МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА города СЕМЕЙ Документ СМК 3 УМКД УМКД 042–18-9.1.81/03 уровня 2014 УМКД программа Редакция № дисциплины 2 от 11.09.2017г « Микробиологические методы анализа » УЧЕБНО - МЕТОДИЧЕСКИЙ ДИСЦИПЛИНЫ КОМПЛЕКС «Микробиологические методы анализа» для специальности 6М070100 – «Биотехнология» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ Семей, 2017 УМКД 042-18-9.1.81/03 2014 Страница Редакция № 2 от 11.09.2017 2из53 г. Содержание 1. Лекции 2. Практические занятия 3. Лабораторные занятия Лекция №1 Тема: Введение. Понятие микробиологического контроля биотехнологических производств. План: 1. Микробиологический контроль биотехнологических производств 2. Показатели микробиологического контроля Микробиологический контроль биотехнологических производств является обязательной и важной стадией общего контроля производства и управления технологическим процессом. Важность микробиологического контроля обусловлена необходимостью обеспечения доминирования промышленного штамма на стадии культивирования и строгой последовательности биосинтетических процессов, гарантирующих эффективность производства целевого продукта высокого качества, а также требованиями создания экологически чистого производства с целью обеспечения безопасности занятого в производстве персонала и охраны окружающей среды. Микробиологический контроль биотехнологических производств включает несколько компонентов. 1. Микробиологическую характеристику жидкостных и воздушных потоков: · определение инфицированности входящих потоков; · определение санитарного состояния производственного оборудования и помещений. 2. Микробиологическую характеристику производственной культуры: · определение чистоты (отсутствие контаминации) засевной и производственной культуры (при защищенных процессах) или доминирования производственного штамма (при незащищенном процессе); · определение показателей физиолого-биохимического состояния культуры, определяющих получение целевого продукта требуемого качества. 3. Микробиологическую характеристику качества готового продукта: · определение общей обсемененности, · определение живых клеток продуцента. 4. Санитарно-микробиологический контроль: · состояние рабочей зоны; · состояние отходящих потоков (воздух, вода) и окружающей среды. Показатели микробиологического контроля и критерии оценок определяются требованиями технологического регламента и рабочими инструкциями. Методы контроля и допустимые показатели этапа основаны на утвержденных нормах ПДК и содержания техногенных факторов в рабочей зоне (воздухе, рабочих поверхностях и т.п.). Методы контроля и допустимые показатели основаны на нормах ПДВ и ПДС, утвержденных для каждого предприятия. Методы контроля и требуемые показатели определяются нормативно-техническими документами (технические условия, ГОСТ и др.) на выпускаемый продукт. Определение проводится при осуществлении непрерывного процесса культивирования, поскольку в результате протекающих автоселекционных процессов может происходить изменение структуры популяции культивируемого штамма. При защищенных процессах культивирования (стерильных) контролируется стерильность (т.е. отсутствие контаминации) входящих потоков, отсутствие контаминации засевного материала и готового продукта. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №2 Тема:Основные принципы проведения микробиологического контроля План: 1. Принципы санитарно-микробиологических исследований 2. Общая характеристика методов саиитариомикробиологических исследований Принципы, которыми руководствуются микробиологи при санитарномикробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся при их жизнедеятельности, а также обнаружение и оценка степени порчи изучаемого объекта (особенно пищевых продуктов). Эти принципы можно охарактеризовать следующим образом: 1. Правильное взятие проб для санитарно- микробиологических исследований с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта, и правил стерильности. Ошибки, допущенные при взятии проб, приводят к получению неправильных результатов, и исправить их уже нельзя. При упаковке и транспортировке проб необходимо создавать такие условия, чтобы не допустить гибели или размножения исходной микрофлоры в исследуемом объекте. Сохранение материала допускается только в условиях холодильника и не более 6-8 ч. Каждая проба сопровождается документом, в котором указывают название исследуемого материала, номер пробы, время, место взятия, характеристику объекта, подпись лица, взявшего пробу. 2. Проведение серийных анализов. Этот принцип исходит из особенностей исследуемых объектов. Как правило, вода, почва, воздух и другие объекты содержат разнообразные микроорганизмы, распределение которых неравномерно, к тому же микроорганизмы, находясь в биоценотических отношениях, подвергаются взаимному влиянию, что ведет к гибели одних и активному размножению других. Поэтому берут серию проб из разных участков исследуемого объекта, по возможности большее количество проб, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала - среднее по отношению к исследуемому материалу в целом. 3. Повторное взятие проб. Данная операция необходима для получения сопоставимых результатов. Это связано прежде всего с тем, что исследуемые объекты весьма динамичны (вода, воздух и т.п.), сменяемость микрофлоры в них во времени и пространстве очень велика. Патогенные микроорганизмы попадают в окружающую среду, как правило, в небольшом количестве, к тому же и распределяются в ней неравномерно. Поэтому повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию объектов окружающей среды. 4. Применение стандартных методов исследования, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями, что дает возможность в различных лабораториях получать сравнимые результаты. 5. Использование одновременно комплекса тестов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики. Применяют прямой метод обнаружения патогенных микроорганизмов и косвенный, позволяющий судить о загрязнении объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени. К косвенным тестам относится определение общего микробного числа, количественного и качественного состава санитарно- показательных микроорганизмов. Применение косвенных методов оценки потенциальной возможности загрязнения объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, использование обходного пути для изучения обсемененности материалов, является особенностью санитарно- микробиологических исследований. 6. Проведение оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов при использовании санитарно-микробиологических тестов с учетом других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т. д.). Всегда необходимо учитывать, что развитие микробов тесно связано с другими факторами окружающей среды, которые могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное влияние, усиливая или ограничивая возможности размножения патогенных микроорганизмов и накопления их токсинов. Следует учитывать и то, что почти любой объект исследования имеет собственную микрофлору, которая вызывает специфические биохимические процессы, и те изменения в объектах, которые обусловлены посторонними микроорганизмами. Грамотный микробиолог должен хорошо знать ход биохимических процессов, происходящий в норме в исследуемом объекте (почва, вода), технологию производства, уметь определить характер вредного воздействия попавших микробов, возможные последствия такого воздействия и рекомендовать конкретные мероприятия по их предупреждению. 7. Ответственность специалистов за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов. При санитарномикробиологическом исследовании выявляется степень порчи пищевых продуктов (или других объектов), пригодность их к употреблению, возможная опасность для здоровья населения. Запрещение использовать пищевые продукты, воду водоемов и др., закрытие предприятия из-за санитарного неблагополучия наносят определенный экономический ущерб. Ответственность за такое решение несет врач санитарной службы. В целях предотвращения попадания и развития патогенных микроорганизмов на пищевые продукты на предприятиях пищевой и перерабатывающей промышленности, общественного питания постоянно проводят санитарно- микробиологический контроль всех объектов, контактирующих с продукцией - воздуха, воды, оборудования, тары, упаковочных материалов, рук обслуживающего персонала, а также непосредственных источников обсеменения продукции сырья, вспомогательных материалов. Общая характеристика методов саиитарио-микробиологических исследований При организации планового санитарно-микробиологического контроля на предприятиях пищевого профиля используют, прежде всего, косвенные методы определения присутствия патогенных микроорганизмов. При этом для оценки санитарного состояния объектов окружающей среды используют количественные и качественные микробиологические показатели. Количественные показатели характеризуют степень обсемененности данного объекта микроорганизмами, т.е общее микробное число в единице веса (объема) - обычно в 1г (1см3). Существует два метода определения микробной обсемененности: метод прямого подсчета и метод количественного посева проб исследуемого объекта или его разведений на питательные среды. Прямой подсчет микроорганизмов в исследуемом объекте проводится под микроскопом в счетных камерах Горяева или в камерах, специально сконструированных для счета бактерий. Предварительно пробу исследуемого объекта подвергают обработке, чтобы получить гомогенную взвесь. Для лучшего учета бактерий в исследуемую суспензию добавляют краситель, чаще всего эритрозин. Можно проводить прямой подсчет и на мембранных фильтрах, через которые пропускают исследуемую жидкость или взвесь. Метод прямого подсчета применяется в экстренных случаях, когда необходимо срочно дать ответ о количественном содержании бактерий, например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и т. п. Метод прямого подсчета кажется простым и удобным, однако он имеет ряд существенных недостатков, снижающих его ценность и из-за этого довольно редко используется. Существенным недостатком его является невозможность подсчитать бактерии, когда образуются их скопления или когда они «прилипают» к частицам исследуемого субстрата, не удается подсчитать мелкие микроорганизмы, не говоря уже о вирусах. И наконец, метод прямого подсчета не дает возможности отличить живые микроорганизмы от погибших. Создание автоматических приборов для регистрации общей микробной обсемененности, таких как фотоэлектрические и электронные счетчики, делает метод прямого подсчета более перспективным. Метод количественного посева исследуемого материала на плотные питательные среды применяется наиболее часто. Из приготовленных серийных десятикратных разведений исследуемой жидкости или суспензии по 1 мл переносят в стерильные чашки Петри (начиная с большего разведения, каждое разведение отдельной пипеткой) и заливают расплавленным и остуженным до 45—50 °С мясопептонным агаром - МПА (глубинный посев). Для равномерного смешивания чашки слегка двигают по поверхности стола и после застывания агара помещают в термостат. После инкубации подсчитывают число выросших колоний и с учетом разведения высчитывают число жизнеспособных микробов в единице объема исследуемого объекта. Если посевы выращивали при 30°С, то показателем общей обсемененности исследуемого материала является КМАФАнМ (или МАФАнМ). КМАФАнМ не определяют только у продуктов, при производстве которых используют заквасочные культуры. В зависимости от вида продукта и способа его производства этот показатель может свидетельствовать об общем санитарно- эпидемиологическом состоянии продукта, свежести или начальной стадии порчи внешне доброкачественного продукта, хотя во многих случаях метод считается приблизительным из-за невозможности выявить все микроорганизмы в объекте на одной питательной среде, т.к. их физиологобиохимические свойства различны. Кроме того, режим инкубации также не соответствует требованиям всех микроорганизмов в ассоциации, не дают роста микробы, находящиеся в комочках исследуемого объекта, а если и наблюдается рост колоний, то, возможно, не из одной особи. Наконец, часть микроорганизмов теряет способность к размножению в силу антагонизма, конкуренции и других причин. Несмотря на недостатки этого показателя, для многих продуктов КМАФАнМ нормируется. В обязательном порядке контролируются санитарно- показательные микроорганизмы, обнаружение которых также является косвенным показателем биологической контаминации исследуемого материала патогенными микроорганизмами. Превышение нормативов по допустимому содержанию санитарно-показательной микрофлоры свидетельствует о возможном присутствии тех или иных патогенных микробов. Для количественной характеристики применяются две группы методик: определения титра и индекса. Титр - это тот наименьший объем исследуемого материала (в миллилитрах) или весовое количество (в граммах), в котором обнаружена хоть одна особь санитарно-показательного микроорганизма. Например, для определения титра кишечной палочки в воде засевают несколько разных объемов (от 100 до 0,1 или до 0,01 мл в зависимости от предполагаемой степени загрязнения объекта) в жидкие сахарные питательные среды. Размножение в них кишечных палочек регистрируется по наличию брожения-расщепления углевода до кислоты и газа. Пересев на плотные дифференциальнодиагностические среды и идентификация выросших колоний позволяют выяснить те объемы, в которых присутствовала кишечная палочка. Затем с помощью специальных таблиц, определяют ко ли-титр. Набор таблиц входит в ГОСТ. Индекс - количество особей санитарно-показательного микроба, обнаруженного в определенном объеме (количестве) исследуемого объекта. Для воды, молока, других жидких продуктов - в 1 л, для почвы, и пищевых продуктов - в 1 г. Индекс - величина, обратная титру, поэтому перерасчет титра в индекс и обратно можно производить по формуле: 1000 . 1000 (1) титр =---------- ;индекс =------индекс титр Соответственно для почвы и пищевых продуктов: титр =----------- ; индекс = —-—. (2) индекс титр Индекс чаще определяют путем применения мембранных фильтров или посева различных разведений исследуемых субстратов на питательные среды. Выбор того или иного санитарно-показательного микроорганизма зависит от исследуемого объекта и конкретной задачи. Соответственно говорят, например, о титре или индексе протея или маслянокислых бактерий и т.п. Нередко (и во многих ГОСТах это узаконено) одновременно исследуется и ведется количественный учет двух или более санитарно-показательных микроорганизмов.Качественные показатели указывают на отсутствие (присутствие) микробов конкретных видов в определенной массе продукта. Прямое выявление в пищевых продуктах патогенных или условнопатогенных микробов и их ядов проводится в соответствии с существующими нормативными документами. Обычно проверяют наличие микроорганизмов p.p.Salmonella, Staphylococcus, Cl.botulinum и их токсинов, Cl.perfringens, Bac.cereus и др. Согласно требованиям ГОСТов патогенные микроорганизмы и их токсины должны отсутствовать в определенном объеме (массе) материала, подвергнутого исследованиям (25, 50 г и т.д.). Санитарно-микробиологическое исследование объекта на присутствие патогенных микроорганизмов проводится работниками СЭС в плановом порядке, а также внепланово - по эпидемическим показаниям. Для определения патогенных микроорганизмов могут быть использованы следующие методы : • прямой посев исследуемого материала в питательные среды; • предварительная концентрация патогенных микроорганизмов пропусканием исследуемого объекта (жидкой консистенции) через мембранные фильтры или посевом в среды накопления; • обнаружение патогенных микроорганизмов методом заражения чувствительных животных (биопроба); • применение ускоренных методов: серологических, люминесцентносерологических и радиоизотопного. Для иллюстрации последней группы методов ниже представлена общая характеристика ускоренных методов исследования воды. Наибольшее применение получил метод люминесцентно-серологический, который в настоящее время рекомендуется для обнаружения в воде микроорганизмов p.p.Escherichia, Salmonella, Shigella, Vibrio и др. Метод иммунофлюоресценции основан на способности антител, предварительно обработанных различными флюорохромами (флюоресцеина изотиоцианат, родамина сульфохлорид, родамина сульфофторид и др.), адсорбироваться на поверхности микробной клетки и вызывать ее свечение. Метод флюоресцирующих антител применяется в трех модификациях: прямой, непрямой и непрямой метод с добавлением комплемента. При прямом методе_капшо исследуемой воды, в которой предполагается наличие патогенных бактерий, помещают на предметное стекло, обрабатывают специфической к искомому микроорганизму люминесцирующей сывороткой и наблюдают под люминесцентным микроскопом. На темном фоне препарата при положительном результате видна яркая флюоресценция по периферии клеток. При непрямом методе обработка препаратов происходит в два этапа: специфической иммунной сывороткой выявляют присутствие соответствующих бактерий, на следующем этапе обнаруживают образовавшийся комплекс обработкой меченой иммунной сывороткой, содержащей антитела к глобулинам специфической сыворотки. Этот метод имеет существенное преимущество перед прямым, так как для выявления любых бактерий используется одна меченая сыворотка против антител глобулинов, содержащихся в специфической сыворотке (как правило, глобулинов кролика). При непрямом методе с добавлением комплемента препарат обрабатывают в 3 этапа: сначала специфической к искомому микробу иммунной сывороткой, затем - комплементом, который адсорбируется на комплексе антиген - антитело, и, наконец, иммунной противокомплементарной флюоресцирующей сывороткой. Для повышения эффективности метода следует предварительно концентрировать бактерии в исследуемой воде на мембранных фильтрах центрифугированием или посевом в среды обогащения. В этом случае люминесцентно- серологическим методом удается обнаружить энтеробактерии при наличии в пробах воды даже единичных клеток в 1 мл. Метод флюоресцирующих антител рекомендуется применять при индикации в воде возбудителей туляремии, чумы, бацилл сибирской язвы. Однако люминесцентно-серологический метод является только сигнальным методом индикации патогенных бактерий в воде, и при положительном его результате должно проводиться тщательное бактериологическое исследование воды. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №3 Тема: Стандартная микробиологическая лаборатория. Основные методы работы. Характеристика лабораторий по контролю пищевой продукции План: 1. Стандартная микробиологическая лаборатория 2. Процесс стрелизации Микробиологические лаборатории подразделяют на научноисследовательские, научно-практические, практические учреждения либо подразделения медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных учреждений или промышленных предприятий, проводящих исследования микроорганизмов и вызываемых ими явлений. Для микробиологической лаборатории обычно отводится специальное помещение, состоящее из комплекса комнат, разделяющегося на «чистую» и «заразную» зоны. В «чистой» зоне располагаются: комната для верхней одежды, помещения для проведения подготовительных работ (препараторская, моечная, средоварочная), стерилизационная, комната с холодильной камерой или холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов, комната отдыха и приема пищи, комната для надевания рабочей одежды, комната для работы с документацией и литературой, кабинет заведующего, подсобные помещения. В «заразной» зоне располагаются: комната для приема и регистрации материала, боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности, термостатная комната, автоклавная для обеззараживания и профильные комнаты, в которых осуществляются бактериологические, серологические, гельминтологические, зооэнтомологические и прочие работы. Назначение некоторых комнат микробиологической лаборатории: - препараторская комната является местом работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к проведению микробиологического анализа; - средоварочная комната предназначена для приготовления питательных сред; в ней допускается размещать автоклав для их стерилизации; - моечная комната обеспечена холодной и горячей водой и необхо- дима для подготовки посуды к стерилизации; - автоклавная комната служит для обеззараживания и стерилизации, в ней размещают стерилизующее оборудование: автоклавы и сушильные шкафы. Стерилизации подвергают питательные среды и инструменты, а обеззараживанию – отработанный инфицированный материал; - бокс-комната используется для пересева культур микроорганизмов и требует стерильных условий.Качественная стерилизация бокса достигается применением бактерицидной лампы. Бокс оборудуется предбоксником, служащим шлюзом для перехода из стерильной зоны в общую; - термостатная комната предназначена для культивирования микроорганизмов. В микробиологических лабораториях размещают специализированное оборудование, которое позволяет осуществлять весь цикл работ по обеспечению запланированного микробиологического анализа, направлен- ного на тестирование самых разнообразных материалов. Важнейшей частью работы в микробиологической лаборатории является стерилизация (от лат. sterilitas – бесплодный) – полное уничтожение микроорганизмов в объектах с целью исключения микробного загрязнения питательных сред, культур клеток и др. при микробиологических исследованиях и в биотехнологических производствах, а также для предупреждения их заноса в организм и предотвращения микробной биодеградации различных материалов. Процесс стерилизации включает этапы дезинфекции, очистки с помощью моющих средств, сборки, группировки и размещения материалов в контейнере и камере стерилизатора, собственно стерилизации, сушки, контроля и хранения. Этапы дезинфекции, очистки, размещения преследуют цель снижения числа микроорганизмов на объекте и облегчения доступа к ним стерилизанта; этап стерилизации –полного освобождения объекта от микроорганизмов; этап контроля – проверки эффективности стерилизации с помощью механических, химических и биологических методов; этапы сушки и хранения – предупреждения повторной микробной контаминации в период от стерилизации до использования. В качестве стерилизантов используют насыщенный высокотемпертурный водяной пар (стерилизация паром), сухой горячий воздух (стерилизация жаром), химические вещества (стерилизация химическая), газ (стерилизация газовая), реже используют ионизирующие излучения (лучевая стерилизация), фильтрование через мелкопористые фильтры (механиская стерилизация), многократное прогревание жидкостей на водяной бане при 100 0С (дробная стерилизация) или 560С (тиндализация). Кипячение, однократное прогревание при 1000С, облучение УФЛ не относятся к методам стерилизации, так как не обеспечивают полного уничтожения микроорганизмов, особенно спор. Стерилизация паром. Насыщенный водяной пар под давлением обладает бактерицидными свойствами, не повреждает большинство стерилизуемых материалов и не нуждается в освобождении от стерилизанта. Для данного вида стерилизации характерны надежность, доступность, безопасность для персонала, экономичность, высокая степень автоматизации. Стерилизующий эффект пара связан с прогреванием объекта в процессе конденсации пара в воду на поверхности и внутри предмета. Выпускают два типа паровых стерилизаторов: - стерилизаторы перемещения тяжестью; в них поток пара проникает в верхнюю часть камеры и вытесняет из нее воздух через дренажную трубку. Давление и температура пара возрастают и достигают установленной величины. Постоянную температуру до окончания экспозиции поддерживает таймер. По окончании экспозиции пар выводится через дренаж из камеры, рубашка камеры остается горячей и ее сухой жар высушивает стерилизуемые объекты. Крышка открывается при снижении температуры камеры до 900С; - предвакуумный паровой стерилизатор; в нем вакуумная система в 2 цикла вытягивает большую часть воздуха из камеры и стерилизуемых объектов через дренаж, после чего камеру и ее рубашку наполняют паром под 46 давлением. Давление и постоянная температура поддерживаются автоматически. После окончания срока стерилизации камера освобождается от пара, и объекты высушиваются с помощью вакуумной системы. В зависимости от стерилизуемых объектов температура пара в паровых стерилизаторах – 110–138 0 С, давление пара – 0,4–2,5 атм., экспозиция – 15–60 мин. Паром стерилизуют почти все изделия из металла, стекла, термостойкой пластмассы, резины, питательные среды, в том числе жид- кие, лекарственные препараты. Стерилизация паром – предпочтительный способ стерилизации. Стерилизация жаром. Стерилизуют ограниченный круг объектов: изделия из стекла и других термостойких материалов, безводные гидрофобные порошки, вазелин, предметы, не пропускающие необходимый уровень влаги. Осуществляют в сухожаровых шкафах. Обязательным ус- ловием эффективности стерилизации жаром является правильное соотношение между температурой и экспозицией, которое выражается так: при 180 0 С – 1/2 ч, при 170 0 С – 1 ч, при 160 0 С – 2 ч, при 150 0 С – 2,5 ч, при 140 0 С – 3 ч, при 120 0 С – 6 ч. Стерилизация химическая проводится с помощью химических веществ, обладающих биоцидным действием: 2 %-ного щелочного водного раствора глютаральдегида и 20 %-ного раствора формальдегида в 70 %-ном этаноле. Химическая стерилизация осуществляется путем полного погружения объекта в раствор на относительно долгое время (около 10 ч) при комнатной температуре. При повышении температуры раствора до 40–50 0 С эффективность стерилизации резко возрастает, при температу- ре ниже 20 0 С, а также в кислой среде стерилизующий эффект может утрачиваться. По окончании срока стерилизации предметы извлекают из раствора и в асептических условиях несколько раз споласкивают стерильной водой во избежание химических ожогов при контакте такого предмета с кожей и слизистыми оболочками. Стерилизация газовая. В настоящее время используют этиленоксид – бесцветный газ, легко проникающий сквозь упаковочные материалы, хорошо контактирующий со всей поверхностью плотных предметов и легко проникающий в жидкие вещества, а также устраняющийся обычным проветриванием. Уничтожает все формы микроорганизмов, включая споры. Изза сильной токсичности и длительности процесса газовая стерилизация используется только для обработки предметов, которые повреждаются при паровой стерилизации. Контроль стерилизации: 1. Механический контроль, состоящий в визуальном и инструментальном контроле за всеми параметрами стерилизации. Измерительная аппаратура должна периодически контролироваться в государственном метрологическом учреждении. 2. Химический контроль, проводимый с помощью индикаторов, изменяющих цвет или плавящихся при достижении определенного уровня температуры, влажности, концентрации стерилизанта. Наружные индика- торы в виде стерилизационной ленты (окрашенной или нет) наносят на упаковку простерилизованного предмета, они указывают на то, что пред- мет прошел стерилизацию; внутренние химические индикаторы свиде- тельствуют о том, были ли стерилизуемые объекты подвергнуты действию одного или нескольких видов стерилизации, но не о стерильности объекта. Показатели внутренних химических индикаторов снимаются после окон- чания стерилизации. 3. Биологический контроль непосредственно указывает, произошло уничтожение микроорганизмов в процессе стерилизации или нет, то есть стерилен или нестерилен объект. Для паровой стерилизации в качестве биологического индикатора используют споры В. stearothermophilus, для стерилизации этиленоксидом – В. subtilis. Бокс микробиологической лаборатории – специальное изолирован- ное помещение, предназначенные для выполнения работ, требующих особой стерильности или безопасного пребывания людей. Микробиологический бокс используется для работ с инфекционными (посевы, пересевы, разведения и др.) и стерильными (приготовление питательных сред, куль- тур тканей, разлив иммунных сывороток и др.) материалами. В боксе должны быть созданы такие условия, которые, с одной стороны, исключали бы возможность лабораторного заражения сотрудников, а с другой, – предупреждали бы контаминацию стерильных материалов микроорганизмами. Пол, стены и двери бокса должны быть гладкими, сделаны из материала, хорошо поддающегося мойке и дезинфекции. Оборудование бокса: стол, табуреты, стеклянный шкаф для стерильных материалов, штативы, осветительные и бактерицидные лампы. В современных боксах имеются система подачи стерильного воздуха или устройство для ламинарного потока воздуха, создающего высокую степень стерильности и безопасности. Термостат – аппарат, постоянно поддерживающий заданную температуру и используемый для культивирования микроорганизмов, культур клеток, протекания иммунологических или биохимических реакций. Состоит из нагревателя, термостатирующей камеры, вертикально разделенной на секции перфорированными полками, двойных стенок, между которыми размещается воздух или дистиллированная вода. Наружная стенка сделана из теплоизоляционного материала или содержит его. Дверцы также двойные, плотно закрывающиеся. Температура регулируется терморегуляторами различного типа. Микроскопия в микробиологической лаборатории используется для выявления микроорганизмов в различных субстратах; ориентировочной идентификации микроорганизмов в исследуемом образце; определения не- 48 которых морфологических признаков; изучения окрашенных мазков из колоний чистых культур. Существуют несколько различных видов микроскопии: световая, темнопольная, фазовоконтрастная, люминесцентная, электронная. Световой микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для наблюдения за живыми и неживыми объектами. Состоит из механической (предметного столика с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлени- ях; тубуса; тубусодержателя; макро- и микровинтов), осветительной (осве- тителя, зеркала с плоской и вогнутой поверхностями и конденсора, расположенного под предметным столиком и состоящего из 2 линз, ирисовой диафрагмы и оправы светофильтров) и оптической (набора объективов и окуляров) частей. В световом микроскопе луч от источника света попадает на зеркало, отражаясь от него и проходя через конденсор, концентрируется на объекте, находящемся на предметном столике. Часть прошедших через объект лучей попадает в объектив, преломляется в нем и дает увеличенное обратное действительное изображение объекта на уровне диафрагмы окуляра. Изображение объекта в плосковыпуклой линзе окулярамнимое прямое увеличенное. