МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра неорганической химии Глазов Илья Евгеньевич Доклад Материалы на основе гидроксиапатита Рецензент: к.х.н., доцент каф. неорганической химии Мычко Д.И. Минск, 2017 Содержание Введение ................................................................................................................. 3 Биогенный апатит.................................................................................................. 4 Синтетический гидроксиапатит........................................................................... 5 Синтетический замещенный гидроксиапатит .................................................... 11 Композиты на основе гидроксиапатита и биополимеров ................................. 9 Фибриновые композиты ....................................................................................... 11 Список литературы ............................................................................................... 14 2 Введение Возможность применения различных фосфатов кальция в медицине изучается с момента первого применения трикальцийфосфата (ТКФ) in vivo Элби и Моррисоном в 1920 г. [1]. На сегодняшний день использование в медицине препаратов и биоматериалов на основе фосфатов кальция стремительно растет [2] как в индивидуальном состоянии, так и в составе различных композитов. Кость представляет собой органо-неорганический биокомпозит, состоящий на 70% из неорганических кристаллов, преимущественно гидроксиапатита (ГА), и на 30% из органической матрицы, преимущественно из коллагена типа I [3]. Структурный порядок кости распространяется на несколько иерархических уровней (рис. 1). Рис. 1 Иерархическая структура кости при разных масштабах. ГА химически идентичен неорганической составляющей костной ткани с общей формулой Ca10(OH)2(PO4)6. С недавних пор, ГА используется для достижения разнообразных биомедицинских целей, включая получение матриц для управления высвобождением лекарственных средств и изготовление материалов для костно-тканевой инженерии [4]. 3 Биогенный апатит Состав. Биоапатит кости может иметь отклонение стехиометрического отношения кальция к фосфору от соответствующей гидроксиапатиту теоретической величины, равной 1,67 и изменяться в пределах от 1,37 до 1,77. Одна из причин такого отклонения –изоморфные превращения, протекающие на поверхности кристаллов. Влияние такого рода превращений на конечное отношение Ca/P велико из-за малого размера кристаллов. На поверхности и в объеме в разных концентрациях могут содержаться ионы K+, Na+, Mg2+, Sr2+, Cl-, F-. Особое место при исследовании стехиометрических отношений минерала кости занимает вопрос о локализации CO32-. Это один из ионов, содержащихся в кости в наибольшем количестве, хотя структурная роль в биоапатите до настоящего времени не ясна [5]. Химический состав биоапатита сильно зависит от вида твердой ткани. И концентрационные, и структурные отличия, обнаруживаемые в биоапатитах разных тканей, подчинены их функциональному назначению. Так, растворимость биогенных и синтетических карбонат-содержащих апатитов пропорциональна концентрации углерода в них. Примером функциональной подчиненности есть относительно высокое содержание карбонатов в биоапатите костной ткани, требующей постоянной перестройки и обновления, и существенно меньшее в апатите эмали зубов, являющейся наиболее стабильной и химически устойчивой тканью организма [6]. Механизм обновления костной ткани. Кости живого существа находятся в непрерывном динамическом равновесии с окружающими тканями живого организма. Существующие в организме клетки, называемые остеокластами, непрерывно растворяют биологический апатит (остеокласты выделяют кислоту, переводящую фосфаты кальция в растворенную форму); в то же время другие клетки – остеобласты – способствуют кристаллизации биологического апатита. Процессы постоянного растворения-кристаллизации способствуют поддержанию необходимой концентрации ионов кальция и фосфата в тканях организма, а также поддержанию здоровья костной ткани, поскольку возникшие почему-либо дефектные участки кости растворяются остекластами в первую очередь, а взамен остеобласты кристаллизуют правильную и здоровую костную ткань. 