Современные аналитические методологии в лабораторной диагностики На примере реактивов «Парма Диагностика» «Старые» (ручные) методики: Орто – толуидиновый (глюкозы) Метод Либермана – Бурхарда (холестерин) С реактивом Фолина (мочевая кислота) Лаборатория «Современные» (коммерческие) наборы реактивов Ферментативные методы «Старые» колориметрические методики Возможность визуального контроля Многоступенчатый анализ, использование высоких температур ЗАПАХ!!! Низкие цены Токсичные реактивы, часто содержат крепкие кислоты Невозможность адаптации к автоматическим анализаторам Достаточно высокая специфичность Ферментативные методы Цена??? Да 1 мл дороже, но расход меньше Возможно систематические погрешности в некоторых реакциях Одноступенчатые методы исследования могут быть адаптированы к анализаторам Проведение реакции не требует экстремальных условий (кипящей водяной бани) Нет прекурсоров наркотических препаратов и тоскичных соединений Визуальный контроль за течением и результатами реакции возможен, но не всегда Список наборов «Парма Диагностика» 1. Ферменты: • аланинаминотрасфераза (АлТ), кинетическим методом по оптическому тесту Варбурга • аспартатаминотрасфераза (АсТ) кинетическим методом по оптическому тесту Варбурга • щелочная фосфатаза, ГГТ (self-indicating substrates ) 2. Субстраты: • белок в моче и ликворе по реакции с пирогаллоловым красным • общий и прямой билирубины колориметрическим методом Йендрашика – Грофа, • гемоглобин (гемоглобинцианидным методом) • мочевина (ферментативный кинетический метод, индикаторная реакция Варбурга) • глюкоза (глюкозоксидазный и гексокиназный методы) • Холестерин, триглицириды (реакция Триндера ) • креатинин псевдокинетическим методом по реакции Яффе без депротеинизации • альбумин (по реакции с бромкрезоловым зеленым) • общий белок (биуретовым реактивом) 3. Электролиты: • кальций метод с о – крезолфталеинкомплексоном • железо (феррозиновый метод) и общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) Использование оптического теста Варбурга, реакции Триндера,«самообнаруживающихся» субстратов и «оптимизированных» методов привело к своеобразной унификации процессов химического анализа различных соединений в биологических жидкостях. Это расширяет возможности небольших лабораторий, поскольку позволяет проводить анализ многих клинически значимых показателей крови на недорогих анализаторах с использованием современных тест-систем. Одним из направлений современной клинической диагностики является стремление к унификации аналитических методов обнаружения анализируемых компонентов Прямой оптический тест Варбурга Непрямой оптический тест Варбурга Определение глюкозы Использование реакции Триндера. Использование «самообнаруживающихся субстратов» Проблемы при анализе: • Хилезных сывороток (0,01%) • Иктеричных сывороток (1%) • Гемолизированных сывороток (0,001%) • Анализ сывороток больных принимающих большие количества витамина С или других восстановителей (цитохром С и другие лекарственные препараты) • Контаминация посуды окислителями (Н2О2, хлорсодержащие дезинфектанты и другие) • Низкая сопоставимость результатов, полученных разными методами в разных лабораториях Сходимость фотометрических данных Сходимость отражает близость друг к другу результатов параллельных измерений, выполненных в одинаковых условиях, и характеризуется в абсолютных значениях средним квадратическим (стандартным) отклонением (σ - «сигма», SD, дисперсия), определяемой по соотношению: Воспроизводимость фотометрических данных Если измерения (или серия измерений) выполнены в различных условиях (в разное время, на разных приборах, различными методами и т. п.), то для оценки близости результатов используют термин «воспроизводимость» Таким образом, для достижения сопоставимости результатов, полученных разными методами в разных лабораториях путем обеспечения метрологической прослеживаемости измерения величин в биологических пробах, необходимо обеспечение единства измерений в лабораторной диагностике. Референсные материалы и референсные методы (ГОСТ Р ИСО 15193-2007 и ГОСТ Р ИСО 15194-2007) Производитель контрольного материала АСТ Парма TruLab Р, Lot No. 11383 (132-210 Е/л) 154 Е/л TruLab N, Lot No. 11382 (18.4-29.4 Е/л) 19.3 Е/л Rendex Lev. 2 (22.3-31.4 Е/л) 29.4 Е/л Rendex Lev. 2 (180-210 Е/л) 201 Е/л Spintrol Pat., Lot. 5561 (119-171 E/л) 118 Е/л Spintrol