Л13 2014 Файл

Кинетические методы и ИФА
Лекция 13
I. Современные варианты
ферментативных методов
II. ИММУНОАНАЛИЗ
Лектор к.х.н., доцент
Ю.Ю.Петрова

Изучены свойства пероксидазы из корней хрена в
обращенных мицеллах додецилсульфоната натрия
(ДДС) в водно-органической среде бензолпентанол-вода. Показана перспективность
применения прямых и обращенных мицелл ДДС в
целях химического анализа на примере методик
определения субстратов (H2O2 и цистеина),
ингибиторов (сульфаниламида) и активатора
(имидазола) пероксидазы по реакции окисления одианизидина пероксидом водорода.
Розалин Сасмен Ялоу – лауреат Нобелевской
премии 1977 г. по физиологии




Розалин Сасмен Ялоу родилась 19 июля 1921 года в Нью-Йорке. Окончила
Хантеровский колледж в 1941 году, где у неё появился интерес к физике. Но в
тот же год она получила приглашение в Университет Иллинойса в УрбанеШампэйн. В 1945 году она стала PhD в ядерной физике.
После защиты диссертации Сасмен Ялоу стала работать в Бронкском
госпитале Управления делами ветеранов, где в сотрудничестве с Соломоном
Берсоном она участвовала в разработке метода радиоизотопного
определения биологических составляющих крови. Изначально они
разработали метод исключительно чувствительного детектирования инсулина
в человеческой плазме. Разработанный радиоиммунологический метод стал
широко применяться к сотням других минорных компонентов крови, таких как
гормоны, витамины и ферменты, которые не могли быть измерены раньше изза их низкой концентрации в крови.
Хотя большинство научных работ Яллоу выполнила в соавторстве с
Соломоном Берсоном, он умер до присуждения Нобелевской премии.
Скончалась 30 мая 2011 года в Нью-Йорке.
Иммунный анализ


В основе методов иммунного анализа
лежат взаимодействия антиген-антитело.
При попадании в организм человека или
животного чужеродного высокомолекулярного
вещества вступает в действие иммунная
система. Она вырабатывает специальное
вещество, способное связать постороннее
вещество и, таким образом, его обезвредить.
Чужеродное вещество называется антигеном, а
вырабатываемое иммунной системой
«противоядие» — антителом.
Принципиальная схема протекания
иммунологической реакции
Антиген [Аг или Ag] (гормон, вирус) - вещество (в том
числе чужеродное), способствующее образованию в
организме антител и реагирующее с ними.
Антитело [Ат или Ak] («противоядие») — это белок,
который посредством стереоспецифических
взаимодействий распознает чужеродные для организма
вещества, например, бактерии или вирусы.
Иммунный комплекс
В результате реакции антигена (Ag) с
антителом (Ак) образуется иммунный комплекс:
Иммунный анализ


В методе иммуноанализа обычно
используют конкуренцию между
определяемым антигеном и меченым
стандартным антигеном за
специфические участки распознавания на
антителе.
Меткой может служить радиоактивный
изотоп, фермент или флуоресцентный
краситель.
Антитела
(Ат, Ak)

представляют собой высокомолекулярные
глобулины (Мr масса около 150 000). Белок,
обладающий активностью антитела, называют иммуноглобулином (Ig). В крови
человека обнаружено пять основных типов
иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).
Структура антитела:
214 АК
430 АК
Антигенами (Аг, Ag)


являются высокомолекулярные вещества
(например, белки, пептиды или
полисахариды) с Мr свыше 1000.
Для определения низкомолекулярных
веществ их надо предварительно связать с
каким-либо белком-носителем. Такое
связанное с белком низкомолекулярное
вещество называется гаптеном.
Комплекс Аг-Ат
характеризуют двумя параметрами—
аффинностью (сродством) и авидностью.
Аффинность отражает степень специфического сродства антитела к моновалентному антигену, характеризуемую
константой связывания,
а авидность — общую энергию связывания
между антителами и поливалентным
антигеном.
Комплекс Аг-Ат



Реакцию связывания можно записать
следующим образом:
Константа образования комплекса
выражается как:
Для таких комплексов К принимает
достаточно высокие значения: обычно от
108 — 1010.
Основными принципами детектирования в иммунных методах анализа
служат измерение :
1) люминесценции,
2) активности фермента гетерогенный иммуноферментный
анализ (ИФА),
3) радиоактивности радиоиммунный анализ (РИА).
Радиоиммунный анализ (РИА)
Радиоиммунные методы основаны на
конкурирующем комплексообразовании
определяемого вещества — природного
антигена Ag — и синтетического
меченого (радиоактивного) антигена
Ag* — с антителом Аk:
Основные условия РИА:



Концентрации Ag* и Ak во всей серии
измерений должны оставаться
постоянными.
Ag* берется в избытке по отношению к Ak.
Константы ассоциации определяемого (К )
и меченого антигена (К*) должны достаточно различаться между собой (К*  K).
Принцип радиоиммуноанализа
Типичная градуировочная кривая в РИА
Последовательность операций при
выполнении РИА:




