Влияние in vitro культивирования человеческих эмбрионов на

Репродукция человека, том 25, № 3 стр. 605-612, 2010
Публикация 18 января 2010 doi:10.1093/humrep/dep456
репродукция человека
ИСХОДНАЯ СТАТЬЯ
Эмбриология
Влияние in vitro культивирования человеческих эмбрионов на вес детей при
рождении
John C. Dumoulin1,2,6, Jolande A. Land3, Aafke P. Van Montfoort1,2, Ewka C. Nelissen1,2, Edith
Coonen1,2, Josien G. Derhaag1,2, Inge L. Schreurs1, Gerard A. Dunselman1,2, Arnold D. Kester4,
Joep P. Geraedts2,5, and Johannes L. Evers1,2
1
Центр репродуктивной медицины, Отделение акушерства и гинекологии, Медицинский
Центр Университета г.Маастрихт, Маастрихт, Нидерланды
2
GROW - Школа онкологии и биологии развития, Университет г.Маастрихт, Маастрихт,
Нидерланды
3
Отделение акушерства и гинекологии, Медицинский Центр Университета г.Гронинген,
Гронинген, Нидерланды
4
Отделение методологии и статистики, Университет г.Маастрихт, Маастрихт, Нидерланды
5
Отделение клинической генетики, Медицинский Центр Университета г.Маастрихт,
Маастрихт, Нидерланды
Адрес для корреспонденции. E-mail: [email protected]
Предпосылки: У животных моделей было отмечено, что in vitro культивирование
предимплантационных эмбрионов является фактором риска, провоцирующим
патологический эмбриональный исход, включая большой и малый вес ребенка при
рождении. У людей средний вес при рождении детей, рождённых в результате
одноплодной беременности, после in vitro оплодотворения (ЭКО) значительно меньше,
чем после естественной оплодотворения яйцеклетки, но не известно, влияют ли на это
условия культивирования.
Методы: Мы сравнивали процентные соотношения беременности и перинатальные
исходы одноплодных беременностей, возникших в результате 826 первых циклов
процедур ЭКО, в которых ооциты и эмбрионы были произвольно распределены для
культивирования в любой из двух имеющихся на рынке последовательных систем с
использованием питательных сред.
Результаты: 110 детей, живорождённых в результате одноплодной беременности, в
группе Vitrolife сравнили с 78 детьми, рождёнными в результате одноплодной
беременности, в группе Cook, вес при рождении + SEM (3453 + 53 по сравнению с 3208 +
61 г, P = 0.003), и вес при рождении, скорректированный с учетом гестационного возраста
и пола (средний z-показатель + SEM: 0.13 + 0.09 по сравнению с -0.31 + 0.10, P = 0.001),
оба были значительно выше в группе Vitrolife. На основании исследования методом
многократной линейной регрессией наряду с несколькими другими переменными,
которые могли повлиять на вес при рождении как ковариаты, был сделан вывод, что тип
питательной среды был в значительной мере (P = 0.01) связан с весом ребенка при
рождении.
Выводы: In vitro культивирование человеческих эмбрионов может отрицательно повлиять
на вес при рождении детей, живорождённых в результате одноплодной беременности.
Ключевые слова: ЭКО / человек / перинатальный исход / культивирование эмбриона / вес
ребенка при рождении
Введение
Точно установлено, что исход одноплодных беременностей с результатом рождения
одного ребенка является значительно хуже после процедур искусственной репродукции,
таких как экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и внутриплазматическая инъекция
сперматозоида (ИКСИ) по сравнению с самопроизвольным оплодотворением яйцеклетки
(Helmerhorst et al., 2004; Jackson et al., 2004; Sutcliffe and Ludwig, 2007; Schieve et al., 2007;
Ceelen et al., 2008; Centers for Disease Control and Prevention, 2009). Одноплодные
беременности после ЭКО или ИКСИ сравнивались с контрольными группами после
естественного оплодотворения яйцеклетки, и сравнивались с несколькими материнскими
характеристиками, включая возраст и количество родов в анамнезе, относительные риски
2.04 (CI 1.80-2.32) преждевременных родов (< 37 недель), 1.70 (CI 1.50-1.92) малого веса
при рождении (< 2500 г) и 1.40 (CI 1.15-1.71) малого гестационного возраста (< 10-го
процентиля), которые были описаны в обзоре Helmerhorst et al. (2004). Теоретически, этот
увеличенный риск неблагоприятного исхода беременности после ЭКО или ИКСИ может
быть результатом факторов, связанных с терапией, включая условия in vitro
культивирования или гормональную стимуляцию, а также факторов, связанных с
пациентом, включая тип и срок недостаточности репродуктивной функции, и другие
врожденные характеристики пациентов с недостаточной репродуктивной функцией
(Thomson et al., 2005; De Geyter et al. 2006; Ombelet et al., 2006). При последнем
исследовании (Romundstad et al., 2008) не были обнаружены какие-либо существенные
различия, когда вес ребенка при рождении и другие показатели перинатального исхода
сравнивались с сибсами детей, рождённых в результате одноплодной беременности, у
более чем 2500 женщин, которые забеременели, как минимум, одним ребенком
самопроизвольно, а другим ребенком после ЭКО. Эти результаты наводят на мысль, что
именно факторы, связанные с пациентом, а не технология ЭКО, являются причиной менее
оптимальных перинатальных исходов после ЭКО (Romundstad et al., 2008). Однако, у
животных нескольких моделей было отмечено, что такие аспекты технологии ЭКО, как
использование определенных питательных сред для in vitro культивирования эмбрионов,
могут очень сильно негативно повлиять на перинатальный исход, включая
патологический вес при рождении (Thompson et al., 1995; Khosla et al., 2001; Lane and
Gardner, 2003; Rooke et al., 2007). В настоящем исследовании мы проанализировали
влияние in vitro культивирования на человеческий перинатальный исход посредством
сравнения результатов перинатального исхода беременностей после процедур ЭКО, в
которых применялась любая из двух имеющихся на рынке последовательных систем с
использованием питательных сред.
