Проницаемость гематосаливарного барьера
реклама
На правах рукописи УДК 616.314.17.18-092:616.8-008.615-085: [615.84:612.592] Малышева Галина Викторовна Структурно-функциональное состояние гематосаливарного барьера при стрессиндуцированных изменениях в пародонте под влиянием ритмических гипотермических воздействий (экспериментальное исследование) 14. 00. 21 – «Стоматология» 14. 00. 16 – «Патологическая физиология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2009 2 РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ РОСЗДРАВА» И ГОУ ВПО «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ РОСЗДРАВА» Научные руководители: Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Сергей Васильевич Чуйкин Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Александр Ильич Воложин Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, Юрий Михайлович Максимовский ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» Доктор биологических наук, профессор Инга Алексеевна Вальцева Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Ведущее учреждение – ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (ЦНИИС и ЧЛХ) Защита состоится «__» _______ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.03 при ГОУ ВПО «Московском государственном медикостоматологическом университете» по адресу: 127006, Москва ул. Долгоруковская д. 4. Почтовый адрес: 127473 Москва ул. Делегатская 20/1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московского государственного медико-стоматологического университета» (127206 Москва ул. Вучетича д. 10а). Автореферат разослан « » Ученый секретарь диссертационного Совета, 2009 года. 3 Актуальность проблемы Среди научных проблем, касающихся этиологии и патогенеза болезней человека и, в том числе пародонта, группа ВОЗ признала актуальными исследования влияния на организм эмоционального стресса (ДмитриеваТ.Б., Воложин А.И.,2001). Стоматологи и патофизиологи убедительно доказали важную роль дистресса в динамике развития заболеваний пародонта (Тарасенко и соавт., 2000). Дистресс (от греч. dys – приставка, означающая расстройство + англ. stress – напряжение) — стресс, связанный с выраженными негативными эмоциями и оказывающий вредное влияние на здоровье (Гринберг Д., 2002; Селье, 1979). Механизмы действия хронического психо-эмоционального стресса на организм изучается с использовангием новейших методов исследования. В том числе, имеются фундаментальные заболеваний пародонта при длительным стрессорным исследования дизадаптации воздействием. по патогенезу организма, Одним вызванного из важнейших патогенетических механизмов поражения тканей пародонта при стрессорных воздействиях является активизация процессов свободнорадикального окисления липидов, входящих в мембраны клеток, в результате чего образуются эндоперекиси (Тарасенко Л.М., Петрушанко Т.А.,1999). Следствием этого болезнетворных нарушения факторов при является всем многообразии повышение действия проницаемости биологических мембран и нарушение микроциркуляции, т.к. именно в сосудистой стенке наиболее низок темп биоферментативного окисления (Суражев Б.Ю., 1999). Традиционные методы лечения воспалительных заболеваний пародонта направлены на устранение основного причинного фактора - микробного зубного налета, контроль за его образованием, использование антимикробных, противовоспалительных совершенствование средств хирургических местного методов и общего устранения применения, инфекционно- 4 деструктивного очага в пародонте. Однако они не всегда достаточно эффективны и не могут исключить обострения патологического процесса. Поэтому ведутся интенсивные поиски средств и методов, направленных не только на конкретные патогенетические звенья развития воспалительного процесса в пародонте, но и на повышение устойчивости организма к стрессорному фактору, в первую очередь, к эмоциональному дистрессу. Следует ожидать, что средства, направленные на повышение устойчивости организма к эмоциональному стрессу, могут оказаться эффективными и при комплексном лечении патологии пародонта. К таким методам относится так называемая резонансная терапия, когда с лечебной целью используют различные виды сенсорной стимуляции с частотными параметрами, соответствующим индивидуальным биоэлектрическим осцилляторам. В клинических работах киевской школы стоматологов показана эффективность использования в стоматологической практике прерывистых контрастных эмпирический характер температурных выбора параметров воздействий. лечебной Однако гипотермии ограничивает возможности ее применения. Основные механизмы действия на организм ритмической гипотермии, в том числе, и при эмоциональном стрессе, связаны с адаптивным эффектом таких процедур посредством регуляции проницаемости гистогематических барьеров для вегетотропных веществ, что приводит к нормализации симпато-парасимпатических отношений (Ашмарин И.П. и соавт. 1989; Бабийчук Г.А. и соавт., 2002). Представлялось актуальным использовать некоторые режимы ритмической гипотермии для лечения тех болезней пародонта, которые связаны с нарушениями барьерных механизмов, в частности гематосаливарного барьера (ГСБ). Концепция ГСБ была разработана в конце прошлого века московской стоматологической школой (Петрович Ю.