Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕПТИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ СТАРЕНИИ Линькова Н.С., Умнов Р.С., Гутоп Е.О. Характеристика пептида пинелона (Т-33) Структурная формула: Glu-Asp-Arg (L-глутамил-L-аспартил-L-аргинат) Масса молекулы 0,418 кДа Суммарный заряд -1 Индекс гидрофобности -11.5 Европейский патент Khavinson V.Kh., Grigoriev E.I., Malinin V.V., Ryzhak G.A. Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application // European patent. ЕР 2024388. 2009. - атом азота - атом кислорода - атом углерода Нейропротекторная активность пинелона у людей разного возраста Влияние пинелона на показатели памяти у мужчин пожилого возраста * - p<0,05 - по сравнению с соответствующим контролем Влияние пинеалона на физическую работоспособность спорстменов * - p<0,05 - по сравнению с соответствующим контролем Влияние пинеалона на интеллектуальную работоспособность спортсментов * - p<0,05 - по сравнению с соответствующим контролем Влияние пинеалона на экспрессию генов у спортсменов PPARA и PPARG – гены, усиливающие окислительную способность скелетных мышц HSPA1A – ген, кодирующий выработку белка теплового шока 70 кДа (антистрессорная активность) * - p<0,05 - по сравнению с соответствующим контролем Молекулярный механизм нейропротекторного действия пинелона Пептидная регуляция экспрессии сигнальных молекул в диссоцированных культурах клеток коры головного мозга Влияние пептидов на экспрессию р53 в диссоцированных культурах клеток коры головного мозга * - p<0,05 - по сравнению с контролем Влияние пептидов на экспрессию Ki67 в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга "молодые" культуры 3 * Площадь экспресии Ki67, % * "старые" культуры 2.5 ** 2 ** 1.5 1 0.5 0 контроль пинеалон * - p<0,05 - по сравнению с контролем везуген кортексин Экспрессия Ki67 в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга при их старении контроль везуген, 20 нг/мл иммуноцитохимия, х200 Влияние пептидов на экспрессию серотонина в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга Площадь экспресии серотонина, % 4 * 3.5 * "молодые" культуры 3 "старые" культуры * 2.5 2 ** 1.5 1 0.5 0 контроль пинеалон * - p<0,05 - по сравнению с контролем везуген кортексин Экспрессия серотонина в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга контроль пинеалон, 20 нг/мл иммуноцитохимия, х200 В диссоциированных культурах клеток пептиды не влияли на синтез кальмодулина и виментина Молекулярный механизм нейропротекторного действия пинелона Пептидная регуляция экспрессии сигнальных молекул в органотипических культурах клеток коры головного мозга Площадь экспресии Ki67, % Влияние пептидов на экспрессию Ki67 в органотипических культурах клеток коры головного мозга 0.02 0.018 0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 ** "молодые" культуры "старые" культуры ** * * * * контроль кортексин кортексин кортексин пинеалон пинеалон 1 пинеалон 10 нг/мл 20 нг/мл 50 нг/мл 0,05 нг/мл нг/мл 10 нг/мл *- p<0,05 - по сравнению с контролем «молодые» культуры ** - p<0,05 - по сравнению