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличен- ное изображение объекта. Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. В бактериологии обычно используют полезное увеличение в 900 раз (объектив – 90х, окуляр – 10х). Для изучения объектов, которые меньше 0,2 мкм и обладают малой контрастностью, используют микроскопию в отраженном свете, подбирая для этого специальные темнопольные конденсоры (микроскопия в темно- польном микроскопе). Живые и неокрашенные объекты позволяет изучать фазово- контрастная микроскопия путем повышения их контрастности (при прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда свето- вой волны, а при прохождении через неокрашенные – фаза световой волны, что используется для получения высококонтрастного изображения). Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения за люминесцирующими (флюоресцирующими) микроорганизмами, обработанными специальными флюорохромами (флюоресцеин, родамин). Преимущество люминесцентной микроскопии перед световой состоит в ее более высокой разрешающей способности и быстроте выявления микроорганизмов, что привело к широкому использованию микроскопии этого вида для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний. Объекты или их части, не видимые в световой микроскоп, наблюдают в электронный микроскоп, используя вместо видимого света пучки электронов, а вместо стеклянных оптических линз – электромагнитные. Реактивы и некоторые биологические препараты, используемые для приготовления питательных сред, изучения жизнедеятельности микроорганизмов, дезинфекции помещения лаборатории хранят в подвале или в темном стенном шкафу, где сухо, температура невысокая и без резких ко- лебаний в течение года. Оборудование рабочего места включает стол, покрытый стеклом (пластиком), на котором должны находиться бактериологическая петля, пинцет, банка с дезинфицирующей жидкостью и газовая (спиртовая) горелка. По окончании работы стол приводят в порядок и дезинфицируют. В микробиологической лаборатории должен храниться как минимум недельный запас дезинфицирующих средств. Дезинфицирующие растворы готовит лаборант или дезинфектор. На емкости с дезинфицирующим раство- ром должно быть указано его название, концентрация и дата приготовл ния. Ежедневно помещение микробиологической лаборатории убирают влажным способом. Текущая уборка помещений в «чистой» зоне лаборатории проводится с применением моющих средств, а в заразной – с применением дезинфектантов. Комнаты лаборатории, в которых проводится работа с патогенными биологическими агентами (ПБА): бактериями, вирусами, хламидиями, риккетсиями, простейшими, грибами, микоплазмами, генно-инженерно модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения, гельминтами, а также с материалами, включая кровь и другие биологические жидкости и экскреты организма, подозрительными на содержание выше перечисленных агентов, оборудуются бактерицидными лампами. Лампы включают после проведения влажной уборки. Вход в помещение разрешается только после проветривания не ранее чем через 30 мин. При применении безозоновых бактерицидных ламп проветривание не требуется. Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, канализацией, электричеством, отоплением и вентиляцией. При ориентации окон лабора- тории на юг необходимо предусмотреть защиту рабочих столов от попада- ния прямого солнечного света путем использования светозащитных пленок или жалюзи из материала, устойчивого к дезинфектантам. На окна цокольного и первого этажей следует устанавливать металлические решетки, не нарушающие правил пожарной безопасности. Лаборатория должна быть обеспечена средствами пожаротушения. Помещения микробиологической лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №4 Тема: Характеристика основных групп санитарно-показательных микроорганизмов –индикаторов загрязнения. 1. Санитарно-микробиологическая оценка 2. Основные группы микроорганизмов-индикаторов загрязнения. Санитарно-микробиологическая оценка состояния исследуемых объектов призвана выявить степень их доброкачественности. Но не все микроорганизмы способны дать истинный ответ. С этой целью в санитарной микробиологии используются так называемые санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ) – индикаторы, являющиеся если не абсолютным, то удовлетворительным тестом, способным охарактеризовать санитарномикробиологическое состояние того или иного объекта. Микроорганизмы-индикаторы делятся на три группы: - индикаторы фекального загрязнения, являющиеся обитателями кишечника животных и человека – E. coli, энтерококки, протеи, сальмонеллы, термофилы, Clostridium perfringens, бактериофаги, дрожжи рода Candida; - индикаторы орального загрязнения, являющиеся обитателями верхних дыхательных путей и носоглотки – гемолитические стрептококки (Streptococcus pyogenes) и золотистые стафилококки (Staphylococcus aureus); - индикаторы процесса самоочищения – обитатели природных сред – аммонифицирующие и нитрифицирующие микроорганизмы, грибы, актиномицеты, синезеленые водоросли. Escherichia coli является одним из фоновых видов кишечника чело- века и животных, способствует защите организма хозяина от патогенных бактерий, выполняет метаболическую и иммунизаторную функции. E. coli считается родоначальником всех СПМ, в качестве таковой эта бактерия была предложена еще в 1888 г. Обнаружение бактерий этого вида в иссле- дуемом объекте характеризует степень его бактериальной загрязненности, свидетельствуя об уровне санитарного благополучия Е. coli относится к роду палочковидных перитрихиальных аспорогенных Грам-факультативно-анаэробных бактерий из семейства Enterobacteriaсеае. В роду выделяют виды: Е. coli, E. blattae, E. fergusonii, Е. hermannii, E. vulneris. Морфология кишечной палочки типична для энтеробактерий. У некоторых штаммов есть капсула, микрокапсула, реснички. Они хорошо и быстро растут на основных питательных средах в аэробных условиях при слабощелочной реакции среды и при температуре 35–370С, формируя гладкие мутные колонии диаметром 1–3 мм. Штаммы, обитающие у теплокровных животных, могут размножаться при 42–43 0 С. Глюкозу ферментируют с выделением смеси кислот, Н2 и СО2. Ферментируют лактозу (иногда замедленно), маннит, мальтозу и другие углеводы. Способны к образованию индола. Чувствительны к аминогликозидам, тетрациклинам. Для внутривидовой систематики применяют серотипирование, фаготипирование и колицинотипирование. Свойства, обнаруженные у E. coli, позднее были выявлены и у других бактерий, являющихся обитателями кишечного тракта человека и животных. Всех их объединяют в отдельную группу, обладающую аналогич- ными санитарно-показательными свойствами. Эта группа носит название 53 «бактерии группы кишечных палочек» (или БГКП) и условно подразделяется на 3 подгруппы: 1. БГКП, способные сбраживать сахара (лактозу и глюкозу или только глюкозу) при 37 0 С и не проявляющие оксидазной активности. В эту подгруппу помимо E. coli входят другие представители семейства Enterobacteriaceae, в том числе бактерии родов Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella. Представители этой подгруппы БГКП вообще не должны обнаруживаться в изначально чистых или прошедших термообработку объектах. В связи с этим выявление БГКП, относящихся к 1-й подгруппе, в питьевой или дистиллированной воде, в термически обработанных пище- вых продуктах (мясных, рыбных и прочих), в отобранном из пастеризатора молоке, в различных блюдах, приготовленных на предприятиях общественного питания, а также в смывах, взятых спустя час после проведения дезинфекции, свидетельствует об их санитарном неблагополучии. 2. БГКП, сбраживающие лактозу и глюкозу до газа при температуре 43– 44,5 0 С. Эта подгруппа, как и первая, представлена большим количеством бактерий из семейства Enterobacteriaceae, а их обнаружение свидетельствует о неопределенном по времени фекальном загрязнении исследуемых объектов. В отношении этой подгруппы особенно высокие требования предъявляются к объектам, прошедшим термическую обработку. В связи с этим проводится обязательный контроль поверхностей пищевых продук- тов, вторых и третьих блюд на раздаче, пищевых продуктов, имеющих жидкую консистенцию и смывов. 3. БГКП, сбраживающие лактозу до газа при температуре 43–44,5 0 С. Обнаружение микроорганизмов этой подгруппы в исследуемом объекте почти всегда свидетельствует о его свежем фекальном загрязнении. Все же E. coli и другие представители БГКП не считаются четкими индикаторами санитарной чистоты исследуемых объектов. Во-первых, они не способны долго выживать в пищевых продуктах в отличие от многих патогенных микроорганизмов – энтеровирусов, шигелл, паратифозных палочек. Во-вторых, были выявлены случаи сальмонеллеза водного происхождения, когда на фоне кажущегося санитарного благополучия водоема (при содержании E. coli в незначительном количестве – 4 бакт./л) выявляли высокий уровень содержания сальмонелл - в 4–5 раз выше содержания E. coli. Бактерии родов Enterococcus и Proteus Род Enterococcus. Представители рода широко распространены в природе. Факультативные Грам+ анаэробы, спор не образуют. В мазках из сахарных сред имеют круглую, овальную или ланцетовидную форму, располагаются парами, небольшими скоплениями, реже – короткими цепочками. Подвижны, либо неподвижны, иногда синтезируют капсулу. На жидких средах дают диффузный рост, на плотных – мелкие круглые вы- пуклые блестящие колонии или нежный налет. Растут при 10 0 С и 45 0 С, 54 рН = 9,6, в молоке с 0,1 % метиленовым синим, в 10 и 40 % желчи. В средах с молоком, кровью, сывороткой формируют водонерастворимый пигмент белого или лимонно-желтого цвета. Энтерококки являются одним из фоновых видов микроорганизмов в кишечнике человека, млекопитающих, птиц. Нередко обнаруживаются на коже промежности и в просвете половых путей, полостей глотки, рта, носа. Долго живут в пищевых продуктах, в которых при комнатной температуре могут размножаться. Устойчивы к высушиванию, свету, низкой температуре. Типовой вид – E. faecalis – использует аргинин как источник энергии, сбраживает сорбит, но не сбраживает арабинозу, не нуждается в фолиевой кислоте, редуцирует трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). В род также входят виды E. faecium, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. saccharolyticus, E. solitarius и др. Для энтерококков свойственно быстрое отмирание во внешней среде, гораздо более раннее, чем для E. coli. Поэтому выявле- ние этих бактерий практически всегда свидетельствует о свежем фекаль- ном загрязнении. Этих представителей СПМ принято определять в воде, почве, а также в пищевых продуктах. Протеи (Proteus) – факультативные Грам– анаэробы, перитрихи, не образуют спор. Клетки прямые палочковидные, размерами 0,5x2 мкм, встречаются нитевидные формы. Хорошо растут на простых питательных средах при температуре 20–40 0 С, рН = 7,2…7,4, образуя круглые выпук- лые гладкие мутные колонии. Большинство штаммов продуцируют кисло- ту, иногда газ из глюкозы, лактозу не ферментируют, гидролизуют моче- вину, дезаминируют фенилаланин. Содержат жгутиковый, соматический и капсульный антигены, на основании которых разделяются на большое количество сероваров. Относительно устойчивы к различным повреждаю- щим факторам, в том числе ко многим антибиотикам. Широко распространены в воде, почве, продуктах, на объектах внешней среды, окружающих человека. Паразитируют у животных и чело- века, как правило, в кишечнике. Типовой вид – P. vulgaris. Род включает в себя также P. mirabilis, P. myxofaciens, P. penneri. Присутствие протеев в том или ином объекте санитарного контроля: в воде, пищевых продуктах, смывах, является категорическим свидетель- ством их загрязнения продуктами разложения и указывает на развитие крайне неблагополучного санитарного состояния. Все пищевые продукты, содержащие бактерии рода Proteus, обычно выбраковывают. Питьевую во- ду из загрязненного этим микроорганизмом водозабора пить запрещено до специального разрешения органов Госсанэпиднадзора. В нашей стране принято проводить обязательное исследование объектов, подлежащих санитарно-микробиологической оценке, на нали- чие протеев. Выявление протеев в пищевых продуктах предусмотрено ГОСТом РФ. Обнаружение этих бактерий в воде открытых водоемов и при 55 исследовании лечебных грязей носит официальное название «протеемет- рия». Clostridium perfringens – спорообразующие Грам+ анаэробы, перитрихи. Споры крупные, имеют овальную форму. Растут на мясных питательных средах с добавлением сахаров при рН = 7,2…7,4 в анаэробных условиях. Выделяют 6 сероваров (A…F), различающихся по антигенным свойствам продуцируемых экзотоксинов. Оксидазо- и каталазонегативны. Сульфиты не восстанавливают. Являются паразитами кишечника человека (у 25–35 % здоровых людей) и животных, способны долго выживать, а при определенных условиях и размножаться в почве и воде. От прочих клостридий C. perfringens отличается способностью восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу и образовывать лецитиназу. C. perfringens вызывает опасное заболевание – газовую гангрену. Обнаружение этого санитарно-показательного микроорганизма осуществляется с помощью так называемого энтеритного теста, заключающегося в посеве анализируемого субстрата в молоко и выявлении в нем бурного процесса брожения («штормовой реакции»). Эта реакция и этот тест осно- ваны на физиологических особенностях данного микроорганизма, способ- ного к активному газообразованию. Название теста «энтеритный» связано с его первоначальным названием Bacterium enteritidis sporogenes. В нашей стране о давности фекального загрязнения принято судить, сопоставляя индексы Clostridium perfringens и E. coli. Высокие показатели индексов, свойственные обоим микроорганизмам, свидетельствуют о появлении свежего фекального загрязнения. О давнем фекальном загрязне- нии судят при выявлении в анализируемом объекте незначительного количества бактерий Clostridium perfringens и высокого – E. coli. Количественный учет Clostridium perfringens предусмотрен при санитарном обследовании почв, лечебных грязей, воды открытых водоемов. Особые требования по содержанию этих микроорганизмов предъявляются к пищевым продуктам: при изготовлении колбасных изделий мясо не должно содержать больше 100 клеток возбудителя в 1 г, в продуктах, заложенных на консервирование, их должно быть не более 1000 клеток / г, в готовых консервах возбудитель газовой гангрены вообще не должен обна руживаться. К воде, используемой предприятиями пищевой промышленности, также предъявляются жесткие требования: Clostridium perfringens совсем не должен обнаруживаться в 100 мл воды. Нарушение санитарных норм, влекущее за собою появление в пище и воде этого представителя СПМ, способно почти всегда спровоцировать пищевое отравление. Бактерии рода Salmonella – наиболее распространенные возбудители острых кишечных инфекций. Это мелкие, длиной 2–3 мкм, шириной 0,5–0,7 мкм, Грам- бактерии с закругленными концами. В мазках располагаются беспорядочно. Не образуют спор, имеют микрокапсулу, перитрихи. 56 Сальмонеллы – факультативные анаэробы. Растут без всяких особенностей на простых питательных средах при температуре 37 0 С и рН = 7,2…7,4. Элективной средой является желчный бульон. Биохимическая активность сальмонелл достаточно высока, но они обладают меньшим набором ферментов, чем E.coli, в частности не сбраживают лактозу. Имеют соматический и жгутиковый антигены, некоторые виды имеют поверхностный антиген вирулентности. Сальмонеллы обнаруживаются не только в сточных водах различ- ных промышленных предприятий, в том числе в стоках мясокомбинатов (в 80–100 % проб), но даже в хлорированных сточных водах. Их обнаружение в субстрате всегда свидетельствует о фекальном загрязнении, так как они обычно попадают в окружающую среду только с фекалиями животных и человека. Широкое распространение этой инфекции связано с увеличением числа бактерионосителей среди животных и людей. Термофилы и бактериофаги Термофилы – обширная полиморфная группа бактерий, способных к спорообразованию. Оптимальная температура для их развития 70 0 С. Ме- стом их обитания наряду с объектами окружающей среды является кишеч- ник человека и животных. Вследствие этого по количеству выявляемых в природных средах и на рукотворных объектах термофилов можно судить о степени их загрязнения фекалиями. Отсутствие термофильных микроорганизмов в консервах – хороший индикатор эффективности их стерилизации. К СПМ относят также и бактериофагов кишечных бактерий (эшери- хий, шигелл, сальмонелл). Их обнаружение в объекте, подвергнутом сани- тарному обследованию, – опосредованное свидетельство присутствия бак- териихозяина. Методы обнаружения фагов просты. Посевы производят в бульон с индикаторными штаммами, а затем пересевают на плотную пита- тельную среду. Однако использование их в качестве СПМ имеет сущест- венные недостатки. Бактериофаги выживают во внешней среде дольше соответствующих бактерий. Кроме того, они способны адаптироваться к другим видам бактерий. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №5 Тема:Методическое обеспечение микробиологического контроля пищевой продукции План: 1. Прямой метод санитарно-микробиологического контроля 2. Косвенные методы санитарно-микробиологического контроля Основные методы контроля санитарно-микробиологического состояния самых разных объектов абсолютно идентичны, так как направлены на выявление общего микробного числа (ОМЧ), СПМ, патогенов и на определение степени доброкачественности каждого обследуемого объекта, то есть его санитарного состояния, характеризующего объект в целом. Практически в санитарной микробиологии используются два основных метода контроля за состоянием окружающей среды: прямое обнаружение патогенных микроорганизмов и косвенные методы, позволяющие опосредованно судить о наличии патогенов. Прямой метод санитарно-микробиологического контроля считается наиболее точным и надежным критерием оценки эпидемиологической опасности. Отобранные для анализа образцы гомогенизируют и вводят краситель (эритрозин). Количественный учет патогенов осуществляют при использовании специальных камер Петрова или электронных счетчиков. Данный метод применяют в экстренных случаях (например, при авариях в системе водоснабжения или на очистных сооружениях) с целью получения срочного ответа о количественном содержании в тестируемых объектах патогенных микроорганизмов. Описанный метод имеет массу недостатков, в частности низкую чувствительность, так как не дает возможности отличить живые и мертвые клетки микроорганизмов, не позволяет выявить микроорганизмы, обладающие субмикроскопическими размерами, и провоцирует получение ошибочных результатов при анализе образцов, загрязненных примесями. Затруднения с выявлением патогенных микроорганизмов связаны со следующими причинами: - патогены составляют лишь незначительную (1/30000) часть от всего видового разнообразия микрофлоры; - патогены способны быстро изменяться во внешней среде, что затрудняет их распознавание; - патогены не выдерживают конкуренции с сапротрофными микроорганизмами при их совместном культивировании на питательных средах; - патогенные микроорганизмы невозможно культивировать на обычных средах, для этой цели необходимо использовать культуры тканей и клеток, а также яйца и эмбрионы лабораторных животных; - выявление какого-либо патогенного вида не всегда свидетельствует, что в исследуемом объекте присутствуют другие виды патогенов. Косвенные методы санитарно-микробиологического контроля определение в исследуемых объектах ОМЧ и СПМ, которые хотя и опосредованно, но все же могут дать точный и надежный ответ о возникновении санитарных нарушений и появлении высокого уровня эпидемиологической опасности для человека, исходящих от природной среды и рукотворных объектов. ОМЧ – общее микробное число (количественный показатель, характеризующий содержание жизнеспособных клеток микроорганизмов различных физиологических групп в 1 г или 1 мл). Критерий оценки: чем больше объект исследования загрязнен микроорганизмами, тем выше ОМЧ и тем вероятнее наличие большого количества патогенов в исследуемом образце, а, следовательно, и в тестируемом объекте окружающей человека среды обитания. В то же время нельзя не отметить, что во многих случаях большая численность ОМЧ означает большое количество сапротрофных микроорганизмов и незначительное – патогенов. Определение СПМ также позволяет судить о наличии в исследуемых объектах патогенных микроорганизмов. Критерий оценки в этом случае: чем больше в объекте исследования санитарно-показательных микроорганизмов, тем больше он загрязнен фекалиями и тем вероятнее в нем присутствие патогенов. СПМ выявляют как при использовании метода прямого подсчета, так и методом культивирования на элективных (избирательных) питательных средах. Содержание СПМ в объектах окружающей среды принято выражать в титрах и индексах. Титр – наименьшие объем (мл) или масса (г) исследуемых образцов, в которых обнаруживается хотя бы одна особь СПМ. Индекс – количество особей, обнаруживаемых в определенном объеме или массе исследуемого образца. Индекс и титр – величины обратные, зная один из них, можно легко выразить другой. Следует иметь в виду, что выбор определенного вида СПМ – индикатора фекального или орального загрязнения, характеризующего тот или иной объект окружающей среды, отнюдь не случаен и базируется на до- пущениях: - СПМ должен постоянно обитать в естественных полостях челове- ка и животных и постоянно выделяться в окружающую среду; - СПМ не должен размножаться во внешней среде, исключая пищевые продукты; устойчивость СПМ во внешней среде, а следовательно, длительность выживания должны быть выше, чем у патогенных микроорганизмов; - СПМ не должны иметь во внешней среде двойников, с которыми их можно перепутать; - СПМ не должны видоизменяться во внешней среде; - методы обнаружения СПМ должны быть экспрессными. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №6 Тема: Методы отбора и подготовки проб пищевых продуктов для микробиологического анализа План: 1. Микробиологичкский анализ 2. Методы определение микроорганизмов 3. Методы отбора и подготовки проб Пищевые продукты обычно не бывают стерильными, так как полностью освободить их от микроорганизмов и не ухудшить присущие им питательные, вкусовые или другие свойства практически невозможно. Но это и не нужно, потому что естественная и безвредная для человека микрофлора пищи является одновременно и естественной биологической защитой ее от нежелательных микроорганизмов. Вместе с тем она, представляя сложный биоценоз, в котором могут преобладать отдельные виды и группы микроорганизмов, играет свою роль и по-своему влияет на качество пищевых продуктов. Обычно в подавляющем большинстве случаев в пищевых продуктах выявляются микроорганизмы, используемые при их приготовлении. Кроме того, там могут оставаться и микроорганизмы, находившиеся в исходном растительном или животноводческом сырье, а также попавшие в продукт в процессе его переработки, изготовления, хранения, транспортировки и реализации. Нарушения этих режимов и санитарно-гигиенических условий могут направить развитие микробного ценоза по такому пути, который приведет к потере пищевыми продуктами товарных свойств и порче, а также будет способствовать их поражению возбудителями пищевых отравлений и заболеваний. Представление о микрофлоре пищевых продуктов может дать количественное и качественное исследование их общей микробной популяции. Но при этом необходимо учитывать, что оценка роли конкретного вида микроорганизма в популяции должна даваться после всестороннего изучения составляющих биоценоза в совокупности с анализом качества самих продуктов. Так, в некоторых случаях фекальный стрептококк может быть виновником пищевой токсикоинфекции, хотя в ряде технологических процессов отдельные виды энтерококков применяются для приготовления диетической простокваши, сыра «чеддер», лактобациллина; а широко используемые в пищевой промышленности молочнокислые бактерии могут явиться причиной порчи мяса, вина, пива. В некоторых случаях возникает необходимость выявить наличие в пищевом продукте технологической микрофлоры (участвующей в технологическом процессе). Так, анализ свежести кисломолочных продуктов осуществляется путем микроскопии мазков из хорошо гомогенизированной пробы, окрашенных метиленовым синим. Применение комбинированного фиксатора позволяет сократить этот процесс. При микроскопии кисломолочных продуктов констатируют наличие молочнокислых бактерий, кефирных зерен или выявляют присутствие посторонних дрожжей, обрывков мицелия и других, не свойственных продукту микроорганизмов. Если в приготовленном мазке видна только технологическая микрофлора, то 155 продукт считается доброкачественным. Если же кроме этого имеются по- сторонние включения, то исследуемый молочнокислый продукт определя- ется как несвежий. Эпидемиологическая характеристика продуктов и их безопасность оцениваются по двум основным показателям. Наиболее простым методом определения потенциальной эпидемической опасности объектов является их исследование на наличие и степень обсемененности санитарнопоказательными микроорганизмами. Более точным, но и более трудоемким считается прямое выявление патогенных микроорганизмов, что используется, например, в процессе первичной переработки скота, в ряде анализов молока, мяса и продуктов из них, при санитарно-технологическом контроле консервного производства, а также при эпидемиологических показаниях. Микробиологический анализ, играя важную роль в оценке качества пищевых продуктов, представляет собой одну из частей их товарной и технологической характеристики и может преследовать три основные цели: - контроль производственных и технологических процессов с оценкой санитарно-гигиенических условий их проведения; - контроль технологических условий хранения и оценка санитарных условий транспортировки и реализации; - контроль обеспечения эпидемической безопасности пищевых продуктов. При этом следует отметить, что сама по себе идея санитарнобактериологического контроля продуктов появилась в связи с организацией надзора за качеством пастеризованного молока и, пройдя ряд этапов развития, оформилась в систему санитарно-микробиологического нормирования и контроля подавляющего большинства пищевых продуктов. Методические особенности изучения общей микрофлоры пищевых продуктов определяются как характером и свойствами последних, так и задачами, стоящими перед анализом. В некоторых случаях целью анализа может быть только количественная характеристика микробоценоза, обсеменившего продукт питания. Чаще всего такой вид анализа требуется при плановой проверке. Качественный санитарно-микробиологический анализ проводится с целью идентификации возбудителя инфекции. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов имеют особое значение для общества, заботящегося о своих гражданах. Пищевые продукты – благоприятная среда обитания для многих микроорганизмов, в том числе патогенных, так как в них, в отличие от объектов окружающей среды, они способны размножаться и, попав в организм человека, вызывать быстрое развитие инфекционных заболеваний. В связи с этим разработаны и с 24 октября 1996 г. действуют на территории РФ новые правила, обеспечивающие полное со- 156 блюдение требований гигиенической сертификации к качеству продовольственного сырья и пищевой продукции. Эти требования включают в себя гигиенические нормативы и по микробиологическим показателям. При оценке качества пищевых продуктов исследуется развитие следующих групп микроорганизмов: - санитарно-показательные, к которым относятся мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы (МАФАнМ), бактерии группы кишечных палочек – БГКП (колиформы), бактерии семейства Enterobacteriaceae, энтерококки; - условно-патогенные микроорганизмы, к которым относятся Е. coli, S. aureus, бактерии рода Proteus, В. cereus и сульфитредуцирующие клостри- дии, Vibrio parahaemolyticus; - патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы и Listeria monocytogenes, бактерии рода Yersinia; - микроорганизмы порчи – дрожжи и плесневые грибы, молочнокис- лые микроорганизмы; - микроорганизмы заквасочной микрофлоры и пробиотические микроорганизмы (молочнокислые микроорганизмы, пропионовокислые микроорганизмы, дрожжи, бифидобактерии, ацидофильные бактерии и др.) – в продуктах с нормируемым уровнем биотехнологической микрофлоры и в пробиотических продуктах. Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (бактерий, дрожжей и плесневых грибов) осуществляют по ГОСТ 10444.15-94 методами посева в агаризованные питательные среды и наиболее вероятного числа (НВЧ). Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) посевом в агаризованные питательные среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см 3 жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Метод основан на высеве продукта или разведения навески продукта в пи- тательную среду, инкубировании посевов, подсчете выросших видимых колоний. При определении КМАФАнМ этим методом из продукта и (или) из каждого соответствующего разведения по 1 см3 высевают в две параллель- ные чашки Петри. Посевы заливают по ГОСТ 26670 одной из питательных сред (глюкозо-триптонный агар, мясо (рыбо)-пептонный агар, мясо (рыбо)пептонный агар с глюкозой и др.) Нормативные и технические документы на питательные среды, предназначенные для контроля микробиологических показателей безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов, подлежат санитарно-эпидемиологической экспертизе в установленном по- рядке. Если ожидают ползучий рост микроорганизмов из родов Bacillus и Proteus, посевы заливают по ГОСТ 26670 вторым слоем питательной среды 157 или голодного агара (~4 см3 ). Посевы инкубируют при температуре 30±1 0 С в течение 72±3 ч в аэробных условиях. После инкубирования по- севов подсчитывают количество колоний, выросших на чашках Петри. Для подсчета отбирают чашки, на которых выросло 15–300 колоний. Результаты подсчета количества колоний пересчитывают согласно ГОСТ 26670. При необходимости из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и определяют наличие каталазы. Метод определения НВЧ мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см3 жидкого продукта менее 15 КОЕ этих микроорганизмов. Сущность метода – в высеве продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую питательную среду, инкубировании посевов, учете видимых признаков роста микроорганизмов, пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на агаризованные питательные среды для подтверждения роста микроорганизмов, подсчете их количества с помощью таблицы НВЧ (ГОСТ 26670). При определении КМАФАнМ по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству высеваемого продукта в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведения в трехкратной повторности высевают в пробирки или колбы с одной из жидких питательных сред, приготовленных идентично агаризованным, но без внесения агара (например вместо мясо (рыбо)пептонного агара применяют мясо (рыбо)-пептонный бульон). Посевы инкубируют идентично первому методу. В средах отмечают наличие или отсутствие видимых признаков роста (газообразование, появление мути, осадок). Если рост микроорганизмов выражен недостаточно четко, проводят микроскопирование посевов методом раздавленной или висячей капли с одновременным подтверждением возможности роста микроорганизмов пу- тем пересева культуральной жидкости внутрь или на одну из агаризован- ных сред. Из выросших колоний, как и в первом случае, готовят мазки, ок- рашивают по Граму, микроскопируют и определяют наличие каталазы. К колиформным бактериям относят аэробные и факультативноанаэробные не образующие спор Грам- палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Колиформы определяют по ГОСТ Р 50474- 93 тремя методами: метод НВЧ и методы посева в (или на) агаризованные селективно-диагностические среды. Для проведения испытаний применя- ют среды: агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым крас- ным, бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, бульон Мак- Конки, среда Кесслера, среда Эндо. Посевы на агаризованных и жидких средах инкубируют при температуре 36±1 0 С в течение 24–48 ч. Положи- тельными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место интен- сивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, об- разовании газа, подкислении среды (изменении цвета). На агаризованных 158 средах отмечают рост характерных колоний. Так, на среде Эндо колифор- мы образуют бледнорозовые или красные с металлическим блеском колонии. Выявление всех микроорганизмов, входящих в состав микрофлоры того или иного продукта, – задача исключительно трудная. В то же время лабораториями Госсанэпиднадзора РФ помимо приведенных выше показателей в пищевых продуктах в обязательном порядке определяются условнопатогенные микроорганизмы – E. coli (ГОСТ 30726-2001), S. aureus (ГОСТ 10444.2-94), B. cereus (ГОСТ 10444.8-88), бактерии рода Proteus (ГОСТ 2856090), сульфитредуцирующие клостридии (ГОСТ 29185-91); патогенные – бактерии рода Salmonella (ГОСТ Р 50480-93) и Licteria monocytogenes (ГОСТ Р51921-2002), а также микроорганизмы порчи – дрожжи, плесневые грибы (ГОСТ 10444.12-88). Регламентирование по показателям микробиологического качества и безопасности пищевого сырья и продуктов питания осуществляется для большинства групп микроорганизмов по альтернативному принципу, то есть нормируется масса продукта, в которой не допускаются БГКП, боль- шинство условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенные мик- роорганизмы, в том числе сальмонеллы и листерии. В других случаях раз- работанный норматив отражает количество колониеобразующих единиц в 1 г (мл) продукта (КОЕ/г, мл). Если в гигиенических нормативах для пищевых продуктов массового потребления не указаны ограничения по микробиологическим показате- лям, следует помнить, что в таких продуктах патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не допускаются в 25 г. Во всех видах доброкачественной рыбной продукции патогенный микроорганизм Vibrio parahaemolyticus не допускается в количестве более 10 КОЕ/г, а контроль по этому показателю проводится при общем эпидемиологическом неблагополучии региона. В салатах и смесях из сырых овощей, готовых к употреблению, наличие бактерий рода Yersinia не до- пускается в 25 г продукта, а контроль за этим показателем также осущест- вляется в случае неблагоприятной эпидемиологической обстановки. При получении неудовлетворительных результатов хотя бы по од- ному из микробиологических показателей проводят повторный анализ уд- военного объема выборки, взятого из той же партии. Результаты повторно- го анализа распространяются на всю партию. Помимо того что в пищевых продуктах не допускается наличие патогенных микроорганизмов и их токсинов, вызывающих инфекционные и паразитарные болезни или представляющих опасность для здоровья чело- века и животных, в мясе и мясных продуктах не допускается наличие воз- будителей паразитарных болезней: финн (цистицерков), личинок трихи- нелл и эхинококков, цист, саркоцист и токсоплазм; в рыбе, ракообразных, моллюсках, земноводных, пресмыкающихся и продуктах их переработки – 159 живых личинок паразитов, опасных для здоровья человека; в свежих и свежезамороженных зелени, овощах, фруктах и ягодах – яиц гельминтов и цист кишечных патогенных простейших. При этом гигиенические норма- тивы по паразитологическим показателям безопасности питьевой воды оп- ределяются в соответствии с гигиеническими нормативами, установлен- ными для воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Микробиологические показатели качества пищевой продукции являются лишь частью полномасштабного санитарного обследования, проводимого специализированными лабораториями и заключающегося в оценке практически всех свойств продуктов питания: органолептических, физико-химических и биологических, дающих наиболее полное представление о их состоянии. Органолептические свойства пищевых продуктов определяются показателями вкуса, цвета, запаха и консистенции, характерными для каждого вида продукции, и должны удовлетворять традиционно сложившимся вку- сам и привычкам населения. Органолептические свойства пищевых про- дуктов не должны изменяться при их хранении, транспортировке и в про- цессе реализации. Кроме того, пищевые продукты не должны иметь посто- ронних запахов, привкусов, включений, отличаться по цвету и консистен- ции, присущих данному виду продукта. Определение показателей безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов смешанного состава, в том числе биологически активных добавок к пище, производится по основным видам сырья как по массовой доле, так и по допустимым уровням нормируемых контаминантов. В пищевых продуктах контролируется содержание основных химических загрязнителей, представляющих опасность для здоровья человека. Гигиенические требования к допустимому уровню содержания токсичных элементов предъявляются ко всем видам продовольственного сырья и пищевых продуктов. Содержание микотоксинов – афлатоксина B1, дезоксиниваленола (вомитоксина), зеараленона, Т-2-токсина, патулина – контролируется в продовольственном сырье и пищевых продуктах растительного происхождения, афлатоксина M1 – в молоке и молочных продук- тах. Основными загрязнителями являются: для зерновых продуктов – дезоксиниваленол; для орехов и семян масличных – афлатоксин B1; для продуктов переработки фруктов и овощей – патулин. В продуктах детского и диетического питания присутствие микотоксинов не допускается. Во всех видах продовольственного сырья и пищевых продуктов контролируются пестициды: гексахлорциклогексан (альфа-, бета-, гамма-изомеры), ДДТ и его метаболиты; в зерне и продуктах переработки – также ртутьорганиче- ские пестициды, 2,4-Д-кислота, ее соли и эфиры; в рыбе и продуктах пере- работки – 2,4-Д-кислота, ее соли и эфиры, полихлорированные бифенилы. Контроль содержания бенз(а)пирена осуществляется в зерне, копченых 160 мясных и рыбных продуктах. В продуктах детского и диетического пита- ния присутствие бенз(а)пирена не допускается. В продуктах животного происхождения контролируются остаточные количества стимуляторов роста животных (в том числе гормональных пре- паратов), лекарственных средств (в том числе антибиотиков), применяе- мых в животноводстве для целей откорма, лечения и профилактики забо- леваний скота и птицы. В мясе, мясопродуктах, субпродуктах убойного скота и птицы контролируются как допущенные к применению в сельском хозяйстве кормовые антибиотики – гризин, бацитрацин, так и лечебные антибиотики, наиболее часто используемые в ветеринарии, – антибиотики тетрациклиновой группы, левомицетин. В молоке и молочных продуктах контролируются пенициллин, стрептомицин, антибиотики тетрациклино- вой группы, левомицетин; в яйцах и яйцепродуктах – бацитрацин, анти- биотики тетрациклиновой группы, стрептомицин, левомицетин. Контроль содержания стимуляторов роста животных (в том числе гормональных препаратов), лекарственных средств (в том числе антибиотиков), препара- тов, применяемых в животноводстве для целей откорма, лечения и профи- лактики заболеваний скота и птицы, основывается на информации, пред- ставляемой изготовителем (поставщиком) продукции, об их использовании при ее изготовлении и хранении. В отдельных пищевых продуктах контролируется содержание азотсодержащих соединений: гистамина – в рыбе семейств лососевых и скумбриевых (в том числе группа тунцовых); нитратов – в плодоовощной продукции; N-нитрозаминов – в рыбе и рыбопродуктах, мясных продуктах и пивоваренном солоде. В жировых продуктах контролируются показатели окислительной порчи: кислотное число и перекисное число. Практически во всех пищевых продуктах контролируются гигиенические нормативы содержания естественных радионуклидов цезияи стронция-90. Следует помнить, что пищевые продукты должны удовлетворять физиологические потребности человека в необходимых веществах и энергии, отвечать предъявляемым к пищевым продуктам требованиям в части органолептических и физико-химических показателей и соответствовать установленным нормативными документами требованиям к допустимому содержанию химических, радиологических, биологических веществ и их соединений, микроорганизмов и других биологических организмов, представляющих опасность для здоровья нынешнего и будущих поколений. В связи с этим изготовляемые, ввозимые и находящиеся в обороте на территории РФ пищевые продукты по безопасности и пищевой ценности должны соответствовать санитарным правилам. Изготовление новых пищевых продуктов на территории нашей страны, ввоз пищевых продуктов на ее территорию, осуществляемый впервые, допускается только после их государственной регистрации в установленном порядке. Для продовольственного сырья растительного происхождения обязательны информация о пестицидах, использованных при возделывании сельскохозяйственных культур, фумигации помещений и тары для их хранения, для борьбы с вредителями продовольственных запасов, а также дата последней обработки ими. Для продовольственного сырья животного происхождения обязательна информация об использовании (или отсутствии такового) пестицидов для борьбы с эктопаразитами или заболеваниями животных и птицы, для обработки животноводческих и птицеводческих помещений, прудовых хозяйств и водоемов для воспроизводства рыбы с указанием наименования пестицида и конечной даты его использования. Для отдельных видов пищевых продуктов (продукты детского, диетического и специализированного питания, пищевые добавки, биологиче- ски активные добавки к пище, пищевые продукты из генетически модифицированных источников и др.) указываются: - область применения (для продуктов детского, диетического и специализированного питания, пищевых добавок, биологически активных добавок к пище); - наименование ингредиентов, входящих в состав пищевого продукта, пищевые добавки, микробные культуры, закваски и вещества, используемые для обогащения пищевых продуктов; в биологически активных добавках к пище и обогащенных продуктах для биологически активных компонентов указывают также проценты от суточной физиологической по- требности, если такая потребность установлена; - рекомендации по использованию, применению, противопоказания к их использованию при необходимости; - для биологически активных добавок к пище обязательна информация: «Не является лекарством»; - для пищевых продуктов из генетически модифицированных источников обязательна информация: «генетически модифицированная продукция», или «продукция, полученная из генетически модифицированных источников», или «продукция содержит компоненты из генетически модифицированных источников» (для пищевых продуктов, содержащих более 5 % таких компонентов); - информация о государственной регистрации. Пищевые продукты, содержащие кормовые добавки, стимуляторы роста животных (в том числе гормональные препараты), лекарственные средства, пестициды, агрохимикаты, не прошедшие санитарно-эпидемиологическую экспертизу и государственную регистрацию в установленном порядке, не подлежат ввозу, изготовлению и обороту на территории РФ. Их утилизация или уничтожение осуществляются в установлен- ном порядке. 162 Для проведения лабораторных исследований и испытаний показателей качества и безопасности пищевых продуктов допускаются метрологически аттестованные методики, соответствующие требованиям обеспечения единства измерений и характеристикам погрешности измерений, способам использования при испытаниях образцов продукции и контроля их параметров, а также методики, соответствующие указанным требованиям и утвержденные в установленном порядке. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №7-8 Тема: Микробиологические методы анализа молока и молочных продуктов План: 1. Методы отбора и подготовки проб молочных продуктов 2. Проведение анализа Объединенную пробу молока объемом 500 см3 составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны. От данной пробы после тщательного перемешивания отбирают 50—60 см3 продукта в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой. От продукции, попавшей в выборку, отбирают для анализа 15—20 г (включая и поверхностный слой) творога, творожных изделий, масла в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой. При отборе сыра стерильным шпателем или ножом прижигают его поверхность. Стерильный щуп вводят наклонно в середину головки на 34 его длины. Из столбика сыра на щупе отбирают стерильным шпателем 15—20 г сыра и помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой или стерильную чашку Петри с крышкой. Пробу, отправляемую в лабораторию, снабжают этикеткой, на которой указывают: номер пробы; наименование предприятия-изготовителя; * наименование и сорт продукта; * номер и объем партии; * дату и час выработки продукта; * дату и час отбора проб; * должность и подпись лица, отобравшего пробу; * объем необходимых анализов; обозначение нормативно-технической документации, по которой вырабатывался продукт. Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 часа с момента отбора проб. Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследования в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6°С, не допуская подмораживания, а для мороженого — не выше минус 2°С. Определение общего микробного числа и коли-титра в молоке Перед посевом готовят десятикратные разведения молока в стерильном растворе хлористого натрия. Для этого стерильной пипеткой отбирают 10 см3 молока и вносят в 90 см3 стерильного раствора хлористого натрия, получают разведение 1 : 10. Далее из него готовят последующие разведения 1 : 100, 1 : 1000 и т. д. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10—15 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40—45° С питательной средой для определения количества мезофильных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри перевертывают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой 30 + 1 °С на 72 часа. Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке. При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 13 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке. Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 см3 продукта (х) в единицах вычисляют по формуле х = n - 10 1, где n — количество колоний, подсчитанных на чашке Петри; m — число десятикратных разведений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам. Допустимое количество микробов в 1 мл молока пастеризованного бутылочного 75 000, во флягах и цистернах 150 000. Метод определения коли-титра БГКП Под коли-титром следует понимать наименьшее количество исследуемой пробы, выраженные в мл (вода, молоко, жидкие пищевые продукты) или в г (плотные пищевые продукты), в котором обнаруживается присутствие бактерий группы кишечных палочек. Метод основан на способности БГКП (бесспоровые, грам-отрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные палочки, в основном, являющиеся представителями родов эше-рихий, цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серация) сбраживать в питательной среде лактозу с образованием кислоты и газа при 37°С в течение 24 часов. Проведение анализа В среду Кесслер производят посев из разведений молока от 0,1 до 0,00001. По 1 см3 соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслер. Пробирки с посевами помещают в термостат при 37°С на 18—24 часа. На вторые сутки просматривают пробирки и при отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразования в наименьшем из засеиваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в нем. Учет результатов Для установления коли-титра применяют стандартные таблицы. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №9-10 Тема: Микробиологические методы анализа мяса и мясных продуктов План: 1. Методы исследование сырое мясо 2. Порядок анализа Сырое мясо исследуется по требованию ветеринарной или санитарной службы на наличие различной патогенной микрофлоры: сальмонелл, возбудителей сибирской язвы и т. д. Методика исследования мяса на патогенную микрофлору изложена в ГОСТе 21237—75. Полуфабрикаты из рубленого мяса исследуются также только на наличие патогенной флоры (ГОСТ 4288—76). В готовых кулинарных изделиях, колбасах, студнях и других мясных продуктах, подвергнутых термической обработке, кроме того, определяются: общая бактериальная обсемененность; обсемененность продукта микробами группы кишечной палочки и протея. Эти показатели отражают как качество обработки продукта, так и санитарные условия его хранения. Методика исследования кулинарных изделий из рубленого мяса (котлеты, битки и т. д.) изложена в ГОСТе 4288— 76. Для анализа отдельно отбирают по 5 г наружной и внутренней части изделия и из каждой готовой 10% суспензию (разведение 1 : 10), для чего к 5 г, помещенным в стерильную ступку, постепенно приливают 45 мл стерильного физраствора. Для определения общей обсемененности производят дополнительное разведение 1 : 100 (10% взвесь разводят в 10 раз) и 1 мл этого разведения заливают МПА в стерильных чашках Петри. Посевы инкубируют 48 г при 37°С. Расчет производят как обычно на 1 г исследуемого продукта. ГОСТ 4288—76 предусматривает лишь определение наличия микробов группы кишечной палочки в 0,5 г изделия. Порядок анализа: 5 мл 10% взвеси продукта засевают в 5 мл питательной среды и инкубируют посевы 24 часа при температуре 37°С. В случае роста кишечных палочек на среде Хейфеца, происходит ферментация манита, среда приобретает желтый цвет. Для окончательного заключения о наличии бактерий группы кишечной палочки в изделии делают высев с жидких сред на чашки со средой Эндо. При наличии на чашках после 24-часовой инкубации при 37°С подозрительных колоний изготовляют мазки и окрашивают их по Граму. Наличие в посевах Гр~ неспоровых бактерий, образующих характерные для группы кишечных палочек колонии, указывает на загрязненность изделия кишечными палочками, имеющими санитарно-показательное значение. Методы бактериологического исследования колбасных изделий и продуктов из мяса изложены в ГОСТе 9958—74. Пробы для баканализа этих продуктов берут следующим образом: а) колбасные изделия в оболочке и копчености помещают на металлическую тарелку, тщательно протирают по поверхности тампоном, смоченным спиртом и обжигают. Затем батоны разрезают продольно (стерильным флам-бированным) ножом или скальпелем на 2 половинки, не рассекая противоположную сторону батона. Пробу снимают путем соскоба или среза фарша с обеих половинок всей поверхности разрезанного батона; б) из продуктов на костях стерильным инструментом вырезают кусочки, взятые с различных участков обожженного образца на глубине 2—3 см от поверхности, предпочтительно ближе к кости; в) мясные хлеба, студень и другие изделия без оболочки подвергаются исследованию, взяв пробы с поверхности и из глубины продуктов. Для этого пробу из глубины продукта помещают в тазик, смачивают спиртом и обжигают. Обожженную поверхность соскабливают стерильным ножом или срезают и затем вырезают в нескольких местах 2—3 кусочка. Отобранную пробу взвешивают. 20 г помешают в ступку, и добавляя стерильный физраствор, готовят разведение 1:5. Для более тщательного растирания добавляют небольшое количество стерильного песка или стерильного битого стекла. Определение общей обсемененности по ГОСТу следует производить путем посева 0,5 мл в разведении 1 : 5 и 1 : 50 в расплавленный и остуженный, как обычно, агар и чашки с посевами в термостат на 48 часов при 37°С. Подсчитанное число колоний умножают на степень разведения продукта (на 10 или 100), т. е. определяют количество микробов в 1 г продукта. В колбасах предусмотрено определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта, для чего 5 мл анализируемой взвеси (разведение 1 : 5) вносят в пробирки, содержащие по 10 мл среды Кесслера или Хейфеца двойной концентрации — 43°С — 20 часов. Дальнейшее ведение исследования аналогично исследованию кулинарных продуктов из рубленого мяса. По ГОСТу, если в 1,0 г продукта не обнаружены кишечные палочки, его бактериологическое состояние удовлетворительное. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №11-12 Тема: Микробиологические методы анализа хлебобулочных, мукомольно-крупяных изделий. План: 1. Обсемененность различных видов крупы микроорганизмами 2. Санитарно-микробиологические показатели безопасности муки и круп 3. Санитарно-микробиологические требования к макаронным изделиям Обсемененность различных видов крупы микроорганизмами обусловлена составом микрофлоры перерабатываемого зерна, большую часть которой представляют бактерии (~ 80 %), меньшую – дрожжи, плесени, актиномицеты. Основным представителем бактерий является типичный представитель микрофлоры, повсеместно заселяющий злаковые культуры, – неспорообразующая, палочковидная бактерия Erwinia herbicola, количе- ство которой на зерне достигает 80–90 %. При соблюдении правил хранения зерна (относительная влажность воздуха в помещении 70–75 %, температура – не более 14–16 0 С) численность обитающих на нем микроорганизмов снижается, тем не менее, Erwinia herbicola остается преобладающей формой, что в принципе считается показателем его хорошего качества. Отметим, что в процессе хранения зерна изменяется качественный состав плесневых грибов: на место изначально присутствующей на свежеубранном зерне плесени, относящейся к родам Alternaria, Cladosporium, Helminthosporium, Ascochyta, приходят аспергиллы и пенициллы. В процессе приготовления любого вида крупы происходит ее дополнительное обсеменение микрофлорой из окружающей среды. Обычно кру- пы содержат 104 –105 бактерий и 102 –103 спор грибов в 1 г. При длительном хранении крупа портится от воздействия микрофлоры, развивающейся на ней при повышенной влажности. При этом преобладают те микроорганизмы, для которых при повышенной влажности устанавливается благоприятная именно для них температура. Следует иметь в виду, что на крупе, выработанной из пропаренного зерна, плесени развиваются интенсивнее, нежели на крупе из непропаренного зерна. Плесневение круп – один из самых неблагоприятных видов микробных пороков для этого вида пищевой продукции, так как развитие плесеней приводит к ухудшению качества и технологических свойств круп вследствие накопления ими микотоксинов. Плесневение круп происходит на несколько месяцев позднее при их хранении в условиях пониженной температуры (4–5 0 С). Муку относят к продуктам, не стойким по отношению к микроорганизмам, способным вызвать ее порчу. Развитие микроорганизмов порчи в муке замедляется при соблюдении режима хранения – при относительной влажности воздуха, не превышающей 70 %. Основные виды порчи муки, связанные с нарушением правил ее хранения: плесневение, прокисание и прогоркание. Два первых типа порчи связаны с нарушением влажностного режима и влекут за собою в первом случае развитие плесеней, относящихся к родам Aspergillus и Penicillium и способных активно развиваться в муке даже при незначительном увеличении влажности, во втором случае – развитие бактериальных культур, способных подкислять субстрат, образовывая молочную, уксусную, пропио- новую и другие кислоты. Прогоркание муки происходит вследствие разви- тия микрофлоры либо за счет окисления липидов кислородом воздуха при участии фермента липоксигеназы, содержащегося в муке. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 мука и крупы, требующие варки, должны обладать строго определенными показателями безопасности, сре- ди которых микробиологические имеют существенное значение (табл. 17). Таблица 17. Санитарно-микробиологические показатели безопасности муки и круп Наименова К Масса продукта (г), в Пл Др ние МАкоторой не допускаются есени, ожжи, ФАнМ, КОЕ/г, КОЕ/г, КОЕ/г, не более не более Б S патоге не ГКП . нные, в том более (коли- aureus числе формы) сальмонеллы Крупы 2 1, 25 10 10 необработанные: ,5х104 0 0 0 рисовая, гречневая, овсяная, пшеничная, ячменная Крупа 1 1, 1 25 50 50 4 манная х10 0 ,0 Мука 5 0, 25 20 10 4 необработанная: х10 1 0 0 рисовая, гречневая, овсяная, ржаная Мука 1 1, 1 25 50 10 обработанная: х104 0 ,0 рисовая, гречневая, овсяная, ржаная Помимо жестких требований к содержанию в муке различных видов токсичных элементов (Pb, As, Cd и Hg – не более 0,5, 0,2, 0,1 и 0,03 мг/кг продукта соответственно), радионуклидов (Cs-137 и Sr-90 – не более 60 и 30 Бк/кг соответственно), микотоксинов (в частности Т-2-токсина, зеара- ленона и афлатоксина В1 – не более 0,1, 0,2 и 0,005 мг/кг соответственно), пестицидов (в частности метаболитов ДДТ – не более 0,05 мг/кг продукта), в ней не допускается присутствие вредителей хлебных злаков (насекомых, клещей), а в пшеничной муке спустя 36 ч после пробной лабораторной вы- печки не допускается наличие возбудителя картофельной болезни хлеба. Требования к макаронным изделиям в зависимости от технологии их приготовления содержатся в СанПиН 2.3.2.1078-01 (табл. 18). Таблица 18. Санитарно-микробиологические требования к макаронным изделиям Макаронн КМ Масса продукта (г), в которой Дро ые изделия: Ане допускаются жжи, ФАнМ, КОЕ/г, не КОЕ/г, не более БГ S. патогенн более КП aureus ые, в том числе (колисальмонеллы формы) Яичные 25 С добавками на 04 молочной основе С добавками на 04 растительной основе Безбелков ые 04 5х1 0,0 1,0 25 - 5х1 0,1 - 25 - 1х1 0,0 - 25 200 1 1 Макаронные изделия получают из пшеничной муки, воды и различных добавок, улучшающих их вкус и сохранность. Сохранять этот вид пищевой продукции возможно довольно продолжительное время, так как она содержит обычно от 11 до 13 % влаги. В то же время порча макаронных изделий может происходить как при нарушении технологии их приготовления, так и в процессе хранения. Источником микробного поражения макаронных изделий в процессе приготовления могут стать все виды сырьевых ресурсов (мука, вода, добавки, в частности яйца), а также тестомесильная и формовочная аппаратура. Обсеменение макаронных изделий микроорганизмами может происходить и в процессе их хранения при нарушении влажностного режима, в результате чего макароны могут испортиться в связи с развитием плесневых грибов родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, а также сенной палочки, молочнокислых бактерий и других представителей микрофлоры. Помимо плесневения и прокисания макаронные изделия могут заселить дрожжи, вызвав изменение их окраски (фиолетовые полосы на поверхности). Для выпуска доброкачественной продукции все сырьевые ресурсы, необходимые в производстве макарон, подвергают санитарномикробиологической оценке. Кроме этого, дважды в месяц исследуют воздух всех производственных помещений, в 1 м 3 которого должно содержаться не более 500 микроорганизмов, среди которых не допускается присутствие спор и конидий плесневых грибов. Чистота аппаратуры проверяется визуально или микроскопированием последней промывной воды. