Баллы и способы их зарабатывания o Максимальное количество баллов за курс – 100, нормируемое к требуемому количеству баллов (в зависимости от того, зачет или экзамен будет в конце курса) o Источники баллов: n Работа на лекциях/семинарах (интересные вопросы, замечания, предложения, идеи и т.д.) n Выполнение он-лайн курса «Основы генетической инженерии» (в разработке) n Написание спецрефератов n Написание манускриптов Манускрипт o Ру́копись — собирательное название текстов, написанных от руки, синоним термина манускрипт (позднелат. manuscriptum, от лат. manus — рука и scribo — пишу). Как правило, рукописью называют черновики литературных произведений, либо их образцы, написанные автором от руки.[ определение взято из Рукопись // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: в 86 т. (82 т. и 4 доп.). — СПб., 1890—1907] o В науке: манускрипт – текст статьи, посылаемый авторами для публикации в рецензируемом научном журнале. Лекция 2 Методы очистки и детекции нуклеиновых кислот и белков Начало генетической инженерии Очистка ДНК Очистка РНК Очистка белка Полимеразная цепная реакция Синтез кДНК Саузерн-, Нозерн-, Вестерн-блоттинг анализы o Ферменты для манипуляций с нуклеиновыми кислотами и белками in vitro o o o o o o o Генетическая инженерия Экспериментальный раздел молекулярной генетики, совокупность приемов, методов и технологий для целенаправленного создания новых комбинаций и внесения изменений в генетический материал как in vitro так и in vivo. Открытие антибиотиков o В 1928 г британский бактериолог Александр Флеминг обнаружил антимикробные свойства пенициллина o o В 1940 г. Эрнст Борис Чейн и Ховард Вальтер Флори предложили способ очистки пенициллина В 1945 г. Флеминг, Флори и Чейн удостоены Нобелевской премии за «открытие пенициллина и его лечебный эффект на различные инфекционные болезни» Открытие антибиотиков o В 1928 г британский бактериолог Александр Флеминг обнаружил антимикробные свойства пенициллина o o В 1940 г. Эрнст Борис Чейн и Ховард Вальтер Флори предложили способ очистки пенициллина В 1945 г. Флеминг, Флори и Чейн удостоены Нобелевской премии за «открытие пенициллина и его лечебный эффект на различные инфекционные болезни» Казалось, что мы близки к полной победе над бактериальными эпидемиями… R-факторы o В 1960х годах обнаружены штаммы патогенных бактерий устойчивых к одному или нескольким антибиотикам. o Факторы устойчивости к антибиотикам (resistance factors, Rfactors) – были идентифицированы как отдельные единицы наследственности (гены), но они не картировались на хромосомы бактерий. R-факторы могли передаваться от одной бактерии к другой. Долгое время их структура была неясна. o Плазмиды В 1952 г. Джошуа Ледеберг (Joshua Ledeberg) предложил термин плазмида (plasmid) [ гибрид слов цитоплазма (cytoplasm) и ИД (id)], обозначающий любой фактор внехромосомной наследственности (включая и R-факторы). В 1958 г Эли Жакоб (Élie Jacob) и Франсуа Волман (François Wollman) предложили термин эписома, обозначающий не важный генетический элемент, который может существовать автономно или быть встроенным в хромосому. В 1968 г. на симпозиуме, посвященном плазмидам и эписомам, предложено использовать только термин плазмида. Джошуа Ледеберг (1925-2008 гг) Современное определение плазмиды □ Плазмида - небольшая молекула ДНК физически отделимая от хромосом и способная реплицироваться автономно. \ // Ыа promoter CMV prom oter Amp(R| .» CMV forward primer T7 primer 17 promoter 7K pUC origin / X, CE LNC Я и Г (и о з) pR SVlucM S SV40 pA Neo(R) 74«bp NS1 NC . - ■ \ \ \ NT7TERM SV40 early promoter \ BOH reverse primer \ i Origin of Replication BGHpA M origin Начало генетической инженерии In vitro получена плазмида, состоящая из фрагментов ДНК вируса SV40, E.coli и фага λ. Показано, что такая гибридная молекула может реплицироваться в клетках млекопитающих. Начало генетической инженерии В плазмиду E.coli pSC101, несущую ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, авторы встроили ген устойчивости к антибиотику – канамицину из другой плазмиды E.coli pSC102. Полученная химерная плазмида обеспечивала устойчивость E.coli к обоим антибиотикам, т.