с контролем «старые» культуры Площадь экспрессии кальмодулина, % Влияние пептидов на экспрессию кальмодулина в органотипических культурах клеток коры головного мозга 0.035 * "молодые" культуры 0.03 0.025 "старые" культуры 0.02 ** 0.015 ** 0.01 0.005 0 контроль пинеалон кортексин *- p<0,05 - по сравнению с контролем «молодые» культуры ** - p<0,05 - по сравнению с контролем «старые» культуры Площадь экспрессии серотонина, % Влияние пептидов на экспрессию серотонина в органотипических культурах клеток коры головного мозга 0.009 * "молодые" культуры 0.008 0.007 * "старые" культуры 0.006 0.005 0.004 ** 0.003 0.002 0.001 0 контроль пинеалон *- p<0,05 - по сравнению с контролем «молодые» культуры ** - p<0,05 - по сравнению с контролем «старые» культуры кортексин Площадь экспрессии виментина, % Влияние пептидов на экспрессию виментина в органотипических культурах клеток коры головного мозга 0.02 ** 0.018 "молодые" культуры 0.016 0.014 "старые" культуры 0.012 0.01 0.008 0.006 * * 0.004 0.002 0 контроль пинеалон кортексин *- p<0,05 - по сравнению с контролем «молодые» культуры ** - p<0,05 - по сравнению с контролем «старые» культуры Пептиды не влияли на экспрессию проапоптотического протеина р53 в органотипических культурах клеток коры головного мозга Молекулярный механизм нейропротекторного действия пинелона Экспериментальные данные и молекулярный механизм взаимодействия пинеалона с ДНК Взаимодействие пинеалона и ДНК in virto – данные спектроскопии cпектры поглощения снимали в 0,005М растворе NaCl Взаимодействие пинелон+ДНК характеризуется: 1) сдвигом максимума поглощения 2) гиперхромным эффектом 3) т.к. в области > 250 нм пептид не поглощает, изменения связаны с поглощением оснований ДНК (взаимодействие осуществляется с основаниями ДНК). Конформационный анализ пинеалона и везугена (наложение 15 конфораций пептидов) пинеалон везуген энергия оптимизации конформеров отличается на 2 ккал/моль энергия оптимизации конформеров отличается на 3,5 ккал/моль среднеквадратичное отклонение конформаций 0,356 Å среднеквадратичное отклонение конформаций 0,143 Å Распределение электростатического потенциала в молекулах пинеалона и везугена Пинеалон: равномерное распределение заряда по молекуле Везуген: выраженное разделение заряда, есть дипольный момент положительно заряженные группы отрицательно заряженные группы нейтрально заряженные группы Модель взаимодействия пинеалона с ДНК с сайтом d(CCAGC) - атом азота - атом кислорода - фосфатный остов ДНК с сайтом d(CCTGCC) - атом углерода - полярный атом углерода - азотистые основания ДНК Предполагаемые сайты связывания пинелона в промоторных зонах генов крыс Ген Промоторные участки генов у крыс Rattus norvegicus Регуляторный участок гена, range -120 to 100 bp (кДНК 5'→3') TPH1 GCTTCTCCTATAAGAGGCGGCAGCTCCCGTCCGCAGGTGACCCT (ген белка 5триптофангидрокс илазы – фермент синтеза серотонина) CTGAACTCCAGTGGCTTTGAGGTCCTCTTTCCAGTGCCGGATCCT CALM1 ACAGGCCAGCAGCCTTGCTCAGGTCCCGGACTCCCAAGTGACC TCTGCCCGCGTAATGAGCCCGCCGCGCCGGGCGCGCCTTGGGG GCGGAGCCTTGCGGTGAGGTCCGGTTGTCGCAGCGCCGCCCTG