На правах рукописи Филиппова Наталья Андреевна

На правах рукописи
Филиппова Наталья Андреевна
РОЛЬ Toll-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И ИЛ-10 В ПАТОГЕНЕЗЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЕРСИНИОЗА
14.00.36 – Аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2007
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научные руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Иван Генрихович Козлов
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Юрген Хисеманн
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Марина Александровна Стенина
доктор медицинских наук, профессор Виктор Фадеевич Семенков
Ведущая организация:
Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального
медико-биологического агентства России
Защита состоится «29» мая 2007г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «26» апреля 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент
Т.Е. Кузнецова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность, цель и задачи исследования
Млекопитающие обладают множеством рецепторов для распознавания
микробных агентов и немедленного запуска врожденного иммунного ответа.
В частности, к ним относятся так называемые toll-like рецепторы (TLRs), которые также известны как паттерн-распознающие (PRRs, pattern recognition
receptors). В настоящее время у человека идентифицировано 10, а у мышей 9
TLRs [Ковальчук Л.Н., Ганковская Л.В., 2005; Chuang T., 2001; Vasselon T.,
2002]. В норме система TLRs участвует в защите организма от непатогенных,
условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, поддерживая иммунный гомеостаз. Характерной чертой ряда патогенных микроорганизмов является способность преодолевать первичную линию защиты, частью которой
являются TLRs. Во многом ответственным за неспособность врожденной
иммунной системы справиться с патогеном является ИЛ-10.
Одним из патогенных микроорганизмов, способных к подавлению
иммунной защиты хозяина, является Yersinia enterocolitica. Среди иммуносупрессивных воздействий этого патогена наибольшую роль отводят:
 короткодистантному эффекту – прямое подавление синтеза фактора
некроза опухоли-α (ФНО-α) через активацию TLRs, осуществляемое за
счет аппарата секреции/транcлокации III типа (TTS) и белков наружной
мембраны Y. enterocolitica (Yops – Yersinia outer proteins);
 длиннодистантному эффекту – непрямое подавление синтеза ФНО-α,
реализуемое через V-антиген Yersinia (LcrV).
Несмотря на достаточное количество исследований, молекулярные
механизмы, лежащие в основе преодоления Y. enterocolitica иммунологической защиты организма, остаются не до конца изученными. Для ряда
других патогенов они и вовсе неизвестны.
Поэтому целью данной работы является изучение in vivo и in vitro
иммуномодулирующих эффектов основного антигена Y. enterocolitica –
LcrV.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Определение механизмов иммуносупрессивного действия Y. enterocolitica
на клетки врожденной иммунной системы и роли LcrV в этом процессе.
2. Определение рецептора(ов) врожденного иммунитета, отвечающего(их)
за взаимодействие с LcrV Y. enterocolitica.
3. Выявление активного региона LcrV, ответственного за взаимодействие
с рецептором.
4. Выявление роли TLR2 в иерсиниозе и восприимчивости мышей разных
линий к Y. enterocolitica.
5. Сравнение значимости TLR2 и TLR4 в развитии инфекционного процесса при заражении животных Y. enterocolitica.
Научная новизна работы
Выявлено, что V-антиген Y. enterocolitica (LcrV) оказывает иммуносупрессивный эффект как in vitro, так и in vivo, который выражается в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-α.
Впервые показано, что иммуносупрессивное действие LcrV проявляется при условии одновременной экспрессии на клетках хозяина CD14 и
TLR2. Установлено, что взаимодействие LcrV с рецепторным комплексом
CD14/ TLR2 вызывает генерацию внутриклеточного сигнала и активацию
NF-κB.
Проведен анализ аминокислотной последовательности V-антигена Y.
enterocolitica, и обнаружен участок аа31-49 NH2-конца LcrV, обладающий
наиболее выраженной иммуносупрессивной активностью.
Впервые получены данные о восприимчивости линейных мышей к
иерсиниозу в зависимости от их генотипа. Показано, что линейные мыши с
отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу,
чем животные, экспрессирующие этот рецептор. Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ-10 и высокими – ФНО-α, за исключением сублиний мышей C3H.
Обнаружено, что у мышей сублиний C3H даже при отсутствии экспрессии TLR2 сохраняется повышенная восприимчивость к иерсиниозу, а
цитокиновый ответ на rLcrV не изменяется.
В результате сравнения инфекционного процесса, вызванного Y.
enterocolitica у линейных мышей, установлено, что экспрессия TLR2 при
иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа
организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4.
Практическая значимость полученных результатов
Представленные исследования расширяют имеющиеся представления о механизмах иммуносупрессивного воздействия Y. enterocolitica на
врожденные иммунные реакции человека и животных. Кроме того, полученные в работе данные способствуют более глубокому пониманию функционирования достаточно мало изученных рецепторов TLR2 и их возможной двоякой роли во врожденном иммунном ответе на бактериальные инфекции.