4 До сих пор нет полной ясности о том, как протекает процесс образования костной ткани из растворенных в крови ионов Ca2+ и PO43-. Многочисленными исследователями [6, 7] доказано, что синтетический апатит образуется не сразу: кристаллизация происходит через образование одного или нескольких промежуточных фосфатов кальция – фаз-предшественников. На основании этих данных был сделан вывод, что и биологический апатит кости тоже формируется аналогичным образом. Правда, никому из исследователей не удалось четко зафиксировать какие-либо промежуточные фазы (или их отсутствие) в процессе роста кости. Все упирается в экспериментальные трудности: если можно провести кристаллизацию in vitro и ждать сколько угодно, периодически отбирая пробы на анализ, то с живой костью такой эксперимент невозможен. Синтетический гидроксиапатит Химическое подобие на неорганическую составляющую кости обуславливает сильное сродство синтетического ГА с костной тканью. Химическое связывание с тканью предоставляет ГА ряд преимуществ по сравнению с аллотрансплантантами (тканями, пересаженными от генетически несходного организма) и металлическими имплантатами. Основные преимущества ГА – биосовместимость, низкая резорбируемость in situ и хорошие остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства. Исследования [8] показали, что спеченный ГА проявляет хорошую биосовместимость с такими мягкими тканями, как кожа, мускулы и десны. Это свойство делает ГА подходящим материалом для ортопедических и стоматологических имплантатов или компонентов для имплантатов. Низкая механическая прочность керамики на основе ГА в индивидуальном состоянии позволяет эффективно её использовать только в рамках костных тканей, не подвергающихся высоким нагрузкам. Наноразмерный ГА. Достижения в нанохимии и нанотехнологии породили интерес к получению наноразмерного ГА и изучению его свойств с учетом размерных эффектов. Так, было выяснено, что нанокристаллический порошок ГА проявляет улучшенную спекаемость и повышенное уплотнение при спекании из-за высокой удельной поверхности, что может также увеличивать вязкость разрушения, равно как и другие механические свойства [8]. Обнаружено [9], что структура костной ткани, сформированной 5 под влиянием матриц на основе наноразмерного ГА почти не отличается от структуры, например, трабекулярной кости. Стоит отметить, что под структурой в данном случае понимается не только устройство неорганической составляющей костной матрицы, но и плотность нарастания колагеновых нитей и кровеносных сосудов и капилляров. Гистоморфологическое сравнение проводилось между трабекулярной костью, сформированной в естественных условиях (контрольный опыт), и дефектами с имплантированным наноразмерным ГА. Значительное нарастание кости наблюдается спустя 12 недель (рис. 2) с момента имплантации – до 50% области поперечного сечения ткани заполняется минерализованной костью. Рис. 2. Изображения поперечного сечения костной ткани после внедрения имплантата на основе наноразмерного ГА. СЭМ-изображения (a, c) и микрографические снимки (b, d), выявляющие светопреломление нитей коллагена, получены спустя 3 (a, b) и 12 (c, d) недель после внедрения. C коллаген, M - минерализованная кость, S – матрица ГА, V– сосуды. 6 Синтетический замещенный гидроксиапатит Информация о содержании различных ионов в апатите костных тканей, а также о влиянии этих ионов на свойства апатита позволяет разрабатывать новые материалы для имплантатов узкой направленности, обладающие большей эффективностью относительно отдельных тканей, чем обычный ГА. Кремний-замещенный ГА. Способность кремния играть определенную роль в процессах минерализации костной ткани была отмечена в 1970 г. E.M. Carlisle [10]. Положительный эффект кремния на метаболизм костной ткани вызвал интерес многих ученых [11, 12]. Отмечено, что Si-замещенные фосфаты кальция обладают выраженными остеопластическими свойствами по сравнению с обычными ФК. Отличить зерна образцов ГА от Si -замещенного ГА достаточно трудно, т. к. образцы имеют сходную химическую структуру [11]. Однако гистологическая картина отличается разнообразием. Через 30 суток эксперимента при заживлении под кровяным сгустком в костном дефекте сохранились обширные территории, занятые грубоволокнистой соединительной тканью. В тоже время по краям костного дефекта отмечалось формирование новой трабекулярной костной ткани с фиброзным матриксом. Местами по краям регенерата отмечались участки образования хондроподобной ткани, а также появление вновь формирующегося вещества с хондроидной тканью и образованием костно-хрящевых структур. Таким образом, проведенные исследования показали, что содержание костноподобных структур для Si-замещенного ГА значительно выше, чем для незамещенного ГА, что связано, в первую очередь, с различной пористостью материала. Стронций-замещенный ГА. В последнее время большое внимание уделяется влиянию стронциевого замещения на свойства биологических материалов на основе ГА [13–15]. Установлено [14], что после 12 недель лечения титановые импланты с покрытиями на основе ГА, содержащие 10 % Sr10(PO4)6(OH)2, показали улучшенную остеоинтеграцию по сравнению с «чистым» ГА, а удельная плотность костной ткани и контакта «кость– имплант» возрастала на 70,9 и 49,9 %, соответственно (по данным гистоморфометрии). Отношение объема костного вещества и доля остеоинтеграции увеличивались на 73,7 и 45,2 % (по данным микрокомпьютерной томографии), а максимальная выталкивающая сила и 7 предельная сила сдвига – на 107,2 и 132,9 %, соответственно. Эти результаты указывают на возможность использования покрытий из фосфата стронция для улучшения фиксации имплантов в остеопорозной кости. Обнаружено, что ионы стронция могут быть скорее замещены в октакальциевом фосфате, чем в ГА [15]. Предполагается, что эти ионы способствуют остеогенезу, внедряясь в метастабильную фазу октакальциевого фосфата в процессе образования зародышей ГА. Показано также, что ионы, высвобождающиеся из стронцийзамещенных биостекол, улучшают метаболическую активность остеобластов [13]. Композиты на основе гидроксиапатита и биополимеров Использование композитов на основе ГА и определенных органических полимеров при получении имплантатов обладает рядом преимуществ: неорганическая матрица обеспечивает необходимый уровень биоактивности и биосовместимости, а полимерная матрица обеспечивает определенную степень формуемости и прочности ГА [16]. Коллагеновые композиты. Коллаген и карбонат-замещенный ГА представляют собой основные твердые компоненты человеческой кости. Как коллаген, так и ГА способны оказывать положительное влияние на рост и развитие кости, однако, эффективность их композита в данном случае несравненно больше. Помимо ускорения остеогенеза, композит обладает также превосходной биосовместимостью с тканями человека и животных [17]. Природный полимер коллаген, являющийся материалом матрицы костей и соединительных тканей, может быть получен из биогенных источников, при этом имеют место процессы декальцинирования, очистки, модификации. Коллаген I типа – наиболее используемый в тканевой инженерии, и наиболее изученный. Он содержится в сухожилиях, коже, костях, роговой оболочке. Преимущество коллагена из кожи и сухожилий – отсутствие необходимости декальцинирования, в остальных же случаях фосфаты кальция могут быть удалены с помощью раствора ЭДТА [18]. Известно, что коллагеновые матрицы, полученные из различных источников не различаются ни по размерам пор, ни по диаметрам фибрилл, но, при этом, матрицы, полученные из тканей лошади, показали меньшую устойчивость к деградации и невысокий коэффициент набухания [19]. 