Материалы и методы
План исследования
В Медицинском Центре Университета г.Маастрихт все процедуры ЭКО (либо со
стандартным оплодотворением, либо с ИКСИ как методом оплодотворения) обычно
оценивались для культуры, помещенной в одной из двух широко используемых
имеющихся на рынке последовательных питательных сред. В данном перспективном
исследовании оценка выполнялась посредством строго чередующихся последовательных
процедур ЭКО между этими двумя видами питательных сред за день до того, как
яйцеклетка бралась лаборантами, которые не были ознакомлены с характеристиками
пациентов или процедур. Предписание, по которому бралась яйцеклетка, было
запланировано на определенную дату. Согласно этому предписанию персонал клиники, не
ознакомленный с процедурами распределения в лаборатории, напрямую определял
распределение по группам исследования. Поочередное использование двух питательных
сред в нашей программе проведения процедур ЭКО является частью нашей внутренней
системы
контроля
качества,
позволяющей
определять
субоптимальные
экспериментальные серии конкретной питательной среды. С июля 2003 года по декабрь
2006 года культивирование выполнялось либо в питательных средах компании Vitrolife
AB (Гетеборг, Швеция), либо в питательных средах компании Cook (Брисбен, Австралия).
При этом отличались лишь питательные среды, а такие процедуры как стимуляция
яичников, оплодотворение, культивирование и пересадка эмбрионов были одинаковыми в
обеих группах. Для целей данного анализа были отобраны только те результаты, которые
были получены во время первых процедур ЭКО у всех пациентов, которые обслуживались
в нашем центре на момент проведения исследования. Были включены только данные о тех
беременностях, которые возникли в результате пересадки свежих эмбрионов. Сюда не
были включены пациенты, обратившиеся с просьбой проведения предимплантационной
генетической диагностики, и пациенты, для которых требовались донорские ооциты.
Кроме исключительных случаев, к участию в нашей программе ЭКО допускались лишь
пациенты в возрасте <40 лет, индекс массы тела (ИМТ) <30 кг\м и не страдающие от
артериальной гипертензии. Все пациенты дали информированное согласие на
использование их данных. Местный комитет по вопросам этики одобрил сбор данных для
цели контроля качеству в рамках нашего лечебного протокола ЭКО.
Процедуры
В соответствии с долгосрочным протоколом, у пациентов осуществлялось ежедневное
подавление с помощью 0.1 мг трипторелина п/к (Deca-peptyl; Ferring BV, Hoofddorp, The
Netherlands). Для стимулирования развития многочисленных фолликулов, использовался
рекомбинантный фолликуло-стимулирующий гормон (Puregon; Organon, Oss, The
Netherlands). Рост фолликула проверялся с помощью ультразвука, и 5000 междун. единиц
хориогонадотропина (hCG) (Pregnyl; Organon) вводились сразу после того, как, по крайней
мере, три фолликула оказывались > 18 мм. Изъятие ооцита под контролем УЗИ
осуществлялось через 36 часов после введения хориогонадотропина (hCG). Лютеиновая
фаза была поддерживалась прогестероном (Progestan; Organon) 200 мг три раза в день
внутривлагалищно, начиная со дня изъятия ооцита, на протяжении последующих 2
недель. В случае беременности, лютеиновая поддержка продолжалась еще в течение 3
недель.
Сосуды, содержащие капли питательной среды, были подготовлены за день до изъятия
ооцита. В случае оплодотворения ооциты культивировались либо в 50 µл каплях IVF-50TM
(группа Vitrolife), либо в K-SIFM (группа Cook) питательной среды, и были
оплодотворены с помощью приблизительно 50000 прогрессивно подвижных
сперматозоидов. После проверки на наличие пронуклеус в 18-20 ч. после оплодотворения,
зиготы были последовательно перенесены либо в питательную среду GITM Версия 3
(группа Vitrolife), либо в питательную среду K-SICM (группа Cook), и культивировались
отдельно в каплях 5 µл. В случае ИКСИ, ооциты отдельно культивировались либо в
питательной среде GITM Версия 3 (группа Vitrolife), либо в питательной среде K-SICM
(группа Cook) сразу же после инъекции. Все питательные среды от обоих поставщиков
были готовы к использованию и включали 5 мг/мл человеческий сывороточный альбумин
фармацевтической категории. Капли культуры для обеих групп были покрыты
минеральным маслом (Irvine Scientific, Orange Medical, Tilburg, The Netherlands).
Культивирование выполнялось в среде 5% O2, 6% CO2 и 89% N2. Эмбриональное развитие
ежедневно фиксировалось. Эмбрионы были распределены по морфологическим
категориям (1-4, при этом категория 4 является лучшей категорией: бластомеры
правильной формы, одинакового размера, с фрагментацией <20%, и отсутствие
многоядерных бластомеров). Перенос эмбриона выполнялся на второй в день после
изъятия ооцита, или, в меньшинстве случаев, из соображений удобства, на третий день.
Наша стандартная процедура переноса заключается в переносе единственного эмбриона,
если женский возраст был <38 лет, и имелся, как минимум, один эмбрион хорошего
качества. Во всех остальных случаях переносились по два эмбриона. Эмбрионы,
достигшие 4-клеточной стадии на второй день, или 8-клеточной стадии на третий день, в
сочетании
с
показателем
наилучшей
морфологической
категории,
были
классифицированы как эмбрионы хорошего качества.
Сбор данных и статистический анализ
Беременность определялась по тесту мочи (предел чувствительности 50 межуд.ед./л),
проводимому через 14-16 дней после пересадки эмбриона. Клиническая беременность
была определена по наличию плодного яйца. Сердцебиение плода определялось на УЗИ
через 5-6 недель после пересадки эмбриона. Показатель имплантации был определен в
виде процентного соотношения плодных яиц (с сердечным биением или без сердечного
биения) к количеству перенесенных эмбрионов. Когда тест на наличие беременности был
положительным, но при этом на УЗИ не было обнаружено плодное яйцо, то в таком
случае считалось, что произошла имплантация единственного плода. В случае
беременности, пациентов просили сообщать об исходах. С ними связывались акушерки
для получения информации об осложнениях во время беременности (включая
гестационный диабет, артериальную гипертензию и преэклампсию) и перинатальном
исходе. В анализ данных были включены только живорожденные дети, рождённые в
результате одноплодной беременности, после 20 полных недель беременности,
появившиеся в результате переноса свежих эмбрионов. Гестационная продолжительность
определялась посредством вычитания даты изъятия ооцита от даты рождения плюс 14
дней. Для сравнения детей, рождённых в результате одноплодной беременности,
родившихся в разном гестационном возрасте и разных полов, каждому ребенку был
присвоен z-показатель (вес отдельного ребенка - средний вес населения сопоставимого
контингента детей, рожденных в таком же гестационном возрасте, и такого же пола,
разделенный на SD) (Oken et al., 2003; Land, 2006). Привычка к курению, парентеральный
вес и рост были задокументированы в начале процедуры ЭКО.
