ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ИЗОЛЯТОВ ВГВ В РАМКАХ РАЗРАБОТКИ РОССИЙСКОЙ РЕФЕРЕНС ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК HBsAg Максютов Р.А., Гаврилова Е.В., Канев А.Н. ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, Кольцово, Россия Введение. Вирус гепатита В вызывает острый и хронический вирусный гепатит. Приблизительно 5 % мировой популяции инфицировано ВГВ и более чем 1 млн пациентов с хроническим ВГВ умирает каждый год. На основе высокой гетерогенности, ВГВ подразделяется на 8 (A-H) генотипов с четким географическим распространением. Антигенные детерминанты поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) подразделяются на десять иммунологических серотипов: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adw2, adw3, adw4, ayr, adrq–, adrq+. Присутствие HBsAg в сыворотках крови является четким серологическим маркером инфекции ВГВ и, к настоящему времени, разработано множество ИФА тестсистем для выявления поверхностного антигена. Однако, у некоторых пациентов с острым и хроническим гепатитом В или бессимптомных пациентов уровень HBsAg может быть слишком низок для детекции большинством диагностических наборов. Разработка референс панели сывороток ВГВ с известными концентрациями HBsAg определенных серотипов необходима для контроля качества диагностических тест-систем и качество вакцин против гепатита В, которые должны быть строго стандартизованы по HBsAg составу. Представление серотипов в референс панели должно соответствовать встречаемости различных серотипов ВГВ в той географической территории, в которой планируется использование референс панели. Национальная референс панель для РФ должна включать лиофилизированные сыворотки, содержащие образцы ВГВ серотипов ayw2, ayw3, adw2. Цель и задачи. Главной целью исследования было определить генотипы и серотипы ВГВ в образцах сыворотки, собранных из различных географических регионов РФ для конструирования референс панели, содержащей все варианты HBsAg, циркулирующие в РФ. Референс панель необходима для государственного контроля качества сертифицированных HBsAg тест-систем и для сертификации вновь разрабатываемых диагностикумов. Данная работа также необходима, т.к. предоставит дополнительные знания о распределении ВГС генотипов и серотипов в РФ. Материалы и методы. Было исследовано 343 образца сывороток крови, полученных от хронических носителей ВГВ из шести городов, расположенных в различных регионах РФ: Краснодар, Нижний Новгород, Горный Алтай, Санкт-Петербург, Новосибирск, Хабаровск. Выделение ДНК ВГВ проводили из 200 мкл сыворотки набором QIAamp DNA Mini kit (Qiagen) с последующей постановкой двухраундовой ПЦР. Секвенирование нуклеотидной последовательности фрагмента S гена, включающего детерминанту А, проводили по обеим цепям на автоматическом секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Филогенетический анализ фрагмента S гена проводили с использованием прототипных последовательностей ВГВ с помощью программы MEGA2.0. Основные результаты. ДНК ВГВ была выявлена в 262 из 343 HBsAg-положительных образцов (76.4%). Нуклеотидная последовательность фрагмента S гена была определена для 72 произвольно выбранных образцов: 20 из Краснодара, 5 из Нижнего Новгорода, 15 из Горно-Алтайска, 8 из Санкт-Петербурга, 9 из Новосибирска, 15 из Хабаровска. Последующий филогенетический анализ фрагмента S гена длиной 404 п.н. показал принадлежность всех 20 изолятов ВГВ из Краснодара, 15 из Горно-Алтайска и 8 из СанктПетербурга генотипу D. 4 и 1 ВГВ изолят из Нижнего Новгорода, 8 и 1 из Новосибирска, 14 и 1 из Хабаровска были определены как генотипы D и A, соответственно. Таким образом, распределение генотипов ВГВ среди 72 образцов сыворотки составило: 69 (95.8%) для генотипа D и 3 (4.2%) для генотипа A (таблица 1). Генотипы B, C, E, F, G и H не были выявлены. Существует точная корреляция между иммунологическим серотипом ВГВ и аминокислотным составом HBsAg. В нашей работе, основываясь на выявленных аминокислотных остатках в 122, 127, 140, 159 и 160 позициях HBsAg, были субтипированы все 72 образца сыворотки с определенной последовательностью S гена. Распределение серотипов ВГВ среди 69 образцов сыворотки с генотипом D было следующим: 38 были серотипа ayw2 (55.1%), 30 – ayw3 (43.5%), 1 – adw2 (1.4%). Все 3 образца сыворотки генотипа A были определены как серотип adw2 (100%). Таким образом, распределение серотипов ВГВ различалось в нескольких городах РФ. Распределение серотипов ВГВ было схожим в Санкт-Петербурге и Хабаровске с доминированием серотипа ayw3 (87.5% и 93.3%, соответственно), тогда как серотип ayw2 был уникальным в Горно-Алтайске. Все три серотипа ayw2, ayw3 и adw2 были выявлены в Нижнем Новгороде и Новосибирске с доминированием серотипа ayw2. Заключение/выводы. Было определено распределение генотипов и серотипов 72 образцов ВГВ из городов, расположенных в различных географических регионах. Все 72 образца сыворотки были включены в референс панель. Национальная референс панель, состоящая из лиофилизированных сывороток, содержащих образцы ВГВ с D/ayw2, D/ayw3, A/adw2 и D/adw2 комбинациями генотипов и серотипов, предназначена для государственного контроля специфичности и чувствительности сертифицированных тестсистем как для выявления концентрации HBsAg, так и для детекции его различных серотипов. Также в нашей работе впервые был обнаружен образец сыворотки с комбинацией генотипа D и серотипа adw2. Ранее такая комбинация генотипа и серотипа не выявлялась. Таблица 1. Распределение генотипов и серотипов ВГВ Генотип A Генотип D Город adw2 ayw3 ayw2 Санкт-Петербург – 7 (87.5%) 1 (12.5%) Краснодар – 7 (35%) 13 (65%) Нижний Новгород 1 (20%) 1 (20%) 3 (60%) Новосибирск 1 (11.1%) 1 (11.1%) 6 (66.7%) Горно-Алтайск – – 15 (100%) Хабаровск 1 (6.7%) 14 (93.3%) – Всего 3 (4.2%) 30 (41.7%) 38 (52.7%) adw2 – – – 1 (11.1%) – – 1 (1.4%)