Лабораторная работа №1 Количественное определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту Цель: количественно определить активность α-амилазы слюны по методу Вольгемута. 1. Теоретическое введение Слюна – это сложная биологическая жидкость, участвующая в подержании гоместоза полости рта. Слюна обеспечивает глубокое переваривание пищи. Амилаза — фермент, расщепляющий крахмал до мальтозы, глюкозы и декстринов. Амилазная активность характеризует деятельность пищеварительной системы (индивидуальная особенность). Гидролитическое расщепление крахмала зависит от температуры, времени, концентрации субстрата (крахмала) и др. Разработана стандартные методики оценки амилазной активности слюны человека. Одна из методик – методика по Вольгемуту. В ней зафиксированы следующие условия: время, температура. В норме амилазная активность у человека равна 160-320. Если амилазная активность меньше 80, то это говорит о патологии. Амилазная активность обозначается следующим образом: А 38°/30’ = 160 – 320 2. Методическая часть 2.1 Посуда и оборудование: 10 пробирок, штатив для пробирок, водяная баня, пипетки. 2.2 Реактивы: дистиллированная вода, 0,1% раствор крахмала, раствор слюны 1/10, 1% раствор йода в йодиде калия, 1% раствор CuSO4. 2.3 Биологический материал и его подготовка к эксперименту: В качестве биологического материала использовали образцы слюны. В пробирку вносят 1 мл слюны и разбавляют в 10 раз. Тщательно перемешивают содержимое пробирки. 2.4 Ход работы В 8 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую из них добавляют 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Содержимое перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и так далее. Из восьмой пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Перемешивают, встряхивая пробирки, и помещают на водяную баню при 38° на 30 минут. После инкубации пробирки охлаждают холодной водой, добавляют по 1 капле 1% раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый, фиолетовый и синий цвета. Отмечают последнюю пробирку с желтой окраской, где гидролиз крахмала прошел полностью и делают расчет. Результаты активности слюны при гидролизе крахмала представлены в таблице 1. 3. Результаты эксперимента и его обсуждение Таблица 1 Изменение цвета крахмала при его ферментативном разрушении под действием слюны Рязанцевой Татьяны Разведение слюны 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 Пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 Окраска желтая желтая желтая розовая синяя синяя синяя синяя с I2 Можно отметить, что в разведениях №1, №2 и №3 амилазная активность высокая и крахмал полностью гидролизовался до моносахаридов. В разведении №4 амилазная активность слабее и крахмал гидролизовался не полностью – до декстринов. В разведениях №5, №6, №7 и №8 амилазная активность не проявляется. То есть крахмал не гидролизовался. Отмечают пробирку с желтой окраской. В данном случае – это разведение №3 (1/80). Активность будет определяться как 2 * на разведение пробирки с желтой окраской. Амилазная активность данного образца будет определяться следующим образом: А 38°/30’= 2 * 80 = 160 Полученный результат удовлетворяет минимуму от нормы амилазной активности слюны человека. 4. Вывод 4.1 Определили в каких разведениях образца слюны человека амилазная активность наиболее выражена, а в каких она не проявляется. 4.2 С помощью метода Вольгемута количественно определили амилазную активность образца слюны. Для данного образца А составила 160 единиц, что соответствует норме. Лабораторная работа №2 Влияние токсикантов на амилазную активность слюны Цель: обнаружить влияние активаторов (NaCl) и токсикантов-ингибиторов (CdSO4 и CuSO4) на амилазную активность слюны. 