Для сравнения различий, использовался критерий Стьюдента для непрерывных
переменных и критерий χ2 для двойных переменных. Когда это было целесообразно,
применялась поправка Йэйтса. Считается, что двухсторонние P-значения 0.05 или меньше
указывают статистический уровень значимости. Помимо поправок на гестационный
возраст и пол при использовании z-показателя при оценке разницы в весе детей при
рождении в этих двух группах наблюдения, тип питательной среды наряду с некоторыми
другими переменными, которые могут негативно повлиять на вес ребенка при рождении,
были включены в модель анализа множественной линейной регрессии в качестве
ковариатов, для оценки их относительного влияния на исход.
Результаты
За весь период исследования было выполнено, в общей сложности, 826 изъятий ооцитов,
представляющих первую процедуру ЭКО, у 826 последовательных пациентов,
соответствовавших нашим критериям. Для 414 пациентов использовались питательные
среды компании Vitrolife, в то время как для 412 пациентов использовались питательные
среды компании Cook. Характеристики пациентов и циклов (процедур) сравнивались у
двух группах наблюдения. Все 826 случаев были проанализированы, за исключением
случаев, когда в значительном большем количестве циклов в группе Cook использовалась
технология ИКСИ (Таблица I).
Таблица I. Характеристики пациентов и циклов процедур.
Характеристика
Все циклы
Циклы, в результате которых
родились живорожденные дети
от одноплодной беременности
Группа
Группа
PГруппа
Группа
PVitrolife
Cook
значение Vitrolife
Cook
значение
(n = 414) (n = 412)
(n = 110) (n = 78)
Характеристики
матери
Возраст
(кол-во 33.3 (4.0) 33.1 (3.9) 0.40
32.2 (4.0) 32.2
0.97
лет)
(3.5)
Возраст> 38 лет
53 (13%) 50 (12%) 0.77
5 (5%)
3 (4%)
0.81
Рост (см)
Индекс массы тела
168.3
(6.7)
68.5
(10.8)
24.2 (3.5)
168.2
(6.6)
68.2
(10.7)
24.1 (3.3)
Амплитуда
17.1–33.3
15.7–33.9
Курение
>
10 58 (14%)
сигарет/сут.
Характеристики
отца
Возраст
(кол-во 36.1 (5.2)
лет)
Рост (см)
181.6
(8.0)
Вес (кг)
84.7
(13.0)
Индекс массы тела 25.6 (3.4)
70 (17%)
Курение>
10
сигарет/сут.
Первичный признак
для
процедуры
ЭКО
Трубный фактор
Мужской
(male)
фактор
Необъяснимый
фактор
Другой фактор
Продолжительность
недостаточности
репродуктивной
функции
(кол-во
лет)
Первенцы
Вес (кг)
0.85
0.04
0.24
168.0
(7.5)
66.6
(10.0)
23.5
(3.1)
17.5–33.3 18.0–
31.4
16 (15%) 12 (15%)
36.2 (5.2)
0.83
35.2 (5.7)
0.34
181.8
(7.2)
85.1
(12.4)
25.7 (3.1)
0.63
0.74
182.2
(8.0)
86.0
(14.5)
25.8 (3.6)
82 (20%)
97 (24%)
0.19
20 (18%)
36.3
(5.6)
180.8
(7.2)
81.9
(11.5)
25.0
(2.8)
18 (23%)
64 (15%)
229
(55%)
100
(24%)
21 (5%)
3.3 (2.0)
64 (15%)
249
(60%)
82 (20%)
0.97
0.14
10 (9%)
71 (65%)
13 (17%)
48 (61%)
0.12
0.67
0.14
24 (22%)
14 (18%)
0.52
17 (4%)
3.5 (2.0)
0.52
0.24
5 (5%)
3.0 (1.6)
3 (4%)
3.3 (1.8)
0.81
0.18
81 (74%)
59 (76%)
0.76
73 (66%)
48 (62%)
0.50
-
-
86 (78%)
59 (76%)
0.68
24 (22%)
19 (24%)
0.68
0.66
0.63
0.69
306
320
0.21
(74%)
(78%)
Циклы с ИКСИ
238
267
0.03
(57%)
(65%)
Перенос эмбриона 25 (6%)
25 (6%)
1.00
не выполнялся
Циклы с переносом 302
299
0.90
на второй день
(73%)
(73%)
Циклы с переносом 87 (21%) 88 (21%) 0.90
на третий день
Приведены средние показатели(+SD) или n (%).
170.1
(5.6)
70.2
(11.2)
24.3 (3.7)
0.02
0.16
0.87
0.20
0.04
0.10
0.41
В 188 случаях, когда родились живорожденные дети в результате одноплодной
беременности, рост и вес матери, а также вес отца были значительно больше в группе
Vitrolife (Таблица I). Характеристики перенесенных эмбрионов немного отличались
между этими двумя группами. Эмбрионы в группе Vitrolife имели значительно большее
среднее количество клеток, тогда как эмбрионы в группе Cook были значительно более
высокой морфологической категории (Таблица II).
Таблица II. Результаты ЭКО.
