Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
Экспресс метод биолюминесцентного
биотестирования в системе комплексного
мониторинга почвенного покрова
Руководители:
д.б.н., профессор Кратасюк В. А.
м.н.с Римацкая Н. В.
Выполнила:
Студентка ББ 11-03М
Казанцева М. А.
В настоящее время основой мониторинга ядовитых веществ в окружающей
среде являются их предельно допустимые концентрации (ПДК) в воде,
воздухе, почве и продуктах питания.
Превышение ПДК химических веществ в исследуемых субстратах служит
лишь косвенным показателем их токсичности. Почва может быть
сильнозагрязненной, но нетоксичной или слаботоксичной и,
наоборот, слабозагрязненной, но сильнотоксичной.
Необходимо оценивать интегральную токсичность почвы, отражающую
влияние всего комплекса загрязнителей. Наиболее целесообразным методом
определения интегральной токсичности почвы является биотестирование.
Цель: Исследовать возможность применения биолюминесцентного
метода тестирования для оценки качества почвенного покрова
Задачи:
1.
2.
3.
4.
Подобрать условия пробоподготовки почв для биолюминесцентного
анализа.
Подобрать условия для биолюминесцентного анализа почвенного
покрова.
Исследовать почвы методом биолюминисцентного ферментативного
тестирования и сравнить его с другими методами.
Разработать методику биолюминесцентного анализа почвенного
покрова.
Материалы и методы:
1.
Определении смертности и изменений в плодовитости дафний (Daphnia
magna Straus) при воздействии токсических веществ, присутствующих в
исследуемой водной вытяжке, по сравнению с контрольной культурой в
пробах, не содержащих токсических веществ.
Острое токсическое действие растворов отдельных химических
веществ, исследуемой водной вытяжки из почв на дафний,
определяется по их смертности (летальности) за определенный
период экспозиции. Критерием острой токсичности служит
гибель 50 % и более дафний за 96 часов в исследуемой воде при
условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает
10 %.
Материалы и методы:
2.
Метод оценки токсичности по всхожести семян, по длине стеблей и корней
проростков.
Семена кресс-салата помешали на фильтровальную бумагу, пропитанную
водной вытяжкой. Семена инкубировали в темноте при комнатной
температуре. Количество проросших семян, длину побега и корень
подсчитывали на первые, вторые и четвертые сутки.
3.
Биотестирования по реакции хемотаксиса парамеций.
Метод определения токсичности основан на установлении различий
между количеством инфузорий в опытной пробе и контрольной
пробе. Оценка токсичности производится путем определения
функциональной активности и счета простейших в динамике с
помощью оптической техники.
Материалы и методы:
4.
Биолюминесцентный метод биотестирования.
Биоиндикатор – биферментная биолюминесцентная система НАДН:ФМНоксидоредуктаза –люцифераза; в качестве тест – функции : изменения
интенсивности свечения этой системы относительно контрольного (остаточное
свечение -Т )
Пробоподготовка:
1
3
Фильтрация
Набор пробы
2
5
Просеивание
4
Просушивание пробы при
105 º С в течении 1 часа
6
Приготовление водной
вытяжки
Центрифугирование
ПОДБОР УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ
Вытяжка с помощью различных растворителей
 Фильтрация вытяжки из почвы разными
фильтрами
 Хранения вытяжки из почвы в различных
условиях
 Подготовка для экспресс анализа

Io/Ik
Io/Ik
Подбор условий проведения
биолюминесцентного анализа
C14
FMN
Реакционная смесь:
Io/Ik
1.
2.
3.
4.
5.
6.
NAD H
Буфер 300 мкл
КРАБ 5 мкл
С14 30 мкл
NAD H 100 мкл
Проба 50 мкл
FMN 7 мкл
Подбор условий проведения биолюминесцентного анализа
t
250
200
150
t max
вода
100
100
t max
проба
80
50
t
60
0
50 мкл 70 мкл 90 мкл 100 мкл 110 мкл 130 мкл
t max
вода
40
t max
проба
20
NAD H
t
0
60
5 мкл
50
7 мкл
10 мкл
FMN
40
t max
вода
30
t max
проба
20
10
0
20 мкл
30 мкл
50 мкл
C14
70 мкл
90 мкл
13 мкл
ОПИСАНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ ПРОБ ПОЧВ
4 пробы почв собранных возле территории КраЗА
 4 пробы почвы с территории Ангарскго НПЗ
 3 пробы почвы с побережья оз. Байкал
 6 модельных токсикантов (HgSO4, CdCl2, K2CrO4,
ZnSO4, Co(NO3)2, Pb(NO3)2)

Сравнительный анализ методов биотестирования
Биоиндикаторы
биферментная
биолюминесцент
ная система
Daphnia
Кресс салат
НАДН:ФМНmagna Straus
оксидоредуктаза
–люцифераза
Остаточное
Смертность, Всхожесть
свечение –Т, %
%
семян, %
тест – функции
Почва +
Почва +
Почва
CdCl2 (1.0 г/кг)
CdCl2 (0.7 г/кг)
CdCl2 (0.5 г/кг)
CdCl2 (0.3 г/кг)
HgSO4 (7.0 г/кг)
HgSO4 (2.0 г/кг)
HgSO4 (0.7 г/кг)
73.41
12.50
Модельные токсиканты
29.28
100.00
51.82
65.50
55.14
52.00
68.06
27.80
49,34
100.00
30,89
60.00
66.50
25.00
Paramecium
caudatum
96.67
Реакция
хемотаксиса,
%
12.69
95.30
98.70
100.00
100.00
95.56
96.78
98.89
81.67
79.14
62.50
50.30
75.51
63.26
58.60
Таблица 1. Влияние водной вытяжки из почвы и водной вытяжки из почвы с
добавлением токсикантов на различные тест-объекты.
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
50
40
HgSO4 2 гр/кг
+ проба
30
Io/Ik
Io/Ik
Результаты:
50
40
30
20
20
10
10
0
0
1
2
4
8
16
32
Разбовления
Диаграмма 1. Влияние почвенной
вытяжки с добавлением HgSO4 2 гр/кг
на интенсивность свечения.
HgSO4 7 гр/кг
+ проба
1
2
4
Разбавления
Диаграмма 2. Влияние почвенной
вытяжки с добавлением HgSO4 7 гр/кг на
интенсивность свечения.
Влияние водного раствора HgSO4 2 гр/кг на интенсивность свечения.
85
100
90
75
80
70
70
65
60
Io/Ik
80
60
55
HgSO4 2 гр/кг
+ проба
40
30
50
Т, %
50
20
45
10
40
0
35
1
2
4
8
16
Разбовления
30
25
20
15
10
5
0
1
4
8
16
32
64
Разбавления
128
256
512
32
Результаты:
Смертность, %
Проба
1 ч.
2 ч.
3 ч.
24 ч.
48 ч.
1
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
22
3
0
0
0
0
0
4
0
0
0
50
100
Эталонная
0
0
0
0
20
Таблица 3. Результаты биотестирования острой токсичности водной вытяжки из
почвы по смертности цериодафний.
Биферментная биолюминесцентная система Т= 73.41 %
ВЫВОДЫ:
1.
2.
3.
4.
5.
Подобраны оптимальные условия
пробоподготовки и проведения анализа
Биолюминесцентная система чувствительна к
вытяжкам из различных видов почв
Сравнительный анализ показал высокую
чувствительность биферментной биолюминесцентной
системы
Эффект разбовления HgSO4 ????
Основным параметром оценки качества почвы является
остаточное свечение (Т)