мяРНК (U snRNA export complex) (рис. 3.7). Единственным сигналом, необходимым для его формирования, служит кэп на 5 -конце премяРНК, а собственно экспорт опосредуется белком экспортином 1 (Xpo1; от exportin 1) — общим фактором, который обеспечивает экспорт продуктов РНК-полимеразы II в клетках высших эукариот. Взаимодействие между экспортином 1 и пре-мяРНК опосредуется двумя адаптерами: кэп-связывающим белком CBP (cap binding protein) и фосфопротеином PHAX (phosphorylated adaptor for RNA export). Если Xpo1 и CBP являются общими факторами экспорта РНК, то PHAX является фактором, специфичным для экспорта именно пре-мяРНК. Фактор PHAX непосредственно связывается как с кэпсвязывающим комплексом (CBC), так и с пре-мяРНК, образуя так называемый «пре-комплекс» экспорта, который является основой для формирования комплекса экспорта мяРНК. Этот «пре-комплекс» может эффективно взаимодействовать с экспортином 1 (Xpo1) в присутствии комплекса Ran–ГТФ. Белок Ran представляет собой ГТФазу, которая выполняет многие функции в координации ядерных и митотических процессов у эукариот, в том числе векторную направленность ядерно-цитоплазматического транспорта; этот белок может находиться в ГТФ- и ГДФ-связанных конформациях, которые различаются по их молекулярным взаимодействиям. 96 Обратите внимание (рис. 3.7) на взаимодействие факторов экспорта с пре-мяРНК: кэп-связывающего комплекса (CBC), специфического фосфорилированного фактора экспорта мяРНК (PHAX), экспортина 1 (Xpo1) и Ran-ГТФ (RAN-GTP). В цитоплазме происходит гидролиз ГТФ, дефосфорилирование PHAX, после чего комплекс диссоциирует. Рис. 3.7. Экспорт мяРНК в цитоплазму на примере U1 По Will, Lührmann, 2001. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 290-301 После экспорта в цитоплазму комплекс, в составе которого премяРНК находится в связи с кэп-связывающим белком (CBP), PHAX, экспортином 1 (Xpo1) и Ran-ГТФ, диссоциирует за счет гидролиза ГТФ и дефосфорилирования PHAX, после чего начинается сборка мяРНП-частиц. Сборка мяРНП происходит в строго определенном порядке и осуществляется пошагово. В результате этого процесса молекула премяРНК связывается с семью так называемыми Sm-белками: B/B′, D3, D2, D1, E, F и G, которые формируют центральную часть (Sm core) частицы мяРНП (рис. 3.8). 97 Sm-белки взаимодействуют с консервативной уридин-богатой последовательностью пре-мяРНК — так называемым Smсвязывающим участком (Sm site), который ограничен двумя «шпильками» (stem-loop structures). Перед связыванием с Sm-сайтом Sm-белки первоначально формируют три комплекса (рис. 3.8). Вначале с пре-мяРНК связываются комплексы D1–D2 и E–F–G, формируя довольно стабильный комплекс, только после чего присоединяются Рис. 3.8. Ассоциация Sm-белков с мяРНК комплекс B–D3 или B′–D3 (белки B и B′ различаются только по их последним 11 аминокислотным остаткам и кодируются одним и тем же геном). В результате сформированный комплекс Sm-мяРНП представляет собой 7-членное белковое кольцо вокруг молекулы пре-мРНК (рис. 3.8). В живой клетке сборка мяРНП обеспечивается особым белковым комплексом, центральное место в котором занимает белок SMN (белок «выживания нейронов», survival of motoneurons). Для справки, недостаток белка SMN приводит к атрофии мышц спины (spinal muscular atrophy disease, SMA) — одному из тяжелейших наследственных заболеваний человека, которое является ведущей причиной детской смертности. Это заболевание вызывается дегенерацией мотонейронов позвоночника, что приводит к слабости мышц, их атрофии и, в конечном итоге, к гибели ребенка. Установлено, что в основе дегенерации мотонейронов при SMA человека лежит уменьшение эффективной сборки комплексов SmмяРНП в клетке за счет резкого снижения количества белка SMN. 98 Комплекс SMN (рис. 3.9) помимо собственно белка SMN содержит по крайней мере восемь других белков, в том числе так называемые белки гемины (Gemins2–7, по названию ―Gems‖, или ―Gemini‖ [англ. «близнецы»] — особые ядерные тельца, родственные тельцам Кахала (разд. 4.1.4), в которых впервые были обнаружены эти белки). Комплекс SMN осуществляет сборку Sm-белков непосредственно на Sm-связывающем сайте каждой молекулы пре- Рис. 3.9. Участие комплекса SMN в сборке мяРНП. По Battle et al., 2006. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 71: 313–320 99 мРНК. Этот процесс требует энергии АТФ. Первоначально Sm-белки связываются с комплексом SMN и лишь затем ассоциируют с премяРНК (рис. 3.9). Каждый белок, который входит в состав комплекса SMN (за исключению гемина-2), напрямую взаимодействует с Smбелками. Кроме того, Sm-белки B/B , D1 и D3 имеют характерный Cконцевой «хвост», богатый повторами остатков аргинина (R) и глицина (G) (RG-rich domain), который метилируется с помощью особых частиц — 20 S-метилосом (рис. 3.9). Это метилирование усиливает связывание Sm-белков с комплексом SMN. Независимо от взаимодействия с Sm-белками комплекс SMN связывается непосредственно с мяРНК и распознает не только их короткий Sm-связывающий сайт, но и специфические по строению участки молекул. После ассоциации с Sm-белками происходит гиперметилирование кэпа пре-мяРНК. В результате стандартный 7-метилгуанозиновый кэп преобразуется в особый 2,2,7-триметилгуанозиновый кэп (trimethylguanosine cap, TMG, или m3G). Этот процесс осуществляется ферментом триметилгуанозинсинтетазой. Цитоплазматический этап метаболизма мяРНП заканчивается процессингом 3 -конца пре-мяРНК, который состоит в удалении примерно 20 нуклеотидов с помощью пока неизвестной рибонуклеазы. Этот процесс называется «триммингом 3 -конца» (3 -trimming). Для эффективного осуществления этого процесса требуется определенный набор белковых факторов. Процессинг 5 конца пре-мяРНК (гиперметилирование кэпа) и тримминг (процессинг 3 -конца) возможны только после ассоциации пре-мяРНК с Sm-белками. После цитоплазматического этапа процессинга пре-мяРНК частицы мяРНП снова импортируются в ядро. Этот импорт обеспечивается по крайней мере двумя транспортными факторами, составляющими вместе с мяРНП комплекс импорта (рис. 3.10). 100 Триметлгуанозиновый кэп мяРНК распознается белком снѐрпортином 1 (snurportin-1, SPN1). Название этого фактора (от Рис. 3.10. Импорт мяРНП в ядро после завершения цитоплазматической фазы процессинга на примере U1. По Will, Lührmann, 2001. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 290-301 ―snurps‖ — snRNPs) подчеркивает его специфичность для импорта именно мяРНП. Однако само по себе взаимодействие мяРНП и SPN1 недостаточно для импорта мяРНП в ядро и требует взаимодействия мяРНП с общим фактором импорта РНК — импортином . Предполагают, что импортин имеет «стыковочный» сайт (docking site) для связывания комплекса SMN. После возвращения мяРНП в ядро комплекс импорта диссоциирует, а оба транспортных фактора — снѐрпортин 1 и импортин — возвращаются в цитоплазму. 101 Оказавшись в ядре, мяРНП (по-видимому, еще в ассоциации с комплексом SMN) временно накапливаются в особых внутриядерных органеллах — тельцах Кахала (Cajal bodies, CBs; подробнее см. разд. 4.1.4). Здесь мяРНК в составе мяРНП подвергаются двум заключительным этапам процессинга — сайт-специфическим 2 -O-метилированию остатков рибозы и псевдоуридинилированию, т. е. замене части уридинов на псевдоуридин (Ψ). Эти процессы управляются особым классом малых РНК, специфичных для телец Кахала (мткРНК; small Cajal body RNAs, scaRNAs). Эти РНК, как и мяРНК, относятся к классу U малых РНК, а по строению и функциям близки многим малым ядрышковым (мяш) РНК (см. ниже). В частности, U85, U87, U88 и U89 РНК осуществляют метилирование остатков рибозы и псевдоуридинилирование U4 и U5 мяРНК сплайсинга. U90 и U91 РНК осуществляют метилирование U1 и U4 мяРНК, а U92 — псевдоуридинилирование U2 мяРНК. Наконец, с мяРНП связываются белки, специфические для каждого мяРНП. Так, биогенез U1 мяРНП завершает ассоциация U1 мяРНК с тремя U1-специфическими белками — U1A, U1C и U170 кДа (рис. 3.11). Подобного рода белки играют важную роль в межбелковых взаимодействиях в ходе сборки сплайсосом (см. ниже). Предполагают, что импорт этих белков в ядро осуществляется независимо от импорта мяРНП, однако не исключено, что часть мяРНПспецифических белков, как и Рис. 3.11. Ассоциация U1 мяРНП Sm-белки, могут связываться с со специфическими белками мяРНК еще в цитоплазме. 102 Комплекс SMN отделяется от частиц мяРНП (поскольку он не является их интегральной частью) и возвращается в цитоплазму. Зрелые мяРНП временно хранятся в особых ядерных компартментах — кластерах интерхроматиновых гранул, или ядерных ―speckles‖ (разд. 4.1.3), откуда рекрутируются к местам транскрипции и сплайсинга. Особенности метаболизма U7 мяРНП Напомним, что U7 мяРНП по своему строению близок U1, U2, U4 и U5 мяРНП, но принимает участие не в сплайсинге пре-мРНК, а в своеобразном процессинге 3 -конца пре-мРНК гистонов (разд. 3.1.3). Как и в частицах сплайсосомных мяРНП, со своеобразным Sm-сайтом U7 мяРНК (рис. 3.12) связываются Sm-белки B, D3, E, F и G. Однако вместо белков D1 и D2 с ним связываются два так называемых Sm-подобных белка Lsm10 и Lsm11 (от англ. like-Sm). Рис. 3.12. Сравнение строения Sm-связывающих участков молекул U2 мяРНК (слева) и U7 мяРНК (справа) Основные этапы метаболизма сплайсосомных мяРНП (кроме U6) и U7 мяРНП приведены в табл. 2. Метаболизм U6 мяРНП Метаболизм (биогенез) мажорной мяРНК U6 и минорной U6atac осуществляется сходным образом, но принципиально отличается от процессинга остальных сплайсосомных мяРНК, а также U7 мяРНК (табл. 3, рис. 3.13). Во-первых, это исключительно ядерный процесс. Во-вторых, особенности процессинга U6 и U6atac пре-мяРНК определяются тем, что соответствующие гены транскрибируются РНК-полимеразой III. 103 Таблица 2 Этап метаболизма мяРНП сплайсинга (кроме U6), а также U7 мяРНП Синтез пре-мяРНК Место осуществления кэпирование 5 -конца — формирование стандартного метилгуанозинового кэпа ЯДРО Процессинг присоединение пре-мяРНК дополнительной нуклеотидной последовательности на 3 конце Экспорт из ядра в цитоплазму Ассоциация с Sm-белками Гиперметилирование 5 -кэпа с ЦИТОПЛАЗМА образованием триметилуганозинового кэпа Тримминг 3 -конца сайт-специфическое 2 -ОМодификация метилирование остатков тельце Кахала оснований рибозы псевдоуридинилирование Ассоциация с белками, специфичными для неизвестно каждой мяРНК Хранение и рециклирование кластеры интерхроматиновых гранул (мяРНП сплайсинга), тельца Кахала или тельца гистоновых локусов (U7) 104 ЯДРО Возврат из цитоплазмы в ядро Этап метаболизма U6 мяРНП Синтез U6 пре-мяРНК Ассоциация с белком La Таблица 3 Место осуществления в ядре клетки Нуклеоплазма Процессинг 3 -конца: формирование 2 3 -циклофосфата Процессинг 5 -конца: метилирование кэпа Замещение белка La Lsm-белками с образованием U6 мяРНП Модификации оснований (метилирование, псевдоуридинилирование) Формирование дуплекса U4/U6 и присоединение U5 мяРНП образованием [U4/U6•U5] мяРНП Временное хранение и рециклирование Ядрышко Ядрышко Тельце Кахала Кластеры интерхроматиновых гранул Вновь синтезированная молекула U6 пре-мРНК на своем 5 конце имеет трифосфатный кэп, а ее 3 -конец заканчивается терминальной OH-группой. В районе 3 -конца U6 пре-мяРНК располагается консервативный поли(U)-участок, который составлен несколькими остатками уридина и соответствует типичному сигналу терминации транскрипции РНК-полимеразы III. 105 Рис. 3.13. Метаболизм U6 мяРНП. По Patel, Bellini, 2008. Nucl. Acids Res. 36: 6482-6493 В начале процессинга молекулы U6 пре-мяРНК с ней временно ассоциирует белок La. Он связывается как с 5 -трифосфатным кэпом, так и с 3 -поли(U) участком. Белок La — весьма распространенный фосфопротеин молекулярной массой 47 кДа, который связывается со всеми продуктами РНК-полимеразы III и представляет собой шаперон РНК и фактор стабильности. Белок La защищает продукты транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой III, от деградации рибонуклеазами и связывает с ядрышками. В ядрышках, первичная функция которых состоит в синтезе рибосомных РНК (пре-рРНК), их созревании и формировании прерибосомных частиц, осуществляется основная часть процессинга U6 пре-мяРНК (рис. 3.13). У большинства (~ 90 %) молекул U6 мяРНК на конце имеется 2 -3 -циклофосфат, а у меньшей части (~ 10 %) на 3 -конце находится олиго(U)-участок (3 -oligo(U) stretch) длиной до 20 нуклеотидов. Идентифицировано два специфических фермента, которые участвуют в модификации 3 -конца молекул U6 пре-мяРНК: 3 -экзонуклеаза 106 и концевая уридилилтрансфераза (terminal uridylyltransferase, TUTase). Оба фермента специфически распознают 3 -конец молекулы U6 пре-мяРНК в качестве субстрата и участвуют, соответственно, в добавлении или удалении остатков уридина. Процессинг 5 -конца молекулы U6 пре-мяРНК состоит в добавлении метильной группы к трифосфатному кэпу с образованием -монометилтрифосфатного кэпа ( -m-P3 cap) (рис. 3.14). Этот процесс катализируется специфической метилтрансферазой. Кэп защищает молекулу U6 мяРНК от деградации. Формирование -m-P3-кэпа на 5 -конце, а также 3 -концевого 2 3 -циклофосфата приводит к отсоединению белка La и замещению Рис. 3.14. Строение -монометилтрифосфатного кэпа на 5 -конце молекулы U6 мяРНК его набором других белков (Sm-подобных белков Lsm). Молекула U6 мяРНК не содержит Sm-связывающего сайта, однако она ассоциирует с семью Sm-подобными белками (Lsm2–8), которые связываются с 3 -концом молекулы U6 мяРНК. В отличие от Sm-белков, Sm-подобные белки способны формировать семикомпонентный комплекс в отсутствие РНК. Таким образом, 107 сборка корового Lsm-комплекса на молекуле U6 мяРНК может представлять собой одношаговый процесс. Одна из важных функций Sm-подобных белков, ассоциированных с U6 мяРНК, — ее удержание (retention) в ядре. Иными словами, именно данный белковый комплекс обеспечивает ядерную локализацию U6 мяРНК. Подобно остальным мяРНК сплайсинга, молекулы U6 премяРНК в ходе своего процессинга подвергаются сайт-специфическим метилированию и псевдоуридинилированию. Однако в отличие от большинства мяРНК (см. выше), эти процессы протекают не в тельцах Кахала, а в ядрышках и осуществляются особыми малыми РНП-частицами. В состав таких частиц входит одна молекула малых ядрышковых (мяш) РНК (small nucleolar RNAs, snoRNAs) и набор определенных белков. МяшРНК, которые управляют процессами метилирования и псевдоуридинилирования (guide RNAs), по своему строению относятся к двум классам: C/D и H/ACA по названию входящих в их состав консервативных последовательностей С (UGAUGA) и D (CUGA) или, соответственно, H (ANANNA, где ―N‖ – любой нуклеотид) и ACA. Эти консервативные участки служат для связывания с набором белков с формированием частиц мяшРНП и определяют специфические участки для связывания соответствующих РНК. МяшРНП класса C/D отвечают за сайт-специфическое 2 -Oметилирование рибозы, а мяшРНП класса H/ACA катализируют изомеризацию уридина до псевдоуридина. Следует отметить, что U85, U87—U92 РНК (мткРНК), которые по своей структуре родственны мяшРНК, одновременно содержат последовательности C/D и H/ACA и, соответственно, участвуют как в метилировании, так и псевдоуридинилировании соответствующих мяРНК сплайсинга в тельцах Кахала. Большинство известных к настоящему времени малых РНК, которые управляют процессами метилирования и 108 псевдоуридинилирования других РНК (как мяшРНК, так и мткРНК), кодируются интронами структурных генов. По завершении всех этапов своего процессинга U6 пре-мяРНК направляется в тельца Кахала. Здесь первоначально формируется мяРНП-частица, содержащая одновременно две мяРНК — U4 и U6 (U4/U6 di-snRNP). Образование дуплекса между двумя мяРНК — U4 Рис. 3.15. Формирование дуплекса U4/U6 РНК и U6 — достигается за счет обширных участков комплементарного спаривания оснований (рис. 3.15). Для сборки U4/U6 мяРНП необходим U6-специфический белок SART3, в клетках человека известный также как белок p110 (protein 110). Белок SART3 содержит две РНК-связывающие последовательности и связывается непосредственно с U6 мяРНК. Кроме того, посредством своего C-конца он взаимодействует с Lsmбелками, а за счет определенного N-концевого домена — с одним из U4/U6-специфических белков. Такие сложные межбелковые взаимодействия создают основу для формирования частицы U4/U6 мяРНП. В тельцах Кахала происходит еще одно важное событие, связанное с метаболизмом мяРНП сплайсинга, которое предшествует сборке сплайсосомы. После формирования частицы U4/U6 мяРНП ее 109 покидает белок SART3, после чего с U4/U6 мяРНП связывается U5 мяРНП, формируя сложную мяРНП-частицу, которая одновременно содержит сразу три мяРНК: U4, U6 и U5. Эта мяРНП-частица представляет собой одну из трех субъединиц сплайсосомы [U4/U6•U5] мяРНП (tri-snRNP). В формировании этой частицы основу составляют взаимодействия между белками, специфичными для U5 мяРНП. Сборка [U4/U6•U5] мяРНП в тельцах Кахала осуществляется довольно быстро и с высокой степенью интенсивности. Так, за 1 мин в одном тельце Кахала осуществляется сборка примерно 230 частиц [U4/U6•U5] мяРНП. Временное хранение [U4/U6•U5] мяРНП, как и остальных мяРНП, а также белковых факторов сплайсинга, не входящих в состав мяРНП-частиц, осуществляется в кластерах интерхроматиновых гранул (разд. 4.1.3). 3.1.5.2. Белковые факторы сплайсинга Важнейшими факторами сплайсинга являются SR-белки. Кроме того, это регуляторы альтернативного сплайсинга (разд. 3.1.5.4.). SRбелки не входят в состав мяРНП-частиц (non-snRNP splicing factors). Свое название они получили за то, что их молекулы чрезвычайно богаты остатками серина (S) и аргинина (R). Эти белки играют важную роль на разных этапах сборки сплайсосомы (см. разд. 3.1.5.3). Они облегчают комплементарные взаимодействия между пре-мРНК и мяРНК в 3 - и 5 -сайтах сплайсинга и способствуют привлечению [U4/U6•U5] мяРНП к пресплайсосомному комплексу. Кроме того, SRбелки обеспечивают стабилизацию компонентов сплайсосомы за счет взаимодействия между их особыми доменами (RS-доменами). Семейство SR-белков включает в себя эволюционно консервативные белки, родственные друг другу в структурном отношении. Все они имеют модульное строение (рис. 3.16) и содержат на N-конце одну или две РНК-распознающие последовательности (RRM), а на C-конце — характерный RS-домен, богатый повторяющимися друг за другом остатками аргинина (R) и 110 серина (S). RS-домены, длина которых у различных SR-белков варьирует от 50 до 300 аминокислотных остатков, представляют собой адаптеры, которые играют существенную роль в межбелковых взаимодействиях. Показано также, что RS-домен может служить сигналом ядерной локализации (NLS), опосредуя взаимодействия SR-белков с фактором их ядерного импорта — SR-импортином. В ядре эукариотической клетки SR-белки являются молекулярными маркерами кластеров интерхроматиновых гранул (см. разд. 4.1.3). Обратите внимание на присутствие двух РНК-связывающих последовательностей (RRM) и RS-домена, чрезвычайно богатого Рис. 3.16. Строение молекулы одного из ведущих факторов сплайсинга SR-белка SF2/ASF дипептидными повторами остатков аргинина и серина (RS) (на рисунке 3.16 подчеркнуты). Функциональная активность SR-белков и их внутриядерная локализация определяется циклами фосфорилирования– дефосфорилирования RS-доменов, которое происходит по остаткам серина. Фосфорилирование SR-белков определенными протеинкиназами приводит к рекрутированию SR-белков из кластеров интерхроматиновых гранул к местам транскрипции и сплайсинга, чему также способствует связывание SR-белков с CTD транскрибирующей РНК-полимеразы II. Дефосфорилирование SRбелков, наоборот, служит одним из сигналов, необходимых для возвращения SR-белков в их временные хранилища — кластеры 111 Рис. 3.17. Рекрутирование SR-белков к местам транскрипции и сплайсинга. По Dundr, Misteli, 2001. Biochem. J. 356: 297–310 интерхроматиновых гранул (рис. 3.17). Важную группу белковых факторов сплайсинга составляют АТФ-зависимые РНК-связывающие белки. Они разрушают как дуплексы РНК–РНК, так и нарушают взаимодействия между РНК и белками. Эти белки могут выступать в качестве независимых от нуклеотидной последовательности РНК «зажимов», которые защищают определенные участки РНК. Почти каждый шаг сборки или разборки сплайсосомы (разд. 3.1.5.3) требует участия, по крайней мере, одного такого белка. Наконец, следует помнить, что процессингу подвергается премРНК в форме гяРНП, т. е. в связи с РНК-связывающими коровыми белками гяРНП, или информатинами. Многие из этих белков способны позитивно или негативно регулировать начало сборки сплайсосомы. Часть белков гяРНП напрямую не зависит от нуклеотидных последовательностей сайтов сплайсинга или других последовательностей пре-мРНК и являются факторами упаковки РНК. В ходе сборки сплайсосомы они постепенно замещаются активными сплайсосомными компонентами. Другие белки гяРНП, 112 напротив, демонстрируют специфичность по отношению к нуклеотидным последовательностям пре-мРНК и создают уникальные стехиометрические комбинации, которые могут влиять на раннее распознавание сайтов сплайсинга сплайсосомным «оборудованием» и регулировать альтернативный выбор этих сайтов (см. разд. 3.1.5.4). 3.1.5.3. Сборка сплайсосом и реакции сплайсинга С биохимической точки зрения сплайсинг пре-мРНК представляет собой две последовательные реакции трансэтерификации. В результате происходит разрыв исходных фосфодиэфирных связей между нуклеотидами на границах экзон– интрон в донорном и акцепторном сайтах сплайсинга с образованием новой фосфодиэфирной связи между соседними экзонами (этот процесс также называют лигированием). При этом интрон высвобождается в форме характерного лассо («кольцо с хвостом») (рис. 3.18). В ходе первой реакции сплайсинга 2 -гидроксильная группа аденозина в точке ветвления, действуя как нуклеофил, атакует фосфодиэфирную связь между 5 -экзоном и интроном в донорном сайте сплайсинга. В результате образуется два промежуточных продукта: (1) «первый» экзон со свободной гидроксильной группой и (2) комплекс, состоящий из интрона в форме лассо, «хвост» которого все еще соединен со «вторым» экзоном. При этом свою форму лассо интрон приобретает за счет образования новой фосфодиэфирной связи в точке ветвления (рис. 3.18). После первой реакции трансэтерификации сразу следует вторая, в ходе которой свободный гидроксил на 3 -конце «первого» экзона совершает нуклеофильную атаку на акцепторный сайт сплайсинга, разрывая фосфодиэфирную связь на границе интрона и «второго» экзона. При этом образуется новая фосфодиэфирная связь между двумя соседними экзонами (рис. 3.18). 113 Рис. 3.18. Строение интрона (вверху) и схема реакций сплайсинга Итак, при сплайсинге в результате двух последовательных реакций трансэтерификации образуется сплайсированная мРНК с сохранением непрерывной кодирующей последовательности и свободный интрон в форме лассо. Для осуществления этих двух относительно простых химических реакций, лежащих в основе сплайсинга, требуется чрезвычайно сложное молекулярное «оборудование». 114 С молекулярно-биологической точки зрения сплайсинг премРНК осуществляется на основе РНК-белкового каталитического комплекса, называемого сплайсосомой. Это гигантская молекулярная машина массой около 3 МДа. Большинство сплайсосом состоит из трех РНП-субъединиц U1 мяРНП, U2 мяРНП и [U4/U6•U5] мяРНП. Минорные сплайсосомы включают, соответственно, U11, U12 и [U4atac/U6atac•U5] мяРНП-субъединицы. Сборка сплайсосомы представляет собой многоступенчатый процесс и требует временных и энергетических затрат. В ходе сборки мажорных, или U2-зависимых, сплайсосом последовательно образуется по крайней мере четыре различных короткоживущих надмолекулярных комплекса, которые различаются по их молекулярному составу и порядку формирования: E A B C (рис. 3.19). Сборку этих комплексов обеспечивает правильное распознавание сайтов сплайсинга среди множества похожих нуклеотидных последовательностей, а также точное сближение друг с другом донорного (5 ss) и акцепторного (3 ss) сайтов сплайсинга, расстояние между которым может составлять десятки тысяч (!) нуклеотидов, до дистанции на уровне атомов. За последние годы достигнут существенный прогресс в расшифровке процессов, лежащих в основе сборки сплайсосом на молекулярном и даже атомном уровнях, что позволило внести ряд уточнений в схемы сплайсинга, которые существовали еще недавно. Сборка сплайсосомы (рис. 3.19) начинается с АТФнезависимого формирования так называемого комплекса E (от англ. ―early‖ — ранний), который в дрожжевых клетках называют комплекс СС (commitment complex; от англ. ―commitment‖ — вручение, передача). Этот комплекс необратимо определяет дальнейшее вырезание конкретного интрона, а его сборка играет решающую роль в первичном распознавании 5 - и 3 -сайтов сплайсинга. 115 Рис. 3.19. Сплайсосомный цикл В ходе формирования комплекса E с пре-мРНК первоначально связывается субъединица U1 мяРНП. При этом происходит распознавание 5 -сайта сплайсинга за счет обширного комплементарного спаривания оснований между U1 мяРНК и последовательностью в районе консервативного элемента GU на 5 конце интрона. Сами по себе все взаимодействия РНК–РНК в ходе формирования сплайсосомы относительно слабые и обязательно требуют дополнительного усиления и стабилизации за счет белковых факторов сплайсинга. Например, образование дуплекса между 5 -сайтом сплайсинга пре-мРНК и U1 мяРНК затрагивает всего 4–7 пар оснований. Посредником в регуляции спаривания оснований между U1 мяРНК и 5 -сайтом сплайсинга частично выступает U1специфический белок U1-C. 116 За пределами донорного (5 -) сайта сплайсинга при формировании комплекса E происходит связывание белка SF1 (splicing factor 1) с нуклеотидной последовательностью в районе точки ветвления. С полипиримидиновым трактом связывается белок U2AF (вспомогательный фактор для U2; U2 auxiliary factor). Связывание этих двух белков с пре-мРНК осуществляется кооперативно, а их взаимодействие между собой определяется фосфорилированием белка SF1. Фактор U2AF необходим для осуществления последующего связывания с интроном U2 мяРНК — центрального компонента второй субъединицы сплайсосомы. Он представляет собой гетеродимер, включающий две субъединицы с молекулярными массами, соответственно, 65 и 35 кДа. Непосредственно с полипиримидиновым трактом связывается субъединица U2AF65 за счет своей РНК-распознающей последовательности. Субъединица U2AF35 связывается с пре-мРНК, специфическим образом распознавая каноническую последовательность AG на 3 -конце интрона. Эта субъединица играет также существенную роль в межбелковых взаимодействиях за счет двух доменов, один из которых связывает субъединицу U2AF65, а другой (RS-домен) взаимодействует с RS-доменами других SR-белков. Вообще, RS-домены SR-белков играют важную роль в процессах сборки сплайсосомы. Прежде всего, они обеспечивают межбелковые взаимодействия, стабилизирующие сплайсосомные компоненты, но также участвуют в привлечении мяРНП к формирующейся сплайсосоме. После образования комплекса E (СС) все последующие этапы сборки сплайсосомы требуют энергии АТФ. Связывание с пре-мРНК U2 мяРНП приводит к преобразованию комплекса E в комплекс A, который также называют пресплайсосомой. В ходе формирования комплекса A достигается стабильное взаимодействие U2 мяРНП с участком в районе точки ветвления. При этом формирование 117 короткой внутримолекулярной спирали в молекуле U2 мяРНК приводит к «выпячиванию» аденозина точки ветвления, придавая ему особую реакционную способность. Спариванию оснований U2 мяРНК с участком пре-мРНК в районе точки ветвления способствует RSдомен фактора U2AF65, связанного с полипиримидиновым трактом интрона. Выше точки ветвления (upstream) с пре-мРНК также связывается белковый комплекс SF3. В стабилизации комплекса A важную роль играют взаимодействия между SR-белками. Так, RS-домен субъединицы U2AF35 напрямую взаимодействует с RS-доменом фактора SF2/ASF. На этом этапе существенное значение для сборки сплайсосомы имеет SR-белок SC35 (spliceosome component 35), RS-домен которого одновременно взаимодействует с RS-доменами белков U1-70 кДа, SF2/ASF и U2AF35. На этапе формирования комплекса A белок SF1 высвобождается из участка в районе точки ветвления и замещается белком UAP56, который представляет собой АТФазу, взаимодействующую с U2AF65. На следующем этапе сборки сплайсосомы происходит преобразование комплекса A в комплекс B1. Это преобразование состоит в АТФ-зависимом связывании с 5 -сайтом сплайсинга третьей субъединицы сплайсосомы — [U4/U6•U5] мяРНП, которое опосредуется U5 мяРНК и одним из белков U5 мяРНП. Привлечению этой субъединицы к мяРНК способствуют также RS-домены SRбелков. Таким образом, сплайсосомный комплекс B1 охватывает полный набор мяРНК, необходимых для сплайсинга. Кроме того, в клетках человека он содержит около 110 различных белков, включая 50 новых, которые отсутствуют в комплексе A. Однако сплайсосома в виде комплекса B1 еще не имеет активного каталитического центра и потому неактивна. Для ее активации требуются последующие конформационные перестройки, которые приводят к формированию комплекса B2 — каталитически активной сплайсосомы. 