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №13 Тема: Микробиологические методы анализа напитки и продукты брожения План: 1. Микробиологические методы анализа безалкогольных напитков 2. Санитарно-микробиологические показатели безопасности различных видов пива 3. Источники инфекции при производстве вин К безалкогольным напиткам относят несброженные натуральные соки из свежих плодов и ягод. Полученные соки содержат остаточную микрофлору сырья, которая изменяется при различных технологических операциях: уменьшается за счет мойки и фильтрования и увеличивается за счет прессования плодов и ягод. Соки – благоприятная питательная среда для многих микроорганизмов, поэтому их в обязательном порядке пасте- ризуют. Но даже пастеризованные соки, сохраняемые при рекомендованной температуре хранения 2–10 0 С, достаточно быстро подвергаются микроб- ной порче, особенно из-за активно развивающихся дрожжей, относящихся к различным родам, в том числе Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Candida. Результатом их развития является изменение органолептических свойств сока, он становится мутным, приобретает посторонние неприят- ный вкус и запах. Помимо дрожжевых культур в соках развиваются молочнокислые и реже уксуснокислые бактерии с образованием соответствующих продуктов брожения, что необратимо портит их вкус. Соки могут стать тягучими и ослизняться за счет развития бактерий рода Leuconostoc. Развитие в соках грибов рода Penicillium приводит к их плесневению. Чтобы предотвратить порчу натуральных соков, в технологический процесс включают их обработку УФО, ультразвуком или зарекомендовавшими себя консервантами – бензойной и сорбиновой кислотами и их солями. Вследствие того что соки относятся к быстро портящимся продуктам, их микробиологические показатели строго нормируются. Так, титр БГКП для соков равен 300 см3 . Квас является слабоалкогольным напитком, полученным за счет параллельно идущих спиртового и молочнокислого брожения. Порча кваса происходит при развитии в нем бактерий рода Leuconostoc, уксуснокислых и термоустойчивых кислотообразующих бактерий, а также дрожжей рода Candida. Длительное хранение кваса возможно лишь при проведении пастеризации. Требования к его качеству по микробиологическим показате- лям довольно высокие: титр E. сoli 10–100 см3 , присутствие слизеобра- зующих бактерий не допускается. Пиво также относят к слабоалкогольной продукции. Технология получения пива включает процесс солодоращения, варку пивного сусла и его сбраживание, созревание, фильтрацию и розлив. Сусло и готовая про- 200 дукция в течение всего технологического процесса подвержены воздейст- вию посторонней микрофлоры, поступающей из воздуха, воды, с засевны- ми дрожжами, с аппаратурного оснащения и тары. Развитие этих микроорганизмов в сусле или пиве в значительной степени задерживается в связи с их естественной устойчивостью, обусловленной бактерицидным действи- ем хмелевых смол, низким (4,1–4,4) уровнем кислотности, низкой темпе- ратурой, отсутствием кислорода, избыточным содержанием СО2 и присут- ствием спирта. Порчу пива способны вызвать дрожжи, среди которых наибольшую опасность представляет Candida mycoderma, окисляющая спирт, образую- щийся в пиве, до СО2 и воды. Опасны для пива молочнокислые и уксуснокислые бактерии. Первые вызывают помутнение, прокисание, иногда ослизнение пива, вторые, окисляя спирт в уксусную кислоту, образуют на поверхности пива пленку и слизь. Общий санитарно-гигиенический контроль технологического процесса при производстве пива направлен на систематическую микробиоло гическую проверку воды, воздуха и аппаратуры производственных поме щений, а также чистоты рук обслуживающего персонала на наличие БГКП. Микробиологический контроль готового продукта включает оценку по показателям: КМАФАнМ, БГКП (колиформы), патогенные микроорганизмы, а также микроорганизмы порчи (табл. 21). Таблица 21. Санитарно-микробиологические показатели безопасности различных видов пива Наименовани КМАФ Объем или масса продукта (см3 , г), е пива АнМ, в которой не допускаются КОЕ/100см3 , БГКП патоген дрож не более (коные, в том жи и лиформы) числе плесени сальмонеллы Разливное 1,0 25 Непастеризо 3,0 25 ванное в кегах Непастеризо 10,0 25 ванное в бутылях Пастеризова 500 10,0 25 40 нное и обеспложенное Предотвращение порчи пива предполагает его пастеризацию, а также обработку СВЧ и применение консерванта – сорбиновой кислоты. Вина получают путем сбраживания виноградного или плодово- ягодных соков. Сбраживание осуществляют чистые культуры дрожжей, 201 относящиеся к виду Saccharomyces vini, оптимум их развития 13–15 0 С. Для производства хереса применяют другой вид сахаромицетов – Saccharomyces oviformis с температурным оптимумом 16–20 0 С. При произ- водстве некоторых вин используется смешанная дрожжевая флора. Источники инфекции при производстве вин: сырье, вода, оборудова- ние и аппаратура, руки обслуживающего персонала, а также одежда и обувь, не отвечающие санитарным требованиям. В связи с этим производ- ственные цеха, сырьевые ресурсы и прочее подлежат обязательной про- верке на соответствие санитарным нормам. В процессе жизнедеятельности дрожжей, благодаря осуществляемым ими ферментативным процессам и образованию эфиров, создается букет вина – сочетание определенного приятного вкуса и аромата. Полученный виноматериал подлежит очень длительной процедуре – созреванию, иду- щему в присутствии незначительного содержания кислорода. Содержание последнего регулируется за счет высокого содержания СО2 и SО2. Нежелательные изменения состава, вкуса и аромата вин вызывают различные посторонние микроорганизмы. Их развитие в готовом продукте способствует ухудшению его качества, а иногда провоцирует полную пор- чу продукции. Болезни вин вызывают микроорганизмы, способные актив- но развиваться в условиях повышенных спиртосодержания и кислотности. Среди вредителей вин: дрожжи, бактерии и грибы. К дрожжевым болезням вин относятся помутнение, цвель и пониже- ние кислотности. Помутнение обусловлено развитием в вине дрожжей родов Candida, Bretanomyces, Pichia и других, которым чаще всего сопутствуют уксуснокислые бактерии. В результате развития этого порока в вине снижается содержание спирта и кислот. Для получения столовых вин, стойких к микробному помутнению, рекомендуется применять холодную стерилизацию и сульфитацию. Цвель вина вызывают пленчатые дрожжи родов Candida и Pichia. Развитие этих микроорганизмов происходит в неполно налитой вином та- ре. Поверхность вина покрывается постепенно утолщающейся морщини- стой серовато-белой пленкой. Предупреждение цвели основано на пре- кращении доступа кислорода к пленчатым дрожжам. Понижение кислотности свойственно свежим плодово-ягодным со- кам, содержащим преимущественно яблочную кислоту и заготовляемым на длительное хранение при недостаточном сульфитировании, или бродя- щему суслу. Возбудители порчи – дрожжи рода Shizosaccharomyces. В со- ках с повышенным содержанием лимонной кислоты (смородиновом, кры- жовенном, малиновом и земляничном), а также в соках, в которых вообще отсутствует яблочная кислота (брусничном, клюквенном, ежевичном), по- нижения кислотности практически не происходит. Бактерии способны вызывать разнообразные, очень опасные болезни вин: ослизнение, прогоркание, прокисание, маннитное брожение, ожире- ние. Ослизнение вин происходит при развитии смешанных популяций микроорганизмов, склонных к слизеобразованию. Среди них: микрококки, молочнокислые бактерии, относящиеся к роду Leuconostoc, и плесени. Слизеобразование чаще всего происходит в белых молодых винах. Этот вид винного порока предупреждают добавлением танинов или сульфита- цией. Возбудитель винного прогоркания – Bacillus amaracrylus. При разви- тии данного порока в вине образуется осадок, оно горчит и приобретает неприятный запах летучих кислот. Предупреждают прогоркание вин сортированием винограда с тщательной выбраковкой заболевших ягод и, применением стерильного розлива. Прокисание вин обеспечивают уксуснокислые или молочнокислые бактерии. В борьбе с этими пороками, как и со многими другими, важно не лечение, а предотвращение болезни. Поэтому основными мерами борьбы являются эффективный санитарно-гигиенический контроль чистоты тары и аппаратуры, своевременная выбраковка больного сырья, строгое соблю- дение технологического режима производства. Лечение прокисших вин возможно только в самом начале развития болезни. С этой целью приме- няют пастеризацию, сульфитацию, фильтрование и подкисление. Маннитное брожение поражает малокислотные красные вина. Заболевание могут вызвать представители родов Leuconostoc и Lactobacillus. Фруктоза и другие сахара переводятся ими в маннит, вино мутнеет, приобретая запах разлагающихся фруктов и острый кисло-сладкий вкус. В этом случае профилактические мероприятия такие же, как и при других видах бактериальных болезней. Возбудители ожирения вина – виды рода Leuconostoc, из-за которых сахароза превращается в декстран. В результате вино приобретает консистенцию яичного белка, но его букет не исчезает. Ожирение вина легко лечится либо введением танина при слабом развитии болезни, либо при сильном ее течении удалением образовавшейся слизи переливанием вина через разбрызгиватель с сильной аэрацией и последующей сульфитацией, а также соблюдая все положенные на этом этапе технологические приемы. Качество вина зависит и от развития на виноградных гроздьях гри- бов вида Botrytis cinerea. При этом гриб способен влиять на качество вина положительно, вызывая так называемую благородную гниль винограда, либо отрицательно, способствуя развитию серой гнили. Условия для раз- вития благородной гнили имеются только в некоторых районах Франции и Германии. В связи с большим количеством пороков, которым подвержены вина, очень важны санитарно-микробиологический контроль, заключающийся в 203 обнаружении источников и очагов инфекции на производстве с целью их своевременного устранения, а также раннее распознавание болезней вин для их лечения и борьбы с вредной микрофлорой. Для определения содержания посторонних микроорганизмов в 1 мл вина пробы высевают на плотные питательные среды. Больными винами считаются зараженные бактериями (5 и более в поле зрения) и содержа- щими летучие кислоты: более 1,5 г/л в белых винах и более 2,0 г/л – в красных. Общие правила предохранения вин от микробной порчи: - пастеризация; - использование антисептиков (SО2, сорбиновой кислоты и ее со- лей); - холодная стерилизация (обработка ультразвуком, УФО и γ-лучами 60СО). Важнейшими показателями качества вин, водки, а также других спиртных напитков, в том числе пива, являются санитарно-химические по- казатели, по которым допустимый уровень содержания в этой продукции токсичных элементов и опасных для здоровья человека химических соединений не должен превышать, мг/кг: - по токсичным элементам (Pb – 0,3, по As – 0,2, по Cd – 0,03, по Hg – 0,005); - хинину (для спиртных напитков, содержащих хинин) – 300; нитрозаминам (для пива) – 0,003; - радионуклидам (Бк/л) – Cs-137 – 70, Sr-90 – 100; - метанолу (%, в пересчете на чистый спирт) – для водки – 0,05, для коньяка – 1,0. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 Лекция №14-15 Тема: Микробиологические методы анализа продуктов для питания детей раннего возраста. План: 1. Микробиологические показатели сухих, жидких и пастообразных молочных продуктов детского питания 2. Микробиологические показатели кисломолочных продуктах детского питания Микробиологические показатели сухих, жидких и пастообразных молочных продуктов детского питания зависят от целого ряда факторов: качества сырья и компонентов, соблюдения режимов тепловой обработки, качества мойки и дезинфекции оборудования, тары, соблюдения правил личной гигиены персоналом и др. Нормативы призваны способствовать улучшению качества молочных продуктов детского питания и сырья, применяемого для их изготовления, а также повышению санитарно-гигиенического уровня и совершенствованию технологических процессов производства на предприятиях, производящих указанную продукцию. Предельно допустимые количества микроорганизмов в компонентах, используемых в производстве сухих, жидких и пастообразных продуктов детского питания. При этом в продуктах и компонентах нормируются общее количество мезофильных, аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (что соответствует прежнему показателю ОМЧ), плесневые грибы, дрожжи и B. cereus в 1 г продукта и их содержание выражается количеством колониеобразующих единиц - КОЕ/г. Другие группы микроорганизмов - бактерии группы кишечных палочек, E. coli, коагулазоположительные стафилококки, патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не должны обнаруживаться в определенной, указанной в соответствующей графе, массе продукта. В ряде продуктов введенный ранее норматив: отсутствие E. coli и S. aureus в 11 г продукта заменен на отсутствие в 10 г, что существенно не отражается на микробиологической безопасности продукта, но упрощает проведение исследований. В кисломолочных продуктах детского питания нормируется также содержание ацидофильных бактерий и бифидобактерий. Среди перечисленных продуктов и компонентов особое место занимают биологически активные добавки (БАДы), которыми обогащают продукты детского питания (и даже термически обработанное донорское молоко). БАДы вносят в количестве 1 г на 100 куб. см восстановленного продукта или жидкого продукта. Производственные лаборатории осуществляют контроль сырья, компонентов и готовой продукции по всем показателям в соответствии с настоящими Санитарными правилами, за исключением анализа на сальмонеллы. В производственных лабораториях комбинатов, производящих продукты типа "Детолакт" (употребляемые без термической обработки для питания детей с первых дней жизни), каждую партию готовых продуктов контролируют по всем показателям, предусмотренным настоящими Санитарными правилами. Контроль компонентов, используемых для изготовления этих продуктов, производят периодически в соответствии с показателями табл. 7. Периодичность контроля устанавливают в соответствии с действующей "Инструкцией по микробиологическому контролю производства на молочноконсервных комбинатах детских продуктов". В производственных лабораториях комбинатов, производящих продукты типа "Малютка", "Малыш", употребляемых после термической обработки, контролируют каждую партию готового продукта и компонентов на содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек, плесневых грибов и дрожжей. Контроль на содержание коагулазоположительных стафилококков и B. cereus в сухих готовых продуктах, их компонентах, жидких и пастообразных продуктах проводят периодически, не реже одного раза в месяц. Анализ на наличие патогенных микроорганизмов, в том числе бактерий рода Salmonella, в этих видах продуктов детского питания осуществляют санитарно-эпидемиологические станции, за исключением производственных лабораторий МККДП, изолированных от производства и специально оборудованных. При обнаружении повышенного содержания мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в детских молочных продуктах следует также определять количественное содержание энтерококков в данных продуктах по методам, изложенным ниже. При этом следует иметь в виду, что повышенное содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий), эшерихий коли, коагулазоположительных стафилококков свидетельствует либо о несоблюдении температурного режима на производстве, либо о повышенной бактериальной обсемененности исходных компонентов, либо о неудовлетворительном санитарном состоянии оборудования. Более строгие требования к отсутствию сальмонелл в значительных объемах готовых продуктов и компонентов введены в связи со способностью практически всех сероваров этого рода вызывать инфекционные заболевания у детей. Запрещается выпуск в реализацию готовой продукции, в которой обнаружены патогенные микроорганизмы в массе продукта, предусмотренной настоящими Санитарными правилами. При наличии отклонений готовой продукции от указанных нормативов в сторону ухудшения осуществляют контроль компонентов на все виды микроорганизмов, а также контролируется санитарно-гигиеническое состояние оборудования, инвентаря, воздуха, воды, соблюдение правил личной гигиены и т.д. с последующим назначением санитарных дней и др. санитарногигиенических мероприятий. При несоответствии качества компонентов требованиям настоящих Санитарных правил использование их в производстве запрещается. Микробиологический контроль включает следующие этапы: контроль сырья (не реже 1 раза в декаду); контроль компонентов – каждая партия; контроль технологического процесса производства (не реже 1 раза в декаду); контроль эффективности пастеризации молока, сливок и нормализованной смеси; контроль санитарно-гигиенического состояния производства и рук работников; контроль воды и воздуха (не реже 1 раза в месяц); контроль качества тары и упаковочных материалов; контроль готовой продукции. Контроль эффективности пастеризации молока, сливок и нормализованной смеси. Контроль эффективности пастеризации осуществляется ежедневно вне зависимости от качества готового продукта.Показателем эффективности пастеризации является отсутствие в 1мл молока бактерий группы кишечных палочек (БГКП), а также к МАФАМ – общего количества бактерий в 1мл молока – не более 10000. Микробиологический контроль готового продукта. Микробиологический контроль готовых продуктов детского питания также включает определение следующих показателей: содержание КМАФАМ, дрожжей и плесневых грибов, БГКП (колиформы), E. Coli, B.cereus, S. aureus, патогенных микроорганизмов, в том числе Salmonella. В продуктах, содержащих специфическую микрофлору, контролируют ее титр. В производственных лабораториях предприятий производящих продукты без термообработки (адаптированные смеси) контролируют каждую партию продуктов по всем показателям. Контроль санитарно-гигиенического состояния производства и рук работников. Все участки оборудования, аппаратуры и молокопроводы должныконтролироваться не менее 3-х раз в месяц на БГКП. Качество мойки оборудования оценивается по КМАФАМ в смывах, не реже 2-3 раз в неделю. Чистоту рук (хлорирование) работников контролируют не реже 3-х раз в месяц. Оценка результатов контроля санитарно-гигиенического состояния производства. Один раз в декаду исследуют пробу смыва с оборудования (с 100 см2) следующих линий: линии сырого молока и не пастеризованных компонентов; линии стерилизованного молока; линии кисломолочной продукции (включая резервуары) и т.д. Контроль воды и продукты. Питьевая вода, используемая на бытовые и производственные нужды исследуется на баканализ не реже 1 раза в месяц. Согласно НД коли-индекс не должен превышать 3 в 1мл воды. В воздухе производственных помещений определяют общее количество бактерий, количество дрожжей и плесневых грибов не реже 1 раза в месяц. Контроль тары и упаковки и материалов. На предприятиях в целях контроля тары и упаковочных материалов проводят анализы на содержание КМАФАМ и БГКП Контроль за качеством и безопасностью молочных продуктов должен осуществляться на постоянной основе, обеспечивая безопасность их потребления для жизни и здоровья людей и предотвращая экономический ущерб, наносимый употреблением некачественной продукции. Литература 1. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. /Мармурзова, Л.В. – 2008 2. Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена /Жарикова, Г.Г. - 2008 3. Методическое пособие по микробиологии и вирусологии: для студентов специальности "Биотехнология" / Ж.К. Тулемисова, Г.Т. Касенова, Б. Музапбаров / - 2011 4. Микробиология /Гусев, М.В. – 2008 ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№1 Тема занятия: Введение. Понятие микробиологического контроля биотехнологических производств. Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Микробиологический контроль биотехнологических производств 2. Микробиологический контроль биотехнологических производств включает какие компоненты? 3. Как определяются показатели микробиологического контроля и критерии оценок? 4. Как определяются методы контроля и требуемые показатели? ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№2 Тема занятия: Основные принципы проведения микробиологического контроля Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Поясните принципов санитарно-микробиологических исследований 2. Общая характеристика методов саиитарио-микробиологических исследований 3. Как правильно взять проб для санитарно- микробиологических исследований? 4. Поясните проведение серийных анализов. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№3 Тема занятия: Стандартная микробиологическая лаборатория. Основные методы работы. Характеристика лабораторий по контролю пищевой продукции Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Стандартная микробиологическая лаборатория 2. Поясните важнейшей частью работы в микробиологической лаборатории 3. Процесс стрелизации 4. В качестве стерилизантов что используют? ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№4 Тема занятия: Характеристика основных групп санитарнопоказательных микроорганизмов –индикаторов загрязнения. Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Сто такое санитарно-микробиологическая оценка? 2. Основные группы микроорганизмов-индикаторов загрязнения? 3. Штаммы, обитающие у теплокровных животных, могут размножаться при каких температурах? 4. Какие микроорагнизмы вызывают опасное заболевание – газовую гангрену? ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№5 Тема занятия: Методическое обеспечение микробиологического контроля пищевой продукции Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Прямой метод санитарно-микробиологического контроля 2. С какой целью применяются прямой метод? 3. Затруднения с выявлением патогенных микроорганизмов связаны с какими причинами? 4. Косвенные методы санитарно-микробиологического контроля ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№6 Тема занятия: Методы отбора и подготовки проб пищевых продуктов для микробиологического анализа Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Ч то такое микробиологичкский анализ? 2. К акие методы определение используются для микроорганизмов? 3. Какими методами проводят отбор и подготовки проб? 4. К акими методам осуществляют определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов? ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№7-8 Тема занятия: Микробиологические методы анализа молока и молочных продуктов Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Какими методами проводят отбор и подготовки проб молочных продуктов? 2. Как проводят анализ молочных продуктов? 3. Как определяют общего микробного числа и коли-титра в молоке? 4. Пробы прикакой температуре храняться и где транспартируют? ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№9-10 Тема занятия: Микробиологические методы анализа мяса и мясных продуктов Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Методы исследование сырое мясо 2. Порядок анализа мясных продуктов 3. Как определяют общего микробного числа в мясе? 4. Какими методами проводят отбор и подготовки проб мясных продуктов? ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№11-12 Тема занятия: Микробиологические методы анализа хлебобулочных, мукомольно-крупяных изделий. Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Как отбирают проб для анализа хлебобулочных, мукомольнокрупяных изделий? 2. Обсемененность различных видов крупы микроорганизмами 3. Санитарно-микробиологические показатели безопасности муки и круп 4. Санитарно-микробиологические требования к макаронным изделиям ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№13 Тема занятия: Микробиологические методы анализа напитки и продукты брожения Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Микробиологические методы анализа безалкогольных напитков 2. Как отбирают проб для анализа напитки и продукты брожения? 3. Санитарно-микробиологические показатели безопасности различных видов пива 4. Источники инфекции при производстве вин ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ№14-15 Тема занятия: Микробиологические методы анализа продуктов для питания детей раннего возраста. Задание: 1.Оформить отчет по работе. 2.Ответить на контрольные вопросы. Контрольные вопросы: 1. Микробиологические показатели сухих, жидких и пастообразных молочных продуктов детского питания 2. Как отбирают проб для анализа продуктов для питания детей раннего возраста.? 3. Микробиологические показатели кисломолочных продуктах детского питания 4. Предельно допустимые количества микроорганизмов в компонентах, используемых в производстве сухих, жидких и пастообразных продуктов детского питания. Лабораторная работа 1. Микробиологическая лаборатория и правила работы в ней. Правила работы с микроскопом. Исследование микробов в живом состоянии Цель работы: Познакомиться с особенностями работы и правилами техники безопасности в микробиологической лаборатории. Изучить устройство микроскопа и правила работы с ним. Научиться готовить препараты "раздавленная капля" и "висячая капля". Методические указания 1. Микробиологическая лаборатория и правила работы в ней В микробиологической лаборатории студенты овладевают методами микробиологических исследований, проводят научно-исследовательскую работу. Специфика микробиологической лаборатории обусловлена особенностями культивирования и изучения микроорганизмов, так как микробиологи в большинстве случаев имеют дело с чистыми культурами, представляющими один вид бактерий. Лаборатория должна иметь средоварочное отделение для приготовления пита-тельных сред, автоклав для их стерилизации и для уничтожения отработанных культур, который должен находиться в отдельном помещении. Столы в лаборатории должны быть снабжены колод-ками с необходимыми красителями, спиртовками, микроскопами с осветителями. Обязательно наличие в лаборатории термостатов для культивирования микроорганизмов: для выращивания грибов температура в термостате должна быть 20-25ºС, для большинства сапрофитов – 25-30ºС, для возбудителей инфекционных болезней 35-37ºС, для термофилов 40-45ºС. Как правило, требуется не менее двух термостатов. Микробиологическая лаборатория должна содержаться в чистоте. В ней не должно быть посторонних предметов и биологи-ческих объектов исследований. В лаборатории нельзя находиться в верхней одежде, во избежание заражения нельзя курить и прини-мать пищу. Работать следует только в халатах, во время работы из-бегать излишнего хождения, открывания и закрывания дверей. Необходимо аккуратно работать с культурами микроорганизмов, инструменты после использования прокаливать в пламени спир-товки, все использованные материалы с микроорганизмами, мик-робные культуры следует обеззараживать и только после этого мыть посуду. Не следует выносить из лаборатории предметы и вносить посторонние вещи. Личные вещи держать только в отве-денном для этого месте, верхней одежды в лаборатории быть не должно. Работа с чистыми культурами микроорганизмов ведется в стерильных условиях, которые обеспечивает пламя спиртовки. По-этому на занятиях студенты должны соблюдать правила пожарной безопасности. На лабораторном столе студент должен иметь при себе только тетрадь для записей и зарисовок препарата, цветные карандаши, ручку. Во время выполнения работы необходимо пом-нить основные правила техники безопасности: -ками; другими предметами с проводами и контактными частями электросети; обслуживающего персонала; юдать правила работы с химическими реактивами. После окончания работы студент прибирает рабочее место и обязательно моет руки. На каждом лабораторном занятии студенты выбирают де-журного, который в начале работы получает необходимые реакти-вы и оборудование от лаборанта, а в конце занятия проверяет рабо-чие места студентов и сдает реактивы и оборудование лаборанту. 