Выявленная в исследованиях ведущая роль ИЛ-10 в патогенезе иерсиниоза, а также имеющаяся к настоящему времени технология создания
терапевтических моноклональных антител создают предпосылки для разработки новых подходов для лечения этого инфекционного заболевания. С
другой стороны, обнаруженный активный пептидный фрагмент LcrV, высокоэффективный в подавлении иммунного ответа на Y. enterocolitica, может послужить основой для создания нового иммуносупрессивного лекарственного препарата.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. V-антиген Y. enterocolitica (LcrV) и синтетические пептиды, отражающие часть его последовательности при взаимодействии с рецепторным
комплексом CD14/TLR2 обладает иммуносупрессивным эффектом как
in vitro, так и in vivo, который проявляется в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-α.
2. Линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие TLR2. Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ10 и высокими – ФНО-α, за исключением сублиний мышей С3Н.
3. Экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки
зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4.
Апробация работы
Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке фонда
DFG (Мюнхен, Германия), включена в проект программы Graduiertenkolleg
«Механизмы подавления врожденной иммунологической защиты организма Y. enterocolitica».
Материалы диссертации неоднократно докладывались в Институте
гигиены и медицинской микробиологии им. М. Петтенкофера (Универси-
тет им. Л. Максимилиана, Мюнхен, Германия) в 2001-2003 г.г., на Съезде
молодых ученых, работающих по программе Graduiertenkolleg фонда DFG
(Ульм, Германия, 2001 г.). Основные результаты работы были представлены на Съезде Немецкого общества гигиены и микробиологии (6–10 октября 2002 г., Гейдельберг, Германия), 11-м Европейском совещании по бактериальным белковым токсинам (ETOX-11; 28 июня–3 июля 2003 г., Прага, Чехия), 8-й Конференции Международного эндотоксинового общества
(15–18 ноября 2004 г., Киото, Япония), Конференции молодых ученых, посвященной памяти Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (4–7 декабря 2006 г., Пермь, Россия).
Апробация работы проходила на совместном заседании кафедры
фармакологии и кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. По результатам выполненных исследований опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати.
Внедрение результатов исследования
Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры фармакологии и лекционном курсе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в экспериментальной работе бактериологической лаборатории по исследованию вирулентных свойств Y. enterocolitica Института гигиены и медицинской микробиологии им. М. Петтенкофера (Университет им. Людвига Максимилиана, Мюнхен, Германия).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав и заключения. Работа содержит 19 рисунков и 2
таблицы. В списке использованной литературы – 222 источника.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Часть работы выполнена в Институте гигиены и медицинской микробиологии им. М. Петтенкофера (Университет им. Людвига Максимилиана, Мюнхен, Германия).
Экспериментальные животные. В работе были использованы мыши линий C57BL/6, SV129, C3H/HeN и C3H/HeJ. Характеристика линий по
экспрессии TLR и CD14 была следующей:
 C3H/HeN-TLR4 – дикий тип мышей, экспрессирующий TLR4;
 C3H/HeJ-TLR2/4(+/d) – мыши, имеющие мутацию в TLR4, но экспрессирующие TLR2;
 C3H/HeN-TLR2(-/-), (TLR2/4(-/+)) – мыши с мутацией в TLR2, но экспрессирующие TLR4;
 C3H/HeJ-TLR2(-/-), (TLR2/4(-/d)) – мыши с мутацией в TLR4 и с дополнительным отсутствием экспрессии TLR2;
 C57BL/6 – дикий тип;
 C57BL/6-TLR2(-/-) – мыши с мутацией в TLR2;
 C57BL/6-CD14(-/-) – мыши с мутацией в CD14;
 SV129 – дикий тип;
 SV129-TLR2(-/-) – мыши с мутацией в TLR2.
Животные содержались в специальных апатогенных условиях. В
экспериментах были использованы самки в возрасте 4-6 недель.
Получение перитонеальных макрофагов мышей. Для получения
перитонеальных макрофагов были использованы мыши линий C57BL/6,
SV129 и С3H. Животным интраперитонеально был введен 1 мл 10% раствора пептона. Через три дня был получен перитонеальный клеточный экссудат. Для проведения опытов in vitro клетки поддерживали культивированием в среде RPMI 1640, содержащей 2 mM L-глютамина, 10 mM Хепесбуфера, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина и 10% инактивированную ЭТС при 37˚С и 5% содержании СО2 в окружающем воздухе.
Поддержание клеточных линий Mono Mac-6, J774, HEK 293.
Клетки Mono Mac-6 были любезно предоставлены Dr. H.W.L. ZieglerHeitbrock, Институт иммунологии, Мюнхен, Германия. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 mM L-глютамина,
неэссенциальных аминокислот, 1 mM пирувата натрия, 9 ug/мл коровьего
инсулина, 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина . Для экспериментов использовали 3-суточные культуры; концентрация клеток составляла 2×105 клеток/мл.
Клон макрофагальных клеток J774 был любезно предоставлен группой
K. Rueckdeschel, Институт медицинской микробиологии и гигиены им. М.
Петтенкофера, Мюнхен, Германия. Макрофаги культивировались в среде
RPMI 1640 с добавлением 10% ЭТС, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл
стрептомицина. Была использована концентрация 1×106 клеток/мл.
Клон клеток HEK 293 (человеческие эмбриональные почечные клетки) культивировались в среде DMEM c добавлением 10% инактивированной ЭТС. Клетки линии HEK 293 использовались для трансфекции в концентрации 3×105 клеток/мл.