118 На этапе каталитической активации сплайсосомы, во-первых, теряется связь между U1 мяРНП и 5 -сайтом сплайсинга. Вовторых, расплетаются участки комплементарного спаривания между U4 и U6 мяРНК, в результате чего U4 мяРНП высвобождается из сплайсосомного комплекса. В-третьих, образуются новые комплементарные связи между U6 и U2 мяРНК. Наконец, образуется связь между U6 мяРНК и 5 -сайтом сплайсинга. Эти преобразования обеспечивают точность распознавания 5 -сайта сплайсинга и укрепляют контакт с точкой ветвления. Самую активную роль в этих перестройках играют белки, специфичные для U5 мяРНП (табл. 4). Таблица 4 Белок Функция U5-200 кДа Расплетает дуплекс U4/U6; при этом U4 мяРНП (p200) высвобождается. U5-100 кДа Способствует связи между U6 мяРНК и 5 -сайтом (p100) сплайсинга, вытесняя U1 мяРНП. U5-116 кДа (p116) U5-220 кДа (p220) Регулирует АТФазную 200 кДа и U5-100 кДа. активность белков U5- Связывает U5 мяРНК одновременно с 5 - и с 3 сайтами сплайсинга. В результате сложных конформационных преобразований сплайсосомы в ходе формирования комплекса B2 новый дуплекс U2/U6 мяРНК связывает точку ветвления и донорный (5 -) сайт сплайсинга. U5 мяРНК дополнительно фиксирует 5 -сайт сплайсинга так, что становится возможна первая реакция трансэтерификации — нуклеофильная атака 2 –OH-группы аденозина точки ветвления на фосфодиэфирную связь между каноническими нуклеотидами GU*AG (где «*» — граница между 3 - концом экзона и 5 -концом интрона). Первая реакция сплайсинга происходит при переходе от комплекса B2 к комплексу C, который обеспечивает вторую 119 реакцию сплайсинга. Суть преобразований сплайсосомы в этот период состоит в необходимости проведения контроля правильности осуществления первой реакции трансэтерификации с последующей подстановкой акцепторного (3 -) сайта сплайсинга в каталитический центр сплайсосомы. Этот каталитический центр, сформированный при переходе от комплекса B1 к комплексу B2, состоит из U2/U6 мяРНП и U5специфического белка U5-220 кДа. Белок U5-220 кДа непосредственно отвечает за выбор 3 -сайта сплайсинга, а в процессе подстановки акцепторного сайта сплайсинга в каталитический центр сплайсосомы принимает участие еще множество других белков. Теперь возможно осуществление второй реакции сплайсинга — нуклеофильной атаки 3 -гидроксила первого экзона на межнуклеотидную фосфодиэфирную связь между интроном и его 3 концевым экзоном. В результате экзоны оказываются соединенными новой фосфодиэфирной связью, а интрон вырезанным в виде лассо. По завершении обеих реакций сплайсинга происходит разборка сплайсосом, высвобождение продуктов реакции сплайсинга, а мяРНП подвергаются переработке (recycling) для последующих циклов катализа. Высвобождение из сплайсосомы сплайсированной мРНК и интрона, который подвергается дальнейшему расщеплению и деградации, требует АТФазной активности определенных белков. Рециклирование мяРНП включает повторную ассоциацию U4 и U6 мяРНП с последующим присоединением U5 мяРНП с образованием частицы [U4/U6•U5] мяРНП. Эти процессы осуществляются в тельцах Кахала, как и в случае новообразованных мяРНП. Свободные интроны в форме лассо, образовавшиеся в ходе сплайсинга пре-мРНК, довольно быстро деградируют. Первоначально интрон линеаризуется в результате действия особого расщепляющего фермента (debranching enzyme, от англ. ―debranching‖ — расщепление какой-либо разветвлѐнной структуры), после чего окончательно расщепляется экзонуклеазами с обоих 120 концов. Если интрон не содержит кодирующей информации (напомним, что некоторые интроны кодируют некоторые мяшРНК и мткРНК), то он сразу же полностью деградирует. В противном случае его фрагмент, содержащий информацию о таких РНК, защищается от экзонуклеазного расщепления набором определенных белков. После разборки сплайсосомы не все белки покидают мРНК. Некоторые сплайсосомные белки остаются связанными с мРНК в составе мРНП. Часть этих белков играет роль факторов экспорта мРНК. Некоторые белки в составе мРНП сопровождают мРНК в цитоплазму и после экспорта, где участвуют в различных цитоплазматических процессах. Таким образом, подобные белковые комплексы играют роль регуляторов дальнейшего метаболизма мРНК, претерпевшей процессинг. Одним из ключевых белковых комплексов, который связывается со сплайсированной мРНК после удаления интрона и остается с ней в течение длительного времени в стабильной ассоциации, является так называемый комплекс связи экзонов (exon junction complex, EJC). Этот комплекс белков загружается на мРНК в определенной точке выше границы лигируемых экзонов (upstream) на расстоянии примерно 20 нуклеотидов и остается в составе мРНП во время ядерного экспорта и в цитоплазме до начала трансляции. Комплекс EJC предоставляет архитектурную информацию о положении удаленного интрона молекулярному «оборудованию» цитоплазмы, обеспечивающему, например, контроль качества РНК (nonsense-mediated decay, NMD). В ходе этого процесса распознаются неправильно процессированные мРНК, содержащие стоп-кодон в ненадлежащем положении, что препятствует синтезу аберрантных и потенциально опасных для клетки белков. В клетках млекопитающих стоп-кодон считается в неправильном положении, если хотя бы один EJC присутствует ниже (downstream) этого стоп-кодона. Комплекс EJC важен для осуществления экспорта мРНК и увеличивает эффективность трансляции. 121 Со структурной точки зрения EJC состоит из трех групп белков. Четыре белка являются сплайсосомными белками, которые составляют сердцевину (core) EJC. Они остаются связанными с мРНК как в ядре, так и в цитоплазме и формируют платформу связывания для других белков. На периферии сердцевины (shell) расположены белки, являющиеся посредниками между сплайсингом и экспортом мРНК. Они привлекают белки, временно ассоциирующие с EJC, в том числе ведущие факторы экспорта мРНК (например, белки семейства NXF — nuclear export factors). Таким образом, в каскаде реакций экспрессии генов комплекс EJC создает молекулярную связь, отвечающую за стимулирующее влияние сплайсинга на эффективность трансляции. Молекулярные события сборки минорных, или U12-зависимых, сплайсосом практически не отличаются от вышеописанных процессов по отношению к U2-зависимым сплайсосомам. Имеется лишь одно существенное различие. Как отмечалось, минорные U11, U12 и U4atac/U6atac мяРНП являются функциональными аналогами, соответственно, U1, U2 и U4/U6 мажорных мяРНП. Однако перед своей ассоциацией с пре-мРНК U11 и U12 мяРНП образуют стабильный комплекс (U11/U12 di-snRNP), который кооперативно связывается c 5 -сайтом сплайсинга и точкой ветвления во время первого этапа сборки U12-зависимых сплайсосом. Таким образом, в противоположность U2-зависимым сплайсосомам, начальный этап сборки U12-зависимых сплайсосом сразу приводит к формированию комплекса A. Дальнейшие этапы являются отражением событий сборки U2зависимых сплайсосом. Первоначально происходит связывание с премРНК частицы [U4atac/U6atac•U5] мяРНП с формированием комплекса B. Затем происходит высвобождение U11 и U4atac мяРНП, которые напрямую не вовлечены в катализ. Первая реакция сплайсинга происходит при формировании C-комплекса. После 122 завершения второй реакции сплайсинга сплайсосомы диссоциируют. 3.1.5.4. Альтернативный сплайсинг и его регуляция При реализации проектов последнего времени, связанных с расшифровкой геномных последовательностей у различных организмов, неожиданно было обнаружено, что количество генов, кодирующих белки, не связано с эволюционным положением того или иного организма и его общей сложностью. Например, геном плодовой мушки Drosophila melanogaster содержит всего 14000 структурных генов, что даже меньше, чем их содержится в геноме нематоды (круглого червя) Caenorhabditis elegans, у которой их 19000. Для сравнения, геном человека содержит около 35000 структурных генов, т. е. вполне соизмеримое количество, учитывая эволюционное расстояние между червем и человеком и различия между этими организмами в их биологической сложности. Количество структурных генов в геноме различных видов млекопитающих оказалось примерно таким же, как в геноме растения Arabidopsis thaliana (20000–25000), что всего в четыре раза больше, чем в геноме дрожжей (6000). Одним из широко распространенных феноменов, позволяющих организму существенно расширить информационную емкость генома, является альтернативный сплайсинг. Он представляет собой один из наиболее распространенных механизмов регуляции экспрессии генов и дает возможность образования нескольких разных мРНК в результате изменения хода сплайсинга одного и того же первичного транскрипта. Это один из основных механизмов установления высокой макромолекулярной и клеточной сложности высших эукариотических организмов. Альтернативные пути сплайсинга основаны на возможности использования разных экзонов одного и того же гена при образовании зрелых мРНК (рис. 3.20). Таким образом, зрелые молекулы мРНК, образующиеся при транскрипции одного гена, который включает несколько экзонов, будут различаться набором их копий, 123 кодирующих различные участки молекулы белка. Иначе говоря, разные способы экспрессии одного гена могут приводить к образованию множества полипептидов — изотипов, или изоформ, с различными структурными и функциональными свойствами. По современным данным, у человека количество генов, продукты которых способны подвергаться альтернативному сплайсингу, может достигать более 80 %. Различают конститутивные и альтернативные экзоны. Первые входят в состав всех мРНК — продуктов данного гена, а вторые включаются в состав только некоторых мРНК. В простейших случаях существует возможность двоякого выбора. Во-первых, между двумя конститутивными экзонами (т. е. такими экзонами, копии, которых присутствуют во всех мРНК, кодируемых данным геном) может присутствовать добавочный экзон, копия которого может либо включаться в мРНК, либо вырезаться как часть единого длинного интрона (рис. 3.20, а). Во-вторых, между конститутивными экзонами могут располагаться взаимно исключающие экзоны; в этом случае оборудование сплайсинга будет выбирать лишь один такой экзон (рис. 3.20, б). В-третьих, в составе экзонов могут существовать конкурирующие между собой 5 - или 3 -сайты сплайсинга (рис. 3.20, в, г). Эти четыре варианта альтернативного сплайсинга наиболее распространены в природе. Однако существует еще по крайней мере три варианта альтернативного сплайсинга. В некоторых случаях участок экзона может распознаваться и вырезаться как интрон (рис. 3.20, д). Кроме того, альтернативный сплайсинг может сочетаться с использованием альтернативных промоторов (рис. 3.20, е) или альтернативных участков процессинга 3 -конца пре-мРНК (рис. 3.20, ж). Подобно другим формам контроля экспрессии генов, для осуществления регуляции альтернативного сплайсинга требуется одновременное присутствие как цис-, так и транс-компонентов. Первые представляют собой определенные последовательности 124 в самой пре-мРНК, а вторые — различные клеточные факторы (РНК и белки). Во многих случаях невозможно провести четкую границу между элементами и факторами «конститутивного» и Рис. 3.20. Варианты альтернативного сплайсинга «альтернативного» сплайсинга. Четко определяемые по присутствию «канонических» нуклеотидов 5 - и 3 -сайты сплайсинга, безусловно, влияют на выбор соответствующего участка гена в качестве экзона. Однако наличие таких последовательностей еще не достаточно для однозначного выбора. Например, существуют «псевдоэкзоны», обрамленные последовательностями канонических нуклеотидов, которые не сплайсируются. Для определения конститутивных и альтернативных сайтов сплайсинга необходимо присутствие в молекуле пре-мРНК так называемых вспомогательных элементов. Нуклеотидные последовательности таких цис-элементов могут значительно варьировать, но они крайне важны для регуляции альтернативного сплайсинга. При этом регуляторные последовательности могут 125 присутствовать в составе как экзонов, так и интронов. Регуляция сплайсинга может быть позитивной, способствующей сплайсингу, и негативной, когда сплайсинг подавляется. Соответственно, в экзонах и интронах различают энхансеры (enhancers, или усилители, от англ. to enhance — усиливать) и сайленсеры (silencers, или глушители, от англ. silence — тишина, молчание). Среди энхансеров имеются экзонные (exonic splicing enhancers, ESE) и интронные (intronic splicing enhancers, ISE) энхансеры. С ними связываются комплексы, которые обычно содержат различные SR-белки (см. разд. 3.1.5.2). За счет формирования таких комплексов обеспечивается эффективное использование слабо выраженных или регулируемых сайтов сплайсинга. Ключевую роль в регуляции такого типа играет, в частности, SR-белок SF2/ASF. Среди сайленсеров также имеются экзонные (exonic splicing silencers, ESS) и интронные (intronic splicing silencers, ISS) сайленсеры. На этих последовательностях формируются белковые комплексы, которые часто содержат белки гяРНП (см. разд. 3.1.4), однако в этом случае формирование таких комплексов приводит к подавлению использования соответствующего сайта сплайсинга. Наиболее хорошо известны в качестве репрессоров сплайсинга белки гяРНП A1 и гяРНП I (в названии последнего белка «I» — не римская цифра, а прописная буква латиницы). Белок гяРНП A1 является антагонистом ряда SR-белков, в том числе одного из ведущих факторов сплайсинга SF2/ASF. На регуляцию событий альтернативного сплайсинга белок гяРНП A1 оказывает влияние независимо от нуклеотидных последовательностей РНК. Регуляторная функция белка гяРНП I, наоборот, проявляется в связывании с конкретной нуклеотидной последовательностью, а именно с полипиримидиновым трактом интрона, препятствуя ассоциации с ним фактора U2AF65. Как видно из приведенных примеров, репрессоры и активаторы 126 сплайсинга обычно влияют на формирование комплексов E и A, т. е. преимущественно влияют на ранние этапы сборки сплайсосомы (см. разд. 3.1.5.3.). Кроме энхансеров и сайленсеров сплайсинга другим регулирующим цис-элементом может служит сама вторичная структура пре-мРНК. В результате ее формирования определенные нуклеотидные последовательности в ее составе могут пространственно разделяться или, наоборот, тесно сближаться между собой. Например, тесное сближение сайтов сплайсинга может усиливать сплайсинг экзонов при типе альтернативного сплайсинга, показанном на рис. 3.20, б. 3.1.5.5. Транс-сплайсинг В предыдущих разделах были рассмотрены примеры и механизмы превращения одной и той же молекулы пре-мРНК в сплайсированную молекулу мРНК (цис-сплайсинг). Однако известно явление, когда происходит сплайсирование фрагментов РНК, синтезированных на разных генах, которые могут быть расположены даже на разных хромосомах. Это явление получило название транссплайсинг. Классическим примером транс-сплайсинга является сплайсинг мРНК трипаносом — паразитических простейших. К настоящему времени установлено, что у этих организмов транс-сплайсинг является необходимым этапом созревания всех ядерных пре-мРНК. Для справки, трипаносомы — род простейших класса жгутиковых. Паразиты крови и тканей человека и позвоночных животных. Вызывают трипаносомозы — опасные, во многих случаях летальные заболевания, в том числе сонную болезнь. Переносчиками являются кровососущие насекомые (муха цеце, слепни и др.). Открытие транс-сплайсинга было сделано на Trypanosoma brucei, которая до сих пор служит одним из модельных биологических объектов. При транс-сплайсинге мРНК трипаносом происходит слияние 127 своеобразных «мини-экзонов» со значительно более длинным экзоном, составляющим основную часть молекулы мРНК. Эти «миниэкзоны» представляют собой особые малые РНК — SL-РНК (spliced leader RNAs). При этом гены, кодирующие SL-РНК и мРНК (основной экзон), в геноме трипаносом могут располагаться на разных хромосомах. В ходе транс-сплайсинга SL-РНК, которая кодирует короткую лидерную последовательность мРНК, сливается с 5 -концом каждой мРНК. По своей структуре SL-РНК (рис. 3.21) сходны у различных организмов. На своем 5 -конце они кэпированы и несут 7метилгуанозин (m7G), а первые четыре (а не один–два) нуклеотида метилированы. Это представляет собой характерную особенность кэпа SL-РНК. На расстоянии 39–41 нуклеотидных пар от 5 -конца находится 5 -сайт сплайсинга, за которым следует интрон, длина которого вариабельна. Интрон SL-РНК может быть свернут в две «шпильки» (stem-loop), между которыми располагается одноцепочечный участок. Этот участок аналогичен Sm-связывающему сайту мяРНК Рис. 3.21. Строение SL-РНК (разд. 3.1.5.1). Роль интрона SL-РНК в транс-сплайсинге до конца не выяснена. В геноме трипаносом кодирующие гены располагаются 128 тандемно, в виде больших полигенных кластеров, которые транскрибируются полицистронным способом. Транс-сплайсинг и полиаденилирование приводят к расщеплению предшественника в точках выше и ниже кодирующего участка (up- and downstream). Поскольку все мРНК трипаносом образуются за счет транссплайсинга, их гены в типичном случае не содержат интроны. Исключение составляют всего два гена T. brucei (один из них кодирует поли(A)-полимеразу), которые содержат по одному интрону, а их продукты подвергаются обычному цис-сплайсингу. Возможность осуществления транс-сплайсинга достигается за счет присутствия двух канонических обрамляющих нуклеотидов GU в транскриптах SL-РНК и AG в транскрипте основного экзона (рис. 3.22). Процесс транс-сплайсинга также существенно облегчается за счет установления временных комплементарных взаимодействий между разными сплайсируемыми молекулами РНК. Как и обычный цис-сплайсинг, процесс транс-сплайсинга с биохимической точки зрения представляет собой две последовательные реакции трансэтерификации, которые катализируются транс-сплайсосомами, которые, однако, имеют ряд особенностей по своему молекулярному составу. При формировании транс-сплайсосом существенное значение имеют комплементарные взаимодействия между SL-РНК и мяРНК. Важную роль играют и белки, специфические для SL-РНК, ряд которых аналогичен специфическим белкам мяРНП. Существенной особенностью транссплайсинга является формирование после первой реакции трансэтерификации не «лассо» в точке ветвления, а своеобразной Yподобной структуры (рис. 3.22). Оказалось, что SL-РНК-зависимый транс-сплайсинг — распространенное в природе явление. В настоящее время он обнаружен у многих паразитических организмов, включая круглых и плоских червей и даже некоторых низших хордовых. Однако он не описан в клетках организмов-хозяев (например, у членистоногих и 129 позвоночных) и, по-видимому, представляет собой специфический для паразитического образа жизни. процесс, Рис. 3.22. SL-РНК-зависимый транс-сплайсинг. 5 SS, 3 SS — соответственно, 5 - и 3 -сайты сплайсинга; BP — точка ветвления (branch point); Py — полипиримидиновый тракт Вместе с тем, проводимый в настоящее время широкомасштабный анализ «транскриптомов» — всех транскриптов клеточных РНК в определенный момент времени — выявил, что некоторые транскрипты клеток млекопитающих, включая человека, могут быть составлены из сегментов, которые кодируются участками, расположенными в геноме далеко друг от друга, в том числе на разных хромосомах. Установлено, что некоторые из таких «химерных» транскриптов формируются за счет генетических 130 перестроек, однако некоторые возникают в результате посттрансрипционных модификаций пре-мРНК. Если процесс транссплайсинга у низших эукариот изучен уже весьма хорошо, то его события у высших организмов остаются практически неизученными. По-видимому, эти процессы являются SL-РНК-независимыми. 3.1.6. Автокаталитический сплайсинг До сих пор, говоря о сплайсинге, речь шла о процессе, катализируемом РНП-частицами — сплайсосомами. Однако в молекулах различных пре-РНК существуют интроны, сплайсинг которых обеспечивается самой РНК. Этот процесс получил название автокаталитического сплайсинга, или самосплайсинга (selfsplicing), а РНК, обладающие каталитической активностью — рибозимами (от ribonucleic enzymes). Обнаружение самосплайсинга и рибозимов, сделанное в 1982 г. Томасом Чеком (T.R. Cech), было довольно сенсационным открытием, поскольку оказалось, что не только белки, но и некоторые РНК обладают способностью к биокатализу. За открытие каталитических свойств РНК Т. Чек в 1989 г. был удостоен Нобелевской премии по химии. В настоящее время известно уже много природных и искусственных рибозимов с различной ферментативной активностью. В одних случаях ферментативная активность РНК направлена на ту же молекулу РНК. В других случаях рибозимы могут катализировать реакции по отношению к другим молекулам РНК и вести себя как истинные ферменты. Большинству рибозимов для успешной работы требуются определенные белки, однако их роль сводится в основном к стабилизации вторичной и третичной структуры РНК, а сам каталитический центр образуется только за счет рибозима (молекулы самой РНК). Самосплайсирующиеся интроны имеются у многих организмов, включая бактерии и низшие эукариоты — водоросли, лишайники, грибы, простейшие. В меньшей степени они характеризуют клетки 131 эукариот. При этом самосплайсингу подвергаются далеко не только пре-мРНК, но и множество других РНК. Все интроны, подвергающиеся самосплайсингу, условно подразделяют на 2 (иногда выделяют 3) группы. Интроны группы I относятся к рибозимам, осуществляющим самовырез из молекул ядерных пре-мРНК, пре-тРНК и пре-рРНК различных организмов. Это самая распространенная группа самосплайсирующихся интронов. Классический пример самосплайсирующегося интрона I группы — 400-нуклеотидный интрон пре-рибосомной (пре-рРНК) макронуклеуса инфузории-тетрахимены. Для справки, инфузории — это простейшие, у которых в каждой клетке присутствует два ядра: микронуклеус, участвующий в половом размножении, и макронуклеус, управляющий обменом веществ и ростом клетки. Интроны (рибозимы) группы II осуществляют самосплайсинг различных РНК клеточных органелл (например, митохондрий) грибов, растений и простейших. Следует подчеркнуть, что в основе самосплайсинга, как и в случае классического сплайсинга, лежат реакции трансэтерификации. Однако рибозимы I и II групп различаются по механизму своего действия. 3.1.6.1. Автокаталитический сплайсинг интронов группы I В интронах рибозимов группы I 5 -сайт сплайсинга определяет консервативная пара GU в области контакта первого экзона и интрона. На 3 -конце интрона также присутствует консервативный гуанозин, который называют концевым гуанозином и обозначают G (рис. 3.23). Этот гуанозин определяет 3 -сайт сплайсинга. Существенной особенностью рибозимов I группы является то, что они могут связывать в качестве кофактора гуанозин или его 5 фосфаты (ГМФ, ГТФ). Перед осуществлением последовательных реакций трансэтерификации свободный кофактор (гуанозин) связывается с интроном в так называемом G-связывающем сайте (G132 Рис. 3.23. Самос плайс инг интро нов групп ы I. По Vicens , Cech, 2006. Trends Bioche m. Sci. 31: 41–51 binding site). 133 На рис. 3.23 экзоны показаны серым цветом, а интрон — черным. Обратите внимание на сложность внутренней организации интрона, в частности, на наличие участков комплементарного спаривания оснований. Серым прямоугольником выделен каталитический центр. В ходе первой реакции самосплайсинга (рис. 3.23) 3 -гидроксил гуанозина атакует 5 -сайт сплайсинга. При этом на конце экзона освобождается 3 –OH-группа, а гуанозин присоединяется к интрону, образуя ковалентную связь с его 5 -концом. После первой реакции происходят важные конформационные изменения структуры интрона, которые приводят к замещению гуанозина в G-связывающем сайте 3 -концевым гуанозином G. В ходе второй стадии сплайсинга интрон катализирует реакцию трансэтерификации, обратную первой: свободный 3 -гидроксил 5 конца экзона атакует 3 -сайт сплайсинга. При этом экзоны оказываются сплайсированными, а интрон удаляется вместе с добавочным гуанозином (рис. 3.23). Как мы видим, на данном этапе основная «цель» сплайсинга — вырезание интрона и сшивание экзонов уже достигнута. Однако у тетрахимен высвободившийся из пре-рРНК интрон в дальнейшем претерпевает ряд дополнительных превращений, сопровождающихся его циклизацией, а затем линеаризацией, что сопровождается отщеплением дополнительных нуклеотидов. В основе этих реакций также лежат реакции трансэтерификации, в которых РНК (интрон) выступает в качестве катализатора — рибозима. Для осуществления самосплайсинга интронами группы I принципиально важна их особая, очень сложная структурная организация. При этом информация, необходимая для самосплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних участков, которые обеспечивают укладку молекулы с образованием характерной пространственной структуры. 134 Каждый интрон группы I имеет около 10 комплементарно спаренных между собой участков (парных элементов). Один из таких парных элементов на своем конце содержит пару канонических нуклеотидов GU, которые определяют 5 -сайт сплайсинга, и служит для пространственного сближения 5 - и 3 -сайтов сплайсинга. Другой парный элемент формируется в результате конформационных изменений интрона после первой реакции трансэтерификации и обеспечивает распознавание 3 -сайта сплайсинга, который, как отмечалось, определяется консервативным концевым гуанозином на 3 -конце интрона — G. 3.1.6.2. Автокаталитический сплайсинг интронов группы II Интроны группы II имеют иную организацию, однако и в этом случае их сложная вторичная и третичная структура имеет решающее значение для осуществления реакций самосплайсинга. Структурный анализ показал, что интроны группы II имеют шесть структурных доменов. Один из этих доменов очень консервативен (его обозначают «домен V», или DV). Его вторичная структура удивительно напоминает таковую U6 мяРНК сплайсосом. Предполагают, что именно этот домен играет ведущую роль в биокатализе самосплайсинга интронов группы II. Внутри интронов группы II имеется две нуклеотидные последовательности, комплементарные определенным последовательностям 5 -экзона. Это позволяет сформировать третичную структуру, в которой фиксируются 3 -экзон и 3 -конец интрона. Кроме того, одна из спиралей рибозима группы II содержит аденозин, который по своим свойствам напоминает аденозин в точке ветвления интронов пре-мРНК, подвергающихся классическому сплайсингу. Именно 2 –OH-группа этого аденозина действует как 135 нуклеофил на первой стадии самосплайсинга интронов группы II. Механизм самосплайсинга интронов II группы похож на механизм сплайсинга классических интронов. В отличие от интронов группы I, самосплайсинг интронов группы II не требует гуанозина или его фосфатов (рис. 3.24). Вместо них на первой стадии атакующей группой служит 2 –OH одного из аденозинов самого интрона. В результате реакции 5 -конец интрона присоединяется не к его 3 -концу (в этом случае сформировалась бы кольцевидная структура), а на некотором расстоянии от него, так что образуется разветвление с петлей — лассо. Разветвление, получается, из-за возникновения новой 2 -дифосфодиэфирной связи, в результате чего один из адениловых нуклеотидов образует не две, как обычно, а три связи с соседними нуклеотидами (рис. 3.24, в рамке). В ходе второй реакции трансэтерификации, в ходе которой нуклеофильную атаку совершает 3 -гидроксил 5 -концевого экзона, происходит лигирование экзонов и вырезается лассообразная структура (рис. 3.24). Таким образом, можно видеть, что в структуре рибозимов группы II, в осуществлении реакций и продуктах их самосплайсинга прослеживается ряд черт, характерных для сплайсосом и классического сплайсинга. Предполагают, что в эволюции сплайсинг классических интронов возник именно из самосплайсинга интронов группы II. Более того, открытие ферментативных свойств РНК легло в основу ряда эволюционных теорий, допускающих в качестве первичной формы живой материи самовоспроизводящуюся молекулу РНК. Однако есть и существенные отличия. Так, кроме домена DV интронов группы II, соответствующего U6 мяРНК, прообразы других мяРНК в структуре рибозимов группы II выявить не удается. 136 Рис. 3.24. Самосплайсинг интронов группы II. Справа в рамке — строение «лассо» 3.1.7. Процессинг транспортных РНК Почти все некодирующие РНК синтезируются в виде предшественников — более длинных молекул. Их процессинг состоит в разрезании молекулы в определенных участках и в модификации определенных нуклеотидов. Не составляют исключение и предшественники транспортных РНК (пре-тРНК). Они подвергаются процессингу как по обоим концам, так и в срединной части молекулы. 137 Гены, кодирующие тРНК, транскрибируются РНК-полимеразой III. Первичный транскрипт тРНК (пре-тРНК) в среднем содержит около 100 нуклеотидов, а после процессинга — 70–90 нуклеотидньгх остатков. На 5 -конце пре-тРНК содержат дополнительный фрагмент, который отрезается РНКазой P — рибонуклеопротеином, основную каталитическую роль в котором играет РНК. РНК-компонент РНКазы P — рибозим, а белки в РНКазе P, как и в случае других рибозимов, играют лишь структурную роль, однако оказывают при этом существенное влияние на его ферментативную активность. Это влияние особенно высоко у эукариот. Как и в случае других рибозимов (разд. 3.1.6), РНК-компонент РНКазы P имеет сложную вторичную структуру, правильное формирование которой зависит от ионов Mg2+ или других бивалентных ионов. Важной посттранскрипционной модификацией 3 -конца претРНК является добавление тринуклеотида ССА, что необходимо для функционирования тРНК в качестве акцептора аминокислот. Только у некоторых эубактерий тринуклеотид ССА кодируется генами тРНК; в этом случае процессинг 3 -конца пре-тРНК осуществляет РНКаза, представляющая собой 3 -экзонуклеазу, которая в ходе процессинга отщепляет от 3 -конца по одному нуклеотиду до тех пор, пока не достигнет последовательности CCA, одинаковой у всех тРНК. У остальных организмов, включая эукариот, тринуклеотид ССА добавляется посттранскрипционно, с помощью белков — CCAдобавляющих ферментов (CCA-adding enzymes), относящихся к группе нуклеотидилтрансфераз (CCA:tRNA nucleotidyl transferases, CCAtrs). В данном разделе мы более подробно рассмотрим процессинг срединной части молекулы — сплайсинг пре-тРНК. Гены, кодирующие тРНК, содержат интроны. Однако механизм сплайсинга пре-тРНК существенно отличается от такового при 138 сплайсинге пре-мРНК, а также он различается у представителей различных эволюционных ветвей — бактерий, архей и эукариот. Однако у бактерий интроны пре-тРНК самосплайсируются, а у архей и эукариот сплайсинг пре-тРНК катализируется ферментами-белками. Вспомогательные РНК типа мяРНК не являются участниками этого процесса. Впервые наличие интронов в генах, кодирующих тРНК (и, соответственно, сплайсинг пре-тРНК), было обнаружено у низших эукариот — дрожжей. Геном дрожжей содержит 272 гена тРНК, из которых 59 генов, кодирующих 10 различных тРНК, содержат интроны. В отличие от интронов пре-мРНК, они не ограничены какими-либо консервативными последовательностями нуклеотидов, но встроены в строго определенный участок пре-тРНК — антикодоновую петлю. У дрожжей сплайсинг пре-тРНК (рис. 3.25– 3.29) осуществляется в три шага, каждый из которых катализируется определенным ферментом. Первый шаг состоит в расщеплении молекулы-предшественника в двух точках сплайсинга с помощью фермента тРНК-эндонуклеазы. Этот фермент распознает характерную петлю, которая всегда имеется во вторичной структуре молекулы пре-тРНК в районе 3 -сайте сплайсинга (рис. 3.25). Продуктами данной эндонуклеазной реакции являются две половины молекулы тРНК и интрон в линейной форме. Этот первый шаг реакции сплайсинга не требует энергии АТФ. На концах двух половин молекулы тРНК оказывается 2 ,3 -циклофосфат и 5 –ОН-группа. Две половины молекул пре-тРНК остаются связанными друг с другом водородными связями. Второй шаг сплайсинга — лигазная реакция, в свою очередь, протекает в три этапа (рис. 3.26–3.28). На первом этапе циклофосфат раскрывается, образуя 2 -фосфат и 3 –OH-группу (рис. 3.26). Этот процесс катализируется циклической фосфодиэстеразой (CPDase). На втором этапе 5 –OH-группа 3 - 139 экзона, созданная эндонуклеазой, фосфорилируется с помощью специфической киназы (этот процесс требует энергии АТФ) (рис. 3.27). На третьем этапе происходит лигирование двух половин молекул пре-тРНК (рис. 3.28). Перед этим они складываются в тРНКподобные структуры. Фермент аденилатсинтетаза (ASTase) аденилирует 3 -половины молекул пре-тРНК и активирует лигазу, используя энергию АТФ. тРНК-лигаза аденилируется по остатку лизина в активном сайте. Затем АМФ переносится на 5 -концевой фосфат. Происходит формирование 5 —3 фосфодиэфирной связи в точке сплайсинга, и АМФ высвобождается. В итоге образуется непрерывная, сплайсированная молекула тРНК, которая, однако, имеет добавочную 2 -фосфатную группу. Для завершения сплайсинга этот добавочный фосфат должен быть удален, что осуществляется с помощью специального фермента — фосфотрансферазы (рис. 3.29). Эта фосфотрансфераза (2 -Ptase) является NAD-зависимой. К сведению, NAD (никотинамидадениндинуклеотид) — кофермент, присутствующий во всех живых клетках. Он входит в состав ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, а также выполняет функцию переносчика электронов и водорода, которые принимает от окисляемых веществ. Его восстановленная форма (NADH) способна переносить их на другие вещества. Итак, фосфотрансфераза (2 -Ptase) удаляет 2 -фосфат и переносит его на NAD. Как продукты этой реакции образуются зрелая тРНК со стандартной 3 —5 связью в точке сплайсинга и АДФ-рибоза-1 -2 -циклофосфат в качестве продукта переноса фосфата на NAD (рис. 3.29). При образовании последнего продукта никотинамид замещается, что предоставляет энергию для его 140 циклизации. 