2. Устройство микроскопа и правила работы с ним Для изучения микроорганизмов, размеры которых исчисля-ются в микрометрах, пользуются микроскопом. Виды микроскопии разнообразны: световая, инверсионная, конфокальная лазерная сканирующая, электронная. Электронная микроскопия позволяет получать изображения объектов с максимальным увеличением до раз. Однако для повседневных нужд микробиологов в учебных, клинических или исследовательских лабораториях наиболее часто используется световая микроскопия, так как требует меньше затрат и времени на изготовление и просмотр препарата. Световая микроскопия подразделяется на просвечивающую (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцент-ную. Наиболее часто для учебных целей используется световая просвечивающая микроскопия. Микроскопы постоянно усовершенствуются, но основные правила работы с ними остаются неизменными. Изображение в световом микроскопе формируется вслед-ствие избирательного поглощения объектом света разной длины волны. Это сложный оптический прибор, состоящий из двух ос-новных частей: механической и оптической. Механическая часть состоит из штатива, в котором разли-чают ножку (башмак), основание, тубусодержатель и предметный столик, крепящийся к основанию штатива. Предметный столик имеет препаратоводитель, в котором с помощью зажима закрепля-ют предметное стекло. Препаратоводитель перемещается в гори-зонтальной плоскости. С использованием препаратоводителя дви-жение микропрепарата на предметном столике происходит плавно, без рывков. Для прохождения лучей света, освещающих препарат, в центре предметного столика есть отверстие. Макро- и микровин-ты изменяют расстояние между объективами и предметным столи-ком. Макровинт требуется для грубой, а микровинт – для более точной настройки изображения. Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров. Осветительный аппарат находится под предметным столиком и состоит из конденсора, и подсвет-ки. Встречаются микроскопы, которые оснащены зеркалом для настройки освещения поля зрения. Однако в современных микро-скопах подсветки светодиодные и нет необходимости улавливать зеркалом свет. Достаточно просто включить кнопку и отрегулировать яркость встроенной в микроскоп подсветки. Конденсор пред-ставляет собой систему линз, собирающих параллельные лучи и концентрирующих их в плоскости препарата. Перемещение кон-денсора в вертикальной плоскости осуществляется с помощью винта. Регулируя высоту конденсора, можно также регулировать яркость освещения объекта: поднимать конденсор при слабой освещенности поля зрения и опускать при слишком сильной. С по-мощью встроенной в конденсор ирисовой диафрагмы можно регу-лировать ширину светового потока путем сдвигания и раздвигания металлических сегментов рычажком. Важную часть микроскопа составляют объективы. Они вы-полняют основную работу: увеличивают изображение. Каждый из объективов представляет собой систему линз в металлической оправе. Собственно увеличение дает лишь передняя или фронталь-ная. Остальные линзы коррекционные. Чем больше увеличение объектива, тем более выпуклую поверхность имеет фронтальная линза, приближаясь к форме полушара. Чем больше увеличение объектива, тем ближе он находится к поверхности препарата. Однако качество микроскопа определяется не только увели-чивающей способностью. Другой важной характеристикой являет-ся разрешающая способность. Она тем лучше, чем меньше мини-мальное расстояние между двумя точками, при котором еще можно их различить. В свою очередь, это минимальное расстояние, или предел разрешения, рассчитывается по формуле: d = λ/( А об + Аконд), [1] где λ Числовая апертура является мерой количества света, попа-дающего в линзу: А = n sinα, -щимся лучом, попадающим в линзу. Судя по формулам [1] и [2], увеличить разрешающую спо-собность можно двумя способами: уменьшить длину волны света, которым освещается препарат, и увеличить апертуру. Длину волны света в обычных лабораториях, как правило, не меняют, так как для большинства микробиологических лабораторий это необосно-ванная трата денежных средств. Но во всех лабораториях разреше-ние улучшают путем увеличения апертуры. Для этого достаточно увеличить коэффициент преломления n. При работе с объективами, дающими малое увеличение, обычно разрешения хватает для того, чтобы хорошо рассмотреть микроорганизмы. В этом случае между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом находится слой воздуха. Такие объективы называют сухими. Линзы таких объективов имеют большой радиус кривизны. Работая с большими увеличениями, применяют объективы, радиус кривизны фронталь-ной линзы которых мал (чем больше увеличение объектива, тем меньше радиус кривизны фронтальной линзы). При этом ухудша-ется разрешение микроскопа, которое улучшают увеличением коэффициента преломления n. Для этого объективы погружают в каплю жидкости, показатель преломления которой отличается от показателя преломления воздуха и приближается к показателю преломления предметного стекла. Тогда световые лучи при пере-ходе из стекла в слой жидкости не преломляются и, не отражаясь, попадают в объектив. Жидкость, применяемую для увеличения разрешения, называют иммерсионной, а объективы – иммерсион-ными. Чаще всего для иммерсионных объективов используют кед-ровое масло (при увеличении объектива в 100 раз). Реже, при 40-кратном увеличении объектива, используют воду.Биологические микроскопы имеют обычно 3-4 объектива, дающие малое, среднее и большое увеличение. Максимальное уве-личение объектива у большинства современных световых микроскопов – в 100 крат. Окуляр располагается в верхней части тубуса микроскопа и представляет собой систему двух линз, Окуляры дают дополни-тельное увеличение в 5, 7, 10 и 15 раз. Наиболее четкое изображе-ние получается при сочетании сильных объективов со слабыми и средними окулярами. Общее увеличение микроскопа определяется умножением показателя увеличения объектива на показатель увеличения окуляра. Правила микроскопирования 1. Устанавливают объектив малого увеличения, максимально приблизив его к предметному столику. Если микроскоп снаб-жен зеркалом, то, наблюдая в окуляр, направляют зеркало на источник освещения, выбирая такое его положение, при кото-ром поле зрения микроскопа имеет форму равномерно и хоро-шо освещенного круга. Во многих современных микроскопах регулировать освещение не надо. 2. Отрегулировав освещение, на предметный столик помещают препарат, закрепляют в препаратоводителе, и, медленно подни-мая тубус с помощью макровинта, находят четкое изображение препарата. 3. Если объектом исследования является препарат «раздавленная капля» или «висячая капля», то объектив малого увеличения с помощью револьвера заменяют объективом среднего увеличе-ния. Осторожно вращая микровинт, находят четкое изображе-ние. 4. Если объектом является сухой мазок, то его рассматривают с помощью иммерсионного объектива. Для этого на мазок поме-щают каплю иммерсионного масла, с помощью револьвера объ-ектив с малым увеличением заменяют иммерсионным объек-тивом. Если с помощью объектива малого увеличения изобра-жение было верно найдено, то иммерсионный объектив погру-зится в каплю масла. Изображение находят, осторожно вращая макровинт. Для получения четкого изображения вращают лег-ким движением микровинт. Если при движении микровинта чувствуется сопротивление, значит, ход его пройден до конца. В этом случае винт следует повернуть на полный оборот назад, снова найти микрокартину на малом увеличении с помощью макровинта и только тогда устанавливать четкость изображе-ния на большом увеличении с помощью микровинта. Основные правила пользования микроскопом 1. Микроскоп нужно предохранять от попадания пыли и влаги, после работы ставить в футляр или шкаф, или накрывать. 2. При работе с объективами малого и среднего увеличения тубус перемещать только макрометрическим винтом. 3. При смене объективов регулировать освещение, поднимая или опуская тубус конденсора. 4. По окончании микрокопирования объектив следует отдалить от препарата с помощью макрометрического винта, убрать препа-рат, протереть окуляры и объективы замшей или фланелью. Иммерсионный объектив с показателем увеличения 90 или 100 после работы с иммерсионным маслом протереть фланелевой тряпочкой, смоченной в бензине. Ни в коем случае нельзя оставлять объектив в масле: засохшее на объективе масло в дальнейшем не дает увидеть изображение, долгий контакт с маслом портит линзы. 5. Установить малый объектив. 6. При перемещении микроскоп следует обязательно придержи-вать снизу, чтобы не испортить макровинт. Важно уметь не только микроскопировать, но и зарисовы-вать изучаемые объекты. Микробиологи, как правило, рисуют окружность, по диаметру соответствующую полю зрения препара-та, и рисуют объекты, не увеличивая и не уменьшая тех размеров, которые они наблюдают в микроскоп. При подписывании препарата наряду с названием обязательно следует ставить увеличение, при котором наблюдали данный объект. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2 ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ. СЛОЖНЫЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ Цель работы: Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и основными признаками, используемыми при их идентификации. Изучить различные сложные и дифференциальные методы окраски бактерий и их структур и разобраться в сущности этих методов и цели их использования. Освоить тех-нику окраски бактерий по Граму и спор бактерий по ШефферуФултону. Оборудование, материалы: Микроскоп; бактериологические петли; предмет-ные стекла; спиртовка; иммерсионное масло; фильтровальная бумага; набор красок для окраски по Граму (фильтровальные бумажки с генцианвиолетом, растворы Люголя и фуксина рабочего) и окраски спор по Шефферу-Фултону (растворы бриллиантовой зелени и сафранина); 96 %-ный этиловый спирт: ло-ток с рельсами для предметных стекол; промывалка; чистые культуры бакте-рий: Staphylococcus albus; Sarsina flava; Escherichia coli; Bacillus subtilis. 2.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2.1.1 Основные признаки, используемые при идентификации микроорганизмов Определение систематической принадлежности микроорганизмов – сложная задача, требующая длительных наблюдений, значительного количества специфических исследований и биохимических анализов. При идентификации микроорганизмов учитывают: - морфолого-цитологические признаки. К ним относятся строение, форма и размеры клеток, их взаимное расположение, тинкториальные свойства (осо-бенности при окрашивании различными красителями), способность к обра-зованию спор и капсул, подвижность, наличие жгутиков, образование в клетках некоторых включений, особенности размножения; физиологобиохимические признаки. При изучении физиолого-биохимических признаков устанавливают отношение микроорганизмов к различным источникам углерода и азота, потребность в кислороде, темпера-турные границы роста, солеустойчивость, чувствительность к антибиотикам, ферментативные тесты; - культуральные признаки. К таким признакам относятся особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. При идентификации бактерий рекомендуется также учитывать дополни-тельные признаки: серологические свойства, фагоустойчивость, химический состав клеточных стенок, содержание отдельных нуклеотидов в нуклеоиде (единственной хромосоме бактерий – молекуле ДНК, состоящей из двух спи-рально закрученных цепочек нуклеотидов, замкнутых в кольцо). Чем больше у различных микроорганизмов общих признаков, тем ближе они находятся друг к другу по степени родства. Основными признаками, позволяющими распределить микроорганизмы на группы, являются морфологические признаки, которые легко и достаточно быстро можно определить с помощью микроскопа. 2.1.2 Морфологические признаки бактерий Бактерии объединяют обширную группу в основном одноклеточных микроорганизмов, разнообразную по форме, размерам и обмену веществ. Они являются прокариотными микроорганизмами. При дифференциации бактерий путем микроскопии учитывают размеры и формы клеток, их взаимное расположение, химический состав и строение кле-точных стенок, способность образовывать споры и капсулы, подвижность. Основными формами бактерий, которые присутствуют в пищевом сырье, а также в продуктах растительного и животного происхождения, являются сферические бактерии (кокки) и палочковидные бактерии (палочки). К основным морфологическим признакам кокков относятся их размеры (диаметр кокков в среднем составляет 1…2 мкм) и взаимное расположение. Взаимное расположение кокков определяется направлением образования пере-городок при делении клеток. Если после деления клетки расходятся и распола-гаются поодиночке, то такие формы называются монококками или микрококка-ми. Если при делении образуются скопления, напоминающие виноградные грозди, их относят к стафилококкам. Кокки, остающиеся после деления в од-ной плоскости связанными парами, называются диплококками, а образующие разной длины цепочки – стрептококками. Сочетания из четырех кокков, появ-ляющиеся после деления клетки в двух взаимно перпендикулярных плоскостях представляют собой тетракокки. Если кокки делятся в трех взаимно перпен-дикулярных плоскостях, то они образуют скопления кубической формы - сар-цины. Как выглядят различные скопления кокков под микроскопом изображено на рис. 1. Рис. 1 Взаимные расположения кокков: а - микрококки; б - диплококки; в - стрептококки; г - тетракокки; д - стафилококки; е - сарцины Основными морфологическими признаками палочковидных бактерий, ко-торые определяются путем микроскопии, являются размеры палочек (средняя длина палочек – 2…7 мкм, диаметр в поперечнике - 0,5…1 мкм), взаимное рас-положение клеток, способность образовывать споры, подвижность. Палочковидные бактерии могут располагаться поодиночке, попарно (диплобактерии) и цепочками (стрептобактерии). При микроскопии легко можно определить спорообразующие и не спорообразующие формы палочковидных бактерий. Вегетативные клетки хорошо адсорбируют красители на своей поверхности и полностью окрашиваются. Оболочка споры малопроницаема, краски в них почти не проникают и под микроскопом споры имеют вид округлых или овальных блестящих зерен. Палочки, образующие споры называются бациллами и клостридиями. У бацилл размер споры не превышает ширину клетки и поэтому при образовании споры форма клетки не меняется. У клостридий диаметр споры больше толщины клетки и поэтому при созревании споры клетка приобретает форму веретена (если спора располагается в центре клетки) или барабанной палочки (если спора располагается на одном из полюсов клетки). На рис. 4 представлены морфологические разновидности палочковидных бактерий. Рис. 2 Морфология палочковидных бактерий: а - диплобактерии; б - стрептобактерии; в - бациллы; г - клостридии При идентификации палочек диагностическое значение имеют также расположение спор в клетках бацилл и клостридий, наличие и расположение жгутиков, способность образовывать капсулы. 2.2.3 Сложные и дифференциальные методы окраски бактерий Различают простые, сложные и дифференциальные методы окраски бакте-рий. При простой окраске используют один краситель и прокрашивают всю клетку. Сложное окрашивание предусматривает применение двух или несколь-ких красителей (например, при определении отношения бактерий к окраске по Граму). Дифференциальное окрашивание основано на индивидуальном отно-шении биологических структур клетки к различным красителям (окраска спор, оболочки, капсул, метахроматина и др.). При этом так же, как и в сложных ме-тодах, как правило, используется несколько красителей. Сложные методы окраски позволяют распределить бактерии на группы, что имеет важное диагностическое значение при их идентификации. Среди сложных методов наиболее широкое применение нашел метод окраски бактерий по Граму, позволяющий разделить бактерии в зависимости от химического состава и структуры клеточной стенки на две основные группы грамположи-тельные (грам+; Г+) и грамотрицательные (грам ; Г ). Грамположительные бактерии по этому методу окрашиваются в синефиолетовый цвет, а грамотри-цательные – в розовый. К сложным методам относится и метод окраски по Ци-лю-Нильсену, позволяющий дифференцировать бактерии на две группы по ки-слотоустойчивости. Этот метод позволяет выявить туберкулезную палочку, бактерии паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота и другие кислотоустойчивые микроорганизмы. При использовании дифференциальных (специальных) методов можно ок-расить споры, определить наличие в клетках запасных питательных веществ,выявить клеточные структуры. При окраске спор, например, можно использовать различные методы (методы Шеффера-Фултона, Пешкова, Златогорова, Меллера и др.), основанные на разрыхлении малопроницаемой для красителей оболочки спор различными способами (путем нагревания, обработки препарата кислотами, щелочами) с одновременным или дальнейшим их окрашиванием концентрированным красителем. После такой обработки препарат промывают водой (при этом клетки обесцвечиваются, а споры остаются окрашенными) и докрашивают вегетативные клетки красителем контрастного цвета. Большое значение с диагностической точки зрения имеет окрашивание капсул. Капсульные вещества слабо окрашивается и при простом методе окра-ски выступает в виде бледной каймы бесцветного или слабоокрашенного орео-ла вокруг микробной клетки. Для того чтобы лучше рассмотреть капсулы, ис-пользуют методы Михина, Муромцева, Ольта, БурриГинса и др. В этих мето-дах используют один или несколько красителей. Так, для окраски капсул по Бурри-Гинсу, суспензию слизеобразуюших бактерий смешивают на краю предметного стекла с каплей туши и с помощью другого предметного стекла распределяют тонким слоем по поверхности. Далее препарат фиксируют над пламенем горелки и окрашивают фуксином или сафранином. При микроскопии такого препарата на темном фоне отчетливо выделяются окрашенные в крас-ный цвет бактерии, окруженные бесцветными капсулами. С другими специальными методами, позволяющими определить наличие и содержание запасных веществ в клетках (определение гликогена и волютина), студенты ознакомятся при исследовании качества производственных дрожжей 2.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ На занятии студенты знакомятся с основными признаками, которые учитываются при идентификации микроорганизмов, обращают внимание на морфологические признаки кокков и палочек, диагностическое значение сложных и дифференциальных методов окраски бактерий. Осваивают технику окраски бактерий по методу Грама. Определяют, какие из представленных для исследования бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным. Готовят фиксированный мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий Bacillus subtilis и окрашивают его по Шефферу-Фултону. 2.2.1 Окраска бактерий по методу Грама Сущность метода заключается в различии химического состава и строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Клеточная стенка грам+ бактерий толстая, но однослойная, содержит мно-го пептидогликана – муреина, а также тейховые кислоты, которые образуют прочное соединение с красителями - генцианвиолетом и йодом и поэтому ос-таются окрашенными после обработки мазка спиртом. Таким образом, грам+ бактерии по методу Грама окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. У грам бактерий клеточная стенка тонкая, но двухслойная. Муреина мало, причем он содержится во внутреннем слое клеточной стенки, тейхоевые кислоты отсутствуют. Внешний слой клеточной стенки содержит, главным образом, вещества, обладающие гидрофобными свойствами – липополисахариды и липопротеиды. Эти вещества не образуют прочного комплекса с красками генцианвиолетом и йодом и поэтому клетки обесцвечиваются после обработки 96 %-ным этиловым спиртом и после дополнительной окраски красителем фуксином окрашиваются в бледно-розовый цвет. Техника окраски по Граму 1. На предметном стекле готовят фиксированный мазок исследуемой чистой культуры; 2. Мазок окрашивают красителем генцианвиолетом через полоску фильтро-вальной бумаги. Можно также использовать заранее приготовленные фильт-ровальные бумажки, смоченные 1 %-ным спиртовым раствором кристал-лвиолета и высушенные (метод Грама в модификации А.В. Синева). В этом случае бумажки помещают на фиксированный мазок и смачивают несколь-кими каплями воды. Окраску препарата проводят в течение 2…3 мин; 3. Фильтровальную бумагу снимают с мазка, краску сливают и наносят на ма-зок раствор Люголя на 2 мин; 4. Раствор Люголя сливают с мазка и обрабатывают 96 %-нам спиртом в тече-ние 30…60 сек. Затем препарат промывают водой и подсушивают фильтро-вальной бумагой; 5. Мазок окрашивают красителем фуксином 2…3 мин, второй раз промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. Затем на стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100 при максимальном освещении. 2.2.2 Окраска спор бактерий по Шефферу-Фултону Сущность метода заключается в комбинированном действии концентрированного раствора красителя бриллиантового зеленого и температуры на малопроницаемую оболочку спор с дальнейшим обесцвечиванием цитоплазмы вегетативной клетки и ее контрастным докрашиванием сафранином. Таким обра-зом, споры окрашиваются в зеленый цвет, а клетки – в красный. Техника окраски по Шефферу-Фултону 1. На краю предметного стекла (на расстоянии примерно 1,5-2,0 см от края) го-товят густой нефиксированный мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий; 2. На раствор наносят водный раствор бриллиантовой зелени, и мазок с крас-кой нагревают над пламенем горелки до появления пара. Нельзя допускать прикипания краски к мазку. Поэтому препарат периодически отстраняют от пламени. Нагревание мазка с краской проводят в течение 3 мин; 3. Краску сливают, препарат быстро промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой; 4. Окрашивают мазок раствором сафранина 2…3 мин, затем краску сливают, мазок вторично промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой. Далее на мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают под объективом на х90 или х100 при максимальном освещении. Оформление и анализ результатов исследований В отчете студенты кратко конспектируют теоретический материал и пере-писывают сущность и технику окраски бактерий по Граму и спор бактерий по Шефферу-Фултону. Зарисовывают микроскопические картины исследованных чистых культур бактерий с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписывают латинское название микроорганизма, отношение его к окраске по Граму, увеличение исследованно-го объекта. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3 Методы определения микроорганизмов в воздухе, воде Цель работы. Знакомится с методиками определения мик-роорганизмов в воздухе, воде и осуществлять посевы этих объектов на питательные среды. Готовить смывы с рук и далее проводят определение наличие кишечной палочки с использованием среды Кода. 3.1 Микробиологическое исследование воздуха седиментационным методом Определяют количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей. Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см3 мясопеп-тонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на разверну-тую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была от-крыта полностью. Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 370С, а со средой Сабуро – в течение 2-3 суток при 250С. Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроор-ганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Формула Омелянского: Х = а1005100 / ST, где а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух); S – площадь чашки Петри, см2; Т – время экспозиции, мин; 100 – пересчет площади чашки на 100 см2; 5 – время экспозиции по Омелянскому, мин; 100 – пересчет на 1 м3 воздуха. 3.2 Микробиологическое исследование воды Отбор проб Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем. 3.2.1 Определение общего микробного числа (КМАФАнМ) . Для посева отбирают по 1 см3 воды и переносят в 2 чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45…50 0 С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два. 3.2.2 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мем-бранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальнодиагностической среде и последующей идентификации выросших колоний. Для анализа точно отмеряют 100 см3 воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 370С в течение 24 часов. Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью. При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа. Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 37 0С в течение 16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: ок-сидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 370С для определения общих колиформных бактерий и при 440С при определении термотолерантных колиформных бактерий. 3.2.3 Определение содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом Метод бродильных проб (или титрационный метод) основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциальнодиагностическую среду для идентификации выросших колоний. Титрационный метод может быть использован: при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом бродильных проб; при анализе воды с большим содержанием взвешенных частиц; в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий. Первый этап исследования заключается в посеве 3-х объемов воды по 100 см3 в концентрированную лактозопептонную среду. Посевы инкубируют при температуре 370С в течение 24-48 часов для определения общих колиформных бактерий и при 440С – при определении термотолерантных колиформных бактерий в течение 24 2 часов. Если в колбах не обнаружены признаки роста (об этом судят по отсутствию газа в поплавках) то колиформные бактерии отсутствуют в 100 см3 . На втором этапе исследований из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 370 С в течение 1820 часов. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды. 3.2.4 Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий прямым посевом Из каждой пробы воды делают посев 20 см3 в железосульфитный агар. Для этого в стерильные пробирки вносят по 10 см3 в 2 пробирки объемом 30 см3 или по 5 см3 в 4 пробирки вместимостью 15 см3. Посевы заливают горячим (75…80 0С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирки быстро охлаждают, помещая их в емкость с холод-ной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 440С в течение 24 2 часов. Если после культивирования не наблюдается почернения среды в пробирках, то считают, что сульфитредуцирующие клостридии отсутствуют в 20 см3. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ДРОЖЖЕЙ Цель работы: Ознакомиться с основными морфологическими, физиологиче-скими и производственно-ценными свойствами культурных дрожжей. Изучить технически вредную микрофлору, сопутствующую производственным дрож-жам. Освоить микробиологические методы контроля качества производствен-ных дрожжей, применяемых в хлебопечении и бродильных производствах. Научиться определять концентрацию дрожжевых клеток в дрожжевой суспен-зии с помощью счетной камеры Горяева. Оборудование и материалы: Микроскоп; бактериологические петли; предмет-ные и покровные стекла; счетная камера Горяева; фильтровальная бумага; 96 % этиловый спирт; лоток с рельсами; промывалка. Красители: метиленовая синь (1:40), синька Финка (раствор метиленовой сини 1:5000), карболовый фуксин Циля, 0,5 % спиртовый раствор йода; 5% раствор H2SO4; набор красок для окраски по методу Грама (бумажки, пропитанные ген-цианвиолетом, раствор Люголя; фуксин рабочий). Водная суспензия производственных дрожжей, чистые культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis в пробирках на скошенном сусло-агаре. 4.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Характеристика дрожжей, используемых в хлебопечении и в бродильных производствах Дрожжи, используемые в хлебопечении и в бродильных производствах, относятся к семейству сахаромицетов, роду Saccharomyces. Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму (см. рис. 6а), размножают-ся в производственных условиях почкованием, а в неблагоприятных условиях – аскоспорами. Температурный оптимум для размножения дрожжей находится в пределах 25…300С. Низкие температуры дрожжи переносят хорошо, хотя размножение их приостанавливается (минимальная температура развития дрожжей 2…3 0С). При температуре 400С рост и развитие дрожжей прекращается, дрожжи отмирают. Культурные дрожжи относятся к ацидофилам, т. е. развиваются в кислой среде, оптимальное значение рН для дрожжей 4,5…5,0. Являются факультативными анаэробами. В аэробных условиях они активно растут и размножаются, а в анаэробных – осуществляют спиртовое брожение (эффект Пастера). Дрожжи чувствительны к высокой концентрации растворенных в среде веществ. При высокой концентрации сахара в среде жизнедеятельность дрожжей прекращается, так как при этом увеличивается осмотическое давление среды и наступает плазмолиз клеток. Величина предельной концентрации сахара для различных рас дрожжей неодинакова. Различают дрожжи верхового и низового брожения. Дрожжи верхового брожения в стадии интенсивного брожения распределяются на поверхности сбраживаемой среды в виде довольно толстого слоя пены и остаются в таком состоянии до окончания брожения. К таким дрожжам относятся спиртовые и хлебопекарные дрожжи. Дрожжи низового брожения, развиваясь в сбражи-ваемой жидкости, не переходят в поверхностный слой – пену, быстро оседают по окончании брожения, образуя плотный слой на дне бродильной емкости. К дрожжам низового брожения относятся пивные дрожжи. Такие различия при сбраживании жидких сред дрожжами верхового брожения и дрожжами низово-го брожения обусловлены тем, что дрожжи верхового брожения принадлежат к пылевидным дрожжам, не склеивающимися друг с другом, а дрожжи низового брожения относятся к хлопьевидным дрожжам, так как имеют клейкие оболоч-ки, что приводит к агглютинации и быстрому осаждению клеток. Кроме общих свойств, дрожжи, используемые в том или ином производст-ве, обладают специфическими свойствами. Более того, в одном и том же произ-водстве применяют разновидности, различающиеся по одной или нескольким технологическим особенностям. Разновидности дрожжей одного вида называ-ют расами. Каждое производство располагает несколькими расами дрожжей. Основными технологическими особенностями различных рас являются вели-чина клеток, способность сбраживать и утилизировать различные сахара. Дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве Роль дрожжей в хлебопекарном производстве заключается в разрыхлении теста. Дрожжи сбраживают сахара муки и мальтозу, образующуюся из крахмала с выделением спирта и углекислого газа. При этом образуются побочные продукты (уксусный альдегид, бутиловый, изобутиловый, изоамиловый спир-ты, органические кислоты, ароматические вещества – диацетил и ацетоин, эфи-ры и др.), которые создают вкус и аромат хлеба. При производстве пшеничного хлеба применяют дрожжи Saccharomyces cerevisiae, а при производстве ржаного хлеба _ дрожжи двух видов Saccharo-myces cerevisiae и Saccharomyces minor, причем преобладают дрожжи второго вида. Дрожжи Saccharomyces minor отличаются более высокой кислотоустой-чивостью, чем дрожжи первого вида, менее требовательны к источникам вита-минного и азотного питания, более спиртоустойчивы. Требования, предъявляемые к хлебопекарным дрожжам: Должны быть устойчивы к высоким концентрациям соли (до 3 – 4 %) и са-хара в тесте; Должны хорошо размножаться при оптимальных значениях рН 4,5…5,0 и температуре 26…28 0С; Должны обладать высокой бродильной энергией (мальтазной и зимазной ак-тивностью). Мальтазная активность – это время (в мин), необходимое для выделения 10 см3 СО2 при сбраживании 10…20 см3 мальтозы при 300С дрожжами, взятыми в количестве 2,5 % к объему среды. Мальтазная активность характеризует способность дрожжей гидролизовать мальтозу муки и зависит от активности содержащегося в дрожжах фермента мальтазы. Маль-тазная активность дрожжей хорошего качества должна быть не более 100 мин. Зимазная активность - это время (в мин), необходимое для выделения 10 см3 СО2 при сбраживании 10…20 см3 глюкозы при 30 0С дрожжами, взя-тыми в количестве 2,5 % к объему среды. Зимазная активность дрожжей хо-рошего качества должна быть не более 60 мин. О бродильной активности хлебопекарных дрожжей можно также судить по их подъемной силе – пе-риоду времени (в мин), в течение которого тесто, замешанное на испытуе-мых дрожжах, поднимается до определенного уровня в формочке. Все эти показатели относятся к технологическим показателям качества хлебопе-карных дрожжей; Должны быть стойкими к инфицированию при хранении в прессованном виде и в высушенном состоянии. Дрожжи, используемые в бродильных производствах Пивные дрожжи относятся к двум видам: Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются дрожжами верхового брожения и в пивоварении используются редко, в основном для темных и специальных сортов пива. Эти дрожжи в производственных условиях сбраживают сусло при 12…15 0С. Дрожжи Saccharomyces carlsbergensis относятся к дрожжам низового брожения и в производстве осуществляют главное брожение при 5…100С. Они нашли широкое применение в пивоваренном производстве и используются для приготовления стандартного и сортового пива. Требования, предъявляемые к пивным дрожжам: Должны обладать высокой бродильной активностью. Бродильная активность определяется степенью сбраживания сусла, т.е. отношением массы сбро-женного экстракта к массе сухих веществ (СВ) в начальном сусле; Должны обладать флокуляционной способностью, т.е. способностью мед-ленно и полно оседать на дно бродильных аппаратов в конце главного бро-жения; Должны иметь умеренную способность к размножению. Очень активное размножение дрожжей нежелательно, т.к. при этом расходуются экстрак-тивные вещества сусла и образуется большое количество побочных продук-тов. В среднем в процессе брожения биомасса дрожжей увеличивается в 3…4 раза; Должны быть стойкими к неблагоприятным условиям и инфицированию; Должны обладать стойкостью морфологических и физиологических свойств; Должны придавать пиву характерный вкус и аромат. Спиртовые дрожжи. В спиртовом производстве применяют дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae. Основными требованиями, предъявляемыми к расам дрожжей при производстве спирта являются: Высокая бродильная активность. Спиртовые дрожжи должны образовывать максимум спирта; Способность сбраживать как моносахара, так и дисахариды и некоторые декстрины;Способность сбраживать растворы, содержащие довольно большие концен-трации сахара; Высокая кислотоустойчивость; Способность осуществлять спиртовое брожение при высоком содержании спирта в растворе. 4.1.2 Микрофлора производственных дрожжей Культурные дрожжи должны быть стойкими к инфицированию. Тем не менее, посторонние микроорганизмы попадают в засевные производственные дрожжи при неправильном ведении технологического процесса, при недостаточно тщательной мойке и дезинфекции оборудования и коммуникаций, несоблюдении санитарного режима в отделении чистых культур и т.д. Чаще всего производственным дрожжам сопутствуют молочнокислые, уксуснокислые бактерии и дикие дрожжи, которые, так же как и культурные дрожжи, используют сахара питательной среды в качестве основного источника питания, что снижает выход спирта. Эти микроорганизмы образуют органиче-ские кислоты и другие продукты, которые могут отрицательно влиять на орга-нолептические показатели готовой продукции (хлеба, пива) и бродильную ак-тивность культурных дрожжей. Хлебопекарные дрожжи, инфицированные по-сторонними микроорганизмами, имеют низкую ферментативную активность и стойкость. Молочнокислые бактерии чаще других микроорганизмов встречаются в производственных дрожжах. Они принадлежат к трем родам: Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Стрептококки и лейконостоки имеют шаровидную форму клеток. Стрептококки располагаются друг относительно друга попарно, короткими и длинными цепочками, а лейконостоки в основном попарно. Отличием этих двух родов друг от друга является то, что лейконостоки в отличие от стрептококков образуют слизистые капсулы. Лактобациллы являются палочковидными бактериями, которые в зависимости от вида могут располагаться поодиночке или короткими цепочками. Общими признаками этих бактерий являются грамположительная окраска, отсутствие спорообразования, каталазу они не образуют, не восстанавливают нитраты в нитриты, являются факультативными анаэробами. Молочнокислые стрептококки хорошо развиваются в средах, содержащих 3…6 % спирта, а палочковидные формы молочнокислых бактерий не теряют своей активности даже при 10…12 % спирта. Уксуснокислые бактерии относятся к двум родам Acetobacter и Gluconobacter. В производстве пива чаще всего встречаются бактерии вида A. аceti. Для этих бактерий характерна чрезвычайная изменчивость формы клеток – от эллиптических до палочковидных, прямых или слегка изогнутых. Грамотрицательные, спор не образуют, некоторые виды имеют слизистую капсулу. При росте в жидкой среде образуют пленки беловатого или сероватого цвета. Реак-ция на каталазу положительная. Аэробы. Оптимальное значение рН 5,4-6,3, но могут расти и при рН 4,0-4,5. Эти бактерии устойчивы к антисептическим ве-ществам хмеля, высокой кислотности, толерантны к спирту. Некоторые виды выделяют соединения, токсичные для дрожжей. В пивоваренном производстве в засевных производственных дрожжах очень часто встречаются пивные сарцины (род Pediococcus). Сферические клетки (кокки) в парах, чаще в тетрадах или пакетах. Бесспоровые, грамположительны. Факультативные анаэробы. Каталазоотрицательные. Мезофилы. Оптимальное значение рН 4,5-5,0. Могут развиваться при содержании спирта до 8%. Лучше всего растут в присутствии дрожжей. Пивные сарцины вызывают сильное помутнение пива, сначала опалисцирующее, а затем с появлением мелкозернистого осадка. Иногда происходит увеличение вязкости пива и даже его ослизнение. Вследствие образования диацетила эти бактерии придают пиву характерный прогорклый маслянистый вкус и медовый аромат. Диацетил также отрицательно влияет на рост и размножение производственных дрожжей, ускоряет их оседание и отмирание. Развитие педиококков стимулирует образование продуктов распада белков, а также тиамина и рибофлавина, синтезируемых дрожжами. Дикие дрожжи инфицирующие производственные дрожжи принято подразделять на две группы: Дикие дрожжи, принадлежащие к роду Saccharomyces; Дикие дрожжи, не принадлежащие к роду Saccharomyces. При попадании в сусло на стадии брожения дикие дрожжи не могут интен-сивно развиваться, так как их рост подавляется культурными дрожжами, коли-чество которых по сравнению с содержанием инфицирующих пиво диких дрожжей значительно больше. Дикие дрожжи, принадлежащие к роду Saccharomyces В чаще всего встречаются следующие разновидности диких дрожжей-сахаромицетов: S. diastaticus, S. pastorianum, S. bayanus, S. ellipsoideus. В на-стоящее время все эти дрожжи принято относить к одному виду Saccharomyces cerevisiae, так как с точки зрения систематики различия в их признаках не яв-ляются существенными для разграничения видов. Клетки этих дрожжей имеют овальную или эллиптическую форму. Размножаются в основном почкованием, но могут и спорообразованием. Факультативные анаэробы. Активно сбражива-ют сахара. Оптимальная температура развития 27-35 0С, рН – от 3,5 до 5,0. Дикие дрожжи, не относящиеся к роду Saccharomyces Из производственных дрожжей выделены следующие дрожжи этой группы: дрожжи родов Candida, Torulopsis, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Rhodotorula и др. Дрожжи рода Candida имеют круглые, овальные или яйцевидные, а иногда удлиненные или неправильные формы клеток. Морфология клеток непостоянна и существенно меняется в зависимости от условий культивирования и пита-тельной среды. Спор не образуют. На жидких средах развиваются преимущественно на поверхности в виде белой или сероватой пленки. Некоторые виды яв-ляются факультативными анаэробами, а другие – аэробами. Размножению большинства видов способствует присутствие в среде кислорода. Некоторые дрожжи этого вида продуцируют специфический белок, губительно воздейст-вующий на культурные дрожжи (дрожжи-убийцы). Дрожжи родов Pichia и Hansenula имеют клетки различной формы – от круглых и овальных до сильно вытянутых, иногда изогнутых. Многие виды образуют псевдомицелий. Образуют споры. Большинство видов – аэробы, некоторые виды относятся к факультативным анаэробам. Размножению способствует присутствие кислорода. Дрожжи рода Rhodotorula обычно круглой, овальной, яйцевидной или удлиненной формы Спор не образуют. Дрожжи рода Torulopsis (пивная торула) имеют круглую или овальную форму. Спор не образуют, плохо сбраживают сахара. Основным источником попадания этих микроорганизмов в производство является воздух. Дрожжи рода Brettanomyces имеют клетки эллиптические, а также цилинд-рические, удлиненно-продолговатые, нередко стрелозаостренные с одного кон-ца. Образуют псевдомицелий. Спор не образуют. Являются факультативными анаэробами. Плохо сбраживают сахара. На жидких средах образуют хлопье-видный или вязкий осадок, могут образовывать тонкую пленку. Многие виды устойчивы к высоким концентрациям спирта. Помимо вышеперечисленных групп микроорганизмов, инфицирующих производственные дрожжи, в них могут присутствовать гнилостные бактерии. Это спорообразующие грамположительные бациллы и клостридии и грамотрицательные не образующие спор палочковидные бактерии. Гнилостные бактерии вызывают распад белковых веществ. В аэробных условиях они осуществляют полную минерализацию белка, вплоть до диоксида углерода, ам-миака, сероводорода, воды и минеральных солей. В анаэробных условиях гни-лостные бактерии образуют различные органические дурнопахнущие и ядови-тые вещества. Особую опасность представляют маслянокислые бактерии (Clo-stridium butyricum, Clostridium pasterianum, Clostridium saccharobutyricum и др.) и нитритобразующие бактерии (например, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus). Маслянокислые бактерии образуют масляную кислоту, а нитритобразующие бактерии превращают нитраты в нитриты. Эти соединения даже в очень малых концентрациях (0,0005 %) подавляют развитие культурных дрожжей. Биологическая чистота является одним из самых важных показателей качества производственных дрожжей. Особое значение этот показатель имеет в пивоваренном производстве. Это связано с тем, что в пивоварении засевные производственные дрожжи используются в нескольких производственных цик-лах (до 10..12 генераций) и поэтому являются основным источником попада-ния в производство микроорганизмоввредителей, вызывающих прокисание, помутнение, образование осадка в пиве и придающих продукту неприятные вкус и аромат. Биологическая чистота пивных дрожжей считается удовлетворительной, если в них содержится не более 1 % бактерий и не более 0,5 % диких дрожжей. 4.1.3 Микробиологический контроль качества производственных дрожжей В пивоваренном производстве при контроле засевных дрожжей основным методом исследования является их микроскопирование. При микроскопировании дрожжевой суспензии определяют морфологическое состояние дрожжей, способность дрожжей к размножению, процентное содержание мертвых клеток, наличие посторонних микроорганизмов, содержание в дрожжах запасных питательных веществ (гликогена и волютина). В дрожжах хорошего качества морфологическое состояние должно быть удовлетворительным. Процентное содержание почкующихся клеток - высокое (40…70%), дрожжей, содержащих гликоген должно быть не менее 70…75%; биологическая чистота - удовлетворительная (не более 1% бактерий и 0,5% диких дрожжей), количество мертвых клеток – не более 5% . В дрожжах чистой культуры должны отсутст-вовать посторонние микроорганизмы и мертвые дрожжевые клетки. В засевных производственных дрожжах целесообразно также определять концентрацию дрожжевых клеток. Это исследование проводят с использованием счетной камеры Горяева. Определение биологической чистоты дрожжей ведут также путем высева разведение из дрожжевой суспензии плотные питательные среды. Количество инфицирующих бактерий в засевных дрожжах определяется с использованием сусло-агара или дрожжевого агара с 1% глюкозы с мелом и антибиотиками (нистатином или актидионом). Для обнаружения диких дрожжей рода Saccha-romyces исследуемые пробы прогревают при 500 С в течение 20 мин, а затем высевают на агар с ацетатом. В качестве элективных сред для этих дрожжей можно также использовать агар с кристаллвиолетом, сусло с 2% винной кисло-ты или 10% раствор глюкозы с 4% винной кислоты. Дрожжи, не относящиеся в роду Saccharomyces, определяют на синтетической среде с лизином. Рецептуры этих сред приведены в приложении 2. В производстве спирта засевные производственные дрожжи регулярно просматривают под микроскопом, что дает возможность следить за их размножением, морфологическим и физиологическим состоянием, а также степенью загрязнения посторонними микроорганизмами. В засевных дрожжах количество почкующихся клеток должно быть не более 3%. Так как производственные дрожжи готовятся в не стерильных условиях, в них может присутствовать некоторое количество бактерий. О инфицировании засевных дрожжей кислотообразующими бактериями (молочнокислыми, уксуснокислыми) свидетельствует повышение титруемой кислотности более чем на 0,05 град. В сильно инфици-рованных дрожжах могут быть подвижные спорообразующие бактерии, распо-знавание которых осуществляют путем окраски раствором йода (маслянокис-лые бактерии при этом окрашиваются в серо-голубой цвет). Обращают также внимание на наличие диких дрожжей, количество мертвых клеток (не более 5%). Учитывают также упитанность дрожжей по гликогену - в нормальных дрожжах гликоген занимает от 1/3 до 2/3 объема клетки. Если гликогена мень-ше 1/4 объема клетки, его содержание считается недостаточным. Путем микроскопирования определяют также процентное содержание мертвых и почкующихся клеток и концентрацию дрожжевых клеток в бражке. Значения этих показателей в процессе брожения меняется. Так, в первые часы брожения концентрация дрожжевых клеток в бражке составляет 100 – 150 млн./см3, почкующихся клеток – 10…12%, мертвых – до 3…4%. В дальнейшем концентрация дрожжевых клеток и процентное содержание мертвых клеток увеличивается, а относительное содержание почкующихся клеток уменьшается. Для установления степень инфицирования бражки посторонними микроорганизмами ее исследуют под микроскопом не реже 3 раз в сутки (из каждого бродильного аппарата). В первые часы брожения посторонние микроорганизмы должны отсутствовать, в период главного брожения допускается наличие единичных клеток, а при дображивании – 3…5 клеток посторонних микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Микробиологический контроль хлебопекарных прессованных дрожжей включает: Микроскопирование. При микроскопировании оценивают качество прессо-ванных дрожжей – по величине, по однородности клеток и по наличию посто-ронних микроорганизмов (бактерий, диких дрожжей), процентному содержа-нию мертвых клеток. Определение процентного содержания сахаромицетов и посторонних микроорганизмов с использованием плотных питательных сред проводят в случае резкого ухудшения подъемной силы и при снижении стойкости прессованных дрожжей. Упрощенный метод – посев на сусло-агар с мелом (подсчитывают общее количество выросших на среде колоний и отдельно - колонии кислотообразующих бактерий, вокруг которых имеются зоны растворения мела). Усложненный метод – посев на несколько элективных питательных сред для выявления количества клеток посторонних микроорганизмов и распределения их по группам. В качестве элективных сред используют сусло-агар (8 % СВ) – для определения общего количества дрожжей и грибов; сусло-агар (12 % СВ) с мелом и нистатином (для определения молочнокислых бактерий); среда 10 на дрожжевой воде (для определения слизеобразующих бактерий – лейконостоков); молочный агар с нистатином (для определения гнилостных бактерий); дрожжевой агар с 4 % сахарозы и нистатином (для определения общего количества бактерий); синтетическая среда с лизином (для определения несовершенных дрожжей) и др. Состав этих сред и особенности их приготовления приведены в приложении 2. Общее количество дрожжей принимают за 100 % и определяют процентное содержание посторонних видов дрожжей, грибов и бактерий. В доброкачественных прессованных дрожжах допускается присутствие кислотообразующих бактерий не более 15…35 %, гнилостных дрожжей быть не должно, посторонних (диких) дрожжей – не более 30 %. 4.2 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ На занятии студенты знакомятся с морфологическими, физиологическими и призводственно-ценными свойствами культурных дрожжей и изучают свойства посторонних микроорганизмов, инфицирующих производственные дрожжи. Знакомятся с методами оценки качества производственных дрожжей. Путем микроскопирования определяют основные показатели качества дрожжей. Определяют концентрацию дрожжевых клеток методом прямого счета с использованием счетной камеры Горяева. 4.2.1 Определение биологической чистоты дрожжей Готовят фиксированных мазок из густой дрожжевой суспензии. Окрашивают его по Гаму (разд.3.2.1) или простым методом (разд. 2.2.3). Далее препарат микроскопируют в иммерсионной системе с использованием объектива х90. Рассматривают препарат в 10 полях зрения. При микроскопировании обращают внимание на наличие посторонних бактерий и диких дрожжей (морфологические свойства бактерий и диких дрожжей, инфицирующих производственные дрожжи описаны в разд. 8.1.2). Определение биологической чистоты можно также вести путем приготовления препарата «раздавленная капля» с использованием фазово-контрастного микроскопа. В этом случае на предметное стекло наносят каплю дрожжевой суспензии и добавляют каплю 10% раствора КОН или 50% уксусной кислоты для растворения белков и жировых частиц, что облегчает просмотр препарата. Далее накрывают препарат покровным стеклом и микроскопируют с объективом х40 и рассматривают в 20 полях зрения В поле зрения должно быть около 50 клеток дрожжей. 4.2.2 Определение морфологического состояния дрожжей Ведут путем микроскопирования препарата «раздавленная капля» в затем-ненном поле зрения микроскопа с объективом х40. Для этого на предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и накрывают ее по-кровным стеклом. Излишки воды удаляют фильтровальной бумагой. При микроскопировании обращают внимание на форму, размеры клеток, толщину оболочек, структуру цитоплазмы, наличие почкующихся клеток. Дрожжи должны иметь форму и размеры, соответствующие применяемой расе. Клетки должны быть равномерной величины, с тонкой оболочкой, одно-родной или мелкозернистой цитоплазмой, небольшими вакуолями. Количество почкующихся клеток в засевных дрожжах, используемых в пивоварении долж-но составлять 40…70%. Наличие большого количества морфологически изме-ненных клеток свидетельствует о дегенерации культуры, поэтому такие дрож-жи использовать в производстве не рекомендуется. Зернистая цитоплазма, крупные вакуоли и отсутствие почкующихся клеток характеризует старую культуру. 4.2.3 Определение процентного содержания мертвых клеток На предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и каплю раствора синьки Финка (раствор метиленового синего концентрацией 1:5000). Через 2 мин препарат накрывают покровным стеклом, излишки воды убирают с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопирование ведут в 5 полях зрения. При этом подсчитывают количество всех дрожжевых клеток, а также отдельно считают количества мертвых (окрашенных в синий цвет) кле-ток. Далее рассчитывают процентное содержание мертвых клеток. Определение мертвых клеток в дрожжевой суспензии можно проводить и с помощью водного раствора красителя нейтрального красного в концентрации 1:10000. При этом мертвые клетки окрашиваются в красный цвет, а в живых клетках окрашиваются только включения цитоплазмы. При окрашивании дрожжевой суспензии раствором нейтрального красного микроскопирование ведут через 15 мин после окраски. 4.2.4 Определение запасных веществ (гликогена, волютина) в клетках дрожжей Основными запасными веществами дрожжевой клетки являются гликоген и волютин (зерна метахроматина). Гликоген – запасной полисахарид дрожжевой клетки. По содержанию гли-когена судят об упитанности дрожжей. Если гликогена в дрожжах мало, то это свидетельствует о том, что они длительное время находились без питательного субстрата и имеют поэтому низкую бродильную активность. Волютин – запасной полифосфат в соединении с простыми белками и рибонуклеиновой кислотой. В состоянии активного обмена волютин в клетках дрожжей располагается мелкими каплями по стенкам вакуолей или непосредст-венно под клеточной стенкой. В больших количествах волютин накапливается перед почкованием. Накопление волютина особенно интенсивно происходит при выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами. 4 2.4.1 Определение гликогена Для определения гликогена на предметное стекло наносят каплю разбав-ленной дрожжевой суспензии и каплю 0,5% раствора йода. Через 2…3 мин цитоплазма клеток окрашивается в светло-желтый цвет, а гранулы гликогена – в красно-бурый. Препарат накрывают покровным стеклом и удаляют излишек жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с объективом х40. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5 САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСЛОВИЙ ПРОИЗВОДСТВА Цель работы: Ознакомиться с организацией санитарно-гигиенического кон-троля на предприятиях пищевой промышленности. Освоить микробиологиче-ские методы, позволяющие оценить санитарное состояние воды, воздуха про-изводственных помещений, оборудования, тары, упаковочных и вспомогатель-ных материалов, рук и спецодежды работников. Оборудование, материалы: термостаты, микроскопы, спиртовки, плитки, про-бирки с тампонами для приготовления смывов, пробирки со средой Кесслера, средой Кода, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 см3, стериль-ные колбы на 500 см3, питательные среды: мясопептонный агар, суслоагар или среда Сабуро, бактериологические петли, предметные стекла, набор красок по Граму, фильтровальная бумага. 5.1.КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 5.1.1Организация санитарно-гигиенического контроля на предприятиях пищевой промышленности Санитарно-гигиенический контроль условий производства на предприяти-ях пищевой промышленности осуществляется общегосударственной и ведом-ственными службами. Государственный санитарный надзор осуществляется санитарнозпидемиологической службой (СЭС) в форме предупредительного (при проектировании и строительстве) и текущего надзора за выполнением установленных для предприятий молочной промышленности санитарно-гигиенических требований. Текущий контроль может быть плановый и внеплановый. Органы и учреждения государственного санитарного надзора наделены широкими полномочиями. Распоряжения и указания представителей санитар-ной службы являются обязательными для администрации предприятия. Их не-выполнение несет за собой административную ответственность руководителей предприятий, цехов и отделов, отдельных работников. Принудительные административные меры применяются и при выявлении нарушений, представляющих непосредственную угрозу для здоровья людей. В таких случаях может быть установлен запрет на дальнейшую эксплуатацию предприятия (например, запрет на выпуск продукции). При особо серьезных нарушениях, повлекших или могущих повлечь за со-бой возникновение пищевых заболеваний или другие вредные последствия, ор-ганы санитарного надзора могут привлекать виновных к уголовной ответственности. Внутриведомственный санитарный контроль осуществляют ведомственная санитарная служба и заводская лаборатория. Они контролируют выполнение требований СанПиНа для предприятий пищевой промышленности, регулярно следят за санитарным состоянием производства, за профилактическими обследованиями работников цехов и соблюдением ими правил личной гигиены. Результаты проведения санитарно-гигиенического контроля фиксируются в специальном журнале. При отборе проб для микробиологических исследований представителями санитарно-эпидемиологической службы, микробиологи предприятия также проводят отбор проб и их исследование. В случаях систематических расхожде-ний результатов, получаемых службой СЭС и ведомственными лабораториями, проводят по согласованию совместные исследования для уточнения методов анализа и интерпретации их результатов. 5.1.2 Оценка помещений санитарного состояния воздуха производственных Воздух производственных помещений может стать источником микробно-го загрязнения молочных продуктов. Санитарно-гигиеническая оценка воздуха производственных помещений проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальнойобсемененности (КМАФАнМ) и содержанию санитарнопоказательных микро-организмов – гемолитических стрептококков и стафилококков. Воздух произ-водственных помещений считается чистым, если КМАФАнМ не превышает 1500 КОЕ/м3, а гемолитических стрептококков и стафилококков не более 16 в 1 м3 . В качестве питательных сред используют мясопептонный агар (для опреде-ления КМАФАнМ) и кровяной агар (для определения гемолитических стрепто-кокков и стафилококков). Для определения микроорганизмов в воздухе используют седиментационный и аспирационный методы. Седиментационный метод основан на самопроизвольном оседании пылинок и капель вместе с микроорганизмами на поверхность плотной питательной среды в открытых чашках Петри. Аспирационный метод заключается в принудительном оседании микроор-ганизмов из воздуха на поверхности плотных питательных сред. Осуществляет-ся аспирационный метод с помощью специальных приборов (например, прибо-ра Кротова), снабженных вентиляторами, которые засасывают воздух в прибор через клиновидную щель. В приборе воздух ударяется о поверхность плотной питательной среды в открытой чашке Петри. Помимо нормируемых микробиологических показателей в воздухе производственных цехов и холодильниках на предприятиях пищевой промышленности определяют наличие спор микроскопических грибов и дрожжей, произвольно оседающих на поверхности сусло-агара или среды Сабуро за 5 минут. Посевы культивируют при комнатной температуре в течение 5-и суток. Сани-тарно-гигиеническая оценка проводится по 3-х бальной шкале. Состояние воз-духа отличное, если в посевах споры грибов и дрожжей не обнаружены; хоро-шее, если на поверхности среды оседает до 2 спор грибов, а споры дрожжей не выявлены; удовлетворительное, если в чашках Петри после культивирования вырастает не более 5-и колоний грибов и 2-х колоний дрожжей. Для снижения бактериальной обсемененности воздуха на предприятиях молочной промышленности проводят проветривание и влажную уборку помещений. Снизить содержание микроорганизмов в воздухе можно также путем его фильтрации через воздушные фильтры, применяя физические и химические методы обеззараживания воздуха: обработку ультрафиолетовыми лучами, хлорсодержащими препаратами в виде испарений и аэрозолей. Эффективным способом является озонирование воздуха. 