А. и соавт., 1988) и продолжает плодотворно развиваться (Денисов А.Б. и соавт., 2005). Исследований по эффективности примененеия резонансной терапии для лечения патологии пародонта на фоне эмоционального стресса до 5 настоящего времени проведено не было, поэтому внедрять этот немедикаментозный метод в клинику, возможно, после его предварительного доклинического изучения. Актуальность этой проблемы опеределяется еще и «перенасыщенностью» организма человека фармакологическими препаратами. Цель Применить в эксперименте ритмические гипотермические воздействия для нормализации функции гематосаливарного барьера на фоне стрессиндуцированного поражения тканей пародонта. Задачи 1. Оценить структурно-функциональные различия элементов гематосаливарного барьера у крыс с разным балансом вегетативной регуляции путем фармакологической стимуляции, а также стрессовых и гипотермических воздействий на основании фрактальной размерности трехмерной архитектоники слюнных желез и их биоэлектрической активности. 2. Определить характер морфологических изменений в слюнных железах у животных с разным балансом вегетативной регуляции под влиянием эмоционально-болевого стресса и ритмических гипотермических воздействий. 3. Изучить локальные структурные изменения в пародонте у крыс под влиянием эмоционально-болевого стресса и ритмических гипотермических воздействий по показателям светового, электронно-микроскопического исследования и фрактальной размерности соединительнотканной основы эпителиального слоя. 4. Показать направленность изменения гематосаливарного барьера для эмоционально-болевом воздействиях у животных. стрессе 3 коэффициента Н-ацетилхолина и и ритмических проницаемости С-адреналина при 14 гипотермических 6 5. Определить режимы ритмических гипотермических воздействий, при которых нормализуется функциональное состояние гематосаливарного барьера, нарушенного в результате симпатической и парасимпатической фармакологической нагрузки и эмоционально-болевого стресса у экспериментальных животных с различной вегетативной регуляцией. Научная новизна Впервые установлено, что эмоционально-болевой стресс и ритмические гипотермические воздействия вызывают различные морфологические изменения в слюнных железах у животных с разным балансом вегетативной регуляции. При стрессе в группе крыс с преобладанием парасимпатической регуляции значения морфометрических показателей такие же, как и при ацетилхолиновой стимуляции, в группе с преобладанием симпатической регуляции - как при адреналиновой стимуляции, у крыс с равновесным вегетативным статусом развивается усредненная реакция на фармакологическую вегетативную нагрузку. Ритмические гипотермические воздействия напротив вызывают в слюнных железах у животных «симпатической» группы парасимпатический, а у «парасимпатической» группы – симпатический структурный ответ. Научной новизной отличаются данные о том, гипотермические что эмоционально-болевой воздействия приводят к стресс и ритмические идентичным структурным изменениям в мягких тканях пародонта, но изменяется фрактальная размерность соединительнотканной основы пародонта и гематосаливарного барьера для Н-ацетилхолина 3 и проницаемость С-адреналина. 14 Ритмические гипотермические воздействия нормализуют функциональное состояние гематосаливарного барьера, нарушенное в результате симпатической и парасимпатической фармакологической нагрузки. Практическая ценность Структурно-функциональные различия элементов гематосаливарного барьера связаны с разным балансом вегетативной регуляции и могут быть 7 выявлены путем фармакологической стимуляции с определением биоэлектрической активности ткани. Эмоционально-болевой стресс и ритмические гипотермические воздействия вызывают изменения слюнных желез в зависимости от баланса вегетативной регуляции. При эмоциональноболевом стрессе и ритмических гипотермических воздействиях наблюдается 1,5-2-кратное увеличение проницаемости гематосаливарного барьера для 3Нацетилхолина и коэффициентов 14 С-адреналина, проницаемости однако при нарушаются, стрессе тогда соотношения как в динамике ритмических гипотермических воздействий колебания проницаемости носят согласованный характер. Ритмические гипотермические нормализуют функциональное состояние нарушенное в симпатической результате фармакологической нагрузки. воздействия гематосаливарного Практически и барьера, парасимпатической важно, что режимы гипотермических воздействий зависят от типа вегетативной регуляции: при преобладании парасимпатической вегетативной регуляции – эффективные режимы охлаждения составляют 3 односекундных стимула/мин, с равновесным вегетативным статусом – 6, а при преобладании симпатической вегетативной регуляции – 12 стимула/мин. Применение данных режимов холодовых воздействий архитектоники и устраняет проницаемости стресс-индуцированные гематосаливарного нарушения барьера и их целесообразно испытать в лечебной практике у пациентов с разными типами вегетативной регуляции. Личный вклад соискателя Все разделы диссертации написаны автором самостоятельно. Самостоятельно выполнена экспериментальная часть работы, трехмерная реконструкция и фрактальный анализ - совместно с канд. биол. наук Марченко В.