141 Рис. 3.25. Сплайсинг тРНК. 1-й шаг — удаление интрона Рис. 3.26. Сплайсинг тРНК. Этап 2.1.— перенос фосфата в положение 2 142 Рис. 3.27. Сплайсинг тРНК. Этап 2.2.— фосфорилирование 5 -гидроксильной группы Рис. 3.28. Сплайсинг тРНК. Этап 2.3. — лигирование Рис. 3.29. Сплайсинг тРНК. 3-й шаг — удаление добавочного 2 фосфата 143 Необходимо отметить, что вышеприведенный способ лигирования половин молекул пре-тРНК с участием лигазы и фосфотрансферазы, первоначально открытый у дрожжей, является наиболее универсальным. Однако у позвоночных также существует вторая, совершенно иная лигаза, которая напрямую связывает два конца половин молекул пре-тРНК (соответственно, содержащие 5 – OH-группу и 2 -3 -циклофосфат, см. рис. 3.26) с образованием нормальной 3 —5 фосфодиэфирной связи в точке сплайсинга без всякого добавочного 2 -фосфата. 3.1.8. Редактирование мРНК Одним из удивительных открытий конца XX в. было обнаружение того факта, что в генетическую информацию мРНК, записанную в последовательности ДНК, перед трансляцией могут вноситься изменения, причем такая корректировка является не случайной, а генетически обусловленной. Это явление получило название «редактирование РНК» (RNA editing). Впервые редактирование было обнаружено в мРНК митохондрий трипаносом (паразитических простейших). Позднее оказалось, что редактированию могут подвергаться и другие РНК — транспортные, рибосомные, а также транскрипты некодирующих областей генома. К настоящему времени редактирование РНК обнаружено у многих организмов, находящихся на разных ступенях эволюционной лестницы, — от простейших до высших растений и млекопитающих. Редактирование РНК распространено преимущественно во внеядерных генетических системах — хлоропластах и митохондриях, и только несколько случаев описано для ядра. Обнаружено, что при редактировании происходят практически все типы изменений нуклеотидной последовательности РНК: делеции (удаления нуклеотида), инсерции (вставки нуклеотида) и конверсии (замены одного нуклеотида на другой). 144 Например, во многих участках митохондриальных мРНК трипаносом происходит добавление остатков урацила, а в некоторых случаях — наоборот, их удаление. Эти изменения обеспечиваются большим количеством малых РНК. Однако такая форма редактирования РНК неизвестна у высших эукариот. В клетках высших эукариот, включая человека, редактирование РНК состоит в ковалентной модификации нуклеотидов, которая известна в двух вариантах: замена цитидина на уридин (C U) и аденозина на инозин (A I) (рис. 3.30). Рис. 3.30. Химические реакции, лежащие в основе редактирования мРНК по типу C U (а) и A I (б) В случае редактирования по типу C U аминогруппа в позиции 4 цитозина замещается карбонильной группой, что приводит к превращению цитозина в урацил (рис. 3.30, а). Во всех известных случаях такая замена приводит к образованию стоп-кодона, в результате чего будет транслироваться укороченная форма белка. 145 Наиболее хорошо известным примером редактирования по типу C U является редактирование мРНК, кодирующей белок аполипопротеин B (рис. 3.31). К сведению, аполипопротеины — это белковые составляющие липопротеинов, которые специфически связываются с соответствующими липидами при формировании липопротеиновой частицы. Аполипопротеин B (апо-B) — основной белок всех липопротеинов низкой плотности. Наиболее распространенная форма аполипопротеина с молекулярной массой 100 кДа (апо-B-100) выявляется в липопротеинах, синтезирующихся в печени. Его функция состоит в транспорте холестерина в кровь. Форма апо-B-48 (48 кДа) синтезируется в кишечнике и выполняет совсем другую функцию, а именно функцию абсорбции липидов из кишки. Рис. 3.31. Значение редактирования мРНК на примере экспрессии гена аполипопротеина Обе формы белка кодируются одним геном (рис. 3.31), длина которого составляет 4564 кодона (триплета нуклеотидов). 146 Транскрипция этого гена приводит к синтезу мРНК, которая в печени не подвергается редактированию, и в результате с нее транслируется белок полной длины (апо-B-100). Однако в клетках кишки такая мРНК подвергается редактированию по типу C U, в ходе которого кодон CAA (№ 2153) становится стоп-кодоном UAA. В результате трансляция прерывается на этом кодоне и образуется укороченная форма белка (апо-B-48). Дезаминирование цитозина при редактировании мРНК по типу C U осуществляется с помощью специального молекулярного комплекса, который иногда называют эдитосомой (editosome, от англ. edit — редактировать и греч. ζώμα [«сома»] — тело). Центральное место в составе эдитосомы занимает дезаминаза Apobec-1 (apolipoprotein B [apo-B]-editing catalytic subunit 1). В процессе редактирования мРНК по типу A I (рис. 3.30, б) центральное место в качестве катализатора занимает дезаминаза аденозина ADAR (adenosine deaminase acting on RNA). Этот фермент замещает аминогруппу аденозина в положении 2 в двухцепочечных РНК, что приводит к формированию производного аденозина — инозина. Во время трансляции инозин интерпретируется уже не как аденозин, а как гуанозин. Впервые активность фермента ADAR была обнаружена в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus, однако она, по-видимому, существует во всех тканях многоклеточных животных, включая человека. Известно, что большинство транскриптов, которые редактируются с помощью фермента ADAR по типу A I, кодируют рецепторы центральной нервной системы и этот процесс необходим для создания полного набора рецепторов. Аминокислотные замены могут существенным образом изменять свойства ионных каналов, а неправильное редактирование приводит к серьезным заболеваниям — от эпилепсии до опухолей головного мозга. 147 4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА И ПРОЦЕССИНГ РНК В предыдущей главе вы познакомились с некоторыми молекулярно-биологическими аспектами процессинга РНК как важного этапа экспрессии генов. Если с точки зрения физикохимической биологии об этих процессах известно уже довольно много, то вопрос о том, как работает геном эукариотической клетки в контексте трехмерной архитектоники клеточного ядра, остается «Святым Граалем» современной биологии клетки. Поиск ответа на него, очевидно, является одной из наиболее сложных на сегодняшний день проблем естествознания и следующим логическим шагом после завершения проекта по секвенированию генома. Ядро эукариотической клетки — сложное, динамичное и в высокой степени структурированное образование, в котором кроме хромосомных территорий с транскрипционными доменами и ядрышка как части хромосомно-ядрышкового аппарата присутствуют различные экстрахромосомные компартменты, или домены. Слово «домен» в данном контексте происходит от фр. domaine — область — и подразумевает участки, отличающиеся какими-либо физикохимическими свойствами от окружающей среды, либо упорядоченностью в расположении или ориентации частиц. В отличие от многих цитоплазматических компартментов, ядерные домены не ограничены мембранами и по существу не являются «компартментами» в истинном смысле этого слова. Это обстоятельство весьма затрудняет исследование молекулярного состава и функций ядерных доменов, поскольку практически любые их молекулярные составляющие могут быть обнаружены и в остальной части нуклеоплазмы. К настоящему времени описано около 10 различных ядерных доменов. Среди них есть такие, которые характеризуют лишь 148 определенные типы клеток или формируются в ответ на изменение физиологических условий, в том числе при экспериментальных воздействиях или различных патологиях. Но есть и такие домены, которые претендуют на роль универсальных и эволюционно консервативных, аналоги которых можно обнаружить в различных типах клеток и у организмов, далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице. Некоторые из таких универсальных ядерных доменов, имеющих отношение к процессингу РНК (за исключением ядрышка, подробно рассматриваемого в других цитологических курсах), будут представлены в данной главе. 4.1. Универсальные ядерные домены интерхроматиновой области ядра С развитием электронной микроскопии морфологи стали различать в ядре эукариотической клетки три основные области (рис. 4.1, а): хроматин (хромосомные территории), ядрышко (ядрышки) и интерхроматиновое (межхроматиновое) пространство (interchromatin space), занимающее остальную часть ядра. В интерхроматиновом пространстве некоторые исследователи особо выделяет перихроматиновую область — пограничную с хроматином зону нуклеоплазмы. Интерхроматиновое пространство ядра долгое время представлялось малоструктурированной областью. Однако в конце 1960-х гг. Моннероном (A. Monneron) и Бернаром (W. Bernhard) был предложен специальный способ обработки ультратонких срезов материала, подготовленного для электронной микроскопии, раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Это позволило на ультраструктурном уровне различать ДНП- и РНПсодержащие структуры (домены). Несмотря на то, что метод Моннерона и Бернара оказался не вполне специфичным и в настоящее время применяется мало, он открыл новую эру в исследованиях ядерных структур (доменов) и 149 послужил отправной точкой развития современной кариологии (науки о клеточном ядре). С помощью вышеупомянутого метода были открыты или переоткрыты следующие РНП-содержащие структуры перихроматинового пространства клеточного ядра (рис. 4.1, б): перихроматиновые гранулы, перихроматиновые фибриллы, интерхроматиновые гранулы и ядерные тельца, известные в настоящее время как тельца Кахала. Рис.4.1. Морфологические области клеточного ядра (а) и некоторые структуры интерхроматинового пространства (б) 4.1.1. Перихроматиновые гранулы Среди структур интерхроматиновой области ядра перихроматиновые гранулы (perichromatin granules, PGs) до сих пор остаются недостаточно изученными, хотя они являются одними из эволюционно консервативных структур и были описаны в клетках широкого круга объектов: начиная от растений, простейших, червей и заканчивая млекопитающими, включая человека. Это электронно-плотные гранулы размером 40–55 нм, часто окруженные характерным электронно-прозрачным «гало» размером 20–25 нм, и тогда, вместе с гало, размер этих структур составляет 70 нм. При большом увеличении электронного микроскопа обнаруживается, что каждая перихроматиновая гранула состоит из тонких, плотно упакованных фибрилл около 3 нм толщиной. Кроме 150 того, с периферией конденсированного хроматина перихроматиновые гранулы могут быть связаны тонкими филаментами. Количество перихроматиновых гранул в соматических клетках млекопитающих в среднем составляет 500–2000 на ядро, но может значительно варьировать в зависимости от физиологического состояния клетки. В частности, их количество заметно возрастает при снижении транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II, в естественных или экспериментальных условиях. Полный биохимический состав перихроматиновых гранул, а также их функции остаются неизвестными, однако установлено, что перихроматиновые гранулы содержат гяРНП (разд. 3.1.4). Соответственно, наиболее распространена гипотеза об участии перихроматиновых гранул в транспорте мРНК и временном ее хранении в ядре в форме гяРНП. Некоторые авторы также полагают, что перихроматиновые гранулы могут содержать аберрантные РНК в процессе их деградации. Существует точка зрения, что перихроматиновые гранулы отражают более высокий уровень упаковки частиц гяРНП и формируются за счет сворачивания перихроматиновых фибрилл (разд. 4.1.2). 4.1.2. Перихроматиновые фибриллы Как и перихроматиновые гранулы, перихроматиновые фибриллы, как следует из названия, располагаются преимущественно на периферии конденсированного хроматина, однако могут мигрировать из перихроматиновых зон, где они формируются, далеко вглубь интерхроматинового пространства. Существенно, что в перихроматиновых зонах перихроматиновые фибриллы обнаруживаются в участках транскрипции. Индивидуальную перихроматиновую фибриллу (3–5 нм толщиной) визуализировать удается редко. Гораздо чаще под электронным микроскопом выявляются группы перихроматиновых фибрилл около 20 нм толщиной. 151 Общепризнано, что перихроматиновые фибриллы представляют собой «морфологическое выражение» первичных транскриптов мРНК (―in situ forms of nascent transcripts‖), а также являются местами осуществления ранних этапов процессинга пре-мРНК, которые происходят в основном котранскрипционно. Иными словами, перихроматиновыми фибриллами представлены пре-мРНК в комплексе с сопутствующими белками и другими факторами их процессинга при электронно-микроскопическом исследовании. В частности, кроме пре-мРНК в составе перихроматиновых фибрилл выявлена РНК-полимераза II и базальные транскрипционные факторы (например, TFIIH и TFIID), а также некоторые факторы процессинга пре-мРНК: например, факторы сплайсинга (мяРНП сплайсинга и SR-белки) и фактор процессинга 3 -конца молекулы премРНК CFIm (cleavage factor I). Перихроматиновые фибриллы являются первичным и высокочувствительным маркером изменения транскрипционного статуса клеток при различных физиологических и экспериментальных условиях. При этом существует прямая взаимосвязь между плотностью перихроматиновых фибрилл и скоростью синтеза премРНК: чем выше интенсивность транскрипции и, соответственно, процессинга пре-мРНК, тем выше плотность перихроматиновых фибрилл в ядре. 4.1.3. Интерхроматиновые гранулы Среди структур интерхроматинового пространства клеточного ядра важное место занимают интерхроматиновые гранулы. В большинстве случаев они собраны в более или менее выраженные скопления (кластеры), из-за чего обычно используют термин «кластеры интерхроматиновых гранул» (interchromatin granule clusters, IGCs). Это универсальные и эволюционно консервативные структуры, обнаруженные в различных типах клеток растений, простейших, червей, моллюсков, насекомых, амфибий и млекопитающих, включая человека. Вместе с тем, кластеры 152 интерхроматиновых гранул до сих пор по непонятным пока причинам не удалось обнаружить в клетках дрожжей или в ооцитах птиц. В типичном случае соматических клеток млекопитающих размеры кластеров интерхроматиновых гранул варьируют от одного до нескольких микрометров в диаметре, при этом часто эти домены характеризуются неправильной формой и весьма неровным очертанием контуров. В типичных случаях индивидуальные интерхроматиновые гранулы имеют размер 20–25 нм, но в некоторых типах клеток (например, в ооцитах) могут быть крупнее. В составе кластеров интерхроматиновые гранулы связаны между собой сетью тонких фибрилл и при исследовании под электронным микроскопом часто выглядят как скопления «бусин на нитках». В интерфазных соматических клетках млекопитающих в среднем выявляется 20–50 кластеров интерхроматиновых гранул на одно ядро. В ранних электронно-микроскопических исследованиях фунцкциональная роль кластеров интерхроматиновых гранул оставалась непонятной. Существенный прорыв в этом отношении произошел в конце 1980-х — начале 1990-х гг., когда были получены и охарактеризованы новые антитела, в том числе те, которые специфически распознают белки мяРНП и другие компоненты сплайсосом. Появилась возможность иммуноцитохимически выявлять в ядрах молекулярные компоненты сплайсинга пре-мРНК. Одни из первых полученных антител распознавали Sm-эпитоп мяРНП, а именно — симметричные диметиларгинины, присутствием которых он характеризуется. Другие антитела выявляли триметилгуанозиновый кэп сплайсосомных мяРНК. Поскольку триметилгуанозиновый кэп характеризует в ядре только те мяРНК, которые уже побывали в цитоплазме и приобрели связь с Sm-белками (разд. 3.1.5.1), использование этих антител в иммуноцитохимических исследованиях позволило локализовать в ядре функционально зрелые мяРНП. Наконец, были получены антитела к SR-белкам (например, к белку SC35, который играет существенную роль в межбелковых 153 взаимодействиях в ходе сборки сплайсосомы, а также к фактору сплайсинга SF2/ASF). Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия с использованием данных антител к факторам сплайсинга выявила характерное окрашивание ядер в виде интенсивно флуоресцирующих пятен, названных ядерными ―speckles‖ (англ. speckle [читается «спекл»] — пятнышко, крапинка). Было установлено, что на ультраструктурном уровне такие «пятна» как раз и соответствуют кластерам интерхроматиновых гранул. Помимо ―speckles‖, антитела к факторам сплайсинга обнаруживают и менее интенсивное диффузное окрашивание нуклеоплазмы, которое, соответствует перихроматиновым фибриллам (разд. 4.1.2). Проведенные исследования с помощью гибридизации нуклеиновых кислот in situ показали, что кластеры интрхроматиновых гранул (ядерные ―speckles‖) содержат мажорные и, по крайней мере, некоторые минорные мяРНК сплайсинга. Высокая концентрация факторов сплайсинга в кластерах интерхроматиновых гранул (ядерных ―speckles‖), которая в 5–10 раз превышает таковую в остальной части нуклеоплазмы, привела к появлению нескольких других специальных терминов, использующихся для описания этих структур: «компартменты факторов сплайсинга» (splicing factor compartments, SFCs), а также SC35-домены. Белок SC35 рассматривают в качестве одного из диагностических молекулярных маркеров этих ядерных структур. Если в кластерах интерхроматиновых гранул столь высокая концентрация сплайсинга, то происходит ли в этих структурах сам сплайсинг? Современные исследования показали, что кластеры интерхроматиновых гранул не являются главными участками активного сплайсинга, который пространственно сопряжен преимущественно с перихроматиновыми фибриллами, где осуществляется котранскрипцонно. 154 Согласно современным представлениям, основная функция кластеров интерхроматиновых гранул — временные «депо» (резервуары) факторов сплайсинга, откуда они рекрутируются к местам транскрипции и сплайсинга, т. е. на перихроматиновые фибриллы (см. разд. 3.1.5.2. и рис. 3.17). В этих же доменах происходит переработка (рециклирование) факторов сплайсинга и, возможно, сборка некоторых пресплайсосомных компонентов. Кластеры интерхроматиновых гранул — высокодинамичные структуры; при этом их размеры и форма являются отражением динамики белков, непрерывно их покидающих и возвращающихся обратно. Показано, что за 1 с около 12000 молекул SR-белка SF2/ASF покидает кластер интерхроматиновых гранул и возвращается назад. Эти структуры чрезвычайно чувствительны к изменениям транскрипционного статуса клетки, а также к различным сигналам, оказывающим влияние на доступность пула факторов транскрипции и процессинга РНК. При снижении транскрипционной активности ядра обычно происходит заметное увеличение размеров кластеров интерхроматиновых гранул, которые при этом приобретают правильную округлую форму. Сравнительный анализ данных светооптической микроскопии (speckles) и электронной микроскопии (кластеры интерхроматиновых гранул) показал, что они формируются в тех участках ядра, которые либо не содержат, либо содержат весьма незначительное количество ДНК. Однако петли транскрипционно активных генов могут простираються из более конденсированного хроматина хромосомных территорий на периферию кластеров интерхроматиновых гранул (рис. 3.17). В этом случае кластеры интерхроматитновых гранул могут увеличивать локальную доступность компонентов сплайсосом вблизи пре-мРНК. Функцию кластеров интерхроматиновых гранул как мест хранения и переработки факторов сплайсинга долго рассматривали в качестве единственной. Однако появляется все больше данных, 155 свидетельствующих о том, что кластеры интерхроматиновых гранул — полифункциональные ядерные домены. Проведенное с помощью масс-спектрометрического анализа исследование протеома (белкового состава) кластеров интерхроматиновых гранул, биохимически очищенных их клеток печени крысы, позволило идентифицировать в их составе около 150 различных белков, что послужило отправной точкой дальнейших исследований, которые привели к современным представлениям о кластерах интерхроматиновых гранул как о полифункциональной ядерной органелле. Установлено, что 81 % идентифицированных белков так или иначе связаны с метаболизмом РНК, а 54 % действительно имеет отношение конкретно к сплайсингу пре-мРНК. Более того, сревнение протеомов кластеров интерхроматиновых гранул и сплайсосом выявило в них 63 % общих белков. Однако значительную группу белков в составе протеома кластеров интерхроматиновых гранул составляют белки, вовлеченные в иные ядерные процессы, нежели сплайсинг пре-мРНК. Многие исследователи аргументировано полагают, что кластеры интерхроматиновых гранул являются не просто инертными хранилищами факторов сплайсинга, но могут оказывать регулирующее и координирующее влияние на регуляцию экспрессии генов, в том числе расположенных на разных хромосомах. Действительно, некоторые активные гены и (или) их продукты могут располагаться на периферии кластеров интерхроматиновых гранул (хотя преимущественно не внутри самих этих доменов). Эти взаимодействия могут играть важную роль в создании условий для эффективной состыковки событий инициации транскрипции, элонгации первичного транскрипта и процессинга РНК. Данная модель может представлять собой широко распространенный в природе интеграционный механизм, способствующий усилению эффективности регуляции экспрессии генов. 156 В настоящее время начинают разрабатываться представления о том, что мРНК, благодаря кластерам интерхроматиновых гранул, приобретает способность (компетентность) к экспорту из ядра. Первым толчком для разработки этой гипотезы послужило обнаружение в их составе полиаденилированных РНК. Хотя природа таких поли(А)+-РНК до конца не установлена, считают, что по крайней мере их часть представляет собой мРНК или пре-мРНК. В настоящее время разрабатывается модель, согласно которой кластеры интерхроматиновых гранул участвуют в удержании мРНК (retention of mRNA) перед ее экспортом из ядра в цитоплазму. При этом в кластерах интерхроматиновых гранул задерживаются, вопервых, пре-мРНК, не завершившие сплайсинг (содержащие интроны), а во-вторых, — мРНК с неправильно или не полностью собранным комплексом связи экзонов (см. разд. 3.1.5.3). Завершение сплайсинга и повторная сборка функциональных комплексов связи экзонов (EJC), включая временно ассоциированные с ними факторы экспорта мРНК (например, NXF1 — nuclear export factor 1, ведущий фактор экспорта мРНК), формирует стабильные РНК–белковые комплексы, которые теперь могут успешно экспортироваться. 4.1.4. Тельца Кахала Ядерные тельца, известные в настоящее время как тельца Кахала, были открыты более 100 лет тому назад испанским нейробиологом, лауреатом Нобелевской премии (1906) Рамоном Кахалом (Ramόn y Cajal). В нейронах млекопитающих (крысы, собаки, человека), которые изучал Кахал, эти тельца располагались вблизи ядрышек, но заметно отличались от них и других ядерных образований по характеру окрашивания азотнокислым серебром. По этой причине Кахал назвал эти тельца «добавочными» (исп. ―cuerpo accessorio‖). До конца 1950-х гг. «добавочные тельца» Кахала не являлись предметом специальных исследований. Лишь в 1960-е произошло «переоткрытие» этих телец на ультраструктурном уровне благодаря 157 методу Моннерона и Бернара (см. выше). Эти исследователи описали в ядрах различных соматических клеток млекопитающих своеобразные тельца, состоящие из перекрученных электронноплотных фибриллярных тяжей (coiled threads), и назвали их «скрученными тельцами» (coiled bodies). Этот термин просуществовал почти 40 лет. Лишь в 1999 г. ему на смену пришел общеупотребительный в настоящее время термин «тельце Кахала» (Cajal body, CB), предложенный в честь открывшего их ученого. В соматических клетках млекопитающих тельца Кахала имеют размеры 0.3–0.5 мкм в диаметре, а основной их структурный компонент — «перекрученные тяжи» — толщину 40–60 нм. Несмотря на долгую историю «открытия», лишь недавно стала складываться определенная точка зрения на молекулярный состав и функции телец Кахала. Одним из ключевых этапов в этой истории явилось открытие в начале 1990-х гг. белка, названного коилином от прежнего названия этих структур — ―coiled bodies‖. Этот белок принято считать маркером телец Кахала, хотя значительная его часть присутствует и в остальной части нуклеоплазмы. Коилин оказался фосфопротеином, молекула которого имеет домен, отвечающий за взаимодействие с Sm-белками и U мяРНП (в том числе мяРНП сплайсинга и U7 мяРНП), с которыми он образует слабые, но специфические комплексы. Обнаружено, что коилин — челночный белок, являющийся частью ядерноцитоплазматической транспортной системы. В частности, он участвует в импорте в ядро мяРНП, в конечном итоге обеспечивая их связывание с тельцами Кахала (см. разд. 3.1.5.1). Коилин напрямую взаимодействует с белком SMN, который осуществляет сборку мяРНП-комплексов и участвует в их транспорте. С момента открытия коилина и специфических антител к этому белку количество молекулярных компонентов, обнаруживаемых в тельцах Кахала, продолжает стремительно расти. Согласно одному из определений, тельца Кахала представляют собой ядерные органеллы, 158 занимающие одно из центральных мест в метаболизме мяРНК и представляющие собой «промежуточные станции» (waystations) в ходе перемещения мяРНП в клетке во время их процессинга. Действительно, одними из первых молекулярных компонентов, идентифицированных в тельцах Кахала различных клеток, были «Smэпитоп» мяРНП, а также триметилгуанозиновый кэп мяРНК. В тельцах Кахала обнаружены все мяРНП сплайсинга и U7 мяРНП, а также мяшРНК и, что особенно существенно — малые РНК, специфические для телец Кахала (мткРНК — см. разд. 3.1.5.1). Последние РНК являются, по-видимому, единственными специфическими маркерами телец Кахала, поскольку они обнаруживаются только в них и больше нигде в ядре. Соответственно, важнейшая функция телец Кахала — участие в поздних этапах процессинга мяРНП, а именно в 2 -Oметилировании и псевдоуридинилировании мяРНК. В тельца Кахала попадают не только вновь образованные мяРНП, импортированные из цитоплазмы после цитоплазматической фазы их процессинга. В клетке существует постоянный круговорот мяРНП, которые могут проходить через тельца Кахала неоднократно. В метаболизме тех мяРНК, которые по своей природе имеют Sm-сайт, именно этот сайт играет ведущую роль в их направленном связывании с тельцами Кахала. Для мяРНК, не имеющих Sm-сайта, за связывание с тельцами Кахала отвечают другие консервативные последовательности их молекул. В направленном позиционировании мяРНП в тельца Кахала принимает участие и белок SMN. Он и сопутствующие ему белки обнаруживаются в зависимости от типа клеток либо непосредственно в самих тельцах Кахала, либо в отдельных, родственных им тельцах, называемых «близнецами» телец Кахала (gems, или Gemini). Еще одна важная функция телец Кахала — их участие в ассоциации U4 и U6 мяРНП и в сборке трехкомпонентной [U4/U6•U5] субъединицы сплайсосом (см. разд. 3.1.5.3). 159 Роль телец Кахала в качестве первичного ядерного центра, в котором мяРНК завершают процессинг и в котором происходит сборка мяРНП-комплексов, распространяется и на ряд мяшРНК. Установлено, что мяшРНК первоначально ассоциируют с тельцами Кахала и только затем оказываются в ядрышках, где осуществляют свои функции. Еще одна мяРНК, которая в некоторых случаях маркирует тельца Кахала, — U7 мяРНК, участвующая в процессинге 3 -конца мРНК гистонов (разд. 3.1.3). Однако в некоторых типах клеток (например, в клетках Drosophila) U7 мяРНК локализуется в особых ядерных тельцах, ассоциированных с генами, кодирующими гистоны, и потому изначально названных тельцами гистоновых локусов (histone locus bodies, HLBs). Эти тельца содержат коилин и потому могут, по-видимому, рассматриваться как функциональные разновидности телец Кахала. Кроме самой U7 мяРНК в тельцах гистоновых локусов обнаруживается U7-специфический Smподобный белок Lsm10, а также белок SLBP1 (stem-loop binding protein), который необходим для успешного осуществления процессинга транскриптов гистоновых мРНК (разд. 3.1.3). На примере некоторых типов клеток показано, что, по крайней мере, часть телец Кахала расположена в ядре неслучайным образом не только по отношению к генам, кодирующим мРНК гистонов, но и к некоторым другим генам. Так, в соматических клетках млекопитающих установлена ассоциация телец Кахала с активными генами, кодирующими U1 и U2 мяРНК. Тельца Кахала обнаруживают заметную динамичность внутри ядра, периодически перемещаясь в нуклеоплазме с помощью механизмов, отличных от простой диффузии. Они могут объединяться в более крупные структуры и, наоборот, разделяться с образованием мелких телец, содержащих неодинаковый набор белков. 