5.1.3 Оценка санитарного состояния воды Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям СанПиНа 2.1.4.1074-01 на питьевую воду. Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число – не более 50 КОЕ/см3; термотолерантные колиформные бактерии – не допускаются в 100 см3; общие колиформные бактерии также должны от-сутствовать в 100 см3; споры сульфитредуцирующих клостридий не допуска-ются в 20 см3; колифаги – в 100 см3. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде. Общее микробное число воды (ОМЧ) – количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов, способных образовывать коло-нии на питательном агаре при 370 С в течение 24 часов. К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 370С в течение 24 часов. Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые, кроме этого способны ферментиро-вать лактозу до кислоты и газа при температуре 440С в течение 24 часов. Сульфитредуцирующие клостридии (преимущественно Clostridium perfrin-gens) – спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре в течение 24 часов при температу-ре 44 0С. Колифаги – бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18 2 часа при температуре 3 0С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги – индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов. Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами. 5.1.4 Контроль оборудования, трубопроводов, посуды, инвентаря, вспомо-гательных и упаковочных материалов, рук работников Контроль аппаратов и оборудования. Контроль проводят непосредственно после мойки, дезинфекции и пропаривания перед началом работы. Для проведения исследования готовят ватные или марлевые тампоны, которые закрепляют на деревянном или металлическом стержне и помещают в пробирки с 10 см3 воды. Пробирки с тампонами стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 20-30 минут. Смывы с крупного оборудования и аппаратов берут с помощью нержавеющих металлических трафаретов с вырезанной серединой (площадь выреза 10, 25 или 100 см 3). Перед взятием пробы трафарет смачивают спиртом, обжигают и накладывают на исследуемую поверхность. Ограниченную поверхность промывают смоченным тампоном, затем тампон погружают в пробирку с водой и содержимое хорошо перемешивают. В смыв-ной воде определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишеч-ной палочки (путем посева на МПА и среду Кесслера). В смывах с хорошо вы-мытого оборудования общее количество микроорганизмов в смывной воде не должно превышать их содержания в чистой воде, поступающей на мойку. Ки-шечные палочки должны в смыве отсутствовать. Количество слизеобразующих бактерий не должно быть более 0-5 в 1 мл смыва. Наличие кишечной палочки можно определить, используя среду Кода. В этом случае тампоном, смоченным в среде Кода, промывают исследуемую поверхность. Далее тампон погружают в среду, а пробирку помещают в термостат с температурой 420С на 18-24 часа. О наличии кишечной палочки судят по изменению цвета среды с зеленого до желтого. Контроль трубопроводов, рукавов, шлангов Внутренняя поверхность трубопроводов, рукавов, шлангов недоступна для взятия проб с помощью тампонов. В этом случае общую бактериальную обсе-мененность и коли-индекс определяют в последней промывной воде. Эти пока-затели не должны отличаться от показателей воды, применяемой в производстве. Качество мойки трубопроводов можно также оценить путем отбора 10 мл смывной воды в стерильную посуду с последующим центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 10 минут и микроскопированием осадка в 10 полях зрения. При этом должно обнаруживаться не более 5-6 клеток микроорганиз-мов. Контроль посуды и инвентаря Для анализа санитарного состояния стеклянных бутылок и банок смыв делают путем обмывания внутренней поверхности последовательно 10 единиц посуды 20 см3 воды. Санитарное состояние бочек, бидонов, цистерн проверяют путем посева последней смывной воды. Смыв с мелкого инвентаря (мешалки, пробники, термометры и др.) готовят путем смачивания всей поверхности стерильным тампоном, а при анализе санитарного состояния стеллажей, лотков, ведер, лопат пользуются трафаретом. В смывах определяют общую бактери-альную обсемененность и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка должна отсутствовать в смывах. Контроль вспомогательных и упаковочных материалов Пергамент, фольгу, пленку, комбинированные материалы для упаковки молока и молочных продуктов разворачивают и с внутренней стороны берут смыв стерильным ватным тампоном (со 100 см3 поверхности). Определяют на-личие микроскопических грибов и наличие кишечной палочки. Кишечная па-лочка в смывах должна отсутствовать, а содержание плесеней не должно пре-вышать 5 в 1 см3 смыва. Поваренную соль контролируют на общую бактериальную обсемененность. Для разведения берут 5 г соли и растворяют ее в 95 см3 воды. Содержание микроорганизмов в соли не должно превышать 100 КОЕ/г. Сахар исследуют на наличие дрожжей и плесеней, растворяя 10 г сахара в 90 см3 воды. Дрожжи и микроскопические грибы должны отсутствовать. Контроль чистоты рук и спецодежды работников Анализ чистоты рук работников производят (без предварительного предупреждения) пред началом производственного процесса только у рабочих, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией. Перед анализом тампон смачивают стерильной водой или физиологиче-ским раствором и обтирают им обе руки и пальцы каждого работника. Тампон ополаскивают в воде, в которой проводилось его смачивание, хорошо взбалты-вают, отбирают 1 мл и подготавливают разведения (1:10 и 1:100). Для опреде-ления общего количества микроорганизмов в 1 мл смыва производят посев раз-ведений на МПА в стерильные чашки Петри и далее проводят термостатирова-ние при 370С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в 5 см3 среды Кесслера или Кода, а затем проводят культивирование при темпе-ратуре 42430С в течение 18-24 часов. Наличие в смыве кишечной палочки не-допустимо. Можно применить и такой метод: в сложенные ладонями вместе кисти рук наливают 100 мл стерильной воды так, чтобы вода хорошо промыла пальцы. Стерильным тампоном протирают ладони и ногти. Воду собирают в стериль-ную склянку и туда же бросают тампон. Смывную воду перемешивают и про-изводят аналогичные высевы. Чистоту рук оценивают по количеству микроор-ганизмов в 1 мл смыва при отсутствии кишечных палочек: Количество микроорганизмов в 1 мл смыва с рук Оценка чистоты До 1000 Отлично 1000-5000 Хорошо 5000-10000 Удовлетворительно Свыше 10000 Плохо Периодически проводят контроль обработки рук хлорной известью, для че-го отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрах-мальным раствором (смесь растворов - 6% раствора йодистого калия и 4% рас-твора растворимого крахмала в равных соотношениях). Если тампон и поверх-ности рук в местах соприкосновения с тампоном окрашиваются в синебурый цвет, то это свидетельствует о присутствии ионов хлора. Чистоту рук можно проверить также с помощью индикаторных бумажек для определения бактерий группы кишечной палочки. Для этого индикаторную бумажку смачивают в стерильной воде и накладывают на руку. Затем бумажку помещают в пакет, запаивают и термостатируют в течение 12 часов при 370С. Появление розовых пятен свидетельствует о присутствии БГКП. Халаты, куртки, передники, перчатки из ткани периодически исследуют на присутствие кишечных палочек посевом 1 см3 смывной воды в среду Кесслера. Кишечные палочки на спецодежде должны отсутствовать. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6 ПРИНЦИПЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ НА ПРЕДПРИЯТИЯХ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Цель работы: Ознакомиться с принципами проведения микробиологического контроля сырья, полуфабрикатов и готовой продукции. Освоить методы опре-деления микроорганизмов в пищевых продуктах в соответствии с требованиями нормативной документации. Изучить качественный состав микрофлоры иссле-дуемого продукта. Оборудование, материалы: Исследуемые пищевые продукты (крем, маргарин, майонез, питьевое молоко, колбасное изделие, детская молочная смесь, овощ-ные консервы, пиво); пробирки с 9 см3 стерильной воды; стерильные пипетки на 1 см3 и чашки Петри; пробирки со стерильными питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ; со средой Сабуро или сусло агаром; средой Кесслера с поплавками; с солевым агаром и т.п.; набор красок по Граму; бактериологические петли и препаровальные иглы; фильтровальная бумага; предметные и покровные стекла; микроскоп; спиртовка; лоток с рельсами; промывалка; термостаты. 6.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Задача микробиологического контроля - возможно быстрое обнаружение и выявление путей проникновения микроорганизмов-вредителей в производство, очагов и степени размножения их на отдельных стадиях технологического процесса, предотвращение развития посторонней микрофлоры путем использования различных профилактических мероприятий. Микробиологический контроль проводится заводскими лабораториями систематически. При отсутствии микробиологической лаборатории на предприятии указанный контроль может осуществляться по хоздоговору с органами Госсанэпиднадзора или лабораториями, аккредитованными для проведения микробиологических исследований. Он осуществляется на всех этапах техноло-гического процесса, начиная с сырья и кончая готовым продуктом на основа-нии утвержденных государственных стандартов (ГОСТ), технических условий (ТУ), инструкций, медико-биологических требований и санитарных норм каче-ства продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также другой норма-тивной документации. Для отдельных производств имеются свои схемы микро-биологического контроля, в которых определены объекты контроля, точки от-бора проб, периодичность контроля, указаны микробиологические показатели, которые необходимо определять, приводятся нормативы по этим микробиоло-гическим показателям. Многие пищевые продукты являются благоприятной средой для роста и развития посторонних микроорганизмов. Несоблюдение и нарушение технологических режимов переработки сырья, санитарно-гигиенических условий на производстве, нарушение режимов хранения и сроков реализации пищевой продукции может привести к интенсивному накоплению в них микроорганизмов, способных образовывать токсины, что является причиной пищевых отравлений. Кроме того, при несоблюдении санитарных правил и норм работниками пищевого предприятия в продукты могут попасть патогенные микроорганизмы – возбудители пищевых инфекций. Поэтому важнейшими характеристиками продовольственных товаров являются их безопасность и микробиологическая стойкость. Под безопасностью понимают отсутствие вредных примесей химической и биологической природы, в том числе патогенных микроорганизмов и ядовитых продуктов их жизнедеятельности. Понятие «микробиологическая стойкость» подразумевает потенциальные возможности сохранения продукта без порчи. Микрофлора пищевых продуктов представляет собой сложную динамическую систему, связанную с внешней средой. Это значительно осложняет способы ее исследования и трактовку полученных результатов. Для оценки качества пищевых продуктов, а также условий их производства и хранения пользуются количественными и качественными показателями. Количественные показатели указывают общее число микроорганизмов определенных групп в 1 г (см3) продукта. Качественные показатели указывают на отсутствие (присутствие) микробов конкретных видов в определенной массе продукта. 6.1.1 Группы микробиологических критериев безопасности пищевых продуктов 1. Группа показателей санитарного состояния Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов (возбудителей пищевых инфекций) в пищевых продуктах невозможно из-за низкого их содер-жания в продукте по сравнению с содержанием сапрофитной микрофлоры. По-этому при санитарной оценке пищевых продуктов используют косвенные мето-ды, позволяющие определить уровень загрязнения продукта выделениями че-ловека. Чем выше этот уровень, тем вероятнее попадание в объект патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций. Санитарная оценка пищевых продуктов проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и наличию бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Общая бактериальная обсемененность (КМАФАнМ) - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г или 1 см3 продукта. В нормативной документации указывают предельное содержание этих микроорганизмов в единицах КОЕ (колониеобразующих единицах). Высокая бактериальная обсемененность пищевых продуктов свидетельствует о недостаточной термической обработке сырья, недостаточно тщательной мойке и дезинфекции оборудования, неудовлетворительных условиях хранения и транспортировки продукции. Общую бактериальную обсемененность определяют в продуктах, в которых отсутствует технически полезная микрофлора (микрофлора заквасок). Для определения этого показателя используют универсальные питательные среды: мясопептонный агар (МПА) или среду для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Наличие бактерий группы кишечной палочки (БГКП) определяется во всех жидких продуктах, во всех продуктах животного происхождения (за исключением стерилизованных), во многих продуктах растительного происхождения. БГКП объединяют представителей нормальной микрофлоры кишечника человека и относятся к семейству Enterobacteriaceae родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. БГКП выполняют функцию индикатора фе-кального загрязнения и относятся к санитарнопоказательным микроорганизмам. Выбор БГКП в качестве санитарно-показательных микроорганизмов для оценки санитарного состояния пищевых продуктов не случаен. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим требованиям: Эти микроорганизмы должны являться представителями нормальной микрофлоры организма, в нем развиваться и размножаться; Они должны в больших количествах выделяться из организма; В окружающей среде они должны длительное время сохранять свою жиз-неспособность, но не размножаться; Они не должны изменяться под действием факторов внешней среды, подавляться или стимулироваться другими микроорганизмами; Эти микроорганизмы должны равномерно распределяться в исследуемых объектах внешней среды; Определение этих микроорганизмов должно осуществляться простыми методами. В нормативных документах обычно указывается количество продукта, в котором БГКП не допускаются. При высоком уровне загрязнения продукта БГКП возрастает вероятность нахождения в нем патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры и др.). Для определения БГКП применяют накопительную среду Кесслера, а идентификацию этих бактерий проводят с использованием дифференциально-диагностической среды Эндо. 2. Группа условно-патогенных микроорганизмов. К этой группе относятся микроорганизмы – возбудители пищевых отравлений, таких как Proteus vul-garis, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum. Условно- патогенные микроорганизмы являются микроорганизмами, кото-рые постоянно присутствуют в окружающей среде и в живых макроорганизмах. Благоприятной средой для роста и развития этих микроорганизмов является мясо и мясопродукты, поэтому именно эти продукты чаще всего являются причиной пищевых отравлений. Таким образом, многие из вышеперечисленных микроорганизмов нормируются в колбасных изделиях и других мясных продуктах. В мясных и многих растительных консервах нормируют содержание суль-фитредуцирующих клостридий, которые развиваются в анаэробных условиях. В молочных продуктах, богатых белком (например, твороге, сыре) нормируется содержание коагулазоположительного золотистого стафилококка (Sta-phylococcus aureus) – возбудителя пищевой интоксикации. При определении условно-патогенных микроорганизмов используют элек-тивные питательные среды. Например, наличие золотистого стафилококка вы-являют с помощью молочно-солевого (МСА) или желточно-солевого (ЖСА) агара. 3. Группа патогенных микроорганизмов Из патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах определяют сальмонеллы. Проводят исследования на наличие сальмонелл органы Санэпиднадзора. Обычно, сальмонеллы не допускаются в 25 г (см3) продукта. В некоторых продуктах детского и диетического питания не допускается наличие сальмонелл в 50 и даже в 100 г (см3). Для определения сальмонелл используют накопительные питательные сре-ды (селенитовую, Кауфмана, Мюллера) и дифференциальнодиагностические среды (Плоскирева, Левина). 4.Группа показателей микробиологической стабильности продукта. К этой группе относятся микроскопические грибы и дрожжи, которые, как из-вестно, являются возбудителями порчи продукта. Этот показатель нормируется многих продуктах из растительного сырья, а также в продуктах животного про-исхождения с растительными добавками. Динамику роста грибов и дрожжей обязательно исследуют при установлении сроков годности и режимов хранения новых видов продуктов. Плесени и дрожжи определяют с использованием сус-ло-агара или среды Сабуро, причем количество колоний грибов и дрожжей, вы-росших на плотных средах подсчитывают отдельно. Кроме вышеперечисленных нормируемых микробиологических показате-лей для прогнозирования качества выпускаемой пищевой продукции целесооб-разно определять отдельные группы микроорганизмов, которые являются пред-ставителями технически полезной и технически вредной микрофлоры. Так, в производстве сыров периодически определяют гнилостные бактерии как основные возбудители порчи сыров, а также следят за развитием полезных микроорганизмов (молочнокислых и пропионовокислых бактерий) в процессе выработки сыров. 6.1.2 Понятие о системе критических контрольных точек (НАССР) В целях гарантии качества выпускаемой пищевой продукции, ее безопасности за рубежом активно внедряется система критических контрольных точек (НАССР) в качестве основы экспертизы пищевых продуктов. НАССР расшиф-ровывается как Hazard Analysis Critical Control Paint (критические пределы над-зора вредных факторов). Характерной особенностью данной системы является планомерный надзор и контроль пищевых продуктов при предварительном определении всех воз-можных факторов, связанных с полным циклом обращения с пищевыми про-дуктами. Этот надзор начинается с контроля условий выращивания животных и контроля условий произрастания растений; с контроля среды обитания промы-словых животных и гидробионтов. Далее проводят контроль условий получе-ния сырья, и контроль производства определенного продукта из этого сырья. Заканчивается надзор исследованием готового продукта после его приготовления, хранения, транспортировки и реализации. Эта система существенно отличается от ранее применявшегося метода санитарно-гигиенического контроля и надзора, в котором основное внимание бы-ло уделено надзору лишь конечных продуктов. Хотя система критических контрольных точек была разработана для микробиологического контроля пищевых продуктов, в последнее время она успешно применяется и для контроля и предотвращения остаточных химических веществ, в том числе и химикатов сельскохозяйственного назначения (удобрений, гербицидов, пестицидов и др.), антибактериальных веществ, гормонов, а также включений инородных веществ в пищевые продукты. Международным комитетом по стандартизации микроорганизмов пищевых продуктов (ICMSF) рекомендовано Всемирной Организации Здравооохра-нения (ВОЗ) внедрить НАССР в международный стандарт. В настоящее время в странах ЕС считается обязательным обработка и производство импортирован-ных мяса и морепродуктов с применением системы НАССР. 6.1.3 Микробиологический контроль качества некоторых пищевых продуктов При проведении микробиологического исследования пищевых продуктов в можно руководствоваться медико-биологическими требованиями и санитарны-ми нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов (Сан-ПиН 2.3.2.560-96). Микробиологические нормативы для продуктов детского питания представлены в методических указаниях (МУК 4.2.577-96) «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов». Выписка из этих документов по отдельным группам пищевых продуктов представлена в приложении данного лабораторного практикума. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОНДИТЕРСКИХ ИЗДЕЛИЯ Цель работы: Освоить методы определения микроорганизмов в кондитерских изделиях в соответствии с требованиями нормативной документации. Изучить качественный состав микрофлоры исследуемого продукта. Оборудование, материалы: Исследуемые пищевые продукты (крем, маргарин, майонез, питьевое молоко, колбасное изделие, детская молочная смесь, овощ-ные консервы, пиво); пробирки с 9 см3 стерильной воды; стерильные пипетки на 1 см3 и чашки Петри; пробирки со стерильными питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ; со средой Сабуро или сусло агаром; средой Кесслера с поплавками; с солевым агаром и т.п.; набор красок по Граму; бактериологические петли и препаровальные иглы; фильтровальная бумага; предметные и покровные стекла; микроскоп; спиртовка; лоток с рельсами; промывалка; термостаты. Кремовые кондитерские изделия Кремы, используемые для изготовления тортов и пирожных, является ско-ропортящейся продукцией, которая может послужить причиной пищевых отравлений. Помимо различных споровых и неспоровых бактерий, дрожжей, спор плесеней, в кремах могут присутствовать патогенные микроорганизмы. Осо-бенно опасен заварной крем, который отличается от других кремов низкой кон-центрацией сахара, повышенной влажностью и содержанием муки. Помимо то-го, что заварной крем быстро закисает в результате развития кислотообразую-щих бактерий, в нем могут развиваться токсигенный золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) и некоторые условнопатогенные микроорганизмы (на-пример, энтеропатогенные кишечные палочки). Следует помнить, что накопле-ние токсинов в кремовых изделиях происходит при температуре от 15 до 22 0С. Причинами инфицирования крема может быть сырье (молоко, сливки, сахар, масло, яйца). Нарушение технологического режима и санитарных правил при изготовлении и хранении крема и кремовых изделий приводит к интенсивному развитию микроорганизмов, внесенных с сырьем и микроорганизмов, попадающих в крем в процессе его производства и хранения. Поэтому, в соответствии с требования ми по хранению и реализации скоропортящихся продуктов торты и пирожные с различными кремами разрешается хранить при температуре не выше 60С в течение ограниченного времени (например, с белковосбивным кремом не более 72 часов). Готовые кремовые изделия подвергают микробиологическому контролю. КМАФАнМ в зависимости от вида крема должно быть не выше значения 1104 – 1105 КОЕ/г; БГКП не допускаются в 0,01 г; золотистый стафилококк – в 1 г за-варного и в 0,01 г сливочного крема. Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы должны отсутствовать в 25 г крема (приложение ). ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАРГАРИНА И МАЙОНЕЗА Цель работы: Освоить методы определения микроорганизмов в маргарине и майонезе в соответствии с требованиями нормативной документации. Изучить качественный состав микрофлоры исследуемого продукта. Оборудование, материалы: Исследуемые пищевые продукты (крем, маргарин, майонез, питьевое молоко, колбасное изделие, детская молочная смесь, овощ-ные консервы, пиво); пробирки с 9 см3 стерильной воды; стерильные пипетки на 1 см3 и чашки Петри; пробирки со стерильными питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ; со средой Сабуро или сусло агаром; средой Кесслера с поплавками; с солевым агаром и т.п.; набор красок по Граму; бактериологические петли и препаровальные иглы; фильтровальная бумага; предметные и покровные стекла; микроскоп; спиртовка; лоток с рельсами; промывалка; термостаты. Маргарин и майонез Маргарин. Микроорганизмы в производстве маргарина играют двоякую роль. Молочнокислые бактерии, которые входят в состав водно-молочной фазы являются полезной микрофлорой маргарина, так как придают ему специфический вкус и аромат. Все остальные микроорганизмы, которые попадают с сырьем, из внешней среды являются вредителями производства, снижающими качество маргарина и его стойкость при хранении. Основными источниками посторонней микрофлоры маргарина являются компоненты водно-молочной фазы, так как жиры и растительные масла являются неблагоприятной средой для раз-вития микроорганизмов. Микробную порчу маргарина вызывают гнилостные бактерии, которые попадают в маргарин с молоком (вызывают порок горького вкуса), грибы, дрожжи, флуоресцирующие бактерии (вызывают прогорклый вкус и неприятный запах, грибы также являются причиной образования пиг-ментных пятен на маргарине), термоустойчивые молочнокислые бактерии (вы-зывают излишне кислый вкус). Качество маргарина оценивается по наличию БГКП – не допускаются в 0,01 г, по содержанию в маргарине дрожжей (не бо-лее 5х103 КОЕ/г) и плесеней (не более 20 КОЕ/г). Сальмонеллы не допускаются в 25 г маргарина. Майонез. В производстве майонеза не используются промышленно полез-ные микроорганизмы. В этом продукте может находиться только технически вредная микрофлора, попадающая в майонез с поверхности оборудования, и остаточная микрофлора компонентов майонеза. Представители технически вредной микрофлоры майонеза вызывают его газообразование (возбудители порчи - гетероферментативные молочнокислые бактерии и дрожжи), бомбаж банок (возбудитель – маслянокислые бактерии рода Clostridium), горький вкус (возбудители порчи гнилостные бактерии). В маргарине нормируется наличие БГКП (не допускаются в 0,1 см3), содержание дрожжей (не более 5х102 КОЕ/см3), количество плесеней (не более 10 КОЕ/см3), наличие сальмонелл (не допускаются в 25 см3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №9-10 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОЧНЫХ И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ Цель работы: Освоить методы определения микроорганизмов в питевой молоке в соответствии с требованиями нормативной документации. Изучить качественный состав микрофлоры исследуемого продукта. Оборудование, материалы: Исследуемые пищевые продукты (крем, маргарин, майонез, питьевое молоко, колбасное изделие, детская молочная смесь, овощные консервы, пиво); пробирки с 9 см3 стерильной воды; стерильные пипетки на 1 см3 и чашки Петри; пробирки со стерильными питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ; со средой Сабуро или сусло агаром; средой Кесслера с поплавками; с солевым агаром и т.п.; набор красок по Граму; бактериологические петли и препаровальные иглы; фильтровальная бумага; предметные и покровные стекла; микроскоп; спиртовка; лоток с рельсами; промывалка; термостаты. Питьевое молоко. Микрофлора питьевого молока состоит из остаточной микрофлоры пасте-ризованного молока (представлена спорами бацилл и клостридий, а также тер-мойстойчивыми молочнокислыми палочками) и микрофлоры вторичного обсе-менения (бактериями группы кишечной палочки, психрофильными гнилостны-ми бактериями, мезофильными молочнокислыми стрептококками и палочками, дрожжами и др.). Микроорганизмы, попадающие в питьевое молоко, могут вы-звать пороки консистенции, вкуса и цвета молока. Нормируемые показатели качества питьевого молока представлены в приложении данного лабораторного практикума. Так, для пастеризованного молока в бутылках и пакетах группы А, общая бактериальная обсемененность (КМАФАнМ) не должна превы-шать значения 5х104 КОЕ/см3, БГКП и золотистый стафилококк не допускаются в 1 см3 молока, а патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы – в 25 см3 Колбасные изделия. Колбасы относятся к продуктам, употребляемым в пищу без предвари-тельной термической обработки. В связи с этим колбасы должны отвечать вы-соким санитарным требованиям. Источниками микрофлоры колбасных изделий являются сырье и микрофлора вторичного обсеменения, попадающая в колбас-ные изделия в процессе переработки сырья. Поэтому технологические процес-сы выработки колбасных изделий направлены на придание им соответствую-щих свойств и на уничтожение микроорганизмов. Количественный и качественный состав микрофлоры колбас зависит от вида и сорта колбасы. В вареных колбасах, подвергнутых действию высоких температур (68…70 0С внутри батона), погибают бесспоровые бактерии, но остаются невредимыми споры и частично кокковые формы и единичные палочки, т.