Штамм Yersinia enterocolitica O8 WA 324. Бактерии культивировались на чашках Петри с агаром или в жидкой среде Luria-Bertani (LBсреда; 10 г триптона, 5 г дрожжей, 5 г NaCl, дистиллированная H 2O до 1 л,
рH 7,4-7,6) с добавлением антибиотиков в 15 мл пробирках в инкубаторешейкере при 200 об/мин, 27˚С в течение 15 часов.
Экспериментальное инфицирование мышей. Мышей инфицировали перорально штаммом Y. enterocolitica О8 WA 324 в рабочей концентрации 5×107 CFU. Через 5 дней животных забивали, выделяли печень и
селезенку. Органы помещали в пластиковые пробирки в 1 мл охлажденного раствора Хенкса, содержащего 1% 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS), затем гомогенизировали. Суспензию осаждали центрифугированием. Супернатанты были взяты для измерения уровня цитокинов.
С целью определения числа бактерий в печени и селезенке органы
гомогенизировали в 10 мл ФСБ, делали посевы разведений гомогенатов на
селективную среду для Yersinia и подсчитывали количество выросших колоний после инкубации в течение 40 часов при 27˚С, 5% СО2.
Определение уровня цитокинов методом ELISA. Уровни мышиного ФНО- были определены в 96-луночных круглодонных иммуноплейтах с использованием покровных крысиных-антимышиных антител к
ФНО- (G281-2626) и меченых биотином анти-ФНО- антител (MP6XT3).
Уровень человеческого ФНО- был измерен при помощи мышиных античеловеческих (mAb1) антител и меченых биотином анти-ФНО- антител
(mAb11) (BD PharMingen). Мышиный ИЛ-10 был изучен с помощью коммерческого набора (RLD systems) согласно рекомендациям производителя.
Измерение выполнялось с помощью DuoSet ELISA Development kit.
Трансфекция клона клеток 293 HEK. Культуру клеток HEK 293 в
концентрации 3×105 клеток/мл разносили в 6-луночный плейт и инкубировали при 37C, 5% CO2 в течение 12 часов. Трансфекцию клеток проводили
методом кальциево-фосфатной преципитации. Клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с использованием реагентов Promega Corp.
Метод иммунофлуоресценции. Этот метод был использован для визуализации связывания LcrV с TLR2 в условиях живой культуры. Иммунофлуоресценцию измеряли с помощью конфокального лазерного микроскопа.
Выделение плазмиды с помощью Nucleobond AX100 Kit (Machery-Nagel). Для выделения высококачественной ДНК в высоких концентрациях (до 100 мкг) был использован Nucleobond AX100 Kit. Принцип выделения ДНК основан на алкалиновом лизисе клеток, очищении нуклеиновых кислот на основе анионообменной хроматографии. Процедура выделения проводилась согласно инструкциям производителя.
С целью очистки ДНК от контаминирующих протеинов была применена экстракция фенолом. Для очищения препарата ДНК от контаминации
солями или концентрирования препарата ДНК был использован метод
осаждения этанолом. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на основе
метода спектрофотометрии. Полученную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР. ПЦР-продукт анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Статистическая обработка результатов. При постановке всех экспериментов параллельно с опытными вели контрольные пробы. Это позволило учитывать только те изменения, которые возникали в культуре клеток
под влиянием специфических воздействий, а не являлись результатом
естественных колебаний характеристик. Для статистического анализа результатов использовалась программа "Microstat" (Ecosoft Inc.).
Все результаты выражали как значения среднего  стандартное отклонение. Полученные в ходе экспериментов данные распределялись по
нормальному закону, поэтому для оценки достоверности различий применяли критерий Стьюдента, вычисляя коэффициент достоверности. Различие средних показателей считалось достоверным, если величина коэффициента достоверности соответствовала уровню значимости P<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ
Иммуномодулирующий эффект rLcrV на клетки хозяина вследствие экспрессии CD14. ЛПС бактерий активируют комплекс CD14/TLRs в
клетке хозяина [Ulevitch R.J., 1999]. Нами была поставлена задача устано-
вить, взаимодействует ли V-антиген Y. enterocolitica с CD14 на клетках хозяина и связано ли это взаимодействие с индукцией синтеза ИЛ-10. Для реализации поставленной задачи были получены перитонеальные макрофаги мышей линии C57BL/6 с отсутствием экспрессии CD14 (CD14(-/-)) и мышей дикого типа, экспрессирующих данный маркер (CD14(+/+)). Макрофаги разносили в планшет и стимулировали рекомбинантным LcrV (rLcrV) в концентрации 5 мкг/мл. После окончания 2-часового культивирования супернатанты собирали и оценивали в них уровень ИЛ-10 с помощью ELISA.
Как показали полученные результаты, интактные макрофаги мышей
дикого типа и животных, негативных по экспрессии CD14, практически не
синтезировали ИЛ-10. При стимуляции rLcrV макрофаги мышей дикого типа
скачкообразно усиливали продукцию цитокина. Концентрация ИЛ-10 в супернатантах этих клеток при стимуляции возрастала почти в 10 раз. Напротив, CD14(-/-) макрофаги на присутствие в среде rLcrV не реагировали и уровень продукции ИЛ-10 практически не отличался от нестимулированного
контроля. На основании этих данных можно сделать предположение об участии CD14 в rLcrV-индуцированной экспрессии ИЛ-10.