С. Статистическая обработка и интерпретация данных проведены лично автором. Вместе с научными руководителями проф. С.В. Чуйкиным и проф. А.И. Воложиным сформулированы выводы. 8 Апробация результатов диссертации Результаты исследований представлены на конференции молодых ученых «Биология - наука ХХІ столетия» (Пущино, Россия, 2006), всероссийском конгрессе и республиканской конференции стоматологов РБ (Уфа, РБ 2007, 2008 г.). Работа была обсуждена на совместном заседании кафедр стоматологии детского возраста, терапевтической стоматологии и кафедры пропедевтики и физиотерапии стоматологических заболеваний Башкирского государственного медицинского университета и на межкафедральном совещании кафедр патологической физиологии стоматологического факультета и кафедры госпитальной терапевтической стоматологии МГМСУ Росздрава. Внедрение. Материалы диссертации используются с мая 2007г. в учебной работе кафедры патологической физиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава для студентов 4 курса на лекциях и практических занятиях при изложении темы: Патофизиология слюнных желез. По диссертационной работе Г.В. Малышевой внедрены и используются в лекционном курсе материалы (диаграммы, слайды) для студентов, интернов и ординаторов Университета. Публикации. Основные положения диссертации изложены в 8-ми работах, из которых одна монография и две статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах формата А4 и состоит из введения, обзора литературы, 5 разделов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы (21 страница), который включает 228 первоисточника. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 53 рисунками. 9 Материалы и методы исследования В экспериментах использовали белых крыс массой 200-250 г. Все манипуляции с животными, кроме особо оговоренных, выполняли под наркозом (внутрибрюшинное введение тиопентала натрия, 2 мг на 100 г веса). Экспериментальные животные были разделены на 3 группы: S – с доминированием симпатической вегетативной регуляции, Р – с преобладанием парасимпатической регуляции и М – со слабосимпатическим или равновесным вегетативным статусом (Гемонов В.В. и соавт., 1997). Разделение проведено на основе математического анализа электрокардиограммы по программе «Поли Спектр Ритм», в которой производится математический анализ изменений длительности R-R интервалов ЭКГ. В работе применён спектральный анализ вариаций сердечного ритма и методика вариационной пульсометрии, позволяющая оценить степень устойчивости организма к стрессовым воздействиям. Проведено 4 серии экспериментов. В 1-й серии (90 крыс) изучены последствия эмоционально-болевого стресса, а также симпатической (введение адреналина) и парасимпатической (введение ацетилхолина) фармакологической стимуляции на структурно-функциональное состояние элементов гематосаливарного барьера – мягких тканей пародонта, поднижнечелюстной и подъязычной слюнных желез крыс S, P и М групп. Во 2-й серии (90 крыс) изучено влияние ритмических гипотермических воздействий на структурно-функциональное состояние элементов ГСБ крыс S, P и М групп. В 3-й серии (90 крыс) исследовано влияние РГВ на структурно-функциональное состояние элементов ГСБ животных S, P и М групп после ЭБС, а также симпатической и парасимпатической фармакологической стимуляции. В 4-й серии (60 крыс) изучены отдалённые последствия действия ЭБС, РГВ на структурно-функциональное состояние элементов ГСБ. Очаговые поражения в мягких тканях пародонта у крыс моделировали методом среднедлительного (28 сут.) хронического эмоционально-болевого 10 стресса (Тарасенко Л.М., Петрушанко Т.А., 2000). Группе животных (без наркоза) наносили болевые раздражения электрическим током (15 с – воздействие, 45 с – перерыв) в течение 30 мин в каждый из 20 рабочих дней. Порог чувствительности определяли индивидуально. Ритмические гипотермические воздействия проводили на установке, состоящей из электрогенератора, подключенного к планшетному потенциометру, у которого каретка с пером была заменена шторкой для прерывания потока холодного воздуха (4-60C), поступающего от промышленного гипотермогенератора в пластиковые камеры с животными на протяжении 120 минут с разной (5,10,20) скважностью односекундных холодовых стимулов. Использовали три режима РГВ: 0,05 РГВ – 3 стимула в минуту (0,05 стимула/сек.); 0,1 РГВ – 6 ст./мин (0,1 ст./сек); 0,2 РГВ – 12 ст./мин (0,2 ст./сек). Выбранные режимы РГВ вызывали колебания температуры тела ненаркотизированных крыс в пределах 10 С и по этому показателю достоверно не отличались друг от друга, приводя к снижению температуры ротовой полости на 1,2±0,60 С; ушного канала на 0,9±0,40 С; ректальной на 0,6±0,20 С. Температуру измеряли цифровым инфракрасным термометром IR 1DE1 Microlife (Швейцария). Препарирование