HBsAg

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ИЗОЛЯТОВ ВГВ В РАМКАХ РАЗРАБОТКИ
РОССИЙСКОЙ РЕФЕРЕНС ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК HBsAg
Максютов Р.А., Гаврилова Е.В., Канев А.Н.
ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, Кольцово, Россия
Введение. Вирус гепатита В вызывает острый и хронический вирусный гепатит.
Приблизительно 5 % мировой популяции инфицировано ВГВ и более чем 1 млн
пациентов с хроническим ВГВ умирает каждый год. На основе высокой гетерогенности,
ВГВ подразделяется на 8 (A-H) генотипов с четким географическим распространением.
Антигенные детерминанты поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) подразделяются на
десять иммунологических серотипов: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adw2, adw3, adw4, ayr,
adrq–, adrq+. Присутствие HBsAg в сыворотках крови является четким серологическим
маркером инфекции ВГВ и, к настоящему времени, разработано множество ИФА тестсистем для выявления поверхностного антигена. Однако, у некоторых пациентов с острым
и хроническим гепатитом В или бессимптомных пациентов уровень HBsAg может быть
слишком низок для детекции большинством диагностических наборов. Разработка
референс панели сывороток ВГВ с известными концентрациями HBsAg определенных
серотипов необходима для контроля качества диагностических тест-систем и качество
вакцин против гепатита В, которые должны быть строго стандартизованы по HBsAg
составу. Представление серотипов в референс панели должно соответствовать
встречаемости различных серотипов ВГВ в той географической территории, в которой
планируется использование референс панели. Национальная референс панель для РФ
должна включать лиофилизированные сыворотки, содержащие образцы ВГВ серотипов
ayw2, ayw3, adw2.
Цель и задачи. Главной целью исследования было определить генотипы и серотипы ВГВ
в образцах сыворотки, собранных из различных географических регионов РФ для
конструирования референс панели, содержащей все варианты HBsAg, циркулирующие в
РФ. Референс панель необходима для государственного контроля качества
сертифицированных HBsAg тест-систем и для сертификации вновь разрабатываемых
диагностикумов. Данная работа также необходима, т.к. предоставит дополнительные
знания о распределении ВГС генотипов и серотипов в РФ.
Материалы и методы. Было исследовано 343 образца сывороток крови, полученных от
хронических носителей ВГВ из шести городов, расположенных в различных регионах РФ:
Краснодар, Нижний Новгород, Горный Алтай, Санкт-Петербург, Новосибирск, Хабаровск.
Выделение ДНК ВГВ проводили из 200 мкл сыворотки набором QIAamp DNA Mini kit
(Qiagen) с последующей постановкой двухраундовой ПЦР. Секвенирование нуклеотидной
последовательности фрагмента S гена, включающего детерминанту А, проводили по
обеим цепям на автоматическом секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). Филогенетический анализ фрагмента S гена проводили с использованием
прототипных последовательностей ВГВ с помощью программы MEGA2.0.
Основные результаты. ДНК ВГВ была выявлена в 262 из 343 HBsAg-положительных
образцов (76.4%). Нуклеотидная последовательность фрагмента S гена была определена
для 72 произвольно выбранных образцов: 20 из Краснодара, 5 из Нижнего Новгорода, 15
из Горно-Алтайска, 8 из Санкт-Петербурга, 9 из Новосибирска, 15 из Хабаровска.
Последующий филогенетический анализ фрагмента S гена длиной 404 п.н. показал
принадлежность всех 20 изолятов ВГВ из Краснодара, 15 из Горно-Алтайска и 8 из СанктПетербурга генотипу D. 4 и 1 ВГВ изолят из Нижнего Новгорода, 8 и 1 из Новосибирска,
14 и 1 из Хабаровска были определены как генотипы D и A, соответственно. Таким
образом, распределение генотипов ВГВ среди 72 образцов сыворотки составило: 69
(95.8%) для генотипа D и 3 (4.2%) для генотипа A (таблица 1). Генотипы B, C, E, F, G и H
не были выявлены. Существует точная корреляция между иммунологическим серотипом
ВГВ и аминокислотным составом HBsAg. В нашей работе, основываясь на выявленных
аминокислотных остатках в 122, 127, 140, 159 и 160 позициях HBsAg, были
субтипированы все 72 образца сыворотки с определенной последовательностью S гена.
Распределение серотипов ВГВ среди 69 образцов сыворотки с генотипом D было
следующим: 38 были серотипа ayw2 (55.1%), 30 – ayw3 (43.5%), 1 – adw2 (1.4%). Все 3
образца сыворотки генотипа A были определены как серотип adw2 (100%). Таким
образом, распределение серотипов ВГВ различалось в нескольких городах РФ.
Распределение серотипов ВГВ было схожим в Санкт-Петербурге и Хабаровске с
доминированием серотипа ayw3 (87.5% и 93.3%, соответственно), тогда как серотип ayw2
был уникальным в Горно-Алтайске. Все три серотипа ayw2, ayw3 и adw2 были выявлены в
Нижнем Новгороде и Новосибирске с доминированием серотипа ayw2.
Заключение/выводы. Было определено распределение генотипов и серотипов 72
образцов ВГВ из городов, расположенных в различных географических регионах. Все 72
образца сыворотки были включены в референс панель. Национальная референс панель,
состоящая из лиофилизированных сывороток, содержащих образцы ВГВ с D/ayw2,
D/ayw3, A/adw2 и D/adw2 комбинациями генотипов и серотипов, предназначена для
государственного контроля специфичности и чувствительности сертифицированных тестсистем как для выявления концентрации HBsAg, так и для детекции его различных
серотипов. Также в нашей работе впервые был обнаружен образец сыворотки с
комбинацией генотипа D и серотипа adw2. Ранее такая комбинация генотипа и серотипа
не выявлялась.
Таблица 1. Распределение генотипов и серотипов ВГВ
Генотип A
Генотип D
Город
adw2
ayw3
ayw2
Санкт-Петербург
–
7 (87.5%) 1 (12.5%)
Краснодар
–
7 (35%)
13 (65%)
Нижний Новгород
1 (20%)
1 (20%)
3 (60%)
Новосибирск
1 (11.1%) 1 (11.1%) 6 (66.7%)
Горно-Алтайск
–
–
15 (100%)
Хабаровск
1 (6.7%) 14 (93.3%)
–
Всего
3 (4.2%) 30 (41.7%) 38 (52.7%)
adw2
–
–
–
1 (11.1%)
–
–
1 (1.4%)