Normal., Lot. 3569 (38.5-55.5 E/л) 38 Е/л Государственная система обеспечения единства измерений (ГОСТ 8.557-2007) измерительный преобразователь (тест-система) средство измерения (анализатор) Фотометрия Основные принципы Фотометрия – совокупность оптических методов и средств измерения фотометрических величин светового потока. Основным понятием фотометрии является поток излучения, смысл которого в мощности переносимого электромагнитного (оптического) излучения. Спектрофотометрия – определение зависимости фотометрических величин от длины волны излучения. Спектроскопия (или эмиссионный спектральный анализ) – определение излучательной способности веществ в зависимости от длины волны излучения. В аналитической химии и классической лабораторной диагностике широкое применение нашли фотометрические методы количественного анализа, основанные на переведении определяемых компонентов в поглощающее свет соединения с последующем определением их количеств путем измерения светопоглощения растворов. Колометрический и фотометрический методы анализа. Колометрический метод: измерение проводиться без выделения узкого диапазона длин волн, т.е. измеряются характеристики всего светового потока. Фотометрический метод: для измерения выделяется характерный для поглощения данным веществом оптический диапазон и измерение проводится на определенной длине волны. Фотометрический метод является более объективным, чем колометрический, поскольку результаты его менее зависимы от поглощения света другими (интерферирующими) окрашенными веществами. Фотометрический анализ – один из самых старых и распространенных физико-химических методов, для него требуется относительно простое оборудование, в тоже время он характеризуется высокой чувствительностью и возможностью определения большого количества органических веществ. Фотометрические свойства растворенного вещества T+R+A=1 T – коэф-т светопропускания R – коэф-т отражения А – коэф-т поглащения Фотометры – приборы регистрирующие поглощение света веществом (А). Отражательные фотометры - приборы регистрирующие отражение света веществом (R). Фотометрические методы Нефелометрия Изучение способности веществ рассеивать излучение Турбидемитрия Изучение способности веществ пропускать излучение Флуометрия Изучение способности веществ переизлучать поглощенное излучение Примечание: в качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и Б/Х анализаторов, так этот способ не требует особой конструкции прибора. Поляриметрия Изучение изменения степени поляризации излучения, при прохождении его через оптически активные вещества Колометрия Визуальные методы . Наиболее простой пример: скрининговый полуколичественный метод определения гемоглобина по WHO GEMOGLOBIN COLOR SCALE. Содержание гемоглобина оценивается по цвету капли капиллярной крови, помещаемой на бумагу. Цвет крови определяется методом сравнения со шкаой цветности имеющейся в наборе. Другие колометрические визуальные методы: метод разбавления, метод уравнивания интенсивности окраски. Фотоэлектические методы. Терминология. В медицинской литературе часто используется достаточно вольное обращение с терминами физических величин, что объясняется прямым применением англоязычных выражений в русской интерпретации. Как пример можно привести пример когда оптическую плотность называют поглощением или экстинкцией. Термин экстинкция относится к характеристикам процессов рассеивания света, а не поглощения. Изменение в многокомпонентных растворах. Растворы в клинической химии часто представляют собой многокомпонентные системы. При фотометрическом измерении многокомпонентных систем используют принцип аддитивности, согласно которому поглощение отдельного вещества не зависит от других веществ, обладающих собственным поглощением. Поэтому, при данной длине волны оптическая плотность раствора из смеси компонентов, не взаимодействующих между собой, равна сумме оптических плотностей отдельных компонентов при той же длине волны. На рисунке представлены спектры поглощения реактива без белка и с белком. В обоих состояниях, как в свободном, так и в комплексе с белком реактив поглощает, но с разной интенсивностью. Для оценки степени поглощения исследуемого раствора, содержащего какое-либо соединение, проводится сравнение интенсивности потока излучения, прошедшего через этот раствор, с интенсивностью потока излучения, прошедшего