160 Не только различные мяРНП и связанные с ними белки, но и целый ряд других компонентов, имеющих отношение к транскрипции и посттранскрипционному процессингу разных типов РНК, обнаруживаются в тельцах Кахала. Например, в них обнаружены все три РНК-полимеразы и некоторые важнейшие сопутствующие им транскрипционные факторы. Некоторые факторы расщепления и полиаденилирования пре-мРНК обнаруживаются либо в самих тельцах Кахала, либо в тесно связанных с ними структурах, названных «тельцами расщепления» (cleavage bodies). Что касается белковых факторов сплайсинга, то в составе телец Кахала соматических клеток млекопитающих не были выявлены белки из семейства SR (например, SC35). Однако исследования молекулярного состава телец Кахала ооцитов некоторых животных показывают, что обнаружение малых количеств белка SC35 в их составе в настоящее время уже не является неожиданностью. В настоящее время число молекулярных компонентов, идентифицированных в тельцах Кахала различных клеток и организмов, продолжает расти. Для многих из них показана значимость для поддержания структурной целостности телец Кахала. 4.2. Некоторые особенности экстрахромосомных ядерных структур ооцитов Благодаря крупным размерам не только самих клеток, но также их ядер и внутриядерных структур, ооциты (яйцеклетки) являются перспективными модельными объектами для изучения структурнофункциональной компартментализации ядра. Однако, в отличие от соматических клеток, ооциты — это делящиеся клетки, находящиеся в профазе мейоза. Кроме того, в оогенезе многих животных существует иногда очень длительный период естественной (физиологически детерминированной) инактивации ядра, что не может не оказывать влияния на организацию, состав и функции внутриядерных компартментов. Наконец, «стратегия» оогенеза во 161 многом направлена на обеспечение не столько жизнедеятельности самого ооцита, сколько на обеспечение развития будущего эмбриона. Поэтому не исключено, что в ядрах ооцитов могут формироваться особые запасающие компартменты, депонирующие инактивированные компоненты экспрессии генов для их использования в раннем эмбриогенезе при активации эмбрионального генома. По своим морфологическим признакам и молекулярному составу экстрахромосомные ядерные структуры ооцитов нередко отличаются от своих гомологов в соматических клетках, и даже простая их идентификация в ряде случаев представляется сложной задачей. 4.2.1. Снѐрпосомы Большинство работ по организации внутриядерных органелл ооцитов выполнено на ооцитах амфибий и особенно африканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Первоначально было установлено, что многие внутриядерные тельца в ооцитах амфибий содержат малые ядерные РНП. Для таких внутриядерных органелл был предложен термин «снѐрпосома» (snurposome— от амер. лаб. ―snurps‖ [произносится «снѐрпс», от small nuclear RNPs] и греч. ζώμα [«сома»] — тело). Таким образом, формально снѐрпосомой можно назвать любое ядерное тельце, богатое мяРНП. В ядрах большинства видов амфибий присутствует только один тип снѐрпосом — B-снѐрпосомы (B-snurposomes, читается «биснѐрпосомы»). Это мелкие тельца правильной сферической формы, которых в ядре зрелого ооцита Xenopus может насчитываться несколько тысяч. Размер B-снѐрпосом составляет всего несколько микрометров в диаметре. Большинство В-снѐрпосом располагается свободно в кариоплазме, а часть из них ассоциирована с тельцами Кахала. В-снѐрпосомы состоят из гранул, по размеру и по составу почти не отличающихся от интерхроматиновых гранул соматических клеток 162 млекопитающих. В настоящее время B-снѐрпосомы и рассматривают как ядерные структуры ооцитов, соответствующие кластерам интерхроматиновых гранул соматических клеток. В частности, они содержат все основные мяРНП сплайсинга (U1, U2, U4, U5 и U6) и также SR-белки (например, SC35). В ядрах ооцитов американского тритона Notophtalmus viridiscens присутствует два вида снѐрпосом. Кроме обычных B-снѐрпосом в них обнаружены так называемые А-снѐрпосомы (A-snurposomes), которые имеют форму двояковогнутой линзы, напоминая форму эритроцитов. А-снѐрпосомы мельче B-снѐрпосом ( 1 мкм в диаметре). В них присутствует только один вид мяРНП — U1 мяРНП и отсутствуют SR-белки. А-снѐрпосомы, по-видимому, — специфическая структура ядер ооцитов тритона Notophtalmus. У других видов амфибий они до сих пор не обнаружены. Однако в соматических клетках млекопитающих известны похожие по составу структуры. В некоторых клетках с кластерами интерхроматиновых гранул могут быть ассоциированы особые фибриллярные области (interchromatin granule-associated zones, IGAZ). В составе IGAZ соматических клеток млекопитающих не обнаруживаются белок SC35, гяРНП, а также поли(А)-полимераза. Из мяРНП в составе IGAZ выявлен только U1 мяРНП, но не U2 или другие мяРНП сплайсинга. Предполагают, что А-снѐрпосомы ооцитов тритона Notophtalmus и IGAZ соматических клеток млекопитающих представляют собой специальные участки финального созревания (сборки) U1 мяРНП сплайсосомной субъединицы. 4.2.2. Особенности телец Кахала ооцитов В ооцитах амфибий тельца Кахала — весьма своеобразные в морфологическом плане структуры, непохожие по организации на тельца Кахала в соматических клетках млекопитающих. Впервые они были идентифицированы в ходе многочисленных морфологических исследований, относящихся к XIX в., хотя в то время их часто путали 163 с множественными ядрышками, имеющими в ряде случаев сходный размер (от 1 до 20 мкм в диаметре). Ядро ооцита амфибий может содержать 20–100 телец Кахала. В ооцитах амфибий (но не других животных) тельца Кахала состоят из трех морфологических частей: 1) центральной тонкофибриллярной части — матрикса тельца Кахала; 2) небольших электронноплотных образований на поверхности; 3) различных по размеру включений в матриксе, по ультраструктуре напоминающих образования на поверхности. Матрикс такого сложного тельца Кахала — это его коилинсодержащая часть. Во включениях и поверхностных образованиях коилин отсутствует. Исследования показали, что образования на поверхности тельца Кахала и включения в матриксе по составу и тонкому строению идентичны свободным В-снѐрпосомам (кластерам интерхроматиновых гранул). Таким образом, в ооцитах амфибий тельца Кахала и кластеры интерхроматиновых гранул связаны в единую структуру, что, очевидно, должно свидетельствовать и об их функциональном единстве. U мяРНК сплайсинга и SR-белки обнаруживаются в матриксе телец Кахала ооцитов амфибий лишь в следовых количествах. Ими обогащены B-снѐрпосомы, соответствующие кластерам интерхроматиновых гранул: как свободные в нуклеоплазме, так и Bснѐрпосомы, ассоциированные с тельцами Кахала, в том числе включения (B-like inclusions) в матриксе. Напротив, основной компонент матрикса телец Кахала — U7 мяРНК, которая гиперметилирована (имеет триметилгуанозиновый кэп) и ассоциирована с Sm- и Sm-подобными (Lsm) белками. В ядрах ооцитов амфибий большинство телец Кахала не связано с хромосомами, лишь некоторые из них специфическим образом ассоциированы с участками расположения гистоновых генов. Очевидно, что такие тельца Кахала можно рассматривать в качестве телец гистоновых локусов. 164 В 1990-х гг. известным американским цитологом Джозефом Голлом (J.G. Gall) была предложена модель функционирования сложных телец Кахала ооцитов Xenopus, однако до сих пор не вполне ясно, насколько она применима к тельцам Кахала других типов клеток. Согласно этой модели, в тельцах Кахала происходит первичная сборка компонентов, связанных с транскрипцией и процессингом РНК, транскрибируемых всеми тремя РНКполимеразами, в унитарные частицы, названные Пол I-, Пол II- и Пол III-транскриптосомы (pol I-, pol II-, pol III-transcriptosomes; pol (Пол) — сокращение от «полимераза»). При этом транскриптосомы направляются к соответствующим ядерным доменам: Пол Iтранскриптосомы — к ядрышку, Пол IIи Пол IIIтранскриптосомы — к соответствующим генам на хромосомах. Своеобразны тельца Кахала в ооцитах некоторых насекомых. Так, в ооцитах домового сверчка Acheta domesticus это относительно крупные ядерные органеллы идеально правильной сферической формы. Они были описаны еще в 1913 г. Йоргенсеном (M. Jörgensen), который уже в те годы предполагал, что они отличны от ядрышек. В конце 1960-х годов эти образования были исследованы на ультраструктурном уровне группой немецких ученых, которые дали им название «внутренние тельца» (ориг. нем. — Binnenkörper, англ. перевод — endobody). В конце 1980-х — начале 1990-х годов Голл впервые предположил, что ―Binnenkörper‖ ооцитов насекомых представляют собой тельца Кахала. На ранних стадиях развития ооцита сверчка тельца Кахала имеют совершенно однородную тонкофибриллярную организацию, однако в ходе роста ооцита они приобретают характерное строение и состоят из тонкофибриллярного коилин-содержащего матрикса, обширной центральной полости, в которой расположен одиночный «внутренний» кластер интерхроматиновых гранул, напоминающий Bснѐрпосому ооцитов амфибий. 165 Несмотря на некоторые внешние черты сходства в организации телец Кахала ооцитов шпорцевой лягушки и сверчка, эти структуры имеют существенные отличия по составу (рис. 4.2). Так, в ядрах ооцитов сверчка мяРНК сплайсинга присутствуют не только в составе Рис. 4.2. Сравнение строения и молекулярного состава телец Кахала домового сверчка (слева) и шпорцевой лягушки (справа). По Bogolyubov et al., 2009. BioEssays 31: 400–409 кластеров интерхоматиновых гранул, но и в матриксе тельца Кахала; при этом U2 мяРНК представлена в нем в наибольшей концентрации. В отличие от телец Кахала соматических клеток млекопитающих и ооцитов амфибий, в ооцитах сверчка SR-белок SC35 обнаруживается не только в кластерах интерхроматиновых гранул, но и в матриксе 166 тельца Кахала; правда, в незначительном количестве и лишь на поздних стадиях развития этой органеллы. У других насекомых ядерные структуры ооцитов чрезвычайно гетерогенны как по организации, так и по молекулярному составу, что затрудняет их изучение. Обычно это крупные тонкофибриллярные тельца, связанные с хроматином. Таковы, например, тельца Кахала в ооцитах дрозофилы или других мух. Вопросы для повторения: 1. Какие РНК эукариотической клетки вы знаете? Каковы особенности процессинга (созревания) первичных транскриптов этих РНК? 2. Процессинг (кэпирование) 5 -конца пре-мРНК: основные события и молекулярные компоненты. 3. Процессинг 3 -конца пре-мРНК: эндонуклеолитическое расщепление и полиаденилирование. 4. Особенности процессинга 3 -конца пре-мРНК гистонов. 5. Понятие гетерогенных ядерных РНП. 6. Понятия «экзон» и «интрон». Строение экзонов и интронов. Сущность сплайсинга. Биохимические реакции при «классическом» сплайсинге. 7. Что такое «сплайсосома»? Молекулярный состав и порядок сборки сплайсосом. 8. Малые ядерные РНК сплайсинга. Метаболизм (биогенез) мяРНП на примере U1 и U6 мяРНК. Сборка мяРНП. 9. SR-белки: особенности молекулярного строения и функции. 10. Альтернативный сплайсинг: сущность, варианты, биологическое значение и регуляция. 11. SL-РНК и транс-сплайсинг. 12. Самосплайсинг интронов групп I и II. Понятие рибозима. 13. Сплайсинг транспортных РНК. 14. Сущность редактирования мРНК. 14. Распределение факторов процессинга РНК в ядре 167 эукариотической клетки. Универсальные ядерные домены, обогащенные мяРНП и SR-белками. 15. Кластеры интерхроматиновых гранул: строение, молекулярный состав, функции. 16. Тельце Кахала: особенности строения и молекулярного состава в разных типах клеток. Основные функции. Структурные комплексы телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул в ооцитах. 5. ДНК КАК САМОПОДДЕРЖИВАЮЩАЯСЯ СТРУКТУРА. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В ДНК-МЕТАБОЛИЗМ 5.1. ДНК-МЕТАБОЛИЗМ: РЕПЛИКАЦИЯ, РЕКОМБИНАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ 5.1.1. Конститутивные и индуцибельные процессы в клетке Все клеточные процессы делятся на те, которые протекают постоянно, вне зависимости от воздействия внешней среды и те, которые нуждаются для своей активации в специальных стимулах. Первые получили название конститутивных, а вторые ― индуцибельных. Часто один и тот же процесс может иметь одновременно и конститутивную, и индуцибельную ветви. Например, основания ДНК, измененные под действием эндогенных факторов (такими факторами могут быть генерируемые митохондриями активные формы кислорода), постоянно заменяются на нормальные (конститутивная ветвь), но при воздействии внешних мутагенов эти процессы активируются и количество вовлеченных в них белков возрастает (индуцибельная ветвь). Экспрессия главного антионкогена ― белка р53 и его перемещение в ядро являются постоянными (то есть конститутивными) процессами, но обычно этот 168 белок достаточно быстро переносится обратно в цитоплазму и деградирует. Накопление же р53 в ядре связано с его фосфорилированием в ответ на повреждение ДНК или резкое изменение ее конформации, то есть является индуцибельным. Таким образом, изучая ДНК-метаболизм нужно понимать, что активность процессов в клетке меняется в зависимости от внешних и внутренних условий. 5.1.2. Основные группы белков, вовлеченные в процессы ДНК-метаболизма Самое интересное то, что ДНК сама кодирует все белки, участвующие в ее построении и метаболизме. Все белки, вовлеченные в процессы репликации, рекомбинации и репарации ДНК, кодируются самим геномом. Из этого следует, что определенные гены кодируют белки, способствующие созданию новых комбинаций генетического материала, передаваемых потомству. Таким образом, геном сам является источником возможности эволюционных изменений, хотя в некоторых случаях эта способность может приводить к тяжелым заболеваниям или гибели организма. В генетической программе также предусмотрен механизм, который исправляет ошибки, происходящие при репликации ДНК, и механизм репарации повреждений, возникающих при действии различных агентов. В тоже время важно понимать, что все части ДНК-метаболизма тесно связаны между собой и многие белки одновременно вовлечены в процессы репликации, рекомбинации и репарации. Такими белками являются нуклеазы, ДНК-полимеразы, геликазы, топоизомеразы. Некоторые белки принимают участие в двух из трех описываемых процессов, например, белки Rad51 (radiation 51) и Msh2 (Mut S homologue 2) принимают участие и в рекомбинации и в репарации, а некоторые ― уникальны. Таким уникальным белком является ДНК- 169 зависимая РНК-полимераза — праймаза, синтезирующая праймерзатравку для процесса репликации или гликозилазы, различающие поврежденные основания в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов. Для наглядности рассмотрим схему процесса репликации у прокариот, представленную на рис. 5.1. Рис. 5.1. Схема репликации ДНК у E. coli На панели а (рис. 5.1) схематически показаны белки в Yраскрученной вилке репликации ДНК, но в реальности вилка репликации свернута в трех измерениях и образует структуру, подобную той, что изображена на вставке б. (Фридберг, 2003). В репликативной вилке одновременно активны две молекулы ДНК-полимеразы. Одна движется постоянно, производя новую дочернюю молекулу ДНК на ведущей нити, тогда как другая производит длинную серию коротких фрагментов Оказаки на 170 отстающей нити. Обе полимеразы «заякорены» на их матрице с помощью ассоциированных с ними белков в виде «скользящего зажима» (sliding clump) и «загрузчика зажима» (clump loader). ДНК-полимеразы, разумеется, участвуют и в процессах рекомбинации и репарации, когда необходим синтез ДНК. ДНК-геликаза, активированная энергией АТФ-гидролиза, быстро движется вдоль одной из матричных нитей (на рис. 5.1 — ведущая нить), раскрывая ДНК-спираль прямо перед репликативной вилкой. ДНК-геликаза предоставляет основания ДНК-спирали ДНКполимеразе ведущей нити, чтобы та могла их копировать. Ферменты ДНК-топоизомеразы облегчают раскручивание спирали ДНК. В дополнение к матрице, ДНК-полимераза в процессе репликации нуждается в праймере, «затравке», существующей до начала собственно самого основного процесса синтеза ДНК, к которому и присоединяется следующий нуклеотид. Этот праймер синтезирует специальный фермент — ДНК-зависимая РНК-полимераза — праймаза. Праймаза производит очень короткую молекулу РНК (РНК-праймер) в качестве 5 -конца каждого фрагмента Оказаки, к которому ДНК-полимераза и будет достраивать нуклеотиды. По этой причине ДНК-полимераза отстающей нити многократно нуждается в действии фермента ДНК-праймазы перед тем, как она начнет синтез каждого нового фрагмента Оказаки. В тоже время, синтез ДНК при рекомбинации и репарации не нуждается в праймере, мы увидим, что в этих процессах ДНК-полимеразы используют свободный 3'-конец ДНК, образующийся другим путем. Наконец, однонитевые участки ДНК внутри вилки покрыты множеством копий SSB-белка (связывающего однонитевую ДНК, single strand binding), занимая открытую область ДНК на нитяхматрицах с их подготовленными для копирования основаниями. У эукариот роль такого защищающего однонитевую ДНК белка выполняет белковый комплекс RPA (replication protein A). В представленной на вставке б схеме репликационной вилки 171 показано, что ДНК-полимераза отстающей нити остается связанной с ДНК-полимеразой ведущей нити. Это позволяет ДНК-полимеразе отстающей нити оставаться внутри вилки после того, как завершен синтез очередного фрагмента Оказаки. В результате, одна и та же полимераза снова и снова участвует в синтезе большого числа фрагментов Оказаки, необходимых для образования новой цепи ДНК на отстающей нити. В дополнение к перечисленной группе коровых (основных) белков, для репликации ДНК необходимы и другие белки, не представленные на рис. 5.1. Среди них можно описать группу белков — инициаторов репликации, необходимых для организации каждой новой репликативной вилки на ориджине репликации, белок РНКазу, удаляющий РНК-праймеры, и ДНК-лигазу, сшивающая близлежащие фрагменты Оказаки друг с другом при формировании непрерывной нити ДНК. Лигазы, разумеется, участвуют и в рекомбинации, и в репарации ДНК, так как там часто бывает нужно соединить концы ДНК. 5.2. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ У ЭУКАРИОТ 5.2.1. Чекпойнт-контроль клеточного цикла Молекулярные процессы, происходящие во время репликации ДНК, в основном похожи у эукариот и прокариот. Тем не менее, существуют и различия. Во-первых, репликация ДНК у эукариот происходит не постоянно, а периодически, что и привело к появлению понятия о клеточном цикле. Во-вторых, если бактериальная хромосома представляет собой единицу репликации ― репликон, то репликация ДНК эукариотической хромосомы осуществляется посредством разделения ее на множество отдельных репликонов. По эукариотической хромосоме в каждый момент времени может двигаться независимо друг от друга множество репликативных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при 172 столкновении с другой вилкой, движущейся во встречном направлении, или по достижении конца хромосомы. В результате вся ДНК хромосомы в короткий срок оказывается реплицированной. Клеточные циклы эукариот качественно не различаются у разных видов и в клетках разных тканей одного вида. Замечены различия, главным образом, в длительности цикла. Среди высших эукариот некоторые клетки делятся каждые 10 мин, другие каждые 3 часа, третьи ― раз в 200 часов. Клеточный цикл большинства соматических клеток высших эукариот подразделяют на 4 стадии: G1 (gap1, предсинтетический период, или период подготовки к синтезу ДНК), S (synthesis, период синтеза ДНК), G2 (gар 2, постсинтетический период или период подготовки к клеточному делению) и М (mitosis, собственно процесс клеточного деления). Иногда выделяют G0 ― стадию между М и G1, или стадию покоя. В культуре клеток человека весь цикл занимает примерно 24 ч, при этом на стадии G1, S, G2 и М приходится 10, 9, 4 и 1 ч соответственно. Фазы G1, S и G2 вместе составляют интерфазу. Клеточный цикл включает ряд этапов, на которых осуществляется контроль продвижения клетки от одной фазы к другой ― точки проверки, или чекпойнты (checkpoints). Первая стадия проверки у дрожжей называется START, у млекопитающих — G1-checkpoint. Если клетка не выросла до необходимых размеров и окружающая среда недостаточно богата, клетка будет оставаться в G1, т. е. не будет получено сигнала для начала синтеза ДНК (S-фазы). В S-фазе разные участки генома реплицируются в разное время. Полагают, что внутри S-фазы также существует стадия проверки (проверка целостности ДНК, checkpoint DNA intregrity), или чекпойнт S-фазы. Стадия проверки G2-фазы находится на границе G2 и М. Если не завершилась репликация всей ДНК, если клетка не выросла до нормальных для этой фазы размеров и окружающая среда недостаточно хороша, клетка не способна перейти к стадии М. 173 Четвертая проверка происходит в самого митоза (М) ― чтобы началось разделение хроматид, хромосомы должны быть надежно прикреплены к нитям митотического веретена. Нарушения регуляции клеточного цикла и чекпойнт-контроля часто приводят к геномной нестабильности и предрасположенности к возникновению опухолей. 5.2.2. Циклин-зависимые киназы и циклины Осуществления событий клеточного цикла координируется и контролируется циклин-зависимыми киназами (cycline-dependent kinases, Cdks). Как это следует из названия, Cdks являются протеинкиназами, которые для своей активации должны связаться с соответствующими циклинами. Ассоциация киназы с циклином приводит к частичной активации киназного комплекса. Для полной активации киназы требуется фосфорилирование ее С-конца специальными протеинкиназами, называемой Cdk-activating kinases (Cak). Активность самих Cak постоянна в течение клеточного цикла и, вероятно, даже небольшие ее модуляции могут оказывать влияние на движение по циклу. Инактивация Cdks контролируется, во-первых, ингибирующим фосфорилированием самих киназ, во-вторых убиквитин-опосредованной деградацией циклинов и в-третьих ― взаимодействием всего комплекса с малыми белками-ингибиторами. Основные принципы, положенные в основу регуляции прохождения клетки по циклу таковы: 1) активация Cdks управляется последовательно экспрессией и объединением с циклинами; 2) активность каждой пары Cdk-циклин необходима для активации последующей; 3) разрушение циклинов приводит к однонаправленному клеточному циклу; 4) ингибирование комплексов Cdks-циклины путем фосфорилирования или путем связывания с белками-ингибиторами задерживает активацию Cdks и замедляет движение клетки по циклу в неблагоприятных условиях. Процесс синтеза и деградации циклинов высоко координирован, 174 в то время как основной уровень контроля активности Cdks заключается в периодичности присутствия или отсутствия циклиновой субъединицы. Динамика экспрессии различных циклинов в течение клеточного цикла различна, они экспрессируются последовательно под влиянием друг друга. Первым из них экспрессируется циклин D, способный к объединению с циклинзависимыми киназами 4 и 6. Это первый циклин фазы G1. Активация следующей пары ― циклин Е–Cdk2 ведет к инициации репликации ДНК. Циклин А экспрессируется сразу же после циклина Е на границе G1 и S фаз. Активность обоих комплексов ― циклин Е–Cdk2 и циклин А–Cdk2 — необходима для инициации и правильного протекания ДНК-репликации, а также для гарантии того, что репликация ДНК инициируется и проходит в течение каждого клеточного цикла только один раз. К тому же циклин А–Cdk2 способствует эффективному протеканию S-фазы, повышая транскрипцию гистоновых и других генов, необходимых для согласованной репликации. Митоз проходит под контролем Cdk1, ассоциированной с циклинами А и В. Экспрессия циклина В запаздывает по отношению к экспрессии циклина А, возрастая в поздней S-фазе и сохраняя высокий уровень в фазах G2 и М. Так как комплекс циклин В–Cdk1 преимущественно пребывает в неактивной фосфорилированной форме, то постепенное возрастание количества циклина В не сопровождается таким же постепенным возрастанием киназной активности этого комплекса. Дефосфорилирование и активация циклин В–Cdk1 строго коррелирует с морфологическими изменениями, сопровождающими митоз. Разные стадии митоза характеризуются очень быстрым и скоординированным исчезновением циклинов A и В. Разрушение митотических циклинов необходимо для того, чтобы гарантировать переход клеток в интерфазу до инициации следующего раунда ДНК-репликации. Это разрушение опосредуется специальным белковым комплексом АРС 175 (anaphase promoting complex). 5.2.3. Роль ростовых факторов в экспрессии генов, ответственных за движение клетки по циклу Если покоящиеся клетки стимулировать к вхождению в клеточный цикл ростовыми факторами, то первым будет экспрессирован циклин D, который может объединяться с Cdk4 или Cdk6. Этот комплекс входит в ядро, где фосфорилирует белок ретинобластомы Rb и два других покет-белка р107 и р130. Факторы роста регулируют циклин D четырьмя способами одновременно: 1) индукция транскрипции; 2) стабилизация белка циклина D; 3) перемещение в ядро; 4) объединение с каталитическими партнерами Cdk-4 Cdk-6. Промоторы D-циклинов отвечают на большое число митогенноактивирующихся сигналов. Индукция транскрипции циклина D1 зависит от Ras/Raf-1/Mek/ERK сигнального пути, к тому же он имеет короткое время существования и быстро деградирует. Во время клеточного деления удваиваются и разделяются по двум дочерним клеткам все молекулы и органеллы материнской клетки. У всех эукариот имеются сходные белковые комплексы, участвующие в инициации репликации и сходные белки, разрешающие репликацию. После образования, компоненты этого комплекса активируются циклин-зависимыми киназами. Начавшись, репликация ДНК должна быть завершена. Таким образом, внеклеточные сигналы типа ростовых факторов не должны влиять на прохождение S-фазы. Так как S-фаза независима от ростовых сигналов, то к ее остановке могут приводить только массивные повреждения ДНК или отсутствие пула нуклеотидов, но такая ситуация часто оканчивается гибелью клетки. После успешного завершения синтеза ДНК клетки переходят в G2-фазу и готовятся к митозу. Покоящиеся клетки млекопитающих являются диплоидными, так что после удвоения ДНК клетки должны 176 разделиться. То есть в G2-фазе контроль ростовых факторов также не нужен. Не нужны и свободные нуклеотиды, и остановить вступление клетки в митоз могут только внутриклеточные сигналы, генерируемые в ответ на повреждение ДНК. В процессе митоза циклин В–cdk1 фосфорилирует ламинин, белок ядерной мембраны, что приводит к растворению ядерной оболочки. Во время митоза хромосомы конденсированы, белки гиперфосфорилированы, а транскрипция и биосинтез резко ограничены или отсутствуют. Прохождение митоза определяется мониторингом функционирования микротрубочек, способствующих правильному расхождению хромосом. Внешний контроль ростовых факторов в такой момент представляется просто вредным, так что и митоз также является фазой цикла, независимой от них. Таким образом, из простых логических умозаключений следует, что только G1-фаза клеточного цикла может зависеть от ростовых факторов. Одним из важнейших загадок в понимании регуляции клеточного цикла является связь митогенной стимуляции с машиной клеточного цикла. Экспрессия циклина D, его продвижение в ядро, стабилизация и ассоциация с Cdks4 или 6 в активный киназный комплекс регулируется ростовыми факторами. Следовательно, циклин D является сенсором ростовых факторов. Способность циклин D–зависимых киназ начинать фосфорилирование белка ретинобластомы (Rb) в средней и поздней G1 показывает, что инактивация Rb также является митоген-зависимым шагом. Белок Rb является фактором, супрессирующим клеточный рост, он участвует в контроле G1/S перехода, связывая семейство транскрипционных факторов E2F. При высвобождении транскрипционные факторы семейства E2F активируют транскрипцию генов, продукты которых вовлечены в ядерный метаболизм и синтез ДНК. Факторы роста активируют собственные рецепторы и другие тирозинкиназы, а через них Ras и митоген-активирующиеся 177 сигнальные пути, кульминацией этого процесса является индукция транскрипции многочисленных генов, включая протоонкогены. Сходным образом, многие гены, кодирующие факторы роста, рецепторы, рецептор-ассоциированные белки и киназы сами являются протоонкогенами. 5.2.4. Точка рестрикции клеточного цикла и ее биологический смысл Основные регуляторные события, приводящие к пролиферации, происходят в G1-фазе цикла. Факторы роста необходимы для инициации и поддержания движения по фазе G1, приводящего к фазе S. Их удаление до определенного момента фазы G1 предотвращает наступление фазы S в нормальных клетках. Точка G1-фазы, после которой клетка не нуждается более в ростовых факторах для завершения клеточного цикла, была названа точкой рестрикции (restriction point). Ее время было определено примерно за 2–3 ч до начала синтеза ДНК. Единожды в точке рестрикции или точке, после которой нет пути назад, клетки настраиваются на синтез ДНК и в дальнейшем не нуждаются во внеклеточных ростовых факторах в течение всего клеточного цикла. Определение точки рестрикции могло бы быть маркером для различения нормальных и опухолевых клеток. Но какова ее биохимическая природа? Была высказана гипотеза, что имеется особый R-белок, являющийся функциональным короткоживущим регуляторным белком, синтез которого чувствителен к ростовым факторам. В то время еще не были известны онкогены и пути передачи клеточных сигналов. Первыми кандидатами были циклин D1 и циклин Е, свойства которых отвечают всем требованиям к R-белку, так как именно они приводят клетку к S-фазе. Зависимое от митогенного сигнала продвижение по G1 связано с индукцией циклинов D-семейства. После объединения циклина D c Cdk в ядре, этот комплекс фосфорилирует белок Rb, нарушая его связывание с факторами транскрипции E2F, активирующими E2F-зависимую транскрипцию. 