образцов тканей десны и слюнных желез для световой микроскопии полутонких микроскопии ультратонких общепринятыми срезов методами. глутаральдегидом и 1% и срезов трансмиссионной проводилось Фиксация буферным тканей раствором в электронной соответствии осуществлялась четырехокиси с 3% осмия. Обезвоживание проводили в этаноле возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне. Образцы заключались в смесь смол эпон-аралдит (Fluka). Серийные ультрамикротоме полутонкие УМТП-6, (0,5 мкм) окрашивали срезы изготавливали толуидиновым синим на и метиленовым синим, фотографировали на микроскопе МБР-3 с помощью цифровой видеокамеры изготавливали на Panasonic WV-CP ультрамикротоме 470. Ультратонкие УМТП-4, срезы контрастировали 11 уранилацетатом и цитратом свинца, просмотр и фотографирование осуществляли в электронных микроскопах ПЭМ-125К и ЭМВ-100БР при ускоряющем напряжении 75 Кв. Для морфометрической обработки данных и трехмерной реконструкции использовали программный пакет 3D Studio Max 8.0 и компьютерную систему анализа FRAM-М v.3.0. Сканированные фотографии препаратов для оптической и электронной микроскопии (или изображения, полученные цифровой видеотехникой) как рисунки с расширением bmp., загружали в вычислительную среду программы, при помощи автофигур разного цвета обводили анализируемые контуры структур. Затем производили точную заливку площадей и вычисляли требуемые значения и соотношения длин, площадей, углов автофигур с полной статистической обработкой в реальном масштабе метрических величин. Для фрактального анализа в среду FRAM переносятся фрагменты анализируемых изображений биообъектов и, реализуя математический аппарат, всё чаще применяемый в морфометрии (Державин Д.К. и соавт., 2001), вычисляли фрактальные размерности объектов с их статистической оценкой. Запись ЭКГ осуществлялась на электроэнцефалографе “Bioscript-1” во 2м стандартном отведении - на правой передней и левой задней конечностях. По кардиограмме определяли частоту сердечных сокращений с последующей математической обработкой 100-500 кардиоинтервалов. Проводили вариационную пульсографию и спектрально-корреляционный анализ ЭКГ. Рассчитывали следующие показатели: моду (Мо), амплитуду моды (Амо), вариационный размах (ΔХ), индекс напряжения регуляторных систем (ИН= Амо/2ΔХ х Мо), индекс вегетативного равновесия (ИВР=Амо/ΔХ), вегетативный показатель ритма (ВПР=1/ Мо х ΔХ). Биоэлектрическую коаксиальными активность миографическими (БА) элементов электродами ГСБ отводили фирмы Medicor, расположенными в полости рта у выводных протоков поднижнечелюстной и 12 подъязычной слюнных желез (расстояние между отведениями 1 мм) и регистрировали на энцефалографе BST-1 и компьютерном энцефалографе. Дискретизированную (256 Гц) БА анализировали на компьютере, оценивая динамику фрактальной размерности (D) и показателя Херста (Н), которые связаны соотношением D = 2-H (при размерности вложения dir = 2). В работе приняты допущения и ограничения, связанные с выбранными методами. Проницаемость ГСБ для 3Н-ацетилхолина (3Н-АХ) и 14С-адреналина (14СА) изучали радиоизотопным методом с использованием push-pull канюли, рабочая поверхность которой находилась в полости рта у выводного протока поднижнечелюстной слюнной железы. Меченый нейромедиатор вводили в кровяное русло и одновременно со сбором перфузата или забором ткани брали кровь из хвостовой вены животного. Коэффициент проницаемости ГСБ определяли отношением содержания меченного тритием нейромедиатора в перфузате (с учетом уровня захвата нейротрансмиттера) или ткани. Статистическую обработку полученных результатов кроме указанных выше специальных случаев проводили с применением критерия Стьюдента-Фишера. Животных выводили из эксперимента декапитацией под наркозом на 20-й день ЭБС, 14-й и 21-й дни после ЭБС, непосредственно после РГВ, на 7-й день после ЭБС с РГВ. Результаты и обсуждение Данные морфологических исследований контрольных животных трех групп (S, P, M) свидетельствовали об отсутствии значимых типологических различий в структуре эпителия, что было подтверждено фрактальным анализом послойного сканирования изображений полутонких срезов мягких тканей пародонта. В роговом слое эпителия, в зернистом и шиповатом слоях наблюдалось чередование эвклидовых и персистентных областей, однако они четко не ограничены. 