Министерство науки и высшего образования РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Химический институт им. А.М. Бутлерова КАФЕДРА ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ КАСИМОВА ЗАЙНАБ РИНАДОВНА ОТЧЕТ ПО ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЕ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ Студент 4 курса Группа 07-608 Касимова З.Р. Казань–2019 1 Цель работы: ознакомление с методом флуоресценции, устройством импульсного спектрофотометра Fluorolog 3 (FL 3-221- NIR), приобретение умения регистрировать и анализировать электронные спектры испускания и возбуждения органического соединения (эозина В) в растворах. Флуоресценцией называют излучательный переход возбужденного состояния с самого нижнего синглетного колебательного уровня S1 в основное состояние S0. в общем случае флуоресценцией называют разрешенный по спину излучательный переход между двумя состояниями одинаковой мультиплетности: между синглетными уровнями S1 → S0 или триплетным Т1 → Т0. Типичное время такого возбужденного состояния составляет 10 -8 ̶ 10-6 с. Согласно представлениям квантовой химии, электроны в атомах расположены на энергетических уровнях. Каждому электронному уровню (S0, S1, S2) сопутствует несколько колебательных подуровней (υ0, υ1, υ2). При поглощении света (hνA – процесс, происходит за время порядка 10–15с) электрон переходит с одного из колебательных уровней основного электронного состояния S0 на некоторый высший колебательный уровень состояний S1 или S2 (принцип Франка-Кондона) с сохранением спина. После этого большинство молекул претерпевают быструю релаксацию, т.е. электрон спускается на самый нижний колебательный уровень состояния S1. Эта внутренняя конверсия происходит за время порядка 10–12 с и заканчивается до процесса «возвращения» возбужденного электрона в основное состояние. Следовательно, испускание чаще всего осуществляется из равновесного возбуждённого состояния (S0); это и есть процесс флуоресценции. К важнейшим характеристикам флуоресценции относятся: Стоксов сдвиг. Сдвиг полосы испускания относительно полосы поглощения в сторону больших длин волн (спектр испускания – зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждающего света; cпектр возбуждения – зависимость интенсивности испускания при определённой длине волны от длины волны возбуждающего 2 света). Одной из основных причин Стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень первого возбужденного электронного состояния S1 (т.е. потеря энергии). Cдвиг может быть смещен под влиянием растворителя и реакций в возбуждённых состояниях. Испускание без сдвига наблюдается в газах, когда их концентрации малы настолько, что возбуждённые молекулы не претерпевают столкновений с другими до процесса испускания. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения. Спектр испускания обычно не зависит от длины волны возбуждения, поскольку при возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния S1. Иногда испускание может происходить как из S1, так и из S2 состояния (например, в азулене). Правило зеркальной симметрии. Обычно спектр флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее поглощения, соответствующего переходу из S0 в S1. Cимметричная природа спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S0 и S1. Из этого правила есть много исключений. Они бывают обусловлены различным геометрическим положением ядер в основном и возбуждённом состояниях (например, у дифенила). Другой причиной являются возможные реакции в возбуждённых состояниях. Молекулы пирена при возбуждении переходят в эксимеры (возбуждённые димеры), испускание которых смещено в длинноволновую область по сравнению с мономером. Время затухания флуоресценции – средний промежуток времени, в течение которого молекула остаётся в возбуждённом состоянии, прежде чем вернуться в основное. Квантовый выход флуоресценции − отношение числа испущенных фотонов к поглощённым. 3 Вещества, проявляющие флуоресценцию, называются флуорофорами – это, как правило, органические вещества, содержащие систему сопряженных π-связей. Наиболее известными являются хини, РОРОР, флуоресцин, акридиновые красители (акридиновый желтый, акридиновый желтый), родамины (родамин 6G, родамин В), белки (флуоресценция белков обусловлена содержанием в них остатков флуоресцирующих аминокислот), кофакторы, лантаноиды и др. O O OH (C2H5)2N O N(C2H5)2 COOH COOH антрацен родамин В флуоресцеин N N O O POPOP N O PPO 2,5-дифенилоксазол n-бис[2-(5-фенилоксазолил)]бензол Рис.1 Примеры флюорофоров 4 Схема прибора: 450 Вт ксеноновая лампа (без озона) и150 Вт ксеноновая пульсирующая лампа Двойной монохроматор возбуждения возбуждения Одинарный монохроматор испускания детектор УФ и видимого диапазона Двойной монохроматор испускания Кюветное отделение Рис.2 Блок-схема спектрофлуориметра Fluorolog 3 (FL 3-221- NIR) Ход работы: Приготовление серии калибровочных растворов: 1. Исходный раствор 1мМ родамина разбавляли дистиллированной водой до получения растворов с концентрациями 0,0025 мМ, 0,0045 мМ, 0,0065 мМ, 0,0085 мМ, 0,015 мМ объемом 2,5 мл. 1.Включили лампу, блок управления прибором и компьютер. 2. Прогрели лампу в течение 20-30 минут для ее стабильной работы. 