178 Циклин Е в комплексе с Cdk2 сотрудничает с циклин D–Cdk4/Cdk6 комплексами для полного фосфорилирования белка Rb. Зависимость от ростовых факторов заканчивается при полном фосфорилировании Rb, приводящем к проходу через точку рестрикции в средней G1 и дальнейшему движению по клеточному циклу. Но индукции одного циклина D недостаточно для перехода покоящейся клетки через G1 в S, так как циклины D являются короткоживущими белками, что гарантирует быстрое сокращение их пула при отсутствии митогенов. Во время клеточного цикла D-циклины начинают накапливаться в середине G1, в то время как циклин Е появляется позже, почти прямо перед переходом из G1 в S. Он и завершает фосфорилирование Rb. Эта задержка между появлением комплексов циклин D\Cdk4 и циклин Е\Cdk2 объясняет потерю зависимости от факторов роста. В тоже время, завершение фосфорилирования Rb циклином Е и приводит к полному высвобождению E2F. Таким образом, циклин Е является более удачным кандидатом на роль R-белка, чем циклин D. R-белок разделяется, как минимум, надвое. То есть точка рестрикции расположена между пиками активности транскрипции циклина Е и циклина D. Кроме того, E2F частично тоже обладает свойствами R-белка. Именно он необходим для начала фазы S. История поиска R-белка показывает, как, расширяясь, наши знания приводят к выводу о существовании не точки, а узла рестрикции. 5.2.5. Роль белка ретинобластомы в регуляции клеточного цикла Фосфорилирование Rb приводит к высвобождению семейства транскрипционных факторов E2F, активирующих транскрипцию генов, вовлеченных в процесс репликации ДНК, и таким образом способствует экспрессии белков, необходимых для G1 и S-фаз клеточного цикла. Тот же митогенный сигнал, который вызвал экпрессию циклина D, также вызывает и экспрессию второго циклина — Е и двух ингибиторов Cdks — р21cip1 и р27kip1. Экспрессия 179 белков-ингибиторв в тот момент, когда клетка входит в новый цикл роста и деления, кажется контрпродуктивной. Тем не менее, р21 и р27 связываются с коплексом циклин D–Cdk4, не ингибируя его киназную активность, и на самом деле оказываются необходимыми для создания этого комплекса и его транспорта в ядро. Напротив, р21 и р27 являются эффективными ингибиторами активности комплекса циклин Е–Cdk2. Таким образом, присутствие этих белков в ранней G1-фазе способствует образованию комплексов циклин D–Cdk4 и, в то же время, задерживает активацию циклин Е–Cdk2 комплексов. Циклин Е-Cdk2 взаимодействует с циклин D–Cdk4/6 в фосфорилировании и инактивации Rb и покет-белков. Двойное фосфорилирование Rb необходимо для полной активации транскрипционной программы S-фазы. После этого с момента точки рестрикции (restriction point) движение клетки по циклу происходит независимо от внеклеточных сигналов. Внутренние или внешние события могут замедлить или предотвратить продвижение клетки по циклу, но если никакого останавливающего это движение сигнала получено не будет, то инициированный клеточный цикл, включая рост, репликацию, сегрегацию и деление клетки, будет продолжаться сам по себе без дальнейших внеклеточных посылов. 5.3. РЕГУЛЯЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ ДНК 5.3.1. Инициация репликации Участок ДНК, на котором синтезируется отдельный фрагмент лидирующей нити, называется репликоном. У многих прокариот их геном содержит только одну точку инициации репликации, то есть у них в ДНК только один репликон. Эукариотические геномы полирепликонны, для них характерно наличие множественных точек начала репликации, разбросанных по хромосоме на расстоянии около 20 т.п.н. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор, пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. 180 Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких, независимо инициированных новосинтезированных нитей. Место начала репликона, в котором происходит инициация репликации, носит название ориджина репликации. Именно ориджин распознается специальными белковыми комплексами и на нем начинается формирование вилки репликации. В соответствии с современными представлениями, репликоны у эукариот распределены в геноме не случайно, а группами (replicon foci). В этих группах, или фокусах, собираются ферменты репликации, которые удлиняют вилки репликации одновременно 10– 100 соседних репликонов. Репликация в них завершается за 45– 60 мин. Активация ориджинов репликации происходит на протяжении всей S-фазы. ДНК-полимеразы не могут начать процесс репликации без помощи других белков. Белки, участвующие в распознавании ориджина и способствующие привлечению к нему праймазы и ДНКполимеразы, образуют комплекс инициации репликации. Инициация репликации у E. coli происходит в единственном ориджине оriС (origin chromosomae) и требует всего шесть белков. У эукариот инициация репликации ДНК — процесс гораздо более сложный. Он начинается с образования комплекса ориджина репликации и белка-инициатора репликации. Белком-инициатором репликации ДНК в клетках эукариот является ORC (origin recognition complex). У всех эукариот ORC образован шестью субъединицами — Orc1–Orc6 (120–50 кДа). Для жизнедеятельности S. cerevisiae существенны все шесть субъединиц комплекса. У S. cerevisiae ORC присоединяется к ориджину в конце митоза, образуя пострепликативный комплекс (post-RС), и остается связанным с ним в последующих клеточных циклах. При этом post-RC существует в фазах S, G2 и М, а в фазе G1 входит в состав пререпликативного комплекса (рге-RС). 181 Пререпликативный комплекс формируется на основе post-RC, этот процесс начинается во всех ориджинах одновременно на границе фаз М и G1 и завершается в конце G1 в ориджинах, активирующихся первыми при переходе в S-фазу. В ориджинах, активирующихся позже в S-фазе, образование prе-RC завершается в соответствующий для каждого из них период S-фазы. В G1-фазе во время сборки pre-RС ОRС способен взаимодействовать с циклинзависимыми киназами (Сdks). Это взаимодействие является одним из механизмов, позволяющих клетке формировать рге-RC после митоза. Первыми к post-RC на границе фаз М/G1 присоединяются белок Сdс6 (cell division cycle protein) и семейство шести белков Mcm 2–7 (minichromosome maintenance proteins). Белки Mcm 2–7 являются наиболее известными среди семейства «поддерживающих минихромосомы» белков, впервые идентифицированных у S. сerevisiae при исследовании мутантов, не способных к поддержанию стабильности мини-хромосом. Белки Мсm 2–7 образуют гексамерный комплекс МСМ ― ключевой компонент рге-RС. МСМ генерирует контрольный сигнал на нереплицированном хроматине для ингибирования преждевременного митоза в G1-фазе. Также он необходим для продвижения клетки по циклу в S-фазу. Белки Сdс6 и Мсm 2–7 описаны у многих представителей эукариот, включая млекопитающих. В отсутствие Сdс6 клетки S. cerevisiae теряют способность инициировать репликацию ДНК и подвергаются «урезанному» митозу и нереплицированные хромосомы сегрегируют случайным образом к полюсам веретена. Способность Сdс6 предотвращать «урезанный» митоз до завершения репликации ДНК обеспечивается его взаимодействием с Cdks. Связывание МСМ с ориджинами репликации необходимо для обеспечения стабильности генома, именно оно переводит хроматин в состояние, за которым закрепилось название «разрешающего» 182 репликацию (replication-liscensing). В G1-фазе к частично сформированному рrе-RC присоединяется киназа Сdc7 со своей регуляторной субъединицей Dbf4 (DNA binding factor 4), а в поздней G1-фазе или на границе фаз G1/S ― белок Сdс45 и связывающий однонитевую ДНК репликативный белок A (RРA, replication protein A). Киназа Dbf4/Cdc7 связывается с ori за некоторое время до того, как начинает выполнять свои функции. Присоединившись к рге-RС, киназа Dbf4/Cdc7 «ждет», когда активируются Cdks, и только после этого фосфорилирует свои субстраты. Роль «раннего» связывания этой киназы с ori пока остается неясной. Связывание Сdс45 с хроматином зависит от белков Сdс6 и Мсm2 и от активности киназы Dbf4/Cdc7 и циклинзависимых киназ S-фазы (Сdk2/Cyclins A, E у высших эукариот). Белок Сdc45 может быть фосфорилирован киназой Dbf4/Cdc7, но это происходит только после активации Cdks-S-фазы. Присоединение белка Сdс45 к рге-RC происходит в поздней G1-фазе клеточного цикла только на ориджинах тех репликонов, которые начинают синтез ДНК первыми при переходе к S-фазе. Cdk-S- и Dbf4/Cdc7-зависимое связывание Cdc45 с остальными ориджинами осуществляется в определенное для каждого из них время на протяжении всей S-фазы. В то же самое время к pre-RC присоединяется белок RPA. Присоединение белков Сdс45 и RPA завершает сборку pre-RC. Сразу после завершения сборки pre-RC происходит частичная его диссоциация, сопровождающаяся началом формирования RC (replication complex). Белок Сdc6 первым диссоциирует из рге-RС при переходе из фазы G1 в S или даже ранее, подвергаясь фосфорилированию под действием Cdks, за которым следуют убиквитинирование и деградация. Этот путь инактивации Сdс6 показан как для низших эукариот, так и для некоторых представителей высших эукариот. В клетках человека уровень Сdc6 остается постоянным на протяжении всего клеточного цикла. Но при переходе в S-фазу Сdс6 транспортируется из ядра в 183 цитоплазму. По всей видимости, и этот процесс регулируется Cdks. Удаление Сdc6 из ядра (путем гидролиза или транспортировки в цитоплазму) является одним из механизмов, предотвращающих множественные акты репликации в течение одного клеточного цикла. RPA является белком, связывающим однонитевую ДНК, и наличие его в RС при инициации репликации необходимо для стабилизирования расплетенного участка ДНК. RРА образован тремя субъединицами с молекулярными массами 70, 34 и 11 кДа, причем активностью, связывающей однонитевую ДНК, обладает субъединица 70 кДа, а субъединица 34 кДа является регуляторной. Последняя фосфорилируется Сdk, что, по-видимому, необходимо для активации репликации ДНК. Белок Сdс45 также участвует в формировании RC. Он необходим для присоединения ДНК-полимеразы α к ориджинам репликации. Из всех многочисленных ДНК-полимераз эукариот именно она содержит праймазную активность, способную синтезировать РНК-праймер. ДНК-полимераза α обнаружена у всех исследованных эукариот и хорошо изучена. Показано, что один из путей регуляции инициации репликации связан с фосфорилированием двух больших субъединиц ДНК-полимеразы α под действием Cdk. При этом циклин Е и Сdk2 стимулируют инициацию репликации при переходе клетки в S-фазу, а циклин A и Сdk2-1 ингибируют ее в фазе G2. Следует отметить, что роль ДНК-полимеразы α ограничивается только запуском репликации ДНК. Она не способна к процессивному, то есть протяженному, синтезу ДНК и не обладает корректирующей активностью. Поэтому в дальнейшем в процессе репликации она добавляет к РНК-праймеру приблизительно 20 нуклеотидов и замещается ДНК-полимеразами δ или ε. Надо учесть, что в клетках эукариот один из механизмов, предотвращающих повторную репликацию уже реплицированного хроматина, связан с инактивацией роst-RС либо путем диссоциации из него Оrс1 (у высших эукариот), либо путем фосфорилирования 184 Оrс2 (у низших эукариот). 5.3.2. Регуляция экспрессии ДНК-полимераз В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНКполимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у соответствующих ферментов прокариот. Сводные данные об основных полимеразах эукариот приведены в таблице 5. Таблица 5. ДНК-полимеразы эукариот ДНКполимераза Дополнительная активность Субъединицы (кДа) Локализация, функция α (альфа) ДНК-праймаза Точность 102– 104 dRp-лиаза,103 165–180 70 48–50, 55–60 38–40 Ядро, репликация (инициация в районе ori и фрагментов Оказаки) Ядро, репарация γ (гамма) 3 →5 экзонуклеаза, dRp-лиаза, 104 125–140 35–50 Митохондрии, репликация и репарация δ (дельта) 3 →5 экзонуклеаза, 105 ε (эпсилон) 3 →5 экзонуклеаза, 105 125–130 Ядро, репликация 48–55 (дрожжи: (элонгация лидирующей 125, 55, 54, 42, 22) нити). PCNA-зависимая репарация 261, 55 Ядро, репликация (дрожжи: 256, (элонгация запаздывающей 870, 34, 31, 29) нити). PCNA-зависимая репарация β (бэта) Пик экспрессии ДНК-полимеразы α — праймазы совпадает с началом репликации ДНК. В комплексе, осуществляющем репликацию лидирующей нити, ДНК-полимераза α связана с ДНКполимеразой δ, а в комплексе, синтезирующем запаздывающую цепь, ― с ДНК-полимеразой ε. У эукариот оба комплекса связаны друг с другом в репликативной вилке подобно тому, как связаны холоферменты синтеза лидирующей и запаздывающей нити у 185 прокариот на рис. 5.1. Об этом свидетельствует выделение из клеток человека комплексов, названных синтесомами и содержащих ДНКполимеразы α, δ и ε, а также ряд других репликативных белков, среди которых ДНК-праймаза, репликативный фактор RFC (replication factor C), РСNА (proliferating cell nuclear antigene), поли(АDР-рибозо)полимераза (PARP), ДНК-геликаза A и ДНК-лигаза I. ДНК-полимераза δ представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы с молекулярной массой 125–130 кДа и субъединицы 48–55 кДа, необходимой для связывания с фактором процессивности РСNА (proliferating cell nuclear antigene). Синтез ДНК-полимеразы δ в клеточном цикле регулируется на уровне транскрипции. Количество мРНК фермента и белка достигает максимума на границе G1/S-фаз. Динамика синтеза ДНК-полимеразы δ в цикле соответствует динамике синтеза ДНК-полимеразы α. Интересно, что синтез PCNA в ходе клеточного цикла коррелирует с синтезом ДНК-полимеразы δ, однако содержание РСNА стабильно увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/М. ДНК-полимераза ε человека содержит два полипептида ― каталитический 261 кДа и 55 кДа. Ферментативные активности ― ДНК-полимеразная и 3'→5'-экзонуклеазная ― связаны с высокомолекулярным полипептидом, N-концевой домен которого обеспечивает обе активности, а С-концевой домен необходим для контроля вступления клетки в S-фазу цикла. Содержание мРНК ДНКполимеразы ε в клеточном цикле изменяется, достигая своего максимума непосредственно перед клеточным делением. Уровень этой мРНК в пролиферирующих клетках в 5–16 раз выше, чем в покоящихся. ДНК-полимераза γ локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией мтДНК. Как и другие ферменты репликации мтДНК, ДНК-полимераза γ кодируется ядерным геномом. Первичная структура ДНК-полимеразы γ сходна со структурой ДНКполимеразы I Е. соli. 186 ДНК-полимераза β является наименьшей по размеру и самой простой по строению ДНК-полимеразой в клетках эукариот. В силу этого она наиболее изучена. Она участвует в процессе эксцизионной репарации оснований. Уровень активности ДНК-полимеразы β не меняется на протяжении клеточного цикла. Однако в присутствии агентов, повреждающих геномную ДНК, может наблюдаться индукция этого фермента, что согласуется с репаративной функцией ДНК-полимеразы β. К настоящему времени описано еще несколько малых ДНКполимераз, участвующих в различных клеточных процессах, в первую очередь ― репарации ДНК. Практически все они являются индуцибельными, и их экспрессия возрастает в ответ на повреждение ДНК. 5.3.3.Регуляция экспрессии ДНК-лигаз ДНК-лигазы (от англ. ligase — соединять, связывать) являются важными ферментами метаболизма ДНК. Они катализируют реакцию объединения концов ДНК, необходимую для репликации и рекомбинации ДНК и для тех путей репарации, при которых есть репаративный синтез. Полинуклеотидлигаза является основным ферментом у E. coli, а высшие организмы производят несколько различных лигаз, имеющих специфические мишени и функции. Лигаза I необходима для сшивания фрагментов Оказаки, поэтому пик ее экспрессии совпадает с таковым у ДНК-полимеразы δ. ДНК-лигаза III имеет несколько изоформ, вовлеченных в процессы репарации и рекомбинации, а ДНК-лигаза IV необходима для V(D)J рекомбинации и негомологичного соединения концов ДНК при воссоединении двунитевых разрывов. Обе эти лигазы являются индуцибельными, и их экспрессия зависит от активности процессов, в которых они участвуют. 187 5.3.4.Белки, влияющие на топологию ДНК. Топоизомеразы и геликазы Для осуществления комплементарного копирования цепей двунитевая ДНК должна постепенно раскручиваться. Раскручивание, или расплетание, спирали происходит только в локальном участке репликативной вилки. Раскручивание не является спонтанным процессом, в нем участвуют особые ферменты — ДНК-геликазы. Геликазы связываются с белками, инициирующими процесс репликации, а затем переходят на молекулу ДНК. Этот фермент движется по одиночной нити ДНК и, встречая участок двойной спирали, разрывает водородные связи между основаниями, разделяет нити и продвигает репликационную вилку, используя для разделения нитей энергию АТФ. Молекулы геликазы часто образуют гексамер, надевающийся на однонитевую ДНК, как кольцо, причем АТФ присоединяются к активному центру каждого мономера последовательно, а не одновременно. ДНК-геликазы движутся вдоль нити со скоростью более 1000 нуклеотидных пар в секунду. Разворачивание матрицы в вилке репликации осуществляют две различные ДНК-геликазы, работающие на разных нитях и, соответственно, в разных направлениях. Процесс раскручивания двойной спирали в репликативной вилке порождает механические и топологические проблемы. Они снимаются путем внесения однонитевого или двунитевого разрыва. Тем самым образуется «шарнир», который дает возможность нереплицированной ДНК, находящейся перед вилкой, вращаться вместе с ней. Эти разрывы вносят в ДНК ферменты, имеющие общее название ДНК-топоизомеразы. Эти ферменты изменяют степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Идентифицированы топоизомеразы двух основных типов. Одни ферменты, называемые топоизомеразами типа I, надрезают одну из двух нитей, в результате чего фланкирующие области могут повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. 188 Топоизомеразы II вносят временные разрывы в обе комплементарные нити, пропускают двунитевой сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В результате внесения двунитевого разрыва и прохождения через него другой двунитевой ДНК за одну реакцию снимаются два отрицательных или положительных сверхвитка. Существует особая топоизомераза II, называемая гиразой, и обнаруженная пока только у бактерий. Эта топоизомераза способна индуцировать образование отрицательных сверхвитков в релансированных кольцевых ДНК. Для этого гираза делает двунитевые надрезы и затем особым способом воссоединяет концы, снимая, таким образом, положительные сверхвитки и внося отрицательные в релаксированную ДНК. У бактерий топоизомераза I и гираза являются ключевыми ферментами, определяющими степень суперскрученности ДНК при ее ответе на стрессовые внешние воздействия, такие как повышение температуры, изменении рН и оксидативный стресс. Сбалансированное действие топоизомеразы I и гиразы у бактерий регулирует степень сверхспиральности ДНК и влияет на скорость движения репликативной вилки. У эукариот экспрессия Тор II является одним из компонентов клеточного ответа на различные типы повреждений ДНК. Эта топоизомераза способна образовывать комплексы с важнейшими регуляторами клеточного цикла, включая Р53, BRCT-содержащий белок TopBP1 и Cdк1-киназу. Ассоциация топоизомеразы II с Cdк1 указывает на начальную раннюю стадию конденсации хроматина в митозе. Регуляция этого взаимодействия, вероятно, является одним из механизмов, влияющих на вступление клеток в митоз. Конденсация хромосом и их сегрегация при переходе в анафазу находятся под контролем белкового комплекса, состоящего из топоизомеразы II и конденсина. 189 5.3.5. Нуклеазы, их классификация и роль в процессе репликации Нуклеазы ― это ферменты, способные к расщеплению ДНК. Если нуклеазы способны внести надрез в интактную ДНК, то они называется эндонуклеазами. Если же для расщепления ДНК им нужен свободный конец или разрыв, то они называется экзонуклеазами и, в зависимости от того, с какого конца они это делают, различаются 3'→5' и 5'→3' экзонуклеазы. Большинство ДНК-полимераз обладают не только полимеразной, но и экзонуклеазной активностью (см. табл. 5). Такие экзонуклеазы называются корректирующими. Но часто в клетке для коррекции новосинтезированной ДНК привлекаются многочисленные автономные экзонуклеазы. Эти экзонуклеазы способны отщеплять неправильный нуклеотид, образуя (или не образуя) комплекс с ДНК-полимеразами. Все виды экзонуклеазной коррекции должны закончиться за время репликации. По-видимому, коррекция ДНК-полимеразных ошибок ― весьма эффективный процесс, поскольку анализ генома человека показал, что дивергенция последовательностей в транскрибируемой ДНК составляет примерно 0,1 % при исследовании ДНК от 24 человек различных этнических групп. 5.3.6. Метилирование ДНК. Роль метилаз семейства DCMT. Кроме того, что ДНК связана с различными белками, она также подвергается и различным модификациям, в первую очередь — метилированию. Нити образовавшихся при репликации молекул ДНК в течение какого-то периода времени различаются между собой: материнская нить метилирована, а дочерняя — нет. Процесс репликации ДНК сопровождается обязательным последующим метилированием дочерней ДНК. При изучении этого процесса был обнаружен СрG-тип метилирования ДНК животных и растений, а также СрNрG-тип (N — любой нуклеозид) метилирования ДНК высших растений. 190 В настоящее время установлено участие метилирования ДНК эукариотических организмов в регуляции транскрипции генов, клеточной дифференцировке и эмбриональном развитии, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. Существенные успехи в исследовании функций метилирования ДНК достигнуты после открытия белков, связывающихся с метилированными СрG-последовательностями ДНК и мобилизующих в эти участки гистоновые деацетилазы, которые формируют транскрипционно неактивную структуру хроматина, т. е. метилирование ДНК и деацетилирование гистонов могут быть прочно сопряжены с формированием нетранскрибируемой структуры хроматина. Цитозин(С5)-ДНК-метилтрансферазы катализируют перенос метальной группы с 3-аденозилметионина на остатки цитозина в специфических последовательностях двунитевой ДНК с образованием 5-метилцитозина и 5-аденозилгомоцистеина. Эта реакция необратима. Эукариотические ДНК-металазы осуществляют метилирование цитозина в полуметилированной реплицирующейся ДНК в симметричных последовательностях CpG и CpNpG. Это соответствует полуконсервативному (как и синтез ДНК) типу наследования картины метилирования родительской ДНК, называемому поддерживающим метилированием. Метилирование полностью неметилированных последовательностей ДНК, называеется метилированием de novo. Описано несколько типов метилаз, участвующих в СрGметилировании. ДНК-метилаза эукариот Dnmt1 ассоциирована с областью репликации ДНК в течение S-фазы и распределена диффузно в нуклеоплазме в клетках, находящихся вне S-фазы, она является компонентом репликативного комплекса. На это указывает, 191 в частности, способность фермента связываться с PCNA. Dnmt1 человека может избирательно узнавать и метилировать полуметилированные асимметричные двунитевые ДНК, несущие «целевую мишень» CpG на одной цепи и спаренный с ней метилированный цитидиновый остаток в комплементарной цепи. Инактивация гена мышиной метилазы Dnmt1 приводит к значительному (до 70 %) снижению общего уровня метилирования генома и к гибели развивающихся эмбрионов. Метилирование ДНК de novo выполняют ДНК-метилазы Dnmt3а и Dnmt3b. На функцию метилирования ДНК de novo этих белков указывает значительное уменьшение их активности в зрелых соматических тканях. Высокая экспрессия генов DNMT3A и DNMT3B отмечена в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках. В этих клетках метилазы Dnmt3a и Dnmt3b играют важную роль не только в установлении, но и в поддержании обшей картины метилирования ДНК. В то же время в этих дифференцирующихся клетках и в соматических тканях взрослого организма экспрессия этих генов крайне мала. Инактивация генов DNMT3A и DNMT3B в эмбриональных стволовых клетках приводила к потере способности метилировать ретровирусную ДНК de novo. Эти гены существенны также для нормального постэмбрионального развития мышей: дефектные по ним генам животные погибали спустя четыре недели после рождения. Хотя ферменты Dnmt3а и Dnmt3b выполняют сходные или перекрывающиеся функции, они проявляют и специфические различия. Так, метилаза Dnmt3b отвечает за метилирование центромерных линкерных сателлитных повторов и мутации гена DNMT3B у человека приводят к развитию ICF-синдрома (immunodeficiency, centromeric instability, facial anomalies). IСFcиндром — редкое аутосомное рецессивное заболевание, характеризующееся различными иммунологическими дефектами и аномальным строением лица. Он связан с нестабильностью 192 центромерного гетерохроматина. При IСF-синдроме отмечается гипометилирование сателлитных ДНК II и III ― главных компонентов конститутивного гетерохроматина. Важно отметить присутствие в клетках млекопитающих особого белка семейства Dnmt3, обозначенного как Dnmt3L. Этот белок не проявляет собственной метилтрансферазной активности, но и напрямую взаимодействует ДНК-метилазами Dnmt3а и Dnmt3b стимулирует их активность. Установлена совместная локализация всех белков семейства Dnmt3 в ядре и необходимость наличия Dnmt3L для регуляции метилирования ДНК de novo и установления геномного импринтинга. Следует отметить, что в ассоциации с гистоновой деацетилазой Dnmt3L выполняет также функцию транскрипционного репрессора. В связи с участием метилирования ДНК в переключении различных генетических программ клетки, должны существовать и механизмы регуляции экспрессии и модуляции активности самих ДНК-метилаз. В нормальных тканях человека показана скоординированная транскрипция генов ДНК-метилаз DNMT1, DNMT3A и DNMT3B, однако она нарушена в опухолях. При этом на фоне умеренного повышения экспрессии генов DNMT1 и DNMT3А наблюдается значительное повышение экспрессии гена DNMT3B. Сложная структура генов эукариотических ДНК-метилаз и кодируемых ими белков предполагает наличие у них разнообразных регуляторных элементов. На генном уровне одним из способов регуляции экспрессии этих генов является альтернативный сплайсинг (см. разд. 3.1.5.4) и транскрипция с разных промоторов. Так, ген DNMT1 мыши (>56 тпн) состоит из 39 экзонов размером от 32 до 352 п.н. Большая изоформа ДНК-метилазы Dnmt1 транслируется с третьего АТG-кодона первого экзона. Она присутствует в эмбриональных стволовых клетках и соматических тканях, а короткая изоформа транслируется с четвертого АТG-кодона четвертого экзона и обнаружена в ооцитах и доимплантационных эмбрионах. 193 Два секс-специфических экзона гена DNMT1 контролируют его экспрессию в ооцитах млекопитающих. Вероятно, различные изоформы ДНК-метилаз могут обладать разной субстратной специфичностью. Транскрипция человеческого гена DNMT1 может происходить с одного главного и трех минорных участков инициации и регулироваться независимыми промоторами и энхансерами, что соответствует существованию различных изоформ этого фермента в зародышевых и соматических клетках. Область главного промотора гена DNMT1 Р1 отличается высоким содержанием последовательностей СрG, а область минорных промоторов Р2— Р4 ― дефицитом этих последовательностей. Метилирование самого ДНК-метилазного гена может регулировать его экспрессию. В эмбриональных стволовых клетках мышей с высокой экспрессией гена DNMT1 все динуклеотиды СрG в его промоторной области не метилированы, в то время как в дифференцированных клетках и тканях они метилированы. Между промоторами Р1 и Р2—Р4 расположены три энхансера, активируемых протоонкогенным сигналом Ras-с-jun и репрессируемые супрессором опухолей Rb. Таким образом, регуляция транскрипции гена DNMT1 играет существенную роль в реализации нормальных и онкогенных программ клетки. Выдвинута гипотеза о регуляции экспрессии гена DNMT1 по принципу обратной связи. Эта гипотеза объясняет парадоксальное явление сосуществования в раковых клетках общего недометилирования ДНК и высокого уровня ДНК-метилазной активности. 5.4. ПРОЦЕССЫ РЕКОМБИНАЦИИ И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ 5.4.1. Типы рекомбинации и их роль в жизни клетки и организма Генетическая рекомбинация включает несколько связанных между собой процессов, в результате которых в клетках или организмах, где они происходят, создаются новые комбинации 194 элементов — носителей генетической информации. Чаще всего мы говорим о рекомбинации при описании процесса кроссинговера, во время которого рекомбинация между гомологичными хромосомами приводит к интенсивной перетасовке отцовских и материнских генов в ходе мейоза. Рекомбинация может происходить и в соматических клетках, где она проявляется обычно в виде обменов сестринских хроматид, которые не приводят к изменению генотипа или фенотипа клетки. Также рекомбинация бывает часто вовлечена и в процессы репарации. Существуют три типа рекомбинации: 1) общая, или гомологическая; 2) сайт-специфическая; 3) случайная, или негомологичная. Рекомбинация, включающая обмены между гомологичными последовательностями ДНК, называется общей, или гомологической, рекомбинацией. Именно она вовлечена в различные процессы ДНКметаболизма. Два других типа рекомбинации, с помощью которых бактериальные вирусы и мобильные элементы перемещаются по геному, происходят под контролем ферментов, опознающих специфические последовательности нуклеотидов, присутствующие на одной или двух рекомбинирующих молекулах. 