Характеристика
Все циклы
Циклы, в результате которых
родились живорожденные дети
от одноплодной беременности
Группа
Группа
PГруппа
Группа
PVitrolife
Cook
значение
Vitrolife
Cook
значение
(n = 414) (n = 412)
(n = 110) (n = 78)
Ооциты
8.49
8.00
0.16
8.94
9.14
0.77
(0.25)
(0.24)
(0.45)
(0.53)
Степень
69.4 (1.2) 69.8 (1.8) 0.86
60.8 (2.9) 62.2 (3.8) 0.78
оплодотворенияa
Перенос эмбриона
Общее количество 389 (94%) 387
1.00
110
78
–
(94%)
(100%)
(100%)
Перенос
192 (49%) 220
0.04
53 (48%) 49 (63%) 0.047
единственного
(57%)
эмбриона
Характеристики
перенесенных
эмбрионов
на
второй день
Стадия
3.70
3.40
0.003
4.16
3.90
0.04
b
яйцеклетки
(0.07)
(0.07)
(0.09)
(0.07)
Морфологическая
2.97
3.20
0.001
3.08
3.38
0.001
c
категория
(0.03)
(0.03)
(0.05)
(0.07)
Характеристики
перенесенных
эмбрионов
на
третий день
Стадия
7.43
6.22
0.004
8.71
7.68
0.06
b
яйцеклетки
(0.30)
(0.29)
(0.44)
(0.17)
Морфологическая
2.93
2.90
0.73
2.97
3.16
0.19
c
категория
(0.06)
(0.07)
(0.09)
(0.11)
Приведены средние показатели (+ SEM) или n (%).
a
Данные относятся к среднему количеству оплодотворенных (2PN) зиготов на общее
количество взятых ооцитов на каждый цикл.
b
Данные относятся к среднему количеству клеток на эмбрион на каждый цикл.
c
Данные относятся к средней морфологической категории (1-4, при этом категория 4
является лучшей категорией) на эмбрион на каждый цикл.
Перенос единственного эмбриона выполнялся значительно чаще в группе Cook.
Процентное соотношение беременности и процентное соотношение клинической
беременности были значительно более высокими в группе Vitrolife, как и процентное
соотношение имплантации (Таблица III).
Таблица III. Исход беременностей
Группа
Группа Cook Соотношение
P-значение
Vitrolife (n = (n = 412)
показателей
414)
(95% CI)
Беременности (%
на цикл)
Положительные
164 (39.6)
тесты
Клинические
138 (33.3)
беременности
Имплантация (%
на
каждый
перенесенный
эмбрион)
Общее количество 186 (31.7)
Плодные яйца с 157 (26.8)
сердцебиением
Многоплодные
беременности (%
на
каждую
клиническую
беременность)
Двуплодные
18 (13.0)
беременности
Трехплодные
1 (0.7)
беременности
Самопроизвольный
аборт
Ранний
аборт 26 (15.9)
(FHB
не
обнаружено)
Клинический аборт 8 (4.9)
(< 17 недель)
Самопроизвольный 0
аборт
(17-20
недель)
Частичный
2 (1.2)
самопроизвольный
аборт (исчезающий
близнец)
Роды (% на общее
количество родов)
Один ребенок
112 (86.2)
Двойня
18 (13.8)
Исход родов (% на
общее количество
родившихся детей)
Количество
148
родившихся детей
Количество
146 (98.6)
живорожденных
детей
Количество
2 (1.4)
мертворожденных
детей
Данные указаны в n (%).
125 (30.3)
1.31 (1.08–1.58)
0.005
104 (25.2)
1.32 (1.07–1.64)
0.01
144 (26.0)
120 (21.7)
1.22 (1.02–1.47)
1.24 (1.01–1.52)
0.04
0.04
17 (16.3)
0.80 (0.43–1.47)
0.50
0
0.89
22 (17.6)
0.90 (0.54–1.51)
0.69
5 (4.0)
1.22 (0.41–3.64)
0.94
1 (0.8)
0.89
1 (0.8)
1.52 (0.14–
16.62)
0.81
81 (83.5)
16 (16.5)
1.03 (0.92–1.15)
0.84 (0.45–1.56)
0.58
0.58
110 (97.3)
1.01 (0.98–1.05)
0.76
3 (2.7)
0.51 (0.09–3.00)
0.76
113
Для беременностей, в результате которых родились единственные живорожденные дети,
не были обнаружены какие-либо значительные различия в вопросах осложнений,
возникших во время беременности, включая гестационный диабет, артериальную
гипертензию и преэклампсию (9 = 8.2 % в группе Vitrolife, и 4 = 5.1 % в группе Cook).
Средний вес ребенка при рождении, а также средний вес при рождении,
скорректированный с учетом гестационного возраста и пола (z-показатель) всех
живорождённых детей, рождённых в результате одноплодной беременности, был
значительно ниже в группе Cook (Таблица IV).
Таблица IV. Неонатальные характеристики детей, живорождённых в результате
одноплодной беременности
Группа
Группа Cook Соотношение
P-значение
Vitrolife (n = (n = 412)
показателей
414)
(95% CI)
Мальчики
49 (45)
35 (45)
0.99 (0.72–1.37) Незначимый
показатель
Гестационный
39.6 (0.2)
39.4 (0.3)
Незначимый
возраст
при
показатель
рождении (недели)
Преждевременное 5 (4.5)
5 (6.4)
0.71 (0.21–2.37) Незначимый
рождение (< 37
показатель
недель)
Крайне
1 (0.9)
2 (2.6)
0.35 (0.03–3.84) Незначимый
преждевременное
показатель
рождение (< 32
недель)
Вес при рождении 3453 (53)
3208 (61)
0.003
(г)
Малый вес при 3 (2.7)
6 (7.7)
0.35 (0.09–1.37) Незначимый
рождении (< 2500
показатель
г)
Малый вес при 1 (0.9)
4 (5.1)
0.18 (0.02–1.56) Незначимый
рождении в срок (>
показатель
37 недель)
Очень малый вес 2 (1.8)
2 (2.6)
0.71 (0.10–4.93) Незначимый
при рождении (<
показатель
1500 г)
Большой вес при 4 (3.6)
0
Незначимый
рождении (> 4500
показатель
г)
Маленький
для 5 (4.6)
9 (11.5)
0.39 (0.14–1.13) Незначимый
гестационного
показатель
возраста (< 10-го
процентиля)
Очень маленький 2 (1.8)
5 (6.4)
0.28 (0.06–1.42) Незначимый
для гестационного
показатель
возраста (< 3-го
процентиля)
Большой
для 8 (7.2)
2 (2.6)
2.84 (0.62–
Незначимый
гестационного
13.00)
показатель
возраста
(>90-го
процентиля)
Очень
большой 5 (4.5)
1 (1.3)
для гестационного
возраста (> 97-го
процентиля)
z-показатель
0.13 (0.09)
-0.31 (0.10)
Приведены средние показатели (+ SEM) или n (%).