3. На компьютере в программе FluorEssence выбрали тип эксперимента Excitation. 4. Откалибровали монохроматор возбуждения по спектру лампы. Для этого: а) нажали на кнопку Load…, выбрали в папке c/program files/JobinYvon/Data/ExperimentTemplates файл ISOLampCal.xml. б) нажали внизу панели на кнопку Run. 5 в) с помощью курсора проверили положение реперного пика (467 нм). 5. Откалибровали монохроматор испускания. Для этого: а) поставили в кюветное отделение кювету с дистиллированной водой. б) нажали на кнопку Load…, выбрали в папке c/program files/JobinYvon/Data/ExperimentTemplates файл WaterRaman.xml. в) нажали внизу панели на кнопку Run. г) с помощь курсора проверили положение реперного пика (397 нм). Запись спектров возбуждения: 1. Нажали на кнопку M на верхней панели, выбрали тип эксперимента Excitation. 2. Выбрали пункт Monos, поставили галочки в пунктах Excitation1 и Emission1. Ввели нужные значения длины волны испускания (Emission) и диапазон сканирования длин волн возбуждения (Excitation). 3. Введите ширину щели 3 нм (Slits) для обоих монохроматоров (во избежание засвечивания детекторов). 4. В пункте Detectors выбрали время интегрирования 0.05 с (Integration Time). 5. Выбрали детекторы R и S, поставив в табличке Enable галочку напротив этих детекторов. 6. С помощью нижних табличек Signal Algebra и Operations ввели формулу S/R и добавили её (Add) в табличку Formulas. 7. Нажали внизу панели на кнопку Run. Запись спектров испускания: 1. Нажали на кнопку M на верхней панели, выберите тип эксперимента Emission. 2. Выполнили пункты 2 – 4 для записи спектров возбуждения. 3. Выбрали детектор S, поставив в табличке Enable галочку напротив этого детектора; для записи скорректированного спектра поставили галочку в графе Correction. 4. В нижней табличке Signal Algebra выбрали Sc (скорректированный сигнал) и добавили его (Add) в табличку Formulas. 5. Нажали внизу панели на кнопку Run. Вычитание фонового сигнала: 1. Поставили в кюветное отделение кювету с растворителем (этанол). 2. Выполнили пункты 1 – 5 для записи спектров испускания. При этом в табличке Enable галочку в графе Correction не ставили. 3. В нижней табличке Signal Algebra выбрали S (нескорректированный сигнал) и добавили его (Add) в табличку Formulas. 6 4. Нажали внизу панели на кнопку Run. 5. Создали файл бланка, нажав на кнопку Make Overlay File. 6. Заменили кювету с растворителем на кювету с исследуемым раствором. 7. Выполнили пункты 1–5 для записи спектров испускания. При этом в табличке Enable поставили галочки в графах Correction и Blank. Затем, нажав Subtract, выбрали созданный ранее ***.spc файл. 8. Нажали внизу панели на кнопку Run. Определение зависимости флюоресценции от концентрации растворов эозина В Приготовили растворы родамина в воде с концентрациями 0,0025 мМ, 0,0045 мМ, 0,0065 мМ, 0,0085 мМ, 0,015 мМ, объемами 2,5 мл путем последовательного разбавления. Поочередно помещаем приготовленные растворы в кюветы, начиная с наименьшей концентрации. Регистрируем спектры поглощения каждого раствора. Полученные результаты: 0,0025 мМ 1000000 Интенсивность, мкА 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 530 540 550 560 570 Длина волны, нм Рис.3 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0025 мМ 7 Интенсивность, мкА 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 490 515,5 541 566,5 592 Длина волны, нм Рис.4 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0045 мМ Интенсивность, мкА 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 490 515,5 541 566,5 Длина волны, нм Рис.5 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0065 мМ 8 592 Интенсивность, мкА 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 490 515,5 541 566,5 592 Длина волны, нм Рис.6 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0085 мМ Интенсивность, мкА 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 490 515,5 541 566,5 Длина волны, нм Рис.7 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,015 мМ 9 592 Интенсивность, мкА 2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 490 515,5 541 566,5 592 Длина волны, нм Рис.8 Спектр испускания раствора родамина с неизвестной концентрацией концентрация образца, мМ длина волны при интенсивность при максимальной эмиссии, максимальной нм эмиссии,мкА 0,0025 549,8 867216,2 0,0045 552,1 1397030 0,0065 551,5 2419950 0,0085 552,3 2847110 0,015 552,8 5411760 Х 550,8 1963300 10 Градуировочный график 6000000 y = 4E+08x - 122780 Интенсивность 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0,000 0,005 0,010 0,015 Концентрация расворов, ммоль/л Методом линейной аппроксимации было получено уравнение прямой зависимости максимальной флюоресценции от концентрации раствора родамина. Подставив в уравнение значение интенсивности, рассчитали неизвестную концентрацию. С = 0,00521 мМ Вывод: в ходе работы ознакомились с методом флуоресцентной спектроскопии; были приобретены навыки работы с устройством импульсного спектрофотометра Fluorolog 3 (FL 3-221- NIR), умения регистрировать электронные спектры испускания раствора органического соединения – родамина разной концентрации; определена концентрация раствора родамина с помощью градуировочного графика зависимости испускаемого излучения от концентрации раствора. 11