Иммобилизация антитела, например, на
внутренней поверхности реакционного сосуда.
Проведение иммунной реакции с участием
пробы, в которую добавлен меченый антиген.
Отделение непрореагировавших веществ
путем промывания поверхности сосуда.
Измерение радиоактивности стенок сосуда.
Разделение связанного и свободного
антигена:




осаждение (денатурация) добавлением
большого количества соли (например, (NH4)2SO4,
Na2SO4) или органического растворителя
(ацетона, этанола и др.);
метод с вторичными антителами (для
осаждения комплексов Аг-Ат и Аг*-Ат);
электрофорез;
иммобилизация антигенов или антител на
твердой подложке.
Прямой (A) и непрямой (Б) метод Конечный комплекс, образующийся
визуализации
при РАР-методе
Использование радиоактивной
метки 125I


Наиболее подходящими радиохимическими
свойствами для синтеза меченых антигенов
обладают 32Р, 35S, 3H, 14С, 57Со и 125I.
Чаще всего используют изотоп 125I. Он является
чистым -излучателем, а его препараты легко
доступны и могут быть получены в виде веществ
со 100%-ной изотопной чистотой. Период
полураспада изотопа 125I достаточно велик и
составляет 60 суток, а энергия его излучения
относительно низкая.
При синтезе и работе с
препаратами, меченными 125I:



Если молекула определяемого вещества содержит
йод, то возможен нежелательный процесс
изотопного обмена между Ag и Ag* (гормоны
щитовидной железы — тироксин и трииодтиронин).
Введение изотопной метки 125I легко осуществимо,
если молекула содержит остаток тирозина или
гистидина.
Если молекула не содержит удобных мест для
введения метки 125I, то метку можно ввести вместе
с остатком тирозила.
Для введения метки
достаточно использовать смесь Na125I и
окислителя, например, хлорамина Т:
Схема радиоиммунного анализа
(РИА)
Антитела против Аг
Определяемый
антиген
Антиген
с изотопом 125I
Измерение
радиоактивности
*
Добавление антиглобулиновой
сыворотки, центрифугирование,
удаление супернатанта
* Меченный изотопом 125I антиген, идентичный
определяемому, в известной концентрации.
Схемы РИА, ИРМА и тИФА созданы по мотивам рисунков, опубликованных на сайте Томского
медицинского университета http://biotech.city.tomsk.net
Иммунорадиометрический анализ
(ИРМА)
• Определение антител с помощью изотопной метки
получило название иммунорадиометрического
анализа.
• В качестве примера ИРМА рассмотрим
радиоаллергосорбентный тест (РАСТ). РАСТ был
разработан в начале 1970-х (Wide L.) для определения
аллерген-специфических IgE в сыворотке крови.
• Аллерген сорбировали на пористом носителе (бумага,
полимерные мембраны, гранулы, губки). Далее
добавляли сыворотку пациента, инкубировали 3 часа,
отмывали и добавляли антиглобулиновую сыворотку
(против IgE), меченную радиоактивным изотопом.
После отмывки несвязавшихся реагентов,
радиоактивность учитывали на счетчике.
Схема радиоаллергосорбентного теста
(РАСТ)
Аллерген сорбирован
на полименой “губке”
в микропробирке
Специфические
IgE в сыворотке
Антитела против IgЕ
человека, коньюгированные с 125I
Измерение радиоактивности
Главным критерием при выборе антисыворотки
является ее специфичность и аффинность по
отношению к анализируемому антигену.

Обычно для получения антител животным
вводят от 0,2 до 2,0 мг чистого антигена,
смешанного с адъювантом Фрейнда
(комбинация минерального масла, воска и
убитых бактерий, которая усиливает и
продлевает иммунный ответ). Для
получения антител используют кроликов,
овец, морских свинок, коз, кур или обезьян.
Синтез иммуногенов


Небольшие молекулы с относительной
молекулярной массой 1000-5000 (небольшие
полипептиды, стероиды, триазины и др.),
называемые гаптенами, самостоятельно не
могут вызывать иммунный ответ.
Для определения таких веществ их необходимо
предварительно связать с белком-носителем в
высокомолекулярный продукт, называемый
иммуногеном:
Схема синтеза иммуногена по реакции
глутарового альдегида с аминогруппами
гаптена и белка:
Примеры определения веществ
иммунохимическими методами
Специфичность иммуноанализа



На специфичность анализа оказывает
влияние:
а) гетерогенность антител;
б) перекрестные реакции с другими
антигенами;
в) присутствие низкомолекулярных веществ,
способных влиять на реакцию между
антителами и антигенами посредством
изменения условий среды.
Недостатки радиоиммуноанализа


В целом, применение изотопных меток (РИА,
ИРМА) сыграло важную роль в становлении
иммуноанализа.
Однако, недостатки данного подхода (в первую
очередь небезопасность, трудности разработки,
транспортировки, хранения, утилизации отходов,
необходимость применения дорогостоящего
оборудования и др.) привели к вытеснению
методов, основанных на радиоактивной метке,
альтернативными.