8 Павлова и команда [20] провели исследование особенностей регенерации костной ткани при введении нанокомпозитов коллаген-ГА у подопытных крыс. Выяснено, что регенерация костной ткани при заполнении дефекта нанокомпозитами протекает значительно быстрее, чем без их применения, что доказывает отсутствие местного и общего токсического влияния нанокомпозитов и их остеогенетические свойства. Имеются данные[21] о композитах коллаген-ГА с костноподобной наноструктурой. При выборе условий синтеза, особое внимание уделяется получению такой структуры по механизму самоорганизации, что достигается путем регуляции pH и температуры раствора. Несмотря на то, что ионная концентрация в рабочих растворах сильно отличалась от таковой в организме, костноподобной наноструктуры удается добиться in vitro при температуре в 40°С и pH 8-9. Полученные данные о подходящих условиях объясняются следующим образом: 1. Температура в 40°С соответствует высвобождению коллагеном гидратной воды. 2. Изоэлектрическая точка ателоколлагена (очищенной формы коллагена I), использованного в ходе работы, находится в диапазоне pH 8-9, то есть, фибриллы коллагена агрегируются или осаждаются в данной области pH. 3. Образование нанокристаллов ГА происходит при pH 8-9. Сочетание этих факторов обуславливает реализацию механизма самоорганизации. Полученный композит обладает костноподобной структурой: нанокристаллы ГА, размером 50-100 нм, выстроены вдоль волокон коллагена длиной до 20 мкм. Композит обладает прочностью на разрыв в 40 МПа. Это значение совпадает с таковым для аутогенной губчатой кости, что существенно для костных трансплантатов. Достижение подобной структуры положительно сказывается на биосовместимости композита. Композиты на основе шелковых протеинов. Шелковые протеины обладают биосовместимостью, большим временем разложения и механическими характеристиками, превосходящими таковые у любого известного синтетического полимера (включая кевлар). В ходе различных in vivo и in vitro испытаний [22] было обнаружено, что композиты на основе шелковых протеинов могут быть применены в костно-тканевой инженерии. 9 Одним из исследований, направленных на улучшение свойств шелковых композитов, является исследование группы Мэндала [22]. В качестве полимерной матрицы были использованы микроволокна фиброина шелка тутового шелкопряда, полученные методом электропрядения. Выбор матрицы обусловлен низкой пожароопасностью и отсутствием иммунной реакции. В результате удалось достичь прочности шелковых волокон около 13 МПа (для сравнения, прочность губчатой кости – 10 МПа, трубчатой – 100 МПа). Не наблюдалось никакой реакции иммунной системы на модифицированный композит. Результатом исследования является достижение нового предела прочности для системы ГА-протеин шелка без потери биосовместимости и устойчивости к разложению. Хитозановые композиты. Полисахарид хитозан является производным биополимера хитина, который встречается в панцирях ракообразных и играет ключевую роль, схожую с ролью коллагена у высших животных. Хитозан обладает рядом характерных свойств: структурная схожесть с глюкозаминогликаном, обнаруженном в кости; остеокондуктивность, превосходная биосовместимость, управляемая биодеградируемость, низкая иммуногенность и отличные механические свойства. Хитозан, в силу своих свойств, может быть использован в качестве биополимерной матрицы и альтернативой коллагену в костно-тканевой инженерии. Команда Ямагучи [23] исследовала микроструктуру, механические и биологические свойства композита ГА/хитозан. Композит был приготовлен химическим осаждением ГА (в качестве реагентов использованы H3PO4 и Ca(OH)2 из раствора хитозана, содержащего 1% уксусной кислоты. Выбор кислоты обусловлен превосходной растворимостью хитозана в растворах органических кислот, при этом уксусная обеспечивает высокую степень кристалличности конечного композита. Промывка продукта дистиллированной водой позволяет полностью удалить остатки уксусной кислоты и ацетата кальция. В ходе работы удалось выяснить, что полученный композит хитозан/ГА обладает механической гибкостью и легко может быть сформован в любую необходимую форму. Механическая прочность может быть увеличена термообработкой насыщенным паром, что связано с формированием водородных связей между молекулами хитозана. 