е. гибридная плазмида не только реплицировалась, но и работала. Начало генетической инженерии В работе показано, что можно «пересадить» гены из плазмид стафилококка в плазмиды E.coli и эти гены в составе химерных межвидовых плазмид нормально работают в E.coli. Начало генетической инженерии В работе показано, что эукариотические гены можно встроить в бактериальную плазмиду и они будут экспрессироваться. Базовый принцип генетической инженерии Модульность генетических конструкций Наследственный материал (ДНК) может быть разделен на структурно и функционально независимые фрагменты (модули), которые можно соединять с другими фрагментами различного происхождения в более сложные конструкции с сохранением активности всех частей конструкции. Очистка геномной ДНК o Выделение всех нуклеиновых кислот со смесью фенол-хлороформ (pH = 8.0). Удаление РНК при помощи РНКазы. o Выделение методом щелочного лизиса с нагреванием. При нагревании в щелочных условиях происходит автогидролиз РНК. o Использование коммерческих наборов. Осаждение ДНК, носители o ДНК формирует осадок в присутствие одновалетных ионов, нейтрализующих заряд фосфатных групп, и спирта, отбирающего воду. Пример, 0,1 объема 3М NaOAc и 2 -2,5 объема этилового спирта или 0,8 – 1,0 объема изопропилового спирта. o Для осаждения малых количеств ДНК в смесь добавляют носители: Гликоген o тРНК o Полиамины (спермин) o Линейный полиакриламид Задача носителя сформировать основу, к которой прилипнут фрагменты нуклеиновых кислот. Очистка плазмидной ДНК методом щелочного лизиса Метод основан на создании условий для денатурации геномной ДНК, белков, с последующим выпадением их в осадок Наборы для выделения плазмидной ДНК Основной принцип работы: сорбция ДНК на силикатной мембране или фильтре, промывка этанолом и элюция водой или лучше буферным раствором (Tris pH8.0) Не элюируйте буфером, содержащим EDTA!!! Электрофорез в агарозном геле В электрическом поле нуклеиновые кислоты движутся в направлении к катоду (+). В агарозном геле фрагменты нуклеиновых кислот разделяются в геле в соответствии с их длиной. Флуоресцентные красители нуклеиновых кислот in vitro Бромистый этидий SYBR Green I Очистка ДНК из агарозного геля Основана на ферментативном (агараза) или химическом (перхлорат натрия) расщеплении агарозы. Определение концентрации ДНК □ Спектрофотометрически. Прибор NanoDrop. Показатель чистоты: отношение O D 260/O D 280 = 1.8 1.9. Дает завышенные показания из-за примесей. □ При помощи флуоресцентных красителей. Прибор Qubit. Не дает информации о чистоте препарата. □ При помощи ПЦР. Для оценки количества конкретного фрагмента ДНК. В качестве контроля используется серия стандартов с известной концентрацией. Выделение тотальной РНК o Выделение при помощи фенолхлороформ, имеющей кислый pH (pH = 4.0). ДНК в этих условиях находится в интерфазе. Расщепление примесей ДНК при помощи ДНКазы I. o Выделение при помощи коммерческих наборов Очистка фракции полиаденилированной РНК o При помощи коммерческих наборов. Принцип работы: аффинная хроматография на сорбенте с олиго-dT Определение концентрации РНК □ Спектрофотометричес ки. Показатель чистоты: отношение O D 260/O D280 > 2 .0 . □ При помощи флуоресцентных красителей. Прибор Qubit □ ОТ-ПЦР-РВ. Оценка количества определенной РНК. Вместе со стандартами количества очищенной РНК. Электрофорез РНК в агарозном геле Отличия от электрофореза ДНК: 1. Все используемые приборы и реактивы должны быть чистыми от РНКаз 2. Предварительная денатурация РНК в формамиде 3. Краситель добавляют в образец РНК 4. В