Подтверждением высказанного выше предположения явились результаты, полученные в экспериментах с клеточной линией Mono-Mac-6 и
оценкой продукции ФНО-α. Клетки разносили в планшет и культивировали 13 часов. За 1 час до конца культивирования в опытные лунки добавляли блокирующие связывание ЛПС с CD14 анти-CD14 мАт (bIG-10 или
MEM-18) в концентрации 10 мкг/мл. В качестве контроля использовали
культуры без добавления антител или с добавлением неблокирующих видоспецифических анти-CD14 мАт (bIG 4 и MEM-15) в той же концентрации, что в опытных культурах. Через 13 часов в культуры добавляли 5
мкг/мл rLcrV или 1 нг/мл липополисахаридов на 6 часов. Затем проводили
стимуляцию макрофагов 1 мг/мл зимозана А и через 12 часов в супернатантах определяли уровень секреции ФНО-α методом ELISA.
Как видно из данных, представленных на рисунке 1, в контрольных
культурах без добавления каких-либо стимуляторов продукция ФНО-α
практически отсутствовала. Стимуляция клеток линии Mono-Mac-6 зимозаном вызывала многократное увеличение секреции цитокина. В свою очередь, как rLcrV, так и ЛПС значительно угнетали стимулированную зимозаном продукцию ФНО-α макрофагами Mono-Mac-6. Угнетающее дей-
ствие обоих агентов отменялось при добавлении в культуры блокирующих
анти-CD14 мАт (bIG-10 или MEM-18) и не изменялось в присутствии неблокирующих видоспецифичных мАт (для ЛПС данные не показаны).
Рисунок 1. Продукция ФНО-α культурой клеток Mono Mac-6 при их стимуляции зимозаном А в присутствии rLcrV или ЛПС в комбинации с блокирующими (bIG 10 и MEM-18) или неблокирующими анти-CD14 (bIG4 и
MEM18) мАт.
Взаимодействие LcrV с комплексом CD14/TLR2. Активация TLR
млекопитающих микробными продуктами запускает внутриклеточные сигнальные пути в клетке хозяина, в результате чего происходит транскрипция
генов, регулирующих развитие врожденного и приобретенного иммунного
ответа [Aderem A., 2000; Akira S., 2001]. Целью этого фрагмента исследований явилось определение TLR, который связывается с LcrV Y. enterocolitica, и
вследствие активации которого LcrV оказывает иммуномодулирующий эффект на клетки хозяина. FLAG-меченые плазмиды (TLR1, TLR2 и
TLR4/MD2) и ELAM-1-люциферазу трансфецировали в клетки линии HEK
293. Предварительно для нормализации эффективности трансфекции клетки
были трансфецированы плазмидой, кодирующей RSV-β-галактозидазу. Ряд
культур с трансфецированными TLR были дополнительно котрансфецированы плазмидой, кодирующей CD14. Трансфекты в опытных культурах стимулировали в течение 6 часов rLcrV с или без полимиксина В. В качестве контроля использовали нестимулированные клетки или клетки, обработанные
инактивированным высокой температурой rLcrV. Затем клетки лизировали и
измеряли активность люциферазы с помощью хемилюминометра.
Из результатов, представленных на рисунке 2 видно, что среди котрансфецированных клеток повышение активности люциферазы в ответ на
rLcrV было отмечено только для одной комбинации рецепторов, а именно
для CD14/TLR2. Добавление в экспериментальную систему полимиксина В
(рВ), который, как известно, является потенциальным ингибитором липополисахаридов, не влияло на активацию комплекса CD14/TLR2 V-антигеном.
Кроме того, термическая инактивация rLcrV полностью отменяла активацию люциферазы в CD14/TLR2-позитивных клетках (рис. 3).
Рисунок 2. Активность люциферазы в культуре клеток HEK 293 при
трансфекции в них плазмид, кодирующих MD2, CD14 и TLRs. Белые
столбцы – стимуляция rLcrV, черные – нестимулированные клетки.
Рисунок 3. Активность люциферазы в культуре клеток HEK 293, котрансфецированных CD14/TLR2 при их стимуляции rLcrV (в присутствии и в
отсутствии рВ), rPcrV и синтетическими пептидами (V7-9-5), повторяющими аминокислотную последовательность региона NH2-конца LcrV.
Таким образом, распознавание LcrV Y. enterocolitica клетками хозяина осуществляется именно через TLR2. Необходимым условием распознавания и активации внутриклеточных сигнальных путей является коэкспрессия TLR2 с CD14.
Активация комплекса CD14/TLR2 синтетическими пептидами,
полученными из LcrV. На основании результатов исследований в нашей
лаборатории было установлено, что активный регион LcrV, ответственный
за активацию CD14/TLR2 и индукцию ИЛ-10-зависимого подавления вы-
работки ФНО-α в клетке хозяина, в аминокислотной последовательности
LcrV располагается где-то между аа31-70. Нами сделана попытка уточнить
локализацию региона LcrV, ответственного за активацию комплекса
CD14/TLR2. При анализе аминокислотной последовательности гомолога
LcrV Pseudomonas auruginosa – PcrV, было установлено, что регион аа1-39
является неактивным в отношении активации CD14/TLR2.