через раствор сравнения - бланк. Измерение в максимуме спектральной полосы поглощения. Исследование растворов рекомендуется проводить при длине волны облучения, соответствующей максимальному поглощению. В это случае чувствительность фотометрического исследования так-же максимальна. Закон Бугера Измерение на оптимальной длине волны. Если в многокомпонентной системе два или более компонентов имеют максимум поглощения в одной области, то часто измерение проводиться на оптимальной длине волны, на которой существенно различаются оптические плотности рабочего раствора (бланка) и исследуемого вещества. Пример 1: Определение креатинина по конечной точке. Субстрат реакции, пикриновая кислота, продукт реакции, щелочной пикрат, образующийся в результате реакции Яффе, имеют близкие спектры поглощения. Пример 2: При определении магния методом с ксилидиловым синим, максимум поглощения реагента отмечается при длине волны 540 нм, а комплекса с магнием при длине волны 520 нм. В случае измерения при длине волны 545 (546) нм (часто устанавливаемый фильтр на фотометрах и б/х анализаторах) на фоне ОП рабочего реагента (бланк) будет слабо различима ОП анализируемого образца. Измерение по калибровочной кривой. Возможны 3 варианта калибровочного графика: 1. Вариант А. Калибровочный график имеет вид прямой и проходит через точку 0. В этом случае F=Ci/Di 2. Вариант Б. Имеется систематическая ошибка, которую следует учитывать при расчете фактора. F=Ci/(Di-a). Для построения калибровочного графика на оси абсцисс откладывается концентрация С, а на оси ординат плотность D. На оси D откладывают все полученные значения Di, соответствующие концентрациям Сi. Желательно измерение с холостой пробой, в которой данная ошибка учитывается. 3. Вариант В. Данным калибровочным графиком пользоваться нельзя, так как не определяются низкие концентрации калибратора. Метод сравнения стандартного и опытного образца. Этот метод определения концентрации является наиболее приемлемым, так анализируемая и стандартная проба пробы обрабатываются в одинаковых условиях. Поэтому при больших сериях рекомендуется исследовать стандартную пробу в начале исследования определяя соотношение Сст/Dст, или фактор F. Расчет ведут по стандарту ил фактору. Расчет по стандарту: обозначается в том случае, если используется уравнение: Ci=Di*Cст/Dст, где Ci – искомая величина. Расчет по фактору, случай когда используется уравнение: C=D x F Следует помнить, что в опытной и стандартной пробах должен обрабатываться одинаковый объем образца. Пример: В реакции необходимо использовать 100 мкл образца. В качестве образца используется плазма в том же объеме, но в плазму при ее получении добавляют цитрат в отношении 1:9. Следовательно в 100 мкл плазмы содержится 90 мкл исследуемой биологической жидкости. Это следует учитывать при расчетах, вводя поправочный коэф-т. Прим.: Данный метод расчета справедлив только на линейном диапазоне зависимости ОП от концентрации. Измерение по конечной точке. (End point method) Количеству продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации. Поглощение измеряется после окончании реакции при стабильном уровне сигнала. Реакция, сопровождающаяся изменением фотометрического сигнала, развивается за некоторый период времени и достигает определенного конечного состояния, так называемой конечной точки. Изменение сигнала как функция времени показано на рисунке. При измерении по конечной точке уровень сигнала соответствует При работе с одноканальным фотометром измерение сопровождается значительной систематической ошибкой, связанной с влиянием на конечный результат рабочего реактива, отражением света от стенок кюветы и др. Для исключения влияния этих факторов используют измерение относительно бланка (холостой пробы). Как правило, бланк определяется по рабочему реактиву, т.е. готовому к работе реактиву перед измерением пробы. Оптическая плотность пробы рассчитывается: Dпробы=Dк.