13 У животных всех групп ЭБС не вызывала видимых патологических изменений тканей пародонта с сохранением слизистой оболочки десен и опорного аппарата зубов. При морфологическом изучении тканей десны при ЭБС вне зависимости от вегетативного статуса животных выявлен комплекс изменений в кровеносных сосудах микроциркуляторного русла. При этом страдают все компоненты сосудистой стенки, прежде всего, эндотелиоциты, у которых возникают наиболее выраженные реактивные изменения. Наряду с этим отмечены вариации базальной мембраны сосудов, перицитов и перикапиллярного пространства, нарушение целостности плазмолеммы эндотелиальных клеток, как со стороны просвета, так и базальной мембраны. Отмечено также формирование дефектов в местах контакта периферических частей эндотелиальных клеток, что может приводить к изменениям проницаемости ГСБ. На полутонких срезах тканей десны у животных всех групп выявлялись очаговые нарушения целостности эпителия, слущивание рогового слоя, трещины, пронизывающие все эпителиальные слои. Применение РГВ в значительной мере уменьшало степень очаговых нарушений целостности эпителия и способствовало его восстановлению уже к 7-м суткам после ЭБС (без РГВ последствия ЭБС сохраняются до 14 суток). Эффективными режимами РГВ оказались: для групп S – 0,2 РГВ; P – 0,05 РГВ, M – 0,1 РГВ. Разобраться в структурных механизмах РГВ позволило только сочетание методов фрактального анализа и трёхмерной реконструкции изображений серийных полутонких срезов эпителия десны. Этот метод позволил математически обосновать факт быстрого восстановления ГСБ нарушенного воздействием ЭБС. Визуальный анализ препаратов полутонких срезов слюнных желез (поднижнечелюстная, подъязычная) не выявил отличий у контрольных животных групп S, P и M. Поскольку и морфометрическая оценка секреторных элементов изученных желез не показала достоверных отличий у животных с различным вегетативным статусом, была применена 14 фармакологическая нагрузка. Установлено, что общим структурным компонентом реакции слюнной железы на вегетативную стимуляцию (как при введении А, так и АХ) было увеличение диаметра ацинусов, высоты серицитов и повышение их количества в состоянии дегрануляции при уменьшении просвета исчерченных и внутридольковых протоков. Отличия структурных изменений заключалась в том, что если при парасимпатической стимуляции внешний диаметр вставочных протоков увеличивался, а его просвет не изменялся, то при симпатической стимуляции, наоборот, диаметр не изменялся, а просвет увеличивался. Кроме того при действии АХ уменьшался внешний диаметр и просвет исчерченных протоков, а во внутридольковых протоках внешний диаметр увеличивался при сужении просвета, тогда как при введении А, наоборот согласованно уменьшался внешний диаметр и просвет внутридольковых протоков, а у исчерченных – сужался просвет при увеличении диаметра. Изменения линейных морфометрических параметров секреторных элементов поднижнечелюстной слюнной железы крыс групп S и Р имели однонаправленный характер при введении АХ и достоверно не отличались от группы М. Характерно, что у животных группы Р наблюдалась тенденция более выраженных изменений некоторых морфометрических показателей, тогда как у животных группы S изменения изученных показателей были менее выражены по сравнению с группой М. В отличие от действия АХ, при введении А у животных с преобладанием симпатической вегетативной регуляции наблюдались более выраженные вариации морфометрических показателей. Влияние фармакологических нагрузок на слюнные железы, которые отмечались при визуальном анализе препаратов, как тенденции методами традиционной морфометрии, четко проявились при фрактальном анализе образцов. Наиболее лабильной в этом смысле являлась поднижнечелюстная железа у животных с парасимпатическим статусом, а наименее лабильной – подъязычная слюнная железа у животных с симпатическим статусом. 15 Симпатическая фармакологическая стимуляция повышала хаотичность структуры железы у всех групп животных, особенно у группы Р, оставаясь в персистентной, самоподдерживающейся, области. При ЭБС происходила реорганизация структуры ткани слюнных желез по морфометрическим показателям более близкой у группы P к ацетилхолиновой стимуляции, S – к адреналиновой и подобная «усредненной» реакции на фармакологическую вегетативную нагрузку - у животных группы M. Тогда как РГВ вызывают у животных S группы - парасимпатический, а у группы Р - симпатический структурный ответ. Характерной особенностью действия ЭБС является отслоение эпителиоцитов внутридольковых и междольковых протоков с образованием в просветах этих протоков сетчатой структуры с гексагональными ячейками, соответствующими по форме апикальной поверхности эпителиальной выстилки протока. Холодовые воздействия приводят к идентичной морфологической картине, а специфика РГВ выявляется только при трёхмерной реконструкции и фрактальном анализе серийных полутонких срезов препаратов слюнных желёз. Так, структура внешней поверхности протоков может не отличаться от контроля ни при ЭБС, ни при РГВ, тогда как внутренняя поверхность претерпевает при обоих воздействиях существенные и кардинально отличающиеся друг от друга изменения. При ЭБС внутренние складки, располагаясь беспорядочно, практически полностью перекрывают просвет протоков. Эмоциональноболевой стресс и ритмические гипотермические воздействия влияют на структурную упорядоченность и суммарную биоэлектрическую активность ГСБ, что было показано с использованием спектрально-корреляционного анализа ЭЭГ. Результаты наших экспериментов показали, что при РГВ и ЭБС наблюдаются значительные изменения синхронизации суммарной биоэлектрической активности ткани (БАТ), особенно в секундном диапазоне частот, протекающие с разной интенсивностью, но по сходному сценарию. Продолжение охлаждения