Мы предположили, что данный регион является неактивным и у
LcrV. В связи с этим, были синтезированы 3 синтетических полипептида,
соответствующие следующим локусам LcrV: V5 (aa27-43), V7 (aa31-49),
V9 (aa39-57). Данные пептиды были добавлены в концентрации 10 мкг/мл
в культуры трансфецированных CD14/TLR2 клеток HEK 293 и их эффект
на активацию люциферазы сравнивали с эффектами LcrV и PcrV (оба агента добавляли в концентрации 5 мкг/мл). В контрольные культуры добавляли полимиксин В или инактивированный LcrV.
Из полученных результатов видно (рис. 3), что при стимуляции клеток синтетическим полипептидом V7 активность люциферазы достигала
того же уровня, как и при стимуляции rLcrV, в то время как пептид V5 и
rPcrV не вызывали ответа клеток. Менее выраженная активность люциферазы наблюдалась при стимуляции клеток HEK 293 пептидом V9.
Таким образом, было показано, что синтетический пептид V7, повторяющий аминокислотную последовательность региона aa31-49 NH2конца LcrV, является той самой структурой, которая обеспечивает активацию комплекса CD14/TLR2.
Опосредованное через TLR2 влияние LcrV на продукцию ИЛ-10.
Взаимосвязь экспрессии TLR2 с восприимчивостью мышей к иерсиниозу. Для подтверждения того, что распознавание LcrV Y. enterocolitica
TLR2 приводит к ранее наблюдаемой индукции ИЛ-10 в клетке хозяина,
были получены перитонеальные макрофаги от мышей гибридов SV129 x
B57BL/6 (далее SV129) и линии C57BL/6, как экспрессирующих
(TLR2(+/+)), так и неэкспрессирующих (TLR2(-/-)) TLR2. Как было обнаружено, макрофаги обеих линий мышей, нокаутированных по генам TLR2,
в отличие от клеток животных дикого типа не обладали способностью отвечать на стимуляцию rLcrV усилением продукции ИЛ-10 (рис. 4).
Таким образом, иммуносупрессорный эффект LcrV опосредуется
именно через TLR2 и проявляется как индукция экспрессии противовоспалительного цитокина ИЛ-10.
Рисунок 4. LcrV-индуцированная продукция ИЛ-10 перитонеальными
макрофагами TLR2(-/-) и TLR2(+/+) мышей линии C57BL/6 при их стимуляции rLcrV. Белые столбы – стимуляция rLcrV, черные – интактные клетки; Р < 0,001.
Рисунок 5. Число бактерий в селезенке и печени TLR2(-/-) и TLR2(+/+)
мышей линии SV129 при их пероральном инфицировании Y. enterocolitica.
Черные столбцы – количество бактерий в органах TLR2(-/-) мышей, белые
– число иерсиний в органах TLR2-позитивных животных.
В одной из предыдущих работ нашей лаборатории было продемонстрировано, что мыши с отсутствием экспрессии ИЛ-10 (ИЛ-10(-/-)) имеют
высокую резистентность к иерсиниозу [Sing A., 2002]. На основании этого
было сделано предположение, что и животные с дефектом в экспрессии
TLR2 также будут менее восприимчивы к инфицированию Y. enterocolitica.
Для подтверждения этого предположения была спланирована серия экспериментов, в которой сравнивали иерсиниозную колонизацию печени и селезенки у мышей-нокаутов по TLR2 и животных тех же линий, но дикого типа,
после перорального инфицирования 5×107 CFU Y. enterocolitica O8 (штамм
WA-314).
Было показано, что количество бактерий в селезенке и печени TLR2негативных мышей линий SV129 и C57BL/6 были примерно на 2 порядка
ниже, чем в органах TLR2(+/+) мышей тех же линий (рис. 5). Таким образом, было установлено, что мыши линий SV129 и B57BL/6 с отсутствием
экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем мыши
данных линий, экспрессирующих этот тип PRR. Данные представляют результаты, по крайней мере, 2-х независимых экспериментов, где использовались группы по 5-10 мышей (Р  0,05).
Взаимодействие TLR2 с LcrV. Для исключения возможных неучтенных в предыдущих разделах факторов необходимо было напрямую визуализовать связывание LcrV с TLR2 в условиях живой культуры. В связи с этим
был отработан комплекс методов с использованием латексных микросфер.
Латексные частицы, представляющие собой сульфатные микросферы 4 мкм
в диаметре, были покрыты путем нековалентного взаимодействия рекомбинантными LcrV и PcrV. Молекулярная масса rLcrV была подтверждена при
помощи MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption-ionization mass
spectrometry analysis) (Toplab). Препарат rLcrV не содержал липополисахариды, что было установлено с помощью limulus amebocyte assay (Pyroquant).
Оставшиеся сайты неспецифического связывания забивали альбумином.