10 Фибриновые композиты Фибрин является перспективной полимерной матрицей в композитах на основе ФК. Молекулярная формула фибрина - C5H11N3O2, 2D- и 3D-структуры фибрина представлены на рис. 3. а б Рис. 3. Структура фибрина: 2D-конформер (а); 3D-конформер (б). Будучи природным соединением, фибрин не обладает тканевой токсичностью, обеспечивает быстрое образование плотного упрочняющего слоя, способен рассасываться в течение нескольких дней, а также индуцирует локальное восстановление и рост тканей. В исследовании, проведенном Бонуччи и его группой [24], направленном на изучение остеогенной реакции на ГА-фибриновые имплантаты, был использован гранулированный пористый ГА, смешанный с фибрином; фибрин получен смешением равных количеств тромбина и Тиссукола. Испытания композита in vivo показали превосходные результаты; установлено, что в области имплантации образуется плотная гомогенная кость. Результаты работы подтвердили тот факт, что за введением ГА-фибриновых имплантатов следует окостенение и формирование губчатой кости, схожей с таковой в обычном скелете. Установлено, что главная функция фибриновой матрицы – превращение неформуемого гранулированного порошка в формуемый материал, способный подстраиваться под костные дефекты любой формы. Фибрин удерживает гранулы ГА в месте имплантации, стимулирует регенерации тканей и предотвращает возможную инфекцию. Имеются данные [25] о влиянии гетерогенного фибрина на процесс формирования кости. Ранее, было выдвинуто предположение, что гетерогенный фибрин вызывает местную иммунную реакцию, что несколько замедляет формирование кости [26]. С другой стороны, гомогенный фибрин ускоряет рост капиллярных сосудов и развитие связывающих ткань клеток. С учетом этих данных, роль фибрина в формировании кости кажется несколько 11 противоречивой. Тем не менее, в ходе испытаний in vivo было выяснено, что гетерогенный фибрин ускоряет затвердевание композита, никоим образом не ингибируя формирование кости. Применение. Имеются сведения [27] об экспериментальном лечении пародонтита у крыс с помощью воздействия на поврежденные ткани пародонта препаратов тромбоцитарного фактора роста-ББ, системы фибринфибронектина и ГА. В результате исследования тканевого материала выяснено, что введение вышеописанной системы вызывает заметную активизацию регенераторных процессов поврежденных тканей с восстановлением их структуры в поздние сроки лечения, а участки иммунной реакции почти не наблюдались. Для сравнения, при отдельном введении ГА наряду с восстановлением в большинстве тканей пародонта в поздние сроки лечения сохранялось затяжное воспаление, а также отмечалась выраженная иммунная реакция. Различные дефекты после краниотомии иногда приводят к небольшим, но нежелательным проблемам с кожей. Метод краниопластики (рис. 4) позволяет с помощью фибринового композита устранять вышеуказанные дефекты. Рис. 4. Метод краниопластики: 1 - отбор костной стружки; 2 - заполнение дефекта костной стружкой; 3 - заполнение дефекта фибриновым клеем. 12 Композит представляет собой смесь костного порошка и фибринового клея, состоящего из фибриногена, тромбина, апротинина и небольшого количества хлорида кальция. В группе из 92 пациентов, подвергшихся краниопластике, после пяти лет ни один не имел проблем с кожей в прооперированной зоне [28]. 13 Список литературы 1. Albee, F.H. Studiesin bone growth: triple calcium phosphate as a stimulus to osteogenesis / F.H. Albee // Annals of surgery. – 1920. – V. 71, № 1. – P. 32. 2. Bohner, M. Calcium orthophosphates in medicine: from ceramics to calcium phosphate cements / M. Bohner // Injury. – 2000. – V. 31. – P. D37–D47. 3. Glimcher, M.J. Molecular biology of mineralized tissues with particular reference to bone / M.J. Glimcher // Rev. Modern Phys. – 1959. – V. 31. – № 2. – P. 359. 4. Zhou, H. Nanoscale hydroxyapatite particles for bone tissue engineering/ H. Zhou, J. Lee // Acta Biomaterialia. – 2011. – V. 7, № 7. – P. 2769–2781. 5. Данильченко С. М., Данильченко С. Н. Структура и свойства апатитов кальция с точки зрения биоминералогии и биоматериаловедения (обзор). – 2007. 6. Elliott J.C. Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates / Studies in Inorganic Chemistry 18.-Amsterdam: Elsevier, 1994.389p. 7. Dorozhkin S.V. Calcium orthophosphates // J. Mater. Sci.- 2007.- V.42.- P. 1061–1095. 8. LeGeros, R. Z. Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics / R. Z. LeGeros //Clinical materials. – 1993. – V. 14. – № 1. – С. 65-88. 