5.4.2. Белок RecA E. coli и его роль в гомологической рекомбинации У прокариот известны ферменты, вовлеченные в каждый этап гомологической рекомбинации, и кодирующие их гены, имеющие название rec (recombination). Мутации этих генов фенотипически проявляются в неспособности к рекомбинации. У Е. coli описаны два механизма гомологичной рекомбинации. Один ― RecA-зависимый, то есть основанный на уникальных свойствах АТФ-зависимой синаптазы ― белка RecA, другой ― RecA-независимый, ключевым ферментом которого является АТФ-независимая аннилаза ― белок RecT. Мы остановимся подробно на RecA-зависимой рекомбинации, 195 так как именно этот тип рекомбинации оказался тем механизмом, эволюция которого привела к появлению особой системы репарации двунитевых разрывов у эукариот. У Е. coli в рекомбинацию, проводимую белком RecA, вовлечено более 20 белков. Рекомбинация инициируется переходом белка RecA в активную форму RecA*, представляющую собой тройной комплекс RecA::АТФ::oнДHK, образующийся при полимеризации отдельных молекул RecA на однонитевой ДНК в присутствии АТФ. То есть онДНК выступает в качестве «затравки» процесса, и для экспрессии RecA необходимо наличие однонитевой ДНК, которая обычно появляется при повреждении. Гомологическая рекомбинация может быть инициирована как двунитевыми разрывами ДНК, так и однонитевыми брешами. Химические препараты или облучение, приводящие к образованию однонитевых разрывов, будут стимулировать рекомбинацию. В принципе инициировать рекомбинацию в клетке может любая онДНК. Однако в нормальной клетке баланс ферментов таков, что образующиеся в ходе репликации однонитевые пробелы (между фрагментами Оказаки) не являются рекомбиногенными. Рис. 5.2. Белок RecA организует трехнитчатую структуру ДНК Дальнейшее развитие процесса гомологической рекомбинации у E. coli протекает следующим образом. Нить ДНК, покрытая белком RecA, растягивается, филамент RecA::ATP::oнДHK имеет 196 спиральную структуру и способен втягивать внутрь своей спирали молекулы днДНК партнера с образованием трехнитевой структуры (рис. 5.2), в которой и разыгрывается основной акт рекомбинации ― переключение комплементарного спаривания, приводящее к «переносу» одной из нитей вошедшей ДНК на онДНК, находящуюся внутри филамента. Как видно, небольшой по размеру белок RecA (у бактерий его молекулярная масса составляет 38 кДа) полифункционален: он взаимодействует с АТФ, образует филамент на онДНК, взаимодействует с днДНК, осуществляет гомологичный синапс молекул ДНК и перенос нити. В ходе взаимодействия с АТФ и онДНК белок претерпевает конформационные изменения, а в реакции переноса нити он использует свою ДНК-зависимую АТФазную активность, которая особенно необходима при взаимодействии областей ДНК с несовершенной гомологией. В белке RecA имеется несколько сайтов связывания с ДНК, поэтому он может удерживать одинонитевую и двунитевую цепи ДНК вместе. Эти сайты позволяют белку RecA катализировать многоступенчатую реакцию (называемую синапсисом) между двунитевой молекулой ДНК и гомологичными районами однонитевой. В результате образуется особая трехнитевая структура ДНК. Затем короткий гетеродуплексный участок, в котором нити из двух различных молекул начали спариваться, увеличивается из-за «миграции ветви» с образованием D-петли (deplacement loop). «Миграция ветви» может происходить в любой точке, где две одиночные цепи ДНК, имеющие одинаковые последовательности, конкурируют за возможность спариваться с одной и той же комплементарной нитью. Неспаренный участок одной из одиночных нитей заменяется спаренным районом другой, двигая точку ветвления. Спонтанное движение ветви равновероятно в любом направлении. Поскольку белок RecA катализирует однонаправленное движение ветви, это создает район гетеродуплекса длиной в несколько тысяч пар оснований. Такое расширение спаренного участка за счет миграции ветви ДНК осуществляется геликазами RuvAB и (или) RecG. «Миграция ветви» 197 приводит к вытеснению лишней нити ДНК, которая, в свою очередь, спаривается с комплементарной нитью партнера по рекомбинации, что приводит к образованию структуры Холлидея ― четырехнитевой структуры ДНК, у которой две нити одной полярности находятся в перекресте. В этой структуре две гомологичные молекулы ДНК, которые раньше были спарены, теперь удерживаются вместе за счет сформировавшихся обменов между двумя из четырех цепей: по одной из каждой молекулы ДНК. Структура Холлидея имеет две особенности: 1) точка обмена между цепями может быстро мигрировать вперед и назад; 2) она состоит из двух пар цепей — одна пара пересекающихся и одна пара непересекающихся. Третья стадия ― «разрешение структуры Холлидея». Эту стадию осуществляет топоизомеразный комплекс RuvABC. Вначале эндонуклеаза RuvC (субъединица этого топоизомеразного комплекса) вносит координированные разрывы в нити ДНК одной полярности, затем разрывы зашиваются, молекулы ДНК расходятся, и процесс перетасовки генетического материала завершен. 5.4.3. Белок Rad51 и другие гомологи RecA у эукариот Главная роль гомологической рекомбинации у эукариот (кроме мейоза) ― это воссоединение двунитевых разрывов ДНК и участие в пострепликативной репарации. Двунитевые разрывы ДНК являются самыми опсными для развития тяжелых генотоксических эффектов ― разрывов хромосом, их перестроек и клеточной гибели. У высших эукариот один нерепарированный двунитевой разрыв в важном гене может привести к гибели клетки путем апоптоза. Рекомбинационную репарацию (это словосочетание является, по сути, синонимом гомологической рекомбинации у эукариот) этих разрывов контролирует ряд генов, принадлежащих к эпистатической группе RAD52 (radiation), среди которых особое место принадлежит гену RAD5I, так как его продукт структурно и функционально гомологичен бактериальному белку RecA. Другие гены, принадлежащие к этой группе, также кодируют белки структурно 198 сходные с белком RecA. К их числу относятся гены Dmc1, Rad55 и Rad57 (последний, правда, кодирует белок более сходный с белком Rad51, чем с RecA). Но только Rad51 обладает способностью катализировать АТФ-зависимое гомологичное спаривание и обмен нитей ДНК в реакции переноса нити in vitro подобно тому, как это делает RecA. Так же, как RecA требует присутствия в реакции белка SSB, Rad5l требует присутствия его эукариотического аналога ― фактора репликации RPA. Вероятно, подобно RecA, RAD51 функционирует в комплексе с другими белками, облегчающими его взаимодействие с однонитевой и двунитевой ДНК. Такой комплекс с Rad51 могут, например, образовывать белки Rad52, Rad54, Rad55 и Rad57. Белки, подобные Rad5l дрожжей, выявлены у грибов, у растений, птиц и млекопитающих, включая человека. У млекопитающих они найдены в мейотическом хроматине и в составе синаптонемного комплекса. 5.4.4. SOS-ответ на повреждение ДНК у E. coli. Экспрессия генов SOS-регулона Ошибки в ДНК возникают в результате неточной работы трех различных систем: подбора оснований полимеразами (base selection), редакторской 3'–5'-экзонуклеазы (proofreading) и репарации неправильно спаренных оснований (mismatch correction). Все это называется «спонтанный мутагенез», так как ошибки ДНКполимеразы присущи самому организму, а не индуцируются извне. Однако частоту мутаций можно значительно повысить, если организм обработать каким-либо ДНК-тропным агентом, например химическим веществом, ионизирующим или ультрафиолетовым излучением. Этот эффект называется индуцированным мутагенезом, а его механизм зависит от природы повреждения ДНК. Все дефекты в ДНК удобно разбить на два класса: модифицированные азотистые основания, не блокирующие работу ДНК-полимеразы, и летальные дефекты, блокирующие работу ДНК-полимеразы. В первом случае ДНКполимераза узнает дефектное основание и ставит напротив него 199 комплементарное звено (например, при окислении аминогруппы цитозина, комплементарного гуанину, образуется азотистое основание с кетогруппой в четвертом положении, комплементарное аденину, в результате возникает транзиция G→А). Подобного типа дефекты носят исключительно мутагенный характер, а мутагены, индуцирующие в ДНК такие дефекты, широко используются на практике. Более сложная ситуация возникает, если в ДНК индуцируются летальные дефекты, блокирующие ДНК-полимеразу, например апуриновые/апиримидиновые сайты (abasic sites, или АР-сайты), циклобутановые пиримидиновые димеры (Рyr–Рyr) и др. В этом случае в бактериальной клетке возникает особое состояние, получившее название SOS в соответствии с известным морским сигналом. Ключевыми элементами SOS-системы являются белки RecA и LexA. RecA уже известен нам по процессу рекомбинации, а LexA-репрессор генов (их количество около 30–40), входящих в состав SOS-регулона ― группы генов, вовлеченных в ответ на повреждение ДНК и имеющих общую регуляцию экспрессии. LexA связывается со специфическим десятичленным палиндромом в регуляторных областях генов SOS-регулона и таким образом препятствует их транскрипции. Чем выше совершенство каждого данного палиндрома, тем крепче связан с ним репрессор LexA. Белок RecA выполняет несколько функций. Во-первых, он имеет высокое сродство к однонитевой ДНК, поэтому при взаимодействии с онДНК образуется растянутый филамент RecA:ДНК (один мономер RecA на каждые 4 н. ДНК). Во-вторых, RecA в этом комплексе активируется (активированный RecA обозначают обычно RecA*) и приобретает свойства весьма специфической протеазы, деградирующей белок-репрессор LexA (точнее, ускоряющей авторасщепление белка LexA, то есть он может быть назван его копротеазой). В результате разрушения LexA открываются гены SOS-регулона, из которых два гена, umuD и umuC 200 (under mutated), имеют прямое отношение к индуцированному мутагенезу. При взаимодействии RecA* с UmuD с N-конца UmuD отщепляются первые 24 аминокислотных остатка, и образуется белок UmuD', который и принимает непосредственное участие в SOSмутагенезе. Итак, в SOS-индуцированных клетках Е. coli в области повреждения формируется особая структура ДНК: вплоть до дефектного нуклеотида, остановившего репликативную вилку, расположена двунитевая ДНК, с 3'–ОН-концом последнего правильного нуклеотида которой связана ДНК-полимераза III, затем идут дефектный нуклеотид в матричной нити и однонитевая ДНК в виде филамента (RecA*:ДНК). Есть еще два уже упомянутых белка ― UmuD' и UmuC, которые образуют комплекс (UmuD')2UmuC. Основная задача этого комплекса ― «проскочить» сложный дефект и, желательно, без потерь, то есть без формирования бреши напротив дефекта. Подобный вариант синтеза носит наименование TLS (translesion synthesis). Как правило, TLS сопровождается включением во вновь синтезируемую нить нуклеотида, некомплементарного исходному основанию в матрице. В результате возрастает выживаемость клетки (SOS-репарация) и возникает мутация (SOSмутагенез). При реконструкции этого процесса в системе in vitro было показано, что очищенный комплекс (UmuD')2UmuC в присутствии белков RecA, АТФ и всех четырех dNTP самостоятельно ведет синтез ДНК, причем напротив G (перед дефектом) ставит C (dCTP, комплементарный синтез), а напротив X ставит случайный нуклеотид, то есть что этот комплекс является самостоятельной ДНКполимеразой. Эффективность TLS (но не комплементарного синтеза) принципиально зависит от белка RecA и значительно усиливается при добавлении в смесь белка, связывающего однонитевую ДНК (SSB), и вспомогательных субъединиц ДНК-полимеразы III. В комплексе (UmuD')2UmuC собственно полимеразной активностью обладает 201 UmuC, а субъединица (UmuD')2 является ее активатором. Показано, что механизм SOS-мутагенеза позволяет клетке заменить мутацию со сдвигом рамки (инсерция или делеция нуклеотида), как правило, инактивирующую ген, на более «мягкую» по последствиям мутацию замещения (транзицию или трансверсию). В последнее время получен ряд новых, принципиально важных результатов по регуляции SOS-системы in vivo. Оказалось, например, что белок UmuD расщепляется сериновой АТФ-зависимой Lonпротеазой, а процессированный белок UmuD', у которого удалены с N-конца 24 аминокислотных остатка, в том числе фрагмент 15-FPLF, являющийся мишенью для Lon-протеазы, расщепляется (в комплексе с геликазой UvrD) другой клеточной сериновой АТФ-зависимой протеазой ClpXP. К тому же белки RecA и LexA также являются членами SOS-регулона. В результате после SOS-индукции в бактериальной клетке довольно быстро восстанавливается уровень белков SOS-peгулона, характерный для необработанных клеток. Интенсивность SOS-ответа клетки зависит от степени повреждения ДНК, так как только большое количество однонитевой ДНК позволяет активироваться RecA белку в количестве, достаточном для открытия SOS-регулона. Так как белок RecA связывается c LexA в том же сайте, в котором происходит его связывание с двунитевой ДНК, то при запуске SOS-ответа белок RecA не активирует процесс гомологической рекомбинации. В норме при гомологичной рекомбинации SOS-ответ также выражен слабо. Каким же образом RecA* делает выбор между запуском SOSответа и инициацией гомологичной рекомбинации? Вероятно, все зависит от ситуации в клетке: быстрая диссоциация белка SSB от онДНК, то есть быстрое формирование комплекса белка RecA с онДНК приведет к SOS-ответу, который индуцирует также и синтез ряда рекомбинационных ферментов. Медленное формирование тройного комплекса завершается только гомологичной рекомбинацией со слабой SOS-индукцией. 202 Скорость сборки комплекса зависит и от рекомбиногенной активности самого белка RecA. 5.4.5. Мейотическая рекомбинация у эукариот и ее регуляция. В 1922 году был описан первый ген кроссинговера «запиратель кроссинговера Гоуэна» С(3)G у дрозофилы. К настоящему времени специфических генов мейоза (мей-генов) у дрожжей выявлено 360, а у дрозофилы — 82. Это ферменты мейотической рекомбинации, структурные белки хромосом, белки кинетического аппарата мейоза. 5.5. Репарация ДНК 5.5.1. Фундаментальная роль процессов репарации ДНК в функционировании клеток и организмов Большинство повреждений ДНК не являются результатом только ошибок репликации. Множество повреждений возникает в любое время клеточного цикла под действием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Основные типы повреждений ДНК опознаются и устраняются различными системами репарации. Ультрафиолетовые лучи вызывают образование пиримидиновых димеров, 6,4-фотопродуктов, аддуктов, разрывов и прочие повреждения ДНК. Под действием химических агентов происходят разного рода модификвции нуклеотидов, возникают межнитевые сшивки, конформационные дефекты. Двунитевые разрывы могут приводить к перестройкам хромосом, что и является главной причиной летального действия ионизирующей радиации. В результате внутриклеточных процессов в ДНК образуются многочисленные АP-сайты из-за спонтанной утраты пуринов/пиримидинов, окисленные участки (например, 8оксигуанин), возникающие под действием токсических радикалов, постоянно генерируемых в процессах метаболизма. 203 Следует заметить, что любое повреждение вызывает локальное изменение структуры ДНК вокруг себя, а разрывы ДНК почти всегда сопровождаются и модификацией прилежащих к ним оснований. Различные системы репарации ДНК способны исправлять определенные типы повреждений. 5.5.2. Типы процессов репарации и механизмы регуляции их активности Системы репарации ДНК крайне разнообразны ― от простых одноэтапных (фотореактивация, деалкилирование) до сложнейших, многоэтапных механизмов, контролируемых большим числом генов и включающих, соответственно, большое число белков. Этим репарация принципиально отличается от процессов репликации и рекомбинации, обходящихся существенно более ограниченным набором биохимических реакций. Множественность частично перекрывающихся и дополняющих друг друга систем репарации, даже некоторая их избыточность, повышает надежность защиты генома и расширяет возможности обеспечения его работы в онтогенезе и при различных физиологических условиях. Классификация процессов репарации ДНК строится на тех реакциях, которые являются их основой. Выделяются реакции прямой репарации, системы эксцизионной репарации ДНК, репарация с привлечением рекомбинации, пострепликативная репарация, репарация двунитевых разрывов, репаративный обход повреждения, причем иногда один и тот же тип репарации может иметь несколько разных названий. В результате исследований последних лет эта классификация менялась и уточнялась, что мы в дальнейшем будем учитывать. 5.5.3. Прямая репарация Самый простой и эффективный путь восстановления поврежденных нуклеотидов в составе ДНК ― это прямое обращение тех химических реакций, индуцированных химическими или 204 физическими агентами, результатом которых стало данное повреждение. Такой способ устранения повреждений принято называть прямой репарацией. К сожалению, с помощью реакций этого типа может быть исправлено только ограниченное число повреждений. Реакциями прямой репарации являются фотореактивация, репарация с помощью метилтрансфераз (репарация алкилированного гуанина), прямая вставка пуринов инсертазой и прямое зашивание однонитевых разрывов полинуклеотидлигазой. Фотореактивация ― первый из описанных (еще до появления модели ДНК Уотсона и Крика) процессов репарации, поэтому на истории его открытия мы подробно остановимся. Намек на то, что живые клетки способны выживать после действия летальной дозы УФ-облучения появляются в научном сообществе чуть раньше середины 1930-х годов. Разразившаяся Вторая мировая война задержала открытие этого механизма ДНК-репарации повреждений, возникающих в результате УФ-облучения, до конца 1940-х, до независимых одновременных наблюдений Альберта Кельнера (эмигранта из Германии), работавшего в группе Милислава Демерека в лаборатории Колд-Спринг-Харбора, и Ренато Дальбекко из лаборатории Сальватора Лурии в университете Индианы. В 1949 году немецкий генетик Альберт Кельнер, бежавший из гитлеровской Германии в США, обнаружил, что в клетках бактерий и грибов, таких, как стрептомицеты и пенициллы, облученных ультрафиолетовым (УФ) светом, а затем перенесенных на видимый свет, частота мутаций падает, а выживаемость резко возрастает по сравнению с клетками, оставленными после облучения в темноте. Кельнер пришел к выводу, что на свету проходят реакции восстановления, и какие-то поврежденные молекулы или части их возвращаются к норме. Нужно подчеркнуть, что в 1949 году большинство генетиков еще не понимали ведущей роли ДНК в наследственности, имели весьма смутные представления о структуре хромосом и даже не знали, что дрожжи и другие грибы являются 205 эукариотами. Поэтому объяснение, данное Кельнером восстановлению повреждений на свету, было по-настоящему пионерским. Макс Дельбрюк, другой эмигрант из Германии, будущий Нобелевский лауреат, подсказал Кельнеру название для описанного им явления — фотореактивация. В том же 1949 году сходный процесс был найден независимо Р. Дальбекко у бактериофагов. Ни Кельнер, ни Дальбекко не занимались изучением повреждений ДНК или их репарацией. Они оба использовали УФ-облучение как экспериментальный инструмент и заметили неожиданно высокие уровни выживаемости, когда клетки или бактериофаги после УФоблучения в результате лабораторной ошибки во время их исследований в соответствующих лабораториях оказались на свету. Старания объяснить эти поразительные наблюдения привели к открытию феномена фотореактивациии, когда полученные при облучении УФ-светом ДНК-повреждения репарируются в реакции со светозависимым ферментом. Кельнер считается первооткрывателем фотореактивации потому, что именно он пришел к выводу, что за процесс исправления ответственна простая реакция в наследственном аппарате. Этот вывод был сделан еще до постулирования существования ДНК в виде двойной спирали и признания за ней функции главной наследственной молекулы. Процесс фотореактивации состоит в том, что тиминовые димеры, возникшие в результате УФ-облучения, разрушаются, и тимины возвращаются к своей исходной форме под действием видимого света. Что же такое представляет собой пиримилиновый димер? В 1960 году голландские ученые Р. Бьюкерс и У. Верендс изучили химию процесса повреждения нуклеиновых кислот УФсветом и выделили продукт, специфический для данного повреждающего агента. Оказалось, что двойная связь между пятым и шестым атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине в ДНК и цитозине и урациле в РНК) под 206 действием УФ-света может рваться. Атомы остаются связанными одиночной связью, а в результате разрыва другой связи образуются две свободные валентности. Обычно ДНК в клетках находятся в так называемой В-форме, когда плоскости оснований параллельны друг другу и расстояние между плоскостями равно примерно 3.4 Å. Это расстояние оказывается как раз таким, чтобы освободившиеся при УФ-облучении валентности между С5=С6 атомами пиримидпновых оснований, расположенных рядом в цепи ДНК, могли замкнуться друг на друга и сформировать более сложное, так называемое циклобутановое кольцо. Довольно часто употребляют и другой термин для их обозначения — пиримидиновые димеры. Сущность процесса фотореактивации заключается в том, что фермент фотолиаза расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними основаниями и восстанавливает нативную структуру ДНК. В 1963 году фотолиаза E. coli была выделена и очищена. Фотолиазы были найдены у бактерий, дрожжей, дрозофилы, ксенопуса, иглокожих, но не у высших млекопитающих, включая человека. Эти белки являются мономерами с молекулярной массой 55–70 кДа, имеющими два нековалентно связанных хроматофора: первый хроматофор это флавин, а второй ― фолат (или дезафлавин). Фотолиаза светонезависимым образом (то есть в темноте) связывается с вызванным УФ-облучением повреждением ДНК. Сама же реакции репарации является светозависимой. Фотолиаза может восстанавливать как пиримидиновые димеры, так и (6–4) фотопродукты — другой тип повреждения ДНК, обычно возникающий под действием УФ-облучения. При образовании этого фотопродукта новые связи возникают между 6 и 4 атомами углерода соседних оснований, оно менее устойчиво, чем пиримидиновые димеры, и поэтому не является такой удобной экспериментальной моделью и несколько хуже изучено. 207 После расщепления связей в поврежденных основаниях и восстановления их формы фотолиаза отходит от ДНК. Прямое восстановление структуры ДНК на этом завершено. Это единственная пока найденная репаративная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. У человека белки — гомологи фотолиаз участвуют не в процессах репарации, а в регуляции циркадного ритма. Были клонированы гены hCry1, hCry2, mCry1, mCry2 (human/mouse circadian rythm). Гены Cry представляют собой очень интересный пример эволюционного изменения функции репарационных генов. Вторым важным типом прямой репарации является репарация О6-алкилированного гуанина с помощью специфических метилтрансфераз. В 1944–1948 годах выдающийся советский генетик И.А. Рапопорт нашел новый класс химических мутагенов, способных добавлять к взаимодействующим с ними молекулам алкильные (метиловые, этиловые, пропиловые, бутиловые) боковые группы, и назвал их алкилирующими агентами. В конце 60-х годов стало ясно, что обработка клеток алкилирующими агентами вызывает, в зависимости от агента, N- или О-алкилированние пуринов и пиримидинов, а также трифосфатов. Один из наиболее мощных алкилирующих мутагенов, метил-нитро-нитрозогуанидин, может алкилировать гуанин, присоединяя метальную группу к кислороду, связанному с шестым атомом кольца. Полученный продукт был назван О6-метил-гуанином. В 1978–1979 годах генетики и биохимики обнаружили, что метильная группа может отщепляться от гуанина и тогда происходит прямое восстановление структуры ДНК в этой точке. В 1982–1988 годах было установлено, что такой же механизм функционирует при репарации О4-алкилтимина. Последующие исследования показали, что в клетках млекопитающих есть целый класс метилтрансфераз, которые могут 208 захватывать метальные группы от модифицированного гуанина, переносить их с поврежденного основания на цистеин метилтрансферазы и благодаря этому восстанавливать исходную структуру ДНК. При этом сами метилтрансферазы инактивируются. Например, фермент, кодируемый геном ada (Об-метил-гуанинтрансфераза), распознает Об-метилгуанин в ДНК и удаляет метильную группу, возвращая основание в исходную форму. Репарацией О4-алкилтимина ведает О4-метил-тимин-ДНКметилтрансфераза. Если для каждого акта прямой репарации О6метилгуанина или О4-алкилтимина нужна новая молекула белка, клетка вынуждена запускать синтез новых его порций. Обычно для обеспечения репарации внутри клетки их накапливается несколько тысяч, по одной молекуле уходит на каждое повреждение. Если процесс возникновения новых повреждений в ДНК идет медленнее, чем синтез новых порций метилтрансфераз, то последних хватает на захват всех метильных групп в гуанинах, и мутации не возникают. Если же скорость внесения новых повреждений превышает скорость синтеза метилтрансфераз, последние перестают справляться со всеми повреждениями, и в клетках накапливаются метилированные основания и предшественники. В минуту в клетке Е. coli может синтезироваться порядка 100 молекул метилтрансфераз. Следовательно, мутации не возникнут, если скорость возникновения повреждений будет меньше 100 в минуту. Для сравнения: кишечные палочки делятся каждые 30 минут и, таким образом, клетка за один клеточный цикл может накопить не более 3000 метилтрансфераз. Необходимо отметить, что О6алкилгуанины являются одними из самых значимых повреждений, несмотря на то, что их общее количество среди всех повреждений ДНК, вызванных алкилированием меньше 8 %. В основном это О6метилгуанин и О6-этилгуанин, основания, способные к неправильному спариванию и являющиеся основной причиной возникновения транзиций GC—AT. К тому же именно эти 209 повреждения не удаляются другими системами репарации, а при действии репарации неспаренных оснований (missmath repair, MMR), приводят к возникновению двунитевых разрывов. Другим столь же серьезным предмутационным алкилированным основанием является крайне редко появляющийся О4-метилтимин ― всего менее 0.4 % среди всех вызванных алкилированием повреждений. То есть в случае двух данных повреждений при инактивации или подавлении их прямого восстановления с участием метилтрансфераз, другие системы репарации окажутся бесссильны. В человеческих клетках О6-алкилированные повреждения могут быть восстановлены в прямой реакции О6-метилгуанин-ДНКметилтрансферазой (MGMT), которая является гомологом продукта гена ada (ADA) E. coli. Человеческий MGMT ген картирован на 10q26 и кодирует белок с молекулярным весом в 24 кД, состоящий из 207 аминокислотных остатков. Этот белок переносит метил или хлорэтил из поврежденного гуанина на остаток цистенина в своем активном центре. Активность MGMT была измерена в различных тканях человека, как нормальных, так и опухолевых и было показано, что его экспрессия, особенно в опухолевых тканях, может быть различной. Клетки, дефектные по этому гену, не способны к репарации О6-алкилгуанина, в них резко повышен уровень мутаций, вызываемых алкилирующими агентами, сестринских хроматидных обменов и хромосомных аберраций. Мыши, нокаутные по MGMT, жизнеспособны, но у них резко повышено количество спонтанно возникающих опухолей и они чувствительны к действию алкилирующих агентов. Напротив, у мышей с оверэкспрессией MGMT спонтанные опухоли развиваются значительно реже, чем у контрольных. MGMT был первым геном млекопитающих, у которого была показана экспрессия, индуцированная действием генотоксического стресса и глюкокортикоидов, приводящая к адаптивному ответу клетки на мутагенное и токсическое действие простых алкилирующих агентов. 210 Экспрессия MGMT регулируется метилированием как самого гена, так и его промотора, причем метилирование промотора приводит к ее ингибированию, а метилирование самого гена к повышению экспрессии MGMT. С метилированием MGMT также связана повышенная устойчивость к действию алкилирующих агентов. Еще один тип реакций прямой репарации был обнаружен для однонитевых разрывов ДНК, индуцируемых, например, ионизирующим излучением. При этом у E. coli с помощью фермента ДНК полинуклеотидлигазы происходит прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК. В 1979 году голландский ученый Т. Линдал обнаружил, что при некоторых типах повреждений пуриновых оснований ковалентная связь между основанием и сахаром (гликозидная связь) может рваться. Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется брешь, названная АР-сайтом. Им были описаны ферменты, названные инсертазами (insert — вставлять), которые могут вставлять в брешь такое же основание, какое было до повреждения, и соединять его с сахаром. Например, ДНК-пурин-инсертаза, катализирующая образование N-гликозидной связи между 1-атомом дезоксирибозы апурин/апиримидинового сайта (АР-сайта), образовавшегося напротив пиримидина, и комплементарным ему основанием. Структура ДНК приобретает исходный неповрежденный вид. Однако только ограниченное число АР-сайтов может быть исправлено с помощью этого типа реакции. 5.5.4. Эксцизионная репарация Существуют более сложные реакции восстановления, напоминающие хирургические вмешательства в структуру ДНК, когда поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК (отсюда происходит и термин «эксцизионная репарация», от excision — вырезание), а затем образовавшиеся бреши заполняются неповрежденным материалом. 