к. они бывают защищены слоем жира. Стойкость колбасных изделий при хранении зависит от содержания в них влаги, поваренной соли, степени пропитки антисептическими веществами дыма, а главное – от микробного загрязнения колбас. При соблюдении в колбасном производстве санитарно-гигиенических требований и использовании доброкачественного сырья бактериальная обсемененность свежевыработанных готовых изделий составляет: вареных колбас – 103 в 1 г, полукопченых – 102, ливерных – 104-105. Порчу колбас вызывают мо-лочнокислые бактерии (прокисание колбас), гнилостные не спорообразующие палочковидные бактерии и микрококки (ослизнение оболочек), плесени (плес-невение колбас) и другие микроорганизмы. Нормируемыми микробиологическими показателями колбасных изделий являются КМАФАнМ, наличие БГКП, золотистого стафилококка, сульфитре-дуцирующих клостридий и патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл (см приложение ). Сусло и пиво Производство пива ведется в не стерильных условиях. Поэтому не исклю-чено попадание в сусло, молодое и готовое пиво разнообразных микроорганиз-мов. Микроорганизмы, развивающиеся в сусле и пиве, принадлежат к различ-ным группам – к бактериям, микроскопическим грибам и дрожжам. По количе-ству представителей и по причиняемому ущербу первое место принадлежит бактериям. Это сусловые бактерии (родов Flavobacterium, Zymomonas и др.), бактерии, которые могут развиваться в сусле и пиве (молочнокислые, уксуснокислые бактерии, пивные сарцины и др.). Попав в производство, они постепенно адаптируются к условиям технологического процесса, видоизменяются и так приспосабливаются, что борьба с этими микроорганизмами затруднительна, а наносимый вред может выражаться не только в ухудшении стойкости пива, но и в порче его вкуса вплоть до полной непригодности. Широкое распространение в отечественном пивоварении как вредители получили и дрожжи. Эти микроорганизмы также как и бактерии снижают биологическую стойкость пива и ухудшают его вкус и аромат. Микроскопические грибы, в отличие от бактерий и дрожжей, хотя и часто встречаются в пивоваренном производстве, однако редко вызывают его порчу. Это связано с тем, что грибы относятся к аэробным микроорганизмам, а в процессе сбраживания сусла создаются анаэробные усло-вия. При оценке качества пива принято проводить микробиологический кон-троль пива на общую бактериальную обсемененность (КМАФАнМ) и наличие БГКП. Овощные консервы В зависимости от рН и химического состава овощные консервы можно от-нести к четырем группам: 1. К группе А относятся консервы этой группы подвергаются стерилизации. К этой группе относятся низкокислотные натуральные овощные консервы с рН 4,2…5,2 (зеленый горошек, стручковая фасоль, кукуруза, цветная капус-та идр.). В консервируемых продуктах группы А допускается присутствие небольшого количества спор непатогенных микроорганизмов при условии, что эти споры не разовьются в консервах во время хранения. 2. К группе Б относятся стерилизуемые неконцентрированные томатопродукты и пастеризуемые концентрированные томатопродукты с нерегулируемой кислотностью. Технологический процесс термической обработки томатопродуктов должен быть отрегулирован таким образом, чтобы число спор мезофильных клостридий не превышало в них 1 споры в 2 см3, а термофильных анаэробов было не более чем одна спора в 1 см3. 3. К группе В относятся кислотные консервы с рН от 3,7 до 4,2. Такие консервы подвергают термической обработке при 100…110 0С. Термическая обработ-ка должна обеспечить гибель газообразующих мезофильных бацилл возбудителей порчи. 4. К группе Г относятся высококислотные овощные консервы. Такие консервы подвергают пастеризации при 75…1000С, поэтому в остаточной микрофло-ре этих консервов могут присутствовать микроскопические грибы, молочно-кислые бактерии, дрожжи и др. микроорганизмы. Пастеризация этих про-дуктов должна гарантировать гибель БГКП и сальмонелл. Таким образом, перед тем как проводить микробиологическое исследование овощных консервов нужно определить к какой их вышеперечисленных групп они относятся. Особо тщательно проверяют консервы с рН более 4,2-4,4 в которых возможно развитие возбудителей пищевых отравлений. Допустимая общая бактериальная обсемененность (КМАФАнМ) консервов перед их стерилизацией нормируется. Общее число бактерий в 1 г (1 см3) продукта не должно превышать 10 000 – 50 000 (в зависимости от вида продукта), а в консервах для детского питания – 200. Клостридии должны отсутствовать в 0,5 см3 содержимого банки. Мезофильных бацилл допускается не более 100-300/г. При исследовании готовых консервов проверяют банки на герметичность, термостатируют банки при 37 0С в течение 5 суток, далее отбирают пробы из банок и проводят микробиологическое исследование. Сохранение нормального внешнего вида тары после термостатирования является одним из показателей микробиологической стабильности консервов. Содержимое дефектных банок с признаками микробной порчи (содержание таких банок допускается не более 0,2 %) анализируют для установления природы дефекта. Сухие детские смеси Как видно из табл. приложения, к продуктам детского и лечебного питания предъявляются более жесткие требования, чем к продуктам массового потребления. Соответственно, к промышленному сырью и компонентам, используемым для изготовления продуктов детского питания, также предъявляются повышенные микробиологические требования. Так, в сухих молочных продуктах, предназначенных детей грудного воз-раста, нормируются КМАФАнМ (от 2х103 до 2,5х104КОЕ/г), количество пле-сеней (от 5х10 до 1х102 КОЕ/г), содержание дрожжей (от 10 до 5х10 КОЕ/г), количество спор Bacillus cereus (не более 1х102-2х102 КОЕ/г), не допускается наличие БГКП в 1г, E. сoli – в 10 г, золотистый стафилококк – в 1…10 г, пато-генные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы – в 50…100 г. 9.1 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ 1-е занятие На первом занятии студенты знакомятся с принципами микробиологического контроля на предприятиях пищевой промышленности; группами микробиологических критериев безопасности пищевых продуктов и системой НАССР; с микрофлорой, особенностями проведения и схемой микробиологи-ческого исследования определенного пищевого продукта. Далее они готовят разведения анализируемого продукта и проводят посев этих разведений на плотные и жидкие питательные среды для определения нормируемых микро-биологических показателей и определения содержания микроорганизмов, кото-рые в данном продукте не нормируются, но имеют значение при прогнозирова-нии качества исследуемого продукта. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №11-12 Схема разведения пищевого продукта и проведения микробиологического исследования Цель работы: Ознакомиться с принципами проведения микробиологического контроля сырья, полуфабрикатов и готовой продукции. Освоить методы опре-деления микроорганизмов в пищевых продуктах в соответствии с требованиями нормативной документации. Изучить качественный состав микрофлоры иссле-дуемого продукта. Для приготовления разведений продукта используют пробирки с 9 см3 стерильной воды. Иногда для приготовления разведений используются стерильные растворы разбавленного фосфатного буфера, изотонического раствора хлорида натрия, пептонной воды или лимоннокислого натрия. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 1 см3 продукта. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки (разведение 1:10). Затем этой же пи-петкой из пробирки с разведением 1:10 отбирают 1 см3 жидкости и переносят во вторую пробирку с водой (разведение 1:100). Количество разведений рассчиты-вают таким образом, чтобы в чашках Петри выросло от 30 до 300 колоний. Так, при исследовании пастеризованного молока рекомендуется готовить I, II и III разведение продукта, так как нормируемое значение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в питьевом молоке не более 50…200 тыс. КОЕ/см3. Рис. 1 Схема приготовления разведений продукта и высева его в чашки Петри Исследуемый продукт Рекомендации при приготовлении I разведения (1:10): из кондитерских изделий с кремом, из маргарина 1 г крема или маргарина взвешивают с соблюдением правил асептики и вно-сят в пробирку с 9 смводы. Затем пробирку помещают в водяную баню с температурой 50…55 0С. Выдерживают пробирку на водяной бане до полно-го расплавления крема. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и для последующих разведений отбирают 1 см3 жидкости, находящейся под слоем масла; из продуктов, имеющих плотную и неоднородную консистенцию (например, из колбасных изделий, овощных консервов) 1 г средней пробы исследуемого продукта взвешивают с соблюдением пра-вил асептики, помещают в стерильную ступку. В ступку также вносят 9 см3 стерильной воды, и материал растирают с песком в течение 10…15 мин вблизи пламени горелки до получения однородной массы. Далее дают взве-сям осесть и отбирают 1 см3 надосадочной жидкости для приготовления раз-ведения 1:100. Чашечные методы количественного учета микроорганизмов Сущность чашечных методов количественного учета микроорганизмов заключается в посеве разведений продукта на стерильные плотные питательные среды в чашки Петри с последующим культивированием и подсчетом выросших в чашках колоний. При этом считается, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Учет результатов при использовании чашечных методов Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением от 4 до 10 раз. При большом количестве колоний и равномерном их распределении дно чашки делят на сектора, подсчитывают число колоний в 2-3 секторах, находят средне арифметическое число колоний и умножают на разведение (10 – при первом разведении продукта, 100 – при втором разведении и т.д.). Если инкубированные чашки с первым разведением (1:10) не содержат ко-лоний, то результат выражают так: меньше 1х10 КОЕ/см3 (КОЕ – колониеобра-зующие единицы); Если в чашках Петри с I разведением (1:10) содержится меньше, чем 15 ко-лоний, то результат выражается так: количество микроорганизмов менее Мх10 КОЕ/г, где М – число выросших колоний; Если количество колоний более15, то подсчитывают количество колоний в чашках, умножают на разведение и полученный результат округляют в соответствии с ГОСТом 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов»: - до числа, кратного 5, если количество колоний в чашке менее 100; - до числа, кратного 10, если количество колоний в чашке более 100. Пример: Посеяно I разведение продукта 1:10. В чашке Петри выросло 194 колонии. Полученный результат округляем до 200. Количество микроорганизмов в продукте: 200х10=2,0х103КОЕ/г. Чашечными методами определяют следующие микробиологические показатели: КМАФАнМ, количество спор грибов и дрожжей, содержание гнилостных бактерий, коагулазоположительных стафилококков. Лабораторная работа №13 Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в пищевых продуктах Цель работы: Освоить методы опре-деления микроорганизмов в пищевых продуктах в соответствии с требованиями нормативной документации. Изучить качественный состав микрофлоры исследуемого продукта. Перед посевом чашки маркируют. По 1 см3 разведений продукта вносят в чашки Петри. Пипетку с посевным материалом держат под углом 450С, касаясь концом пипетки дна чашки. Затем в каждую чашку наливают по 12-15 см3 мясопептонного агара или среды для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, расплавленной и охлажденной до 450С. Сразу после заливки агара содержимое тщательно перемешивают путем легкого вращательного по-качивания для равномерного распределения посевного материала. Если ожида-ют ползучий рост микроорганизмов посевы после застывания агара заливают вторым слоем питательной среды или 3…5 см3 водного раствора агара. После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при (30 1)0С на 72 часа (допускается предварительный учет через 48 часов с последующим окончательным учетом через 24 часа). Определение количества грибов и дрожжей Ведут так же, как и определение КМАФАнМ, только в качестве питательной среды используют сусло-агар или среду Сабуро. Инкубацию посевов ведут при температуре 240С в течение 5 суток с предварительным учетом через 3 су-ток. Определение протеолитических (гнилостных) бактерий Соответствующее разведение продукта засевают на молочный агар инкубацию посевов проводят при 300С в течение 72 часов. Протеолитические бактерии на молочном агаре при своем росте образуют зоны просветления агара (зоны протеолиза). Пептонизирующие бактерии образуют узкие зоны пептонизации. Определение коагулазоположительных стафилококков Ведут так же, как и определение КМАФАнМ. В качестве питательной сре-ды используют молочно-солевой или желточно-солевой агар. Культивирование проводят при 370С в течение 24…48 часов. При росте на желточносолевом агаре вокруг колоний образуются перламутровые зоны помутнения агара, а на молочно-солевом агаре – небольшие зоны пептонизации. Определение аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus Исследуемый материал или разведение продукта перед посевом пастеризуют при 75…85 0С в течение 20 мин. Далее ведут определение так же, как и при определении КМАФАнМ. После пастеризации вегетативные клетки погибают, а споры после посева на МПА и культивирования при 370С прорастают и в течение 24…48 час образуют колонии. Определение бактерий группы кишечной палочки Для посева используют то количество продукта, в котором предусматрива-ется отсутствие БГКП (1 см3 молока или 1 см3 первого разведения молока). По-сев проводят в пробирки со средой Кесслера с поплавками. Посевы помещают в термостат с температурой 370С на 24 часа. При отсутствии признаков роста (газообразования в поплавках, помутнения среды) дают заключение об отсутствии БГКП и соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП. При положительной бродильной пробе для окончательного заключения о наличии в продуктах БГКП из подозрительных пробирок производят посев на чашки со средой Эндо или Левина. Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Чашки помещают в термостат. Учет результатов. При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для БГКП (на среде Эндо – красных с металлическим блеском, на среде Левина – черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром) считают, что продукт соответствует нормативу. При наличии на среде Эндо или Левина типичных колоний их окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных, не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП в анализируемой пробе и несоответ-ствии продукта по микробиологическому нормативу. Определение сальмонелл Асептически взвешенные навески сухих компонентов или стерильно отме-ренные объемы жидких компонентов (обычно 25 г или 25 см3) засевают в кол-бы с магниевой средой или средой Мюллера (накопительные среды для саль-монелл), соблюдая соотношение продукта и среды не менее 1 : 9. Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиентов при соотношении продукта и среды 1 : 1. Колбы с посевами помещают в термостат с температурой 370С на 18…24 часа. После инкубации в термостате производят высев из колб с накопительными средами на поверхность дифференциально-диагностических сред (среду Плоскирева или висмут-сульфитный агар). Для получения отдельных колоний петлей берут минимальное количество посевного материала и производят посев штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 370С. Про-верку посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 ч после инкубации в термо-стате. Учет результатов. На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, прозрачные, плоские, на висмут-сульфитном агаре – черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с черным ободком, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред конечный результат анализа записывают как «отрицательный», т.е. в исследуемой массе продукта сальмонеллы отсутствуют. При наличии на любой из питательных сред на чашках Петри типичных или подозрительных колоний на сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение по биохимическим и другим признакам. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №14-15 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКВАСОК И КИСЛО-МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Цель занятия: Ознакомиться с полезной микрофлорой заквасок и классифика-цией кисломолочных продуктов в зависимости от состава микрофлоры заквасок.Ознакомиться с микробиологическими методами контроля качества заквасок и кисломолочных продуктов. Освоить метод микроскопического исследования заквасок и кисломолочных продуктов на наличие посторонней микрофлоры. Оборудование и материалы: Микроскоп; спиртовка; предметные стекла; бак-териологические петли; иммерсионное масло; краска Муромцева; фильтро-вальная бумага; лоток с рельсами; промывалка. Кисломолочные продукты (кефир, сметана, творог, ряженка, йогурт, кисломо-лочный бифидопродукт, кисломолочный продукт с ацидофильной палочкой); жидкие закваски на стерильном молоке; 7.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Закваски – чистые культуры или смесь чистых культур молочнокислых бактерий, вносимые в молоко с целью получения высококачественных кисло-молочных продуктов. Закваски используются также в производстве маргарина. На заводах и в лабораториях по производству бактериальных препаратов выпускают жидкие и сухие бактериальные концентраты, а также маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок. Эти бактериальные препараты высылают на предприятия, где путем последовательного их пересева в возрастающие объемы молока, получают лабораторные закваски (при культивировании микрофлоры бактериальных препаратов на стерильном молоке) и, далее, производственные закваски (путем пересева лабораторной закваски на стерильное или пастеризованное молоко). Производственные закваски используют в про-изводстве кисломолочных продуктов. Производственные закваски на предприятии получают в отделениях чистых культур или в специальном боксе при микробиологической лаборатории предприятия. В этих помещениях необходимо поддерживать асептические условия. Не допускается одновременно проводить посевы по контролю готовой продукции, контролю условий производства и готовить закваски. Нельзя применять закваски и бактериальные концентраты с истекшим сроком хранения. Флаконы с заквасками вскрывают непосредственно перед употреблением и используют все содержимое флакона сразу. Морфологические свойства некоторых бактерий, входящих в состав микрофлоры заквасок Молочнокислые стрептококки . Представляют собой шаровидные или овальные клетки размером до 1-2 мкм в диаметре, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Молоч-нокислые стрептококки неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму ок-рашиваются положительно. Клетки ароматобразующих стрептококков (Strepto-coccus diacetylactis, Streptococcus acetoinicus) мельче, чем клетки молочного и сливочного стрептококков (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris), а клетки термофильного стрептококка (Streptococcus thermophilus) самые крупные. К гомоферментативным относятся молочный и сливочный стрептококки, а к гетероферментативным – ароматические стрептококки. Промежуточное положение между гомоферментативными и гетерофермен-тативными молочнокислыми стрептококками занимает термофильный стрептококк, поэтому его иногда называют среднегетерогенным видом. Рис. 2Молочнокислые стрептококки: а – молочный стрептококк; б – сливочный стрептококк; в – термофильный стрептококк Молочнокислые палочки. Лактобактерии представляют собой палочки, одиночные, соединенные по-парно и цепочками размером (4…10х0,5…0,6) мкм. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно. Молочнокислые палочки относятся к роду Lactobacillus, включающему три подрода: термобактерии, стрептобактерии и бета-бактерии. Термо- и стрепто-бактерии являются гомоферментативными, а бета-бактерии гетерофермента-тивными молочнокислыми палочками. К термобактериям относятся 8 видов палочек, наиболее известными из которых являются Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus. Подрод стрептобактерий включает 7 видов, среди которых в молочной промышленно-сти используются Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. В подрод бета-бактерий входят 11 видов палочек, наиболее изученными из которых являются Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum. Клетки стрептобактерий мельче, чем клетки термобактерий, и часто распо-лагаются в виде цепочек. Бета-бактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клет-ки. Рис.3 Молочнокислые палочки: а – болгарская палочка; б – ацидофильная палочка; в – сырная палочка 7.1.2 Характеристика микрофлоры некоторых кисломолочных продуктов Кефир готовится с использованием естественной симбиотической закваски – кефирного грибка. Кефирные грибки – прочное симбиотическое образование. Они имеют всегда определенную структуру и передают свои свойства и структуру последующим поколениям. Они имеют неправильную форму, сильноскладчатую или бугристую поверхность, консистенция их упругая, мягко-хрящеватая, размеры от 1-2 мм до 3-6 см и более. В состав кефирного грибка входят ряд молочнокислых бактерий: мезофильные молочнокислые стрепто-кокки видов Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris; ароматобразующие бак-терии видов Streptococcus diacetylactis, Leuconostoc dextranicum; молочнокис-лые палочки рода Lactobacillus; уксуснокислые бактерии; дрожжи. При микро-скопировании срезов кефирного грибка обнаруживаются тесные переплетения палочковидных нитей, которые образуют строму грибка, удерживающую ос-тальные микроорганизмы. Процесс сквашивания и созревания кефира ведут при температуре 200 22 С в течение 10-12 часов. Творог, сметана. При приготовлении этих продуктов процесс сквашивания молока проводят при температуре 300С в течение 6-8 часов. В состав микрофлоры этих продуктов входят гомоферментативные стрептококки: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris; гетероферментативные ароматобразующие стрептококки: Streptococcus diacetylactis, Streptococcus acetoinicus и ароматобра- зующие лейконостоки вида Leuconostoc dextranicum. Гомоферментативные молочнокислые стрептококки и гетероферментативный ароматический стрепто-кокк Streptococcus diacetylactis входят также в состав микрофлоры закваски для маргарина. Сметану Любительскую, молочно-белковую пасту «Здоровье», творог, вырабатываемый ускоренным методом, а также напитки пониженной жир-ности с плодово-ягодными наполнителями готовят с использованием мезофильных и термофильные стрептококков. Мезофильные стрептококки осуществляют активное течение молочнокислого процесса и участвуют в обеспече-нии влагоудерживающей способности сгустка. Основной функцией термо-фильных стрептококков является обеспечение необходимой вязкости сгустка, способности его к удерживанию сыворотки и восстановление структуры после перемешивания. Сквашивание молока в этом случае ведут при температурах 35-380С в течение 6-7 часов. Йогурт, простоквашу Южную, ряженку и варенец готовят с использованием термофильных молочнокислых бактерий. Процесс сквашивания ведут при температуре 40-450С в течение 3-5 часов. В состав микрофлоры йогурта и простокваши Южная входят термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus) и болгарская палочка (Lactobacillus bulgaricus) в соотношении 4:1…5:1. Применяют также симбиотическую закваску этих микроорганизмов. В производстве ряженки и варенца используют закваску термофильного молочнокислого стрептококка в количестве 3-5%. Иногда добавляют болгарскую палочку. Продукты лечебно-профилактического назначения. К ним относятся: ацидофильное молоко, ацидофилин, ацидофильно-дрожжевое молоко, ацидо-фильная паста, детские ацидофильные смеси, кисломолочные продукты с ис-пользованием бифидобактерий. Использование бактерий рода Lactobacillus aci-dophilus в производстве продуктов детского и диетического питания обуслов-лено наличием у них способности выделять специфические антибиотические вещества, подавляющие рост бактерий группы кишечной палочки, дизентерий-ной палочки, сальмонелл, коагулазоположительных стафилококков и др. Бакте-рицидные свойства ацидофильной палочки усиливаются в присутствии молоч-ной кислоты. Основным пороком кисломолочных продуктов с использованием ацидофильных палочек является перекисание продукта. Это происходит в том случае, когда не проводят быстрого охлаждения продукта. Продукты, обога-щенные бифидобактериями, характеризуются высокими диетическими свойст-вами, так как содержат ряд биологически активных соединений: свободные аминокислоты, летучие жирные кислоты, ферменты, антибиотические вещест-ва, микро- и макроэлементы. Определение наличия посторонних микроорганизмов в заквасках и в кисломолочных продуктах Контроль качества заквасок. Качество лабораторной и производственной заквасок на стерилизованном молоке контролируют по активность (предельной кислотности и продолжительности свертывания молока). В случае ее снижения проверяют чистоту закваски путем микроскопирования. Качество производственной закваски на пастеризованном молоке контролируют по активности, микроскопическому препарату, кислотности, наличию БГКП и органолептическим свойствам сгустка. БГКП не допускаются в 10 см3 закваски. Контроль кефирных грибковой и культуральной заквасок проводят по кислотности, наличию БГКП и микроскопическому препарату. В кефирных культуральных заквасках БГКП не допускаются в 3 см3. Контроль чистоты закваски по микроскопическому препарату включает приготовление фиксированного препарата из закваски, окраски его краской Муромцева и микроскопирование его с объективом х90 в 10 полях зрения. При этом обращают внимание на наличие посторонних микроорганизмов, содержа-ние которых в заквасках не допускается. Наличие посторонних микроорганизмов в заквасках можно определить и посевом жидких заквасок на питательные среды. Так, споровые формы бактерии определяют посевом заквасок, выдержанных при 0С в течение 10 минут, в стерильное молоко с добавлением парафи-на для выращивания в анаэробных условиях и без парафина – для культивиро-вания споровых форм бактерий в аэробных условиях. Если после культивиро-вания при 300С в течение 2-х суток в пробирках с парафином парафиновая пробка поднимается, а молоко пептонизируется, то это указывает на наличие в заквасках анаэробных споровых палочек рода Clostridium. Наличие грибов и дрожжей определяют путем посева разведений закваски в чашки Петри с суслом-агаром или средой Сабуро с последующим культиви-рованием при 24…26 0С в течение 3-5 суток. Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений пу-тем засева соответствующих разведений в стерильное обезжиренное молоко и термостатирования посевов при температуре 300С в течение 3-5 суток. Учет ре-зультатов проводят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности свернувшегося молока. Микробиологический контроль производства кисломолочных продуктов заключается в проведении контроля технологического процесса, санитарно-гигиенического контроля условий производства и готовой продукции. При контроле технологии проверяют эффективность пастеризации молока не реже 1 раза в 10 дней. Особое внимание уделяют контролю качества заквасок на наличие бактерий группы кишечной палочки, отбирая пробы из трубопровода при подаче закваски в ванну. Исследуют также смесь после заквашивания и сквашивания. В последнем случае пробы отбирают из ванны, резервуара или бутылки при тер- мостатном способе производства. Определяют наличие БГКП, которые не должны содержаться в 1 см3. Контроль технологических процессов производства кисломолочных продуктов проводят один раз в месяц. Готовую продукцию контролируют на наличие БГКП, а при необходимости по микроскопическому препарату не реже одного раза в 5 дней. БГКП не допускаются в 0,1 см3 кефира, простокваши, йогурта, ацидофильно-дрожжевого молока и других кисломолочных напитков. В сметане 20%-ой и 25%-ой жирности БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3, в твороге – в 0,001 г. В твороге нормируется также содержание золотистого стафилококка (не допускаются в 0,01 г). Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы не допускаются в 25 см3 (г) всех видов кисломолочных продуктов. При ухудшении микробиологических показателей готового продукта проводят дополнительный контроль технологических процессов для установления причин, влияющих на качество продукта. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ Студенты знакомятся с микрофлорой представленных к исследованию заквасок и кисломолочных продуктов (кефира, сметаны, творога, йогурта, варенца, ряженки и др.), готовят фиксированные из них мазки, окрашивают их краской Муромцева (см разд. 2.2.3) и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива (х90) в 10 полях зрения. Оформление и анализ результатов исследований Студенты конспектируют теоретический материал. Рассматривают анали-зируемые продукты под микроскопом. При этом обращают внимание на каче-ственный состав полезной микрофлоры и наличие посторонних микроорганиз-мов. Микроскопическую картину зарисовывают и под каждым рисунком дела-ют вывод о качестве исследованного образца.