приводило к возрастанию пространственной 16 синхронизации БАТ. квазисинусоидальный В биоэлектрической секундный ритм, активности мощность доминирует спектра которого повышается почти в 1,5 раза. Динамические изменения пространственной синхронизации секундного ритма БАТ свидетельствуют о повышении активности медленной управляющей системы мозга. Кардинальная перестройка паттернов БАТ происходила и в результате ритмических холодовых воздействий при фармакологических нагрузках. Значения функций автокорреляции и когерентности в секундном диапазоне частот варьировали от околонулевых до предельных с многократными перепадами мощности спектра БАТ. Несмотря на широкое использование спектрально-корреляционного анализа биоэлектрической активности, его применение не всегда корректно для не гауссовых процессов. Динамика биоэлектрической активности железистых тканей ротовой полости, как правило, не линейна, очевидно, не эргодична, не гауссова и обладает внутренней структурой особенно при функциональных нагрузках. У животных с различным вегетативным статусом нами был рассчитан показатель Херста (Н) для БАТ, тесно связанный с фрактальной размерностью (табл. 1) Таблица 1 Изменения показателя Херста биоэлектрической активности Вид воздействия Группы S M P Контроль АХ АХ+А 0,95 (0,03 0,85 (0,01 0,75 (0,01 0,75* (0,03 0,65* (0,04 0,35* (0,01 0,85* (0,02 0,75* (0,03 0,45* (0,03 АХ+А+ АХ+А+ АХ+А+ 0,05 РГВ 0,1 РГВ 0,2 РГВ 0,75* (0,01 0,75* (0,01 0,75* (0,01 0,8* (0,02 0,85 (0,04 0,6* (0,03 0,95 (0,01 0,7* (0,03 0,8* (0,02 0,2 РГВ 0,1 РГВ 0,05 РГВ 0,7* 0,9 0,85 (0,03 (0,03 (0,06 0,85 0,6* 0,78 (0,01 (0,04 (0,07 0,75 0,4* 0,35* (0,01 (0,01 (0,03 АХ - введение ацетилхолина; АХ+А - введение адреналина на фоне действия ацетилхолина; АХ+А+0,05РГВ, АХ+А+0,1РГВ; +АХ+А+0,2РГВ - разные режимы РГВ на фоне введения ацетилхолина и адреналина; * - различия по сравнению с контролем достоверны, Р<0,05. 17 Функциональное состояние ГСБ электрофизиологическим критериям лабильности. высокую Наиболее у контрольных характеризуется хаотическую животных разной по степенью составляющую имеют животные с парасимпатическим статусом, а наименьшая лабильность характерна для животных с симпатическим статусом. Однако для всех групп животных показатель Н находился в персистентной области. Под влиянием АХ уровень хаотичности БАТ возрастал у всех групп животных, особенно у животных с парасимпатическим статусом, где показатель Н уходил в антиперсистентную область. На этом фоне действие А снижало, но не нормализовало уровень хаотичности БАТ. В группе Р показатель Н оставался в антиперсистентной области. Применение РГВ восстанавливало (по критерию Н) исходную геометрию функциональной архитектоники ГСБ. Следует отметить, что для разных групп животных эффективными оказались различные режимы РГВ. Для крыс с преобладанием парасимпатической вегетативной регуляции – с частотой 3 стимула/мин, для крыс с равновесным вегетативным статусом – 6 стимула/мин, а для животных с симпатическим статусом – с частотой 12 стимула/мин. В результате эмоционально-болевого стресса и ритмических гипотермических воздействий происходили ультраструктурные изменения проницаемости гематосаливарного барьера, которые в определенной степени объясняют, как гипотермическое воздействие нивелирует морфофункциональные изменения, вызванные действием гипотермией и заключающиеся в коррекции проницаемости гематоэнцефалического барьера. Показано, что в динамике РГВ происходило повышение уровня и усиление колебаний проницаемости ГСБ, но характерное соотношение коэффициентов проникновения 3Н-АХ и 14 С-А для крыс с разным балансом вегетативной регуляции оставалось постоянным (табл. 2) При ЭБС также происходили изменения проницаемости, однако они носили 18 несогласованный характер, при котором нарушается закономерность соотношений КП для 3Н-АХ и 14С-А у животных разных групп. Таблица 2 Проницаемость гематосаливарного барьера Группы животны Веществ а х е значения 14А M 3Н-АХ 14А S 3Н-АХ 14А P 3Н-АХ Вид воздействий Контрольны ЭБС 0,2РГВ 0,1РГВ 0,05РГВ ЭБС +РГВ 0,35 0,75 0,66 0,67 0,67 0,37 0,06 0,07* 0,07* 0,04* 0,04* 0,04 0,33 0,85 0,68 0,69 0,71 0,33 0,05 0,05* 0,05* 0,07* 0,07* 0,07 0,45 0,74 0,72 0,71 0,73 0,49 0,02 0,03* 0,03* 0,03* 0,03* 0,02 0,35 0,78 0,61 0,61 0,64 0,36 0,03 0,04* 0,04* 0,04* 0,04* 0,05 0,35 0,83 0,65 0,65 0,69 0,38 0,02 0,02* 0,02* 0,02* 0,02* 0,02 0,43 0,75 0,75 0,73 0,78 0,45 0,05 0,01* 0,01* 0,01* 0,01* 0,02 * - различия в сравнении с контролем достоверны, Р<0,05 РГВ способны нормализовать структурно-функциональное состояние элементов гематосаливарного барьера, восстанавливая селективную проницаемость, причём и в этом случае для животных с различным вегетативным статусом эффективны разные ритмы гипотермических воздействий, находящихся в пределах 3-12 стимулов в 1 мин. Нарушение баланса биоактивных веществ при ЭБС может быть не только причиной, но и следствием структурно-функциональных изменений элементов ГСБ. В последние годы в биологии формируется новое научное направление, позволяющее количественно оценивать