1. Теоретическое введение Слюна – это сложная биологическая жидкость, вырабатываемая специализированными железами и выделяемая в ротовую полость, обеспечивая глубокое пищеварение. Амилаза — фермент, расщепляющий крахмал до мальтозы, глюкозы и декстринов. Фермент гидролизует 1,4 – гликозидные связи в молекулах крахмала и гликогена, в результате чего образуются моносахариды и декстрины. Амилаза присутствует в слюне, где начинает процесс пищеварения. Значительное влияние на активность α – амилазы оказывает присутствие хлорид-иона. Сl- рассматривается как естественный активатор фермента. Растворы сернокислой меди или сернокислого кадмия (а также солей тяжелых металлов), наоборот, сильно замедляют действие амилазы слюны. Такие токсиканты встречаются в табачном дыме, неочищенной питьевой воде, пищевых консервантах. Субстратам для действия амилаз является крахмал. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия a-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются a-амилазой до ди- и моносахаридов. 2. Методическая часть 2.1 Посуда и оборудование: лабораторные пробирки, мерные пробирки, штативы для пробирок, химические стаканы, термометр, водяная баня, пипетки, электрическая плитка. 2.2 Реактивы: раствор крахмала (1%), раствор I2 (1%), раствор NaCl (1%), раствор СuSO4 (1%; 0,2%; 0,1%; 0,05%; 0,02%), раствор CdSO4 (1%; 0,1%; 0,01%); дистиллированная вода. 2.3 Биологический материал и его приготовление. В качестве биологического материала используют образцы слюны. Перед проведением опыта готовят растворы биоматериалов. Для этого в пробирку вносят небольшое количество слюны (около 1 мл), разбавляют ее в 5 раз и тщательно перемешивают. 2.4 Ход работы Для проведения анализа подготавливают биологический материал в виде слюны. Готовят требующееся для опыта количество пробирок. В 5 пробирок поочередно приливают по 10 капель 1%-го раствора крахмала, затем вносят в первую пробирку 5 капель 1% раствора активатора NaCl, в три последующие пробирки вносят раствор ингибитора СdSO4 с концентрациями 1%; 0,1% и 0,01% соответственно. Последнюю пробирку оставляют для контрольного раствора без активатора и ингибитора, используя дистиллированную воду. Затем в каждую из пробирок добавляют по 5 капель раствора слюны. Пробирки встряхивают и ставят на водяную баню на 15 минут при температуре 35-36°С. После этого в каждую пробирку добавляют по 1 капле йода. Результаты анализа отображены в таблице 1. 3.Результаты эксперимента и его обсуждение Влияние токсиканта СdSO4 на амилазную активность слюны Рязанцевой Татьяны и степень расщепления крахмала Таблица 1 W, % Цвет р-ра 1 желтый Токсикант СdSO4 0,1 0,01 желтый желтый 0 желтый NaCl желтый Степень гидролитического расщепления крахмала оценивается по интенсивности окраски крахмала. Видим, что данный токсикант не повлиял на активность амилазы, так как все растворы с разным содержанием токсиканта имеют желтый цвет, то есть крахмал полностью не гидролизовался. Затем провели анализ того же образца слюны по той же методике, предварительно изменив токсикант. Использовали раствор CuSO4 с концентрациями 1%; 0,2%; 0,1%; 0,05%; 0,02%. Полученные данные представили в виде таблицы 2. Влияние токсиканта CuSO4 на амилазную активность слюны Рязанцевой Татьяны и степень расщепления крахмала Таблица 2 W, % 1 Цвет р-ра Синий Токсикант CuSO4 0,2 0,1 0,05 Синий Фиолет. Корич. 0,02 Рыжий 0 Желтый NaCl Желт. Разная окраска растворов свидетельствует о том, что данный токсикант повлиял на амилазную активность данного образца слюны. С увеличением концентрации CuSO4 в растворе слюны уменьшается активность амилазы. 4. Вывод 4.1 При действии активатора происходит полное разрушение крахмала. Не фиксированное время гидролиза не дает возможности оценить действие NaCl. В условиях эксперимента исходный раствор слюны и раствор активатора и слюны проявляют высокую амилазную активность до полного разрушения крахмала. Оценивать влияние активатора при фиксированном времени гидролиза не удалось. 4.2 Растворы токсиканта СdSO4 разных концентраций не повлияли на амилазную активность слюны. Сделали вывод о непригодности раствора данного токсиканта. 4.3 Раствор токсиканта CuSO4 оказал действие на амилазную активность слюны. При концентрации больше 0,2% слюна не проявляет амилазной активности. При концентрации 0,02% амилазная активность снижается и углеводы разрушаются до декстринов. Лабораторная работа №3 Изучение влияния токсикантов на подъемную силу дрожжей Цель: изучить влияние токсикантов на подъемную силу дрожжей. 