211 Все типы эксцизионной репарации имеют общие этапы: 1) распознавание повреждения; 2) надрезание нити ДНК (сахарофосфатного остова); 3) эксцизия участка, содержащего повреждение; 4) репаративный синтез на неповрежденной матрице и лигирование. Три основных типа эксцизионной репарации получили свои названия в зависимости от того, какие именно повреждения будут исправляться. Эти типы репарации, несмотря на лежащий в их основе общий процесс вырезания участка ДНК с повреждением, принципиально различаются между собой. Объектом эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER) служат неправильно спаренные, алкилированные, окисленные и тому подобное, основания. За сутки в каждой клетке человека происходит не менее 105 нуждающихся в коррекции модификаций оснований. Этот тип повреждений не вызывает серьезных изменений в структуре двойной спирали ДНК, приводящих к нарушению репликации ДНК и остановке клеточного цикла, но служит источником мутаций. Механизм BER, возможно, является наиболее древним и важным. Первый этап распознавания поврежденных оснований в этой системе репарации осуществляют специальные белки ― гоикозилазы. Это высокоспецифические ферменты, гидролизующие N-гликозидную связь между сахарофосфатным остовом и поврежденным основанием. У E. coli к настоящему времени выделено и описано 8, а у человека ― 11 различных гликозилаз. ДНК-гликозилазы различаются по своей субстратной специфичности, то есть они способны распознавать только определенные поврежденные основания, а не все подряд. У некоторых из них спектр распознаваемых повреждений достаточно широк, а у некоторых ― крайне узок. При этом ни одна из гликозилаз не распознает О6-МеG. 212 Кроме гликозилаз в BER участвуют эндонуклеаза АРЕ1, надрезающая АР-сайт с образованием 3'-конца, ДНК-полимераза-β, лигаза III и структурный ДНК-связывающий белок ERCC1. В некоторых случаях при более протяженной бреши могут быть привлечены PCNA-зависимые полимеразы δ или ε. К настоящему времени была обнаружена зависимость активности этой системы репарации от белка p53. Этот антионкоген стимулирует BER путем прямого взаимодействия с АРЕ1 и ДНКполимеразой-β, стабилизируя связывание последней с АР-сайтом. В целом, BER ― чрезвычайно действенный барьер мутациям оснований. Ярким примером этого является тройная система защиты ДНК от окисления гуанинов, выявленная как у Е. сoli, так и у высших эукариот, включая человека. Известно, что окислению может подвергаться не только уже встроенные в цепь ДНК нуклеотиды, но и их предшественники. Окисление dGTP приводит к образованию 8-окси-dСТР, но клетка содержит специализированную dGTPaзy ― белок MutT, обладающий повышенным сродством к 8-окси-dGTP. Этот белок гидролизует 8окси-dGTP до 8-окси-dGMP, удаляя его из пула нуклеотидов и предотвращая его встраивание во вновь синтезируемую ДНК. Таким образом, MutT E. coli и МТН1 (Mut T homologue 1) человека являются крайне интересными белками, не вовлеченными напрямую в эксцизионную репарацию оснований, но существенно снижающими уровень оксипуринов в ДНК. Если же модифицированный предшественник 8-оксиG все же внедряется в ДНК напротив C, то такая неправильная пара опознается гликозилазой MutM E. coli (Fpg, OGG1 — соответственно, у дрожжей и человека), которая может удалить 8-оксиG, встроившийся напротив C, из ДНК. Если и этого до начала репликации ДНК не произошло, то в ходе нее 8-оксиG может попытаться спариться с А. Такая пара распознается гликозилазой MutY E. coli (гомолог эндонуклеазы III, 213 выщепляющей из ДНК тиминовые гликоли, цитозиновые гидраты и другие повреждения). Эта гликозилаза обладает лиазной активностью, удаляет A из ДНК и вносит разрыв в сахарофосфатный остов. Также она распознает пары G–C и A–G. У человека эту функцию выполняет специализированная гликозилаза MYH (Mut Y homologue). Говоря о взаимосвязи между собой в процессе защиты ДНК от встраивания 8-оксоG нескольких параллельных путей эксцизионной репарации оснований, необходимо добавить, что механизмы репарации, участвующие в удалении из поврежденной ДНК 8-оксо-G были исследованы in vitro, то есть на бесклеточных экстрактах очищенных белков. Было обнаружено, что из транскрибируемой части ДНК 8-окси-G удаляется быстрее, чем из нетранскрибируемой. Гликозилазой, необходимой для инцизии 8-окси-G и использованной в этих опытах, была Ogg1. Таким образом, по крайней мере, для одной из гликозилаз четко показано, что при BER наблюдается преимущественное выщепление поврежденного основания из транскрибиремой ДНК, то есть тот путь BER, который начинает специализированная гликозилаза Ogg1 может быть описан как зксцизионная репарация оснований, спаренная с транскрипцией. Продолжая изучать эксцизионную репарацию ДНК, остановимся на репарации неспаренных оснований (mismatch repair, MMR). На русский язык название этого типа репарации часто переводят как коррекция неспаренных оснований. Основная роль MMR состоит в поддержании стабильности генома и снижении количества потенциально возникающих мутаций. Довольно часто (у Е. coli один раз на 104 пар нуклеотидов, у эукариот еще чаще) во время репликации ДНК происходят ошибки спаривания, в результате которых вместо комплементарной пары нуклеотидов А+Т или G+C в дочернюю цепь ДНК оказываются включенными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам в материнской нити и образующие с ними неправильные пары. Такие 214 пары называют мисмэтчами — mismatch. Как уже говорилось ранее, исправление подобных ошибок самими полимеразами или автономными экзонуклеазами не может убрать их все, и в ДНК по окончании репликации остаются мисмэтчи. Но неспаренные основания в ДНК могут возникать и в результате других событий. Например, при модификации оснований ДНК или их предшественников продуктами клеточного метаболизма или экзогенными повреждающими агентами, если эти поврежденные основания не были отрепарированы системой BER. Неспаренные основания могут возникать и при рекомбинационной интеграции однонитевого участка ДНК в неабсолютно идентичную ДНК партнера по рекомбинации. Все эти события приведут к образованию гетеродуплексной ДНК — субстрата для ферментов, исправляющих мисмэтчи. Хотя процесс MMR получил свое название от неспаренных оснований, но его основными мишенями являются не только такие пары, как G/T, G/G, A/C и C/C, но и О6-меG, спаренный с C или Т, межнитевая сшивка СpG, вызванная действием цисплатина, индуцированные УФ-светом фотопродукты, пуриновые аддукты бензопирена, производные аминофлуорена и 8-оксигуанин. К настоящему времени стало понятно, что система MMR способна распознавать и корректировать не только неправильно спаренные основания, но и протяженные вставки и делеции (по крайней мере, у эукариот). Ясно, что неправильное спаривание (ошибка репликации) может затронуть только дочернюю нить ДНК, матричная в процессе репликации остается неизменной. Если в матричной нити появилось повреждение, которое не было исправлено с помощью репарации и привело к замене основания, то это и есть мутация, и она будет воспроизводиться при репликации во всех последующих поколениях. Следовательно, система репарации мисмэтчей должна оперировать на дочерней нити и производить замену некомплементарных оснований 215 только в ней. То есть одним из основных моментов, важных для данной системы репарации, является необходимость различения матричной и вновь синтезированной нитей. Клетки прокариот при этом используют различие в метилировании материнской и дочерней нитей, так как существует определенный временной промежуток, в течение которого вновь синтезированная нить в отличие от матричной остается недометилированной. Пока это различие в метилировании сохраняется, клетки должны успеть отрепарировать мисмэтчи. Эта особенность MMR у Е. coli подчеркивает главную биологическую функцию системы ― точность воспроизведения ДНК при репликации. Район мисмэтча, то есть гетеродуплексная ДНК, распознается гомодимерным белком МutS, который присоединяется к нему. Это соединение белка МutS с ДНК стабилизируется за счет присоединения белков МutH и МutL с образованием репаративного комплекса. Белок МutH распознает ближайший, локализованный с любой стороны от мисмэтча полуметилированный сайт GATC и разрезает неметилированную нить. Затем следует репаративный синтез и лигирование. Основными биологическими функциями системы MMR у прокариот являются антимутационная, которая способствует точному воспроизведению генома при репликации и поддержанию его исходной структуры и антирекомбинационная, способствующая репродуктивной изоляции вида. У эукариот поиск гомологичных генов привел к выявлению, по меньшей мере, двойного набора гомологов генов mutS и mutL у S. cerevisiae и человека, что легло в основу предположения о гетеродимерной структуре гомологов белков MutS и MutL у эукариот. Они получили названия MSH и MLH, а их гетеродимерные комплексы ― MutSα/β и MutLα/β. Гомолога белка MutН у эукариот не обнаружено и до сих пор недостаточно ясно, как именно MMR у эукариот различает матричную и дочернюю нити. Предполагается, что в дочерней нити остаются недолигированные. После связывания 216 с мисмэтчем MutSα ассоциируется с комплексом MutLα, эксцизию ДНК, содержащей неправильно спарившееся основание, осуществляет экзонуклеаза I, а новый синтез — ДНК-полимераза-δ. Вероятно, у высших эукариот в этой системе репарации принимает участие и белок PCNA, так как у MSH2 и MLH1 есть специфические сайты, связывания с ним. Является ли процесс MMR индуцибельным, до сих пор не ясно. Промотор гена, кодирующего MSH2, имеет сайт связывания с белком p53 и его индукция была показана при котрансфекции p53 и онкогенов fos/jun. Обработка клеток алкилирующими агентами, например метил-нитро-нитроз-гуанидином (MNNG) приводит к повышению мисмэтч связывающей активности комплекса MSH2/MSH6 и его перемещению внутри ядра. Вероятно, регуляция активности MMR происходит как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. Эта система является барьером для внутрихромосомных рекомбинационных перестроек, возможных изза существования в геноме высших эукариот множественных повторов (в клетках млекопитающих внутрихромосомная рекомбинация значительно более чувствительна к совершенству гомологии взаимодействующих участков ДНК, чем межхромосомная). Также существует множество данных о том, что белки MSH2, MSH6 и MLH1 принимают непосредственное участие в других репарационных процессах ― эксцизионной репарации нуклеотидов, спаренной с транскрипцией, репарации двунитевых разрывов и генерации и передаче сигнала о повреждении ДНК. Сравнительное изучение системы MMR у человека имеет большое медико-биологическое значение. Это подтверждается наличием таких наследственных заболеваний человека, как семейная форма неполипозного рака прямой кишки (HNPCC). Неполипозный рак толстого кишечника (HNPCC — human non polyposis colon cancer), который составляет, по разным оценкам, от 5 % до 15 % всех регистрируемых случаев колоректального рака, 217 сопряжены, главным образом, с повреждениями трех генов — hMLHI (49 %), hMSH2 (45 %) и hPMS2 (6 %). К настоящему времени выявлено до 40 мутаций в каждом из первых двух генов и небольшое число мутаций в других генах, включая hPMS2 и hPMSI. Складывается также и генетическая картина перехода от предрасположенности к развитию заболевания в результате инактивации обоих аллелей одного из этих генов системы MMR. В то же время, среди спорадических раковых опухолей различной локализации от 10 % до 30 % имеют нестабильную структуру микросателлитной ДНК, так называемый фенотип RER+ (replication error). Эта нестабильность возникает в результате неисправленной ошибки репликации, что автоматически подразумевает существование дефекта в системе MMR. Результаты исследований клеточных линий, происходящих из раковых клеток с фенотипом RER+, показывают, что они несут мутации в генах hMSH2, hMLHI, hPMS2 и GTPB. В 1968 году в лаборатории Р. Сетлоу у E. coli был описан процесс эксцизионной репарации УФ-повреждений, при котором вырезается не просто отдельное основание, а значительный участок нити ДНК, содержащий пиримидиновый димер. Эта система получила название эксцизионной репарации нуклеотидов и очень скоро была обнаружена у эукариот. Стало понятно, что она способна восстанавливать так же различные аддукты и межнитевые сшивки. Низкая специфичность NER к типу повреждения достигается за счет того, что из ДНК выщепляется не сам модифицированный нуклеотид, а содержащий ДНК-повреждения олигонуклеотид, длина которого составляет 12–13 (у прокариот) или 27–29 (у эукариот) нуклеотидных звеньев. Таким образом, система NER способна удалить из ДНК почти все возможные повреждения. В клетках E. coli этот процесс осуществляется тремя белками ― UvrA, UvrB и UvrC (их название происходит от английского ultraviolet resistant). Сам процесс происходит в несколько этапов: 218 распознавание повреждений белками UvrA и UvrB; изгибание молекулы ДНК и изменение конформации белка UvrB; внесение двух однонитевых надрезов ДНК с обеих сторон от повреждения с помощью белков UvrB и UvrC; расплетание ДНК в участке между двумя надрезами с помощью белка UvrD (MutU, геликаза); отсоединение содержащего дефект фрагмента длиной 12 нуклеотидов (12-мер) с образованием бреши; застройка образовавшейся бреши с помощью ДНК полимеразы; соединение свободных концов ДНК лигазой. Известно, что этот процесс у бактерий ― индуцибельный, гены uvrA и uvrB входят в состав SOS-регулона и их эспрессия возрастает после повреждения ДНК. Эукариоты, включая дрожжи и человека, не имеют прямых гомологов системы UvrABC, но сам механизм NER у них чрезвычайно сходен с таковым у прокариот. В NER вовлечено не менее 30 белков. Главное открытие, связанное с этим, ― высокое структурное и функциональное постоянство генов, кодирующих эти белки у всех эукариот. Дефекты NER у человека приводят к появлению различных наследственных синдромов: пигментной ксеродермы (XP), синдрома Коккейна (CS) и трихотиодистрофии (TTD). У дрожжей гены NER обозначаются и у S. serevisiae и у S. pombe как Rad и rad (от radiation), у грызунов ERCC (Exision Repair Cross Complementing) 1–11, а у человека ― в соответствии с заболеванием, причиной которого они являются: XP, CS и TTD. Эксцизионная репарация нуклеотидов ― процесс очень сложный, и мы не будем подробноостанавливаться на его деталях. Заметим, однако, что у него есть две основные ветви ― общегеномная репарация (GGR, global genome repair) и репарация, спаренная с транскрипцией (TCR, transcription coupled repair). В начале 80-х годов Филипп Ханавалт сформулировал представление о преимущественой репарации ДНК. Это явление 219 заключается в более быстром удалении цикдобутановых пиримидиновых димеров и некоторых других типов повреждений оснований из транскрипционно активных генов по сравнению с транскрипционно молчащими участками генома. Окончательное понятие (на сегодняшний день) преимущественной репарации таково: во многих, но не во всех, транскрипционно активных генах транскрибируемая (матричная) нить репарируется быстрее, чем нетранскрибируемая (кодирующая) нить (нить-специфическая репарация); и транскрибируемая часть генома репарируется быстрее, чем молчащая. Существование эксцзионной репарации нуклеотидов, спаренной с транскрипцией, как раз и является доказательством этой гипотезы. TCR убирает различные повреждения, останавливающие продвижение РНК-полимеразы на транскрибируемой нити транскрибируемого гена. Дефект этого пути репарации приводит к Синдрому Коккейна (CS), при этом при данном заболевании вообще резко снижен уровень транскрипции и его относят к так называемым «транскрипционным синдромам», а не только к «репарационным синдромам». Для TCR основными необходимыми белками являются CSA, CSB, XPB, XPD (члены TFIIH) и XPG. CSB, но не CSA непосредственно связывается с РНК-полимеразой II (хотя не совсем понятно, как именно) и таким образом активирует соответствующую ветвь NER, что приводит к отсоединению остановившегося комплекса RNApolII от поврежденной ДНК. TCR и GGR могут быть объединены белком CSB, вероятно, он работает как «фактор, разделяющий транскрипцию и репарацию». CSB использует свою способность к транслокации ДНК для того, чтобы отделить комплекс RNApolII от остановленной вилки транскрипции. После обработки клеток таким агентом, как цисплатин или после УФ-облучениия наблюдается CSA и CSB-зависимая убиквитинирование RNApolII комплекса, облегчающая его перемещение и последующий протеолиз. 220 Для восстановления транскрипции RNApolII должна снова оказаться в гипофосфорелированной форме (только так она связывается с ДНК), количество которой резко падает после УФоблучения. Может быть, при участии комплекса TFIIS, RNApolII комплекс не отходит от ДНК, а лишь перемещается назад на 20–35 нуклеотидов от повреждения, что позволяет ему вернуться к прерванной работе после завершения процесса репарации. Возможно, в этот процесс вовлечен и один из белков MMR–MSH2. Интересно, что активность GGR зависит от интенсивности ДНК-повреждений. Это связано с тем, что транскрипция генов XPC и DDB2 (XPE) зависит от p53 и индуцируется УФ-облучением. Клетки больных синдромом Ли-Фромени (мутантные по гену р53), таким образом, являются дефектными по репарации пиримидиновых димеров, так как в них отсутствует p53-зависимая индукция DDB2. У человека ХРС индуцируется не только УФ-светом, но и алкилирующими агентами и бензопиреном. При этом у мышей нет индукции DDB2 под действием УФ-облучения. Недавно получены крайне интересные данные о том, что при дефекте p53 ХРС и ХРЕ могут быть индуцированы оверэкспрессией BRCA1 (белок, связанный с развитием семейных форм рака молочной железы и яичников, breast cancer 1). После распознавания повреждения к нему подходит фактор транскрипции РНК-полимеразы II — TFIIH, в состав которого входят субъединицы XPB и XPD, обладающие геликазной активностью и раскручивающие ДНК около повреждения в разные стороны. Это указывает на прямую связь процессов транскрипции и репарации. 5.5.5. Репарация двунитевых разрывов ДНК Двунитевые разрывы ДНК (DSB, double strand breaks) являются наиболее тяжелыми повреждениями геномов эукариот и при отсутствии их репарации почти всегда приводят клетку к гибели. В частности, гибель клеток после действия ионизирующей радиации преимущественно связана с нерепарированными DSB, а также с 221 хромосомными перестройками, возникающими при их неправильной репарации. DSB могут возникать спонтанно или после воздействия на клетку ионизирующей радиации и некоторых химических мутагенов. Одной из функций гомологической рекомбинации, которая, как мы уже говорили, возможна не только в мейотических, но и в соматических клетках позвоночных, является особый путь репарации двунитевых разрывов ДНК. Этот механизм репарации DSB в дрожжах был впервые предложен в 1973 г. В. Г. Королевым и Л. М. Грачевой. Но к настоящему времени стало ясно, что рекомбинация не является основным способом репарации двунитевых разрывов. Репарация DSB путем гомологической рекомбинации (HRR, homologous recombination repair) происходит достаточно редко, так как для нее необходима вторая неповрежденная копия двунитевой ДНК, содержащая участок с нуклеотидной гомологией к поврежденному участку. Необходимо обратить внимание, что на завершающем этапе HR может осуществляться двумя принципиально различными способами. Первый связан с разрешением классической холлидеевской структуры либо путем кроссинговера, либо путем генной конверсии, сопровождающимся образованием разрывов и в донорной, и в реципиентной ДНК и последующим, реальным (физическим) обменом соседними участками двунитевой ДНК. При репарации путем HR по второму механизму разрывы в донорной ДНК не образуются, а идет инициированный свободным концом ДНК ограниченный синтез в районе повреждения, а затем вновь синтезированная нить вытесняется и отжигается со вторым свободным концом в реципиентном дуплексе. Таким образом, даже если рекомбинация произойдет между негомологичными хромосомами или негомологичным участкам гомологичных хромосом, то это не приведет к появлению хромосомных перестроек. Это очень важно для высших эукариот, так как их геном состоит на 90 % из повторяющихся последовательностей, опасность рекомбинации между которыми достаточно велика. 222 Другими системами распознавания и репарации DSB в клетках эукариот являются прямое негомологическое воссоединение концов ДНК (NHEJ, nonhomologous end-joining) и отжиг по прямым повторам (SSA, single strand annealing) ― редкий путь, описанный у S. pombe. Образование DSBs после ионизирующего излучения почти всегда сопровождается фрагментацией ДНК при участии свободных радикалов, и позиционное расхождение между разрывами на отдельных нитях составляет не менее двух нуклеотидов. Процесс NHEJ с этим успешно справляется, хотя именно по этой причине он обычно сопровождается микроделециями. Но геномы высших эукариот в основном (более чем на 90 %) состоят из некодирующих последовательностей, и неточность NHEJ редко приводит к вредным мутациям, хотя и может вносить свой вклад в микроделеционный полиморфизм ДНК. Кроме того, нужно иметь в виду, что клетка способна эффективно репарировать лишь небольшое число DSBs (несколько десятков), и количество микроделеций, возникающих при NHEJ, относительно невелико. В принципе при воссоединении «неправильных» концов ДНК репарация DSBs путем NHEJ может приводить и к большим делециям и транслокациям. Вероятнее всего, это происходит при большом количестве DSBs, то есть у репарации путем негомологического воссоединения концов есть какая-то своя система отбора и сравнения тех концов, которые должны быть объединены для «правильного» воссоединения, но при избытке повреждений она с этой задачей не справляется. Этот процесс репарации двунитевых разрывов не нуждается в партнере для рекомбинации и может протекать в любой фазе клеточного цикла, он используется клеткой в 1500 раз чаще, чем HRR. Кроме белков, непосредственно участвующих в самом процессе рекомбинации, есть немало факторов, служащих триггерами клеточного ответа на повреждения ДНК, что приводит к изменению параметров клеточного цикла и запуску репарационных реакций. Таким триггерами являются протеинкиназы ATM (ataxia- 223 teleangiectasia mutated), ATR (ataxia-teleangiectasia related), DNA-PK (DNA-dependent protein kinase). Все они являются гомологами PI-3киназы (фосфатидилинозитол-3' киназы). Известно, что PI-3 киназа активно участвует в передаче сигналов в клетке и опосредует клеточный ответ на действие различных факторов роста, триггерных факторов клеточной дифференцировки и инсулин. Запускает процесс HRR протеинкиназа ATM, которая каким-то образом, вероятнее всего через конформационные изменения ДНК, «чувствует» DSB. Затем она переходит в активную форму путем автофосфорелирования по серину в 1981 положении (Ser-1981) и, может быть, связывается с DSB. Активированная ATM фосфорелирует гистон Н2АХ, что привлекает белки BRCA1 (breast cancer 1) и NBS1 (Niejmegen breakage syndrome, Нийменгенским синдромом ломкости хромосом), которые АТМ также фосфорелирует. NBS1 является частью комплекса MRN (NBS1/RAD50/MRE11) и прямой мишенью АТМ, то есть главным переносчиком сигнала с АТМ на MRN-комплекс. Белок BRCA1 служит якорем и координатором для дальнейшей сборки репарационного комплекса. Комплекс MRN (обладающий 3 –5 -экзонуклеазной активностью), скорее всего, совместно с другими экзонуклеазами (обладающими 5 –3 -активностью) ращепляет ДНК для создания у двунитевого разрыва выступающих концов, которые нужны для их перекрывания в процессе рекомбинации. MRE11, вероятно играет в этом комплексе главную роль, так как обладает одновременно и экзо(3 –5 )- и эндонуклеазной (со сродством к днДНК) активностями. В состав MRN кроме NBS1 и MRE11 входит еще и АТФаза RAD50, раскручивающая ДНК. BRCA1 привлекает к разрыву BRCA2, который облегчает загрузку белка RAD51 (гомолог RecA) на одетую RPA (гомолог SSBбелка) нить ДНК. То есть у эукариот RAD51 вытесняет RPA с нити в комплексе с BRCA2. Участвующие в реакции паралоги RAD51 в свою очередь привлекают белки RAD52 и RAD54, может быть, с помощью 224 WRN и BLM геликаз. Так формируется активный 3 -конец ДНК, ведущий процесс гомологического спаривания и обмена нитей. Известно, что в этом ДНК-белковом комплексе также обнаружен антионкоген p53, способный связываться с белками BRCA1, RAD51, WRN и BLM. Геликазы WRN и BLM в процессе синапсиса внедряются в образовавшиеся холидеевские структуры. Именно в этот момент решается, каким образом эти структуры будут разрешены — с кроссинговером или без него. То есть эти геликазы, вероятнее всего, способны «открутить» донорную ДНК после завершения репаративного синтеза от места спаривания без ее разрывов. В эукариотических клетках существует и специфическая для структуры Холлидея геликазная-эндонуклеазная активность, способствующая ее разрешению, которая может быть аналогична RuvABC-активности Е. coli. У S. cerevisiae выделен комплекс Mus81-Mms4, который способен к правильному разрешению Холлидеевской структуры. Вероятно, роль HRR более значительна в эмбриональных клетках, чем в клетках взрослого организма. Об этом свидетельствует то, что нокаутные по основным генам HRR мыши погибают еще на эмбриональных стадиях, а клетки, мутантные по этим генам, вполне жизнеспособны 5.5.6. Пострепликативная репарация Пострепликативной, как это следует из названия, принято называть репарацию, которая происходит в клетке после завершения процессов репликации. Очевидно, что это может быть не один, а несколько независимых процессов, происходящих в одно и то же время клеточного цикла. Естественно, что все эти процессы были открыты не одновременно, и долгое время под названием «пострепликативная репарация» подразумевался только процесс гомологической рекомбинации, инициируемый однонитевыми брешами, образовавшимися напротив неотрепарированных пиримидиновых димеров. 225 С этого процесса мы и начнем изучение пострепликативной репарации ДНК. В 1968 году американцы У. Рапп и П. Ховард-Фландерс исследовали облученные УФ-светом бактерии, у которых был нарушен синтез эндонуклеаз, участвующих в эксцизионной репарации нуклеотидов. Опыты проводили в темноте для того, чтобы не мог осуществиться и процесс фотореактивации. Таким образом, после УФ-облучения в ДНК этих клеток оказывалось много невырезанных перимидиновых димеров. В тот момент, когда ДНКполимераза, ведущая репликацию, доходила до первого из них, она на 10 секунд застывала на месте. Этот обнаруженный Раппом и Ховардом-Фландерсом факт задержки синтеза был неоднократно подтвержден другими исследователями. Необходимо сознавать, что задержка на 10 секунд весьма значительна, так как репликация у кишечной палочки идет со скоростью 1000 нуклеотидов в секунду. Затем ДНК-полимераза каким-то образом ухитрялась перебраться за пиримидиновый димер и возобновить синтез позади повреждения. Тоже самое повторялось и перед следующим димером. Известно, что репликацию ДНК у E. coli осуществляет специальный комплекс из нескольких десятков белков. Каким образом весь этот белковый комплекс может перебраться через повреждение и возобновить реакцию репликации без помощи затравки (короткого участка РНК, без которого синтез ДНК невозможен) до сих пор до конца не ясно. В результате такого перемещения ДНК-полимеразного комплекса и последующего ресинтеза формируется дочерняя ДНК с брешами, то есть участок дочерней нити, иногда длиной в несколько генов, оказывается неудвоенным, причем в родительской нити напротив бреши так и остается нерепарированное повреждение ДНК. Такая ситуация может привести клетку к гибели, и чтобы этого избежать, в клетке включается специальный механизм, основанный на рекомбинации, в процессе которой белок RесА ведет гомологичное спаривание нитей. Из изначально свободной от дефектов 226 комплементарной нити матричной ДНК, на которой процесс репликация ДНК был правильно завершен, вырезается участок ДНК, равный по длине участку бреши, и встраивается в брешь. Затем лигазы соединяют концы вставленного фрагмента с концами нормально синтезированного участка дочерней нити. После этого другие ферменты репарации устраняют дефект в исходно поврежденной нити. Одновременно брешь, оставшаяся после вырезания участка из родительской нити, застраивается ДНКполимеразой I. Эта модель описывает только один из механизмов пострепликативной репарации. У эукариот процесс пострепликативной репарации существенно сложнее, причем репаративные реакции могут идти различными путями, один из которых приводит к появлению мутаций (является мутагенным) и, вероятно, связан с ДНК-полимеразами, способными вести синтез на поврежденной матрице. Этот механизм еще иногда называют «проходом» повреждения. В то же время накопленные экспериментальные данные показывают, что существует и механизм зашивания брешей без ошибок, причем преимущественным механизмом является безошибочный обход повреждения. Очевидно, что есть момент «решения», каким именно путем будет идти пострепликативная репарация. К настоящему времени сложилось представление, что ключевую роль в процессах пострепликативной репарации и выборе того или иного ее пути у эукариот играет убиквитинирование вовлеченных белков. Поэтому нам кажется необходимым сделать здесь небольшое отступление. Процесс пострепликативной репарации (PRR, post replication repair) у дрожжей называется еще Rad6-зависимой репарацией, так как была обнаружена группа белков, эпистатически связанных с Rad6 и вовлеченных в этот процесс. Rad6-зависимый путь PRR является эволюционно консервативным: у E. coli гомолог Rad6 вовлечен в процесс ресинтеза (рестарта репликации) при SOS-ответе, гомологи 227 найдены у S. pombe и мыши, причем участвуют в сходных процессах обхода повреждения. Rad6-зависимый путь контролируется белками Rad6 и Rad18, образующими гетеродимер, способный к связыванию с ДНК и обладающий убиквитин-связывающей активностью. Гетеродимер Rad6/Rad18 и белок Rad5 необходимы для одного из путей пострепликативной репарации. Rad6 является классическим Е2-убиквитин-связывающим ферментом, образующим множество убиквитиновых цепей через связывание лизином в 48 положении. Rad18 является ДНК-связывающим белком с убиквитин-лигазной активностью. Комплекс Ubc13/Mms2 также является Е2-убиквитинсвязывающим ферментом, но формирует убиквитиновые цепи через лизин в 63 положении. Rad5 является ДНК-связывающим белком, который привлекает комплекс Ubc13/Mms2 к ДНК, а также служит связующим звеном между комплексами Ubc13/Mms2 и Rad6/Rad18. Функции этих белков пока точно не определены, но их гомологи существуют и у млекопитающих. Rad6 имеет два гомолога в клетках человека, с которыми взаимодействует человеческий гомолог Rad18 (hRad18). Участие самого hRad18 в пострепликативной репарации доказано. Ген Mms2 считается частью безошибочного пути PRR, контролируемого Rad6, его продукт способен образовывать прочный комплекс с белком Ubc13, который в свою очередь способен к альтернативному убиквитинированию лизина в 63 положении. Белок Rad18 обладает способностью связываться с однонитевой ДНК, таким образом комплекс Rad6\Rad18 способен связаться с остановившейся вилкой репликации, так как там имеется однонитевой «хвост». При этом Rad6 может убиквитинировать белки остановившегося комплекса репликации. Мутагенный путь пострепликативной репарации основан на способности полимераз семейства Y вести синтез на поврежденной матрице. Это процесс аналогичный SOS-репарации у прокариот. Вероятнее всего, убиквитинирование процессивной ДНК-полимеразы δ необходимо для ее деградации или перемещения, позволяющего 228 полимеразам Y-семейства занять ее место и провести синтез на поврежденной матрице. Безошибочный путь пострепликативной репарации состоит из одного из вариантов синтеза на поврежденной матрице (Rad30зависимого) и путей обхода повреждений, для которых необходимы белки Rad5, Mms2, Ubc13, Srs2, а также ДНК-полимераза-δ, PCNA и некоторые белки гомологической рекомбинации. О низкопроцессивных ДНК-полимеразах эукариот, участвующих в процессе «прохода» повреждении, мы уже подробно говорили при изучении SOS-ответа у E. coli. Rad5 может способствовать ремоделированию хроматина и помогать белкам репарации подойти к ДНК, а также участвовать в переключении матрицы при остановке вилки репликации. Это делает его одним из главных игроков. PCNA может быть моноубиквитинирован Rad6 и Rad18, полиубиквитинирован Rad6, Rad18, Rad5, Mms2, Ubc13, и «сумоирован» Ubc9, что играет важную роль в выборе субпути Rad6зависимой PRR. Таким образом, различные модификации PCNA могут определять тот тип репарации, который будет использован при ресинтезе (рестарте репликации). Связаны ли модификации PCNA с внутри S-фазными чекпойнт-функциями, не ясно. 5.5.7. Глобальный клеточный ответ на повреждение ДНК и его регуляция Повреждения, индуцированные в ДНК действием ионизирующей радиации, влияют на пути активации точек сверки (чекпойнтов), которые останавливают движение клетки в G1 и G2 фазах, и вызывает временную задержку в прохождении фазы S. Чекпойнты совместно с репарацией и апоптозом вовлечены в круговорот, который определяет основной ответ клетки на повреждение ДНК. Вероятно, главную роль в чекпойнт-ответе играют белки ATR и ATM, а также CHK1 (check-point kinase 1) и CHK2киназы. Также важна роль лежащих ниже эффекторов, таких как p53 229 и семейство белков-фосфатаз CDC25. Процессы репарации ДНК и геномной стабильности напрямую связаны с активацией чекпойнтов. Уже не менее 50 лет известно, что облучение вызывает задержку нормального прохождения клеток по циклу. Было очевидно, что в клетке инициируются особые процессы, помогающие облученным клеткам каким-то образом бороться с возникшими повреждениями и облегчить их репарацию. К настоящему времени стало понятно, что существуют механизмы «обзора» генома (genomesurveillance), обычно определяемые термином «чекпойнт повреждений ДНК» (DNA damage chekpoint), лишь одним из проявлений которого является задержка клеточного цикла. Подобно многим другим областям современной биологии, изучение чекпойнтов питается убеждением, что уточнение их молекулярных механизмов будет способствовать пониманию причин геномной нестабильности и рака, так как любой ген, вовлеченный в чекпойнты ДНК повреждений, важен для стабильности генома и (или) связан с наследственной предрасположенностью к раку. К тому же нарушение чекпойнт-контроля может быть отличительным признаком опухолевых клеток, поэтому большие усилия прикладываются для поиска агентов, которые могли бы сломать эти нарушенные чекпойнты. Участвующие в чекпойнтах повреждения ДНК белки формально разделяются на сенсоры, переносчики и эффекторы. Сенсоры прямо или опосредованно распознают повреждения ДНК, служат сигналом этих нарушений и инициируют каскад биохимических реакций. Переносчиками обычно являются протеинкиназы, которые изменяют и усиливают сигнал о повреждениях от сенсоров, фосфорилируя другие киназы или нижележащие белки-мишени. Эффекторные белки включают самые последние нижележащие мишени протенкиназ ― переносчиков сигнала. Эффекторный уровень чекпойнта повреждений ДНК пересекается с машиной клеточного цикла. 