9. Appleford, M. R. In vivo study on hydroxyapatite scaffolds with trabecular architecture for bone repair / M.R. Appleford [et al]. // Journal of biomedical materials research Part A. – 2009. – V. 89. – № 4. – С. 1019-1027. 10. Carlisle E. M. Silicon: a possible factor in bone calcification / E. M. Carlisle // Science. – 1970. – V. 167. – P. 279–280. 11. Гурин, А. Н. Кремний-замещенный гидроксиапатит, содержащий трикальций фосфат. Перспективы применения в хирургической стоматологии / А. Н. Гурин, В. С. Комлев // Медицинский алфавит. – 2011. – С. 26. 12. Pietak, A. M. Silicon substitution in the calcium phosphate bioceramics / A. M. Pietak, J. W. Reid, M. J. Stott, M. Sayer // Biomaterials. – 2007. – V. 28. – P. 4023–4032. 14 13. Gentleman, E. The effects of strontium-substituted bioactive glasses on osteoblasts and osteoclasts in vitro / E. Gentleman [et al] //Biomaterials. – 2010. – V. 31. – № 14. – С. 3949-3956. 14. Li, Y. The effect of strontium-substituted hydroxyapatite coating on implant fixation in ovariectomized rats / Y. Li [et al.] // Biomaterials. - 2010. - V. 31 - № 34. - P. 9006–9014. 15. Matsunaga, K. Strontium substitution in bioactive calcium phosphates: a first-principles study / K. Matsunaga, H. Murata // The Journal of Physical Chemistry B. – 2009. – V. 113. – № 11. – С. 3584-3589. 16. Venugopal, J. Biomimetic hydroxyapatite-containing composite nanofibrous substrates for bone tissue engineering / J. Venugopal [et al.] // Philosophical Transactions of the Royal Society of London A: Math., Phys. Eng. Sci. – 2010. – V. 368, № 1917. – 17. Wahl, D.A. Collagen-hydroxyapatite composites for hard tissue repair / D.A. Wahl, J.T. Czernuszka // Eur. Cell. Mater. – 2006. – V. 11. – P. 43–56. 18. Clarke, K.I. Investigation into the formation and mechanical properties of a bioactive material based on collagen and calcium phosphate / K.I. Clarke [et al.] // J. Mater. Sci.: Mater. Med. – 1993. – V. 4. – № 2. – 19. Angele, P. Influence of different collagen species on physico-chemical properties of crosslinked collagen matrices / P. Angele [et al.] // Biomaterials. – 2004. – V. 25. – №. 14. – P. 2831-2841. 20. Павлова, Т.В. Особенности регенерации костной ткани при введении коллагеново-гидроксиапатитных нанокомпозитов / Т.В. Павлова [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2009. – №8.– 21. Kikuchi, M. Self-organization mechanism in a bone-like hydroxyapatite/collagen nanocomposite synthesized in vitro and its biological reaction in vivo / M. Kikuchi [et al.] // Biomaterials. – 2001. – V. 22. – № 13. – P. 1705–1711. 22. Mandal, B.B. High-strength silk protein scaffolds for bone repair / B.B. Mandal [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2012. – Т. 109. – № 20. – P. 7699–7704. 15 23. Yamaguchi, I. Preparation and microstructure analysis of chitosan/hydroxyapatite nanocomposites / I. Yamaguchi [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. – 2001. – V. 55. – № 1. – P. 20–27. 24. Bonucci, E. Osteogenic response to hydroxyapatite‐fibrin implants in maxillofacial bone defects / E. Bonucci [et al.] // Eur.J.OralSci. – 1997. – V. 105. – № 6. – P. 557–561. 25. Nakamura, K. Osteogenic response of the rabbit femur to a hydroxyapatite thermal decomposition product–fibrin glue mixture / K. Nakamura, T. Koshino, T. Saito // Biomaterials. – 1998. – V. 19. – № 20. – P. 1901–1907. 26. Bösch, P. Experimental investigations of the effect of the fibrin adhesive on the Kiel heterologous bone graft / P. Bösch [et al.] // Archives of orthopaedic and traumatic surgery. – 1980. – Т. 96. – № 3. – P. 177–185. 27. Меджидов, М.Н. Гистоморфологическое, иммуногистохимическое и иммуноморфометрическое обоснование эффективности использования тромбоцитарного фактора роста-ББ, системы фибрин-фибронектина и гидроксиапатита при лечении экспериментального пародонтита методом направленной регенерации тканей пародонта. Ч. I / М.Н. Меджидов, Д.В. Богомолов // Пародонтология. – 2004. – № 3 (32). – С.60–65. 28. Matsumoto, K. Restoration of small bone defects at craniotomy using autologous bone dust and fibrin glue / K. Matsumoto [et al.] // Surgical neurology. – 1998. – V. 50. – №4. – P. 344–346. 16