гель добавляют формальдегид Синтез первой цепи кДНК MMLV +- +- +- +- +- Матрица: тотальная Применение РНК, полиаденилированная фракция РНК • Анализ экспрессии генов Праймеры: олиго- • Клонирование кодирующих частей генов dT, рассеянная затравка Синтез второй цепи кДНК Матрица: тотальная РНК, полиаденилированная фракция РНК Праймеры: олиго-dT, рассеянная затравка Применение: 1. Приготовление библиотек кДНК для секвенирования следующего поколения 2. Клонирование 3. Вычитающая гибридизация Полимеразная цепная реакция Компоненты реакции: 1. Буфер 2. Нуклеозидтрифосфаты 3. Праймеры 4. Матрица Стадии реакции: 1. Денатурация (95ºС) 2. Отжиг праймеров (40 – 72ºС) 3. Элонгация синтеза (72 ºС) 5. Термостабильная ДНК полимераза Кривая амплификации ДНК Плато количества продуктов реакции o истощение субстратов (дНТФ и праймеров) o падение активности фермента o накопление ингибиторов, включая пирофосфаты и двуцепочечную ДНК o конкуренция за фермент неспецифическими продуктами или праймер-димерами o неполная денатурация ПЦР продуктов при высокой концентрации. ПЦР в реальном времени ПЦР в присутствии флуоресцирующего ДНК красителя, например, SYBR Green I. В через равные интервалы времени происходит считывание уровня флуоресценции и строится график накопления сигнала Параметры реакции: 1. пороговый цикл 2. эффективность реакции Способы генерации флуоресцентного сигнала Интеркалирующие красители o SYBR green I Неинтеркалирующие красители o Eva Green Гибридизационные зонды o Taqman o Молекулярные маяки o Пробы FRET Нозерн блоттинг (Nothern blotting) анализ Метод детекции определенных фрагментов РНК путем гибридизации фракции разделенных РНК с меченными зондами Саузерн блоттинг (Southern blotting) анализ Метод детекции определенных фрагментов ДНК при помощи гибридизации с меченными зондами. Схема метода аналогична нозерн блоттингу. Сэр Edwin Mellor Southern (род. 1938 г.) Очистка белков: виды хроматографий o Аффинная – связывание белка на сорбенте за счет субстрата, антител или иных молекул, специфично взаимодействующих с нужным белком. Частный случай: никель-хелатная хроматография. o Гель-фильтрационная – разделение белков по размеру. o Ионо-обменная – разделение белков по заряду. o Обратно-фазная – разделение белков по степени гидрофобности. Металл-аффинная хроматография белков с гексагистидиновой меткой (6хHis) на Ni-NTA-агарозе Механизм действия Ni-NTA агарозы NTAнитрилотрехуксусная кислота, хелатор ионов никеля Механизм связывания гистидиновой метки с Ni-NTA агарозой основан на образовании координационных связей с ионами Ni Определение концентрации белков Чистый белок: o Спектрофотометрически: (OD224 - OD233)/0.0496 o Метод Бредфорд. o Метод Лоури. В белковой смеси: o Вестерн-блот анализ со стандартами количества данного белка o ELISA Разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) o o o o Белки могут быть предварительно денатурированы в SDS или мочевине (денатурирующий ПААГ) или разделятся без денатурации (нативный ПААГ). В денатурирующем ПААГ разделение белков идет преимущественно в соответствии с их массой В нативном ПААГ белки разделяются в зависимости от их формы и заряда. Окраска гелей: Coomassie, нитрат серебра. L – исходный клеточный лизат FT - фракция «проскока» W – фракция промывки E – элюат M - маркеры молекулярной массы белков Вестерн-блот анализ белков o Этап 1. Разделение белков в ПААГ o Этап 2. Перенос белков на мембрану (нитроцеллюлозную, PVDF) o Этап 3. Инкубация мембраны с антителами против нужного белка(ов), коньюгированных с ферментом (люцифераза, пероксидаза) o Этап 4. Экспозиция мембраны с фоточувствительной бумагой/экраном. Детекция сигнала Вестерн-блот анализ белков Ожидание Реальность "Я знаю, как я умру. Это будет в фотокомнате... от инфаркта..." Приписывается Е.Тульчинскому. Дот-блот и слот-блот анализы белков и белковых смесей Слот-блот