3.55 (0.42–
29.76)
Незначимый
показатель
0.001
Пропо
рциона
льное
соотно
шение
(%)
общег
о
количе
ства
береме
нносте
й
Категория веса детей при рождении (г)
Рис. 1 Распределение веса при рождении детей, живорождённых в результате
одноплодной беременности, возникшей в результате культивирования эмбриона либо в
питательной среде Vitrolife, либо в питательной среде Cook. График представляет собой
процентное соотношение новорожденных на каждую категорию веса детей
при
рождении.
Это также иллюстративно подтверждается кривой распределения веса детей при
рождении (рис. 1). На этом рисунке показано процентное соотношение детей по каждой
категории веса при рождении (например, дети весом > 1500 и < 1750 г, и так далее) от
общего количества детей. Если несколько возможных усугубляющих факторов
[количество родов в анамнезе, особенности обоих родителей (возраст, рост, вес, ИМТ,
привычка к курению), продолжительность недостаточности репродуктивной функции, тип
процедуры ЭКО (оплодотворение или ИКСИ), время пересадки эмбрионов (второй или
третий день), количество пересаженных эмбрионов (1 или 2) и осложнения во время
беременности] были включены в модель анализа множественной линейной регрессии
наряду с гестационным возрастом, полом младенца и типом питательной среды, то лишь
гестационный возраст (P < 0.0001), количество родов в анамнезе (P = 0.005), пол (P=0.03),
возраст матери (P = 0.03) и тип питательной среды (P = 0.01) были в значительной степени
связаны с весом ребенка при рождении (коэффициент множественной корреляции R =
0.697). Для дополнительной оценки влияния нескольких усугубляющих факторов, мы
проанализировали подгруппу детей, которые родились в результате беременностей
сроком > 37 недель, и у которых не были зафиксированы какие-либо медицинские
осложнения. Кроме того, для исключения случаев беременности, когда патологический
вес ребенка при рождении был вызван другими (неизвестными) обстоятельствами, в этом
дополнительном исследовании мы рассматривали только случаи как с нормальным весом
детей при рождении (>2500 и < 4500g), так и с нормальным весом детей при рождении для
гестационного возраста (>10-го процентиля и <90-го процентиля). Также в этой
отобранной группе, средний вес при рождении (P=0.016), а также z-показатель (P = 0.013)
были значительно более высокими в группе Vitrolife (n = 87, 3489 + 35 г, z-показатель 0.11
+ 0.07) по сравнению с группой Cook (n = 58, 3353 + 44 г, z-показатель 20.18 + 0.09), и
модель анализа множественной линейной регрессии вновь подтвердила (коэффициент
множественной корреляции R = 0.485), что тип питательной среды (P = 0.038) был в
значительной степени связан с весом ребенка при рождении в случаях, когда был
проанализирован следующий перечень усугубляющих факторов: характеристики матери
(возраст, рост и вес), гестационный возраст, количество родов в анамнезе, пол и
количество перенесенных эмбрионов (1 или 2). В случаях, когда рост и вес родителей в
группе Vitrolife сравнивались с этими характеристиками родителями в группе Cook, рост
матерей + SEM (169.9+0.6 по сравнению 168.9+1.0 см, P = 0.38), вес матерей + SEM
(69.4+1.1 по сравнению с 67.3+1.3 кг, P = 0.23), рост отцов + SEM (182.3+0.9 по сравнению
с 181.7+0.9 см, P = 0.63) и вес отцов + SEM (85.4+1.4 по сравнению с 82.2+1.6 кг, P = 0.14)
не отличались в значительной степени в этой отобранной группе.
Обсуждение
Наше исследование подтверждает, что питательная среда, используемая для процедуры
ЭКО, имеет значительное влияние не только на раннее эмбриональное развитие, но также
на последующее развитие плода и новорожденного ребенка. Процентное соотношение
беременностей и процентное соотношение клинических беременностей были значительно
выше в группе Vitrolife. Этот результат исследования согласуется с результатом ранее
проведенного исследования, подтверждающего, что в подмножестве пациентов с, как
минимум, пятью эмбрионами, помещенными в культуру, использование предыдущей
версии последовательных питательных сред Vitrolife (G1.2/G2.2) привело к значительной
более высокому процентному соотношению беременностей по сравнению с
использованием питательных сред Cook (Van Langendonckt et al., 2001). Насколько нам
известно, наше исследование является первым подтверждающим, что условия
культивирования могут отрицательно повлиять на вес новорожденных при рождении.
Множество факторов влияют на вес ребенка при рождении, наиболее важными из
которых являются гестационный возраст при родах, пол эмбриона, и родился ли ребенок в
результате одноплодной или многоплодной беременности (Cogswell and Yip, 1995; Oken et
al., 2003). Другие факторы включают характеристики матери, такие как количество родов
в анамнезе (Zhang and Bowes, 1995), рост, вес и ИМТ матери (Cogswell and Yip, 1995;
Rosenberg et al., 2005), раса (Zhang and Bowes, 1995), факторы, связанные с
беременностью, такие как гестационный диабет, артериальная гипертензия и
преэклампсия (Rosenberg et al., 2005) и факторы, связанные с образом жизни, такие как
курение (Cogswell and Yip, 1995). Кроме того, история недостаточности репродуктивной
функции связана с увеличением частоты акушерских и перинатальных осложнений, а
также со сниженным средним весом при рождении детей, рождённых в результате
одноплодной беременности, самопроизвольной (Thomson et al., 2005; De Geyter et al.,
2006) или после контролируемой стимуляции яичников (Ombelet et al., 2006). Недавно
было доказано, что количество перенесенных эмбрионов является фактором, связанным с
процедурой ЭКО, который в значительной степени влияет на перинатальный исход, так
как средний вес детей при рождении более малый, а случаи преждевременных родов и
малый вес детей при рождении в значительной степени более частые у детей, рожденных
в результате одноплодной беременности после переноса двух эмбрионов, по сравнению с
детьми, рождёнными в результате одноплодной беременности после переноса
единственного эмбриона (De Sutter et al., 2006). Этот результат исследования вероятно
связан с относительно высокой частотой исчезающих близнецов после переноса двух
эмбрионов (De Sutter et al., 2006). Продолжительность недостаточности репродуктивной
функции и параметры стимуляции яичников, такие как дозировка гонадотропина и
количество изъятых ооцитов, подтвердили отсутствие количественной связи с весом
ребенка при рождении (Griesinger et al., 2008). В нашем исследовании было обнаружено,
что некоторые из вышеупомянутых усугубляющих факторов смешивания различались
между группами наблюдения.