1. Теоретическое введение Дрожжи – это внетаксономическая группа одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах. Дрожжи независимо от их формы (прессованные, сушеные и жидкие) при приготовлении теста выступают возбудителями спиртового брожения, одним из продуктов которого являются пузырьки диоксида углерода. Броже́ние — процесс анаэробного расщепления органических веществ, преимущественно углеводов, происходящий под влиянием микроорганизмов или выделенных из них ферментов C6H12O6 → 2C2H5OH+2CO2 + 235 кДж Подъемная сила дрожжей характеризует их способность сбраживать сахара и разрыхлять тесто. Подъемную силу дрожжей можно определять по скорости подъема теста в термостате или ускоренным методом по скорости всплывания шарика теста. 2. Методическая часть 2.1 Посуда и оборудование: лабораторные пробирки, мерные пробирки, штативы для пробирок, химические стаканы, термометр, водяная баня, пипетки, электрическая плитка, керамическая ступка и пестик, 2.2 Реактивы: раствор NaCl (2,0%), раствор СuSO4 (1%; 0,1%; 0,01%); дистиллированная вода. 2.3 Биологический материал: в качестве биологического материала используют прессованные дрожжи ‹‹Люкс››, мука пшеничная. 2.4 Ход работы Взвешивают 0,31г прессованных дрожжей. Количественно переносят дрожжи в фарфоровую чашку и приливают 4,8 см3 2,0% раствора поваренной соли, нагретого до температуры 35оС. Пестиком тщательно перемешивают смесь дрожжей, воды и соли до получения однородной водной суспензии. К полученной суспензии прибавляют 7 г пшеничной муки, замешивают тесто и скатывают его в шарик. Шарик сразу помещают в стакан с водой, нагретой до 35 оС. Помещают стакан в термостат с температурой 35 оС. Фиксируют время в минутах от момента помещения стакана с шариком в термостат до момента всплывания шарика. Для определения влияния токсикантов вместо раствора поваренной соли добавляют растворы токсикантов (CuSO4) разной концентрации (1%; 0,1%; 0,01%). 3.Результаты эксперимента и его обсуждение При проведении контрольного опыта установили время, за которое всплыл шарик из теста, содержащий раствор соли NaCl (2,0%) и не содержащий токсикант. Время всплывания равно 11 мин. Затем проанализировали результаты, полученные при добавлении в тесто раствор токсиканта разных концентраций. Полученные результаты занесли в таблицу 1. Влияние на подъемную силу прессованных дрожжей ‹‹Люкс›› токсиканта CuSO4 Таблица 1 Раствор токсиканта Cu2+ Время подъема шара дрожжей (мин) при концентрации токсиканта (%) 0,01% 0,1% 1% 12 25 не вспл. Полученное время всплывание шарика свидетельствует о явном влиянии токсиканта на подъемную силу прессованных дрожжей. Увеличение времени пропорционально увеличению концентрации токсиканта. Зависимость носит линейный характер. 4. Вывод 4.1 Установили, что используемый токсикант CuSO4 оказывает влияние на подьемную силу дрожжей. Во время эксперимента было выявлено угнетение активности ферментов (прекращение брожения, отсутствие возникновения углекислого газа, что обуславливало плохую всплываемость шарика); 4.2 Для используемого токсиканта была установлена линейная зависимость времени всплывания шарика от концентрации токсиканта (чем выше его концентрация, тем больше снижение подъемной силы). Лабораторная работа №4 Биоиндикация токсичности растительного сырья Цель: методом биоиндикации определить степень токсичности в растительном сырье 1. Теоретическое введение Биоиндикация – метод обнаружения и оценки абиотических и биотических факторов местообитания при помощи биологических систем. Существует два основных метода биоиндикации: пассивный и активный. Чаще всего в качестве индикаторов используют лишайники (лихеноиндикация), мхи (бриоиндикация), сосудистые растения (широко используются древесные растения – дендроиндикация). Биоиндикаторами могут быть живые организмы, обладающие хорошо выраженной реакцией на внешнее воздействие: различные виды бактерий, водорослей, грибов, растений, животных и т.п. Существенным свойством биоиндикаторов является чувствительность. 