уровень лабильности 19 функциональной архитектоники систем организма по показателям мультифрактальной размерности. Расчёт размерности препаратов показал, что в широком масштабе величин (увеличение: 120 - 12000) архитектоника слюнных желез имеет фрактальные свойства, характеризуется определённым уровнем хаотичности с персистентной, то есть самоподдерживающейся динамикой. Примечательно, что после РГВ хаотичность архитектоники желез повышалась, движения оставаясь, в согласно персистентном теории обобщенного диапазоне. броуновского Обнаруженные изменения ультраструктуры наиболее выражены в поднижнечелюстной железе по сравнению с подъязычной железой. Более значительные сдвиги отмечены нами в ультраструктуре эндотелиоцитов, их плотных контактов и окружающей сосуд базальной мембраны. На 15-й мин РГВ происходило некоторое уменьшение толщины базальной мембраны, на 65-й - этот показатель увеличивался и к 120-й мин. РГВ на 30-40 % превышал контрольные значения. Интересно отметить, что в капиллярах поднижнечелюстной железы толщина базальной мембраны увеличивалась на 30-40 % больше, чем в капиллярах подъязычной железы. Гель базальной мембраны, образованный глюкозаминогликанами в составе протеогликанов, создает молекулярный и электростатический фильтр, обеспечивающий селективную проницаемость мембраны для отрицательно заряженных молекул. Это позволяет рассматривать базальную мембрану в качестве дополнительного регулятора функциональной активности ГСБ, так как вариации площади базальной мембраны могут отражать изменение степени полимеризации глюкозаминогликанов и проницаемость ГСБ. При РГВ так же изменяется площадь эндотелиальной клетки. На 15 минуте РГВ относительная площадь эндотелиоцита увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с контролем. Это увеличение сохранялось в течение последующих 50 минут охлаждения, возвращаясь к исходным значениям на 120 минуте РГВ. 20 Существенные изменения при РГВ обнаруживает и поверхность эндотелиоцита. Уже на 15 минуте этого воздействия увеличивалось количество микровиллей на люминальной поверхности эндотелиоцита. В результате этого относительная длина люминальной мембраны на срезах капилляров значительно возрастала, что приводило к соответствующему изменению фрактальной размерности и может свидетельствовать о повышении функциональной активности ГСБ Ультраструктура ядра и цитоплазмы эндотелиальных клеток в условиях ритмических гипотермических воздействий (РГВ) близка к нормальной. Характерной особенностью являлось появление в капиллярном эндотелии большого количества эндоцитозных везикул различных размеров, количество которых возрастало в 2-3 раза по сравнению с контролем. Наблюдаемые изменения поверхности эндотелиоцитов вместе с увеличением количества и относительной площади эндоцитозных везикул свидетельствуют о развитии процессов пиноцитоза в эндотелиоцитах капилляров, что подтверждается данными электронной микроскопии. Описанные выше изменения ультраструктуры элементов ГСБ должны приводить к повышению его проницаемости, причем в 30% исследованных просветов капилляров мы наблюдали некоторое расхождения контактов между эндотелиальными клетками. Изменения функциональной активности ГСБ, являются, по нашему мнению, физиологически значимыми для стимуляции адаптационных механизмов. Ритмические гипотермические воздействия являются мощным средством стимуляции функциональной активности ГСБ. На разных этапах РГВ происходят быстрые адаптивные преобразования, в том числе на субклеточном уровне в эндотелии капилляров (везикулизация, трансцитоз, активация базального поверхности мембран стимуляция приводила слоя, разветвление капилляров). к и увеличение Ритмическая периодическому обменной гипотермическая изменению структурно- функциональной активности ГСБ, оптимизации содержания биоактивных 21 веществ, действие которых интегрируется на уровне клеточных структур клеток, что способствует повышению адаптационных возможностей функциональных систем. Таким образом, в структурно-функциональной организации слюнных желёз при определённых условиях формируются морфофизиологические адаптивные системы, значительно повышающие устойчивость тканей полости рта к длительному эмоциональному стрессу. ВЫВОДЫ 1. Структурно-функциональные различия элементов гематосаливарного барьера у крыс с разным балансом вегетативной регуляции выявляются при фармакологической стимуляции, стрессовых и гипотермических воздействиях на основании фрактальной размерности трехмерной архитектоники слюнных желез и их биоэлектрической активности. Отличие этого показателя от единицы свидетельствует об определенном уровне хаотичности организации гематосаливарного барьера. Наиболее лабильными по этим показателям являются животные с преобладанием парасимпатической вегетативной регуляции, а наименее лабильными – с преобладанием симпатической регуляции. 