Частицы отмывали, эффективность взаимодействия была протестирована с
помощью иммунофлуоресцентного окрашивания микросфер сначала специфическими анти-rLcrV или анти-rPcrV антителами, а затем вторичными
FITC-меченными козьими антикроличьими антителами. Покрытые rLcrV и
rPcrV микросферы осаждали центрифугированием на перитонеальные макрофаги мышей C57BL/6, инкубировали 30 минут при температуре 37˚С,
фиксировали формальдегидом и лизировали тритоном. Для окрашивания в
качестве первичных антител были использованы поликлональные кроличьи
антимышиные TLR2-антитела или поликлональные кроличьи анти-FLAG
антитела. Alexa 586- или 350-меченные козьи антикроличьи или ослиные
антикозьи антитела были использованы в качестве вторичных. Флуоресценцию оценивали под конфокальным лазерным микроскопом.
Как видно из результатов, представленных на рисунке 6, часть латексных микросфер локализовалась вблизи мембраны макрофагов. При
этом rLcrV-покрытые микросферы были окружены специфической флуоресценцией, в то время как концентрирования окраски вокруг rPcrV-частиц
не отмечалось. Таким образом, удалось подтвердить целый ряд вышепри-
веденных данных и провести непосредственную визуальную оценку rLcrVTLR2 взаимодействия.
Рисунок 6. Иммунофлуоресцентное окрашивание TLR2 при добавлении к
перитонеальным макрофагам микросфер покрытых LcrV (верхняя часть
рисунка или PcrV (нижняя часть рисунка).
Индукция rLcrV выработки ИЛ-10 при экспрессии TLR2 in vivo.
Чтобы проанализировать, стимулирует ли in vivo rLcrV продукцию ИЛ-10
через взаимодействие с TLR2, были использованы мыши линии С57BL/6 с
отсутствием экспрессии TLR2 и мыши этой же линии, экспрессирующие
данный рецептор. Животным делали однократную внутрибрюшинную
инъекцию 100 мкг rLcrV.
В одной из публикаций упоминалось, что наибольшая продукция
ИЛ-10 наблюдалась через 90 минут после введения мышам фузион протеина, состоящего из V-антигена и полигистидина (Vh) [Nakajima R., 1995].
В связи с этим в этом фрагменте работы использовался тот же срок. Через
1,5 часа после введения rLcrV мыши были забиты, печень и селезенка выделены, гомогенизированы и супернатанты были взяты для измерения
уровня ИЛ-10 с помощью ELISA.
Анализ уровня ИЛ-10 в пробах показал некоторое снижение уровня
того цитокина в селезенках мышей линии С57BL/6 с отсутствием экспрессии TLR2 по сравнению с продукцией цитокина в селезенках мышей той
же линии, экспрессирующих TLR2. Аналогичное, но незначительное различие в уровнях ИЛ-10 было обнаружено в печени TLR2-нокаутов и животных дикого типа.
Таким образом, rLcrV активирует TLR2, в результате чего возникает
индукция ИЛ-10 in vivo.
Влияние активации TLR2 на продукцию ИЛ-10 и ФНО- у мышей линии С57ВL/6 при инфицировании Y. enterocoliticа. На данном
этапе исследования были использованы мыши линии C57BL/6 с отсутствием экспрессии и экспрессирующие TLR2. Животных инфицировали перорально Y. enterocolitica, через 5 дней забивали и оценивали уровни ИЛ-10 и
ФНО-α в супернатантах гомогенатов печени и селезенки.
Как и ожидалось, после инфицирования уровень ИЛ-10 в селезенке и
печени мышей, экспрессирующих TLR2, был значительно выше, чем у
TLR2-/- животных. Напротив, продукция ФНО- в селезенке зараженных
мышей с отсутствием экспрессии TLR2 была значительно более высокой
по сравнению с диким типом животных (рис. 7, 8). Аналогичные, но менее
выраженные различия в продукции цитокинов наблюдались в печени инфицированных мышей.
Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что
при инфицировании мышей линии C57BL/6 Y. enterocolitica происходит активация TLR2, вследствие чего возникает индукция экспрессии ИЛ-10 в
клетках хозяина, который, в свою очередь, подавляет продукцию ФНО-.
Роль TLR2 и TLR4 в иерсиниозе. Для выявления роли TLR2 и
TLR4, как ЛПС-распознающих рецепторов, во врожденной иммунной защите организма при иерсиниозе в исследовании были использованы следующие линии мышей C3H/HeN – TLR4-дикий тип мышей, экспрессирующий TLR4 и TLR2 (TLR2/4(+/+)); C3H/HeJ – (TLR2/4(+/d)) мыши, имеющие мутацию в TLR4, но экспрессирующие TLR2. На основе данных линий были созданы следующие мутантные линии мышей: C3H/HeN-TLR2(/-) (TLR2/4(-/+)) – мыши с мутацией в TLR2, но экспрессирующие TLR4;
C3H/HeJ-TLR2(-/-) (TLR2/4(-/d)) – мыши с мутацией в TLR4 и с дополнительным отсутствием экспрессии TLR2. Инфицирование мышей и подготовку супернатантов проводили по аналогичной с предыдущим разделом
результатов методике. Супернатанты в различных разведениях высевали
на селективную среду для Yersinia, инкубировали в течение 40 ч при 27˚С,
5% СО2 и подсчитывали количество выросших колоний.