2. Методическая часть 2.1 Посуда и оборудование: лабораторные пробирки, мерные пробирки, штативы для пробирок, химические стаканы, термометр, пипетки, электрическая плитка, фильтры, чашки Петри, фарфоровые ступка и пестик. 2.2 Реактивы: дистиллированная вода 2.3 Биологический материал и его приготовление. В качестве биологического материала используют Solánum lycopérsicum (помидор) и Cucumis sativus (огурец), семена редиса и пшеницы. 2.4 Ход работы В ступке размалывают до однородной массы образцы помидора так, чтобы получилось 100 г измельченной массы. Затем помещают массу в мерную колбу объемом 250 мл и приливают 100 мл воды. Интенсивно взбалтывают содержимое и отфильтровывают. Отбирают аликвоту 4 мл. Замачивают в данном объеме жидкости семена редиса и пшеницы по 45 семян каждого вида сырья и оставляют на сутки. То же самое проделываем и с образцом огурца. В качестве контроля используют водопроводную воду (предварительно кипяченую и охлажденную). Через сутки подготавливают чашки Петри следующим образом: на дно чашки кладут 3 фильтра так, чтобы они плотно прилегали ко дну. Смачивают фильтры полученными растворами помидора и огурца таким образом, чтобы фильтр был полностью смочен жидкостью. Фильтры контрольной чашки смачивают водой. Оставляют семена в темном месте на 72ч. По истечении времени анализируют полученные результаты. 3.Результаты эксперимента и его обсуждение По истечении 72 часов замерили мерной линейкой общую длину проростков в каждой чашке Петри. Определили среднюю длину проростка в каждой чашке. Средняя длина проростка, полученная на контрольном варианте, соответствует 100%, а результаты на других вариантах сопоставляли с контролем (в%). Полученные данные занесли в таблицу 1,2. Выявление степени токсичности в образцах помидора и огурца при использовании в качестве биоиндикатора семян редиса,% Таблица 1 Биоиндикатор Образец Контроль Помидор Огурец Lср, мм 11,4 10,2 6,6 % 100 89,47 57,89 Семена редиса Lcр проростков,% 0 10,5 42 Характеристика малотоксичен умеренно токсичен Выявление степени токсичности в образцах помидора и огурца при использовании в качестве биоиндикатора семян пшеницы,% Таблица 2 Биоиндикатор Образец Контроль Помидор Огурец Lср, мм 29 23,8 28,5 % 100 82,1 98,27 Семена пшеницы Lcр проростков,% 0 17,9 12 Характеристика малотоксичен малотоксичен Можно заметить, что практически все образцы показали хороший результат. Содержание токсических веществ в образцах помидора оба биоиндикатора определили как допустимое, то есть относящееся к 4 классу токсичности. Биоиндикатор, в роли которого выступали семена редиса, определил умеренное содержание токсичности в образцах огурца, то есть количество вредных веществ, относящееся к 3 классу точности. Однако, биоиндикатор, в качестве которого выступали семена пшеницы, повышенной токсичности не зафиксировал. 4.Вывод 4.1 Методом биоиндикаци, используя в качестве биоиндикаторов семена редиса и пшеницы, определили степень токсичности образцов помидора и огурца. 4.2 При использовании в качестве биоиндикатора семян редиса, было установлено, что в образцах огурца содержание токсиканта относилось к 3 классу опасности, то есть образец был умеренно токсичен, в то время, как образец помидора был зафиксирован как малотоксичный, а содержание вредных веществ принадлежало 4 классу опасности. 4.3 При использовании в качестве биоиндикатора семян пшеницы, было установлено, что в образцах огурца и образцах помидора содержание токсиканта относилось к 4 классу опасности, то есть оба образца были малотоксичны. 4.4 При анализе полученных результатов выяснили, что семена редиса проявляют чувствительность выше, чем семена пшеницы, поэтому целесообразней для анализа методом биоиндикации использовать в качестве биоиндикатора семена редиса, а не пшеницы. Курский государственный университет Кафедра химии ОТЧЕТ ПО ЛАБОРАТОРНОМУ ПРАКТИКУМУ по дисциплине ‹‹Химическая токсикология›› Выполнила студентка 3 курса Направление подготовки 04.03.01 Химия Профиль: Химия и технология органических веществ Зайцева Дарья Сергеевна Проверила доцент кафедры химии Атрепьева Л.В.