230 До сих пор остается неясным самый первый шаг в распознавании ДНК-повреждений. Комплекс Mre11–RAD50–NBS1 и BRCA1 участвуют в распознавании именно двунитевых разрывов ДНК. BRCA1, вероятно, является адаптором, предоставляющим дополнительные мишени для фосфорелирования киназампереносчикам сигнала, он взаимодействует с большим числом белков, вовлеченных в процессы репарации ДНК, и собирает белковый комплекс, вероятно, участвующий в инициации и передаче сигнала (BASC–BRCA1 associated genom surveillance complex). Каковы основные функции BRCA1 — сенсорные или трансдусерные — до сих пор неясно. Белки, называемые медиаторами, прототипом которых является дрожжевой RAD9, участвуют в передаче сигнала. Они содержат два повторяющихся домена, обнаруженных в С-конце белка BRCA1 и названных поэтому BRCT-доменами. BRCТ-содержащие белки найдены у млекопитающих, но имеют функции, сходные с таковыми дрожжевого RAD9. Среди подобных белков описаны BRCA1, TopBP1 (topoisomerase II binding protein I), 53BP1 (P53 binding protein I) и MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein I). Все эти белки вовлечены в чекпойнт-ответ, они распознают повреждения ДНК и привлекают другие белки, которые облегчают передачу сигнала вниз и репарацию ДНК. Две активно изучаемые киназы из семейсва PI3-киназ (фосфоинозитол-3-киназы) ATM и ATR работают непосредственно сразу же после сенсоров повреждений. ATM играет решающую роль в чекпойнтах повреждений ДНК, контролируя начальное фосфорилирование многих ключевых белков общего ответа, например таких, как p53, MDM2, BRCA1, CHK2, MDC1 и NSB1. При отсутствии ATM ее функции частично берет на себя ATR, сходная с ней по структуре и хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе, а клетки в культуре нежизнеспособны. Ассоциированный с ATR человеческий синдром (синдром Секеля) выявлен всего несколько лет назад. 231 Современные данные утверждают, что именно ATM определяет ранний чекпойнт-ответ, а ATR действует позднее, когда уже идет репарация ДНК повреждений, как вызванных радиацией, так и ультрафиолетом или остановкой репликативных вилок. Следующим шагом в генерации чекпойнт-ответа является активация СНК1 и СНК2 киназ (checkpint kinase 1 and 2). Эти структурно неродственные киназы имеют частично перекрывающуюся специфичность, то есть часто фосфорилируют одни и те же белки. СНК2 фосфорилируется ATM, что приводит к ее активации. СНК1 фосфорилируется по серину-345 ATR в ответ на действие ультрафиолета или гидроксимочевины. Таким образом, в процессе формирования чекпойт-ответа ATM функционально связана с СНК2, а ATR — с СНК1. Транскрипция всех генов, участвующих в чекпойнт-ответе на повреждение ДНК резко возрастает после облучения или генотоксического стресса. 5.6. Активная деградация белков и ее роль в регуляции ДНК-метаболизма Процесс деградации белков как механизм регуляции содержания индивидуальных белков в протеоме уже давно не вызывает сомнения. Однако только сравнительно недавно появилась возможность экспериментально доказать определяющую роль убиквитин-протеасомного пути деградации в таких критических процессах, как клеточный цикл, онкогенез, транскрипция, дифференцировка, рост и атрофия тканей, продвижение субстратов по метаболическим путям, селективное удаление аномальных белков, процессинг антигенов. На сегодняшний день известно, что эукариотическая клетка имеет две основные системы деградации белков. Первая ― это лизосомы, содержащие набор кислых протеаз и других гидролаз. Однако к настоящему времени стало ясно, что лизосомы участвуют только в разрушении белков, ассоциированных с мембранами, и чужеродных белков, захваченных во время эндоцитоза. Вторая система ― это гидролиз белка по АТФ- и 232 убиквитин-зависимому протеолитическому пути, основным действующим элементом которого является мультисубъединичный белковый комплекс, называемый 26S протеасомой. Протеасома обнаружена как у самых примитивных эукариот, так и у высших организмов, и присутствует как в ядре, так и в цитоплазме, некоторые 26S протеасомы ассоциированы с эндоплазматическим ретикулумом и цитоскелетом. Протеолитическое ядро (20S протеасома) найдено также у архей и некоторых эубактерий. Все это свидетельствует об абсолютной необходимости данного комплекса для нормальной жизнедеятельности клетки. 5.6.1. Система убиквитинирования белков Основным субстратом 26S протеасомы являются белковые молекулы, несущие цепи полиубнквитина. Убиквитин ― это небольшой полипептид, состоящий из 76 аминокислотных остатков. В его составе имеется семь остатков лизина, однако полимризация этого белка с образованием полиубиквитиновой цепи происходит в случае протеасомной деградации через остаток Lуs-48. В эукариотических клетках существует специальная система ферментов: Е1 или Uba — убиквити-активирующий (Ubiquitinactivated enzyme), Е2 или Ubc — убиквитин-связывающий (Ubiquitinconjugating enzyme) и ЕЗ или Ubr — убиквитин-лигаза (Ubiquitinrecognition factor или Ubiquitin-protein-ligase). Эта ферментная система узнает белки, несущие специальные деградационные сигналы, и осуществляет их конъюгацию с убиквитином через ε-NH2:-группу остатка лизина белкового субстрата. Высокая специфичность и селективность системы достигается за счет ее иерархичности. Так, в клетке существует только один фермент Е1, активирующий молекулу убиквитина, образуя тиоэфирную связь с карбоксильной группой остатка Glу-76, и передающий ее на один из членов семейства убиквитин-конъюгирующих ферментов ― Е2. Геном дрожжей S. cerevisае кодирует 13 Е2-подобных белков, у млекопитающих их 233 количество гораздо больше. Показано, что каждый Е2-белок участвует в определенном клеточном процессе. Например, Ubс2/RAD6 вовлечен в репарацию ДНК, а UbcЗ/СDС34 необходим в регуляции перехода от G1- к S-фазе клеточного цикла. Фермент из Е2-семейства взаимодействует с одним или несколькими представителями семейства ЕЗ, функция которых заключается в ковалентном присоединении полиубиквитина к молекуле белка через изопептидную связь между остатком Lys субстрата и Glу-76 убиквитина. Минимальным сигналом для эффективного присоединения к протеасоме является цепочка из четырех убиквитиновых звеньев. Сейчас известно около ста различных убиквитин-протеин-лигаз, которые и определяют, в конечном счете, высокую специфичность системы. Убиквнтинирование субстрата, несущего определенный деградационный сигнал (часто таким сигналом является специфическое фосфорилирование), осуществляется различными группами ферментов Е3, причем они могут соединяться с субстратом напрямую или через вспомогательный белок. Хотя о молекулярных механизмах катализа убиквитин-лигаз известно совсем мало, недавние исследования показали, что на основании структуры их каталитических доменов все известные пока Е3-ферменты можно разделить на три класса. Первый класс ― это Е3, содержащие консервативную область в 350 аминокислотных остатков, которая получила название НЕСТдомена (Homology to E6-AP carboxyl terminus) из-за своей гомологии с С-концом наиболее хорошо изученной убиквитин-лигазы Е6-АР; второйой класс — Е3, содержащие мотив из восьми цистеиновых и гистидиновых остатков, которые удерживают два иона цинка, называемый RING-finger-доменом; третий класс — Е3, содержащие U-box-домены, это новый класс убиквитин-протеин-лигаз с третичной структурой близкой к RING-finger-белкам, но без металлхелатирующих аминокислотных остатков. 234 Рис. 5.3. Убиквитин-зависимый протеасомный путь деградации белков Цепи полиубиквитина служат для 26S протеасомы сигналом, что конъюгированные с ними белки должны быть деградированы. В процессе деградации белка полиубиквитиновые цепи высвобождаются и расщепляются до мономеров изопептидазами. Схема взаимодействия протеасомы и системы убиквитинирования белков представлена на рис. 5.3, она была предложена для наиболее изученного класса убиквитин-протеин-лигаз, содержащих НЕСТдомены. 5.6.2. Протеасомы 20S и 26S, их строение и роль в активной деградации белков 26S протеасома ― это мультисубъединичный комплекс, состоящий из каталитически активного ядра и двух регуляторных субкомплексов, обладающий молекулярной массой около 2500 кДа, с коэффициентом седиментации 26S; этот комплекс способен 235 гидролизовать белки, конъюгированные с убиквитином в присутствии АТФ. Термин «протеасома» предложен ведущими исследователями в этой области К. Танака и А. Голдбергом и отражает, по их мнению, как протеолитическую (протеаза) функцию, присущую этому комплексу, так и его природу как дискретной частицы ― сомы. Впервые 26S протеасома была выделена из различных объектов в конце 80-х гг. 26S протеасома представляет собой гантелеобразную симметричную структуру и состоит из центрального цилиндрического 20S ядра, или 20S протеасомы, осуществляющей собственно протеолиз, а также двух боковых регуляторных комплексов РА700 (Рrotein activator). Первоначально 20S протеасома получила несколько названий: мультикаталитический протеазный комплекс, 20S протеаза, просома, макропайн и другие. Однако наиболее употребительным в настоящее время является обозначение «20S протеасома». По данным рентгеноструктурного анализа 20S протеасома представляет собой полый цилиндр длиной 15–17 нм и диаметром 11–12 нм, состоящий из четырех лежащих друг на друге колец, каждое из которых образовано семью белковыми субъединицами с молекулярной массой от 20 до 35 кДа. Полная масса 20S частицы составляет 750 кДа. Наружные кольца сформированы семью субъединицами α-типа, а центральные — субъединицами β-типа. Внутри цилиндра имеется канал с тремя камерами-расширениями: одной большой, центральной, и двумя малыми, по краям. В центральной камере и осуществляется протеолиз поступающих в протеасому белков. Наиболее просто устроенные организмы, в частности археи, имеют только по две различных субъединицы α- и β-типа, а у дрожжей известно 7 различных субъединиц α-типа и 7 — β-типа. У млекопитающих это число еще выше, так как существуют изоформы некоторых субъединиц. В зависимости от типа ткани и стадии дифференцировки органа соотношение изоформ варьирует, и эти модификации имеют 236 важнейшее физиологическое значение. Показано, что в культуре клеток γ-интерферон стимулирует экспрессию трех дополнительных протеолитически активных β-субъединиц (называемых индуцибельными, или иммунными), каждая из которых замещает определенную конституционно-экспрессируемую β-субъединицу. Субъединицы α- и β-типов обладают сходной третичной структурой, но различаются по аминокислотной последовательности. Формирование четвертичной структуры (семичленного кольца) из α-субъединиц происходит без участия других компонентов, тогда как β-частицы сами не могут образовать кольцо. После формирования α-кольца с ним вступают во взаимодействие три β-субъединицы, одна из которых несет лидерный пептид, функционирующий как шаперон и отщепляющийся в процессе сборки протеасомы. Именно эти три белка определяют последующую посадку остальных β-частиц; в результате образуется 13S комплекс (~300 кДа) из одного α- и одного β-кольца. Затем происходит димеризация 13S комплекса в 16S предшественник. На этой стадии сборки протеасомы осуществляется процессинг β-субъединиц, при котором путем автокатализа отщепляются лидерные пептиды. Это способствует формированию активных протеазных каталитических центров. На заключительном этапе образуется зрелая 20S протеасома. Кроме инициации сборки 20S частиц α-субъединицы выполняют еще несколько функций. Они являются местами связывания регуляторных комплексов, а их N-концевые гидрофобные участки образуют физический барьер, ограничивающий доступ цитоплазматических белков во внутреннюю протеолитнческую камеру. β-субъединицы формируют два центральных кольца, и именно на них локализованы каталитические центры, осуществляющие протеолиз. Протеасома 26S образуется при связывании с 20S протеасомой в АТФ-зависимой реакции активатора РА700. В результате этого 237 взаимодействия 26S протеасома приобретает способность к протеолизу убиквитинированных белков, причем скорость гидролиза возрастает, т. е. наблюдается аллостерическая регуляция активности протеолитического ядра активатором РА700. Активатор РА700 имеет молекулярную массу более 800 кДа и состоит, по крайней мере, из 17 различных полипептидов с молекулярной массой от 25 до 110 кДа. По-видимому, он функционирует как «рот» для 20S протеолитического ядра, его субъединицы формируют два структурно и функционально различных комплекса, называемые lid- и base-комплексами (рис. 5.3). Lid-комплекс состоит из 8 субъединиц, не обладающих АТФазной активностью (Rpn 3,5,6,7, 8, 9, 11, 12 — regulatory particle nonATPase). Эти субъединицы отвечают за распознавание и подготовку убиквитинированных субстратов к деградации и взаимодействие с некоторыми непротеасомными белками. Вase-комплекс, прилегающий к 20S, включает три регуляторных субъединицы (Rpn 1, 2, 10) и шесть АТФаз (Rpt 1-6 — regulatory particle triple-A protein), которые играют важнейшую роль в работе 26S протеасомы. (Номенклатура субъединиц РА700 «Rnp» и «Rpt» относится к S. sereviseae, в случае высших эукариот названия основаны на «S»: например, Rpn2 соответствует S1, Rpn10-S5а и т. д.). АТФазы РА700 относятся к АТФазам семейства ААА (АТРase associated with different cellular activities). Они участвуют как в АТФзависимом процессе объединения РА700 и 20S протеасомы во время сборки 26S протеасомы, так и в гидролизе АТФ при деградации убиквитинированных белков на этапах прикрепления субстрата, удаления или разрушения полиубиквитиновых цепей, раскручивания субстрата и его проникновения в 20S частицу, высвобождения олигопептидных продуктов. Показано, что присоединение РА700 приводит к открытию канала в α-кольце, при этом преодоление барьера из N-концевых участков α-субъединиц происходит под действием субъединицы Rpt2, одной из шести АТФаз base-комплекса. 238 В процессе образования 26S протеасомы необходимым этапом является фосфорилирование некоторых субъединиц как 20S протеасомы, так и РА700, то есть ассоциация 20S протеасомы с РА700 является регулируемым процессом и фосфорилирование различных субъединиц протеасомы может быть одним из способов такой регуляции. Генетика протеасомных генов достаточно хорошо исследована на дрожжах. Показано, что делеции в 13 из 14 генов, кодирующих αи β-субъединицы 20S протеасомы, и в генах, кодирующих большинство компонентов РА700 (например, всех АТФаз), летальны. Этот факт еще раз подтверждает важность и необходимость протеасомы для жизни эукариотической клетки. 5.6.3. Регуляция экспрессии различных белковых субъединиц протеасомы Недавно у дрожжей S. cerevisiae была обнаружена общая система централизованной регуляции транскрипции протеасомных генов. В промоторных областях 27 из 33 протеасомных генов был описан неизвестный ранее класс регуляторных UASпоследовательностей, названных РАСЕ-последовательностями (Рroteasome-associated control element). Короткоживущий белок Rpn4, присоединяясь к РАСЕ, функционирует как общий транскрипционный активатор генов, кодирующих субъединицы протеасомы и ряд белков, связанных с убиквитин-протеасомным протеолитическим путем. Механизмы, регулирующие экспрессию протеасомных субъединиц, содержание в клетке и внутриклеточное распределение различных типов протеасом, только еще начинают изучаться. В настоящее время можно предположить, что регуляция активности протеасомы осуществляется на следующих этапах. 1. При экспрессии изоформ β-субъединиц, а также при индукции иммунных изоформ β-субъединнц под действием γинтерферона (в ответ на вирусную инфекцию). Эта экспрессия 239 является тканеспецифической и зависящей от стадии дифференцировки. 2. Скорость протеолиза в определенной области клетки может регулироваться путем изменения внутриклеточного распределения 20S и 26S протеасом. Расположенный на α-субъединицах сигнал ядерной локализации NLS (Nuс1еаг localization signal) позволяет протеасоме перемещаться сквозь ядерные поры из цитоплазмы в ядерный матрикс. В клеточном цикле происходит запрограммированное изменение в распределении форм протеасомы. Локализация 26S протеасомы в определенных клеточных компартментах, видимо, связана с необходимостью ускоренного протеолиза в этих областях, как это, напрмер, происходит при ассоциации 26S протеасомы с центросомой. 3. Превращение 20S комплекса в 26S может регулироваться различными внутриклеточными факторами. Таким фактором может быть увеличение внутриклеточного содержания кальция. 4. Фосфорилирование/дефосфорилирование различных субъединиц как 20S, так и 26S протеасомы может являться одним из механизмов изменения соотношения этих двух форм, а также гибридной (РА28-20S-РА700) протеасомы и иммунопротеасомы. 5. Ряд вирусных белков (НIV-1 Таt-белок, онкобелок 16 Е7 папилломавируса человека, белок Е1А аденовируса) могут взаимодействовать с протеасомными АТФазами, увеличивая скорость протеолиза внутриклеточных белков и приводя к более эффективной вирусной репликации. Другой путь регуляции активности протеасомы при вирусной инфекции (белок X вируса гепатита В) заключается во взаимодействии вирусных белков с субъеднницами 20S протеасомы или регулятора РА28, супрессии в представлении вирусных антигенов и, тем самым, «ухода» вируса из-под контроля иммунной системы; 6. Процесс авторегуляции активности протеасомы может осуществляться на уровне транскрипции. У дрожжей S. cerevisiae белок Rpn4 является активатором транскрипции генов, кодирующих 240 субъединицы протеасомы и некоторые другие компоненты системы убиквитинирования. Сам Rpn4 представляет собой короткоживущий белок с расположенным в N-концевой области деградационным сигналом, благодаря которому Rpn4 напрямую взаимодействует с субъединицей Rpn2 активатора РА700 и не нуждается в предварительном убиквитинировании для 26S-протеасомной деградации. 7. Изменение сродства протеасомы к различным субстратам может происходить и за счет субъединиц активатора РА700. Субъединица Rpn10 экспрессируется в тканях мыши в виде 5 различных изоформ (Rpn10а-е), образующихся за счет альтернативного сплайсинга мРНК (разд. 3.5.1.4). При этом Rpn10а экспрессируется постоянно, а Rpn10е выявляется только в эмбриональных тканях, особенно в развивающемся мозге. Из этого можно сделать вывод, что 26S протеасома существует, по крайней мере, в двух функционально различных формах, одна из которых может играть специфическую роль в раннем эмбриональном развитии. 5.6.4. Роль протеасомы в развитии иммунного ответа Синтезирующиеся в клетке аномальные и чужеродные белки также подвергаются деградации 26S протеасомой по АТФ- и убиквитин-зависимому пути. В результате гидролиза этих белков образуется набор полипептидов длиной от 5 до 24 аминокислот, часть из которых может являться антигенными эпитопами. Полипептиды длиной от 8 до 11 аминокислот соединяются в цитозоле с ТАР (Transporter associated with antigen presentation) и переносятся в эндоплазматический ретикулум, где они связываются в комплексы с молекулами класса I МНС (главного комплекса гистосовместимости, major histocompartibility complex) и выносятся на поверхность клетки. Презентация этих антигенов дает возможность иммунной системе при помощи цитотоксических Т-лимфоцитов обнаруживать и разрушать клетки, экспрессирующие вирусные или другие необычные 241 полипептиды. Центральная роль протеасомы в этом процессе была доказана опытами с использованием ее ингибиторов. Связь протеасомы с иммунным ответом подтверждается и тем, что гены двух из трех γ-интерферон-индуцибельных β-субъединиц протеасомы ― LMP2 и 7 (Low molecular mass polypeptides) расположены в локусе генов комплекса МНС. В присутствии γинтерферона три конституционные β-субъединицы, X, У и Z замещаются на свои иммунные изоформы LMP2, LMP7 и MECL-1 (Multicatalytic endopeptidase complex-like-1) соответственно с образованием так называемой иммунопротеасомы. Хотя скорость протеолиза белков при подобной замене не возрастает, но существенно изменяется спектр образуемых при протеолизе полипептидов: в несколько раз возрастает количество потенциальных антигенных полипептидов с «правильным» С-концом, необходимым для связывания с ТАР. В лимфоидных органах (селезенка, тимус и лимфатические узлы) эти субъединицы экспрессируются постоянно. Сравнение содержания конститутивно-экспрессируемой субъединицы X и замещающей ее индуцибельной субъединицы LPM7 выявило различное их содержание в таких органах, как печень, селезенка, язык и гипофиз. Было показано, что специфичность разрезания пептидных субстратов сильно различается у протеасом, выделенных из мозга и гипофиза, где обнаруживается только обычная протеасома, и из селезенки, где присутствует преимущественно иммунопротеасома. В эукариотических клетках обнаружен еще один активатор 20S протеасомы ― РА28, который может ассоциировать in vitro с 20S протеасомой в отсутствие АТФ, образуя комплекс РА28-20S-РА28. Две субъединицы этого комплекса — РА28α и РА28β — индуцируются в ответ на действие основного иммуномодуляторного цитокина γ-интерферона, что указывает на важную роль этого активатора и его участие в иммунном ответе. Комплекс РА28 имеет молекулярную массу около 180 кДа. Он, как и РА700, присоединяется к дистальным α-кольцам 20S протеасомы. Рентгеноструктурный 242 анализ показал, что при образовании комплекса между 20S протеасомой и РА28 происходит, как и при взаимодействии 20S протеасомы с РА700, открытие канала в α-кольце, однако это не приводит к утилизации таким комплексом белковых субстратов. РА28 активирует только гидролиз коротких полипептидов. Физиологическое значение активации гидролиза пептидов активатором РА28 не совсем ясно, так как содержание свободных пептидов в клетках очень мало. Вероятно, роль РА28 может заключаться в регуляции продукции антигенных пептидов для представления молекулами класса 1 МНС. Во-первых, как уже говорилось, содержание субъединиц РА28 повышается под действием γ-интерферона. Во-вторых, РА28 изменяет специфичность разрезания полипептидов. В-третьих, повышенная экспрессия РА28α после трансфекции приводит к более эффективной презентации антигенов. Существует два объяснения того, как РА28 осуществляет более эффективную презентацию антигенов. Комплекс РА28–20S–РА28 может гидролизовать более длинные полипептиды, первоначально образуемые 26S протеасомой после деградации убиквитинированных белков. Также оба активатора — РА700 и РА28 — могут присоединяться к 20S протеасоме одновременно с образованием гибридной молекулы ― комплекса РА700–20S–РА28. Возможно, гибридная протеасома способна осуществлять более эффективный гидролиз ряда субстратов с образованием антигенных полипептидов ― убиквитинированный белковый субстрат узнается РА700 и транспортируется в полость 20S ядра, протеолитическая способность которой модифицирована активатором РА28. Было показано, что под действием γ-интерферона происходит накопление в цитоплазме формы РА700–20S–РА28. Предполагается также, что in vivo действие РА28 может заключаться в стимуляции высвобождения продуктов деградации. 243 5.6.5. Протеасомная регуляция клеточного цикла Установлено, что убиквитин-зависимый протеолиз играет важнейшую роль в регуляции перехода от G1- к S-фазе, а также в процессе сегрегации хромосом при переходе от метафазы к анафазе и в последующем выходе из митоза. Переход от G1- к S-фазе детально изучен у дрожжей, он осуществляется по СDС34-зависимому механизму путем деградации G1-циклинов (циклины дрожжей называются CLN2 и CLN3) и ингибитора циклин-зависимых киназ Sic1. СDС34 (Се11 division cус1е 34) является убиквитинконъюгирующим ферментом Е2. Регуляция стабильности субстратов СDС34-опосредованого убиквитинирования достигается за счет их фосфорилирования. Ингибитор циклин-зависимых киназ Sic1 стабилен во время ранней G1-фазы и препятствует преждевременной активации циклин-зависимых киназ S-фазы, но в поздней фазе G1 он быстро деградирует, и циклин-зависимые киназы S-фазы инициируют репликацию ДНК. Сходная ситуация наблюдается и у позвоночных, в клетках которых экспрессируются структурные и функциональные гомологи компонентов СDС34 пути. АРС (Anaphase promoting Соmр1ех), или циклосома, представляет собой белковый комплекс, содержащий убиквитинпротеин-лигазу Е3, и осуществляющий при переходе от метафазы к анафазе убиквитин-зависимую протеасомную деградацию ингибиторов анафазы, а при выходе из митоза ― митотических циклинов. Циклины A и B имеют состоящий из 9 аминокислот консервативный фрагмент, названный «destruction box». После изменений именно в этом фрагменте они становятся объектами для убиквитинирования. У мутантов, утративших «destruction box», циклины не убиквитинируются и не деградируют, поэтому у них клеточный цикл останавливается в поздней анафазе. 244 Вопросы для повторения 1. Как вы представляете взаимодействие генов и кодируемых ими белков в процессах поддержания стабильности передающейся по наследству информации и предотвращения нарушения процесса ее копирования? 2. Как изменялся взгляд на изменения молекулы ДНК в процессе ее функционирования? 3. Как гены ДНК-метаболизма связаны с происхождением и эволюцией живых организмов, их способностью приспосабливаться к изменениям окружающей среды? 4. Каковы ваши представления о взаитмодействии и взаимозависимости процессов репликации, рекомбинации и репарации ДНК? 5. В каких областях биологии и медицины могут быть применены детальные знания процессов репликации и рекомбинации ДНК? 6. Каковы молекулярные основы кинетика клеточного цикла? 7. Как вам представляется активность и взаимное влияние большого числа (больше 150) генов и кодируемых ими белков в процессах поддержания стабильности передающейся по наследству информации и предотвращения появления мутаций? 8. Как вы можете сформулировать новую парадигму о динамических изменениях молекулы ДНК при ее повреждении и репарации. 9. Каковы молекулярные основы чекпойнт-ответа клетки на повреждения ДНК? 10. Что такое метилировантие ДНК? Поддерживающее метилирование? 11. Что вы знаете об активной деградации белков и ее регуляции? 12. Какова роль активной деградации белков в иммунном ответе организма? В регуляции процессов ДНК-метаболизма? В кинетике клеточного цикла? 245 Библиографический список 1. Жимулев В.Ф. Общая и молекулярная генетика. Сибирское университетское издательство. Новосибирскк. 2003. 527 с. 2. Василенко Н.Л., Невинский Г.А. Ферменты прямой, эксцизионной и коррекционной репарации высших и низших организмов и их биологическая роль. Мол. биол., 2003. 37:944-960. 3. Крутяков В.М. Ферментативные механизмы антимутагенеза: роль автономных 3 →5 - экзонуклеаз. Бреслеровские чтения. 2002. 85-94. 4. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. В 3-х т. Т. 1. Генная и белковая инженерия. М.: Наука. 2004. 526 с. 5. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х т. Т. 1. Пер. с англ. М.:«Мир». 1998. 373 с. 6. Абрамова Е. Б., Шарова Н. П., Карпов В. Л. Протеасома: разрушать, чтобы жить. Мол. биол., 2002. 36:761-776. 7. Шарова Н.П. , Абрамова К.Б. Инициация репликации ДНК эукариот — интригующий каскад межбелковых взаимодействий. Молекулярная биология. 2002. 67:1217-1223. 8. Коничев А.С. Молекулярная биология: Учеб. Для студ. Пед. ВУЗ’ов. Издательский центр «Академия». 2005. 400 с. 9. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811 246