точкиDбланка Измерение с дифф. бланком(assay differential blank). Данный тип измерения является разновидностью измерения с бланком. При измерении в одной кювете, когда отсутствует кювета сравнения, сопоставление конечного результата проводят в кювете с рабочим реактивом до момента добавления к нему исследуемой биопробы. Такой способ обычно обозначается как 2-х точечное измерение. Важно при этом, чтобы система при измерении бланка достигла стабильного состояния. При добавлении в реакционную среду нескольких реактивов, бланк определяется при достижении стабильного состояния после внесения всех реактивов перед пробой. Таким образом, бланк – это характеристика, отнесенная к шкале оптической плотности, бланк определяет оптическую плотность рабочего реактива. Двухволновое измерение В отдельных случаях необходимо учитывать интерферирующие (мешающие) факторы, например в случае гемолиза сыворотки или при использовании исчерненных кювет. В таких случаях используют измерение на двух длинах волн. В этом случае измеряется только сигнал, связанный с исследуемым аналитом. Ранговое значение Гемолитичность (DD 576/579) 0(-) <0,002 1(+) 0,002-0,005 2(++) 0,005-0,009 3(+++) >0,009 Двухволновое измерение, в случае, если отсекающая длина волны отстоит от основной не более чем на 100 нм может использоваться для оценки степени гемолитичности пробы. Тем самым, врач может оценить результат с учетом слияния интерферирующих факторов. Кинетические измерения (Kinetic measurement) Кинетическое измерение подразумевает определение меняющейся в ходе реакции оптической плотности. Наиболее широко используется для определения активности ферментов. Кинетическое измерение требует точного поддержания температуры в измерительной кювете, и точного отсчета временных интервалов. Общепринятым считается поддержание температуры в измерительной ячейке ±0,2°С. Кинетические измерия проводят при следующих температурах: 25, 30, 37 °С. Фактор температуры тоже следует учитываь, так как он вносит существенные измерения в показатели активности ферментов. Виды кинетических реакций: А – скорость постоянна в течение всего периода времени. Б – скорость реакции постоянно снижается, рекомендуется оценивать активность но начальной скорости B – линейный участок (по которому определяется активность) устанавливается в середине периода инкубации Приборы и компоненты для фотометрического анализа. Фотометр – оптический прибор, позволяющий измерять световой поток на фиксированных длинах (диапазонах) волн. Основные компоненты одноканального фотометра Приборы и компоненты для фотометрического анализа. Спектрофотометр – оптический прибор, который разлагает световой поток на непрерывный спектр и позволяет измерять его на любой длине волны в пределах оптического диапазона. Основные компоненты спектрофотометра Источники света. Лампы. Галогеновые лампы: по структуре аналогичны лампам накаливания, но содержат в газе наполнителе добавки галогенов (бром, хлор, фтор, йод) или их соединения. В галогеновых лампах также используются инертные газынаполнители. Использование инертных газов значительно уменьшает испарение вольфрама и увеличивает время работы лампы. (PD303, PD303S, PD303UV) Преимущества: отсутствие помутнения лампы, увеличенный срок службы, компактный размер. Недостатки: дороговизна, необходимость заказывать лампы у производителя оборудования. Источники света. Лампы. Дейтериевые лампы: представляет собой стеклянную трубку с кварцевым окошком, содержащую анод и катод, заполненную газом дейтерия. Эти лампы относятся г газосветным источникам с дуговым зарядом. Они дают непрерывный спектр в УФ-области (185-360 нм) (PD-303UV) Преимущества: возможность работы в УФ диапазоне. Недостатки: дороговизна, необходимость заказывать лампы у производителя оборудования. Светодиод: полупроводниковый прибор, электрическую преобразующий электрическую энергию в энергию оптического излучения. (AP-700, HG-202) Преимущества: возможность выбора светодиода с нужным спектром излучения. Недостатки: невозможность широкого применения Фильтры Стеклянный абсорбционный фильтр. Стеклянный абсорбционный фильтр: самый простой тип фильтра, это тонкое цветное стекло. Обычно стеклянные фильтры из цветного стела имеют спектральную полосу более 50 нм и относятся к широкополосным фильтрам. (AP-101, AP-700, HG-202) Преимущества: дешевизна, простота изготовления. Недостатки: не является монохроматором, пропускает свет в относительно широком диапазоне волн. Фильтры. Узкополосные интерференционные фильтры. Узкополосный интерференционный фильтр: Обеспечивают точную установку длины волны. В современных б/х анализаторах наиболее распространены фильтры с габаритным диаметром 12,7 мм и световой зоной (диаметр светопропускания) 8 мм (SF1904+, SF3300). Конструкция фильтра: Интерференционное