Рисунки 7 и 8. Продукция ИЛ-10 и ФНО- при пероральном инфицировании мышей линии C57BL/6 Y. enterocolitica. Черные столбцы – уровень цитокинов в селезенке TLR2(-/-) мышей; белые – уровень цитокинов в селезенке мышей дикого типа. Для рис. 7 – Р0,01, для рис. 8 – Р0,05. Данные
представляют средние значения, полученные в независимых экспериментах, в которых использовались группы из 4-х мышей.
Из результатов, представленных на рис. 9, видно, что в органах мышей линии С3Н с отсутствием экспрессии TLR4 выявлено большее количество колоний Y. enterocolitica, чем в печени и селезенке животных линии
С3Н, экспрессирующих TLR4. Таким образом, мыши генотипа С3Н, не
экспрессирующие TLR4 являются более восприимчивыми к иерсиниозу,
чем мыши с экспрессией данного рецептора.
Неожиданные результаты были получены при сравнении негативных
и позитивных по экспрессии TLR2 мышей линий С3Н. В отличие от наших
прежних результатов, полученных в экспериментах с мышами С57ВL/6,
мыши линии С3Н, не экспрессирующие TLR2 (C3H/HeN TLR2(-/-);
C3H/HeJ TLR2(-/-)), оказались более восприимчивыми к пероральному
инфицированию Y. enterocolitica, чем животные дикого типа той же линии.
Более того, активация TLR2 в клетках хозяина представляется более важной с точки зрения вирулентности Y. enterocolitica по сравнению с активацией TLR4, т.к. в селезенке и печени мышей C3H/HeJ с отсутствием экспрессии TLR4 было обнаружено меньшее количество бактерий, чем у
C3H/HeN мышей с мутацией в TLR2. Соответственно, у мышей, не экспрессирующих TLR4 и с дополнительным отсутствием экспрессии TLR2
(C3H/HeJ TLR2(-/-); TLR2/4(-/d)), наблюдалось большее количество бактерий в селезенке и печени, чем у мышей, имеющих мутацию только в TLR4
(C3H/HeJ; TLR2/4(+/d)), тогда как дополнительное присутствие или отсутствие TLR4 у мышей с дефектом TLR2 не имело значительного влияния на
количество иерсиний (рис. 9).
Рисунок 9. Число бактерий в селезенке и печени мышей линии С3Н при их
пероральном инфицировании Y. enterocolitica. Обозначения: C3H/HeN
(TLR2/4(+/+), черные столбцы), C3H/HeJ (TLR2/4(+/d), белые столбцы),
C3H/HeN-TLR2(-/-) (TLR2/4(-/+), серые столбцы) и C3H/HeJ-TLR2(-/-)
(TLR2/4(-/d), заштрихованные столбцы). Данные представляют средние
значения 7 различных экспериментов, в которых использовались группы
из 5 мышей.
Зависимость продукции ИЛ-10 от активации TLR2 рекомбинантным LcrV в перитонеальных макрофагах мышей линии С3Н. В
связи с тем, что нами были выявлены линейные различия относительно
роли TLR2 при иерсиниозной инфекции между мышами C57BL/6 и С3Н,
следующей задачей данной работы являлось определение взаимосвязи
между активацией TLR2 и индукцией экспрессии ИЛ-10 в клетках мышей
линии С3Н. Для решения поставленной задачи перитонеальные макрофаги
мышей С3Н (C3H/HeN, C3H/HeJ) стимулировали in vitro рекомбинантным
LcrV и оценивали уровень ИЛ-10.
Как и в полученных нами ранее результатах, в экспериментах с перитонеальными макрофагами от мышей генотипов SV129 и C57BL/6 продукция ИЛ-10 была резко снижена в rLcrV-стимулированных макрофагах
мышей C3H/HeN TLR2(-/-) (рис. 10) и C3H/HeJ TLR2(-/-).
Таким образом, из приведенных данных следует, что наблюдаемые
различия в исходе кишечного иерсиниоза у мышей генотипов C57BL/6 и
C3H не вызваны различным влиянием активации TLR2 на индукцию ИЛ10 у мышей этих линий.
Зависимость продукции ИЛ-10 от активации TLR2 у мышей генотипа С3Н, перорально инфицированных Y. enterocolitica. Далее была проанализирована продукция ИЛ-10 в селезенке мышей генотипов C3H/HeN
(TLR2/4(+/+)) и C3H/HeJ (TLR2/4(+/d)), экспрессирующих TLR2, и мышей
той же линии с отсутствием экспрессии TLR2 (C3H/HeN TLR2(-/-) – TLR2/4(/+)), C3H/HeJ TLR2(-/-) – TLR2/4(-/d)). Мышей инфицировали и измеряли
уровень ИЛ-10 в супернатантах гомогенатов органов, как описано выше.
В результате исследования наблюдали более низкую продукцию ИЛ10 в селезенке мышей C3H/HeN и C3H/HeJ, не экспрессирующих TLR2, по
сравнению с уровнем цитокина в селезенке мышей указанных линий, экспрессирующих TLR2, что соответствовало данным полученным в экспериментах с мышами линии C57BL/6.
Рисунок 10. LcrV-стимулированная продукция ИЛ-10 перитонеальными
макрофагами мышей линии С3Н, экспрессирующими и не экспрессирующими TLR2. Белые столбцы – уровень ИЛ-10 при стимуляции перитонеальных макрофагов rLcrV; черные – продукция цитокина интактными
клетками. Данные представлены средними значениями, полученными в 3-х
различных экспериментах (Р 0,05).