CGCGAGGCGGTACTGCCGCGGCGGAGGGATACCGCGCACCGTA TATATATCGCGGCACACAGGCTCGCGCTACGGCAGTGGTGCTGG GAGT (ген белка кальмодулина) GenBank № X53501.1 GCCCACTGGGTCATCTTCATTCAGATTCACCATGATTGAAGACAA CAAGGAGAACAAAGACCATTCCTCAGAAAGGGGGAGAGTGACT CTCATCTTTTCCTTGAAGAATGAAGTTGGAGGACTCATAAAAG D90396.1 красным и синим выделены предполагаемые сайты связывания пинеалона Предполагаемые сайты связывания пинелона в промоторных зонах генов человека Ген Промоторные гены участков человека Homo sapiens Регуляторный участок гена, range -499 to 100 bp (кДНК 5'→3') GenBa nk № ACCGGCTCATCGCACAGAGTAGCAGAGCCGGGCTCATCGAGGAGGCAGGAGGGGCTCGCC NM_00 PPARA (ген, усиливающий AGCGTGGCACGGGCGCCCGGCGGGAACCTCCACCCGCCCCGCGGCCGCGCGTCCCCGCC 5036.4 окислительную способность скелетных мышц) PPARG (ген, усиливающий окислительную способность скелетных мышц HSPA1A (ген белка теплового шока) TCGAATTCAGCCCCGCCCCGGTGCGCCGGGCTGGAGGGGCGCTGACGCTCAGCGGTGTCCC ATCGGTGACCTTGGACGGTCCCTCCACCTCTCCGGCCTCAGTTTCCCTTGGCTGCAGCGGCC GCGGGGCGCTAGGTGGGAGCCGCTGAGCGCTCCCGGGGCCCCGCCCACCGCGAGCAGCCA ATCGGGCGCCGCCCTCCGGGGGGTGTGTCCCGGGGCCGAGGCCCGGGGCCCGGAGGGCG CGCGGGGCGGGCGGGGCTTCCGGGTCGGGCCTCGGGACACTGGCTCGCGCGGACCGGG GCAGGGGGCGGGCCGAGGGGCGGTGCGTGTCGCGGGGGCGCGGCTGGCACGGACGCGCG GAGGCGGCGCCGGGCATGGGCCGTGGACGCGGCGGCCCCGCGGCGGGGGCAGCGGGCGG CGGGGGCGGAGGCGGCCGCTAGCGCCCTGCCCGGCGCCGCCTCCTTCGGCGTTCGCCCC ACGG ACCAAGGGACCCGAAATATGCTTTAATTAAATTTTCTTTTAAAATGTCACTGGAAAGAACATCTT NM_13 GGGAAGACGGCCTGGCCGATCGCCGTGTGAAGGGCAAGCCACTCTGGCCGAGAGGGAGCC 8712.3 CCACACCTCGGTCTCCCCAGACCGGCCCTGGCCGGGGGCATCCCCCTAAACTTCGGATCCCT CCTCGGAAATGGGACCCTCTCTGGGCCGCCTCCCAGCGGTGGTGGCGAGGAGCAAACGAC ACCAGGTAGCCTGCCGCGGGGCAGAGAGTGGACGCGGGAAAGCCGGTGGCTCCCGCCGT GGGCCCTACTGTGCGCGGGCGGCGGCCGAGCCCGGGCCGCTCCCTCCCAGTCGCGCGCCG CCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCACCCCCACCCCCACCCCCACCCCCAGCC GGCGCCCGCGCCCGCCCCCGCGCCGGGCCCGGCTCGGCCCGACCCGGCTCCGCCGCGGGC AGGCGGGGCCCAGCGCACTCGGAGCCCGAGCCCGAGCCGCAGCCGCCGCCTGGGGCGCT TGGGTCGGCCTCGAGGACACCGGAGAGGGGCGCCACGCCGCCGTGGCCGCAGGTC GTAATCTTTTTCCAAACTGGCCCATGAGGTCAGAGACAGTATCTCCATTGTAACGTGGCCGGG CGGTGTCAACACAAACGCCCCCACCCTCCCCTGGACGCGCGTAACCCGCTCCCCGCACCA GCCCCCTGCCCACAACTGCGCAGGCCCAGCAAGCCCCCACAATTAAAAGCCCAGCGCC GACCCTTCCTGTCAATTAGGCG NM_00 5345.5 (фраг мент) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нейропротекторное и геропротектрное действие пептидов пинеалона и кортексина реализуется через регуляцию экспрессии сигнальных молекул - маркеров процессов клеточного обновления и функциональной активности нейронов. При этом пинеалон эффективен в меньших дозировках по сравнению с кортексином. Основными молекулярными мишенями действия пинеалона являются молекулы, участвующие в реализации функциональной активности нейронов (серотонин, виментин, кальмодулин), тогда как кортексин в большей степени регулирует процессы клеточного обновления (Ki67, р53). Данные молекулярного моделирования позволяют предположить, что пинеалон регулирует синтез белков через влияние на экспрессию соответствующих генов, связываясь с комплиментарными последовательностия в их промоторных зонах.