2. Эмоционально-болевой стресс и ритмические гипотермические воздействия вызывают существенные и принципиально различные морфологические изменения в слюнных железах у животных с разным балансом вегетативной регуляции. При стрессе у животных с преобладанием парасимпатической вегетативной регуляции значения морфометрических показателей такие же, как и при ацетилхолиновой стимуляции, у группы с преобладанием симпатической вегетативной регуляции – как при адреналиновой стимуляции. У крыс с равновесным вегетативным статусом развивается усредненная реакция на фармакологическую вегетативную нагрузку. Ритмические гипотермические воздействия напротив вызывают у животных с 22 симпатической регуляции парасимпатический, а в группе с парасимпатической регуляцией – симпатический структурный ответ. 3. Эмоционально-болевой стресс и ритмические гипотермические воздействия приводят к сходным локальным структурным изменениям в мягких тканях пародонта. Однако, если при стрессе фрактальная размерность соединительнотканной основы эпителиального слоя пародонта составляет 1,5 (структура переходит в зону несогласованных изменений), то при ритмических гипотермических воздействиях фрактальная размерность остается в персистентной области (D~1,3), то есть структурная лабильность возрастает при сохранении общей организации ткани. 4. При эмоционально-болевом стрессе и ритмических гипотермических воздействиях наблюдается 1,5-2-кратное увеличение проницаемости гематосаливарного барьера для 3Н-ацетилхолина и 14 С-адреналина, однако при стрессе соотношения коэффициентов проницаемости нарушаются, тогда как в динамике ритмических гипотермических воздействий колебания проницаемости носят согласованный характер и соотношения этих коэффициентов остаются постоянными. 5. Ритмические гипотермические воздействия нормализуют функциональное состояние гематосаливарного барьера нарушенное в результате симпатической и парасимпатической фармакологической нагрузки. Для крыс с преобладанием парасимпатической вегетативной регуляции эффективны режимы охлаждения с частотой 3 односекундных вегетативным симпатической холодовых статусом – 6, вегетативной Применение этих воздействий устраняют стимула/мин, а для регуляции режимов с равновесным крыс с преобладанием – 12 стимулов/мин. ритмических гипотермических стресс-индуцированные нарушения архитектоники и проницаемости гематосаливарного барьера. 23 6. Выявленные типологические особенности проявления эмоциональноболевого стресса в мягких тканях пародонта и закономерности холодовых реакций гематосаливарного барьера в эксперименте целесообразно испытать в лечебной стоматологической практике у пациентов с разными типами вегетативной регуляции. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Результат экспериментального исследования является основанием к рекомендации по применению ритмических гипотермических воздействий при клинических испытаниях метода резонансной терапии в комплексном лечении заболеваний пародонта, вызванных длительным эмоциональным стрессом. 2. При клинической отработке метода ритмических гипотермических воздействий на ткани пародонта следует учитывать, что частотные параметры сенсорной стимуляции холодовых рецепторов зависят от баланса вегетативной регуляции организма: при преобладании парасимпатического тонуса эффективные режимы охлаждения составляют 3 односекундных стимула/минуту, при равновесном вегетативном статусе – 6, а при преобладании симпатического тонуса – 12 стимулов/минуту. 24 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Чуйкин С.В., Бабийчук Г.А., Малышева Г.В. Состояние гематосаливарного барьера при стресс-индуцированных изменениях пародонта // Уфа: «Издательство «Здравоохранения Башкортостана», 2007. 141с. 2. Чуйкин С.В., Малышева Г.В. Терморегуляторные механизмы активации гематосаливарного барьера при холодовом купировании стресс- индуцированных поражений пародонта // Сб. материалов Всероссийского конгресса и республиканской конференции стоматологов РБ, Уфа 2007. – С. 315-317. 3. Чуйкин С.В., Зарипова Н.Р., Малышева Г.В. Особенности функционирования элементов гематосаливарного барьера при стрессиндуцированных поражений пародонта у студентов // Сб. материалов Всероссийского конгресса и республиканской конференции стоматологов РБ, Уфа 2007. – С. 255-257. 4. Чуйкин С.В., Малывева Г.В., Ермолаева С.А.Гематосаливарный барьер при стресс-индуцированном вегетативном дисбалансе и гипотермической сенсорной стимуляции // Сб. материалов Всероссийского конгресса и республиканской конференции стоматологов РБ, Уфа 2007. – С. 239-242. 5. Чуйкин С.В., Малышева Г.В., Воложин А.И. Гематосаливарный барьер при стресс-индуцированных изменениях в пародонте под влиянием ритмических гипотермических воздействий // Уральский медицинский журнал, №10, 2008. – С. 30-33. 6. Чуйкин С.В., Малышева Г.В., Воложин А.И. Гематосаливарный барьер при стресс-индуцированных поражениях в пародонте под влиянием ритмических гипотермических воздействий // Материалы Всероссийской научно- практической конференции, РБ, Уфа 2008. – С. 36-37. 7. Малышева Г.В., Чуйкин С.В., Воложин А.И. Гематосаливарный барьер при стрессиндуцированных изменениях в пародонте под влиянием ритмических гипотермических воздействий // Журнал «Кафедра» – 2008 том 7, № 4 – С. 30-33.