Во-первых, в случаях процедур, результатами которых было рождение живых
единственных детей, рост и вес матери, а также вес отца были немного, но в значительной
степени больше в группе Vitrolife (Таблица I), хотя дело было не в общей группе циклов
процедур. В настоящее время у нас нет объяснения этому факту. Важно отметить, что в
нашей клинике мы лишь в исключительных случаях принимаем страдающих ожирением
пациенток (ИМТ >30 кг\м2) для участия в нашей программе ЭКО. Страдающие
ожирением пациентки особенно подвержены риску осложнений при беременности,
неблагоприятных результатов беременности и увеличенного веса детей при рождении
(Schrauwers and Dekker, 2009). В нашем исследовании лишь девять из 188 матерей детей,
рождённых в результате одноплодной беременности, имели ИМТ > 30 кг\м2, при самом
высоком ИМТ 33.3 кг\м.
Во-вторых, пропорциональное соотношение циклов процедур, при которых переносились
два эмбриона, отличалось между этими двумя группами наблюдения. Это различие
связано с различными характеристиками эмбриона (Таблица II) в обеих группах изучения
питательных сред в сочетании с нашей практикой переноса, а не с различиями
характеристик пациентов или циклов процедур (данные не указаны). То обстоятельство,
что в группе Vitrolife чаще выполнялся перенос двойных эмбрионов, объясняет, по
крайней мере частично, более высокое показатель беременности, наблюдаемый в этой
группе. Теоретически это могло привести к более малому среднему весу при рождении
детей, рождённых в результате одноплодной беременности, в группе Vitrolife из-за
исчезающих близнецов (De Sutter et al., 2006). Однако, в нашей серии наблюдений лишь в
трех случаях одноплодной беременности (два в группе Vitrolife и один в группе Cook), в
результате которых родились единственные дети, во время УЗИ, проводимого через 5-6
недель после пересадка эмбрионов, более одного плодного яйца. На основании анализа
множественной линейной регрессии был сделан вывод, что тип питательной среды в
значительной степени связан с весом ребенка при рождении, независимо от
вышеупомянутых усугубляющих факторов. Была проанализирована общая группа
живорождённых детей, рождённых в результате одноплодной беременности, и подгруппа,
в которой были исключены дети, родившиеся преждевременно или с медицинскими
осложнениями, или имеющие патологический вес при рождении. У этих детей факторы
риска, за исключением условий in vitro культивирования, вероятнее всего, будут играть
важную роль (Mongelli and Gardosi, 2000; Das et al., 2004).
В данном исследовании мы использовали альтернативный вариант, псевдослучайный
метод распределения пациентов, который не является оптимальным планом исследования.
Однако, то обстоятельство, что порядок процедур в определенный день, который
собственно определил распределение по группам исследования, был установлен
клиническим персоналом, не ознакомленным с процедурой распределения в лаборатории,
делает процедуру распределения действительно рандомизированной.
Любой из результатов нашего исследования, каким бы то ни было образом связанный с
наблюдаемым влиянием определенных условий in vitro культивирования у видов
животных, является спорным. Влияние, подтверждаемое данным исследованием, конечно,
менее серьезное. У овец и рогатого скота было зафиксировано увеличение на 20-30%
среднего веса потомства при рождении в результате естественного оплодотворения, и
даже увеличение вдвое нормального веса потомства при рождении не является редкостью
(Young et al., 1998; Sinclair et al., 2006). Для сравнения, у мышей, in vitro культивирование
в субоптимальных питательных средах дает начало потомству, вес которого при
рождении уменьшен на 20% (Khosla et al., 2001). В результате некоторых исследований
была выявлена добавка для питательных сред в виде сыворотки (из любого источника),
как, по крайней мере, один из известных факторов, влияющих на так называемый синдром
крупного потомства у рогатого скота и овец (Young et al., 1998; Sinclair et al., 2006; Rooke
et al., 2007) и увеличение частоты случаев более мелки плодов у мышей (Khosla et al.,
2001). Оба типа питательных сред, используемых в нашем исследовании, действительно
содержали человеческий сывороточный альбумин как белковый источник вместо
сыворотки. При исследованиях на животных было установлено, что определенные
условия in vitro культивирования могут привести к изменениям паттернов экспрессии
мРНК у предимплантационных эмбрионов, которые могут сохраняться на протяжении
всего развития плода до рождения. Выдвинута гипотеза, что патологическая генная
экспрессия определенных важных для развития генов отвечает за наблюдаемые
отклонения от нормы у появившегося потомства (Wrenzycki et al., 2005; Rivera et al.,
2008). Примерами таких условий культивирования, подтвердивших отрицательное
влияние на генную экспрессию, а также на развитие плода, являются добавки в виде
сывороток (Rooke et al., 2007) или аммония (Lane and Gardner, 2003) к питательной среде,
и высокая концентрация кислорода питательной среды (Kind et al., 2004). На мышах было
подтверждено, что in vitro культивирование имеет продолжительное влияние на
экспрессии мРНК импринтинговых генов (Rivera et al., 2008), при этом влияние
осуществляется не только на развитие плода, но даже на поведение появившегося
потомства (Fernandez-Gonzalez et al., 2004). Помимо in vitro культивирования, к известным
условиям, изменяющим in vivo среду предимплантационных эмбрионов, относятся диеты
с высоким содержанием белков в околозачаточный период, которые могут привести к
аберрантной генной экспрессии и последующему патологическому развитию плода
(Powell et al., 2006). Считается, что эпигенетические модификации отвечают за
измененную генную экспрессию и импринтинговые гены, такие как IGF2R у овец (Young
et al., 2001) и H19 у мышей (Lane and Gardner, 2003; Fauque et al., 2007), которые кажутся
особенно чувствительными к субоптимальным условиям культивирования.