покрытие наносится на одну из двух подложек из плавленого кварца. Подложки монтируются в металлическую оправу. Между положками находится инертный газ , обеспечивающий защиту и стойкость дифракционного покрытия. Конструкция фильтров видимого диапазона более проста, так как требования к фильтрам не столь жесткие. Инертный газ в них не используется. Преимущества: Является монохроматором. Обеспечивают достаточно установку длинны волны ±2 нм; спектральная полоса 10 нм ± 1 нм, подавление постороннего света в диапазоне от 100 до 1200 нм (кроме рабочей полосы пропускания). Недостатки: сложность изготовления, дороговизна. Монохроматоры. Дифракционная решетка. Монохроматор: оптическая система для выделения узких участков спектра излучения с заданной длинной волны (PD-303, PD303S, PD303UV). В спектральных приборах высокого класса применяются дифракционные решетки. Вне зависимости от способа изготовления решетки представляют собой периодические структуры (полосы или штрихи). Качественные решетки должны содержать не менее 1 000 линий/мм для точной установки заданной длинны волны. При падении на решетку белого света за решеткой возникает разложенный по цветовым пучкам свет, т.е. решетка разлагает свет на спектральные составляющие. Преимущества: возможность установки практически любой длинны волны. Недостатки: дороговизна, сложность изготовления. Metrolab, Argentina • • • • • Metrolab это компания которая разрабатывает и производит биохимические анализаторы самостоятельно осуществляя весь технологический процесс с момента проектирования до момента изготовления и продвижения на рынке. + гибкий подход к продвижению продукта на мировом рынке + удобные в использование + обеспечение гарантийного и постгарантийного сервиса + конкурентоспособные цены Биохимические анализаторы // Metrolab история развития 305 330 315 1985 1600 PLUS 1990 2100 1995 1600 DR 1600 DRK 2300 4000 2000 2005 // Основная линейка продукта 60-250+ patients/day 600 test/hr 600 test/hr 20-60+ patients/day 280 test/hr 400 M4000 10-40 patients/day 240 test/hr 200 semiautomatic M2300v4 M2300GL M1600DRv3 Маленькая лаборатория ветеренары Средние лаборатории Крупные лаборатории METROLAB 2300 PLUS version 4 Version 4 Полностью автоматический анализатор свободного доступа • • • • • • • • • Высокая пропускная способность до 240 фотометрический тестов в час; Загрузка до 48 тестов внутрь устройства; Автоматическая очистка датчика и детекция столкновений; Перемешивающее устройство на датчике; 48 проб в устройстве, непрерывная загрузка; 9 длин волн: 340–750нм; Автоматическое разведение проб; Низкое потребление воды; Контроль качества. Version 4 Samples -лоток для проб с 48 позициями для основных пробирок, пробирки диаметром 13мм, длина 75–100мм, принимает микроконтейнеры; - диапазон объема пробы: 2–100мкл; - нанесение штрих-кодов на образцы и реагенты; - непрерывное охлаждение в течение 24 часов; Version 4 Reagents охлажденные реагенты в 48 позициях; - контейнеры для реагентов: 50мл и 20мл; - нанесение штрих-кодов на образцы и реагенты; - непрерывное охлаждение в течение 24 часов; Version 4 Моющая станция • 4-шаговый вошер реакционных кювет • Автоматическая проверка кювет • PMMA кюветы с оптическим путем 6мм Version 4 Multifunction probe • Mixer on probe • Collision detector • Capacitive liquid level detection • Effective probe washing Version 4 Optical system • Double beam • 9 interference filters: 340, 405, 505, 550, 590, 650, 700 and 767 nm. • Optional filters available (380 and 620 nm ) Version 4 Software • User friendly • Flexible • Designed for the clinical analyst • Continuous upgrade meeting your requirements Clinical Chemistry Analyzers METROLAB 2300 GL METROLAB 2300 GL Quick cuvette load • Simple and Fast • Double tray • One tray in use (80 cuvettes) • Preloaded tray ready to use METROLAB 2300 GL Quick cuvette load • Simple and Fast • Double tray • One tray in use (80 cuvettes) • Preloaded tray ready to use Биохимический анализатор Metrolab 1600 • Графический дисплей и термальный принтер; • Конечная точка; • Кинетика; • Свертывание; • Иммунотурбидиметрия; • Линейные и нелинейные методы; • Измерение по точке отсечения; • Контроль качества; • Двойной держатель с установленной термостатированной проточной микроячейкой • и держателем для стандартных и полумикрокювет. Спасибо за внимание! Успехов Вам в работе!