Таким образом, весь комплекс экспериментальных данных позволяет
сделать заключение, что бактериальный, нелипидированный вирулентный
рекомбинантный протеин LcrV (rLcrV) и синтетические пептиды, отражающие часть его последовательности, вызывают индукцию экспрессии ИЛ10 вследствие активации в клетке рецепторного комплекса CD14/TLR2. В
результате индукции ИЛ-10 происходит подавление выработки ФНО-. Вероятно, данный процесс, происходящий в клетке хозяина при воздействии
на нее V-антигена, является механизмом, с помощью которого Y.
enterocolitica удается уклоняться от врожденного иммунного ответа.
ВЫВОДЫ
1. V-антиген Y. enterocolitica (LcrV) обладает иммуносупрессивным эффектом как in vitro (макрофаги мыши и человека), так и in vivo, который
проявляется в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-α.
2. Необходимым условием иммуносупрессивного действия LcrV является
одновременная экспрессия на клетках CD14 и TLR2. Взаимодействие
LcrV с рецепторным комплексом CD14/TLR2 приводит к генерации
внутриклеточного сигнала и активации NF-kB.
3. Синтетический пептид, соответствующий участку аа31-49 последовательности NH2-конца LcrV, обладает наиболее выраженной иммуносупрессивной активностью.
4. Линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие TLR2. Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ10 и высокими – ФНО-α, за исключением сублиний мышей С3Н.
5. Отсутствие экспрессии TLR2 у мышей сублиний С3Н сопровождается
повышением восприимчивости к иерсиниозу при таком же цитокиновом ответе на rLcrV, как и у других линейных мышей.
6. У мышей С3Н экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Sing A., Tvardovskaia N. (Filippova N.), Rost D., Kirschning C.J., Wagner
H., Heesemann J. Contribution of toll-like receptors 2 and 4 in an oral Y.
enterocolitica mouse infection model // Int. J. Med. Microbiol.- 2003.- V.293.- P.341-8.
2. Sing A., Rost D., Tvardovskaia N. (Filippova N.), Roggenkamp A., Geiger
A.M., Kirschning C.J., Wiedemann A., Aepfelbacher M., Heesemann J.
Mechanisms of Yersinia enterocolitica evasion of the host innate immune
response by V-antigen // Adv. Exp. Med. Biol.- 2003.- V.- 529.-P. 165-7.
3. Sing A., Rost D., Tvardovskaia N. (Filippova N.), Roggenkamp A.,
Kirschning C.J., Wiedemann A., Aepfelbacher M., Heesemann J. Yersinia Vantigen exploits toll-like receptor 2 and CD14 for interleukin 10-mediated
immunosuppression // J. Exp. Med.- 2002.- V.- 196.-P. 1017-24.
4. Reithmeier-Rost D., Bierschenk S., Filippova N., Schroeder-Braunstein J.,
Sing A. Yersinia V-antigen induces both homo- and heterotolerance in an IL10-involving manner // Cell. Immunol.- 2005.- V.- 231.-P. 63-64.
5. Sing A., Rost D., Tvardovskaia N. (Filippova N.), Roggenkamp A., Geiger
A.M., Kirschning C.J., Wiedemann A., Aepfelbacher M., Heesemann J.
Mechanisms of Yersinia enterocolitica evasion of the host innate immune
response by V-antigen // 54 Tagung der Deutschen Geselschaft fuer Hygiene
und Mikrobiologie; Heidelberg, Germany, Oct 6-Oct 10 2002.P.52-53.
6. Sing A., Rost D., Tvardovskaia N. (Filippova N.), Roggenkamp A., Geiger
A.M., Wiedemann A., Aepfelbacher M., Heesemann J. Mechanisms of
Yersinia enterocolitica evasion of the host innate immune response by Vantigen // 11th European Workshop on Bacterial Protein Toxins (ETOX-11);
Celakovice/Prague, Czech Republic, Jun 28-Jul 3, 2003. P. 131-132.
7. Reithmeier-Rost D., Bierschenk S., Filippova N., Schroeder-Braunstein J.,
Sing A. Yersinia V-antigen induces both TLR homo- and heterotolerance in
an IL-10-involving manner // 8th Conference of The International Endotoxin
Society; Kyoto, Japan, Nov 15-18, 2004. P. 33.
8. Филиппова Н.А., A. Sing, J. Heesemann, И.Г. Козлов. Роль Tollрецепторов и ИЛ-10 в патогенезе экспериментального иерсиниоза на
мышиной модели // Вестник Уральской медицинской академической
науки. - 2006. - №3 (1).- с. 256-258.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИЛ
– интерлейкин
КОЕ (CFU)
– колониеобразующие единицы
ЛПС
– липополисахариды
мАт
– моноклональные антитела
ФНОα
– фактор некроза опухоли альфа
ФСБ
– фосфатно-солевой буфер
ЭТС
– эмбриональная телячья сыворотка
PRR
– паттерн-распознающий рецептор
rLcrV
– рекомбинантный LcrV
TLR
– toll-like рецептор
TTS
– система секреции/транслокации протеинов III типа
Yops
– белки наружной мембраны иерсиний