Также предполагалось, что in vitro культивирование человеческих эмбрионов может
привести к эпигенетическим пертурбациям таким же образом, как у видов животных.
Существуют данные, подтверждающие, что частота случаев редких импринтинговых
нарушений, таких синдром висцеромегалии и офтальмоцеле, увеличена у детей,
появившихся в результате ЭКО (Lim etal., 2009; Manipalviratn etal., 2009), хотя
предполагалось, что причинными факторами были статус недостаточности
репродуктивной функции родителей и/или гормональная стимуляция, а не in vitro
культивирование само по себе (Chang et al., 2005; Doornbos et al., 2007). Кроме того,
последнее подтвердило, что препуберантные ЭКО дети, рожденные в срок после
одноплодной беременности, более высокорослые и имеют более высокое уровни
сыворотки IGF-II, и другой профиль липида по сравнению с не-ЭКО контрольными
группами.
Результаты нашего исследования подтверждают, что максимально короткий период 2-3
дня in vitro культивирования человеческих эмбрионов может иметь существенное влияние
на вес детей при рождении. Таким образом можно объяснить, хотя бы частично, более
высокий риск малого веса при рождении ЭКО ребенка, родившегося в результате
одноплодной беременности, по сравнению с общей популяцией, как было описано в
нескольких научных работах (Helmer-horst et al., 2004; Jackson et al., 2004; Sutcliffe and
Ludwig, 2007; Ceelen et al., 2008). Использование оптимальных питательных сред во время
процедур ЭКО может помочь избежать случаев рождения детей с малым весом. Те
обстоятельства, что беременности в результате ЭКО составляют ~2 % всех родов в
западных странах (Sutcliffe and Ludwig, 2007), и что дети с малым весом при рождении (и,
в частности, с малым весом при рождении в срок) при повышенном риске перинатальных
осложнений (Mclntire et al., 1999) и болезней в пожилом возрасте (Barker, 2004), возлагают
огромную ответственность на плечи изготовителей питательных сред для человеческого
ЭКО и на плечи использующих такие питательные среды специалистов по ЭКО. Для
объяснения воздействия in vitro культивирования гамет и эмбрионов на здоровье будущих
детей, необходимо проводить дополнительные исследования.
Роли Авторов
J.C.D. разработал данное исследование; J.C.D. и I.L.S. собирали данные; J.C.D. и A.P.V.M.
проанализировали данные под руководством A.D.K.; все авторы участвовали в
интерпретации данных; J.C.D. составил отчет с участием других авторов.
Библиография
Barker DJP. The developmental origins of chronic adult disease. Acta Paediatr Suppl
2004;446:26-33.
Ceelen M, van Weissenbruch MM, Vermeiden JPW, van Leeuwen FE, Delemarre-van de Waal
HA. Growth and development of children born after in vitro fertilization. Fertil Steril
2008;90:1662- 1673.
Centers for Disease Control and Prevention. Assisted Reproductive Technology and Trends in
Low Birthweight—Massachusetts, 1997-2004. MMWR2009;58:49-52.
Chang AS, Moley KH, Wangler M, Feinberg AP, DeBaun MR. Association between Beckwith Wiedemann syndrome and assisted reproductive technology: a case series of 19 patients. Fertil
Steril 2005;83:349-354.
Cogswell MA, Yip R. The influence of fetal and maternal factors on the distribution of
birthweight. Semin Perinatol 1995;19:222-240.
Das UG, Sysyn GD. Abnormal fetal growth: intrauterine growth retardation, small for
gestational age, large for gestational age. Pediatr Clin North Am 2004;51:639-654.
De Geyter C, De Geyter M, Steimann S, Zhang H, Holzgreve W. Comparative birthweight of
singletons born after assisted reproduction and natural conception in previously infertile women.
Hum Reprod 2006;21:705-712.
De Sutter P, Delbaere I, Gerris J, Verstraelen H, Goetgeluk S, Van der Elst J, Temmerman M,
Dhont M. Birthweight of singletons after assisted reproduction is higher after single- than after
double-embryo transfer. Hum Reprod 2006;21:2633-2637.
Doornbos ME, Maas SM, McDonnell J, Vermeiden JPW, Hennekam RCM. Infertility, assisted
reproduction technologies and imprinting disturbances: a Dutch study. Hum Reprod
2007;22:2476-2480.
Fauque P, Jouannet P, Lesaffre C, Ripoche MA, Dandolo L, Vaiman D, Jammes H. Assisted
Reproductive Technology affects developmental kinetics, H19 Imprinting Control Region
methylation and H19 gene expression in individual mouse embryos. BMC Dev Biol 2007; 7:116135.
Fernandez-Gonzalez R, Moreira P, Bilbao A, Jimenez A, Perez-Crespo M, Ramirez MA,
Rodriguez De Fonseca F, Pintado B, Gutierrez-Adan A. Long-term effect of in vitro culture of
mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinted genes, development, and
behavior. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:5880-5885.
Griesinger G, Kolibianakis EM, Diedrich K, Ludwig M. Ovarian stimulation for IVF has no
quantitative association with birthweight: a registry study. Hum Reprod 2008;23:2549-2554.
Helmerhorst FM, Perquin DAM, Donker D, Keirse MJNC. Perinatal outcome of singletons and
twins after assisted conception: a systematic review of controlled studies. Br Med J
2004;328:261 -265.
Jackson RA, Gibson KA, Wu YW, Croughan MS. Perinatal outcomes in singletons following in
vitro fertilization: a meta-analysis. Obstet Gynecol 2004; 103:551 -563.
Khosla S, Dean W, Brown D, Reik W, Feil R. Culture of preimplantation mouse embryos affects
fetal development and the expression of imprinted genes. Biol Reprod 2001;64:918-926.
Kind KL, Collett RA, Harvey AJ, Thompson JG. Oxygen-regulated expression of GLUT-1,
GLUT-3 and VEGF in the mouse blastocyst. Mol Reprod Dev 2004;70:37-44.
Land JA. How should we report on perinatal outcome? Hum Reprod 2006; 21:2638-2639.
Lane M, Gardner DK. Ammonium induces aberrant blastocyst differentiation, metabolism, pH
regulation, gene expression and subsequently alters fetal development in the mouse. Biol Reprod
2003; 69:1109–1117.
Lim D, Bowdin SC, Tee L, Kirby GA, Blair E, Fryer F, Lam W, Oley C, Cole T, Brueton LA et
al. Clinical and molecular genetic features of Beckwith–Wiedemann syndrome associated with
assisted reproductive technologies. Hum Reprod 2009;24:741–747.
Manipalviratn S, DeCherney A, Segars J. Imprinting disorders and assisted reproductive
Technology. Fertil Steril 2009;91:305–315.
McIntire DD, Bloom SL, Casey BM, Leveno KJ. Birthweight in relation to morbidity and
mortality among newborn infants. N Engl J Med 1999; 340:1234–1238.
Miles HL, Hofman PL, Peek J, Harris M, Wilson D, Robinson EM, Gluckman PD, Cutfield WS.
In vitro fertilization improves childhood growth and metabolism. J Clin Endocrinol Metab 2007;
92:3441–3445.
Mongelli M, Gardosi J. Fetal growth. Curr Opin Obstet Gynecol 2000; 12:111–115.
Oken E, Kleinman KP, Rich-Edwards J, Gillman MW. A nearly continuous measure of
birthweight for gestational age using a United States national reference. BMC Pediatrics
2003;3:6–16.
Ombelet W, Martens G, De Sutter P, Gerris J, Bosmans E, Ruyssinck G, Defoort P,
Molenberghs G, Gyselaers W. Perinatal outcome of 12,021 singleton and 3108 twin births after
non-IVF-assisted reproduction: a cohort study. Hum Reprod 2006;21:1025–1032.
Powell K, Rooke JA, McEvoy TG, Ashworth CJ, Robinson JJ, Wilmut I, Young LE, Sinclair
KD. Zygote donor nitrogen metabolism and in vitro embryo culture perturbs in utero
development and IGF2R expression in ovine fetal tissues. The riogenology 2006;66:1901–1912.
Rivera RM, Stein P, Weaver JR, Mager J, Schultz RM, Bartolomei MS. Manipulations of mouse
embryos prior to implantation result in aberrant expression of imprinted genes on day 9.5 of
development. Hum Mol Genet 2008;17:1–14.
Romundstad LB, Romundstad PR, Sunde A, von Du¨ring V, Skjærven R, Gunnell D, Vatten LJ.
Effects of technology or maternal factors on perinatal outcome after assisted fertilisation: a
population-based cohort study. Lancet 2008;372:737–743.
Rooke JA, McEvoy TG, Ashworth CJ, Robinson JJ, Wilmut I, Young LE, Sinclair KD. Ovine
fetal development is more sensitive to perturbation by the presence of serum in embryo culture
before rather than after compaction. Theriogenology 2007;67:639–647.
Rosenberg TJ, Garbers S, Lipkind H, Chiasson MA. Maternal obesity and diabetes as risk factors
for adverse pregnancy outcomes: differences among 4 racial/ethnic groups. Am J Public Health
2005; 95:1544–1551.
Schieve LA, Cohen B, Nannini A, Ferre C, Reynolds MA, Zhang Z, Jeng G, Macaluso M,
Wright VC, for the Massachusetts Consortium for Assisted Reproductive Technology
Epidemiologic Research (MCARTER). A population-based study of maternal and perinatal
outcomes associated with Assisted Reproductive Technology in Massachusetts. Matern Child
Health J 2007;11:517–525.
Schrauwers C, Dekker G. Maternal and perinatal outcome in obese pregnant patients. J Matern
Fetal Neonatal Med 2009;22: 226–218.
Sinclair KD, Young LE, Wilmut I, McEvoy TG. In-utero overgrowth in ruminants following
embryo culture: lessons from mice and a warning to men. Hum Reprod 2006;15:68–86.
Sutcliffe AG, Ludwig M. Outcome of assisted reproduction. Lancet 2007; 370:351–359.
Thompson JG, Gardner DK, Pugh PA, McMillan WH, Tervit HR. Lamb birthweight is affected
by culture system utilized during in vitro pre-elongation development of ovine embryos. Biol
Reprod 1995; 53:1385–1391.
Thomson F, Shanbhag S, Templeton A, Bhattacharya S. Obstetric outcome in women with
subfertility. Br J Obstet Gynaecol 2005;112:632–637.
Van Langendonckt A, Demylle D, Wyns C, Nisolle M, Donnez J. Comparison of G1.2/G2.2 and
Sydney IVF cleavage/blastocyst sequential media for the culture of human embryos: a
prospective, randomized, comparative study. Fertil Steril 2001;76:1023–1031.
Wrenzycki C, Herrmann D, Lucas-Hahn A, Korsawe K, Lemme E, Niemann H. Messenger RNA
expression patterns in bovine embryos derived from in vitro procedures and their implications
for development. Reprod Fertil Dev 2005;17:23–35.
Young LE, Sinclair KD, Wilmut I. Large offspring syndrome in cattle and ; sheep. Rev Reprod
1998;3:155-163.
Young LE, Fernandes K, McEvoy TG, Butterwith SC, Gutierrez CG, Carolan C, Broadbent PJ,
Robinson JJ, Wilmut I, Sinclair KD. Epigenetic change in IGF2R is associated with fetal
overgrowth after sheep embryo culture. Nature Genet 2001;27:153-154.
Zhang J, Bowes WA. Birth-weight-for-gestational-age patterns by race, sex, and parity in the
United States population. Obstet Gynecol 1995;86:200-208.
Предоставлено 19 июля 2009г.; повторно предоставлено 20 ноября 2009г.; принято 30
ноября 2009г.